CN102326668A

CN102326668A - 利用微生物菌株18d-ta厌氧降解羽毛角蛋白的方法

Info

Publication number: CN102326668A
Application number: CN201110245892A
Authority: CN
Inventors: 邓宇
Original assignee: Biogas Institute of Ministry of Agriculture
Current assignee: Biogas Institute of Ministry of Agriculture
Priority date: 2011-08-24
Filing date: 2011-08-24
Publication date: 2012-01-25
Anticipated expiration: 2031-08-24
Also published as: CN102326668B

Abstract

本发明涉及一种利用微生物菌株18D-TA厌氧降解羽毛角蛋白的方法，属于微生物技术领域。该方法的具体步骤如下：A、羽毛的处理：将羽毛水洗干净后放入45℃-55℃烘箱，烘干2-3天备用；B、菌株的接种：将培养基与经步骤A处理后的羽毛进行高温湿热灭菌后，接种菌株18D-TA，接种量2%-10%，45℃-60℃厌氧静置培养8-10小时，羽毛绒脱落，18-24小时以后，羽毛从羽梗上完全脱落，且羽梗也有不同程度的降解。本发明所利用的菌株相比其他好氧菌，能累计较多的产物，因无需提供通气设备，使能耗大大降低，同时，其效率高，发酵周期短，避免了大部分氨基酸的外消旋化，提高了羽毛水解产物的可吸收利用性。

Description

利用微生物菌株18D-TA厌氧降解羽毛角蛋白的方法

技术领域

本发明涉及一种羽毛角蛋白的降解方法，特别是一种利用微生物菌株18D-TA厌氧降解羽毛角蛋白的方法，属于微生物技术领域。

背景技术

目前，用羽毛角蛋白资源转化的技术主要是采用污染、耗能大、营养价值低的物理化学的方法，生物方法因角蛋白酶生产成本高，微生物降解羽毛效率不高等原因，影响技术的普及利用。如申请号200810018317.2的专利申请公开了一种用超声波处理制备畜禽毛角蛋白的方法，包括还原水解法或氧化水解法制备角蛋白原液、超声波处理、干燥工艺步骤。该方法需要还原水解或氧化水解将畜禽毛角蛋白制成蛋白原液，消耗大量的化学试剂，对环境可能造成较大的污染；另外，蛋白原液还需超声波进一步处理才能能到角蛋白液，不但增加了设备成本，使得畜禽毛角蛋白的资源化利用的操作步骤复杂繁琐。申请号200710171939.4涉及一种产角蛋白酶的菌株及其应用，该菌株是嗜麦芽糖寡养单胞菌 (Stenotrophomonas maltophilia)DHHJ CGMCC No.2231，应用于降解软质角蛋白鸡毛、鸽子毛、牛毛、羊毛、头发和硬质角蛋白牛角、羊角、羊蹄角、指甲废弃物。该技术利用嗜麦芽糖寡养单胞菌 (Stenotrophomonas maltophilia)DHHJ在40℃降解毛角蛋白需要48h-96h的较长时间，这很可能增加工业发展的时间成本，另外，该菌属于好氧菌降解毛角蛋白，需要较大的通气设备，提高了发酵成本；通气时易造成染菌。本发明通过利用高效厌氧羽毛降解菌18D-TA，形成高效羽毛废弃物资源转化的厌氧发酵技术，从而使得微生物法降解羽毛产生有用的资源这一技术得到广泛应用，为我国饲料行业的供给提供有力的技术支撑，进一步提高我国饲料产品在国际上的竞争力。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的缺陷，提供一种利用微生物菌株18D-TA厌氧降解羽毛角蛋白的方法。该微生物菌株不仅能处理不溶性的结构蛋白，还可以处理可溶性的蛋白，该方法在厌氧条件下能使羽毛有很高的降解效率，且发酵周期短。

本发明采用的技术方案是：

利用微生物菌株18D-TA厌氧降解羽毛角蛋白的方法，其特征在于具体步骤如下：

A、羽毛的处理

将羽毛水洗干净后放入45℃-55℃烘箱，烘干2 -3天备用；

B、菌株的接种

1）制备培养基：预先加入500ml蒸馏水于1L的三角瓶中，再分别加入K₂HPO₄ 3 g/L，KH₂PO₄2.5 g/L，NaCl 3 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.02 g/L，CaCO₃0. 02 g/L，维生素液1%（v/v ），微量元素液1%（v/v ）至其溶解，然后加水至1L，煮沸5-8min，冷却至室温，加入0.1%（w/v）HCl·H₂O，用5mol/l KOH调节pH至7.0-7.5，再加入质量体积浓度为0.1% 刃天青溶液0.1%（v/v），按2.0m³/h通N₂，煮沸15min，冷却后分装至预先加有1%（w/v）经步骤A处理后羽毛的厌氧管或血清瓶中，121℃、30min高温湿热灭菌后备用。

无菌无氧的NaHCO₃溶液和Na₂S溶液：取500ml蒸馏水加于1L的三角瓶中，煮沸约10min，在Hungate铜柱除氧***厌氧装置下，通N₂（2.0m³/h），煮沸20min，冷却后，取70ml水分装于预先加有NaHCO₃（10%--w/v）和Na₂S（3%--w/v）的血清瓶中，待全部溶解后塞好内塞，加上铝封。用60ml注射器每瓶分别补加约120ml N₂，121℃，高温湿热灭菌30min，待用。

2）接种：灭菌后的培养基补加10% （w/v） NaHCO₃溶液和3% （w/v）的Na₂S溶液，使其终浓度分别达到0.1%（w/v）和0.3%（w/v），pH 7.0-9.5，接种角蛋白厌氧降解菌18D-TA，接种量 2%-10%（v/v），45℃-60℃厌氧静置培养8-10小时，羽毛绒脱落，18-24小时以后，羽毛从羽梗上完全脱落，且羽梗也有不同程度的降解。

所述培养基的组成为：羽毛1%（w/v），K₂HPO₄ 3 g/L，KH₂PO₄2.5 g/L，NaCl 3 g/L，MgSO₄·7H₂O 0. 02 g/L，CaCO₃0. 02 g/L，维生素液1%（v/v），微量元素液1%（v/v），0.1%（w/v）Cysteine- HCl·H₂O，0.1%（w/v）刃天青溶液0.1%（v/v），蒸馏水1 L， pH 7.0-7.5。

所述维生素液的组成为：生物素 2.00 mg，叶酸 2.00 mg，吡哆醇-盐酸10.00mg，二水合硫胺素-盐酸5.00 mg，核黄素 5.00mg，烟酸 5.00mg，D-泛酸钙 5.00mg，维生素 B₁₂ 0.10mg，对氨基苯甲酸 5.00mg，硫辛酸 5.00 mg，蒸馏水1000.00ml。

所述微量元素液的组成为：MgSO₄ ·7 H₂O 3.00g，MnSO₄ · H₂O 0.50 g，NaCl 1.00 g，FeSO₄·7 H₂O 0.10 g，CoSO₄ ·7 H₂O 0.18 g，CaCl₂ · 2 H₂O 0.10 g，ZnSO₄·7 H₂O 0.18 g，CuSO₄·5 H₂O 0.01 g，KAl(SO₄)₂ ·12 H₂O 0.02g，H₃BO₃ 0.01g，Na₂MoO₄ · 2 H₂O 0.01 g，NiCl₂ · 6 H₂O 0.03g，Na₂SeO₃·5 H₂O 0.30mg，蒸馏水 1000.00ml。

所述厌氧管选自10ml/支的规格；所述血清瓶选自120ml/瓶的规格。

所述羽毛为菌株18D-TA的唯一碳源和氮源。

所述接种后18-24小时后的培养物可作为发酵种子，进行菌种的扩大培养，进行大规模发酵。

所述菌株属于Tepidimicrobium菌属的菌种，该菌株的分类命名为Tepidimicrobium sp. ， 2011年4月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种的保藏编号为CGMCC NO. 4800 。

同已报道的传统或生物法相比，本发明的优点在于：

1、本发明微生物的代谢能在温和条件下进行，能避免物理化学方法处理羽毛带来的污染、能耗大，产物营养价值低的缺点。

2、本发明所利用的菌株属于厌氧发酵菌，相比其他好氧菌，能累计较多的产物，因无需提供通气设备，使能耗和成本大大降低。

3、本发明在较高温度下进行发酵处理，从而确保了生物降解过程不会被病原微生物污染，保证了发酵产品的卫生安全；此外，较高温度还可获得更好的底物溶解性，角蛋白酶更易对底物发生作用。

4、本发明于厌氧条件下对羽毛进行降解，其效率高，发酵周期短，在已知的好氧和厌氧菌降解菌中，其降解羽毛速度是最快的，从而为微生物降解羽毛规模化生产开辟了新的途径。

5、本发明可有益的省去预处理，如热压处理，特别是在大于130℃温度下的预处理，而这样的预处理在水解羽毛时一直沿用，从而有效避免了大部分氨基酸的外消旋化，提高了羽毛水解产物的可吸收利用性。

附图说明

图1为不同时间内羽毛被18D-TA菌株厌氧降解的变化图。

具体实施方式

实施例1

A、羽毛的处理

将羽毛水洗干净后放入45℃-55℃烘箱，烘干2 -3天备用；

B、菌株的接种

1）制备培养基：预先加入500ml蒸馏水于1L的三角瓶中，分别加入K₂HPO₄ 3 g/L，KH₂PO₄2.5 g/L，NaCl 3 g/L，MgSO₄·7H₂O 0. 02 g/L，CaCO₃0. 02 g/L维生素液1%（v/v ），微量元素液1%（v/v ）至其溶解，然后加水至1L，煮沸5-8min，冷却至室温，加入0.1%（w/v）Cysteine-HCl·H₂O，用5mol/ L KOH调节pH至7.0-7.5，再加入浓度为0.1%（w/v）的刃天青溶液0.1%（v/v），按2.0m³/h通N₂，煮沸15min，冷却后分装至预先加有1%（w/v）经步骤A处理后羽毛的厌氧管或血清瓶中，121℃、30min高温湿热灭菌后备用。

所述培养基的组成为：羽毛1%（w/v），K₂HPO₄ 3 g/L，KH₂PO₄2.5 g/L，NaCl 3 g/L，MgSO₄·7H₂O 0. 02 g/L，CaCO₃0. 02 g/L，维生素液1%（v/v），微量元素液1%（v/v），0.1% Cysteine- HCl·H₂O，0.1%（w/v）刃天青溶液0.1%，蒸馏水1 L。

Claims

1.利用微生物菌株18D-TA厌氧降解羽毛角蛋白的方法，其特征在于具体步骤如下：

A、羽毛的处理

将羽毛水洗干净后放入45℃-55℃烘箱，烘干2 -3天备用；

B、菌株的接种

1）制备培养基：预先加入500ml蒸馏水于1L的三角瓶中，分别加入K₂HPO₄ 3 g/L，KH₂PO₄2.5 g/L，NaCl 3 g/L，MgSO₄·7H₂O 0. 02 g/L，CaCO₃0. 02 g/L，维生素液1%（v/v ），微量元素液1%（v/v ）至其溶解，然后加水至1L，煮沸5-8min，冷却至室温，加入0.1%（w/v）Cysteine-HCl·H₂O，用5mol/ L KOH调节pH至7.0-7.5，再加入浓度为0.1%（w/v）的刃天青溶液0.1%（v/v），按2.0m³/h通N₂，煮沸15min，冷却后分装至预先加有1%（w/v）经步骤A处理后羽毛的厌氧管或血清瓶中，121℃、30min高温湿热灭菌后备用；

2.如权利要求1所述利用微生物菌株18D-TA厌氧降解羽毛角蛋白的方法，其特征在于：所述培养基的组成为：羽毛 1% （w/v），K₂HPO₄ 3 g/L，KH₂PO₄2.5 g/L，NaCl 3 g/L，MgSO₄·7H₂O 0. 2 g/L，CaCO₃0. 02 g/L，维生素液1% （v/v），微量元素液1% （v/v），0.1% （w/v）Cysteine- HCl·H₂O，0.1% （w/v）刃天青溶液0.1%，蒸馏水1 L。

3.如权利要求2所述利用微生物菌株18D-TA厌氧降解羽毛角蛋白的方法，其特征在于：所述维生素液的组成为：生物素 2.00 mg，叶酸 2.00 mg，吡哆醇-盐酸10.00mg，二水合硫胺素-盐酸5.00 mg，核黄素 5.00mg，烟酸 5.00mg，D-泛酸钙 5.00mg，维生素 B₁₂ 0.10mg，对氨基苯甲酸 5.00mg，硫辛酸 5.00 mg，蒸馏水1000.00ml。

4.如权利要求2所述利用微生物菌株18D-TA厌氧降解羽毛角蛋白的方法，其特征在于：所述微量元素液的组成为：MgSO₄ ·7 H₂O 3.00g，MnSO₄ · H₂O 0.50 g，NaCl 1.00 g，FeSO₄·7 H₂O 0.10 g，CoSO₄ ·7 H₂O 0.18 g，CaCl₂ · 2 H₂O 0.10 g，ZnSO₄·7 H₂O 0.18 g，CuSO₄·5 H₂O 0.01 g，KAl(SO₄)₂ ·12 H₂O 0.02g，H₃BO₃ 0.01g，Na₂MoO₄ · 2 H₂O 0.01 g，NiCl₂ · 6 H₂O 0.03g，Na₂SeO₃·5 H₂O 0.30mg，蒸馏水 1000.00ml。

5.如权利要求1或2所述利用微生物菌株18D-TA厌氧降解羽毛角蛋白的方法，其特征在于：所述菌株属于Tepidimicrobium菌属的菌种，该菌株的分类命名为Tepidimicrobium sp. ， 2011年4月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种的保藏编号为CGMCC NO. 4800 。