CN102352374A - 一种蓝藻整合型穿梭表达载体及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种蓝藻整合型穿梭表达载体及其构建方法，包含整合片段F1、蓝藻启动子PpsbAl、筛选标记基因nptII和整合片段F2，所述载体序列上游至下游的方向依次为整合片段F1、蓝藻启动子PpsbAl、筛选标记基因nptII和整合片段F2，具体序列见序列表。本发明中pAnFP整合型穿梭表达载体能够直接与蓝藻染色体DNA同源位点重组，将外源基因定位整合到染色体DNA上，可在蓝藻细胞中稳定表达，避免质粒复制丢失的问题。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，尤其是一种蓝藻整合型穿梭表达载体及其构建方法。
背景技术
蓝藻生长只需光照、空气和无机盐，自身不含毒蛋白，一旦外源目的基因能在蓝藻受体细胞中正常表达，在光照下就可生产目的基因的产物。蓝藻可作为外源基因的表达宿主，与常用的表达宿主如大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞宿主相比，蓝藻具有环境适应能力强、培养成本低、不形成包含体、不含内毒素、本身含有对人类有益的营养成分等优点。因此，蓝藻在食品、环境、健康和能源方面的作用越来越受到人们的重视，具有很大的开发前景。
蓝藻基因工程主要研究来源于蓝藻目的基因的克隆、向蓝藻中转移外源基因、所需载体平台的构建、基因转移方法和检测方法的建立等，其中，载体的构建是藻类基因工程的关键所在，是影响外源基因表达稳定性和表达效果的重要因素，常用的载体主要有两类，表达载体和整合型表达载体。表达载体的构建及完善大大推动了蓝藻基因工程的基础研究和应用研究。目前表达载体在蓝藻细胞中的表达中不是很稳定，容易丢失。构建整合型表达载体可定位整合到受体细胞染色体DNA的同源重组位点上，稳定地随染色体DNA的复制而遗传，并在染色体上原有的调控元件或外源基因表达单元自带的调控元件作用下表达。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种蓝藻整合型穿梭表达载体及其构建方法，本发明所述蓝藻整合型表达载体是一种环状载体，包含整合片段、筛选标记基因和外源基因表达元件等组成部分。
本发明实现目的的技术方案如下：
一种蓝藻整合型穿梭表达载体，包含整合片段F1、蓝藻启动子PpsbAl、筛选标记基因nptII和整合片段F2，所述载体序列上游至下游的方向依次为整合片段F1、蓝藻启动子PpsbAl、筛选标记基因nptII和整合片段F2，具体序列见序列5。
而且，所述外源片段***位点为NdeI/ClaI位于649-667bp之间，具体为“CATATGGGGATCCATCGAT”。
而且，所述蓝藻载体序列部分来自于克隆载体pBluescript II SK(+)。
而且，所述同源重组整合片段为F1和F2，来自于鱼腥藻7120 Anabaena sp.PCC 7120基因组DNA序列第4654703-4655672位点，是ORFs alr3857和alr3858之间的非编码区。
而且，所述筛选标记基因为带有专用启动子的新霉素磷酸转移酶NeomycinPhosphotransferase II基因nptII，该酶表现卡那霉素抗性。
而且，所述蓝藻启动子PpsbAl来自鱼腥藻7120光***II的D1蛋白质强启动子序列。
一种蓝藻整合型穿梭表达载体的构建方法，步骤如下：
(1)以鱼腥藻7120的基因组DNA为模板，用F1引物1和2进行PCR扩增，得到整合片段F1片段；
(2)以鱼腥藻7120的基因组DNA为模板，用F2引物3和4进行PCR扩增，得到整合片段F2片段；
(3)以鱼腥藻7120的基因组DNA为模板，用PpsbAl引物5和6进行PCR扩增，得到蓝藻启动子PpsbAl片段；
(4)以pET30载体为模板，用nptII基因引物7和8进行PCR扩增，得到筛选标记基因nptII片段；
(5)载体pPpsbAl-F2的构建：依次将整合片段F2、蓝藻启动子PpsbAl导入大肠杆菌受体细胞中，获得的克隆重组质粒PTF2和pTPpsbAl，用XbaI+BamHI双酶切，纯化回收后进行连接，将F2***到自连的pTPpsbAl载体中获得pPpsbAl-F2载体；
(6)载体pF1-PpsbAl-F2的构建：将F1导入大肠杆菌受体细胞中，获得的克隆重组质粒PTF1，用XbaI+PstI双酶切质粒pPpsbAl-F2和PTF1后，将pPpsbAl-F2连接到载体PTF1上，获得pF1-PpsbAl-F2载体。
(7)载体pAnFP的构建：将nptII导入大肠杆菌受体细胞中，获得的克隆重组质粒pTnptII，用BamHI分别酶切质粒pF1-PpsbAl-F2和pTnptII，纯化回收后进行连接，将nptII***到pF1-PpsbAl-F2载体中获得pF1-PpsbAl-nptII-F2载体即pAnFP载体。
一种含有蓝藻整合型穿梭表达载体的全序列，其特征在于：序列见序列16。
本发明的有益效果和优点是：
本发明的优点和积极效果如下：
1、本发明中pAnFP整合型表达穿梭载体能够直接与蓝藻染色体DNA同源位点重组，将外源基因定位整合到染色体DNA上，可在蓝藻细胞中稳定表达，避免质粒复制丢失的问题。
2、本发明的整个基因重组和表达过程操作简单，实验周期短，重组效率高，能够快速高效地构建蓝藻整合型穿梭表达载体并实现外源基因的稳定表达，具有很好的应用前景，可为产业化开发转基因蓝藻开辟一条新途径。
3、本发明的蓝藻整合型穿梭表达载体pAnFP，可运用三亲接合转移方法和基因整合平台***进行外源基因表达。
附图说明
图1为本发明提供的整合型表达载体pAnFP的表达元件盒示意图，包括同源重组序列F1和F2，蓝藻特异启动子PpsbAI序列，筛选标记基因nptII，以及外源基因***位点的限制性内切酶种类；
图2为本发明提供的整合型表达载体pAnFP的构建方法流程示意图；
图3-A到图3-E为本发明提供的整合型表达载体pAnFP构建方法及应用的一个实施例的鉴定结果，其中图3-A、图3-B为载体pTPpsbAl-F2的鉴定结果；图3-C为载体pTF1-PpsbAl-F2的鉴定结果；图3-D为载体pAnFP的鉴定结果；图3-E为载体pAnFP-gfp的鉴定结果；
图4为本发明提供的整合型表达载体pAnFP构建方法及应用的一个实施例的表达绿色荧光蛋白GFP的荧光显微镜观察结果。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
一种蓝藻整合型穿梭表达载体，命名为pAnFP，包含整合片段F1、蓝藻启动子PpsbAl、外源基因***位点和筛选标记基因nptII、整合片段F2；所述载体序列上游至下游的方向依次为整合片段F1、蓝藻启动子PpsbAl、外源基因***位点(下划线)、筛选标记基因nptII和整合片段F2，序列见序列表，起顺序均为5’-3’。外源片段***位点为NdeI/ClaI位于649-667bp之间，见划线处，具体为“CATATGGGGATCCATCGAT”，外源基因***位点为内切酶NdeI/ClaI的位置。
其中，所述蓝藻载体序列部分来自于克隆载体pBluescript II SK(+)；所述同源重组整合片段为F1和F2，来自于鱼腥藻7120(Anabaena sp.PCC 7120)基因组DNA序列第4654703-4655672位点，是ORFs alr3857和alr3858之间的非编码区；所述筛选标记基因为带有专用启动子的新霉素磷酸转移酶(Neomycin Phosphotransferase II)基因nptII，该酶表现卡那霉素抗性；所述蓝藻启动子PpsbAl来自鱼腥藻7120光***II的D1蛋白质强启动子序列。
一种蓝藻整合型穿梭表达载体的构建方法，包括如下步骤：参考表1、图1和图2，
(1)以鱼腥藻7120的基因组DNA为模板，用F1引物1和2进行PCR扩增，得到整合片段F1片段；
(2)以鱼腥藻7120的基因组DNA为模板，用F2引物3和4进行PCR扩增，得到整合片段F2片段；
(3)以鱼腥藻7120的基因组DNA为模板，用PpsbAl引物5和6进行PCR扩增，得到蓝藻启动子PpsbAl片段；
(4)以pET30载体为模板，用nptII基因引物7和8进行PCR扩增，得到筛选标记基因nptII片段；
(5)载体pPpsbAl-F2的构建：依次将整合片段F2、蓝藻启动子PpsbAl导入大肠杆菌受体细胞中，获得的克隆重组质粒PTF2和pTPpsbAl，用XbaI+BamHI双酶切，纯化回收后进行连接，将F2***到自连的pTPpsbAl载体中获得pPpsbAl-F2载体。
(6)载体pF1-PpsbAl-F2的构建：将F1导入大肠杆菌受体细胞中，获得的克隆重组质粒PTF1，用XbaI+PstI双酶切质粒pPpsbAl-F2和PTF1后，将pPpsbAl-F2连接到载体PTF1上，获得pF1-PpsbAl-F2载体；
(7)载体pAnFP的构建：将nptII导入大肠杆菌受体细胞中，获得的克隆重组质粒pTnptII，用BamHI分别酶切质粒pF1-PpsbAl-F2和pTnptII，纯化回收后进行连接，将nptII***到pF1-PpsbAl-F2载体中获得pF1-PpsbAl-nptII-F2载体即pAnFP载体；
(8)上述各载体的酶切鉴定结果见图3。用BamHI+XbaI双酶切，经琼脂糖凝胶电泳得到F2片段和载体pBS-T(见图3-A)；用XbaI+PstI双酶切，经琼脂糖凝胶电泳得到PpsbA1+F2片段和载体pBS-T(见图3-B)；分别用EcoRI+PstI、BamHI+XbaI和PstI+BamHI双酶切，经琼脂糖凝胶电泳检测，泳道1、2和3分别为F1、F2、PpsbAl片段和载体pBS-T(见图3-C)；分别用XbaI+PstI、BamHI+XbaI、PstI+BamHI和BamHI酶切，经琼脂糖凝胶电泳检测，泳道1、2、3和4分别为F1、F2、PpsbAl、nptII片段和载体pBS-T(见图3-D)；用NdeI+ClaI双酶切，经琼脂糖凝胶电泳检测，得到gfp片段和载体pAnFP(见图3-E)。
应用实施例
本实施例提供的整合型表达载体pAnFP在鱼腥藻7120中表达绿色荧光蛋白GFP的具体步骤如下：
(1)以含有gfp基因的pART27为模板，用引物9和10进行PCR扩增，得到片段gfp；
(2)载体pAnFP-gfp的构建：通过NdeI+ClaI双酶切载体pAnFP，将gfp片段***载体pAnFP中(见图3)，用NdeI+ClaI双酶切鉴定载体pAnFP-gfp，经过琼脂糖凝胶电泳检测gfp的正确连接(见图3E)；
(3)载体pAnFP-gfp用CaCl2法转化感受态大肠杆菌，用三亲接合转化鱼腥藻7120。每管感受态细胞中加入5ul连接液，轻弹混匀，冰浴30min，42℃热休克90sec，冰浴3min使体系冷却，加入温浴至37℃的LB培养液，150rpm振荡45min。
取适量菌液铺于含相应抗生素的LB平板上，待平板表面干燥后，倒置培养过夜。鱼腥藻7120培养在BG-11负氮培养基中，温度27℃，pH 7.2，液体培养时摇床转速为130r/min。经过三亲接合转化，在含有卡那霉素的培养液中筛选具有抗性的转基因鱼腥藻7120；
上述连接液购自Takara生物公司的商品化试剂：2×T4 DNA Rapid Ligation Buffer，用量一般为5ul(以10ul反应体系为例)。
三亲接合转化方法具体如下：
(1)大肠杆菌的准备：在含有相应抗生素的LB培养液中接种含有穿梭表达载体的大肠杆菌及含有接合质粒RP4和辅助质粒pRL623的大肠杆菌，摇菌过夜。离心收菌，用普通LB培养液洗，用适量LB培养液重悬。等体积混合两种菌液；
(2)蓝藻的准备：取对数生长早期(OD665＝0.4)蓝藻培养物，离心收集细胞，用培养液洗涤，再以适当体积的培养液悬浮藻细胞；
(3)接合转化：将藻细胞与细菌以适当的比例混合均匀，轻轻地将其涂于无抗生素的含滤膜的LB固体培养基上，尽量使滤膜上的混合液均匀，正置平板使液体完全渗入培养基中，倒置光照培养使蓝藻表达抗性，小心地转移滤膜到含有相应抗生素的平板上，继续照光培养直至出现阳性克隆。
(4)荧光显微镜检测绿色荧光蛋白的表达。荧光显微镜结果如图4所示，在488nm光激发作用下，绿色荧光蛋白发出绿色荧光。转gfp基因鱼腥藻7120出现绿色荧光，表明有绿色荧光蛋白表达，而且表达的蛋白具有生物活性。
表1是本发明提供的整合型表达载体pAnFP构建涉及的基因特异性引物。包括F1的引物1、2；F2的引物3、4；PpsbAl的引物5、6；基因nptII的引物7、8；基因gfp的引物9、10。
表达元件序列可以将外源基因整合至染色体上。具体应用时，需要将它与“其他序列”组成融合载体进行功能的体现，如本例就是将这个表达元件序列与pBluescript II SK(+)载体组合来表达外源基因。
上述的“其他序列”就是商品化克隆或表达载体，这些载体只有在多克隆位点***外源片段-包括基因或表达元件序列才能表现出载体功能，如果没有外源片段***，就是空载体，不会表达任何功能。本例的表达元件序列***pBluescript II SK(+)载体形成一个新功能的整合表达载体，pBluescript II SK(+)载体使用非常广泛，许多新载体都是以它为出发载体构建新的功能载体。
表达元件序列与“其他序列”的连接通过EcoRI和XbaI，它们分别位于表达元件的两端，即F1的5’-端EcoRI位点和F2的3’-端XbaI位点。表1中已经列出。
表1
1、整合型表达载体pAnFP的表达元件序列(2077bp)，外源片段***位点为NdeI/ClaI(位于649-667bp之间，见划线处)
5’-TATTATTGTTTACTCTACGCTTTACATAGAAATTGTGAAAAGCTCTTTTCCAGACGCTTAGAACTTAGGGACAAAAATGATTTCTGGATACTTGCGCTCACCGTGTAGTACGTTTCCAGTGGCAATTGTTCAGTCTGTAGCAGATATTCAAACTGATTGACTTTACGACTGAACAGCTTGATAGGCTTAGATAGTATTGCTATTAAGTTTCAGTTTGGTCACAAAAAGTAACAAATTAATTAATCAGTCAGATTTTTATTCCTTTGTTATCTTTAAATTTTCGCATCAATAAATAACACAGATAGGAGTTGACTTTGATTTCTGTTGGCGCAGTGTGGCATAGCTATAGGTACTTGTGTATCTAGGGGATGGTCACTCCTTCACCAACAAAATTTAAATGGGATGCCTTATGGAAGTCTAATTGTATGGTTAGAGTTGTAATTATCCCCAATTTTGAAACCTATCAACTATATTATTAACTTTAGAGTAATTTTAACATCTCGGTGTCAATTGTCATGCGGATAACATTTATGTACTCAGCCGAAAAATTTTACTTACTTCGCTTGACAACTATATTATTATAAAGTTATATATGATTGTAAGACAAGTTACACCCTTGTCGGTTGATATTCAAAGCAATCATAAAAACATATGGGGATCCATCGATACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCTAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAACTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAAGAATTAATTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGGCAGTGAAGACTTGCCATAACCTATATTTCTCGCATGAAGTAATCTGCTGAGAACTATGAGTTGTGTAATATATTGTATTTTTATTAAGTGTAGGTTTAATTGCATAGAGTTAGCCGTTAGAACTAATTATCCCAGAATAGATACCTCAAATTCTCAGTAGCAGAAATTAAATAGATAACAAAATATACAAAATGCCTTCAGTATTTAAAACTTCTTCTCAGAAGACAAACACAGTTAGTAACCAGATGAATAACTCATCAAAATCATCAACAGAAGTATTAGCTGTGTCTCCTGCATCCCAAAGGTATACTATGCAAAAATTGCCATGTAGAGACAATATTAATAAGTTGTGGAAGTTATACAGATCAATTTTAAGTAAATGTATGTATACTTCTCTAGAATTAGCTGTGCATTCACCTATGGTGAGCC-3’
2、整合型表达载体pAnFP全序列(5014bp)，划线处为表达元件序列(707bp-2783bp，共2077bp)
5’-CTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAGCGCGCGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCTATTATTGTTTACTCTACGCTTTACATAGAAAT TGTGAAAAGCTCTTTTCCAGACGCTTAGAACTTAGGGACAAAAATGATTTCTGGATACTTGCGCTCAC CGTGTAGTACGTTTCCAGTGGCAATTGTTCAGTCTGTAGCAGATATTCAAACTGATTGACTTTACGACT GAACAGCTTGATAGGCTTAGATAGTATTGCTATTAAGTTTCAGTTTGGTCACAAAAAGTAACAAATTAA 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Claims (8)
1.一种蓝藻整合型穿梭表达载体，其特征在于：包含整合片段F1、蓝藻启动子PpsbAl、筛选标记基因nptII和整合片段F2，所述载体序列上游至下游的方向依次为整合片段F1、蓝藻启动子PpsbAl、筛选标记基因nptII和整合片段F2，具体序列见序列5。
2.根据权利要求1所述的蓝藻整合型穿梭表达载体，其特征在于：所述外源片段***位点为NdeI/ClaI位于649-667bp之间，具体为“CATATGGGGATCCATCGAT”。
3.根据权利要求1所述的蓝藻整合型穿梭表达载体，其特征在于：所述蓝藻载体序列部分来自于克隆载体pBluescript II SK(+)。
4.根据权利要求1所述的蓝藻整合型穿梭表达载体，其特征在于：所述同源重组整合片段为F1和F2，来自于鱼腥藻7120 Anabaena sp.PCC 7120基因组DNA序列第4654703-4655672位点，是ORFs alr3857和alr3858之间的非编码区。
5.根据权利要求1所述的蓝藻整合型穿梭表达载体，其特征在于：所述筛选标记基因为带有专用启动子的新霉素磷酸转移酶Neomycin Phosphotransferase II基因nptII，该酶表现卡那霉素抗性。
6.根据权利要求1所述的蓝藻整合型穿梭表达载体，其特征在于：所述蓝藻启动子PpsbAl来自鱼腥藻7120光***II的D1蛋白质强启动子序列。
7.一种如权利要求1所述的蓝藻整合型穿梭表达载体的构建方法，其特征在于：步骤如下：
(1)以鱼腥藻7120的基因组DNA为模板，用F1引物1和2进行PCR扩增，得到整合片段F1片段；
(2)以鱼腥藻7120的基因组DNA为模板，用F2引物3和4进行PCR扩增，得到整合片段F2片段；
(3)以鱼腥藻7120的基因组DNA为模板，用PpsbAl引物5和6进行PCR扩增，得到蓝藻启动子PpsbAl片段；
(4)以pET30载体为模板，用nptII基因引物7和8进行PCR扩增，得到筛选标记基因nptII片段；
(5)载体pPpsbAl-F2的构建：依次将整合片段F2、蓝藻启动子PpsbAl导入大肠杆菌受体细胞中，获得的克隆重组质粒PTF2和pTPpsbAl，用XbaI+BamHI双酶切，纯化回收后进行连接，将F2***到自连的pTPpsbAl载体中获得pPpsbAl-F2载体；
(6)载体pF1-PpsbAl-F2的构建：将F1导入大肠杆菌受体细胞中，获得的克隆重组质粒PTF1，用XbaI+PstI双酶切质粒pPpsbAl-F2和PTF1后，将pPpsbAl-F2连接到载体PTF1上，获得pF1-PpsbAl-F2载体。
(7)载体pAnFP的构建：将nptII导入大肠杆菌受体细胞中，获得的克隆重组质粒pTnptII，用BamHI分别酶切质粒pF1-PpsbAl-F2和pTnptII，纯化回收后进行连接，将nptII***到pF1-PpsbAl-F2载体中获得pF 1-PpsbAl-nptII-F2载体即pAnFP载体。
8.一种含有如权利要求1所述的蓝藻整合型穿梭表达载体的全序列，其特征在于：序列见序列16。
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Citations (4)
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|---|---|---|---|---|
| JPH07123980A (ja) * | 1993-11-09 | 1995-05-16 | Sekisui Chem Co Ltd | シャトルベクター |
| CN1285409A (zh) * | 2000-09-29 | 2001-02-28 | 厦门大学 | 一种蓝藻穿梭质粒表达载体及其用于表达胸腺素α1的方法 |
| CN1285407A (zh) * | 2000-09-29 | 2001-02-28 | 厦门大学 | 热休克诱导外源基因高效表达的蓝藻转基因表达***及其用于表达胸腺素α1的方法 |
| US20100192258A1 (en) * | 2008-12-18 | 2010-07-29 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Enzyme Directed Oil Biosynthesis In Microalgae |
-
2011
- 2011-10-20 CN CN201110319828XA patent/CN102352374A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07123980A (ja) * | 1993-11-09 | 1995-05-16 | Sekisui Chem Co Ltd | シャトルベクター |
| CN1285409A (zh) * | 2000-09-29 | 2001-02-28 | 厦门大学 | 一种蓝藻穿梭质粒表达载体及其用于表达胸腺素α1的方法 |
| CN1285407A (zh) * | 2000-09-29 | 2001-02-28 | 厦门大学 | 热休克诱导外源基因高效表达的蓝藻转基因表达***及其用于表达胸腺素α1的方法 |
| US20100192258A1 (en) * | 2008-12-18 | 2010-07-29 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Enzyme Directed Oil Biosynthesis In Microalgae |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 宋东辉等: "Construction of integrative expression shuttle vectors for cyanobacteria using the special promoter sequence psbA1 and the reporter gene system gfp", 《PROCCEEDINGS OF 2010 FIRST INTERNATIONAL CONFERENCE ON CELLULAR, MOLECULAR BIOLOGY, BIOPHYSICS AND BIOENGINEERING》, no. 2, 31 December 2010 (2010-12-31), pages 296 - 299 * |
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