CN102759619A - 一种猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫试剂盒及应用，所述的试剂盒还包括抗原酶标板、稀释液A、脱脂奶粉、阳性对照、阴性对照、洗涤液、羊抗猪酶标二抗、显色液A、显色液B、终止液；抗原酶标板是以猪链球菌2型荚膜多糖作为抗原；阳性对照为猪链球菌2型菌免疫过的猪阳性对照血清；洗涤液含有Tween-20的PBS缓冲液；终止液含有氢氟酸溶液；显色液A含有过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲液，显色液B液含TMBpH5.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液；稀释液A含有Tween-20的PBS缓冲液。试剂盒在检测猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫中的应用。猪链球菌2型荚膜多糖的使用，特异性好，灵敏度高。检测时间短，一般2个小时内即可出结果。

Description

一种猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及动物疫病检测，具体涉及一种猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫试剂盒，同时还涉及一种猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫试剂盒的用途，适用于检测猪血清中的猪链球菌2型的荚膜多糖的抗体水平。

技术背景

猪链球菌（streptococcus suis）是一种能引起人、猪和其他动物感染、发病的重要致病菌。根据荚膜多糖分型，猪链球菌有35个血清型，即1/2型和1-34型（后来研究认为32和34型属于Streptococcus orisratti）。其中猪链球菌2型（SS2）是毒力最强、流行最广的血清型。国外自1968年荷兰首次报道人感染脑膜炎病例以来已有200多人因感染猪链球菌死亡。在我国，自七十年代以来该病在全国二十多个省市已发生或流行，造成了不同程度的经济损失。2005年6～8月间，四川省资阳市、内江市等地区暴发流行猪链球菌2型病，并导致204人感染，38人死亡。在其它省市也有零星发生。由此可见，该病在我国广泛存在并严重流行，已成为当前严重危害养猪业发展的一种主要疾病，不仅给养猪业造成巨大经济损失，而且给人类也造成了严重的危害。

为了有效地预防和控制猪链球菌2型病，在加强免疫预防的同时，使用特异、敏感、快速、便于操作的诊断和检测方法，为有效预防和控制猪链球菌2型的发生提供有力的手段和重要的工具。

本发明应用提取的猪链球菌2型的荚膜多糖及ELISA检测技术，使试剂盒具有很好的敏感性和特异性，能大通量的检测猪血清中的猪链球菌2型荚膜多糖的抗体。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫试剂盒，该试剂盒的优点是使用了猪链球菌2型的荚膜多糖作为抗原，使试剂盒的检测具有良好的灵敏性和特异性。

本发明的另一个目的是在于提供了一种猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫试剂盒在检测猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫中的应用，将提取的猪链球菌2型荚膜多糖作为抗原包被于聚苯乙烯微孔板上，然后加待检血清孵育，再加入羊抗猪酶标抗体（购自Southern biotechnology associates（SBA）），显色时应出现两种情况，如果待检血清是阳性，那么此时加入的羊抗猪酶标抗体就会继续与阳性血清中的抗体反应，酶标仪检测数值就会越高。如果是待检血清阴性，那么羊抗猪酶标抗体就不会与ELISA板上猪链球菌2型荚膜多糖抗原反应，得到的数值就会低。该试剂盒特异性好、敏感性高。目前国内还无同类商业化的产品。有着良好的应用前景。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫的试剂盒，包括猪链球菌2型荚膜多糖包被的抗原酶标板。

所述的试剂盒还包括抗原酶标板、稀释液A、脱脂奶粉（市售伊利奶粉）、阳性对照、阴性对照、洗涤液、羊抗猪酶标二抗、显色液A、显色液B、终止液。

所述的抗原酶标板是以猪链球菌2型荚膜多糖作为抗原，在包被聚苯乙烯微孔板时用0.1mol/L，pH9.6的碳酸氢钠溶液作为包被缓冲液。所述的猪链球菌荚膜多糖是从猪链球菌2-LT株（CCTCC NO：M2011282）中提取所得，所述的猪链球菌2-LT株已于2011年8月9日保藏在中国典型培养物保藏中心，CCTCC NO：M2011282。(专利申请号:201110234192.9)

所述的阳性对照为猪链球菌2型菌免疫过的猪阳性对照血清，所述的阴性对照为未感染过和未免疫过猪链球菌的健康猪阴性血清。

所述的洗涤液为含有0.05%（体积比）Tween-20的PBS缓冲液；所述的终止液为含0.25%体积比氢氟酸溶液。

所述的显色液A为含有50mg/mL过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲液，显色液B液为含有0.2mg/mL TMB pH5.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液。

所述的稀释液A为含有0.05%体积比Tween-20的PBS缓冲液。

一种猪链球菌2型荚膜多糖的制备方法，其制备过程是溶菌酶处理与冷酚提取相结合。具体分为两步：

一、使用改良的溶菌酶处理法（林树乾等，金黄色葡萄球菌荚膜多糖的制备及生物学特性，家畜生态学报，第27卷第6期），将灭活的猪链球菌2型菌液使用灭菌生理盐水洗三遍，再用原菌液1/10体积的0.01mol/L PBS将其重悬，加入终浓度0.1mol/L的甘氨酸，并加入终浓度3mg/L溶菌酶（购自北京普博欣生物科技有限公司），置37℃下过夜（8～10小时），室温14000r/min离心45分钟，收集上清，再加入终浓度为25％的无水乙醇和终浓度为0.1g/L的CaCl₂，置2～8℃下作用2小时，12000r/min离心10分钟，收集上清，然后加入终浓度为80％的无水乙醇，置2～8℃下作用12小时，12000r/min离心10分钟，得到的沉淀即为粗制荚膜多糖。

二、用冷酚处理法（林树乾等，金黄色葡萄球菌荚膜多糖的制备及生物学特性，家畜生态学报，第27卷第6期），将粗制多糖进行纯化。将得到的粗制多糖用10ml饱和醋酸钠重悬，加入预冷的苯酚，快速振摇30分钟，8℃4000r/min离心，收集上清液，重复三次，再将所得的的上清液装入透析袋用1mol/L的NaCl溶液透析48小时，收集透析内液，然后加入终浓度为55％的无水乙醇，置2～8℃下作用24小时，12000r/min离心10分钟，取沉淀干燥后用10mlPBS溶解，即为精制荚膜多糖。

一种猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫的试剂盒在检测猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫中的应用，其步骤是：

1）将脱脂奶粉溶于稀释液A中，使其脱脂奶粉的终浓度为5%，作为待检血清和对照血清的稀释液。

2）取抗原包被板（包被有猪链球菌2型荚膜多糖抗原的检测板），先用稀释好的洗涤液洗板2次，再将稀释好的待检血清、阴性对照血清和阳性对照血清各取100μl加入到抗原包被板孔中。待检血清设1孔，阴性对照和阳性对照各设2孔。轻轻振匀孔中样品（勿溢出），置37℃下温育30分钟。

3）弃去孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液200μl，静置3分钟后，弃去洗涤液，并在吸水纸上拍干，重复洗板5次，最后一次在吸水纸上拍干。

4）每孔加羊抗猪酶标二抗100μl，置37℃下温育30分钟后洗板5次（方法同步骤3）。

5）每孔加显色液A、显色液B各一滴（约50μL），混匀，室温（18～25℃，以下相同）避光显色10分钟。每孔加终止液一滴（约50μL），10分钟内用酶标仪测定每孔OD630nm读值。

本发明试剂盒判定标准为：在酶标仪上测各孔OD630nm值，试验成立的条件是；阳性对照孔OD630nm值均应≥0.8，且＜2.0；阴性对照孔OD630nm值均应＜0.3。如果样品OD630nm值≥0.35，判为阳性；如果样品OD630nm值＜0.35，则判为阴性。

本发明具有以下优点和效果：

1．目前国内还无同类商业化的产品

2．由于猪链球菌2型荚膜多糖的使用，特异性好，灵敏度高。

3．操作简单，检测时间短，一般2个小时内即可出结果；

附图说明

图1为一种用苯酚硫酸法测定荚膜多糖时绘制的标准曲线示意图。

图中横坐标为糖浓度，纵坐标为OD值。

图2为一种使用分光光度计对荚膜多糖进行质量检测示意图。

图中横坐标为波长，纵坐标为吸光值。

具体实施方式

为了使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的实施例。结合实施对本发明做进一步的描述和论证。但是本实施例不是对本发明的限制。

实施例1：抗原的制备

1抗原的提取

1.1细菌培养

采用TSA固体培养基传代增菌，第3代菌种以一定的接种量接种于优化的TSB优化液体培养基中，37℃下培养12～14小时，标准细菌比浊管测菌浓度至1.5×109/ml时终止培养，加入千分之五的甲醛，搅拌灭活。

1.2荚膜多糖的提取纯化

1.2.1荚膜多糖的提取

使用改良的溶菌酶处理法，将灭活的猪链球菌2型菌使用灭菌生理盐水洗三遍，再用原菌液1/10体积的0.01mol/LPBS将其重悬，加入终浓度0.1mol/L的甘氨酸，并加入终浓度3mg/L溶菌酶，置37℃下过夜（8～10小时），室温14000r/min离心45分钟，收集上清，再加入终浓度为25％的无水乙醇和终浓度为0.1g/L的CaCl2，置2～8℃下作用2小时，12000r/min离心10分钟，收集上清，然后加入终浓度为80％的无水乙醇，置2～8℃下作用12小时，12000r/min离心10分钟，得到的沉淀即为粗制荚膜多糖。

1.2.2荚膜多糖的纯化

用冷酚处理法，将粗制多糖进行纯化。将得到的粗制多糖用10ml饱和醋酸钠重悬，加入预冷的苯酚，快速振摇30分钟，8℃4000r/min离心，收集上清液，重复三次，再将所得的的上清液装入透析袋用1mol/L的NaCl溶液透析48小时，收集透析内液，然后加入终浓度为55％的无水乙醇，置2～8℃下作用24小时，12000r/min离心10分钟，取沉淀干燥后用10mlPBS溶解，即为精制荚膜多糖。

2.抗原的测定

2.1采用苯酚-硫酸法测荚膜多糖浓度，精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖1g，加入水溶解并定容至100ml容量瓶中，即得到葡萄糖贮备液，精密吸取贮备液0，2，4，6，8，10，12，14，16ml分别置100ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即为葡萄糖应用液，分别吸取上述应用液1ml于试管中，加入8%苯酚溶液1ml，混匀后迅速加入浓硫酸5ml，摇匀，40℃～50℃水浴30min，以1号管为对照管在490nm处测定，绘制出标准回归方程。

2.2利用分光光度计对提取并纯化的荚膜多糖抗原进行全波长扫描，以测定抗原里多糖的含量和纯度。

3.结果

3.1用Excel2003统计软件分析处理，根据结果得回归方程，并要求相关系数R2≥0.985。y=0.4163x+0.0024(R2=0.9987)（见图1）。

3.2荚膜多糖抗原质量检测结果

见图2所示，图谱中260和280nm处没有蛋白质和核酸的吸收峰，200nm左右吸收值很高（荚膜多糖样品稀释100倍），这是多糖的特征吸收波峰，证明获得的CPS抗原中杂蛋白质和残留的核酸含量比较低，荚膜多糖抗原纯度较高。

实施例2：抗原包被板的制备

将荚膜多糖抗原用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释为1.25μg/ml，按100μL/孔加于聚苯乙烯微孔板中，置2～8℃下包被过夜（14～18小时），次日取出，弃去孔中的抗原包被液，每孔加入120μl封闭液（见附注1）封闭，置37℃下作用1小时，弃去孔中封闭液后，再每孔加入120μl保护剂（见附注1）37℃作用1小时，弃去孔中保护剂后，拍干，再置37℃干燥2小时，用锡箔封口膜将抗原包被板密封，置2～8℃下保存。

实施例3：对照血清的制备

1．猪链球菌阳性对照血清的制备

选用4周龄健康仔猪。将猪链球菌2型（LT-1株）菌液灭活后浓缩至30亿/ml，第一次加入等量完全弗氏佐剂乳化后作为免疫原；第二次和第三次加入等量不完全弗氏佐剂乳化后作为免疫原；第四次免疫不加佐剂，直接用浓缩的灭活菌液作为免疫原，颈部肌肉注射三次，第一次2ml，第二次4ml，第三次6ml，第四次静脉注射3ml，每次免疫间隔2周。第四次免疫后10日采血，用琼脂扩散试验检测抗体效价，达到1:16以上，从颈动脉采集血液，分离血清，在血清中加入0.04％硫柳汞钠防腐，0.22μm滤膜过滤除菌，无菌分装，每管1ml，置-70℃下保存。

2．猪链球菌阴性对照血清的制备

选用4周龄健康仔猪，经猪链球菌2型琼脂扩散试验和猪链球菌2型PCR试验检测均为阴性。颈动脉采集血液，分离血清，在血清中加入0.04％（体积比）硫柳汞钠防腐，0.22μm滤膜过滤除菌。无菌分装，每管1ml，置-70℃下保存。

实施例4：试剂盒组装：

一种猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫的试剂盒，包括猪链球菌2型荚膜多糖抗原包被板。

所述的试剂盒还包括酶标板、稀释液A、脱脂奶粉、阳性对照、阴性对照、洗涤液、羊抗猪酶标二抗、显色液A、显色液B、终止液。

所述的抗原包被板是以猪链球菌2型荚膜多糖作为抗原，在包被聚苯乙烯微孔板时用0.1mol/L，pH9.6的碳酸氢钠溶液作为包被缓冲液。所述的猪链球菌荚膜多糖是从猪链球菌2-LT株（CCTCC NO：M2011282）中提取所得，所述的猪链球菌2-LT株已于2011年8月9日保藏在中国典型培养物保藏中心，CCTCC NO：M2011282。

所述的阳性对照为猪链球菌2型菌免疫过的猪阳性对照血清，所述的阴性对照为未感染过猪链球菌的健康猪阴性血清。

所述的洗涤液为含有0.05%体积比Tween-20的PBS缓冲液；所述的终止液为含0.25%体积比氢氟酸溶液。

所述的显色液A为含有50mg/mL过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲液，显色液B液为含有0.2mg/mL TMB pH5.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液。

所述的稀释液A为含有0.05%体积比Tween-20的PBS缓冲液。

试剂盒的组装含：

(1)抗原包被板      2块（96孔/块）

(2)阴性对照血清    1管（1ml/管）

(3)阳性对照血清    1管（1ml/管）

(4)羊抗猪酶标二抗  1瓶（20ml/瓶）

(5)脱脂奶粉        1管（2.5g/管）

(6)稀释液A         1瓶（50ml/瓶）

(7)底物液A         1瓶（10ml/瓶）

(8)底物液B         1瓶（10ml/瓶）

(9)终止液          1瓶（10ml/瓶）

(10)20倍浓缩洗涤液 1瓶（30ml/瓶）

(11)血清稀释板     2块

(12)说明书         1份

阳性、阴性对照的制备：

将筛选获得的猪链球菌阳性血清加入0.04％（体积比）柳硫汞防腐，0.22μm滤膜过滤除菌,。无菌分装，每管1ml，作为阳性对照；将筛选获得的猪标准阴性血清，加入0.04％（体积比）柳硫汞防腐，0.22μm滤膜过滤除菌,。无菌分装，每管1ml，作为阴性对照。

实施例5：试剂盒的应用

一种荚膜多糖抗体的酶联免疫的试剂盒在检测猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫中的应用，其步骤是：

1）将脱脂奶粉溶于稀释液A中，使其脱脂奶粉的终浓度为5%，作为待检血清和对照血清的稀释液。

2）取抗原包被板（包被有猪链球菌2型荚膜多糖抗原的检测板），先用稀释好的洗涤液洗板2次，再将稀释好的待检血清、阴性对照血清和阳性对照血清各取100μl加入到抗原包被板孔中。待检血清设1孔，阴性对照和阳性对照各设2孔。轻轻振匀孔中样品（勿溢出），置37℃下温育30分钟。

3）弃去孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液200μl，静置3分钟后，弃去洗涤液，并在吸水纸上拍干，重复洗板5次，最后一次在吸水纸上拍干。

4）每孔加羊抗猪酶标二抗100μl，置37℃下温育30分钟后洗板5次（方法同步骤3）。

5）每孔加显色液A、显色液B各一滴（约50μL），混匀，室温（18～25℃，以下相同）避光显色10分钟。每孔加终止液一滴（约50μL），10分钟内用酶标仪测定每孔OD630nm读值。

应用中所使用效果实验的情况如下：

1特异性试验：

将我国猪主要病毒病（PRV、PPV、HCV、PRRSV、FMDV）阳性血清用猪链球菌2型荚膜多糖抗体检测试剂盒检测，检测结果全部为阴性（表1）。

表1我国猪主要病毒病抗血清的检测结果

将我国猪主要病原菌阳性血清（APP、HPS、C群链球菌病阳性血清）用猪链球菌2型荚膜多昂抗体检测试剂盒检测，检测结果全部为阴性（表2）。

表2我国猪主要病原菌抗血清的检测结果

2、敏感性的检测：

将10份不同的猪链球菌阳性血清1:5、1:10～1:1280连续倍比稀释后用猪链球菌2型荚膜多糖抗体检测试剂盒检测，从表3中可以看出，试剂盒敏感性良好。

表3不同稀释倍数的阳性血清检测结果

Claims (3)

1.一种猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫试剂盒，包括猪链球菌2型荚膜多糖包被的抗原酶标板，其特征在于：所述的试剂盒还包括抗原酶标板、稀释液A、脱脂奶粉、阳性对照、阴性对照、洗涤液、羊抗猪酶标二抗、显色液A、显色液B、终止液；

所述的抗原酶标板是以猪链球菌2型荚膜多糖作为抗原，在包被聚苯乙烯微孔板时用0.1mol/L，pH9.6的碳酸氢钠溶液作为包被缓冲液；

所述的阳性对照为猪链球菌2型菌免疫过的猪阳性对照血清；

所述的阴性对照为未感染过和未免疫过猪链球菌的健康猪阴性血清；

所述的洗涤液为含有0.05%体积比Tween-20的PBS缓冲液；

所述的终止液为含0.25%体积比氢氟酸溶液；

所述的显色液A为含有50mg/mL过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲液，显色液B液为含有0.2mg/mL TMB pH5.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液；

所述的稀释液A为含有0.05%体积比Tween-20的PBS缓冲液。

2.根据权利要求1所述的一种猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的猪链球菌2型荚膜多糖的制备方法，其步骤是：

A、使用改良的溶菌酶处理法，将灭活的猪链球菌2型菌使用灭菌生理盐水洗三遍，再用原菌液1/10体积的0.01mol/L PBS将其重悬，加入终浓度0.1mol/L的甘氨酸，并加入终浓度3mg/L溶菌酶，置37℃下过夜8～10小时，室温14000r/min离心45分钟，收集上清，再加入终浓度为25％的无水乙醇和终浓度为0.1g/L的 CaCl₂，置2～8℃下作用2小时，12000r/min离心10分钟，收集上清，然后加入终浓度为80％的无水乙醇，置2～8℃下作用12小时，12000r/min离心10分钟，得到的沉淀即为粗制荚膜多糖；

B、用冷酚处理法，将粗制多糖进行纯化，将得到的粗制多糖用10ml饱和醋酸钠重悬，加入预冷的苯酚，振摇30分钟，8℃4000r/min离心，收集上清液，重复三次，再将所得的的上清液装入透析袋用1mol/L的NaCl溶液透析48小时，收集透析内液，然后加入终浓度为55％的无水乙醇，置2～8℃下作用24小时，12000r/min离心10分钟，取沉淀干燥后用10mlPBS溶解，为荚膜多糖。

3.权利要求1所述的一种猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫的试剂盒在检测猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫中的应用。

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