CN1274830C - 一种新型鲑鱼降钙素类似物及其在植物油体中表达的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明采用基因工程技术，克隆了一种新型鲑鱼降钙素类似物的基因msCT(31aa)，并建立了油体蛋白(oleosin)与目的蛋白融合的基因表达体系。其中包括：(1)分离和克隆了油菜油体蛋白基因的启动子及编码芝麻油体蛋白的结构基因；(2)设计合成了编码鲑鱼降钙素类似物msCT[Trp1，Ser6，Phe7，del-Leu19]的基因msCT，将其插在芝麻油体蛋白基因的C端；(3)构建了由油菜油体蛋白基因启动子驱动的芝麻油体蛋白-msCT融合基因植物表达载体，分别用农杆菌法和花粉管通道法转化油菜和棉花，分别获得转基因植株及株系。(4)转基因油菜和棉花的分子生物学检测证明外源基因的整合和表达。本发明的新型降钙素类似物，其生物活性为6000～8000U/mg，远远超过天然鲑鱼降钙素4，500U/mg和人降钙素150U/mg，该鲑鱼降钙素类似物具有降低血钙的作用，可用于治疗骨质疏松、Paget’s症、骨痛及各种高血钙症等。
Description
发明领域
本发明涉及一种新型鲑鱼降钙素类似物msCT(31aa)及其在植物油体中表达的方法，具体地说涉及利用植物油体蛋白—目的蛋白组成融合蛋白基因表达体系生产鲑鱼降钙素类似物msCT(31aa)及其它目的蛋白的方法。
发明内容
降钙素是调节体内钙、磷代谢及骨骼代谢的重要多肽类激素，可降低血钙的水平，还具有抗组胺、抗胆碱、抑制胃酸和胰腺分泌的作用。临床上主要用于治疗高血钙症、骨质疏松、变形性骨炎(Pagete’s症)、骨疼、脊椎管狭窄症、恶性肿瘤的骨转移、肾性骨异营养症、骨折、高磷酸盐血症、消化性溃疡、急性胰腺炎、甲状旁腺机能亢进和风湿性关节炎等，还可做为某些癌症的诊断用药，是重要的生化药物之一。新的“钙迁移”学说认为，骨质疏松症使骨中钙流失到血液中，并在脑、血管中沉积，从而引起老年性痴呆、血管硬化等老年性疾病，因此，降钙素在预防和治疗老年性骨质疏松方面有着很好的应用前景。中国正在进入一个老龄化社会，老年人易患骨质疏松症，该疾病也是一个世界性问题。据统计美国每年要花费约100亿美元用于治疗骨质疏松症，每年有130万人因骨质疏松症引起骨折，其中的髋骨骨折可引起严重的并发症，约5％～20％的病人骨折后1年内死亡，50％以上的生存者致残。由于生物材料中降钙素含量极微(每公斤鲜猪甲状腺中仅含5～6mg降钙素)、提取工艺复杂和化学合成较昂贵等原因，限制了降钙素的大量应用，所以美、日、英等国都积极开发基因工程降钙素，如何获得生物活性高、半衰期长、无抗原性的降钙素一直为人们所关注。
用转基因植物生产医用蛋白或工业用酶，近年来受到人们的广泛关注。在植物油体中表达外源蛋白，目的基因插在油体蛋白(Oleosin)基因的C末端或N端，构成融合蛋白基因。由于Oleosin蛋白镶嵌在油体表面，融合蛋白基因在受体植物种子的油体中特异表达后，利用油体亲脂疏水的特性，将种子粉碎→液体抽提→离心，回收上层油相，即可将融合蛋白或目的蛋白与细胞内的其它组份分开，从而可明显简化目的蛋白的分离纯化过程。
为完成本发明所涉及的油体表达***的构建，本发明人首先分离、克隆了油菜油体蛋白基因的启动子、芝麻油体蛋白的结构基因以及鲑鱼降钙素的突变基因msCT[Trp1，Ser6，Phe7，del-Leu19]，然后将msCT基因插在芝麻油体蛋白基因的C端，构建了由油菜油体蛋白基因的启动子驱动的融合蛋白基因植物表达载体，转化油菜和棉花，分别获得了转基因植株及株系。
转基因油菜经PCR检测，证明降钙素基因已整合到油菜基因组中。转基因棉花经PCR-Southern和Western检测，证明msCT基因在棉花中整合并在油体中表达，目前已得到T2代转基因棉花株系44个。由于在田间对T1、T2代植株的叶片用高浓度(5000ppm)的卡那霉素(Kan)溶液涂抹，故筛选出的卡那霉素抗性(KanR)株理论上应为高表达的个体。
天然鲑鱼降钙素的氨基酸序列如下：
Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2
本发明人经广泛深入的研究，现已发明一种新型的鲑鱼降钙素类似物msCT，其氨基酸序列为：Trp-Ser-Asn-Leu-Ser-Ser-Phe-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2，即将天然鲑鱼降钙素的第1位氨基酸Cys突变为Trp，第6位的Thr突变为Ser，第7位的Cys突变为Phe，第19位的Leu缺失(其核苷酸序列见序列表序列标识符号3)。
发明效果
msCT与天然鲑鱼降钙素相比，第1、第6、第7、第19位的氨基酸均进行了改造，使其生物活性明显提高(6,000～8,000U/mg)，天然鲑鱼降钙素和人降钙素的生物活性分别为4,500和150U/mg。
利用转基因植物在植物油体中表达鲑鱼降钙素类似物等外源目的蛋白，可以大大简化目的蛋白的分离纯化过程，降低生产成本；转基因植物的种子易于贮运，有利于工业化生产，并明显提高农副产品的附加值。
附图简介
图1是植物表达载体pNOC121的结构示意图。
图2是pNOP载体的构建图。
图3是pNOP的酶切鉴定图，其中1：pNOP/HindIII+PstI双酶切；2：λDNA/EcoRI+HindIII marker。
图4是pSO载体的构建图。
图5是pSO的酶切鉴定图，其中1：λDNA/EcoRI+HindIIImarker；2：pSO/PstI+BamHI双酶切。
图6是pCT载体的构建图。
图7是pCT的酶切鉴定图，其中1：pBR322DNA/BstNI marker；2：pCT/BamHI+XhoI双酶切。
图8是中间载体pNOPM的构建图。
图9是pNOPM的酶切鉴定图，其中1：pNOPM/HindIII+PstI双酶切；2：λDNA/EcoRI+HindIII marker。
图10是中间载体pNsOM的构建图。
图11是pNsOM的酶切鉴定图，其中1：λDNA/EcoRI+HindIIImarker；2：pNsOM/PstI+BamHI双酶切。
图12是中间载体pNOCM的构建图。
图13是pNOCM的酶切鉴定图，其中1：pNOCM/BamHI+XhoI双酶切；2：λDNA/EcoRI+HindIII marker。
图14是植物表达载体pNOC121的构建图。
图15是pNOC121的酶切鉴定图，其中1：λDNA/EcoRI+HindIIImarker；2：pNOC121/HindIII+EcoRI双酶切。
图16是转基因油菜nptII的PCR检测，其中1：λDNA/EcoRI+HindIII marker；2～5：750bp PCR扩增的目的片段。
图17是转基因油菜sOle/msCT的PCR检测，其中1～4：577bpPCR扩增的目的片段；5：λDNA/EcoRI+HindIII marker。
图18是转基因棉花T1代的PCR-Southern杂交(nptII)，其中1～11、13～23、25～34为转基因棉花；12、24、36为λDNA/EcoRI+HindIIImarker；35为非转基因棉花对照。
图19是转基因棉籽油体中油体蛋白-msCT融合蛋白的Western检测，其中1：蛋白质分子量maker；2：非转基因棉花对照；3：转基因棉花株系351。
图20是pEA结构图。 图21是pMV结构图。
下面是实现本发明的具体实施方式
本研究中我们将鲑鱼降钙素基因msCT***芝麻油体蛋白基因(sOle)的3’端，构建以油菜油体蛋白基因的启动子(NOP)驱动的sOle/msCT融合蛋白基因的植物表达载体pNOC121。pNOC121结构示意图见图1。
实施例1 油菜油体蛋白基因启动子的PCR扩增和克隆
由于油菜是我国重要的大宗油料作物，含油量高(42～45％)，而且油菜油体中20kD油体蛋白的量为24kD油体蛋白量的10倍，所以我们根据20kD油体蛋白基因启动子的序列设计了引物NP5、NP3，其序列如下：
NP5：ATTCAAGCTTGTCGGATCATGACGTTTCCAG
NP3：GCTTCTGCAGAATTGAGAGAGATCGAAGAG
以白菜型油菜(B.campestris)青油14品种的总DNA为模板，PCR扩增了896bp的20KD oleosin基因的启动子(PCR反应条件为：94℃30秒，58℃30秒，72℃1分钟，35个循环结束后72℃延伸10分钟)，用HindIII+PstI双酶切将其连接到pUC19上，得到pNOP。pNOP载体的构建过程和酶切鉴定分别见图2、3。pNOP测序结果表明，克隆产物为896bp油菜油体蛋白基因的启动子(见序列表序列标识符号1)。
实施例2 芝麻油体蛋白基因的扩增和克隆
以带有芝麻油体蛋白基因的质粒pEA(图20)DNA为模板，设计引物Ole5、Ole3，其序列如下：
Ole5：GTGCTGCAGACAACAATGGCGGACGAACCCCACG
Ole3：AAAGGATCCCGGTCTTATTACATCTTGGCTTC
PCR扩增获得440bp不含终止子序列的芝麻油体蛋白基因。PCR反应条件为：94℃30秒，52℃30秒，72℃1分钟，35个循环结束后72℃延伸10分钟。PCR产物用PstI/BamHI双酶切，连接到载体pUC19上，获得克隆载体pSO。pSO的载体构建、酶切鉴定分别见图4、5。其序列见序列表序列标识符号2。
实施例3 鲑鱼降钙素类似物基因的人工合成
我们根据植物偏爱的密码子、GC含量和所需的酶切位点设计了相应的基因序列，进行了鲑鱼降钙素类似物msCT基因的人工合成(共138bp)。此基因的G/C含量为51.5％，克隆载体为pBluescriptSK。在BamHI/XhoI位点***msCT基因后的克隆载体命名为pCT。pCT载体的构建及酶切鉴定见图6、7。
实施例4 中间载体pNOPM的构建
提取pNOP的质粒DNA，以HindIII/PstI双酶切，回收896bp目的片段(油菜油体蛋白基因的启动子)，连接到载体pMV上(图21)，获得中间载体pNOPM，经HindIII/PstI双酶切鉴定证明连接正确。pNOPM中间载体的构建及酶切鉴定见图8、9。
实施例5 中间载体pNsOM的构建
提取pSO质粒DNA，以PstI/BamHI双酶切，回收440bp目的片段(芝麻油体蛋白基因)，将其连接到pNOPM上，获得中间载体pNsOM，经PstI/BamHI双酶切鉴定，酶切片段大小为440bp。pNsOM中间载体的构建及酶切鉴定见图10、11。
实施例6 中间载体pNOCM的构建
提取pCT质粒DNA，用BamHI/XhoI双酶切后回收138bp目的片段(鲑鱼降钙素类似物msCT基因)，连接到pNsOM载体上，获得中间载体pNOCM(图12)。经BamHI/XhoI双酶切鉴定，酶切片段大小为138bp(图13)。
实施例7 植物表达载体pNOC121的构建
提取pNOCM质粒DNA，用HindIII/EcoRI双酶切，回收约2.0kb的DNA片段，将其连接到pBI121(购自CLONTECH公司)上(图14)，HindIII/EcoRI双酶切鉴定证实酶切片段大小为2.0kb(图15)。至此完成了NOP/sOle/msCT植物表达载体pNOC121的构建。
实施例8 农杆菌介导的油菜遗传转化
1.pNOC121质粒DNA转入农杆菌
2微克pNOC121质粒DNA加入到100微升LBA4404感受态细胞中，混匀，冰浴5分钟。液氮中冷冻5分钟后迅速转至37℃水浴中温浴5分钟。加入1毫升YEB液体培养基，在28℃摇床上250rpm振荡培养4～5小时。取适量菌液涂布到含链霉素125mg/L和卡那霉素100mg/L的YEB固体培养基上，置28℃培养24～48小时，筛选获得带有pNOC121质粒DNA的农杆菌单菌落。
2.农杆菌的活化
从平板上挑取农杆菌单菌落，接种到5毫升YEB液体培养基中(含卡那霉素100mg/L，链霉素100mg/L)，振荡培养过夜，取1毫升菌液接种到50毫升YEB液体培养基(含卡那霉素100mg/L，链霉素100mg/L)中，剧烈振荡培养至OD600为0.4～0.5(约3～4小时)，5000rpm离心5分钟，菌体用MS1(MS+6BA 1.0mg/L+NAA0.05mg/L)培养基洗一次，以MS0(不含任何激素及抗生素)重悬，使OD600为0.1～0.2。
3.油菜的遗传转化
切取发芽7天的油菜下胚轴，在上述MS0重悬的农杆菌菌液中浸泡1分钟，放到MS1(MS+BA 1mg/L+NAA 0.05mg/L)固体培养基上共培养4天，之后转到含有卡那霉素10mg/L+噻孢霉素(Cef)100mg/L的MS1固体培养基上继续进行芽分化选择培养，约4周左右有抗性芽出现，待抗性芽伸长至1～2厘米时转至生根培养基MS2(MS+NAA 0.1mg/L+Kan 100mg/L+Cef 100mg/L)上，一般10天左右即可生根。
实施例9 转基因油菜的PCR检测
提取转基因油菜基因组DNA，分别以npt5/npt3和sOle/msCT两对引物进行PCR扩增检测，各引物序列为：
npt5：GAACAAGATGGATTGCACGC
npt3：AGAAGGCGATAGAAGGCGATG
sOle：TGGCGGACGAACCCCACGACC
msCT：CTTACTCAGCCTCGAGTTACTATCCT
npt5/npt3的PCR反应条件为：94℃30秒，52℃30秒，72℃1分钟；sOle/msCT的PCR反应条件为：94℃30秒，62℃30秒，72℃1分钟。35个循环后均在72℃延伸10分钟。分别扩增出预期的750bpnptII及578bp的芝麻oleosin-msCT目的片段。PCR检测照片分别见图16和17。
实施例10 海岛棉海7124的花粉管通道法转化
大量提取pNOC 121质粒DNA，用无菌的重蒸水稀释成0.02μg/μl，在北京当海7124开花约24小时时，将稀释好的DNA溶液以每朵花10微升的量(0.2微克DNA)注入棉花子房内，并在蕾柄处涂抹1％的赤霉素，以防止蕾铃脱落。共收获了5公斤约5万粒棉花种子，送海南南繁，播种后在苗期以5000ppm的卡那霉素溶液涂抹叶片，筛选出101株卡那霉素抗性(KanR)植株。
实施例11海7124转基因棉花T2代植株的
卡那霉素抗性(KanR)检测
海南南繁KanR株上收获的T2代种子，在北京播种，4叶期及现蕾前分两次在各株行的每一株叶片上涂抹5000ppm的卡那霉素，两次田间调查各株行KanR及Kans(卡那霉素敏感)株的结果列于表1。
表1北京T2代植株田间Kan抗性调查表
| 北京株行 | 海南编号 | KanR株 | KanS株 | 总株数 | 北京株行 | 海南编号 | KanR株 | KanS株 | 总株数 |
| 1 | 1 | 5 | 1 | 6 | 48 | 91 | 0 | 25 | 25 |
| 2 | 2 | 12 | 9 | 21 | 49 | 92 | 0 | 18 | 18 |
| 5 | 7 | 10 | 10 | 20 | 50 | 93 | 0 | 19 | 19 |
| 6 | 8 | 11 | 45 | 56 | 51 | 94 | 1 | 16 | 17 |
| 7 | 10 | 0 | 47 | 47 | 52 | 96 | 5 | 13 | 18 |
| 8 | 11 | 1 | 10 | 11 | 53 | 100 | 0 | 18 | 18 |
| 9 | 13 | 0 | 32 | 32 | 54 | 101 | 2 | 45 | 47 |
| 10 | 15 | 0 | 19 | 19 | 55 | 102 | 0 | 88 | 88 |
| 11 | 16 | 0 | 56 | 56 | 56 | 103 | 2 | 77 | 79 |
| 13 | 19 | 11 | 8 | 19 | 57 | 104 | 0 | 22 | 22 |
| 14 | 20 | 11 | 17 | 28 | 58 | 105 | 1 | 58 | 59 |
| 15 | 21 | 0 | 41 | 41 | 59 | 106 | 1 | 61 | 62 |
| 16 | 23 | 3 | 44 | 47 | 60 | 107 | 3 | 41 | 44 |
| 17 | 24 | 2 | 8 | 10 | 61 | 108 | 1 | 4 | 5 |
| 19 | 26 | 0 | 51 | 51 | 63 | 109 | 2 | 62 | 64 |
| 21 | 28 | 1 | 25 | 26 | 64 | 110 | 6 | 86 | 92 |
| 23 | 31 | 0 | 31 | 31 | 65 | 111 | 2 | 34 | 36 |
| 26 | 36 | 2 | 18 | 20 | 66 | 112 | 2 | 47 | 49 |
| 29 | 39 | 1 | 33 | 34 | 67 | 114 | 2 | 51 | 53 |
| 30 | 44 | 4 | 52 | 56 | 68 | 117 | 18 | 13 | 31 |
| 32 | 46 | 1 | 21 | 22 | 69 | 120 | 5 | 29 | 34 |
| 34 | 48 | 0 | 33 | 33 | 71 | 351 | 4 | 22 | 26 |
| 35 | 50 | 3 | 8 | 11 | 72 | 6 | 1 | 43 | 44 |
| 36 | 51 | 0 | 7 | 7 | 73 | 9 | 0 | 21 | 21 |
| 37 | 76 | 1 | 46 | 47 | 74 | 12 | 1 | 2 | 3 |
| 38 | 77 | 1 | 36 | 37 | 75 | 18 | 0 | 3 | 3 |
| 39 | 78 | 1 | 67 | 68 | 76 | 41 | 3 | 10 | 13 |
| 40 | 80 | 3 | 70 | 73 | 77 | 79 | 0 | 30 | 30 |
| 41 | 82 | 0 | 20 | 20 | 78 | 90 | 0 | 3 | 3 |
| 42 | 84 | 1 | 41 | 42 | 79 | 95 | 0 | 2 | 2 |
| 44 | 86 | 0 | 15 | 15 | 80 | 97 | 2 | 3 | 5 |
| 45 | 87 | 0 | 47 | 47 | 81 | 98 | 1 | 1 | 2 |
| 46 | 88 | 2 | 24 | 26 | 82 | 14 | 1 | 4 | 5 |
| 47 | 89 | 2 | 27 | 29 |
实施例12 T2代转基因棉花的PCR-Southern检测
提取KanR株的基因组DNA，以npt5/npt3及sOle/msCT两对引物对基因组DNA进行PCR扩增。PCR的反应条件为：npt5/npt3：94℃30秒，52℃30秒，72℃1分钟；sOle/msCT：94℃30秒，62℃30秒，72℃1分钟。35个循环后均在72℃下延伸10分钟。结果表明，有63株为nptII阳性，在这63株中有44株为sOle/msCT阳性。
取T2代nptII及sOle/msCT PCR均为阳性的转基因棉花32株，以pNOC121质粒DNA/HindIII+EcoRI双酶切的片段为探针，进行PCR-Southern杂交，结果29株为阳性(图18)。
实施例13 棉籽中oleosin油体蛋白-calcitonin目的蛋白的
Western检测
提取棉籽中的油体蛋白，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。经转膜后用山羊抗鲑鱼降钙素的多克隆抗体进行Western分析。结果表明，在转基因棉花351株系的种子中有鲑鱼降钙素类似物蛋白的表达，表达产物大小约为19kD，与预期的大小一致(芝麻Oleosinn蛋白15.5kD+msCT蛋白3.45kD)，如图19所示。
实施例14 油体蛋白与鲑鱼降钙素类似物的分离
1.棉籽中油体蛋白—鲑鱼降钙素类似物融合蛋白的提取
(1)取棉花种子10粒去掉外壳，加约3倍体积的缓冲液A(0.15MTricine-KOHpH7.5，10mM KCl，1mM MgCl2，1mM EDTA，0.6M蔗糖)研磨，5000×g、4℃离心10分钟。
(2)上清用含0.6M蔗糖的缓冲液A重悬。
(3)液面上覆以等体积的含0.1M蔗糖的缓冲液A。
(4)18000×g、4℃离心20分钟，重复两次，取上清。
注；至此将油体与种子中的其它成份分开。油体的成份包括：中性脂类、磷脂、油体蛋白。
(5)上清中加2倍体积的***，13600×g离心4分钟，上部的***层中多为中性脂类，磷脂留在下面的水相中，取中间的蛋白层。
(6)以250微升含0.1M蔗糖的缓冲液A重悬蛋白，加750微升氯仿/甲醇(2∶1)混合物，抽提2～3次。
(7)取中间蛋白层，用***抽提一次，-70℃冰箱中冻干保存。
2.油体蛋白与鲑鱼降钙素类似物的分离
(1)将油体蛋白-鲑鱼降钙素类似物的融合蛋白溶于尽可能少的无菌水中。
(2)加入50微升凝血酶酶切反应缓冲液(0.1M三乙醇氨pH8.4，0.5％肌氨酰)。
(3)加入0.02U凝血酶，37℃酶切过夜。
(4)经HPLC分离，获得鲑鱼降钙素类似物。
3.鲑鱼降钙素类似物的HPLC纯化程序
分析型反相柱C18(5μ，8×250mm，大连化学物理研究所)；紫外波长214nm；流动相A-0.1％三氟乙酸，B-70％乙腈(0.1％三氟乙酸)。梯度：B在20分钟内由0％升至60％，10分钟内再降至0％，流速为0.5毫升/分钟，收集鲑鱼降钙素类似物，冻干，-70℃保存。
序列表
<110>中国农业科学院生物技术研究所
<120>一种新型鲑鱼降钙素类似物及其在植物油体中表达的方法
<160>4
<170>PatentIn Version 2.1
<210>1
<211>896
<212>DNA
<213>油菜(Brassica campestris)
<400>1
ATTCAACGTTGTCGGATCATGACGTTTCCAGAAAACATCGAGCAAGCTCTC
AAAGCTGACCTCTTTCGGATCGTACTGAACCCGAACAATCTCGTTATGCCC
CGTCGTCTCCGAACAGACATCCTCGTAAGTAGGATTGTCGACGAATCCATG
GCTATACCCAACCTCCGTCTTCGTCACGCCTGGAACCCTCTGGTAAGCCAA
TTCCGCTCCCCAGAAGCAACCGGCGCCGAATTGCGCGAATTGCTGACCAG
GCGAAGGAACATCGTCGTCGGGTCCTTGTGCGATTGCGGAGGAAGCCGCC
GGGTCGGGTTGGGGACGAGACCCGAATCCGAGCCTGGTGAATAGGTTGTT
CATCGGAGATTTATAGACGGAGATGGATCGAGCGGTTTTGGGGAAAGGGG
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AAGAAACCGTTAAGAGTCGGATATTTATTATATTAAAAGCCCACTGGGCCTA
AACCCATTTAAACAAGACAAGATAAATGGGCCGTGTGTGAGTGTTAACGTT
CGGTTTCAAATGCCAACGCCATTGGAACAA AACAAACGTGTCCTCAAGTA
AACCCCTGTCGTTTACACCTCAATGGCTGCATGGTGAAGCCATTAACACGT
GGCGTAGAATGCATGACGACGCCATTGACACCTGACTCTCTTTCCTTCTCT
TCATATATCTCTAATCAATTCAACACTCATTGTCATAGCTATTCGGAAAATAT
ATACACATCCTTTTCTCTTCGATCTCTCTCAATTC
<210>2
<211>440
<212>DNA
<213>芝麻(Sesamum indicum L.)
<400>2
ATGGCGGacGAACCCCACGACCaGCGCCCCACCGACGTCATCaaGAGCTACC
TCCCCGAAAaGGGTCCCTCCACCTCTCAAGTCCTCGCCGTCGTGACCCTCT
TCCCCCTCGGCGCCGTCCTCCTCTGCCTAGCCGGTCTCATTCTTACCGGGA
CCATCATCGGCCTCGCCGTCGCCACCCCGCTCTTCGTCATCTTCAGCCCCAT
CTTGGTCCCCGCCGCCCTAACCATCGCCCTAGCCGTCACCGGTTTCTTGAC
CTCCGGAGCTTTCGGCATCACCGCCCTGTCCTCGATTTCGTGGTTGCTGAA
CTACGTTAGGCGAATGCGGGGGAGCTTGCCAGAGCaGCTGGATCATGCACG
GCGGCGCGTGCaGGAGAcGGTGGGCCaGAaGACAAGGGAGGCGGGGCaGA
GAAGCCAAGATGTAATAAGACCGTGA
<210>3
<211>138
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
GGATCCCATA TGCTTGTTCC AAGGGGATCT TGG AGC AAC CTC AGC AGC TTC GTG CTC GGA
AAG CTC AGC CAA GAG CTC CAC AAG CAA ACC TAC CCA AGG ACC AAC ACC GGA TCT
GGA ACC CCA GGA TAG TAA CTCGAG
<210>4
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<400>4
Trp-Ser-Asn-Leu-Ser-Ser-Phe-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2
Claims (12)
1.一种编码鲑鱼降钙素类似物msCT(31aa)的基因msCT[Trp1，Ser6，Phe7，del-Leu19]，其编码产物的氨基酸序列结构为：Trp-Ser-Asn-Leu-Ser-Ser-Phe-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2，即将天然鲑鱼降钙素的第1位氨基酸Cys突变为Trp，第6位的Thr突变为Ser，第7位的Cys突变为Phe，第19位的Leu缺失。
2.一种重组载体，含有权利要求1所述的基因。
3.根据权利要求2所述的载体，该载体包括油体蛋白(oleosin)基因的启动子，油体蛋白的结构基因及编码鲑鱼降钙素类似物的基因。
4.一种制备降钙素类似物的方法，包括：
(1)将权利要求1所述的基因插在油体蛋白基因的C端或N端；
(2)将获得的融合基因置于油体蛋白启动子之后构建植物表达载体；
(3)用构建的植物表达载体转化受体植物；
(4)获得转基因植物；
(5)分离和纯化在转基因植物油体中表达出的目的蛋白。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其中所述的受体植物和转基因植物是油料植物。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其中所述的油料植物是油菜、向日葵，大豆，花生，芝麻，棉花、油棕或油橄榄。
7.由权利要求4-6所述的制备方法获得的转基因植物细胞，组织或器官。
8.一种鲑鱼降钙素类似物，其氨基酸序列结构为：Trp-Ser-Asn-Leu-Ser-Ser-Phe-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2。
9.含有权利要求1所述的基因或含有权利要求2所述的重组载体的真菌。
10.根据权利要求9所述的真菌，它是一种酵母。
11.含有权利要求1所述的基因或含有权利要求2所述的重组载体的细菌。
12.根据权利要求11所述的细菌，它是一种大肠杆菌或农杆菌。
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