CN102323233A - 一种检测同型半胱氨酸的试剂和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测同型半胱氨酸的试剂，它是色烯衍生物5-(hydroxylmethyl)-7-methyl-3，3a-dihydrocyclopenta[b]chromen-1(2H)-one(HMMPC)。HMMPC试剂由3-羟甲基-5-甲基水杨醛和2-环戊烯酮在室温下一步制得，原料便宜，反应条件简单，易于规模生产。本发明提供了同型半胱氨酸的定量检测方法，是基于HMMPC，在pH为7.0的缓冲溶液中定量地检测同型半胱氨酸的含量。该检测方法，对Hcy显示了高的灵敏性和选择性，检测过程简便、灵敏、快速，检测结果准确。

Description

一种检测同型半胱氨酸的试剂和方法
技术领域
本发明涉及同型半胱氨酸检测分析技术，具体属于一种快速、定量地检测同型半胱氨酸的试剂和方法。
背景技术
心脑血管疾病对全球人的健康都是一个威胁。据估计每年全球约1500万人死于心脑血管疾病。而高同型半胱氨酸(Hcy)血症是导致心脑血管疾病的一个独立危险因子，目前已有不少实验室已将Hcy作为诊断心脑血管疾病必须检测的临床指标之一。
目前已报道的用于检测同型半胱氨酸的检测方法有：高效液相色谱(HPLC)(Kusmierek，K.；Glowacki，R.；Bald，E. Anal.Bioanal. Chem.，2006，385，855.)、气-质联用色谱(MacCoss，M.J.；Fukagawa，N.K.；Matthews，D.E. Anal.Chem.，1999，71，4527.)、酶法(Frantzen，F.；Faaren，A.L.；Alfheim，I.；Nordhei，A.K.Clin.Chem.，1998，44，311.)、免疫测定(Shiu，H.Y.；Chong，H.C.；Leung，Y.C.；Wong，M.K.；Che，C.M.Chem.Eur.J.，2010，16，3308-3313.)、毛细管电泳(Causse，E.；Tierrier，R.；Champagne，S.；Nertz，M.；Valdiguie，P.；Salvayre，R.J. Chromatogr.A，1998，817，181.)和电化学法(Melnyk，S.；Pogribna，M.；Pogribny，I.；Hine，R.J.；James，S.J.J.Nutr.Biochem.，1999，10，490.)。然而，这些检测方法需要耗时的分析程序和昂贵的试剂和仪器。所以，发展一种检测过程简单、灵敏、成本低、适合临床、科研使用的的检测同型半胱氨酸的试剂和方法非常必要。
发明内容：
本发明是为了克服现有技术同型半胱氨酸检测中存在的问题，提供一种体系简单、操作方便、选择性高、灵敏度高的同型半胱氨酸定量检测的试剂和方法。
本发明提供的检测同型半胱氨酸的试剂和方法，是基于一种色烯衍生物5-(hydroxylmethyl)-7-methyl-3，3a-dihydrocyclopenta[b]chromen-1(2H)-one(HMMPC)，在pH为7.0的HEPES缓冲溶液中定量地检测同型半胱氨酸。
本发明提供的一种检测同型半胱氨酸的试剂：它是5-(hydroxylmethyl)-7-methyl-3，3a-dihydrocyclopenta[b]chromen-1(2H)-one(HMMPC)。
HMMPC的合成路线：
Figure BDA0000074758630000021
HMMPC的合成方法，步骤为：将3-羟甲基-5-甲基水杨醛、环戊烯酮、咪唑、四氢呋喃和去离子水按摩尔比1∶1.5∶1.5∶85∶85混合，在室温下搅拌48小时，用相当于3-羟甲基-5-甲基水杨醛10倍摩尔量的1MHCl稀释，并用相当于3-羟甲基-5-甲基水杨醛155倍摩尔量的乙酸乙酯萃取三次，将有机相减压蒸干，然后用体积比1∶4的乙酸乙酯和石油醚在硅胶色谱柱淋洗，得到HMMPC。
本发明提供的一种检测同型半胱氨酸的方法，包括如下步骤：
(1)、配制pH＝6.0-9.0、浓度为1-100mM的HEPES缓冲溶液，并用乙醇配制2mM的HMMPC乙醇溶液；
(2)、把2ml的HEPES缓冲溶液和10μl的HMMPC溶液加到干净的紫外比色皿中，在紫外可见分光光度仪上检测，随着待测样的加入，吸收峰315nm和389nm均逐渐降低，当吸收峰不再降低时，停止加待测样，此时加入待测样的体积计为V待测样；
(3)、按10×7×2×10-3/V待测样计算出待测样中Hcy的浓度(mol/L)。
所述的HEPES缓冲溶液可以用醋酸-醋酸钠缓冲溶液、Tris-HCl、柠檬酸、磷酸缓冲溶液等代替。
经实验证明，其它氨基酸不干扰体系对同型半胱氨酸的测定。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：1、检测体系成本低廉，试剂由3-羟甲基-5-甲基水杨醛和2-环戊烯酮，在室温下一步制得，原料便宜，反应条件简单，易于规模生产；2、本发明的检测方法，对Hcy显示了高的灵敏性和选择性，能将Hcy和其它两种硫醇小分子Cys和GSH区分，克服了长期以来无法将Hcy和Cys、GSH二者区分的困扰；3、检测过程简便、灵敏、快速，检测结果准确；4、检测手段简单，只需要借助紫外分光光度计。
附图说明：
图1HMMPC的单晶衍射结构图。
图2在含有10μl HMMPC和pH7.0HEPES(10mM)缓冲溶液中，加入同样量的Hcy、Cys、GSH的紫外可见吸收图。
图3HMMPC和pH7.0HEPES(10mM)缓冲溶液中，分别加入各种氨基酸的柱状图。
图4实施例4检测Hcy紫外可见吸收图。
图5实施例5检测Hcy紫外可见吸收图。
图6实施例6检测Hcy紫外可见吸收图。
具体实施方式：
实施例1
HMMPC的合成：将3-羟甲基-5-甲基水杨醛2mmoL、环戊烯酮3mmoL、咪唑3mmoL、四氢呋喃3mL和去离子水3mL混合，在室温下搅拌48小时，用20mL 1M HCl稀释，并用30mL乙酸乙酯萃取三次，将有机相减压蒸干，然后用体积比1∶4的乙酸乙酯和石油醚在硅胶色谱柱淋洗，得到HMMPC，产率56％。在乙酸乙酯和石油醚中养晶，得到浅黄色的单晶。
HMMPC的表征：
1H NMR(600MHz，25℃，DMSO-d6)：δ7.18(s，1H)，7.14(d，1H)，7.01(s，1H)，5.30(t，1H)，2.58-2.63(m，1H)，2.39-2.74(m，2H)，2.11-2.38(m，3H)，2.35(s，3H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)：δ21.23，28.92，37.88，61.94，76.82，122.48，128.61，129.21，130.90，132.36，133.34，151.60，202.06；元素分析(calcd.％)C14H14O3：C，73.03；H，6.13.测得：C，73.13；H，6.08.晶体数据：C12H9ClO2，FW＝230.25，crystal size：0.3×0.2×0.2mm，Triclinic，space group P-1(No.2)，
Figure BDA0000074758630000031
Figure BDA0000074758630000032
Figure BDA0000074758630000033
Figure BDA0000074758630000034
α＝109.469(2)°，β＝95.240(2)°，γ＝95.950(2)°，
Figure BDA0000074758630000035
Z＝4，T＝296K，θmax＝25.05°，Rint＝0.0327，R1＝0.0620，wR2＝0.2108，GOF＝0.92.单晶衍射结构图见图1。
实施例2
把2ml pH7.0 HEPES(10mM)的缓冲溶液和浓度为2mM、10μl的HMMPC溶液分别加到三个不同的紫外比色皿中，再分别加入70μl的Hcy、Cys、GSH，在紫外可见光谱仪上检测，紫外可见吸收图见图2。
实施例3
把2ml pH7.0HEPES(10mM)的缓冲溶液和浓度为2mM、10μl的HMMPC溶液分别加到不同的紫外比色皿中，分别加入同等量的各种氨基酸，在紫外可见光谱仪测定389nm的吸收值，绘制不同氨基酸对应的吸收值的柱状图，见图3。
实施例4检测Hcy
配制pH＝6.0的的HEPES(10mM)缓冲溶液，配制2mM的Hcy溶液，并用乙醇配制2mM的HMMPC溶液；把2ml的HEPES缓冲溶液和10μl的HMMPC溶液加到干净的紫外比色皿中，在紫外可见分光光度仪上检测，315nm 389nm有吸收；取Hcy的溶液，逐渐用微量进样器加到此比色皿中，边加样边在紫外可见分光光度仪上检测，随着Hcy的加入，吸收峰315nm，389nm均逐渐变降低，当吸收峰不再降低时，停止加待测样，此时加入待测样的体积计为70μl；按10×7×2×10-3/70计算出Hcy的含量为2×10-3(mol/L)。紫外可见吸收图见图4。
实施例5检测Hcy
配制pH＝7.0的的Tris-HCl(10mM)缓冲溶液，配制2mM的Hcy溶液，并用乙醇配制2mM的HMMPC溶液；把2ml的Tris-HCl缓冲溶液和10μl的HMMPC溶液加到干净的紫外比色皿中，在紫外可见分光光度仪上检测，315nm 389nm有吸收；取Hcy的溶液，逐渐用微量进样器加到此比色皿中，边加样边在紫外可见分光光度仪上检测，随着Hcy的加入，吸收峰315nm，389nm均逐渐变降低，当吸收峰不再降低时，停止加待测样，此时加入Hcy的体积计为70μl；按10×7×2×10-3/70计算出Hcy的含量为2×10-3(mol/L)。紫外可见吸收图见图5。
实施例6检测Hcy
配制pH＝7.0的的醋酸-醋酸钠(10mM)缓冲溶液，配制2mM的Hcy溶液，并用乙醇配制2mM的HMMPC溶液；把2ml的醋酸-醋酸钠缓冲溶液和10μl的HMMPC溶液加到干净的紫外比色皿中，在紫外可见分光光度仪上检测，315nm 389nm有吸收；取Hcy的溶液，逐渐用微量进样器加到此比色皿中，边加样边在紫外可见分光光度仪上检测，随着Hcy的加入，吸收峰315nm，389nm均逐渐变降低，当吸收峰不再降低时，停止加待测样，此时加入Hcy的体积计为70μl；按10×7×2×10-3/70计算出Hcy的含量为2×10-3(mol/L)。紫外可见吸收图见图6。

Claims (4)

1.一种检测同型半胱氨酸的试剂：特征在于它是5-(hydroxylmethyl)-7-methyl-3，3a-dihydrocyclopenta[b]chromen-1(2H)-one(HMMPC)。
2.如权利要求1所述的一种检测同型半胱氨酸的试剂合成方法，其特征在于步骤为：将3-羟甲基-5-甲基水杨醛、环戊烯酮、咪唑、四氢呋喃和去离子水按摩尔比1∶1.5∶1.5∶85∶85混合，在室温下搅拌48小时，用相当于3-羟甲基-5-甲基水杨醛10倍摩尔量的1M HCl稀释，并用相当于3-羟甲基-5-甲基水杨醛155倍摩尔量的乙酸乙酯萃取三次，将有机相减压蒸干，然后用体积比1∶4的乙酸乙酯和石油醚在硅胶色谱柱淋洗，得到HMMPC。
3.一种检测同型半胱氨酸的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)、配制pH＝6.0-9.0、浓度为1-100mM的HEPES缓冲溶液，并用乙醇配制2mM的HMMPC乙醇溶液；
(2)、把2ml的HEPES缓冲溶液和10μl的HMMPC溶液加到干净的紫外比色皿中，在紫外可见分光光度仪上检测，随着待测样的加入，吸收峰315nm和389nm均逐渐降低，当吸收峰不再降低时，停止加待测样，此时加入待测样的体积计为V待测样；
(3)、按10×7×2×10-3/V待测样计算出待测样中Hcy的浓度。
4.如权利要求3所述的一种检测同型半胱氨酸的方法，其特征在于所述的HEPES缓冲溶液用醋酸-醋酸钠缓冲溶液、Tris-HCl、柠檬酸或磷酸缓冲溶液代替。
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