CN107831309A

CN107831309A - 一种猪伪狂犬病病毒gE蛋白抗体竞争ELISA检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN107831309A
Application number: CN201710991735.9A
Authority: CN
Inventors: 韦奇勇; 但汉并; 范俊青; 贾慧勤; 周云朵; 李盼盼; 邹维华; 张弛; 马磊; 董俊; 董晓辉; 徐高原
Original assignee: Wuhan Keqian Biological Co ltd
Current assignee: Heilongjiang Academy of Land Reclamation Sciences
Priority date: 2017-10-18
Filing date: 2017-10-18
Publication date: 2018-03-23

Abstract

本发明公开了一种检测猪伪狂犬病病毒gE蛋白抗体的竞争ELISA检测试剂盒，包括辣根过氧化物酶标记的猪伪狂犬病病毒gE蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体由杂交瘤细胞株4E12分泌产生，所述杂交瘤细胞株4E12的保藏号为CCTCC NO：C2017205，试剂盒还包括：阴性对照、阳性对照、抗原包被板、底物液A、底物液B、终止液、样品稀释液、洗涤液，该试剂盒具有特异性强、敏感性高的特点。本发明还提供了所述试剂盒的检测方法，该方法特异性强、敏感性高、重复性好、与进口试剂盒检测符合率达96.11%，且1h之内获得结果，大幅度缩短检测时间，具有良好的应用前景。

Description

一种猪伪狂犬病病毒gE蛋白抗体竞争ELISA检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于动物疫病检测领域，更具体地，涉及一种猪伪狂犬病病毒gE蛋白抗体竞争ELISA检测试剂盒及检测方法，适用于猪血清中gE蛋白抗体的检测。

背景技术

伪狂犬病病毒(Pseudorabies,PRV)是疱疹病毒科(Herpesviridae)α疱疹病毒亚科的成员，可以引起猪、牛、羊及野生动物的伪狂犬病，猪是其主要宿主，伪狂犬病给养猪业造成了巨大的经济损失。鉴于伪狂犬病的巨大危害，欧美许多国家相继通过使用基因缺失疫苗和鉴别诊断方法，实现了该病的净化。目前商业化的伪狂犬疫苗均为gE基因缺失疫苗，疫苗免疫动物后不会产生gE抗体，因此可通过gE ELISA抗体检测试剂盒检测猪血清中的gE蛋白抗体来监测猪只伪狂犬病毒感染情况，准确、及时地淘汰带毒病猪，逐步实现该病的净化和根除。

目前，一般采用的间接ELISA，乳胶凝集等方法检测gE蛋白抗体，这些方法由于自身的特点必需依赖免疫原性好、高纯度的包被抗原才能得到准确的结果，但高纯度的包被抗原很难获得，运用这些方法必然存在灵敏度不高，特异性不好的问题。因此建立灵敏度高、特异性强、简便快速的gE蛋白抗体ELISA检测方法对猪伪狂犬病的净化和根除具有重要意义。

发明内容

针对上述现有技术中的问题，本发明提供了一种猪伪狂犬病病毒gE蛋白抗体竞争ELISA检测试剂盒，该试剂盒具有特异性好，灵敏度高，快速准确的特点。

本发明的另一目的在于提供了所述试剂盒的检测方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。

一种猪伪狂犬病病毒gE蛋白抗体竞争ELISA检测试剂盒，包括辣根过氧化物酶标记的酶标抗体，所述酶标抗体为抗伪狂犬病病毒gE蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体由杂交瘤细胞株4E12分泌产生，所述杂交瘤细胞株4E12的保藏号为CCTCC NO：C2017205；保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2017年10月17日。

优选的，所述单克隆抗体是由纯化的伪狂犬病病毒鄂A株为免疫原获得；所述伪狂犬病病毒鄂A株为灭活的。

优选的，所述试剂盒中还包括抗原包被板、阴性对照、阳性对照、底物液A、底物液B、终止液、样品稀释液、洗涤液；所述抗原包被板的包被抗原为纯化的灭活伪狂犬病毒。

所述抗原包被板为用0.1mol/L的pH 9.6碳酸钠缓冲液将纯化的伪狂犬病毒稀释到一定浓度包被酶标板。

所述阴性对照为未感染伪狂犬病毒的健康猪阴性血清；所述阳性血清为感染伪狂犬病毒的猪血清。

所述样品稀释液为质量分数为0.1％酚红的PBS缓冲液。

所述洗涤液为体积分数为0.05％Tween-20的PBS缓冲液。

所述底物液A为含有50mg/mL过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲液；底物液B为含有0.2mg/mL TMB pH 5.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液。

所述终止液为体积分数为0.25％的氢氟酸溶液。

所述抗伪狂犬病病毒gE蛋白的单克隆抗体，利用杂交瘤细胞技术(张权庚、张玉祥、丁卫等译，抗体制备与使用实验指南[M].北京：科学出版社，2010)，用纯化的伪狂犬病病毒免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行细胞融合，用HAT选择性培养基进行培养后，再用包被有猪伪狂犬病毒鄂A株的酶标板和伪狂犬病毒gE/gI基因缺失株(参见中国发明专利申请公开说明书，专利申请号200510019513.8)的酶标板运用间接ELISA的方法进行筛选，阳性细胞株进行有限稀释的方法克隆，再用伪狂犬病毒感染猪的阳性血清和未被感染的健康猪阴性血清进行阻断ELISA筛选，最终筛选出有阻断效果的单克隆抗体，命名分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株4E12，保藏号：CCTCC NO：C2017205。

优选的，所述抗原包被板的抗原包被浓度为1:5000，酶标抗体的稀释倍数为1:6000。

本发明还提供所述的一种猪伪狂犬病病毒gE蛋白抗体竞争ELISA检测试剂盒的检测方法，包括如下检测步骤：

1)从试剂盒中取出已包被纯化病毒的抗原包被板，分别将待检血清、阴性对照、阳性对照一定倍数稀释后各取50μl与所述酶标抗体50μl同时加入抗原包被板，其中每份样品设一孔，阴性对照、阳性对照各设两孔、振荡混匀，37℃孵育；

2)洗板5次，最后一次在吸水材料上拍干；

3)每孔先加底物液A50μl、再加底物液B 50μl，混匀，室温避光显色，每孔加入终止液50μl终止显色，酶标仪读取OD₆₃₀值；

4)结果判定：试验成立的条件是阴性对照孔平均OD_630nm值与阳性对照平均OD_630nm值之差≥0.3；

S＝样品孔OD_630nm值，N＝阴性对照孔平均OD_630nm值，若S/N比值＜0.6，样品判为gE抗体阳性，若S/N比值＞0.7，样品判为gE抗体阴性。

优选的，步骤1)所述稀释的倍数均为5倍。

优选的，步骤1)所述孵育的时间为30min。

优选的，步骤3)所述避光显色的时间为15分钟，终止显色10分钟内读取酶标仪数值。

优选的，步骤4)中若0.6≤S/N≤0.7，样品判为可疑；所述样品重测，如结果相同，则判为gE蛋白抗体阳性。

与现有技术相比，本发明有益效果在于：

(1)本发明包被抗原为纯化的灭活伪狂犬病毒，天然抗原免疫原性好。

(2)本发明利用伪狂犬病毒gE蛋白特异性单克隆抗体，与传统试剂盒相比敏感性好，特异性高。

(3)利用竞争ELISA的方法，待检血清样品与酶标单抗同时加入酶标板，操作更加方便，检测更加快速，检测时间仅45min。

(4)试剂盒检测结果判定依据S/N值，科学合理，结果准确性好、可信度高。

(5)本发明试剂盒的特异性强、敏感性高，更加稳定；检测方法的批间及批内重复性好、敏感性高、符合率试验优良，与进口试剂盒检测符合率达96.11％，大幅度缩短检测时间，具有良好的应用前景。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

以下以具体实施条件为例对本发明方法进行进一步说明。

实施例1

包被抗原和制备抗伪狂犬病病毒gE蛋白的单克隆抗体的免疫原，通过以下步骤制备:

(1)将冷冻干燥的PRV毒种加2ml DMEM培养基溶解，即为PRV鄂A株病毒液。将BHK-21细胞用含10％小牛血清的DMEM于37℃培养，细胞长成单层后，倒掉上清，添加含3％小牛血清的DMEM培养基至原体积，同时按原体积1％接种PRV鄂A株病毒液，置37℃继续培养24～72小时，80％左右细胞病变(CPE)时，收获PRV鄂A株病毒液加甲醛(终浓度为0.2％)置37℃灭活处理24小时。

(2)将细胞瓶置于-20℃冰箱，反复冻融三次，收集病毒液。将病毒液在8000rpm，4℃，离心30min，弃沉淀。将上清再进行27000rpm离心2h，弃上清，沉淀用PBS(0.01mol/L，pH值7.4)重悬。

(3)将重悬液进行蔗糖密度梯度离心，同时制备质量体积比为20％、35％、45％和60％的不连续梯度蔗糖溶液，将重悬病毒液加在20％蔗糖界面上，27000rpm离心90min，收集45％和60％蔗糖层间病毒液。

(4)用PBS对收集的病毒液进行5倍稀释，在2～8℃条件下，以27000r/min离心90min进行脱糖，收集沉淀，最后沉淀用PBS(0.01mol/L，pH值7.4)重悬，稀释至2mg/ml后分装。

实施例2

抗伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体的制备、纯化和标记

免疫脾的制备

用纯化的伪狂犬病毒鄂A株作为免疫原，分别对6～8周龄BALB/C雌性小鼠进行三次免疫。首先取1mg/ml的免疫原100ug与等体积的弗氏完全佐剂乳化，皮下免疫小鼠。间隔14d用弗氏不完全佐剂乳化的抗原100μg皮下免疫小鼠，同样的方法再间隔14d进行第三次免疫，第三次免疫后10天采集小鼠血液，分离血清检测小鼠血清抗体效价，血清效价采用间接ELISA的方法对小鼠进行筛选，选取效价最高的小鼠进行加强免疫，加强免疫用200ug的免疫原直接腹腔注射，加强免疫3天后进行融合。

筛选方法的确定

用间接法方阵滴定试验确定最佳抗原包倍浓度和羊抗鼠IgG浓度。小鼠血清做500倍稀释。

取纯化的免疫原用包被缓冲液分别进行1:1000、1:2000、1:3000、1:4000、1:5000、1:6000倍稀释后，100ul/孔加入抗原包被板，4℃过夜。

次日将抗原包被板甩干，加封闭液120ul/孔，37℃，2h，拍干备用。

将1:500的免疫鼠血清和空白鼠血清100ul/孔分别加入制好的抗原包被板，每个抗原稀释梯度各设4孔重复，37℃，30min，洗板5次。

将羊抗鼠IgG(Sigma A4416)分别进行1:3000、1:4000、1:5000、1:6000，100μl/孔，分别加入相应的反应孔中，37℃30min，洗涤5次。

加入底物液A、B各50μl/孔，室温显色10min，用终止液终止反应，50μl/孔。用酶标仪测定OD₆₃₀。

选取阳性血清与阴性血清比值最大，且OD₆₃₀值接近1.0的抗原稀释倍数和羊抗鼠IgG稀释倍数为最佳组合，最佳组合为纯化病毒稀释倍数5000倍，羊抗鼠IgG稀释倍数为5000倍。

免疫鼠血清效价测定

将3只免疫鼠血(分别编号1～3)分别做1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000稀释，然后在最佳组合条件下进行检测，免疫鼠血清效价见表1。1号小鼠血清效价最高，选择1号小鼠进行加强免疫后融合。

表1不同稀释倍数的免疫鼠血清效价检测结果

编号	1:500	1:1000	1:2000	1:4000	1:8000	1:16000	1:32000	1:64000	阴性对照
										1	1.534	1.324	1.187	0.980	0.876	0.765	0.654	0.532	0.098
2	1.221	1.018	0.998	0.896	0.765	0.589	0.498	0.358	0.087
										3	1.349	1.234	0.996	0.879	0.689	0.601	0.450	0.325	0.085

细胞融合

饲养细胞的制备：融合前一天，取健康的6～8周龄BALB/C雌性小鼠，摘眼球放血，颈部脱臼处死，75％酒精浸泡消毒，转移超净工作台上，小鼠腹部向上进行固定，用灭菌镊子和手术剪剪开小鼠腹部皮肤，切勿伤及腹膜，更换镊子和手术剪，小心剪开小鼠腹部左侧腹膜，更换用具，用镊子小心取出脾脏，将脾脏放入灭菌匀浆器中，向匀浆器中添加5ml1640基础培养基，对小鼠脾脏进行研磨，待脾脏被完全磨碎后，再向匀浆器中添加5ml 1640基础培养基，静置5min，将匀浆器中上清小心转移到已添加30ml 1640基础培养基的50ml离心管中，1500rpm，离心10min，弃上清，用40ml 1640基础培养基重悬沉淀，重复离心1次，弃上清将沉淀用含适量HAT的1640完全培养基重悬，调整饲养细胞数目为10⁵个/ml，100μl/孔铺与96孔板中，37℃培养于二氧化碳培养箱中，待用。

骨髓瘤细胞制备：融合前2周，取出液氮中冻存的SP2/0骨髓瘤细胞进行复苏，用含8-氮鸟嘌呤的1640完全培养基进行连续筛选，以保持HGPRT缺陷型，融合当天选择处于对数期，生长状态良好，无微生物污染的细胞，1000rpm，离心10min，弃上清，细胞用基础1640培养基洗3次，重悬细胞并计数备用。

免疫脾细胞制备：取免疫血清效价最高的小鼠，按照饲养细胞制备方法，制备免疫脾细胞计数后备用。

细胞融合：细胞融合前将所用材料和设备准备好，并将培养基放置到37℃二氧化碳培养箱中预热，将免疫脾与SP2/0骨髓瘤细胞按比例充分混匀，免疫脾细胞与骨髓瘤细胞的数目比为10:1，1000rpm，离心5min，弃上清，将离心管平放用吸水纸小心吸取管底残留液体，轻轻敲击管底，使细胞松散，将装混合细胞离心管放入37℃水浴中。轻轻摇动细胞管，一边用吸管向混合物中加入预热的50％PEG 1ml(1min加完)，边加边用吸管尖头缓慢搅拌。再缓慢搅拌1min，然后分批加入37℃预热的1640基础培养基40ml，具体步骤为第1min逐滴加入1640基础培养基1ml，第2min缓慢加入1ml，第3～4min加入3ml，第5min加入5ml，第6～10min分批慢慢加入30ml，并动作轻缓地进行搅拌。将细胞混合物1000rpm，离心10min，弃上清，将细胞混合物用含适量HAT的20％FBS的1640完全培养基轻轻重悬，100μl/孔将融合细胞接种到铺有饲养细胞的96孔板中，一般每次融合可接种4块96孔板。将融合细胞放入37℃，5％CO₂的培养箱中培养，第二天开始观察，有无污染，于第5天进行半量换液，第8天进行全换液。待融合细胞集落长至培养孔1/4，培养基略变黄时，进行抗体效价检测。

阳性杂交瘤细胞的筛选和克隆化

将经筛选后细胞的上清分别加入到已包被纯化伪狂犬病病毒鄂A株和纯化伪狂犬病毒gE/gI基因缺失株的抗原包被板板上，同时每板设置SP2/0培养上清做阴性对照，37℃，孵育30min，洗板5次，加入稀释后的羊抗鼠IgG，100μl/孔，37℃，孵育30min，洗板5次，每孔加入底物底物液A、B各50μl，20～25℃避光显色10min，读取OD₆₃₀值，鄂A株病毒抗原包被板包被浓度和羊抗鼠IgG稀释倍数参照免疫鼠血清效价测定试验，gE/gI基因缺失株病毒的包被浓度和羊抗鼠IgG稀释倍数的确定参照上文方法确定。当杂交瘤细胞上清OD₆₃₀大于2.1倍阴性对照OD₆₃₀时判断为阳性，小于2.1倍阴性对照OD₆₃₀时判断为阴性，当杂交瘤细胞上清鄂A株病毒抗原包被板检测结果为阳性，gE/gI基因缺失株病毒抗原包被板检测结果为阴性，则初步判断该杂交瘤细胞为阳性细胞株。选取生长状态良好，形状规则，遮光性好的阳性细胞运用有限稀释方法进行亚克隆，一般得到单克隆抗体需进行3～4次亚克隆。

单克隆抗体的阻断效果鉴定：将伪狂犬病病毒gE蛋白抗体阳性血清和阴性血清加入纯化伪狂犬病病毒鄂A株的抗原包被板中，同时加入初步筛选为阳性的杂交瘤细胞培养上清，37℃，孵育30min，洗板5次，加入稀释好的羊抗鼠IgG，37℃反应30min，洗涤5次，加入底物液显色10min，终止反应，读取每孔OD₆₃₀值，当阳性孔OD₆₃₀与阴性孔OD₆₃₀的比值大于2时，则该杂交瘤细胞分泌的抗体具有阻断效果。经反复鉴定得到一株具有阻断效果，且能稳定传代的杂交瘤细胞株，将该细胞分类命名：杂交瘤细胞株4E12，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO：C2017205，保藏日期为2017年10月17日。

单克隆抗体的生产：运用体内诱生法生产单克隆抗体，取健康的6～8周龄BALB/C雌性小鼠，在无菌条件下每只腹腔注射灭菌液体石蜡0.5ml/只，7d后，用已经扩大培养状态良好的单克隆抗体细胞进行腹腔注射。

注射用细胞的准备：将生长状态良好的4E12细胞株扩大培养，无菌条件弃掉细胞培养液，向培养瓶中加入5ml 1640基础培养基用无菌吸管将细胞吹下，将细胞悬液转移到离心管中，1000rpm，离心10min，弃上清，细胞沉淀用1640基础培养基洗2次，最后细胞用1640基础培养基调节密度，每只小鼠注射细胞量约为10⁶个，注射体积0.5ml左右为佳，注射细胞之后每天观察小鼠状态，待小鼠腹部明显增大，收集腹水，3000rpm离心10min，收集上清，-20℃保存。

腹水的纯化：腹水的纯化采用辛酸-硫酸铵法，向一体积腹水上清中加入两体积0.06mol/L(pH＝5.0)的乙酸缓冲液，用0.1mol/L的HCl调pH值至4.7。室温搅拌下在30min内逐渐滴加入正辛酸，辛酸加入量为25μl/ml，4℃静置2h，12000rpm离心30min，弃沉淀。

上清经滤纸过滤后调pH至7.4。在4℃冰浴下缓慢加入pH 7.4的饱和硫酸铵，使硫酸铵体积分数小于等于45％，搅拌30min，静置2～4h。4℃下12000r/min离心20min弃去上清。沉淀用0.01mol/L的PBS(pH＝7.4)重悬，用pH为9.0的10mmol/L Tris-Hcl透析过夜。收集抗体蛋白核酸测定仪测定其浓度为6.24mg/ml。

单克隆抗体亚类的鉴定

利用免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒(Sigma公司)对4E12单克隆抗体亚型进行鉴定，操作步骤按说明书，鉴定结果见表2，4E12亚类为IgG1。

表2单克隆抗体4E12亚类鉴定结果

亚类	IgG1	IgG2a	IgG2b	IgG3	IgM	IgA
							OD₆₃₀	1.325	0.213	0.267	0.198	0.387	0.254

纯化腹水的效价测定

用PBS对纯化腹水进行200、400、800、1600、3200、6400、12800、25600倍稀释，通过间接ELISA法对4E12纯化腹水进行效价检测，腹水OD_630nm值大于对照孔OD_630nm值2.1倍时的最大稀释倍数即为纯化效价，经测定纯化腹水效价为12800，测定结果见表3。

表3纯化腹水效价检测结果

	200	400	800	1600	3200	6400	12800	25600	对照孔
										OD₆₃₀	2.344	1.872	1.356	1.032	0.897	0.567	0.453	0.289	0.210

单克隆抗体的HRP标记：称取10mg HRP加入5ml注射用水中，加1ml新配制的NaIO₄(0.06mol/L)，2～8℃放置30分钟，溶液呈草绿色；加入0.16mol/L乙二醇1ml室温避光反应30min，终止反应；然后加入10mg纯化的4E12单克隆抗体，在pH 9.5的碳酸盐缓冲液中2～8℃透析16h；吸出后加0.4ml新配的NaBH₄(5mg/ml)，2～8℃放置2h，再加等体积的饱和硫酸铵溶液，2～8℃放置30分钟；然后8000r/min离心10min，弃上清，用8ml PBS(0.01mol/L，pH值7.4)重悬，再在PBS(0.01mol/L，pH值7.4)中2～8℃透析16小时；收集透析袋中酶标记物，用蛋白核酸浓度测定仪测标记抗体浓度，用PBS调节标记抗体浓度为5mg/ml后分装、冻存。

实施例3

试剂盒工艺参数的确定：

利用方阵滴定的方法确定纯化抗原最佳包被浓度为1:5000，酶标抗体的最佳稀释倍数为1:6000，最佳血清样品稀释倍数为5倍，最优反应时间为孵育30min、显色10min。

试剂盒判定临界值的确定：

使用IDEXX公司猪伪狂犬病病毒gE蛋白抗体检测试剂盒筛选100份阴性血清再用本试剂盒重复检测，求得其S/N平均值标准偏差S＝0.098，确定可疑区间为和之间，即待检血清S/N值低于0.6判为阳性，高于0.7判为阴性。若0.6≤S/N≤0.7则判为可疑。

实施例4试剂盒的制备

试剂盒含96孔ELISA检测板2块，抗猪伪狂犬病病毒gE蛋白酶标抗1瓶(20mL/瓶)，阴、阳性对照各1管(1.5mL/管)，样品稀释液1瓶(50mL/瓶)，20倍浓缩洗涤液1瓶(30mL/瓶)，底物液A、底物液B、终止液各1瓶(10mL/瓶)，附说明书1份。

样品稀释液：质量分数为0.1％酚红的PBS缓冲液。

20倍浓缩洗涤液：体积分数为1％Tween-20的20倍PBS缓冲液。

封闭液：含0.5％(M/V)BSA的磷酸盐缓冲液。

底物液A：含有50mg/mL过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲液。

底物液B：含有0.2mg/mL TMB pH5.0的柠檬酸钠缓冲液。

终止液：体积分数为0.25％的氢氟酸溶液。

阳性对照血清：猪伪狂犬病毒免疫的高免猪血清用0.22μm滤膜过滤除菌，加入硫柳汞钠(终浓度为0.04％)防腐，作为阳性对照。

阴性对照血清：经检测未感染过猪伪狂犬病毒的健康猪血清用0.22μm滤膜过滤除菌，加入硫柳汞钠(终浓度为0.04％)防腐，作为阴性对照。

实施例5

一种猪伪狂犬病病毒gE蛋白抗体竞争ELISA检测方法，利用实施例4的试剂盒，其步骤如下：

1)从试剂盒中取出已包被纯化病毒的抗原包被板，分别将待检血清、阴性对照、阳性对照5倍稀释后各取50μl与酶标抗体50μl同时加入抗原包被板，其中每份样品设一孔，阴性对照、阳性对照各设两孔、振荡混匀，37℃，孵育30min。

2)洗板5次，最后一次在吸水材料上拍干。

3)每孔先加底物液A 50μl、再加底物液B 50μl，混匀，室温(20～25℃)避光显色15分钟，每孔加入终止液50μl终止显色，10分钟内酶标仪读取OD₆₃₀值。

4)结果判定

在酶标仪上测各孔OD_630nm值。试验成立的条件是阴性对照孔平均OD_630nm值与阳性对照平均OD_630nm值之差≥0.3。

S＝样品孔OD_630nm值，N＝阴性对照孔平均OD_630nm值。

若S/N比值＜0.6，样品判为gE抗体阳性。

若0.6≤S/N≤0.7，样品判为可疑。该样品必须重测，如结果相同，则判为gE蛋白抗体阳性；若S/N比值＞0.7，样品判为gE抗体阴性。

实施例6

本发明试剂盒的特异性、批间及批内重复性、敏感性试验、符合率试验

1)试剂盒特异性试验：用实施例4的试剂盒分别检测猪伪狂犬(PRV-gE)、猪瘟(CSFV)、圆环(PCV)、繁殖与呼吸综合征(PRRSV)、传染性胃肠炎(PEDV)、伪狂犬gB(PRV-gB)抗体阳性血清和阴、阳性对照血清，检测结果见表4，这些数据表明本发明试剂盒特异性好，与其他血清抗体之间不存在检测交叉。

表4特异性血清检测结果

血清种类	OD值	S/N值	判定结果
				PRV	0.075	0.051	阳性
CSFV	1.324	0.911	阴性
				PCV	1.332	0.917	阴性
PRRSV	1.354	0.932	阴性
				PEDV	1.235	0.850	阴性
PRV-gB	1.335	0.919	阴性
				阴性对照	1.452
阳性对照	0.065

2)试剂盒批内重复性试验：从同一批试生产的试剂盒中随机选出5个试剂盒，在相同试验条件检测10份背景已知的血清样品，结果同批次5个试剂盒检测血清样品判定结果100％符合，变异系数均在10以内，表明本发明试剂盒批内重复性好。具体检测结果见表5。

表5试剂盒批内重复性试验结果

3)试剂盒批间重复性试验：从5批试生产的试剂盒中每批抽取1个试剂盒，检测10份背景已知的血清，结果5批试剂盒检测同血清样品判定结果100％符合，变异系数在10之内，表明本发明试剂盒批内重复性好。具体检测结果见表6。

表6试剂盒批间重复性试验结果

4)试剂盒敏感性试验：用本发明试剂盒和IDEXX猪伪狂犬病病毒gpI(gE)抗体检测试剂盒检测伪狂犬病病毒感染猪血清，检测结果见表7；2号血清，最高32倍稀释两种检测方法均为阳性，54号血清最高128倍稀释两种检测方法均为阳性，说明两种试剂盒敏感性相当。

表7试剂盒敏感性试验结果

注：IDEXX判定标准：S/N大于0.7判为阴性，S/N小于或等于0.6判为阳性。0.6＜S/N≤0.7判为可疑。自制试剂盒判断标准与IDEXX试剂盒相同。

5)试剂盒符合率试验：对180份样品采用本发明试剂盒和IDEXX猪伪狂犬病病毒gpI(gE)抗体检测试剂盒进行平行检测，检测结果见表8，本发明试剂盒检测为93份为阳性，87份为阴性；IDEXX试剂盒检测为97份为阳性，3份为可疑，80份为阴性。173份样品(93份阳性、80份阴性)检测结果一致，结果总符合率96.11％，说明本发明试剂盒与进口试剂盒符合率较高。

表8试剂盒符合率试验结果

经分析，本发明试剂盒的特异性强、敏感性高；检测方法的批间及批内重复性好、敏感性高、符合率试验优良，与进口试剂盒检测符合率达96.11％，且1h之内获得结果，大幅度缩短检测时间，检测时间仅45min，具有良好的应用前景。

以上详细描述了本发明的实施，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种猪伪狂犬病病毒gE蛋白抗体竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括辣根过氧化物酶标记的酶标抗体，所述酶标抗体为抗伪狂犬病病毒gE蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体由杂交瘤细胞株4E12分泌产生，所述杂交瘤细胞株4E12的保藏号为CCTCC NO：C2017205。

2.根据权利要求1所述的一种猪伪狂犬病病毒gE蛋白抗体竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体是由纯化的伪狂犬病病毒鄂A株为免疫原获得。

3.根据权利要求1所述的一种猪伪狂犬病病毒gE蛋白抗体竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括抗原包被板、阴性对照、阳性对照、底物液A、底物液B、终止液、样品稀释液、洗涤液；所述抗原包被板的包被抗原为纯化的灭活伪狂犬病毒。

4.根据权利要求3所述的一种猪伪狂犬病病毒gE蛋白抗体竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述抗原包被板的抗原包被浓度为1:5000，酶标抗体的稀释倍数为1:6000。

5.权利要求1~4任一项所述的一种猪伪狂犬病病毒gE蛋白抗体竞争ELISA检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括如下检测步骤：

1）从试剂盒中取出已包被纯化病毒的抗原包被板，分别将待检血清、阴性对照、阳性对照一定倍数稀释后各取50μl与所述酶标抗体50μl同时加入抗原包被板，其中每份样品设一孔，阴性对照、阳性对照各设两孔、振荡混匀，37℃孵育；

2）洗板5次，最后一次在吸水材料上拍干；

3）每孔先加底物液A 50 μl、再加底物液B 50 μl，混匀，室温避光显色，每孔加入终止液50μl终止显色，酶标仪读取 OD₆₃₀值；

4）结果判定：试验成立的条件是阴性对照孔平均OD_630nm值与阳性对照平均OD_630nm值之差≥0.3；

S=样品孔OD_630nm值，N=阴性对照孔平均OD_630nm值，若S/N比值＜0.6，样品判为gE抗体阳性，若S/N比值＞ 0.7，样品判为gE抗体阴性。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤1）所述稀释的倍数均为5倍。

7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤1）所述孵育的时间为30 min。

8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤3）所述避光显色的时间为15分钟，终止显色10分钟内读取酶标仪数值。

9.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤4）中若0.6≤ S/N ≤ 0.7，样品判为可疑；所述样品重测，如结果相同，则判为gE蛋白抗体阳性。