CN101563451B

CN101563451B - 芽孢杆菌属物种195的α-淀粉酶多肽的组合物及用途

Info

Publication number: CN101563451B
Application number: CN2007800468791A
Authority: CN
Inventors: N·S·阿明; M·埃斯塔布鲁克; B·E·琼斯; M·科尔克曼; C·弗勒门; W·韦勒
Original assignee: Danisco USA Inc
Current assignee: Danisco USA Inc; Danisco US Inc
Priority date: 2006-12-21
Filing date: 2007-12-06
Publication date: 2012-09-05
Anticipated expiration: 2027-12-06
Also published as: US8097444B2; CN101563451A; JP2010512787A; EP2097519A2; CA2673527A1; RU2009128054A; US20120142074A1; HK1139174A1; BRPI0722093A2; KR20090101193A; US20100035787A1; RU2459867C2; US8470758B2; MX2009005655A; WO2008088493A2; WO2008088493A3

Abstract

本发明公开包含来自芽孢杆菌属物种195的α淀粉酶的组合物、以及使用该酶清洁表面和织物的方法。本发明还公开具有不同信号序列的酶变体。

Description

芽孢杆菌属物种195的α-淀粉酶多肽的组合物及用途

发明领域

本文公开使用获自芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)195的α-淀粉酶的组合物及方法。

背景技术

淀粉是由直链淀粉(15-30％w/w)和支链淀粉(70-85％w/w)的混合物组成。直链淀粉由具有分子量(MW)为约60,000至约800,000的α-1，4-连接的葡萄糖单元的线性链所组成。支链淀粉是每24-30个葡萄糖单元含有一个α-1，6分支点的分支聚合物；其MW可高达1亿。

目前，通过酶催化的工艺自淀粉生产浓缩的葡萄糖浆形式的糖，该工艺包括：(1)用α-淀粉酶将固态淀粉液化(或降低粘度)为具有平均聚合度约7-10的糊精，和(2)用淀粉葡萄糖苷酶(也称作葡糖淀粉酶或GA)将生成的液化淀粉(即淀粉水解产物)糖化。生成的浆液具有高葡萄糖含量。多数商品化生产的葡萄糖浆液随后被酶促异构化为称作异糖浆(isosyrup)的葡萄糖/果糖混合物。

α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)通过随机切割内部的α-1-4-糖苷键而水解淀粉、糖原和相关的多糖。这一酶在诸如糖业、酿造业、酒业和纺织品工业中具有多种重要的商业应用。α-淀粉酶可以分离自多种细菌、真菌、植物和动物源。工业上，许多重要的α-淀粉酶分离自芽孢杆菌属(Bacillus)。

多年来，α-淀粉酶已用于多种不同目的，包括淀粉液化、纺织品退浆、纸和纸浆业中的淀粉改性以及用于酿造。这些酶也可以用于在餐具洗涤和衣物洗涤期间去除含淀粉的污渍。

一种已被测序的芽孢杆菌α-淀粉酶来自芽孢杆菌属物种195(BAA)。其由两个结构域组成：类似于动物α-淀粉酶的催化结构域以及含有两个淀粉结合基序的结构域。参见J.Sumitani等人，″New type of starch-bindingdomain：the direct repeat motif in the C-terminal region of Bacillus sp.195号的α-amylase contributes to starch binding and raw starch degrading，″Biochem.J.350：477-484(2000)。在Sumitani等人(2000)中，在变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)(其中异源性表达芽孢杆菌属物种195基因产物)的培养物上清液中发现了三种有活性的基因产物形式。这三种产物为69kDa形式、60kDa形式和50kDa形式。69kDa形式似乎为全长成熟蛋白质，分子量等于根据全长基因的核苷酸序列所计算的分子量。60kDa形式似乎与芽孢杆菌属物种195的天然酶相同并且据推测由在位于C末端的两个淀粉结合基序之间的蛋白水解加工所产生。这一形式与69kDa形式相比，对于生淀粉的结合和降解具有较低的活性。50kDa形式不能结合或降解不溶性淀粉。

已将淀粉酶用于纺织品加工、洗衣和清洁组合物、退浆组合物、及用于烘焙、淀粉液化和加工。因此，一直需要鉴定更易于以降低的成本来生产、以及能提高利润率、节省工厂生产能力和提供更高活性的α-淀粉酶。

发明概述

因此，一方面涉及来自芽孢杆菌属物种195的α-淀粉酶，其可以以增加的量和较低的成本来生产，并解决了工业上的其他需求。这些变体可以用于使用α-淀粉酶的各种组合物和工艺中。

一个目的是提供核酸，在一个备选方案中，提供图2所示的优化的核酸(SEQ ID NO：2)。另一方面提供有效连接到编码地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶信号肽的核酸序列上的α-淀粉酶基因或其截短多肽。

再另一方面提供编码图4所示的截短形式多肽的核酸，其中可以在氨基酸491后的任何残基处(例如，氨基酸492、494、504、509，在任何淀粉结合结构域之后，等)发生截短。

又一方面提供图4的全长多肽或残基491后的任何羧基端截短产物。

又一实施方式提供有效连接编码前述多肽的核酸的载体。

再又一方面考虑具有任何上述核酸或包含所述核酸的载体的分离的宿主细胞。该分离的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。该分离的宿主细胞可以是细菌(例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、B.lautus、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、鼠灰链霉菌(S.murinus)或大肠杆菌(Escherichia coli)。

另一方面考虑包括本文所述多肽的洗涤剂添加剂，其中该洗涤剂添加剂可选地为无粉尘颗粒、微粒、稳定的液体、凝胶或受保护的酶的形式。洗涤剂添加剂中的多肽可以是如上所述的截短的多肽。该洗涤剂添加剂可以在每克洗涤剂添加剂中含有约0.02mg至约200mg多肽。该洗涤剂添加剂还可以含有选自蛋白酶、脂肪酶、过氧化物酶、氧化酶、淀粉分解酶、纤维素酶、聚酯酶(polyesterase)及其任何组合的酶。

另一方面考虑包括任何上述洗涤剂添加剂的洗涤剂组合物。洗涤剂组合物可以可选地包括下述一种或多种：表面活性剂、漂白体系或漂白剂、洗涤剂助剂、聚合物、稳定剂、织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、防腐蚀剂、染料、香料、悬污剂、晦暗抑制剂、荧光增白剂或杀菌剂。洗涤剂组合物可以包括或进一步包括其他酶，其中该酶是蛋白酶、脂肪酶、过氧化物酶、氧化酶、淀粉分解酶、纤维素酶、聚酯酶、或其任何组合。

另一方面考虑包括本文所述多肽的手工或自动餐具洗涤剂组合物。

再又一方面考虑洗涤餐具的方法，包括施用本文所述的手工或自动餐具洗涤剂于需要清洗的餐具上。该清洗餐具的方法可以考虑以使得洗液(wash liquor))含有约0.01ppm至约4ppm量的本文所述多肽的用量加入餐具洗涤剂。

另一方面考虑包括本文所述的洗涤剂添加剂的洗衣洗涤剂组合物。再又一方面考虑织物清洁方法，包括用本文所述的洗涤剂组合物在溶液中洗涤污染的织物。该方法还可以考虑使溶液中本文所述的多肽的量为约0.01至约2ppm。

附图简述

图1A-B：芽孢杆菌属物种195α-淀粉酶的核苷酸编码序列(登录号No.AB006823)。编码amy195信号肽的核苷酸序列的下划线标出。终止密码子如粗体所示。SEQ ID NO：1

图2：经密码子优化后的芽孢杆菌属物种195α-淀粉酶的核苷酸编码序列。在编码成熟amy195蛋白质的核苷酸序列之前是编码地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的信号肽(LAT)的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。编码LAT信号肽的核苷酸序列以下划线标出。以粗体示出终止密码子。由

(GeneArt GmbH，Germany)进行氨基酸密码子优化。

图3：Amy 195的多肽序列(SEQ ID NO：3)。信号序列是残基1-46(下划线)。成熟Amy195始于残基47。用终止密码子替代编码加下划线的粗体残基的密码子，产生遗传截短的形式。由此，Y511、K521和V526(使用图3的编号)为这些遗传截短形式的最后的氨基酸残基。

图4：作为具有LAT信号序列的异源融合蛋白质而示出的Amy195氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。羧基端的小写字母形成属于家族CBD-25的淀粉结合结构域。氨基端的小写字母(残基1-29)为获自地衣芽孢杆菌的淀粉酶信号序列。大写字母表示酶的催化结构域，包括亚结构域A、B和C，预期对于亚结构域A大约跨越残基30-105和208-300；对于亚结构域B大约跨越残基106-207；和对于亚结构域C大约跨越301-492。Val492是该蛋白水解截短形式的最后的氨基酸残基(使用图4的编号)。注意亚结构域A在多肽的线性序列上是不连续的。

图5：pHPLT载体中编码芽孢杆菌属物种195的α-淀粉酶的核酸与编码LAT信号序列的核酸以及与LAT终止序列连接的示意图。pHPLT质粒是本领域已知的(参见例如美国专利No.5,871,550和6,562,612，以及美国专利公开20060014265)。已将pHPLT载体引入了缺失9种蛋白酶的枯草杆菌菌株并在其中表达amy195基因(参见US20050202535A1)。

图6示出对Amy195酶的性能分析试验的结果(作为pH和蛋白质浓度的函数)。所分析的级分为图10上指示为e-池的级分。在96孔板试验中进行该分析。将被有色的稻淀粉污染的四分之一英寸的织物布样(Testfabrics Inc.，CS28有色的稻淀粉)放到每个孔中。缓冲液：25mMHEPES pH 8.0或25mM CAPS pH 10.3加入每孔。于40℃预孵育该板。通过加入Amy195酶至终浓度为0ppm至2ppm来起始反应。在40℃，在Eppendorf Thermomix装置中以750rpm振荡孵育该板10分钟。这一孵育后，将上清液移至新的96孔板并在Spectra Max 190型MolecularDevices平板读取器中于488nm读取吸光度。在来自Erithicus软件的GRAFIT软件包的辅助下对数据绘图。数据点利用与Michaelis-Menten拟合算法采用相同形式的Langmuir等温线拟合算法(可获自该软件)进行拟合。每个表达的Amy195蛋白质都含有来自LAT的信号肽，但是该信号肽在分泌过程中被剪掉并且不存在于成熟Amy195蛋白质中。

图7：对图10示出的所有蛋白水解片段的性能分析。按实施例3和图6在pH 8的图注所述进行该分析和绘图。数据显示了所有级分与OxAm(Genencor International，Inc.)相比都具有相同或更好的性能。

图8：跑SDS聚丙烯酰胺凝胶并且示出了遗传截短的Amy195分子的表达。示出的截短为残基494、504和509的C端截短(使用图4的编号)。按照实施例2所述进行表达培养并且使用OxAm(用作密度标准)估计浓度。

图9：遗传截短的Amy195淀粉酶变体的应用性能。使用未经进一步纯化的培养物上清进行性能分析。实施例3和图6在pH 8.0的图注描述了分析程序和数据绘图。该数据示出了所有截短的分子都比OxAm表现更好。

图10：对包含Amy195蛋白水解片段的、来自β-环糊精柱的级分分析。以“w1”(“洗涤1”，其为用25mM Bis-Tris丙烷，pH 8.5，2mM CaCl₂ 自柱洗脱的)；“w2”(“洗涤2”，其为用又一等分的相同缓冲液洗脱的)和“e-池”(用50mM β-环糊精在相同的缓冲液中洗脱的级分，其以三种不同浓度上样到凝胶上)。通过标准方法在本实验室从β-环糊精(Sigma Aldrich Cat.No.c4767)和环氧活化的Sepharose-6B(GEHealthcare，NJ.Cat.No.17-0480-01)合成用于β-环糊精柱的基质。

发明详述

本申请涉及包括芽孢杆菌属物种195α-淀粉酶的组合物及使用方法。还公开了关于如何通过修饰成熟α-淀粉酶的多肽序列来产生α-淀粉酶及异源形式的变体方案。

衣物和餐具污渍在组成上变化极大并且因此在其可被去除的能力上也变化很大。市场上相对少数的淀粉酶可以用于衣物和餐具两者。获自芽孢杆菌属物种195的α-淀粉酶没有显示出与商用的任何细菌淀粉酶的高同一性。因此，一方面涉及使用野生型蛋白质作为骨架，通过例如降低Ca²⁺依赖性、提高LAS稳定性、提高pH范围、提高温度范围、增强比活性等来鉴定对于餐具和衣物具有增强的特性的变体。

1.定义和缩写

在本详述中，应用下面的缩写和定义。必须注意如本文所使用，除非上下文另有明确指明，否则单数形式“一”、“一个”和“该”涵盖对复数形式的提及。因此，例如，提到“一种酶”包括多种此类酶，而提到“该剂量”包括一种或多种剂量以及本领域技术人员已知的其等价剂量，等等。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。下面提供如下的术语。

1.1缩写

除非在本说明书中讨论的上下文中另有定义，否则下面的缩写具有相关联的含义。

AE 醇乙氧基化物

AEO 醇乙氧基化物

AEOS 醇乙氧基硫酸盐

AES 醇乙氧基硫酸盐

Amy 195 来自芽孢杆菌属物种195的α-淀粉酶

AOS α-烯烃磺酸盐

AS 烷基硫酸盐

CBD-25 碳水化合物结合结构域蛋白家族25

cDNA 互补DNA

CMC 羧甲基纤维素

DNA 脱氧核糖核酸

DTMPA 二亚乙基三胺五乙酸

EC 酶学委员会

EDTA 乙二胺四乙酸

EMPA

Materialprüfungs-und ForschungsAnstalt(Swiss Federal Laboratories for Materials Testing and Research)

EO 环氧乙烷(聚合物片段)

F&HC 织物和家居护理

GA 葡糖淀粉酶

IPTG 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷

kDa 千道尔顿

LAS 线性烷基苯磺酸盐

LAT 属于地衣芽孢杆菌淀粉酶(例如地衣芽孢杆菌淀粉酶信号序列或终止子)

MW 分子量

MWU 改良Wohlgemuth单位；1.6×10^-5mg/MWU＝活性单位

NOBS 壬酰基氧基苯磺酸盐

NTA 次氮基乙酸

OxAm Purastar HPAM 5000L(Genencor International，Inc.)

PEG 聚乙二醇

pI 等电点

PVA 聚(乙烯醇)

PVP 聚(乙烯吡咯烷酮)

RNA 核糖核酸

SAS 链烷磺酸盐

SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳

sp. 物种

TAED 四乙酰基乙二胺

w/v 重量/体积

w/w 重量/重量

1.2定义

术语“淀粉酶”或“淀粉分解酶”旨在包括任何淀粉酶，例如葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、芽孢杆菌属物种(例如地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌)的野生型α-淀粉酶。“淀粉酶”应指这样的酶，其能够催化淀粉的降解等。淀粉酶是断裂淀粉中α-D-(1→4)O-糖苷键的水解酶。通常，将α-淀粉酶(EC 3.2.1.1；α-D-(l→4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)定义为以随机方式切开淀粉分子内α-D-(1→4)O-糖苷键的内切酶。与此不同，诸如β-淀粉酶(EC 3.2.1.2；α-D-(1→4)-葡聚糖麦芽糖水解酶)等外切酶和如产麦芽糖(maltogenic)α-淀粉酶(EC 3.2.1.133)的一些产物特异性淀粉酶从底物的非还原末端切割淀粉分子。β-淀粉酶、α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.20；α-D-葡糖苷葡糖水解酶)、葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3；α-D-(1→4)-葡聚糖葡糖水解酶)，以及产物特异性淀粉酶可以从淀粉产生特定长度的低聚麦芽糖。

“淀粉酶变体”、“α-淀粉酶变体”、“α-淀粉酶变体多肽”和“变体酶”指已经例如通过使用另一种α-淀粉酶的信号序列而被修饰和已经进行了序列优化的芽孢杆菌属物种195的α-淀粉酶蛋白质。如本文所使用，“亲本酶”、“亲本序列”、“亲本多肽”、“野生型α-淀粉酶蛋白质” 和“(复数形式的)亲本多肽”应指α-淀粉酶变体多肽所衍生自的酶和多肽。亲本酶可以是野生型酶或者是之前已经被重组改造过的α-淀粉酶。因此，α-淀粉酶多肽可以是重组改造后的酶。α-淀粉酶变体也可以是含有异源α-淀粉酶多肽的融合蛋白。例如，α-淀粉酶蛋白可以包含与另一芽孢杆菌α-淀粉酶的成熟蛋白质相连的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(LAT)信号肽。术语“变体”可与术语“突变体”互换使用。变体应包括多肽以及核酸。变体应包括***；这些变体还可以在一个或多个位置上含有其它的替代、***、颠换、截短和/或倒位。变体可以包括与能够同本文所示核苷酸序列杂交的序列相互补的序列。例如，变体序列可以与能够在严紧条件(例如50℃和0.2X SSC{1X SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸三钠，pH 7.0})下同本文所示核苷酸序列杂交的序列互补。术语变体还可以包括与能够在高严紧条件(例如65℃和0.1X SSC{1X SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸三钠，pH 7.0})下同本文所示核苷酸序列杂交的序列相互补的序列。

“芽孢杆菌属物种195的α-淀粉酶”、“Amy195α-淀粉酶”、或“Amy195”指编码图3的蛋白质的核酸(图1)或图2的合成核酸序列(其也编码图4的蛋白质)。其也可以包括任何截短形式(即残基492后被天然地、重组地或合成地截短的形式，没有信号序列的酶形式，或者具有异源信号序列且在羧基端截短的形式)。此外，该术语也可以包括含有非天然存在的氨基酸替代、缺失、***、或N-或C末端的氨基酸延伸的、图3的任何衍生序列及其编码DNA序列。

“分离的”指序列至少基本上不含有与该序列天然相关的且天然存在的至少一种其它组分。

“纯化的”指物质处于相对纯的状态，例如至少约90％纯的，或至少约95％纯的，或至少约98％纯的。

“热稳定的”指酶在暴露于升高的温度后保持活性的能力。以酶的半衰期来测量酶诸如α-淀粉酶的热稳定性。半衰期(t_1/2)是在规定的条件下丧失一半酶活性的时间(以分钟、小时或天计)。通过测量残留的α-淀粉酶活性来计算半衰期值。

“pH范围”指酶自酸性至碱性条件(跨越5个或更多个pH单位)展示催化活性的能力。

如本文所使用，“pH稳定的”指酶在广的pH范围内保持活性的能力。

如本文所使用，“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。

如本文所使用，“核苷酸序列”或“核酸序列”指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，以及其变体、同源物、片段和衍生物(例如其部分)。核苷酸序列可以是基因组的或合成的或重组的来源，并且可以是双链或单链(代表正义或反义链)。如本文所使用，术语核苷酸序列包括基因组DNA、cDNA、合成的DNA和RNA。

“同源物”应指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有一定程度同一性的实体。同源序列旨在包括与主题序列具有至少75％、80％、85％或90％同一性，或者具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。通常，同源物将包括与主题氨基酸序列相同的活性位点。

如本文所使用，“杂交”应包括核酸链通过碱基配对与互补链结合的过程，以及如在聚合酶链式反应(PCR)技术中进行的扩增过程。α-淀粉酶变体核酸可以以单链或双链DNA或RNA、RNA/DNA异源双链体或RNA/DNA共聚物形式存在。

如本文所使用，“共聚物”指包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸两者的单个核酸链。α-淀粉酶核酸甚至可以经密码子优化以进一步增加表达。

如本文所使用，“合成的”应指通过体外化学或酶促合成而产生的。其包括，但不限于，制备的对于宿主生物具有最佳密码子使用的α-淀粉酶变体核酸，宿主生物例如但不限于毕赤酵母属(Pichia)、链霉菌属(Streptomyces)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和汉逊酵母属(Hansenula)。

如本文所使用，“转化的细胞”应包括通过重组DNA技术的应用而已被遗传改变的细胞。转化通常通过一条或多条核苷酸序列向细胞中的插入而发生。***的核苷酸序列可以是异源核苷酸序列(即，对于要被转化的细胞而言并非天然的序列，例如编码融合蛋白的序列)。

如本文所使用，“有效连接的”应指所述及的组分之间的关系将允许它们以它们期望的方式发挥功能。与编码序列有效连接的调节序列是以如下方式实现连接的，即，在该连接方式中所述编码序列能够在与该控制序列相容的条件下获得表达。

如本文所使用，“生物活性的”应指与天然序列具有相似的结构功能(但不必是相同的程度)和/或相似的调控功能(但不必是相同的程度)和/或相似的生化功能(但不必是相同的程度)的序列。

2.核酸和其编码的多肽

芽孢杆菌属物种195的核酸序列可以与各种启动子和调节序列在载体中有效连接并在各种宿主细胞中表达。GenBank登录号AB006823公开了2103个残基的核酸序列(参见图1A-B)。GenBank登录号BAA22082.1公开了由该2103个残基的核酸序列编码的且长度为700个氨基酸的多肽序列(图3)。头46个氨基酸形成信号肽。切割发生在残基46(Ala46)之后。

当在枯草芽孢杆菌中表达时，通过凝胶可见存在该蛋白质的三种经蛋白水解加工的形式。这些形式都具有相同的氨基末端但它们的羧基末端不同。49.5kDa形式终止在残基Val492(图4的序列)，即在残基492后发生蛋白水解切割。两种较长形式(69kDa和60kDa)分别含有如Sumitani等人(2000)中讨论的一个和两个淀粉结合结构域。产生了遗传上C末端截短的形式，这些产物具有Tyr494、Lys504和Val509的C末端残基。如图8中显示的，在LAT启动子和信号序列控制下，这些重组产生的截短产物在缺失9种蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株(参见US20050202535A1)中都以高水平表达。

2.1融合蛋白和重组蛋白

一方面考虑融合蛋白，其中来自其它微生物(例如酵母或其他细菌) 的淀粉酶信号序列用于与芽孢杆菌属物种195的成熟蛋白质相连。即，可以除去形成图3的信号序列的头46个氨基酸并替换成来自另一微生物的信号序列或来自另一微生物的信号序列的变体。例如，如图4所示的，LAT序列(下划线的且小写)可以代替此头46个氨基酸。

其它实例包括但不限于用于在枯草芽孢杆菌中表达的枯草芽孢杆菌淀粉酶(amyE)信号序列，也用于在枯草芽孢杆菌中表达的枯草芽孢杆菌aprE启动子和信号序列。此外，可以考虑使用链霉菌启动子和来自CelA的信号序列来检测在链霉菌中的表达。

3.生产和纯化蛋白质的方法

自芽孢杆菌分泌至培养基中的蛋白质的生产和纯化方法是本领域已知的，同样用于生产α-淀粉酶的适宜宿主细胞也是本领域已知的。以下公开用于生产α-淀粉酶的示例性方法。

3.1用于生产α-淀粉酶的材料和方法

可以使用通常包括编码适宜的启动子、操纵基因、核糖体结合位点、翻译起始信号、和可选地阻遏基因或各种激活物基因的控制序列的表达载体，以酶的形式，表达由本文公开的方法或由任何本领域已知的替代方法产生的编码Amy195α-淀粉酶或其变体的DNA序列。

例如，可以按照T.Kawaguchi等人，″Purification and some propertiesof a Haim-sensitive α-amylase from newly isolated Bacillus sp.No.195，″Biosc.Biotechnol.Biochem.56：1792-1796(1992)所述，在30℃生长芽孢杆菌属物种195。或者，可以将有效连接到载体上的编码α-淀粉酶的基因转染到另一生物，例如变铅青链霉菌TK-24中并在如J.Sumitani等人，″Newtype of starch-binding domain：the direct repeat motif in the C-terminalregion of Bacillus sp.no.195α-amylase contributes to starch binding andraw starch degrading，″ Biochem.J.350：477-484(2000)所述的适宜条件下培养。

携带编码Amy195α-淀粉酶或其变体的DNA序列的重组表达载体可以是任何可方便地进行重组DNA操作的载体，并且载体的选择通常将取决于其待引入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制载体，即以染色体外实体形式存在的载体，其复制与染色体复制无关，例如质粒、噬菌体或染色体外元件、微染色体或人工染色体。或者，载体可以是当被引入到分离的宿主细胞中后能整合到宿主细胞基因组中并且与其所整合到的染色体一起复制的载体。该整合的基因也可以通过使用可扩增构建体(amplifiedconstruct)来扩增，以在染色体中产生该基因的多个拷贝，所述可扩增构建体可以由抗生素选择或者其它选择压力(例如必需调节基因)来驱动，或者可以通过互补作用利用必需代谢途径基因的剂量效应来驱动。

载体中，DNA序列应与适宜的启动子序列有效连接。启动子可以是任何在所选宿主细胞中显示转录活性的DNA序列，并且可源自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。示例性的可用于引导编码Amy 195α-淀粉酶或其变体的DNA序列转录(尤其在细菌宿主中)的启动子是大肠杆菌lac操纵子的启动子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因dagA或celA启动子、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶(amyQ)的启动子、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等。对于真菌宿主中的转录，有用的启动子的实例是源自编码米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白水解酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶或构巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶的基因的启动子。当在诸如大肠杆菌的细菌物种中表达编码α-淀粉酶变体多肽的基因时，可以例如从噬菌体启动子(包括T7启动子和λ噬菌体启动子)，选择适合的启动子。适于在酵母物种中表达的启动子的实例包括但不限于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的Gal 1和Gal 10启动子和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的AOX1或AOX2启动子。对于在里氏木霉中表达，可使用CBHII(纤维二糖水解酶II)启动子。

表达载体也可包括与编码Amy195α-淀粉酶或其变体的DNA序列有效连接的适宜转录终止子以及，在真核生物中，多腺苷酸化序列。终止序列和多腺苷酸化序列可适宜地源自与启动子相同的来源。

载体还可包括允许载体在宿主细胞中复制的DNA序列。该序列的实例是质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起点。

载体也可包括选择标记，例如其产物能在分离的宿主细胞中弥补缺陷的基因，例如来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性)的基因。此外，载体可包括曲霉属(Aspergillus)选择标记，例如amdS、argB、niaD和xxsC(产生潮霉素抗性的标记)，或者可通过诸如本领域已知的共转化实现选择。参见例如，国际PCT申请WO 91/17243。

虽然细胞内表达或固体发酵在一些方面可能是有益的，例如当使用某些细菌或真菌作为宿主细胞时，但一个方面考虑Amy 195α-淀粉酶或其变体在培养基中的表达。一般，α-淀粉酶包括位于氨基末端以允许其分泌到培养基中的信号序列。如果需要，可由不同的序列代替这一信号肽，这可以通过编码相应信号多肽的DNA序列的替代而方便地实现。α-淀粉酶的信号序列通常表征为具有三个结构域，N-末端结构域、H-结构域和C末端结构域，并且通常长度在18-35个残基间变化，但也可以更长，如Amy195信号序列所示例的。

表达载体通常包括克隆载体的组分，例如允许载体在所选的宿主生物中自主复制的元件和一或多个用于选择目的的表型可检测的标记。表达载体通常包括控制核苷酸序列，例如启动子、操纵基因、核糖体结合位点、翻译起始信号和任选地阻遏基因或者一或多个激活物基因。此外，表达载体可包括编码能够将α-淀粉酶变体靶向宿主细胞的细胞器(例如过氧化物酶体)或特定宿主细胞区室的氨基酸序列的序列。该靶向序列包括但不限于序列SKL。为了在控制序列的指导下表达，以对于表达而言适当的方式将α-淀粉酶变体的核酸序列有效连接到控制序列上。图5显示了示例性载体的一部分。

用于分别连接编码α-淀粉酶变体的DNA构建体、启动子、终止子和其他元件，以及用于将它们***到含有复制所需信息的适宜载体中的方法是本领域技术人员公知的(参见例如，Sambrook等人，MOLECULARCLONING：A LABORATORY MANUAL，第二版，Cold Spring Harbor，1989，和第三版2001)。

有益地，将包括DNA构建体或表达载体的分离的细胞用作重组生产Amy 195α-淀粉酶或其变体的宿主细胞。可用编码该酶的DNA构建体，通过将该DNA构建体(以一个或多个拷贝)整合到宿主染色体中而方便地转化细胞。通常认为这一整合是有利的，因为DNA序列更有可能稳定地保持在细胞中。可根据常规方法，例如通过同源或异源重组实现DNA构建体向宿主染色体的整合。或者，可以用与不同类型的宿主细胞相关的上述表达载体转化细胞。

适合的细菌宿主生物的实例为***物种，例如芽孢杆菌科(Bacillaceae)，包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽胞杆菌、Bacillus lautus、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和苏云金芽孢杆菌；链霉菌属物种如鼠灰链霉菌；乳酸细菌物种包括乳球菌属(Lactococcus spp.)，如乳酸乳球菌；乳杆菌属(Lactobacillus spp.)包括罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)；明串珠菌属(Leuconostoc spp.)，片球菌属(Pediococcus spp.)和链球菌属(Streptococcus spp.)。或者，可以选择属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(包括大肠杆菌)或者属于假单胞菌科(Pseudomonadaceae)的革兰氏阴性细菌物种的菌株作为宿主生物。

适宜的酵母宿主生物可以选自生物技术相关酵母物种，例如但不限于酵母物种，如毕赤酵母属、汉逊酵母属、或克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowinia)，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)物种，或酵母属(Saccharomyces)物种，包括酿酒酵母或属于裂殖酵母属的物种，如粟酒裂殖酵母(S.pombe)物种。甲基营养酵母物种(巴斯德毕赤酵母)菌株可以用作宿主生物。或者，宿主生物可以是汉逊酵母属物种。丝状真菌中适宜的宿主生物包括曲霉属物种，例如黑曲霉、米曲霉、塔宾曲霉(Aspergillus tubigensis)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)或构巢曲霉。另外，镰孢霉属物种，如尖镰孢(Fusarium oxysporum)或根毛霉属(Rhizomucor)物种，如米黑根毛霉，可以用作宿主生物。其他合适的菌株包括Thermomyces和毛霉属(Mucor)物种。此外，里氏木霉可用作宿主。转化曲霉属宿主细胞的适宜程序包括例如EP238023中所述的。

再又一方面，提供产生α-淀粉酶Amy195或其变体的方法，包括在有利于酶产生的条件下培养上述宿主细胞以及从该细胞和/或培养基回收酶。

用于培养细胞的培养基可以是任何适于目的宿主细胞生长以及Amy195α-淀粉酶或其变体表达的常规培养基。适合的培养基和培养基组分可获自商品供应商或可根据公开的配方制备(例如按美国典型培养物保藏中心的目录所述)。

一方面，可以将分泌自宿主细胞的酶以全肉汤制备物形式使用。在本发明方法中，可以使用本领域已知的任何培养方法制备重组微生物的用过的全发酵肉汤，从而导致α-淀粉酶表达。因此发酵可以理解为包括在适宜的培养基中在允许淀粉酶表达或分离的条件下进行的摇瓶培养或在实验室或工业发酵罐中进行的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)。术语“用过的全发酵肉汤(spend whole fermentation broth)”在本文定义为包括培养基、细胞外蛋白质(例如酶)和细胞生物质的、未分级分离的发酵物内容物。应理解术语“用过的全发酵肉汤”也包括使用本领域公知的方法已经进行过裂解或透化处理的细胞生物质。

可通过公知的方法从培养基方便地回收分泌自宿主细胞的酶，该方法包括通过离心或过滤从培养基分离细胞，通过诸如硫酸铵的盐沉淀培养基中的蛋白质组分，随后使用诸如离子交换色谱、亲和色谱等的色谱方法。

一方面考虑在载体中将多核苷酸有效连接到能够使宿主细胞实现编码序列的表达的控制序列上，即载体是表达载体。可例如通过加入其它的转录调控元件而修饰控制序列以使得由该控制序列指导的转录的水平更易于响应转录调控因子。控制序列尤其可包括启动子。

可在允许Amy 195α-淀粉酶或其变体表达的适宜条件下培养宿主细胞。酶的表达可以是组成型的以便它们可以连续产生，或可以是诱导型的，从而需要刺激物来起始表达。在诱导型表达的情况下，当需要时可以通过例如向培养基中加入诱导物(例如***或IPTG或Sepharose)来起始蛋白质生产。也可以在体外无细胞体系(例如TnT^TM(Promega)兔网织红细胞体系)中重组产生多肽。

也可以在有氧条件下，于对宿主适合的培养基中培养表达Amy 195α-淀粉酶或其变体的宿主。可以提供振荡或搅拌及通令的组合，在对于该宿主适合的温度，例如约25℃至约75℃(例如30℃至45℃)下进行生产，所述温度取决于宿主的需要以及生产期望的α-淀粉酶变体的需要。可以培养约12至约100小时或更长(以及其间的任何时间值，例如24至72小时)。通常，培养物肉汤在pH约5.5至约8.0，这也取决于宿主所需的培养条件相对于α-淀粉酶变体的生产所需的培养条件。

3.2用于蛋白质纯化的材料和方法

发酵、分离和浓缩技术是本领域公知的并且可以使用常规方法以制备浓缩的含有Amy 195α-淀粉酶或其变体的溶液。

发酵后，获得发酵肉汤，通过常规分离技术除去微生物细胞和各种悬浮的固体(包括残留的发酵原料)以便获得淀粉酶溶液。通常使用过滤、离心、微量过滤、转鼓真空过滤、超滤、离心后超滤、提取或色谱法等。

可能期望浓缩含有Amy 195α-淀粉酶或其变体的溶液以便优化回收率。为收集纯化的酶沉淀物，未浓缩的溶液的使用需要增加的孵育时间。

可以使用常规浓缩技术浓缩含有酶的溶液直到获得期望的酶水平。可通过本文讨论的任何技术实现含酶溶液的浓缩。示例性的纯化方法包括但不限于旋转真空过滤和/或超滤。

将酶溶液浓缩为浓缩的酶溶液，直到所述浓缩的含Amy 195α-淀粉酶或其变体的溶液的酶活性为至少约4g/L(例如，至少约4.8g/L或至少约 5.6g/L或甚至更高)。某些应用中，这些浓度可以增加至高达约25g/L。

用于纯化目的的“沉淀剂”指对于从浓缩的酶溶液中以固体形式(不管其性质如何，即晶体、无定形或两者混合物)沉淀Amy 195α-淀粉酶或其变体有效的化合物。

可以使用例如金属卤化物沉淀剂进行沉淀。金属卤化物沉淀剂包括但不限于：碱金属氯化物、碱金属溴化物和这些金属卤化物的两种或更多种的混合物。示例性的金属卤化物包括氯化钠、氯化钾、溴化钠、溴化钾和这些金属卤化物的两种或更多种的混合物。金属卤化物沉淀剂氯化钠也可以用作防腐剂。

以对沉淀Amy 195α-淀粉酶或其变体有效的量，使用金属卤化物沉淀剂。在常规试验后，本领域熟练技术人员可以容易地至少选择出能够有效地造成酶沉淀的金属卤化物的有效量和最佳量、以及实现最大回收的沉淀条件，包括孵育时间、pH、温度和酶浓度。

通常，将至少约5％w/v(重量/体积)至约25％w/v(且通常是至少8％w/v)的金属卤化物加入浓缩的酶溶液。通常，将不超过约25％w/v的金属卤化物加入浓缩的酶溶液，且通常是不超过20％w/v。金属卤化物沉淀剂的最适浓度将取决于例如具体的Amy 195α-淀粉酶变体的性质以及其在浓缩的酶溶液中的浓度等。

另一可选的实现酶沉淀的方法是使用有机化合物。示例性的有机化合物沉淀剂包括：4-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸的碱金属盐、4-羟基苯甲酸的烷基酯、以及这些有机化合物的两种或更多种的混合物。所述有机化合物沉淀剂的添加可以在金属卤化物沉淀剂的添加之前、与其同时或在其后发生，并且两种沉淀剂(有机化合物和金属卤化物)的添加都可顺序进行或同时进行。

对于进一步的说明，参见例如美国专利No.5,281,526。通常，有机沉淀剂选自4-羟基苯甲酸的碱金属盐(例如钠或钾盐)，以及4-羟基苯甲酸的线性或分支的烷基酯(其中烷基含有1-12个碳原子)，以及这些有机化合物的两种或更多种的混合物。有机化合物沉淀剂可以是例如4-羟基苯甲酸的线性或分支的烷基酯(其中烷基含有1-10个碳原子)，以及这些有机化合物的两种或更多种的混合物。示例性的有机化合物是4-羟基苯甲酸的线性烷基酯(其中烷基含有1-6个碳原子)，以及这些有机化合物的两种或更多种的混合物。也可以使用4-羟基苯甲酸的甲基酯、4-羟基苯甲酸的丙基酯、4-羟基苯甲酸的丁基酯、4-羟基苯甲酸的乙基酯以及这些有机化合物的两种或更多种的混合物。其它有机化合物还包括但不限于4-羟基苯甲酸甲酯(即甲基PARABEN)、4-羟基苯甲酸丙酯(即丙基PARABEN)，两者也是淀粉酶防腐剂。

有机化合物沉淀剂的添加可以提供沉淀条件高灵活性的优点(就pH、温度、Amy 195α-淀粉酶或其变体浓度、沉淀剂浓度和孵育时间而言)。

以对于提高金属卤化物沉淀剂引起的酶沉淀有效的量使用有机化合物沉淀剂。基于本发明公开，在常规试验后，本领有技术人员将可以容易地至少选择出有机化合物沉淀剂的有效量和最佳量、以及用于实现最大回收的沉淀条件，包括孵育时间、pH、温度和酶浓度。

通常，向浓缩的酶变体溶液中加入至少约0.01％w/v的有机化合物沉淀剂且通常至少约0.02％w/v。通常向浓缩的酶变体溶液中加入不多于约0.03％w/v的有机化合物沉淀剂且通常不多于约0.02％w/v。

必要时，可以根据待纯化的酶，调整含有金属卤化物沉淀剂和有机化合物沉淀剂的浓缩的酶溶液的pH。通常，将pH调整至淀粉酶等电点附近。可以将pH调节至位于如下范围内：低于等电点(pI)大约2.5个pH单位至高于等电点约2.5个pH单位。

获得纯化的酶沉淀物所需的孵育时间取决于具体酶的性质、酶浓度、以及具体的沉淀剂(一种或多种)及其浓度。通常，对于沉淀酶有效的时间为约1至约30小时之间；通常不超过约25小时。在有机化合物沉淀剂存在下，孵育时间还可以减少到小于约10小时并且在最多数的情况下甚至是约6小时。

通常，孵育期间的温度为约4℃至约50℃。通常，在约10℃和约45℃之间(例如约20℃和约40℃之间)的温度进行所述方法。用于诱导沉淀的最佳温度根据溶液条件和所用酶及沉淀剂而变化。

可以通过搅拌包括酶、添加的金属卤化物和添加的有机化合物的溶液，提高纯化的酶沉淀物的总回收率以及该方法的实施效率。在添加金属卤化物和有机化合物期间，以及在随后的孵育期均可以进行搅拌步骤。适宜的搅拌方法包括机械搅拌或振荡、强有力的通气或任何类似的技术。

孵育期后，可以通过常规分离技术，例如过滤、离心、微量过滤、旋转真空过滤、超滤、压滤、交叉膜微量过滤(cross membranemicrofiltration)、交叉流膜微量过滤等，自解离的色素以及其他杂质中分离出纯化的酶并收集。可以通过用水洗涤沉淀物获得对纯化的酶沉淀物的进一步纯化。例如，用含有金属卤化物沉淀剂的水，或用含有金属卤化物沉淀剂和有机化合物沉淀剂的水来洗涤纯化的酶沉淀物。

发酵期间，在培养物肉汤中积累Amy 195α-淀粉酶或其变体。为了期望的α-淀粉酶变体的分离和纯化，离心或过滤培养物肉汤以除去细胞，并且将生成的无细胞液体用于酶纯化。一个实施方式中，使用约70％饱和度的硫酸铵对无细胞肉汤进行盐析；然后将70％饱和的沉淀级分溶解在缓冲液中并施加到诸如Sephadex G-100柱的柱中，然后洗脱以回收酶活性级分。为了进一步的纯化，可使用诸如离子交换色谱的常规方法。

纯化的酶对于洗衣和清洁应用是有用的。例如，它们可以用于洗衣洗涤剂和除斑剂。可以将它们制成液体(溶液，浆液)或固体(颗粒，粉末)终产物。

J.Sumitani等人，″New type of starch-binding domain：the directrepeat motif in the C-terminal region of Bacillus sp.no.195α-amylasecontributes to starch binding and raw starch degrading，″Biochem.J.350：477-484(2000)描述了纯化的更加具体的实例并且在此对其进行简述。用80％饱和度的(NH₄)₂SO₄处理获自4升变铅青链霉菌TK24培养物上清液的酶。通过在10,000xg(20分钟和4℃)离心回收沉淀并将沉淀再溶解到含有5mM CaCl₂的20mM Tris/HCl缓冲液(pH 7.0)。然后用相同的缓冲液透析该溶解的沉淀物。然后将透析后的样品施加到先已经用20mM Tris/HCl缓冲液(pH 7.0)，5mM CaCl₂平衡过的Sephacryl S-200柱，然后用相同的缓冲液以7cm/hr的线性流速洗脱。收集来自柱的级分并且通过酶检测法和SDS-PAGE来评估活性。按下述进一步纯化蛋白质。用含有5mM CaCl₂和1.5M(NH₄)₂SO₄的20mM Tris/HCl缓冲液(pH 7.0)平衡Toyopearl HW55柱(Tosoh Bioscience，Montgomeryville，PA；Cat.No.19812)。用在含有5mM CaCl₂的20mM Tris/HCL缓冲液，pH 7.0中的线性梯度1.5-0M(NH₄)₂SO₄洗脱酶。收集活性级分，并以80％饱和度用(NH₄)₂SO₄沉淀酶。按上述回收、再溶解以及透析沉淀物。然后将透析后的样品以60mL/h的流速施加到之前用含有5mM CaCl₂的20mMTris/HCl缓冲液(pH 7.0)平衡的Mono Q HR5/5柱(Amersham Pharmacia；Cat.No.17-5167-01)。收集活性级分并将其加入到1.5M(NH₄)₂SO₄溶液。按前述在Toyopearl HW55柱中对活性酶级分进行再次层析以得到按SDS-PAGE确定为均一的酶。参见J.Sumitani等人，″New type ofstarch-binding domain：the direct repeat motif in the C-terminal region ofBacillus sp.no.195α-amylase contributes to starch binding and raw starchdegrading，″Biochem.J.350：477-484(2000)对于该方法以及其变体方案的一般讨论。

为了生产规模回收，可以按上面一般性描述的方式用聚合物通过絮凝除去细胞来部分纯化酶。或者，可以通过使用可获得的膜和装置，通过微量过滤纯化酶、然后以超滤进行浓缩。然而，对于一些应用，不需要纯化酶，可以裂解全肉汤培养物并使用之而不用进一步处理。之后可以将酶加工成例如颗粒。

4.清洁组合物

Amy 195α-淀粉酶及其变体拥有允许多种工业应用的有价值的特性。这些酶可以用作洗涤、餐具清洗和硬表面清洁洗涤剂组合物的组分。可以将它们配制为洗涤剂添加剂的部分、洗涤剂组合物的部分、机洗或手洗餐具洗涤组合物的部分等。可以以方便用于洗涤剂中的浓度加入Amy 195α- 淀粉酶及其变体。目前考虑的是，在洗涤剂组合物中，可以以相当于每升洗液/餐具洗液中0.00001-1mg(按纯酶蛋白质计算)α-淀粉酶的量加入α-淀粉酶。本文提供示例性配方。

4.1洗衣洗涤剂组合物

因此，Amy195α-淀粉酶或其变体通常可以作为唯一的酶或者与其它酶(包括其他淀粉分解酶)一起成为洗涤剂组合物的组分。同样地，其可以以无粉尘颗粒、稳定的液体或受保护的酶的形式包括在洗涤剂组合物中。可例如，按美国专利No.4,106,991和4,661,452所公开来生产无粉尘颗粒并且可任选地由本领域已知的方法进行包衣。蜡质包衣材料的实例是平均分子量为1,000至20,000的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有16-50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇含有12-20个碳原子且其中有15-80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯及甘油三酯。例如英国专利No.1483591给出了适于通过流床技术应用的成膜包衣材料的实例。可例如通过加入多元醇诸如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸，按照已建立的方法来稳定液态酶制剂。其它酶稳定剂是本领域公知的。可按照如EP 238,216公开的方法来制备受保护的酶。长期以来多元醇被公认为蛋白质的稳定剂，以及可以提高蛋白质的溶解性。参见例如，J.K.Kaushik等人，″Why is trehalose anexceptional protein stabilizer？″J.Biol.Chem.278：26458-65(2003)以及其中引用的参考文献；和Monica Conti等人″Capillary isoelectric focusing：the problem of protein solubility，″J.Chromatography A 757：237-245(1997)。

洗涤剂组合物可以是任何有用的形式，例如粉末、颗粒、糊剂或液体。液体洗涤剂可以是水性的，通常含有高达约70％的水和0％-约3％的有机溶剂。其也可以是只含有约30％水的压缩胶(compact gel)类型的形式。

洗涤剂组合物可以包括一种或多种表面活性剂，其每种都可以是阴离子的、非离子的、阳离子的或两性离子的。洗涤剂将通常包含0％至约50％的阴离子表面活性剂，例如线性烷基苯磺酸盐(LAS)；α-烯烃磺酸盐 (AOS)；烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)(AS)；脂肪醇乙氧基硫酸盐(AEOS或AES)；仲烷磺酸盐(SAS)；α-磺基脂肪酸甲酯；烷基或烯基琥珀酸；或皂。组合物也可包含0％至约40％的非离子表面活性剂，例如醇乙氧基化物(AEO或AE)羧化的醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、或多羟基烷基脂肪酸酰胺(如例如在WO 92/06154中所述)。

洗涤剂组合物可另外包括一种或多种其他酶，例如脂肪酶、其他淀粉分解酶、角质酶、蛋白酶、纤维素酶、过氧化物酶、和/或漆酶的任何组合。

洗涤剂可含有约1％到约65％的洗涤剂助剂或络合剂，如沸石、二聚磷酸盐、三聚磷酸盐、膦酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTMPA)、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如，来自Hoechst的SKS-6)。洗涤剂也可以是未加强的，即基本上不含洗涤剂助剂。可以在与酶的稳定性兼容的任何组合物中使用酶。通常可以用已知的包囊化形式(例如通过在水凝胶中隔离或粒化)来保护酶免于遭遇有害成分。可以将具有或者不具有淀粉结合结构域的酶，并且尤其是α-淀粉酶(例如amy195分子)，用于多种组合物，包括洗衣和洗盘应用、表面清洁剂以及用于从淀粉或生物质中生产乙醇的组合物中。

洗涤剂可包括一种或多种聚合物。实例包括羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。

洗涤剂可含有漂白体系，这可包括H₂O₂来源，例如过硼酸盐或过碳酸盐，它可以与形成过酸的漂白活性剂，如四乙酰基乙二胺(TAED)或壬酰基氧基苯磺酸盐(NOBS)联用。或者，漂白体系可包括过氧酸(例如酰胺、亚胺或砜类过氧酸)。漂白体系也可以是酶促漂白体系，例如过水解酶(perhydrolase)，例如国际PCT申请WO 2005/056783中所述的。

可使用常规稳定剂来稳定洗涤剂组合物中的酶，稳定剂例如多元醇如丙二醇或甘油；糖或糖醇；乳酸；硼酸或硼酸衍生物如硼酸芳香酯；并且可按例如WO 92/19709和WO 92/19708所述配制组合物。

洗涤剂也可含有其它常规洗涤剂成分，例如织物调理剂，包括粘土、增泡剂、抑泡剂、防腐蚀剂、悬污剂、抗污垢再沉积剂、染料、杀细菌剂、晦暗抑制剂、荧光增白剂或香料。

pH(在使用浓度下于水性溶液中测量)通常是中性或碱性，例如pH约7.0至约11.0。

包括Amy 195α-淀粉酶或其变体的洗涤剂组合物可以配制成的具体形式包括：

1)具有体积密度(bulk density)为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约7％至约12％的线性烷基苯磺酸盐(以酸计算)；约1％至约4％的脂肪醇乙氧基硫酸盐(例如C_12-18醇，1-2环氧乙烷(EO))或烷基硫酸盐(例如C_16-18)；约5％至约9％的脂肪醇乙氧基化物(例如C_14-15醇，7EO)；约14％至约20％的碳酸钠(例如Na₂CO₃)；约2至约6％的可溶性硅酸盐(例如Na₂O，2SiO₂)；约15％至约22％的沸石(例如NaAlSiO₄)；0％至约6％的硫酸钠(例如Na₂SO₄)；约0％至约15％的柠檬酸钠/柠檬酸(例如C₆H₅Na₃O₇/C₆H₈O₇)；约11％至约18％的过硼酸钠(例如NaBO₃H₂O)；约2％至约6％的TAED；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0-3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)；0.0001-0.1％蛋白质的酶(按纯酶计算)；和0-5％次要成分(例如抑泡剂、香料、荧光增白剂、光漂白剂)。

2)具有体积密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约6％至约11％的线性烷基苯磺酸盐(以酸计算)；约1％至约3％的脂肪醇乙氧基硫酸盐(例如C_12-18醇，1-2 EO)或烷基硫酸盐(例如C_16-18)；约5％至约9％的脂肪醇乙氧基化物(例如C_14-15醇，7 EO)；约15％至约21％的碳酸钠(例如Na₂CO₃)；约1％至约4％的可溶性硅酸盐(例如Na₂O，2SiO₂)；约24％至约34％的沸石(例如NaAlSiO₄)；约4％至约10％的硫酸钠(例如Na₂SO₄)；0％至约15％的柠檬酸钠/柠檬酸(例如 C₆H₅Na₃O₇/C₆H₈O₇)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；1-6％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；0-5％的次要成分(例如抑泡剂、香料)。

3)具有体积密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约5％至约9％的线性烷基苯磺酸盐(以酸计算)；约7％至约14％的脂肪醇乙氧基化物(例如C_12-15醇，7 EO)；约1至约3％的皂如脂肪酸(例如C_16-22脂肪酸)；约10％至约17％的碳酸钠(如Na₂CO₃)；约3％至约9％的可溶性硅酸盐(例如Na₂O，2SiO₂)；约23％至约33％的沸石(如NaAlSiO₄)；0％至约4％的硫酸钠(例如Na₂SO₄)；约8％至约16％的过硼酸钠(例如NaBO₃H₂O)；约2％至约8％TAED；0％至约1％的膦酸盐(例如EDTMPA)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0-3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；0-5％的次要成分(例如抑泡剂、香料、荧光增白剂)。

4)具有体积密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约8％至约12％的线性烷基苯磺酸盐(以酸计算)；约10％至约25％的脂肪醇乙氧基化物(例如C_12-15醇，7 EO)；约14％至约22％的碳酸钠(如Na₂CO₃)；约1％至约5％的可溶性硅酸盐(例如Na₂O，2SiO₂)；约25％至约35％的沸石(例如NaAlSiO₄)；0％至约10％的硫酸钠(例如Na₂SO₄)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；1-3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如抑泡剂、香料)。

5)水性液体洗涤剂组合物，包括约15％至约21％的线性烷基苯磺酸盐(以酸计算)；约12％至约18％的脂肪醇乙氧基化物(例如C_12-15醇，7 EO或C_12-15醇，5 EO)；约3％至约13％的皂如脂肪酸(例如油酸)；0％至约13％的烯基琥珀酸(C_12-14)；约8％至约18％的氨基乙醇；约2％至约8％的柠檬酸；0％至约3％的膦酸盐；0％至约3％的聚合物(例如PVP，PEG)；0％至约2％的硼酸盐(例如B₄O₇)；0％至约3％的乙醇；约8％至约14％的丙二醇；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如分散剂、抑泡剂、香料、荧光增白剂)。

6)水性结构型液体洗涤剂组合物，包括约15％至约21％的线性烷基苯磺酸盐(以酸计算)；3-9％的脂肪醇乙氧基化物(例如C_12-15醇，7 EO或C_12-15醇，5 EO)；约3％至约10％的皂如脂肪酸(例如油酸)；约14％至约22％的沸石(如NaAlSiO₄)；约9％至约18％的柠檬酸钾；0％至约2％的硼酸盐(例如B₄O₇)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0％至约3％的聚合物(例如PEG，PVP)；0％至约3％的锚型聚合物(anchoringpolymer)，例如甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物；摩尔比25∶1，MW 3800)；0％至约5％的甘油；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如分散剂、抑泡剂、香料、荧光增白剂)。

7)具有体积密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约5％至约10％的脂肪醇硫酸盐；约3％至约9％的乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺；0-3％的皂如脂肪酸；约5％至约10％的碳酸钠(例如Na₂CO₃)；约1％至约4％的可溶性硅酸盐(例如Na₂O，2SiO₂)；约20％至约40％的沸石(例如NaAlSiO₄)；约2％至约8％的硫酸钠(例如Na₂SO₄)；约12％至约18％的过硼酸钠(例如NaBO₃H₂O)；约2％至约7％的TAED；约1％至约5％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如荧光增白剂，抑泡剂、香料)。

8)颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约8％至约14％的线性烷基苯磺酸盐(以酸计算)；约5％至约11％的乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺；0％至约3％的皂如脂肪酸；约4％至约10％的碳酸钠(例如Na₂CO₃)；约1％至约4％的可溶性硅酸盐(Na₂O，2SiO₂)；约30％至约50％的沸石(例如NaAlSiO₄)；约3％至约11％的硫酸钠(例如Na₂SO₄)；约5％至约12％的柠檬酸钠(例如C₆H₅Na₃O₇)；约1％至约5％的聚合物(例如PVP，马来酸/丙烯酸共聚物，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如抑泡剂、香料)。

9)颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约6％至约12％的线性烷基苯磺酸盐(以酸计算)；约1％至约4％的非离子表面活性剂；约2％至约6％的皂如脂肪酸；约14％至约22％的碳酸钠(例如Na₂CO₃)；约18％至约32％的沸石(例如，NaAlSiO₄)；约5％至约20％的硫酸钠(例如Na₂SO₄)；约3％至约8％的柠檬酸钠(例如C₆H₅Na₃O₇)；约4％至约9％的过硼酸钠(例如NaBO₃H₂O)；约1％至约5％的漂白活性剂(例如NOBS orTAED)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；约1％至约5％的聚合物(例如聚羧酸酯或PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如，荧光增白剂、香料)。

10)水性液体洗涤剂组合物，包括约15％至约23％的线性烷基苯磺酸盐(以酸计算)；约8％至约15％的脂肪醇乙氧基硫酸盐(例如C_12-15醇，2-3 EO)；约3％至约9％的脂肪醇乙氧基化物(例如C_12-15醇，7 EO或C_12-15醇，5 EO)；0％至约3％的皂如脂肪酸(例如月桂酸)；约1％至约5％的氨基乙醇；约5％至约10％的柠檬酸钠；约2％至约6％的水溶增溶物(例如甲苯磺酸钠)；0％至约2％的硼酸盐(例如B₄O₇)；0％至约1％的羧甲基纤维素；约1％至约3％的乙醇；约2％至约5％的丙二醇；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如聚合物、分散剂、香料、荧光增白剂)。

11)水性液体洗涤剂组合物，包括约20％至约32％的线性烷基苯磺酸盐(以酸计算)；6-12％的脂肪醇乙氧基化物(例如C_12-15醇，7 EO或C_12-15醇，5 EO)；约2％至约6％的氨基乙醇；约8％至约14％的柠檬酸；约1％至约3％的硼酸盐(例如B₄O₇)；0％至约3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，锚型聚合物(anchoring polymer)例如甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物)；约3％至约8％的甘油；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如水溶增溶物、分散剂、香料、荧光增白剂)。

12)具有体积密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约25％至约40％的阴离子表面活性剂(线性烷基苯磺酸盐、烷基硫酸盐、α-烯烃磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基磺酸盐、皂)；约1％至约10％的非离子表面活性剂(例如脂肪醇乙氧基化物)；约8％至约25％的碳酸钠(例如Na₂CO₃)；约5％至约15％的可溶性硅酸盐(例如Na₂O，2SiO₂)；0％至约5％的硫酸钠(例如Na₂SO₄)；约15％至约28％的沸石(NaAlSiO₄)；0％至约20％的过硼酸钠(例如NaBO₃·4H₂O)；约0％至约5％的漂白活性剂(TAED或NOBS)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；0-3％的次要成分(例如香料、荧光增白剂)。

13)如上面组合物1)-12)所述的洗涤剂组合物，其中所有或者部分的线性烷基苯磺酸盐被(C₁₂-C₁₈)烷基硫酸盐代替。

14)具有体积密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约9％至约15％的(C₁₂-C₁₈)烷基硫酸盐；约3％至约6％的脂肪醇乙氧基化物；约1％至约5％的多羟基烷基脂肪酸酰胺；约10％至约20％的沸石(例如NaAlSiO₄)；约10％至约20％的层状焦硅酸盐(例如来自Hoechst的SK56)；约3％至约12％的碳酸钠(例如Na₂CO₃)；0％至约6％的可溶性硅酸盐(例如Na₂O，2SiO₂)；约4％至约8％的柠檬酸钠；约13％至约22％的过碳酸钠；约3％至约8％的TAED；0％至约5％的聚合物(例如聚羧酸酯和PVP)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如荧光增白剂、光漂白剂、香料、抑泡剂)。

15)具有体积密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约4％至约8％的(C₁₂-C₁₈)烷基硫酸盐；约11％至约15％的脂肪醇乙氧基化物；约1％至约4％的皂；约35％至约45％的沸石MAP或沸石A；约2％至约8％的碳酸钠(如Na₂CO₃)；0％至约4％的可溶性硅酸盐(例如Na₂O，2SiO₂)；约13％至约22％的过碳酸钠；1-8％的TAED；0％至约3％的羧甲基纤维素(CMC)；0％至约3％的聚合物(例如聚羧酸酯和PVP)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-3％的次要成分(例如荧光增白剂、膦酸盐、香料)。

16)上面1)-15)所述的洗涤剂制剂，其含有被稳定化的或囊化的过酸作为额外组分或者作为已经述及的漂白体系的替代物。

17)上面1)、3)、7)、9)和12)所述的洗涤剂组合物，其中过硼酸盐被过碳酸盐代替。

18)上文1)、3)、7)、9)、12)、14)和15)所述的洗涤剂组合物，还含有锰催化剂。锰催化剂例如是″Efficient manganese catalysts forlow-temperature bleaching，″Nature 369：637-639(1994)中描述的化合物之一。

19)配制成非水性洗涤剂液体的洗涤剂组合物，包括液态非离子表面活性剂，例如，线性烷氧基化伯醇、助洗剂体系(例如磷酸盐)、酶和碱。该洗涤剂也可包括阴离子表面活性剂和/或漂白体系。

可以以便于在洗涤剂中使用的浓度加入Amy 195α-淀粉酶或其变体。目前考虑的是，洗涤剂组合物中可以以相应于每升洗液0.00001-1.0mg(以纯酶蛋白质计算)的Amy 195α-淀粉酶或其变体的量加入该酶。

另一实施方式中，可将诸如2，6-β-D-果聚糖水解酶的其他酶加入包括Amy 195α-淀粉酶或其变体的洗涤剂组合物中并用于家用和/或工业纺织品/衣物上存在的生物膜的去除/清洁。

例如，可以将洗涤剂组合物配制成手(手工)或机器(自动)洗衣洗涤剂组合物，包括适于污染的织物预处理的洗衣添加剂组合物和漂清添加的织物软化剂组合物，或者配制成用于一般的家居硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或者配制以用于手工或自动的餐具洗涤操作。

一个具体的方面，洗涤剂组合物除了Amy 195α-淀粉酶或其变体外还可以包括2，6-β-D-果聚糖水解酶，和一种或多种其它清洁酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、***聚糖酶、半乳聚糖酶、其它淀粉分解酶、木聚糖酶、氧化酶、漆酶和/或过氧化物酶和/或其组合。

通常，所选酶的特性应与选择的洗涤剂兼容(例如最适pH、与其他酶和非酶成分的兼容性等)，并且该酶应以有效量存在。

蛋白酶：适宜的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些。包括经化学修饰或蛋白质改造的突变体，以及天然加工的蛋白质。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，例如碱性微生物蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶或糜蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)，尤其是源自芽孢杆菌的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(参见例如，WO 89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如源于猪或牛)，和镰孢霉属(Fusarium)蛋白酶(参见例如，WO89/06270和WO 94/25583)。有用的蛋白酶的实例也包括但不限于WO92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116、和WO 98/34946中所述的变体。市售可得的蛋白酶包括但不限于： Primase^TM、Duralase^TM、

和Kannase^TM(Novo Nordisk A/S)；

Maxacal^TM、Maxapem^TM、 Purafect OxP^TM、FN2^TM和FN3^TM(Genencor International，Inc.)。

脂肪酶：适合的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰的、蛋白水解修饰的、或蛋白质改造的突变体。有用的脂肪酶的实例包括但不限于来自腐质霉属(Humicola)(与Thermomyces同义)，例如来自疏毛腐质霉(H.lanuginose)(T.lanuginosus)(参见例如，EP 258068和EP 305216)，和来自特异腐质霉(H.insolens)(参见例如，WO 96/13580)的脂肪酶；假单胞菌属(Pseudomonas)脂肪酶(例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)；参见例如EP 218 272)，洋葱假单胞菌(P.cepacia)(参见例如EP 331 376)、斯氏假单胞菌(P.stutzeri，参见例如GB 1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属菌株SD 705(参见例如，WO 95/06720和WO 96/27002)、P.wisconsinensis(参见例如WO 96/12012)的脂肪酶；芽孢杆菌属脂肪酶(例如来自枯草芽孢杆菌；参见例如Dartois等人，Biochemica et Biophysica Acta，1131：253-360(1993))，嗜热脂肪芽孢杆菌(参见例如JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(参见例如WO 91/16422)的脂肪酶。其它可以考虑用于制剂中的脂肪酶变体包括例如在WO 92/05249、WO 94/01541、WO 95/35381、WO 96/00292、WO95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079、 WO 97/07202、EP 407225和EP 260105中描述的那些。一些市售可得的脂肪酶包括

和Lipolase Ultra^TM(Novo Nordisk A/S)。

聚酯酶：组合物中可以包括适合的聚酯酶，例如在WO 01/34899和WO 01/14629中描述的那些。

淀粉酶：组合物可以与其它淀粉酶组合，例如非生产增加的α-淀粉酶。这些可以包括市售可得的淀粉酶，例如但不限于

和BAN^TM(Novo Nordisk A/S)；

和

(来自Genencor International，Inc.)。

纤维素酶：可以向组合物中加入纤维素酶。适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰的或蛋白质改造的突变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢霉属(Fusarium)、梭孢壳属(Thielavia)、枝顶孢属(Acremonium)的纤维素酶，例如如美国专利No.4,435,307；5,648,263；5,691,178；5,776,757；和WO 89/09259公开的自特异腐质霉、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)和尖镰孢(Fusarium oxysporum)产生的真菌纤维素酶。可以考虑使用的示例性纤维素酶为对于纺织品具有颜色护理益处的那些。此类纤维素酶的实例是例如EP 0495257、EP 0531372、WO 96/11262、WO96/29397和WO 98/08940中描述的纤维素酶。其它实例是纤维素酶变体，例如WO 94/07998；WO 98/12307；WO 95/24471；PCT/DK98/00299；EP531315；美国专利No.5,457,046；5,686,593；和5,763,254中描述的那些。市售可得的纤维素酶包括

和 (Novo Nordisk A/S)；

和Puradax

(Genencor International，Inc.)；以及KAC-500(B)^TM(Kao Corporation)。

过氧化物酶/氧化酶：考虑用于该组合物的适合的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰的或蛋白质改造的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属(Coprinus)，例如来自灰盖鬼伞(C.cinereus)的过氧化物酶，及其变体如在WO 93/24618、WO95/10602和WO 98/15257中所述的那些。市售可得的过氧化物酶包括例如 Guardzyme ^TM(Novo Nordisk A/S)。

可通过添加含有一种或多种酶的单独的添加剂，或通过添加包括所有这些酶的组合的添加剂而在洗涤剂组合物中包括洗涤剂酶。可以将洗涤剂添加剂，即单独的添加剂或组合的添加剂配成例如颗粒、液体、浆液等。示例性的洗涤剂添加剂制剂包括但不限于颗粒，尤其是无粉尘颗粒、液体，尤其是稳定的液体或浆液。

可例如按照美国专利No.4,106,991和4,661,452所公开来生产无粉尘颗粒并且可任选地用本领域已知的方法包衣。蜡质包衣材料的实例是平均分子量为1,000至20,000的聚(环氧乙烷)(聚乙二醇，PEG)；具有16-50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇含有12-20个碳原子且其中有15-80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯及甘油三酯。例如GB.1483591给出了适于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例。可例如通过加入多元醇诸如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸，按照已建立的方法来稳定液态酶制剂。可按照如EP 238,216公开的方法来制备受保护的酶。

洗涤剂组合物可以是任何便利的形式，例如棒、片、粉末、颗粒、糊或液体。液体洗涤剂可以是水性的，通常含有高达约70％的水和0％-约3％的有机溶剂。也可以考虑含有约30％或更少的水的压缩(compact)洗涤剂凝胶。洗涤剂组合物可以任选地包括一种或多种表面活性剂，该表面活性剂可以是非离子的，包括半极性和/或阴离子和/或阳离子和/或两性离子的。表面活性剂可以以宽范围的量(按重量计从约0.1％至约60％)存在。

当包括在洗涤剂中时，洗涤剂典型地将含有约1％至约40％的阴离子表面活性剂，例如线性烷基苯磺酸盐、α-烯烃磺酸盐、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)、脂肪醇乙氧基硫酸盐、仲烷基磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基或烯基琥珀酸、或皂。

当包括在洗涤剂中时，洗涤剂通常将含有约0.2％至约40％的非离子表面活性剂，如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡糖胺的N-酰基-N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。洗涤剂可含有0％至约65％的洗涤剂助剂或络合剂(complexingagent)，例如沸石、二聚磷酸盐、三聚磷酸盐、膦酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如来自Hoechst的SKS-6)。

洗涤剂可包括一种或多种聚合物。示例性聚合物包括羧甲基纤维素(CMC)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯例如，聚丙烯酸酯，马来酸/丙烯酸共聚物)和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。

可使用常规的稳定剂来稳定洗涤剂组合物中的酶，稳定剂例如：多元醇(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物(例如，硼酸芳族酯)、或苯基硼酸衍生物(例如4-甲酰基苯基硼酸)。可按照WO92/19709和WO 92/19708所述配制该组合物。

目前考虑的是，在洗涤剂组合物中，尤其是酶变体，可以以相当于每升洗液中约0.01至约100mg酶蛋白质(例如每升洗液中约0.05至约5.0mg酶蛋白质或每升洗液中约0.1至约1.0mg酶蛋白质)的量加入。

4.2清洁组合物

在洗涤剂应用中，通常将Amy195α-淀粉酶和/或其变体用于含有丙二醇的液体组合物。例如通过在含有10％氯化钙的25％体积/体积丙二醇溶液中混合，使酶溶解于丙二醇。

可以将本文讨论的Amy195α-淀粉酶和/或其变体配制在用于清洁餐具的洗涤剂组合物中或其他清洁组合物中。这些组合物可以是粉末、凝胶或液体。组合物可以包括单独的该酶或该酶与其他淀粉分解酶和/或与其它清洁酶或漂白活化酶的组合，以及清洁组合物常用的其他组分。

因此，餐具洗涤剂组合物可以包括表面活性剂。表面活性剂可以是阴离子的、非离子的、阳离子的、两性离子的或这些类型的混合。洗涤剂可以含有按重量计0％至约90％的非离子表面活性剂，例如低或无泡沫乙氧基化丙氧基化直链醇。

洗涤剂组合物可含有无机和/或有机类型的洗涤剂助剂盐。洗涤剂助剂可细分为含磷和不含磷的类型。洗涤剂组合物通常含有约1％至约90％的洗涤剂助剂。当存在含磷的无机碱性洗涤剂助剂时，该助剂的实例包括水溶性盐，尤其是碱金属焦磷酸盐、正磷酸盐、和聚磷酸盐。当存在含磷的有机碱性洗涤剂助剂时，其实例包括水溶性膦酸盐。当存在不含磷的无机助剂时，其实例包括水溶性碱金属碳酸盐、硼酸盐和硅酸盐以及各种类型的水不溶性晶体或无定形硅铝酸盐，其中沸石是公知的代表。

合适的有机助剂的实例包括碱金属；铵和取代的铵；柠檬酸盐；琥珀酸盐；丙二酸盐；脂肪酸磺酸盐；羧基甲氧基琥珀酸盐；聚乙酸铵；羧酸酯；聚羧酸酯；氨基聚羧酸酯；聚乙酰基羧酸酯；和多羟基磺酸酯(polyhydroxsulphonates)。

其它适合的有机助剂包括已知具有助剂特性的较高分子量的聚合物和共聚物，例如适宜的聚丙烯酸、聚马来酸和聚丙烯酸/聚马来酸共聚物，及它们的盐。

清洁组合物可含有氯/溴类型或氧类型的漂白剂。无机氯/溴类型漂白剂的实例是锂、钠或钙的次氯酸盐和次溴酸盐，以及氯化磷酸三钠。有机氯/溴类型漂白剂的实例是杂环N-溴和N-氯亚胺，如三氯异氰脲酸、三溴异氰脲酸、二溴异氰脲酸、和二氯异氰脲酸，及其与水增溶性阳离子(如钾，钠)的盐。乙内酰脲化合物也是适合的。

清洁组合物可含有氧漂白剂，例如以无机过酸盐的形式，任选地与漂白前体一起，或以过氧酸化合物的形式。适合的过氧漂白化合物的典型实例是碱金属过硼酸盐(四水合物和一水合物)，碱金属过碳酸盐，过硅酸盐和过磷酸盐。示例性的活性剂材料是TAED，和三乙酸甘油酯。酶促漂白活化体系也可以存在于制剂中，例如过硼酸盐或过碳酸盐、三乙酸甘油酯和过水解酶(参见例如，WO 2005/056783)。

可使用常规用于酶的稳定剂来稳定清洁组合物，该稳定剂例如多元醇例如丙二醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物(例如硼酸芳香酯)。

清洁组合物也可含有其它常规洗涤剂成分，例如反絮凝剂、填充剂、消泡剂、防腐蚀剂、悬污剂、多价螯合剂、防污垢再沉积剂、脱水剂、染料、杀菌剂、荧光剂、增稠剂和香料。

尽管参考下面详述描述了本发明，但应理解可以进行多种改变。

4.3评估洗涤剂组合物的方法

存在多种α-淀粉酶清洁试验。去污检测的示例性描述包括下面。

“样片”(swatch)是一块材料，诸如其上施有污渍的织物。该材料可以是例如由棉、聚酯或天然和合成纤维的混合物制成的织物。样片还可以是纸，例如滤纸或硝化纤维素，或者是一块硬材料，例如陶瓷、金属或玻璃。对于淀粉酶，污渍是基于淀粉的，但是也可以包括血液、乳、墨水、草、茶、酒、菠菜、肉汁、巧克力蛋、奶酪、粘土、色素、油或这些化合物的混合物。

“小样片”是自样片上用单孔穿孔装置切下的部分，或者用定制的96孔穿孔装置(该多孔穿孔模式与标准96孔微滴定板匹配)切下的部分，或者是以其它方式自样片上取下的部分。样片可以是纺织品、纸、金属或其他适合的材料。小样片可以在放入24-、48-、或96孔微滴定板孔之前或之后被污物固着。“小样片”也可以通过向小块材料施加污物而制成。例如，小样片可以是直径为5/8″或0.25″的污染的织物片。定制的穿孔机经设计可以同时将96个样片递送至96孔板的所有孔。该装置可以通过简单地向同一96孔板多次上样，而向每孔递送一个以上的样片。可以想到将多孔穿孔装置用于向任何格式的板(包括但不限于24孔、48孔和96孔板)同时递送多个样片。另一可想到的方法中，污染的测试平台可以是由金属、塑料、玻璃、陶瓷，或其他适宜材料形成的、被污物载污体包覆的珠。然后将一个或多个污物包覆的珠放入含有适合的缓冲液和酶的96孔、48孔或24孔板的孔中或更大格式的板的孔中。这种情况下，可以通过直接吸光度测量或在二级生色反应后在上清液中检测释放的污染物。也可以通过质谱分析来进行释放的污染物的分析。再一微量筛选试验可以将样片(例如靛蓝染色的粗斜棉布)递送并固定到多孔板的孔中，并且加入颗粒诸如沙或更大的颗粒(例如经过筛以包括6-8或9号(gauge)颗粒的石榴石，并且搅动该板以便由加入的颗粒造成样片磨损。这一试验可用于在石洗应用中评价纤维素酶。可以通过释放到反应缓冲液中的颜色(例如，释放的靛蓝溶解到二甲基亚砜中并测量A₆₀₀nm的吸光度)或通过对磨损的样片测量反射率来判断酶的效力。

例如，当在无漂白的洗涤剂中清洗未处理的BMI(血液/乳/墨水)样片时，即使没有蛋白酶的帮助也释放出大部分的墨水。加入蛋白酶导致墨水释放的小量增加，这在大背景下可能难于量化。本发明提供了允许控制污渍固着程度的处理方法。结果是，可以产生例如当在不存在被检测的酶的情况下进行洗涤时能释放出变化量的污渍的样片。固着的样片的使用导致在洗涤试验中信噪比的显著提高。此外，通过改变固着程度，可以产生在不同清洁条件下给出最佳结果的污渍。

在多种材料类型上具有已知“强度”的污渍的样片是市售可得的(EMPA，St.Gallen，Switzerland；wfk-Testgewebe GmbH，KrefeldGermany；或Center for Test Materials，Vlaardingen，The Netherlands)和/或可以由从业者制得(Morris and Prato，Textile Research Journal 52(4)：280 286(1982))。其它测试样片包括但不限于含棉织物上的血液/乳/墨水(BMI)污渍、含棉织物上的菠菜污渍、或含棉织物上的草、以及含棉织物上的巧克力/乳/烟灰。

可以用0.0003％至0.3％的过氧化氢将BMI污渍固着在棉上。其他组合包括用0.001％至1％戊二醛固着的草或菠菜、用0.001％至1％戊二醛固着的明胶和考马斯染料、或用0.001％至1％戊二醛固着的巧克力、乳和烟灰。

也可以在用酶和/或洗涤剂制剂孵育期间搅拌样片。洗涤性能数据取决于孔中，尤其是在96孔板中的样片的定向(水平对垂直)。这表明在孵育期间混合是不充分的。尽管存在许多方式来保证孵育期间充分的搅拌，但可以构建将微滴定板夹在两个铝板之间的板夹。这可以简单地按如下方式实现：例如在孔上放置粘性板密封物然后用任何类型的适合的、市售可得的夹子将两个铝板与96孔板加紧。然后可以将它放到商品化的孵育摇床中。将摇床设定为约400rpm导致非常有效的混合，而板夹有效地阻止了泄漏或交叉污染。

可以使用三硝基苯磺酸(TNBS)来量化洗液中的氨基基团浓度。这可以用作从样片中去除的蛋白质量的量度(参见例如Cayot和Tainturier，Anal.Biochem.249：184-200(1997))。然而，如果洗涤剂或酶样品导致异乎寻常小的肽片段的形成(例如，在样品中存在肽酶时)，那么将获得较大的TNBS信号，即更多“噪音”。

另一用于测量对血液/乳/墨水或其他污渍的洗涤性能的手段是基于墨水的释放。样片上的蛋白质的蛋白酶解导致墨水颗粒的释放，这可以由测量洗液的吸光度而量化。可以在350和800nm之间的任何波长测量吸光度。可以在410nm或620nm处测量吸光度。也可以检查洗液以确定对于含有草、菠菜、明胶或考马斯染料的污渍的洗涤性能。对于这些污渍，示例性的波长包括对于菠菜或草的670nm和对于明胶或考马斯染料的620nm。例如，移出等份的洗液(例如，通常来自96孔微板的100-150μL)并放到小杯或微孔微板中。然后将它放到分光光度计中并在适当的波长读取吸光度。

也可以使用该体系，例如通过使用在诸如布、塑料或陶瓷的适宜载污体上的血液/乳/墨水污渍，来确定用于餐具洗涤的增强的酶和/或洗涤剂组合物。

一方面，通过在25℃将0.3％过氧化氢施加到BMI/棉样片上30分钟或通过在60℃将0.03％过氧化氢施加到BMI/棉样片上30分钟，固着BMI污渍。从BMI/棉样片上切下约0.25″的小样片并放入96孔微滴定板的孔中。向每个孔中放入已知的洗涤剂组合物和酶诸如变体蛋白质的混合物。向微滴定板顶部放置粘性板密封物后，将微滴定板与铝板夹在一起，并在定轨摇床上以约250rpm搅拌约10-60分钟。这个时间结束后，将上清液转移到新的微滴定板的孔中并测量在620nm的墨水吸光度。这可以类似地用通过在25℃向菠菜/棉样片或草/棉样片施加0.01％戊二醛30分钟而固着在棉上的菠菜污渍或草污渍来进行检测。这也可以用巧克力、乳和/或烟灰污渍完成。

实施例

实施例1、枯草杆菌中的表达

将图5示出的构建体转化到9种蛋白酶缺失的枯草芽孢杆菌菌株(degU^Hy32，oppA，ΔspoII3501，amyE::xylRPxylAcomK-ermC，ΔaprE，ΔnprE，Δepr，ΔispA，Δbpr，Δvpr，ΔwprA，Δmpr-ybfJ，ΔnprB)(参见US20050202535A1)。在下面的培养基(每升)中生长这一菌株的培养物：10g Soytone，75g葡萄糖，7.2g尿素，40mM MOPS，4mM Tricine，3mM磷酸氢二钾，21.4mM KOH，50mM NaCl，276μM硫酸钾，528μM氯化镁，50μM二水合柠檬酸三钠，100μM二水合氯化钙，14μM七水合硫酸亚铁，5.9μM二水合硫酸镁，5.7μM一水合硫酸锌，2.9μM二水合氯化铜，4.2μM钴六水合物，4.5μM二水合钼酸钠。对于1L体积，将除了Soytone以外的所有组分混入500mL，除菌过滤，并加入到已通过高压灭菌而除菌的相等部分的2X Soytone中。可以将痕量金属和柠檬酸盐制成100X或1000X贮存液。可以将缓冲液、氢氧化钾、氯化钠、硫酸钾和氯化镁以及痕量金属制成10X贮存液。混合所有组分后，调节pH至7.3。使用这一培养基之前补充入20mM氯化钙。

培养物以多种加工后的形式表达酶。在10％SDS-PAGE胶上，于69kDa标记处观察到明显的成熟形式(没有信号序列)。也存在两种较短的形式。

通过用β-环糊精-Sepharose亲和树脂处理肉汤、收集树脂并用含有2mM氯化钙(CaCl₂)的25mM bis-Tris-丙烷缓冲液(pH 8.5)洗涤，以及用补充了50mM β-环糊精的相同的缓冲液洗脱该洗涤后的树脂，从培养物肉汤分级分离了Amy 195α-淀粉酶活性。用β-环糊精树脂处理培养物肉汤的作用是从肉汤中部分移出(至约50％)60kDa种类以及完全移出69kDa种类。对树脂的缓冲液洗涤提供了60kDa大小的接近纯的蛋白质；用含有β-环糊精的缓冲液洗脱提供了污染有约25％的60kDa蛋白质的69kDa蛋白质。利用SDS-PAGE确定了这些组分估计并示于图10。通过用OxAm淀粉酶(Genencor International，Inc.)作为蛋白质标准，以凝胶光密度测量法估计了级分的酶含量。图10标记为“w1”的泳道中最粗条带的N末端分析提供了″AAPGPKD ATA″序列(SEQ ID NO：5)。结合这一N末端序列，质谱分析鉴定出该蛋白质具有图4中大写字母所示的序列(即没有信号序列和代表淀粉结合基序的C末端延伸)。这些分析表明这一分子片段由α-淀粉酶结构域A、B&C组成。

实施例2、遗传截短的Amy 195催化结构域的表达

在三个不同位点截短Amy 195的基因以允许检测截短形式的表达并检测洗涤性能。使用图4的序列多肽编号，通过本领域技术人员已知的标准技术在氨基酸残基第494、504和509位完成截短。将含有截短基因的质粒转化到9种蛋白酶缺失的枯草芽孢杆菌菌株(degU^Hy32，oppA，ΔspoII3501，amyE::xylRPxylAcomK-ermC，ΔaprE，ΔnprE，Δepr，ΔispA，Δbpr，Δvpr，ΔwprA，Δmpr-ybfJ，ΔnprB)。于37℃，在含有50mL补充了10或30mMCaCl₂的丰富培养基的250mL带挡板三角瓶中以250rpm振荡培养细胞64小时。利用SDS-PAGE分析培养物上清液，并通过凝胶光密度测量来估计淀粉酶含量。

发现自截短基因的淀粉酶表达比自全长野生型基因的相同结构域的表达高约2倍。图8示出了这些结果，其表明截短基因对于蛋白质表达是有利的。

实施例3、清洁试验

通过96孔CS28橙染色的稻淀粉污染样片施用试验，进一步分析了凝胶上所示的所有级分。在25mM HEPES(pH 8.0)以及在25mM CAPS(pH10.3)缓冲液中进行这一试验。

在模拟洗衣试验中检测实施例1中分离的全部Amy 195种类的清洁性能，作为淀粉酶浓度的函数。图6示出了图10的“e-池”级分的结果。通过释放到上清液中并使用分光光度计在488nm处测量到的颜色量来判断性能。对于该试验的其他信息，参见美国专利No.7,122,334。酶在pH 8.0是高度有效的，但在pH 10.3也显示出惊人的污渍去除。蛋白质凝胶(图10)中每个泳道的所有主要的蛋白质带都显示出清洁活性，其中泳道“w1”的条带给出最佳性能。图7示出了pH 8.0条件下的所有清洁活性。相比保留一个淀粉结合结构域的形式(参见图7，“□”)，图4的氨基酸残基492结尾的截短形式显示了更好的性能(参见图7，“·”)。来自这一试验的结果显示，Amy 195α-淀粉酶对于从纺织品样片上除去污渍是高度有效的。

实施例4、遗传截短的基因产物的洗涤性能

采用与上面实施例3中针对蛋白水解片段描述的方式相同的方式，检测上面实施例2中获得的截短基因产物的洗涤性能。用一系列浓度的Amy195催化片段孵育CS28稻样片。通过释放到上清液中并在488nm处测量到的颜色来判断洗涤性能。如图9所示，所有三种遗传截短基因片段都显示了良好的洗涤性能。

出于不同目的，可以以若干方式修改这一样片试验。96孔板试验通过在酶与样片一起孵育后测量上清液，而非常适用作高通量清洁试验，而例如，可以使用24孔板以及与板孔相适应的样片进行较大样片的洗涤，并可以利用本领域已知的方法测量样片的反射率。两种测量方式——上清液吸光度和样片反射率——显示出近乎完全相关。

洗后的样片的反射率与上清液的吸光度高度相关性；决定系数(r²)的值为0.99。原则上，该试验可以扩大到384孔板。可以用任何污染的样片进行该试验，并且除了CS28样片，也可以检测CS26、CS27和CS29样片(例如，分别是玉米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉；Testfabrics，Inc.，West Pittiston，PA)以证明如实施例3所述测量的效力。该试验也可以使用洗涤剂组合物，并可以在不同温度和不同pH值进行。这些试验可以根据美国专利No.7,122,334改编。

出于所有目的，上面引用的所有参考文献在此整体引入作为参考。

Claims

1.编码SEQ ID NO：4的残基30-683的多肽的截短形式的核酸，其中所述截短形式终止于SEQ ID NO：4的残基492、494、504或509。

2.多肽，其为SEQ ID NO：4的残基30-683的多肽的截短形式，其中该截短形式的羧基末端位于SEQ ID NO：4的残基492、494、504或509处。

3.与权利要求1的核酸有效连接的载体。

4.包括权利要求1的核酸的分离的宿主细胞。

5.包括权利要求3的载体的分离的宿主细胞。

6.权利要求5的分离的宿主细胞，其中该宿主细胞是选自枯草杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、变铅青链霉菌、鼠灰链霉菌或大肠杆菌的细菌。

7.包括权利要求2的多肽的洗涤剂添加剂。

8.权利要求7的洗涤剂添加剂，其为无粉尘颗粒，微颗粒、稳定的液体、或凝胶。

9.权利要求7的洗涤剂添加剂，其为受保护的酶的形式。

10.权利要求7的洗涤剂添加剂，其中所述洗涤剂添加剂在每克洗涤剂添加剂中含有0.02mg至200mg多肽。

11.权利要求7的洗涤剂添加剂，还包括选自蛋白酶、脂肪酶、过氧化物酶、氧化酶、淀粉分解酶、纤维素酶、聚酯酶的酶。

12.权利要求7的洗涤剂添加剂，还包括蛋白酶、脂肪酶、过氧化物酶、氧化酶、淀粉分解酶、纤维素酶、聚酯酶的任何组合。

13.包括权利要求7-12中任一项的洗涤剂添加剂的洗涤剂组合物。

14.包括权利要求2的多肽的洗涤剂组合物。

15.权利要求14的洗涤剂组合物，其中所述洗涤剂组合物包括下述一种或多种：表面活性剂、漂白剂、洗涤剂助剂、稳定剂、织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、防腐蚀剂、染料、香料、悬污剂、晦暗抑制剂、荧光增白剂或杀菌剂。

16.权利要求14的洗涤剂组合物，其中所述洗涤剂组合物包含漂白体系。

17.权利要求14的洗涤剂组合物，其中所述洗涤剂组合物包含聚合物。

18.权利要求14的洗涤剂组合物，还包括选自蛋白酶、脂肪酶、过氧化物酶、氧化酶、淀粉分解酶、纤维素酶、聚酯酶的酶。

19.权利要求14的洗涤剂组合物，还包括蛋白酶、脂肪酶、过氧化物酶、氧化酶、淀粉分解酶、纤维素酶、聚酯酶的任何组合。

20.包括权利要求2的多肽的手工或自动餐具洗涤剂组合物。

21.餐具洗涤方法，包括将权利要求20的手工或自动餐具洗涤剂施用给需要洗涤的餐具。

22.包括权利要求7-12中任一项的洗涤剂添加剂的洗衣洗涤剂组合物。

23.清洁纺织品的方法，包括在具有权利要求13-19中任一项的洗涤剂组合物的溶液中洗涤被污染的纺织品。