CN102348717B - 自组装肽和高强度肽凝胶 - Google Patents

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Abstract

本发明旨在提供实用上具有足够力学强度的肽凝胶和可形成该肽凝胶的自组装肽。本发明的自组装肽由下列氨基酸序列构成。氨基酸序列：a1b1c1b2a2b3db4a3b5c2b6a4(该氨基酸序列中，a1～a4为碱性氨基酸残基；b1～b6为无电荷极性氨基酸残基和/或疏水性氨基酸残基，但其中至少5个为疏水性氨基酸残基；c1和c2为酸性氨基酸残基；d为疏水性氨基酸残基)。

Description

自组装肽和高强度肽凝胶
技术领域
本发明是关于可形成高强度肽凝胶的自组装肽和由该自组装肽所形成的肽凝胶。
背景技术
在再生医疗领域的研究和实际治疗中使用的支架(scaffold)(细胞的立足点)，一般使用胶原蛋白凝胶。但是，这些胶原蛋白凝胶来自动物体，因而可能导致未知传染疾病。作为消除感染未知疾病顾虑的一种手段，可使用由化学合成的材料制成的支架。作为这样的材料，例如可以列举专利文献1或专利文献2中公开的自组装肽。但是，由专利文献1或2的自组装肽得到的支架(肽凝胶)由于力学强度不够，所以例如当用镊子夹取时，有被捏碎等的操作性问题。而且，专利文献1中的自组装肽凝胶，在中性区域中，存在透明度不够的问题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：US5670483
专利文献2：WO2007/000979号公报
发明内容
发明所要解决的课题
本发明旨在解决上述问题，其目的在于提供实用上具有足够力学强度的肽凝胶以及可形成该肽凝胶的自组装肽。
用于解决课题的方法
根据本发明，提供自组装肽。该自组装肽由下述氨基酸序列构成。
氨基酸序列：a1b1c1b2a2b3db4a3b5c2b6a4
(该氨基酸序列中，a1～a4为碱性氨基酸残基；b1～b6为无电荷极性氨基酸残基和/或疏水性氨基酸残基，但其中至少5个为疏水性氨基酸残基；c1及c2为酸性氨基酸残基；d为疏水性氨基酸残基。)
在优选实施方式中，上述氨基酸序列中，b3和b4为疏水性氨基酸残基。
在优选实施方式中，上述氨基酸序列中，b1～b6全部为疏水性氨基酸残基。
在优选实施方式中，上述氨基酸序列中，b1～b6分别独立，为丙氨酸残基、缬氨酸残基、亮氨酸残基或异亮氨酸残基。
在优选实施方式中，上述氨基酸序列中，d为丙氨酸残基、缬氨酸残基、亮氨酸残基、或异亮氨酸残基。
在优选实施方式中，上述自组装肽由RLDLRLALRLDLR(序列编号1)、RLDLRLLLRLDLR(序列编号2)、RADLRLALRLDLR(序列编号6)、RLDLRLALRLDAR(序列编号7)、RADLRLLLRLDLR(序列编号8)、RADLRLLLRLDAR(序列编号9)、RLDLRALLRLDLR(序列编号10)或RLDLRLLARLDLR(序列编号11)氨基酸序列构成。
在优选实施方式中，上述自组装肽由RLDLRLALRLDLR(序列编号1)或RLDLRLLLRLDLR(序列编号2)氨基酸序列构成。
根据本发明的另一个方面，提供修饰肽。该修饰肽是通过修饰上述自组装肽的N末端氨基和/或C末端羧基而得到的，并且具有自组装能力。
在优选实施方式中，在上述N末端氨基和/或C末端羧基上，添加含有RGD的氨基酸序列。
根据本发明的又一个方面，提供肽凝胶。该肽凝胶由含有上述自组装肽和/或上述修饰肽的水溶液所形成。
在优选实施方式中，上述水溶液还含有添加物。
在优选实施方式中，上述添加物为选自pH调节剂、氨基酸类、维生素类、糖类、多糖类、醇类、多元醇类、色素、生理活性物质、酶、抗体、DNA和RNA中的至少一种。
在优选实施方式中，上述肽凝胶，在22℃的温度条件下，使用前端为直径3.2mm、曲率半径1.6mm的球状的夹具，以0.05mm/s的压缩速度进行压缩试验时，从压缩开始到8～10秒后为止的测量值的近似直线中，每单位时间负荷变化量的绝对值L(g/s)为0.03g/s以上。
根据本发明的又一个方面，提供一种细胞培养用基材。该细胞培养用基材包含选自上述自组装肽、上述修饰肽和上述肽凝胶中的至少一种。
根据本发明的又一个方面，提供一种无菌肽的制造方法。该无菌肽的制造方法，包括加压条件下，在100℃以上，将上述自组装肽和/或修饰肽灭菌的工序。
根据本发明的又一个方面，提供一种由肽凝胶包被物品的制造方法。由该肽凝胶包被物品的制造方法，包括冷冻上述肽凝胶的工序；
融解该冷冻物制得肽溶胶的工序；
用该肽溶胶将包被物品表面的至少一部分包被的工序；以及
用肽溶胶再形成肽凝胶的工序。
发明的效果
根据本发明的具有特定氨基酸序列的自组装肽，可获得具有实用的力学强度的肽凝胶。
附图说明
图1是说明由n-RADARAAARADAR-c序列构成的肽间距离的示意图。图中的连接N末端和C末端主链中的粗线表示肽键。
图2是表示实施例1中肽凝胶的压缩试验结果的图。
图3(a)是实施例1的肽凝胶用镊子夹住时的照片，(b)是实施例2的肽凝胶用镊子夹住时的照片，(c)是比较例1的肽凝胶用镊子夹住时的照片。
图4是表示实施例2的肽凝胶的压缩试验结果的图。
图5是表示实施例3的肽凝胶的压缩试验结果的图。
图6是表示比较例1的肽凝胶的压缩试验结果的图。
图7是表示比较例2的肽凝胶的压缩试验结果的图。
图8是表示实施例4的肽凝胶的压缩试验结果的图。
图9是表示实施例7中细胞增殖率的图。
图10(a)是灭菌处理前的肽水溶液的质谱分析结果，(b)是灭菌处理后的肽水溶液的质谱分析结果。
图11(a)为灭菌处理前的商品名“PuraMatrixTM”(3DMatrix公司制)的质谱分析结果，(b)为灭菌处理后的商品名“PuraMatrixTM”(3DMatrix公司制)的质谱分析结果。
图12(a)、(b)和(c)分别为凝胶移至培养皿时的照片、冷冻的凝胶照片和及肽凝胶均匀包被在整个表面的培养皿照片。
图13(a)、(b)及(c)分别为凝胶移至载玻片时的照片、冷冻的凝胶照片、及肽凝胶均匀包被整个表面的载玻片照片。
具体实施方式
A.用语的定义
(1)本说明书中，所谓“自组装肽”，指在溶剂中通过肽分子之间相互作用而自发集合的肽。作为相互作用，并没有特别限定，例如可以列举氢键、离子间相互作用、范德华力等的静电性相互作用、疏水性相互作用。在一个实施方式中，自组装肽在室温的水溶液(例如，0.4w/v％的肽水溶液)中，自组装可以形成纳米纤维或凝胶。
(2)本说明书中，所谓“凝胶”，指兼具粘性性质和弹性性质的粘弹性物质。
(3)在本说明书中，“亲水性氨基酸”包括精氨酸(Arg/R)、赖氨酸(Lys/K)、组氨酸(His/H)等碱性氨基酸，天冬氨酸(Asp/D)、谷氨酸(Glu/E)等酸性氨基酸，酪氨酸(Tyr/Y)、丝氨酸(Ser/S)、苏氨酸(Thr/T)、天冬酰胺(Asn/N)、谷氨酰胺(Gln/Q)、半胱氨酸(Cys/C)等无电荷极性氨基酸。上述括号内的字母分别为氨基酸的三字母标记和单字母标记。
(4)本说明书中，“疏水性氨基酸”包括丙氨酸(Ala/A)、亮氨酸(Leu/L)、异亮氨酸(Ile/I)、缬氨酸(Val/V)、甲硫氨酸(Met/M)、苯丙氨酸(Phe/F)、色氨酸(Trp/W)、甘氨酸(Gly/G)、脯氨酸(Pro/P)等非极性氨基酸。上述括号内的字母分别为氨基酸之三字母标记和单字母标记。
B.自组装肽
本发明的自组装肽由下述氨基酸序列构成：
氨基酸序列：a1b1c1b2a2b3db4a3b5c2b6a4
(上述氨基酸序列中，a1～a4为碱性氨基酸残基；b1～b6为无电荷极性氨基酸残基和/或疏水性氨基酸残基，但其中至少5个为疏水性氨基酸残基；c1和c2为酸性氨基酸残基；d为疏水性氨基酸残基。)
一般情况下，认为自组装肽在水溶液中形成由配置亲水性侧链的面和配置疏水性侧链的面所构成的β片层结构，并且认为通过在亲水性面之间作用的氢键、离子间相互作用和在疏水性面间作用的疏水性相互作用等的相互作用，大量肽分子进行自发集合。因此，在以往的自组装肽中交替且等比例具有亲水性氨基酸与疏水性氨基酸非常重要(例如，参照专利文献1)。
相对于此，如上所述，本发明的自组装肽，由以第7位疏水性氨基酸残基作为中心，每隔一个残基在N末端方向和C末端方向上对称的位置具有碱性氨基酸残基(第1、5、9和13位)和酸性氨基酸残基(第3和11位)的13个残基的氨基酸序列构成。即，本发明的自组装肽的特征之一是没有交替的亲水性氨基酸与疏水性氨基酸。另外，本发明的自组装肽的另一个特征是不以等比例具有亲水性氨基酸残基和疏水性氨基酸残基。此外，本发明的自组装肽的再一个特征是，以第7位疏水性氨基酸残基作为中心，在特定的对称位置具有4个碱性氨基酸残基和2个酸性氨基酸残基，且N末端与C末端的氨基酸残基均为碱性氨基酸残基。一般而言，可以认为第7位设为疏水性氨基酸残基，对于β片层结构的形成是不利的，另外因为亲水性氨基酸与疏水性氨基酸的比例不均等，故对于肽的自组装能力造成不良影响。但是，本发明的自组装肽具有优异的自组装能力，而且可形成比以前的力学强度更优异的肽凝胶。尽管达到这种效果的理由不明确，但可以认为是由于除了将第7位设为疏水性氨基酸，而且碱性氨基酸残基比酸性氨基酸残基多2个，并在特定位置上具有各个的氨基酸残基，从而维持形成β片层结构的能力的同时，在肽分子间静电引力和静电斥力还以极优异的平衡发挥作用。
构成上述自组装肽的氨基酸可为L-氨基酸，也可为D-氨基酸。另外，可为天然氨基酸，也可为非天然氨基酸。从价格低廉且肽合成容易出发，优选天然氨基酸。
上述氨基酸序列中，a1～a4为碱性氨基酸残基。碱性氨基酸优选精氨酸、赖氨酸或组氨酸，更优选为精氨酸或赖氨酸。这是因为这些氨基酸具有很强的碱性。a1～a4可为相同的氨基酸残基，也可为不同的氨基酸残基。
上述氨基酸序列中，b1～b6为无电荷极性氨基酸残基和/或疏水性氨基酸残基，其中至少5个为疏水性氨基酸残基。疏水性氨基酸优选为丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甘氨酸或脯氨酸。无电荷极性氨基酸优选为酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸或半胱氨酸。这是因为这些氨基酸易于取得。
优选b3及b4各自独立，为任意合适的疏水性氨基酸残基，更优选是亮氨酸残基、丙氨酸残基、缬氨酸残基或异亮氨酸残基，特别优选是亮氨酸残基或丙氨酸残基。在上述氨基酸序列中，当分别位于第6位与第8位的b3与b4为疏水性氨基酸残基时，第6～8位的三个氨基酸残基连续为疏水性氨基酸残基。可以推测这样在氨基酸序列中心形成疏水性区域，能有助于通过该疏水性相互作用形成强度优异的肽凝胶。
优选b1～b6全部为疏水性氨基酸残基。这是因为自组装肽适于形成β片结构且可以自组装。更优选b1～b6分别独立地为亮氨酸残基、丙氨酸残基、缬氨酸残基或异亮氨酸残基，更优选是亮氨酸残基或丙氨酸残基。在优选实施方式中，b1～b6之中有4个以上为亮氨酸残基，特别优选其中5个以上为亮氨酸残基，最优选全部为亮氨酸残基。这是因为获得的自组装肽有好的水溶性，而且，可形成高强度的肽凝胶。
上述氨基酸序列中，c1和c2为酸性氨基酸残基。酸性氨基酸优选为天冬氨酸或谷氨酸。这是因为这些氨基酸易于取得。c1和c2可以是相同的氨基酸残基，也可以是不同的氨基酸残基。
上述氨基酸序列中，d为疏水性氨基酸残基。如上所述，可以认为通过d为疏水性氨基酸残基，且具有特定的对称结构，则上述自组装肽可以形成比以往肽凝胶力学强度上更加优异的肽凝胶。尽管达到这样的效果的原因尚不清楚，但推测的可能原因是本发明的自组装肽，在第7位的氨基酸残基d为疏水性氨基酸残基，使得自组装过程中肽分子之间的重叠保持恒定，能够形成均匀性高的集合状态。
d优选为丙氨酸残基、缬氨酸残基、亮氨酸残基或异亮氨酸残基。此时，自组装肽形成的β片层结构的亲水性面一侧的氨基酸的侧链长度上变成非互补的，但该自组装肽可以发挥优良的自自组装能力，而且可以形成比以往力学强度更优异的肽凝胶。这是与以往看法大为不同的效果，以往看法为了获得适合于自组装的静电引力，优选β片层结构的亲水面一侧的氨基酸的侧链长度上互补。此处，所谓“侧链长度互补”，指构成一对发挥相互作用的氨基酸残基(例如，碱性氨基酸残基和酸性氨基酸残基)的侧链长的原子数之和一定。例如，图1是说明侧链长度非互补时的肽间的距离的示意图。如图1所示，主要参与用点线围住的丙氨酸残基-精氨酸残基对的侧链长度的原子数之和(7)，比主要参与用实线围住的天冬氨酸残基-精氨酸残基对的侧链长的原子数之和(9)小。
上述自组装肽所含的氨基酸残基在中性区域的电荷总和，实质上为+2。即，上述自组装肽，在中性区域中来自该肽所含的氨基酸残基的侧链的正电荷和负电荷没有相互抵消。加上，由于N末端和C末端的氨基酸残基均为碱性氨基酸残基，因此本发明的自组装肽，例如，在肽分子间除了静电引力还有静电斥力作用，而且这些相互作用保持了微秒的平衡从而实质上不会产生过度缔合，因此在中性区域下，不会沉淀，而可以形成稳定的凝胶。另外，在本说明书中，所谓“中性区域”，指pH为6～8、优选是pH在6.5～7.5的区域。
各pH中的上述自组装肽的电荷，例如，可根据Lehninger(Biochimie，1979)方法计算。Lehninger方法例如根据EMBLWWWGatewaytoIsoelectricPointService的网址(http://www.embl-heidelberg，de/cgi/pi-wrapper.pl)上可利用的程序进行计算。
含有上述自组装肽的水溶液，可形成力学强度优异的肽凝胶。一个实施方式中，自组装肽的水溶液(优选为0.2～5w/v％、更优选为0.2～2w/v％、特别优选为0.2～1w/v％、最优选为0.3～0.8w/v％)，在22℃的温度条件下，使用前端为直径3.2mm、曲率半径1.6mm的球状物的夹具，以0.05mm/s的压缩速度进行压缩试验，可形成从压缩开始至初期(8～10秒为止)的测定值的近似直线中每单位时间负荷变化的绝对值L(g/s)优选为0.03g/s以上、更优选为0.035g/s以上、特别优选为0.04g/s以上的胶。如后述实施例中所述，该压缩试验，例如，可使用装有不锈钢制夹具(TAInstrument公司制)的粘弹性测量装置(TAInstrument公司制，产品编号“RSAIII”)进行。
以下例示本发明中优选实施方式的自组装肽。
n-RLDLRLALRLDLR-c(序列编号1)
n-RLDLRLLLRLDLR-c(序列编号2)
n-RADLRLALRLDLR-c(序列编号6)
n-RLDLRLALRLDAR-c(序列编号7)
n-RADLRLLLRLDLR-c(序列编号8)
n-RADLRLLLRLDAR-c(序列编号9)
n-RLDLRALLRLDLR-c(序列编号10)
n-RLDLRLLARLDLR-c(序列编号11)
上述自组装肽，可根据任何适合的制造方法所制造。可列举例如Fmoc法等的固相法或液相法等化学合成方法、基因重组表达等的分子生物学的方法。
C.修饰肽
本发明的修饰肽，只要具有自组装能力，就可对上述自组装肽施以任意的修饰。进行修饰的部位，可为上述自组装肽之N末端氨基，也可为C末端羧基，或者两者兼有。
作为上述修饰，在一定范围内，可在所得的修饰肽为具有自组装能力的范围中，选择任意的适当修饰。可列举例如，导入N末端氨基的乙酰化、C末端羧基的酰胺化等的保护基，导入烷基化、酯化或卤化等的官能团，氢化，导入单糖、二糖、寡糖或多糖等的糖化合物，导入脂肪酸、磷脂质或糖脂质等脂质化合物，导入氨基酸或蛋白质，导入DNA，以及导入其它具有生理活性的化合物等。当导入氨基酸或蛋白质时，导入后的肽为在上述自组装肽的N末端和/或C末端添加任意氨基酸的肽。在本说明书中，该添加肽也包含在修饰肽中。修饰可仅进行一种，也可组合进行2种以上。例如，可将期望的氨基酸导入上述自组装肽的C末端的添加肽的N末端乙酰化，也可以C末端酰胺化。
上述添加肽(修饰肽)，作为一个整体，有时不具有上述自组装肽的特征。具体而言，有通过任意的氨基酸的添加，以第7位的疏水性氨基酸序列为中心，N末端方向的序列和C末端方向的序列为非对称性的情况，以相等比例含有疏水性氨基酸和亲水性氨基酸的情况等。即使在这样的情况，上述自组装肽也具有极优异的自组装能力，因此可以形成添加任意氨基酸的添加肽、或力学强度优异的肽凝胶。
当导入氨基酸或蛋白质时，构成导入后修饰肽的氨基酸残基数目，优选为14～200，更优选为14～100，更加优选为14～50，特别优选为14～30，最优选为14～20个。这是因为如果氨基酸残基数目超过200个，则有损害自组装肽的自组装能力的情况。
所导入的氨基酸种类和位点，可根据修饰肽的用途等适当设定。更优选从自组装肽的N末端和/或C末端的精氨酸残基(亲水性氨基酸)，交替导入疏水性氨基酸与亲水性氨基酸。
作为导入氨基酸的具体情况，例如，作为细胞黏着因子，可列举REDV、EILDV、YEKPGSPPREVVPRPRPGV、KNNOKSEPLIGRK、YIGSR、RNIAELLKDI、RYVVLPRPVCFEKGMNYTVR、IKVAV、PDSGR和含有RGD序列的氨基酸序列(例如，GRGDSPASS、RGDN、RGDF、RGDT、RGDA、RGD和RGDS)等；作为核转运信号可列举PPKKKRKV、PAAKRVKLD、PQPKKKP和QRKRQK等；作为内质网转运信号可列举MMSFVSLLLVGILFWATEAEQLTLCEVFQ等；作为线粒体转运信号可列举MLSLRQSIRFFLPATRTLCSSRYLL等。这些序列可单独导入，也可作为多个序列的组合导入。另外，所导入的氨基酸序列和上述自组装肽，也可通过在其间一个以上任意的氨基酸连结。
上述修饰可根据其种类等，可通过任意适合的方法进行。
含有上述修饰肽的水溶液，可形成力学强度优异的肽凝胶。在1个实施方式中，修饰肽的水溶液(优选为0.2～5w/v％，更优选为0.2～2w/v％，特别优选为0.2～1w/v％，最优选为0.3～0.8w/v％)在22℃的温度条件下，使用前端为直径3.2mm、曲率半径1.6mm的球状的夹具，以0.05mm/s的压缩速度进行压缩试验中，可形成从压缩开始至初期(压8～10秒后为止)的测定值的近似直线中，每单位时间的负荷变化量的绝对值L(g/s)优选为0.03g/s以上，更优选为0.035g/s以上，特别优选为0.04g/s以上的凝胶。
D.肽凝胶
本发明的肽凝胶，由含有上述自组装肽和/或上述修饰肽(以下，有时将上述“自组装肽和/或修饰肽”称为“本发明的肽”)的水溶液所形成。推测本发明的肽在水溶液中自发集合，形成具有纳米尺度宽度的纤维状分子集合体、所谓的纳米纤维，且以该纳米纤维间作用的静电相互作用作为主因形成三维网状结构，进而形成凝胶。该水溶液中所含的本发明的肽，可仅为1种，也可为2种以上。该水溶液中除了本发明的肽和水之外，还可进一步含有任意适当的添加物。此外，该水溶液还可含有细胞等的不溶物。
上述水溶液中的本发明的肽浓度优选为0.2～5w/v％，更优选为0.2～2w/v％，特别优选为0.2～1w/v％，最优选为0.3～0.8w/v％。浓度在此范围内，可取得力学强度优异的肽凝胶。此外，使用该肽凝胶作为细胞培养用基材时，可取得良好的细胞生存率。
上述添加物可根据肽凝胶的用途、所含肽的种类等恰当选择。作为添加物的具体例子，可列举氢氧化钠、氢氧化钾、盐酸、磷酸、碳酸氢钠、碳酸钠等的pH调节剂，氨基酸类，维生素A、维生素B群、维生素C、维生素D、维生素E及其衍生物等的维生素类，单糖、二糖、寡糖等的糖类，透明质酸、壳聚糖、亲水化纤维素等的多糖类，乙醇、丙醇、异丙醇等的醇类，甘油、丙二醇等的多元醇类，酚红等的色素，荷尔蒙、细胞因子(造血因子、生长因子等)、肽等生理活性物质，酶，抗体，DNA，RNA，其它一般的低分子化合物。添加物可仅添加1种，也可组合添加2种以上。水溶液中的添加物浓度可根据目的、肽凝胶的用途等恰当设定。
作为含有添加物的水溶液的具体例，可列举磷酸缓冲化生理食盐水(PBS)、Tris-HCl等的各种缓冲液、Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)等细胞培养用培养基、由氢氧化钠、盐酸、碳酸氢钠等调整pH的水溶液。
上述水溶液可根据目的而为任意适当的pH。例如，溶解本发明肽前后的水溶液的pH，分别优选为5～9，更优选为5.5～8，特别优选为6.0～7.5。若在此范围，则可获得力学强度优异的肽凝胶。而且，上述水溶液含有细胞时，可取得良好的细胞生存率。此外，若pH值在此范围内，则在高温加压条件下难以发生肽的分解，故可实施高压灭菌锅等的高压蒸汽灭菌处理。其结果，可以简便地获得无菌状态的肽凝胶。
作为上述细胞，可根据目的，选择任何适当的细胞。细胞可为动物细胞，也可为植物细胞。作为细胞的具体例，可列举软骨细胞、成肌细胞、骨髓细胞、纤维原细胞、肝细胞、心肌细胞等。
本发明的肽凝胶，在22℃的温度条件下，使用前端为直径3.2mm、曲率半径1.6mm的球状的夹具，以0.05mm/s的压缩速度进行的压缩试验中，由从压缩开始至初期(8～10秒后为止)的测定值的近似直线中，显示优选为0.03g/s以上、更优选为0.035g/s以上、特别优选为0.04g/s以上的每单位时间的负荷变化量的绝对值L(g/s)。具有上述力学强度的肽凝胶，例如，可以从以优选为0.2～5w/v％、更优选为0.2～2w/v％、特别优选为0.2～1w/v％、最优选为0.3～0.8w/v％的浓度含有本发明的肽的水溶液中形成。
在含有10mm长光路的比色皿中，以380nm～780nm的吸光度测定的可见光透射率，优选为50％以上，更优选为70％以上，特别优选为90％以上。具有上述可见光透射率的肽凝胶，例如，可从含有0.2～2w/v％浓度本发明肽的水溶液形成。此外，该肽凝胶在室温下以密封状态长期间(例如，2个月)放置后的可见光透射率的降低率(％)(100-(保存后的可见光穿透率/保存前的可见光穿透率×100))优选为30％以下，更优选为20％以下，特别优选为10％以下。具有如此高可见光透射率的肽凝胶，当作为细胞培养用基材时，具有易于通过荧光显微镜等观察细胞等的优点。可见光透射率，例如，可使用UV/VIS测定装置进行测量。
上述肽凝胶可通过任意适合的方法形成。典型方法是上述肽凝胶可通过将含有至少一种本发明的肽的水溶液静置而形成。静置时的温度或时间，只要可将本发明的肽自组装形成凝胶即可没有特别限制，可根据凝胶的使用目的，该肽的种类、浓度等适当设定。静置时间通常为1分钟以上，优选在3分钟以上，更优选在5分钟以上。温度通常为4～50℃，更优选为15～45℃。
E.自组装肽、修饰肽和肽凝胶的用途
作为本发明的自组装肽、修饰肽和肽凝胶的优选用途，可以列举例如，细胞培养用基材，护肤用品、护发用品等的化妆品，褥疮制剂、骨填充剂、美容形成用注入剂、眼科用手术辅助剂、人工玻璃体、人工水晶体、关节润滑剂、点眼剂、DDS基材、止血剂等医药品，湿润用保水剂，干燥剂，隐形眼镜等的医疗器械的被膜剂。
F.细胞培养用基材
本发明的细胞培养用基材，包含上述自组装肽、修饰肽和肽凝胶中的至少一种。本发明的细胞培养用基材，因为由化学合成所得的自组装肽和/或修饰肽所形成，所以不会混入病原体等，可安全地培养细胞。此外，通过上述本发明的肽形成的凝胶，在中性区域透明、且力学强度优异，因此本发明的细胞培养基材在细胞培养时的辨视性和操作性优异。
上述细胞培养基材，在其内部本发明的肽自组装成纤维状，进一步形成三维网状结构。因此，不仅可在细胞培养基材上培养，也可在细胞培养基材中培养。
在细胞培养基材上培养时，在已经形成的含有本发明肽的肽凝胶上，载放培养对象的细胞即可培养。在细胞培养基材中培养时，将本发明的肽或肽的水溶液与细胞或细胞悬浮液混合，并从该混合物形成肽凝胶即可培养。
肽凝胶的液相，可通过溶剂置换，置换为所需的培养液。溶剂置换，例如，可使用商品名“CellCultureInsert”等进行。肽凝胶的详细信息(肽浓度、水溶液(混合物)所含的添加物种类、pH值等)和形成方法如上述D项所记载。
培养对象的细胞可根据目的等，选择任何适当的细胞。细胞可为动物细胞，也可为植物细胞。作为细胞的具体例，可列举软骨细胞、成肌细胞、骨髓细胞、纤维原细胞、肝细胞、心肌细胞等。培养液和培养条件可根据培养细胞的种类、目的等恰当选择。
本发明的细胞培养用基材，具有优异的生物体适应性和安全性，因此，例如，在再生医疗等领域的三维细胞培养中可适当利用。
G.无菌肽的制造方法
本发明的无菌胜肽制造方法，包括将自组装肽和/或修饰肽在加压条件下，在100℃以上进行灭菌的工序。典型的为，这些肽以肽的水溶液或由该肽的水溶液所形成的肽凝胶形态供给灭菌处理。该肽水溶液的pH优选为5～9，更优选为5.5～8，特别优选为6.0～7.5。如果为这样的pH，则即使在100℃以上的温度条件灭菌，实质上也不会发生肽的分解，因此可获得无菌状态的本发明的肽。关于肽的水溶液和肽凝胶，如上述D项所记载。
作为灭菌方法，可采用任意适当的灭菌方法。例如，可以优选使用由高温高压的饱和水蒸气进行灭菌(所谓高压灭菌锅灭菌)的方法。高压灭菌锅灭菌时的压力优选为0.122～0.255MPa，更优选为0.152～0.233MPa。另外，灭菌温度优选为105～135℃，更优选为110～125℃。此外，灭菌时间优选为1～60分钟，更优选为3～40分钟，特别优选为5～30分钟。
高压灭菌锅灭菌可使用市售的高压灭菌锅装置进行。
H.由肽凝胶包被的物品的制造方法
本发明的由肽凝胶包被的物品的制造方法，包括以下工序：冷冻上述肽凝胶的工序(冷冻工序)；融解该冷冻物得到肽溶胶的工序(融解工序)；将包被对象物品表面的至少一部分用肽溶胶包被的工序(包被工序)；以及由该肽溶胶再形成肽凝胶的工序(凝胶化工序)。该方法，根据需要，可进一步含有任意适当的工序。通过冷冻融解本发明的肽凝胶，肽分子间的键切断，从而构成凝胶的三维网状结构被破坏，因此可获得肽分子在水溶液中均匀分散的溶胶。以该均匀性高的溶胶包被对象物品表面的至少一部分后，通过凝胶化该溶胶，就可以由肽凝胶均匀包被该物品的表面。
H-1.冷冻工序
冷冻条件，只要可将肽凝胶冷冻，可采用任意恰当的条件。冷冻温度，只要为肽凝胶冷冻温度以下即可。冷冻速度没有限制，可慢慢冷冻，也可急速冷冻。例如，可将肽凝胶于-10℃以下的温度条件放置而适当冷冻。
作为冷冻手段，可选择家庭用或商用冰箱、液态氮等任意适当的冷冻手段。另外，已冷冻的肽凝胶，可在供给融解工序之前的任意期间，直接以冷冻态保存。
当冷冻的肽凝胶是由含有添加物的肽水溶液形成的凝胶时，该添加物的浓度，优选为不会对凝胶化工序中凝胶再形成造成不良影响的浓度。该浓度可根据肽的种类、浓度等恰当设定，通常，优选低浓度。例如，在HEPES和Tris-HCl的溶液中，其终浓度优选为50mM以下，更优选为40mM以下。在碳酸氢钠溶液和碳酸钠溶液时，其终浓度优选为5mM以下、更优选为4mM以下。在PBS溶液时，其终浓度优选为0.5×PBS以下、更优选为0.3×PBS以下。此外，在药典生理食盐水时，其最终浓度优选为0.5重量％以下、更优选为0.4重量％以下。
H-2.融解工序
融解温度，只要是融解上述冷冻工序所得的冷冻物并形成溶胶的温度，就可以设定为任何适当的温度。可以在恒定温度融解，也可以在不同温度阶段性融解。融解速度和时间并无限制，可慢慢融解，也可急速融解。例如，在5～70℃、优选在15～45℃的温度条件下放置已冷冻的肽凝胶，可恰当进行融解。
融解手段，可选择任意合适的手段。作为融解手段的具体例，可列举水浴、油浴、恒温槽等。
如上所述，通过冷冻融解肽凝胶，则可将形成肽凝胶的肽分子间的各种键切断而得到溶胶。经由冷冻融解制得的溶胶中，因为肽分子间的各种键充分断裂且粘度显著降低，故可容易地均匀包被对象物品表面。另外，从进一步提高溶胶均匀性的观点出发，可以一边以溶胶内不会发生气泡的程度提供振动，一边融解已冷冻的肽凝胶，还可以对所得的溶胶提供振动后再进行包被工序。作为提供振动的方法，可列举摇动已冷冻的肽凝胶或溶胶，对其照射超声波等。
H-3.包被工序
作为包被方法，可采用任意恰当的方法。作为具体例，可列举分散器涂布方式、浸渍方式、棒涂方式、由离心力在包被对象物品的表面将溶胶展开的方式、倾斜包被对象物品使溶胶流动并在对象物品表面展开的方式。在上述溶胶中，肽分子间的各种键完全断裂且粘度显著降低，而且肽分子充分分散，因此可在包被对象物品表面形成均匀层。
包被对象物品，可采用任意合适的物品。可列举例如，管、瓶等的容器，多孔培养皿(multi-welldish)、培养皿等的细胞培养器具，载玻片等的平板。包被对象物品可由玻璃、塑料、金属等任意材料形成。
H-4.凝胶化工序
凝胶的再形成条件(温度、时间等)，只要可再形成肽凝胶就没有限制，可根据肽的种类和浓度等恰当设定。本发明的肽因为具有自组装能力，所以通过设定合适的条件，就可自行集合并自发再形成凝胶。
作为凝胶的再形成条件，例如，静置表面经上述肽凝胶包被的物品即可。静置温度优选为15℃以上，更优选为25～45℃。静置时间优选为1分钟以上，更优选为5分钟以上。
凝胶化工序中再形成的肽凝胶厚度，即，物品表面的包被膜厚度，例如在1μm以上，优选在1μm～1cm。
实施例
以下，根据实施例具体说明本发明，但本发明不被这些实施例所限定。
[实施例1]
根据Fmoc固相合成法，合成出由表1列出的序列编号1的氨基酸序列构成的自组装肽。其次，通过常规方法，将N末端乙酰化，并将C末端酰胺化，获得修饰肽1([CH3CO]-RLDLRLALRLDLR-[NH2])。
将获得的修饰肽1以0.2、0.4、和0.6w/v％浓度，分别溶解于0.1重量％的碳酸氢钠溶液中，获得肽溶液。获得的肽溶液，使用pH试纸(商品名：pHIndicatorPapers，WhatmanInternationalLtd.制，测定范围pH＝6.0～8.1，Cat.No.2629990)测定pH值，结果pH值在6.9～7.8的范围内。通过在商品名“NuncTissueCultureInserts”(膜直径：10mm，孔径：8.0μm，膜材料：聚碳酸酯)(NalgeNuncInternational公司制，产品编号“Cat.No：136862”)中加入300μl该肽溶液，并在22℃条件下静置2小时，形成凝胶。凝胶厚度大约为2mm。通过对所得凝胶由DMEM进行12小时溶剂置换，获得0.2、0.4、及0.6w/v％的肽凝胶1(液相：DMEM)。所得各浓度的肽凝胶1供给下列的压缩试验使用，测定力学强度。
[压缩试验]
在22℃的条件下，使用前端为球状(直径：3.2mm，曲率半径：1.6mm)的不锈钢制夹具(TAInstrument公司制)的粘弹性测定装置(TAInstrument公司制，产品编号“RSAIII”)，通过以0.05mm/s(s＝秒)的速度压缩凝胶，测定力学强度。
压缩试验的结果在图2中表示。图2表示夹具逐渐挤压样品时装置所受的负荷与时间的关系，近似直线的斜率越大说明力学强度越高。因此，将从压缩开始后初期(8～10秒钟后为止)的测定值的近似直线斜率(每单位时间的负荷变化量)的绝对值定义为L，L值越大则力学强度越高。如图2所示，0.4w/v％的肽凝胶1在上述压缩试验中的从压缩开始后约10秒钟位置的每单位时间的负荷变化量的绝对值L为0.0476g/s。
由镊子夹住0.4w/v％肽凝胶1搬运时，其结果如图3(a)所示，该肽凝胶1具有用于夹持的足够强度，且操作性优异。
[实施例2]
除了采用序列编号2的氨基酸序列代替序列编号1的氨基酸序列以外，同实施例1一样处理，获得修饰肽2([CH3CO]-RLDLRLLLRLDLR-[NH2])。除了用修饰肽2代替修饰肽1以外，同实施例1一样处理，从而获得0.2、0.4和0.6w/v％的肽凝胶2(液相：DMEM)。
关于所得的肽凝胶，与实施例1同样测定力学强度。结果示于图4中。如图4所示，在0.4w/v％的肽凝胶2的上述压缩试验中，每单位时间的负荷变化量绝对值L为0.0423g/s。
由镊子夹住0.4w/v％的肽凝胶2搬运时，结果如图3(b)所示，肽凝胶2具有用于夹持的足够强度，且操作性优异。
[实施例3]
除了采用序列编号3的氨基酸序列代替序列编号1的氨基酸序列以外，同实施例1一样处理，获得修饰肽3([CH3CO]-RLDLRLALRLDLRL-[NH2])。除了使用修饰肽3代替修饰胜1以外，同实施例1一样处理，从而获得0.2和0.4w/v％的肽凝胶3(液相：DMEM)。
关于所得的肽凝胶，与实施例1同样测定力学强度。结果示于图5。如图5所示，在0.4w/v％的肽凝胶3的上述压缩试验中，每单位时间的负荷变化量的绝对值L为0.0336g/s。
[比较例1]
除了采用序列编号4的氨基酸序列代替序列编号1的氨基酸序列以外，同实施例1一样处理，获得修饰肽c1([CH3CO]-RASARADARADARASA-[NH2])。除了使用修饰肽c1代替修饰肽1以外，同实施例1一样处理，形成0.2、0.4和0.6w/v％的肽溶胶c1(液相：DMEM)。
关于所得的肽凝胶，与实施例1同样测定力学强度。结果示于图6。如图6所示，在0.4w/v％的肽凝胶c1的上述压缩试验中，每单位时间的负荷变化量的绝对值L为0.0143g/s。
由镊子夹住0.4w/v％的肽凝胶c1搬运时，结果如图3(c)所示，该肽凝胶c1力学强度不够充分，操作性方面有问题。
[比较例2]
除了采用序列编号5的氨基酸序列代替序列编号1的氨基酸序列以外，同实施例1一样处理，获得修饰肽c2([CH3CO]-RASARADARASARADA-[NH2])。除了使用修饰肽c2代替修饰肽1以外，同实施例1一样处理，形成0.2和0.4w/v％的肽凝胶c2(液相：DMEM)。
关于所得的肽凝胶，与实施例1同样测定力学强度。结果示于图7。如图7所示，在0.4w/v％的肽凝胶c2的上述压缩试验中，每单位时间的负荷变化量的绝对值L为0.0167g/s。
[实施例4]
除了采用序列编号12的氨基酸序列代替序列编号1的氨基酸序列以外，同实施例1一样处理，获得修饰肽4([CH3CO]-RGDNRLDLRLALRLDLR-[NH2])。除了使用修饰肽4代替修饰肽1以外，同实施例1一样处理，形成0.2、0.4和0.6w/v％的肽溶胶4(液相：DMEM)。
关于所得的肽凝胶，与实施例1同样测定力学强度。结果示于图8。如图8所示，在0.4w/v％的肽凝胶4的上述压缩试验中，每单位时间的负荷变化量的绝对值L为0.0618g/s。
[表1]
如图2和4～8所示，可知本发明的肽，与比较例中的自组装肽相比，可形成具有高力学强度的肽凝胶。另外，如图3所示，可知本发明的肽溶胶，因为具有高的力学强度，故可操作性极为优异。此外，本发明的肽在低肽浓度下即可形成足够力学强度的肽凝胶，因此在成本上也有利。
[实施例5]
将含有2.0×106cells/ml细胞浓度的鼠成肌细胞(L6)的细胞悬浮液与含有1.0w/v％上述修饰肽1的肽水溶液，以体积比3∶2(细胞悬浮液∶肽水溶液)混合。通过将得到的混合物(细胞浓度：1.2×106cells/ml，肽浓度：0.4w/v％)加入***式细胞培养皿(CellCultureInsert)(BDFalcon公司制，产品编号“353096”)中并在室温静置约1分钟，形成肽凝胶。将该凝胶连同***式细胞培养皿安放在加入了1mL的含有10％胎牛血清的DMEM培养基的组织培养用的24孔板(AGCTECHNOGLASS公司制，产品编号“3820-024”)的孔穴中。然后，在5％CO2存在下，在37℃的培养箱中进行细胞培养。从培养开始2日后，仅进行一次培养基更换。培养开始后，在第1、2和4日取出凝胶，使用商品名“CyQUANT(注册商标)CellProliferationAssaykit*forcellsinculture**1000assays*”(Invitrogen公司制，产品编号“C7026”)进行DNA定量，计算细胞增殖率。细胞增殖率在刚开始培养后设为100％时，1日后为150％，2日后为180％，4日后为310％，随着天数的增加细胞数增加(算出结果为n＝3的平均)。
[实施例6]
除了使用修饰肽2代替修饰肽1以外，同实施例5那样处理，进行细胞培养和DNA定量。计算细胞增殖率的结果是，细胞增殖率，刚开始培养后设为100％时，在1日后为140％，2日后为160％，4日后为250％，随着天数的增加细胞数增加(算出结果为n＝3的平均)。
[实施例7]
在碳酸钠溶液溶解上述修饰肽1，制备0.5w/v％的肽水溶液(碳酸钠的最终浓度：2.75mM)。使用高压灭菌锅装置(三洋电机公司制，产品编号“MLS3020”)在121℃条件下，对该肽水溶液，进行20分钟的灭菌处理，制得肽凝胶。将该凝胶与在DMEM培养基中悬浮了小鼠NIH3T3细胞制得的细胞悬浮液，以2∶1(凝胶∶细胞悬浮液)的体积比通过移液枪吸放而均匀混合。在5个***式细胞培养皿(BDFalcon公司制，产品编号“353096”)各加入100μL得到细胞-凝胶混合物，并将该***式细胞培养皿安放在加入了1mL含有10％胎牛血清的DMEM培养基的组织培养用24孔板(AGCTECHNOGLASS公司制，产品编号“3820-024”)的孔穴中。此时，细胞-凝胶混合物中的细胞浓度为1.45×105cell/100μL。然后，在5％CO2存在下37℃的培养箱中进行细胞培养。从培养开始0日后(2小时后)、1日后、3日后和5日后使用商品名“CellCountingkit8”(同仁化学公司制)测定细胞增殖率。其结果如图9所示，随着培养天数的增加，细胞增殖率也增加。
上述细胞增殖率的具体的测定步骤如下。即，将孔穴内1mL的培养基更换成新鲜的1mL培养基，加入CellCountingkit8溶液100μL，并在该孔穴内放入***式细胞培养皿，并在37℃培养2小时。培养后，将100μL浸透在***式细胞培养皿内的凝胶上的培养基移至96孔板中，使用微孔板检测仪测定在450nm波长的该培养基的吸光度。将培养开始0日后得样品的吸光度定义为100，求出各培养天数的细胞增殖率。
由实施例5～7的结果可知，本发明的肽凝胶具有生物体适应性，可作为细胞培养用基材恰当使用。
[实施例8]
在碳酸钠溶液溶解上述修饰肽1，制备0.5w/v％的肽水溶液(碳酸钠的最终浓度：4.5mM)。该肽水溶液的pH为中性区域。使用高压灭菌锅装置(三洋电机公司制，产品编号“MLS3020”)，对该肽水溶液进行121℃、20分钟的灭菌处理。使用飞行时间型质谱仪(Bruker公司制，产品编号“autoflexIII”)，由基质辅助激光解吸电离飞行时间型质谱分析法(MALDI-TOF-MS)测量灭菌处理前后肽水溶液中所含肽分子的质量。结果示于图10中。
[比较例3]
除了使用商品名“PuraMatrixTM”(3DMatrix公司制)代替修饰肽1的肽水溶液以外，同实施例8一样进行灭菌处理及质谱分析(MALDI-TOF-MS)。结果示于图11中。
如图10所示，本发明的肽经灭菌处理不会发生实质上的分解。因此，通过对本发明的进行肽灭菌处理，可实现无菌状态。另一方面，如图11所示可知商品名“PuraMatrixTM”(3DMatrix公司制)经灭菌处理，发生肽的分解。推测这是因为商品名“PuraMatrixTM”(3DMatrix公司制)为酸性肽水溶液。
[实施例9]
在碳酸钠溶液溶解上述修饰肽1，配制0.8w/v％的肽水溶液(碳酸钠的最终浓度：4.5mM)。将得到的肽水溶液在22℃静置2小时形成肽凝胶。将该凝胶不经处理移至玻璃培养皿(φ6cm)中。此时的照片示于图12(a)。如图12(a)所示，在凝胶中有气泡，而且很硬，无法均匀包被培养皿。
将上述培养皿连同凝胶放入-20℃的冰箱中使凝胶冷冻。冷冻凝胶的照片示于图12(b)。之后，将培养皿从冰箱中取出，在室温条件下一边摇动培养皿一边使胶融解，得到的溶胶在培养皿底部全面展开。通过在该状态下静置培养皿，再形成凝胶。由此，可获得肽凝胶在整个底部均匀包被的培养皿。该培养皿的照片示于图12(c)中。
[实施例10]
除了使用载玻片代替培养皿以外，同实施例9一样处理，获得肽凝胶均匀包被整个表面的载玻片。凝胶移至载玻片时的照片、冷冻凝胶的照片、及以肽凝胶均匀包被整个表面的载玻片的照片分别示于图13(a)、(b)和(c)。
工业上的可利用性
本发明的自组装肽等可适用于再生医疗、药物传递***、化妆品、人工玻璃体、止血剂、美容整形用注射剂、骨填充物、关节润滑剂、湿润用保水材料等。
序列表自由文本
序列编号1为本发明的自组装肽。
序列编号2为本发明的自组装肽。
序列编号3为本发明的修饰肽。
序列编号4为本发明的非自组装肽。
序列编号5为本发明的非自组装肽。
序列编号6为本发明的自组装肽。
序列编号7为本发明的自组装肽。
序列编号8为本发明的自组装肽。
序列编号9为本发明的自组装肽。
序列编号10为本发明的自组装肽。
序列编号11为本发明的自组装肽。
序列编号12为本发明的修饰肽。

Claims (11)

1.一种自组装肽，其特征在于：
其是由RLDLRLALRLDLR(序列编号1)或RLDLRLLLRLDLR(序列编号2)的氨基酸序列构成的肽。
2.一种具有自组装能力的修饰肽，其特征在于：
其是由权利要求1所述的自组装肽的N末端氨基和/或C末端羧基经修饰后得到的、由RLDLRLALRLDLRL(序列编号3)或RGDNRLDLRLALRLDLR(序列编号12)的氨基酸序列构成的肽。
3.一种具有自组装能力的修饰肽，其特征在于：
其是将由RLDLRLALRLDLR(序列编号1)、RLDLRLLLRLDLR(序列编号2)、RLDLRLALRLDLRL(序列编号3)或RGDNRLDLRLALRLDLR(序列编号12)的氨基酸序列构成的肽的N末端乙酰化，并将C末端酰胺化后得到的修饰肽。
4.一种肽凝胶，其特征在于：
由含有权利要求1所述的自组装肽和/或权利要求2或3所述的修饰肽的水溶液所形成。
5.如权利要求4所述的肽凝胶，其特征在于：
所述水溶液还含有添加物。
6.如权利要求5所述的肽凝胶，其特征在于：
所述添加物选自pH调节剂、氨基酸类、维生素类、糖类、醇类、色素、荷尔蒙、细胞因子、肽、酶、抗体、DNA和RNA中的至少一种。
7.如权利要求5所述的肽凝胶，其特征在于：
所述添加物选自多糖类、多元醇类中的至少一种。
8.如权利要求4～7中任一项所述的肽凝胶，其特征在于：
在22℃的温度条件下，使用前端为直径3.2mm、曲率半径1.6mm的球状夹具，以0.05mm/s的压缩速度进行压缩试验时，从压缩开始至8～10秒钟后为止的测定值的近似直线中，每单位时间的负荷变化量的绝对值L为0.03g/s以上。
9.一种细胞培养用基材，其特征在于：
其含有选自权利要求1所述的自组装肽、权利要求2或3所述的修饰肽和权利要求4～8中任一项所述的肽凝胶中的至少一种。
10.一种无菌肽的制造方法，其特征在于，包括：
将权利要求1所述的自组装肽和/或权利要求2或3所述的修饰肽，在加压条件下，在100℃以上灭菌的工序。
11.一种以肽凝胶包被的物品的制造方法，其特征在于，包括：
冷冻权利要求4～8中任一项所述的肽凝胶的工序；
融解该冷冻物而得肽溶胶的工序；
将包被对象物品的表面的至少一部分用肽溶胶包被的工序；以及
由该肽溶胶再形成肽凝胶的工序。
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