CN111269926B

CN111269926B - 一种钴离子诱导型蛋白表达***及应用

Info

Publication number: CN111269926B
Application number: CN201911414867.0A
Authority: CN
Inventors: 周哲敏; 崔文璟; 韩来闯; 程中一; 林巧; 陈巧青; 索菲娅; 周丽; 刘中美
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2021-09-28
Anticipated expiration: 2039-12-31
Also published as: CN111269926A

Abstract

本发明公开了一种钴离子诱导型蛋白表达***及应用，属于生物工程技术领域。本发明通过将响应钴离子的阻遏蛋白RcnR及其操纵序列rcnO与来源于枯草芽孢杆菌的强启动子P_veg构建在一起，得到了钴离子诱导型高效基因表达***。当利用该***表达腈水合酶时，以500μM钴离子作为诱导剂，酶活最高达到106.2±4.6U/mL，接近使用IPTG诱导***的水平(121.4±4.0U/mL)。在利用该钴离子诱导型***表达腈水合酶过程中，钴离子同时作为腈水合酶的诱导剂和金属配体，不需要额外添加化学诱导剂，降低了生产成本，简化了生产工艺。

Description

一种钴离子诱导型蛋白表达***及应用

技术领域

本发明涉及一种钴离子诱导型蛋白表达***及应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

诱导型外源基因表达载体在蛋白质表达，尤其是工业酶制剂生产方面有广泛应用。目前诱导型表达载体较为广泛使用的有基于lac操纵子构建的由乳糖或者异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的表达***、基于ara操纵子构建的由***糖诱导的表达***以及基于xyl操纵子构建的由木糖诱导的表达***。不过，诱导型的表达***种类依然很少，性能依然不能满足大规模工业生产的要求，并且外源添加的诱导剂会大幅度提高生产成本，因此，开发经济、高效、更多诱导剂种类选择的外源蛋白表达载体对酶工程领域依然十分重要。

腈水合酶是催化腈类物质生成酰胺类物质的金属酶，在工业生产上应用广泛，主要用于丙烯酰胺和烟酰胺的生产。腈水合酶可由其活性中心所含金属离子的不同分为钴型腈水合酶和铁型腈水合酶。目前第三代腈水合酶生产工业菌株是红球菌Rhodococcusrhodochrous J1，通常使用异戊腈作为诱导剂，主要生产钴型腈水合酶。随着近年来基因工程技术的日益发展，在大肠杆菌等模式表达宿主中构建腈水合酶异源表达***无论在成产成本、产量还是在成产工艺的可操作性上都显现出了巨大的优势。

大肠杆菌生长速度快、易于培养、发酵工艺简单、蛋白表达量高，这些特点使得利用大肠杆菌生产腈水合酶可以显著提高其产量，并降低生产成本，具有巨大的工业应用前景。目前，使用IPTG作为诱导剂的腈水合酶高效表达***已经在大肠杆菌中构建成功并实际应用。但是在发酵生产钴型腈水合酶过程中，需要加入IPTG作为诱导剂表达蛋白，同时加入一定浓度的钴离子以激活腈水合酶的活性。而IPTG作为人工合成的乳糖类似物，价格较高，造成腈水合酶的生产成本较高。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种利用钴离子同时作为基因表达诱导剂和腈水合酶配体的高效的腈水合酶表达***。鉴于启动子是基因工程表达载体的重要元件，对外源基因表达水平有较大的影响，本发明将大肠杆菌Co/Ni调控***的rcn组分构建到强启动子上，从而构建人工的由钴离子诱导调控的外源蛋白表达载体。该方法构建的表达***既避免了在腈水合酶诱导表达的过程中添加额外的诱导剂，降低生产成本，同时又实现了腈水合酶的高效表达。

本发明的第一个目的是提供一种受钴离子诱导的表达载体，是将钴离子响应的阻遏蛋白RcnR、受阻遏蛋白RcnR调控的启动子与载体连接而成；所述受阻遏蛋白RcnR调控的启动子包括将阻遏蛋白RcnR的操纵序列rcnO连接到启动子P_veg下游构建得到的启动子；所述阻遏蛋白RcnR的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

在本发明的一种实施方式中，所述操纵序列rcnO的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述启动子P_veg的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述阻遏蛋白RcnR的基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述载体为pET28a(+)。

本发明的第二个目的是提供一种钴离子诱导蛋白表达的基因工程菌，是以上述表达载体为表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是以大肠杆菌为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌表达腈水合酶，编码所述腈水合酶的基因由融合的α/β亚基基因、编码调控蛋白P的基因组成；所述融合的α/β亚基基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述编码调控蛋白P的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明的第三个目的是提供一种生产腈水合酶的方法，是应用上述基因工程菌进行发酵，在钴离子诱导下表达蛋白。

在本发明的一种实施方式中，将上述基因工程菌在LB平板上划线，挑取单菌落在LB培养基中200-220rpm，35-39℃培养8-14h；按1-5％接种量将培养物转入LB培养基中200-220rpm，35-39℃培养至OD₆₀₀＝0.4-0.6；加入钴离子后，温度降低至20-25℃进行蛋白表达。

在本发明的一种实施方式中，钴离子添加浓度为400-600μM。

本发明的第四个目的是提供所述表达载体在生产含腈水合酶的产品方面的应用。

有益效果：本发明通过将响应钴离子的阻遏蛋白RcnR及其操纵序列rcnO与来源于枯草芽孢杆菌的强启动子P_veg构建在一起，得到了钴离子诱导型高效基因表达***。首先利用绿色荧光蛋白GFP验证***性能，发现该***可受钴离子诱导，并可高效表达外源蛋白。当利用该***表达腈水合酶时，以500μM钴离子作为诱导剂，酶活达到106.2±4.6U/mL，接近使用IPTG诱导***的水平(121.4±4.0U/mL)。在利用该钴离子诱导型***表达腈水合酶过程中，钴离子同时作为腈水合酶的诱导剂和金属配体，不需要额外添加化学诱导剂，降低了生产成本，简化了生产工艺。

附图说明

图1：钴离子诱导型表达***的构建,a：钴离子诱导型***构建示意图；b：钴离子(100μM)诱导GFP表达曲线；c：诱导剂特异性检测。

图2：钴离子诱导型表达***表征，a：不同钴离子浓度对细胞密度的影响；b：不同钴离子浓度对GFP表达量的影响。

图3：钴离子诱导型***表达腈水合酶构建示意图。

图4：钴离子浓度对腈水合酶酶活的影响。

图5：钴离子浓度对细胞密度的影响。

图6：不同时间下钴离子诱导型***表达腈水合酶的酶活和细胞密度。

图7：钴离子诱导型***表达腈水合酶生长曲线和酶活检测。

图8：IPTG诱导型***表达腈水合酶生长曲线和酶活检测。

具体实施方式

1、GFP荧光强度的检测方法：样品12000×g离心2min，收集菌体，PBS缓冲液洗3次，用PBS稀释到一定浓度的菌体悬液，取200μL至96孔黑壁透明底酶标板，放入SynergyTM H4荧光酶标仪检测荧光。激发光495nm，吸收光525nm，检测荧光。

2、腈水合酶酶活检测方法：

在1.5mL的EP管中进行反应。反应体系：10μL培养液加入490μL含有200mM烟腈10mM的磷酸缓冲溶液中，26℃反应10min，加入500μL的乙腈终止反应。过0.22μm的膜后，C18柱经HPLC测其酶活，流动相是为乙腈和水(水：乙腈＝2:1)的混合液，检测波长为220nm，检测温度为40℃，流动相流速为0.6mL/min，进样量10μL，检测时间10min，每组实验数据至少重复3次。

3、培养基：LB培养基(L^-1)：胰蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母提取物5g，pH 7.0，配制固体培养基时添加琼脂粉20g。

4、诱导表达GFP培养条件：重组菌种从-80℃冰箱中取出，在含有相应抗性的LB平板上划线，挑取单菌落在含有5mL LB培养基的试管中200rpm，37℃过夜(8-14h)培养。之后按2％接种量转入含有50mL LB培养基的250mL摇瓶中培养。加入诱导剂后，37℃，200rpm继续培养。

5、诱导表达腈水合酶培养条件：重组菌种从-80℃冰箱中取出，在含有相应抗性的LB平板上划线，挑取单菌落在含有5mL LB培养基的试管中200rpm，37℃过夜(8-14h)培养。之后按2％接种量转入含有50mL LB培养基的250mL摇瓶中37℃，200rpm培养。加入诱导剂后，温度降低至24℃进行蛋白表达。

6、本发明中质粒构建步骤为：(1)以钴离子响应的阻遏蛋白RcnR和受该阻遏蛋白调控的人工构建的启动子与载体连接，得到含有响应钴离子的基因表达调控元件的质粒；(2)将质粒与外源基因连接，得到含有钴离子的基因表达调控元件的质粒_外源基因；(3)将质粒_外源基因转化到细菌细胞中。

实施例1：钴离子诱导型表达***构建

首先，以Ppet-gfp-i1和Ppet-gfp-i2(表2)为引物，以pBSG03(公开于C.Guan,W.Cui,J.Cheng,L.Zhou,J.Guo,X.Hu,G.Xiao,Z.Zhou,Construction and development ofan auto-regulatory gene expression system in Bacillus subtilis,Microb.CellFact.14(2015))为模板，扩增绿色荧光蛋白GFP基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)；以Ppet-gfp-v1和Ppet-gfp-v2为引物，以pET28a(+)质粒为模板，扩增载体骨架，将上述两扩增片段GFP基因和载体骨架通过Gibson Assembly方法连接在一起，构建成质粒pET28a-GFP。

然后，以Pev-1和Pev-2为引物，以pET28a-GFP为模板进行扩增，将表达GFP的启动子替换为P_veg，构建质粒pEV-GFP。再以Pveg-rcnO-1和Pveg-rcnO-2为引物，以pEV-GFP为模板扩增，将RcnR结合序列rcnO引入P_veg启动子下游，构建质粒pEVO-GFP。

最后，以PlacI-rcnR-i1和PlacI-rcnR-i2为引物，以大肠杆菌基因组为模板，扩增rcnR基因序列；以PlacI-rcnR-v1和PlacI-rcnR-v2为引物，以pEVO-GFP为模板扩增载体骨架，并将两片段rcnR基因和载体骨架连接，构建质粒pEVO-GFP-rcnR。将质粒pEVO-GFP-rcnR转化至大肠杆菌细胞中，至此，钴离子诱导型表达***构建完毕，***结构如图1-a所示。各基因序列见表1。

表1构建钴离子诱导型表达***基因序列

表2构建钴离子诱导型表达***引物

实施例2：钴离子诱导型表达***验证

将钴离子诱导型表达***用于摇瓶实验验证。接取实施例1中转化得到的单菌落至含有5mL LB培养基的试管中，37℃，200rpm过夜(8-14h)培养，得到种子液转接1mL种子液至含有50mL LB培养基的250mL三角瓶中，37℃，200rpm培养2h后加入终浓度100μM的CoCl₂，继续培养，培养过程中定时检测荧光。以在相同条件下培养的没有添加CoCl₂的实验作为阴性对照。

结果如图1-b和表3所示，不加入CoCl₂的对照组在整个培养过程中荧光值维持在极低水平，说明该诱导***调控比较严谨。当加入100μM的CoCl₂时，GFP随着细胞生长表达，在16h后基本稳定在最高水平。由此可得，在上述培养条件下，24h时该诱导***的诱导率(诱导荧光强度与不诱导荧光强度的比值)为10.1。

分别使用浓度100μM和500μM的二价金属离子Co²⁺，Ni²⁺，Ca²⁺，Mg²⁺，Zn²⁺，Fe²⁺，Cu²⁺，Mn²⁺检测该***的特异性。如图1-c和表4所示，该***可以被Co²⁺和Ni²⁺诱导，不能被其他二价金属离子诱导，并且该***对Co²⁺离子的响应更加灵敏。

表3钴离子诱导型表达***验证荧光检测

表4钴离子诱导型表达***验证荧光检测

实施例3：钴离子诱导型表达***优化

对实施例1中构建的钴离子诱导型***进行进一步优化，探究诱导GFP表达的最佳Co²⁺浓度。将实施例2中添加的Co²⁺浓度设置为从0.5nM到1mM的16个Co²⁺浓度梯度，对钴离子***进行诱导。首先检测了Co²⁺浓度对细胞OD₆₀₀的影响，结果如图2-a所示，当Co²⁺浓度低于500μM时，细胞密度维持稳定，当浓度达到800μM时，细胞密度有稍许降低，说明该浓度下，Co²⁺开始对细胞产生毒性。当Co²⁺浓度进一步提高到1mM时，细胞OD₆₀₀降低为2.622，说明Co²⁺对细胞的毒性进一步增强。荧光检测结果显示(见图2-b)，荧光强度随Co²⁺浓度增加而提升，当Co²⁺浓度达到500μM时达到最大。更高的Co²⁺浓度没有带来更高的荧光强度，一方面是由于Co²⁺浓度已经足够完全诱导GFP表达，另一方面是由于过高的Co²⁺浓度会抑制细胞生长，降低细胞表达外源蛋白的能力。

表5不同钴离子浓度对GFP表达的影响

Co<sup>2+</sup>浓度	细胞密度(OD<sub>600</sub>)	荧光强度(a.u.)
			0	4.452	31286.5
0.5nm	4.188	30429.5
			1nM	4.848	29411
5nM	4.668	29431.5
			10nM	4.506	30443
50nM	4.458	36476
			100nM	4.56	33603.5
500nM	4.56	60328
			1μM	4.278	73472.5
5μM	4.152	94595
			10μM	4.476	153787.5
50μM	4.134	195479
			100μM	4.902	224934
300μM	4.356	268046.5
			500μM	4.56	293259
800μM	3.954	266156.5
			1mM	2.622	59565

实施例4：腈水合酶表达质粒构建

以PNHase-i1和PNHase-i2(表7)为引物，以pET28a-(BA)(公开于Xia Y,Cui W,LiuZ,et al.Construction of a subunit-fusion nitrile hydratase and discovery ofan innovative metal ion transfer pattern[J].Scientific Reports,2016,6(1):19183.)质粒为模板，扩增编码亚基融合的腈水合酶的基因。以PNHase-v1和PNHase-v2(表7)为引物，以实施例1中的质粒pEVO-GFP-rcnR为模板，扩增载体骨架。利用GibsonAssembly方法将两个扩增片段(编码亚基融合的腈水合酶的基因和载体骨架)连接，得到质粒pEVO-(BA)P，将该质粒转化入大肠杆菌JM109，得到钴离子诱导腈水合酶表达的重组菌。其中，质粒结构示意图见图3，腈水合酶基因序列见表6.

表6腈水合酶基因序列

表7腈水合酶表达质粒构建引物

引物	序列(5’-3’)
		PNHase-i1	GAAGGAGATATACCATGAATGGCATTCACGATACTG
PNHase-i2	CAGCCGGATCTCAAGCCATTGCGGC
		PNHase-v1	GCCGCAATGGCTTGAGATCCGGCTGCTAAC
PNHase-v2	GAATGCCATTCATGGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC

实施例5：利用钴离子诱导型***表达腈水合酶

首先对诱导表达腈水合酶的最佳钴离子浓度进行优化。使用浓度从50μM到900μM的Co²⁺作为诱导剂，诱导腈水合酶表达，培养结束后，检测细胞的OD₆₀₀和腈水合酶酶活。结果显示，当不加入Co²⁺时，细胞密度最高，但是几乎没有酶活。随着Co²⁺浓度增加，酶活逐步提高，在500μM浓度下达到最高值，进一步提高Co²⁺浓度，酶活开始下降(图4，表8)。而细胞OD₆₀₀结果显示，当Co²⁺浓度高于300μM时，细胞密度下降，说明高浓度Co²⁺抑制细胞生长(图5，表8)。因此，诱导腈水合酶表达的较佳浓度是500μM。

使用500μM的Co²⁺对腈水合酶进行摇瓶实验，检测细胞的生长曲线和腈水合酶的表达曲线。接取单菌落至含有5mL LB培养基的试管，37℃，200rpm过夜(8-14h)培养。转接1mL种子液至含有50mL LB培养基的250mL三角瓶中，37℃，200rpm培养至OD₆₀₀＝0.6时，加入终浓度500μM的CoCl₂，并降温至24℃，继续培养，培养过程中定时检测细胞OD₆₀₀和腈水合酶酶活。

如图6和表9所示，随着培养时间延长，细胞OD₆₀₀和酶活逐步增加，到24h之后趋于稳定，酶活达到106.2U/mL。另外，以传统的利用IPTG诱导的pET***表达腈水合酶作为对照。表达质粒为pET28a-(BA)P14K(公开于Xia Y,Cui W,Liu Z,et al.Construction of asubunit-fusion nitrile hydratase and discovery of an innovative metal iontransfer pattern[J].Scientific Reports,2016,6(1):19183.)，并以优化后的条件进行诱导(在OD₆₀₀＝0.8时添加终浓度为0.4M的IPTG，同时加入400μM CoCl₂，温度降低至24℃培养)。如图7和表9所示，酶活达到121.4U/mL。结果表明，钴离子诱导型***表达腈水合酶时，性能接近目前使用的高效IPTG诱导***。

表8不同钴离子浓度对腈水合酶表达的影响

Co<sup>2+</sup>浓度	细胞密度(OD<sub>600</sub>)	酶活(U/mL)
			0	4.75	0.7
50μM	4.737	13.3
			100μM	4.737	12.9
200μM	4.733	38.9
			300μM	4.667	63.3
400μM	3.960	82.3
			500μM	3.217	96.1
600μM	2.477	73.3
			700μM	1.853	47.6
800μM	1.560	34.3
			900μM	1.353	28.1

表9钴离子诱导型表达***与IPTG诱导***表达腈水合酶

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种钴离子诱导型蛋白表达***及应用

<160> 23

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 273

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtctcata caatccgtga taaacagaaa ctgaaagcgc gtgccagtaa gattcagggc 60

caggtcgtgg cgctcaagaa aatgctcgac gagccgcacg aatgcgctgc agttttacaa 120

cagattgctg ctatccgtgg cgcggtaaac ggtctgatgc gggaagtgat taaaggtcat 180

ctgacggaac acatcgttca ccagggggat gagctaaaac gtgaagaaga tctggatgtc 240

gttctgaagg tgctggattc atatatcaaa taa 273

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tactgggggg tagtatcagg tactgggggg gagta 35

<210> 3

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aacgttgata taatttaaat tttatttgac aaaaatgggc tcgtgttgta caataaatgt 60

a 61

<210> 4

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgagtaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60

gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 120

aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccatg gccaacactt 180

gtcactactt tcacttatgg tgttcaatgc ttttcaagat acccagatca tatgaagcgg 240

cacgacttct tcaagagcgc catgcctgag ggatacgtgc aggagaggac catctctttc 300

aaggacgacg ggaactacaa gacacgtgct gaagtcaagt ttgagggaga caccctcgtc 360

aacaggatcg agcttaaggg aatcgatttc aaggaggacg gaaacatcct cggccacaag 420

ttggaataca actacaactc ccacaacgta tacatcacgg cagacaaaca aaagaatgga 480

atcaaagcta acttcaaaat tagacacaac attgaagatg gaagcgttca actagcagac 540

cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac 600

ctgtccacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agagagacca catggtcctt 660

cttgagtttg taacagctgc tgggattaca catggcatgg atgaactata caaatga 717

<210> 5

<211> 1296

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgaatggca ttcacgatac tggcggagca catggttatg ggccggttta cagagaaccg 60

aacgaacccg tctttcgcta cgactgggaa aaaacggtca tgtccctgct cccggcgctg 120

ctcgccaacg gcaacttcaa cctcgatgaa tttcggcatt cgatcgagcg aatgggcccg 180

gcccactatc tggagggaac ctactacgaa cactggcttc atgtctttga gaacctgctg 240

gtcgagaagg gtgtgctcac ggccacggaa gtcgcgaccg gcaaggctgc gtctggcaag 300

acggcgacgc cggtgctgac gccggccatc gtggacggac tgctcagcac cggggcttct 360

gccgcccggg aggagggtgc gcgggcgcgg ttcgctgtgg gggacaaggt tcgcgtcctc 420

aacaagaacc cggtgggcca tacccgcatg ccgcgctaca cgcggggcaa agtggggaca 480

gtggtcatcg accatggtgt gttcgtgacg ccggacaccg cggcacacgg aaagggcgag 540

cacccccagc acgtttacac cgtgagtttc acgtcggtcg aactgtgggg gcaagacgct 600

tcctcgccga aggacacgat tcgcgtcgac ttgtgggatg actacctgga gccagcgcca 660

ggtgggcaat cacacacgca tgaccaccat cacgacgggt accaggcacc gcccgaagac 720

atcgcgctgc gggtcaaggc cttggagtct ctgctgatcg agaaaggtct tgtcgaccca 780

gcggccatgg acttggtcgt ccaaacgtat gaacacaagg taggcccccg aaacggcgcc 840

aaagtcgtgg ccaaggcctg ggtggaccct gcctacaagg cccgtctgct ggcagacggc 900

actgccggca ttgccgagct gggcttctcc ggggtacagg gcgaggacat ggtcattctg 960

gaaaacaccc ccgccgtcca caacgtcttc gtttgcacct tgtgctcttg ctacccatgg 1020

ccgacgctgg gcttgccccc tgcctggtac aaggccgcgc cctaccggtc ccgcatggtg 1080

agcgacccgc gtggggttct cgcggagttc ggcctggtga tccccgccaa caaggaaatc 1140

cgcgtctggg acaccacggc cgaattgcgc tacatggtgc tgccggaacg gcccgcggga 1200

actgaagcct acagcgaaga acaactggcc gaactcgtta cccgcgattc gatgatcggc 1260

accggcctgc ccacccaacc caccccatct cattga 1296

<210> 6

<211> 435

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgaaagacg aacggtttcc attgccagag ggttcgctga aggacctcga tggccctgtg 60

tttgacgagc cttggcagtc ccaggcgttt gccttggtgg tcagcatgca caaggccggt 120

ctctttcagt ggaaagactg ggccgagacc ttcaccgccg aaatcgacgc ttccccggct 180

ctgcccggcg aaagcgtcaa cgacacctac taccggcaat gggtgtcggc gctggaaaag 240

ttggtggcgt cgctggggct tgtgacgggt ggagacgtca actcgcgcgc acaggagtgg 300

aaacaggccc acctcaacac cccacatggg cacccgatcc tgctggccca tgcgctttgc 360

ccgccagcga tcgaccccaa gcacaagcac gagccacaac gctcaccgat caaggtcgtt 420

gccgcaatgg cttga 435

<210> 7

<211> 90

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Met Ser His Thr Ile Arg Asp Lys Gln Lys Leu Lys Ala Arg Ala Ser

1 5 10 15

Lys Ile Gln Gly Gln Val Val Ala Leu Lys Lys Met Leu Asp Glu Pro

20 25 30

His Glu Cys Ala Ala Val Leu Gln Gln Ile Ala Ala Ile Arg Gly Ala

35 40 45

Val Asn Gly Leu Met Arg Glu Val Ile Lys Gly His Leu Thr Glu His

50 55 60

Ile Val His Gln Gly Asp Glu Leu Lys Arg Glu Glu Asp Leu Asp Val

65 70 75 80

Val Leu Lys Val Leu Asp Ser Tyr Ile Lys

85 90

<210> 8

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gtttaacttt aagaaggaga tataccatga gtaaaggaga agaactttt 49

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gttagcagcc ggatctcatt tgtatagttc atccatgcca tg 42

<210> 10

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

catggcatgg atgaactata caaatgagat ccggctgcta ac 42

<210> 11

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

aaaagttctt ctcctttact catggtatat ctccttctta aagttaaac 49

<210> 12

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tgacaaaaat gggctcgtgt tgtacaataa atgtaggaat tgtgagcgga taac 54

<210> 13

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gtacaacacg agcccatttt tgtcaaataa aatttaaatt atatcaacgt tatttcgcgg 60

gatcgag 67

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ttaattgcgt tgcgcttatt tgatatatga atccagcacc 40

<210> 15

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ttcagggtgg tgaatatgtc tcatacaatc cgtg 34

<210> 16

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gattgtatga gacatattca ccaccctgaa ttg 33

<210> 17

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

catatatcaa ataagcgcaa cgcaattaat g 31

<210> 18

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gggtagtatc aggtactggg ggggagtacc tctagaaata attttgttta actttaag 58

<210> 19

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tcccccccag tacctgatac taccccccag tagatacatt tattgtacaa cacgagc 57

<210> 20

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gaaggagata taccatgaat ggcattcacg atactg 36

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

cagccggatc tcaagccatt gcggc 25

<210> 22

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gccgcaatgg cttgagatcc ggctgctaac 30

<210> 23

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gaatgccatt catggtatat ctccttctta aagttaaac 39

Claims

1.一种受钴离子诱导的表达载体，其特征在于，是将钴离子响应的阻遏蛋白RcnR、受阻遏蛋白RcnR调控的启动子与载体pET28a(+)连接，将载体上的启动子替换为P_veg；所述受阻遏蛋白RcnR调控的启动子是将阻遏蛋白RcnR的操纵序列rcnO连接到启动子P_veg下游构建得到的启动子；所述阻遏蛋白RcnR的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述操纵序列rcnO的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述启动子P_veg的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.一种钴离子诱导蛋白表达的基因工程菌，其特征在于，是以权利要求1所述的表达载体为表达载体。

3.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以大肠杆菌为宿主。

4.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌表达腈水合酶。

5.如权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，编码所述腈水合酶的基因由融合的α/β亚基基因、编码调控蛋白P的基因组成；所述融合的α/β亚基基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示，所述编码调控蛋白P的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

6.一种生产腈水合酶的方法，其特征在于，应用权利要求4或5所述基因工程菌进行发酵，在钴离子诱导下表达蛋白。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，将权利要求4或5所述基因工程菌在LB平板上划线，挑取单菌落在LB培养基中200-220rpm，35-39℃培养8-14 h；按1-5%接种量将培养物转入LB培养基中200-220rpm，35-39℃培养至OD₆₀₀=0.4-0.6；加入钴离子后，温度降低至20-25℃进行蛋白表达。

8.如权利要求6或7所述的方法，钴离子添加浓度为400-600 μM。

9.权利要求1或2所述表达载体在生产含腈水合酶的产品方面的应用。