CN102321661A

CN102321661A - 一种真核表达重组质粒及其构建方法与稳定表达该质粒的Vero细胞系

Info

Publication number: CN102321661A
Application number: CN 201110257669
Authority: CN
Inventors: 赵建军; 闫如勋; 闫喜军
Original assignee: Institute Special Animal and Plant Sciences CAAS
Current assignee: Institute Special Animal and Plant Sciences CAAS
Priority date: 2011-09-01
Filing date: 2011-09-01
Publication date: 2012-01-18

Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种真核表达重组质粒及其构建方法与稳定表达该质粒的Vero细胞系。该真核表达重组质粒具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列。应用稳定表达该质粒的Vero细胞系，可以对犬瘟热病毒强毒株进行高效分离及用于犬瘟热病毒致病机制的研究。

Description

一种真核表达重组质粒及其构建方法与稳定表达该质粒的Vero细胞系

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种真核表达重组质粒及其构建方法与稳定表达该质粒的Vero细胞系。

背景技术

犬瘟热(Canine distemper，CD)是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)引起的一种犬科、鼬科等动物易患高度接触性传染病。该病是养犬业、毛皮动物养殖业危害最大的传染病之一，以厌食、双相热、结膜炎、胃肠炎和神经症状为典型特征，可引起大批犬、狐、貉等动物发病，发病死亡率为30～80％。近年来，犬瘟热病毒感染宿主的范围日益扩大，灵长目的猕猴，鳍足目海豹科的海豹、大熊猫、猫科中大型动物狮子、非洲的野狗等均有报道感染犬瘟热病毒。在我国，随着近几年来军犬、警犬、实验用犬和毛皮动物狐、貉等饲养量的大幅度增加以及异地交流的增多，犬瘟热在犬、狐、貉中的发病率和致死率均有升高的趋势，因此犬瘟热防控显得尤为重要。

病毒分离技术是对犬瘟热病毒致病机制研究的重要手段，但具有囊膜的犬瘟热病毒不易在环境中存活，因此难以用普通方法分离成功。目前，针对犬瘟热病毒野毒株的分离一般通过易感动物肺巨噬细胞与Vero或MCDK等传代细胞系共培养的方法，但此类方法存在操作复杂、耗费时间长和分离得到病毒效价不稳定等缺点外，而且由于以上传代细胞为犬瘟热病毒非敏感细胞，对于分离到的犬瘟热病毒很可能在适应细胞的过程中发生了毒力基因的突变，造成病毒株的致弱。由于犬瘟热病毒(尤其强毒株)在体外培养时缺乏敏感且适用的细胞或细胞系，造成犬瘟热病毒分离成功率较低(一般低于20％)，严重阻碍了对犬瘟热病毒病原学生物学及致病机制方面的研究。

2001年，Tatsuo等将CDV野毒株在人工表达犬信号淋巴细胞激活分子(SLAM又称CD150)的CHO细胞上感染，试验证实犬的SLAM为CDV感染的受体，CDV H蛋白通过识别SLAM而吸附到细胞表面起始病毒的感染过程。2003年，Seki等应用建立的稳定表达犬SLAM的Vero细胞系(Vero.DogSLAMtag)较Vero和B95a细胞更快速且敏感地从疑似犬瘟热病犬体内分离到犬瘟热病毒。由于Vero.DogSLAMtag中表达的tag标签为禽流感病毒HA蛋白的抗原表位，因此对该阳性Vero细胞系鉴定需要借助针对该表位的单克隆抗体进行免疫印迹或间接免疫荧光方法。因此，从该细胞系的构建立及鉴定所用方法较为繁琐。此外，由于该阳性Vero细胞系中犬SLAM表达量较低，造成病毒分离的敏感性不高，直接影响了犬瘟热病毒的分离效率。2010年，赵建军等成功克隆了狐、貉和水貂的SLAM基因，并证实其均能作为犬瘟热病毒感染的受体。

因此，构建一种高效表达且病毒嗜性敏感的SLAM基因的重组质粒并导入Vero细胞中，获得稳定表达该SLAM基因的Vero细胞系，对于快速且敏感的分离犬瘟热病毒及其对其致病机制研究具有现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种真核表达重组质粒及其构建方法与稳定表达该质粒的Vero细胞系。该真核表达重组质粒具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列。应用该Vero细胞系，可以对犬瘟热病毒强毒株进行高效分离及应用于犬瘟热病毒致病机制的研究中。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种真核表达重组质粒具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列。

该真核表达重组质粒，由GeneBank登录号为EU678639的貉SLAM基因(rSLAM)、编码6个组氨酸(6×his)的核苷酸序列和Kozak序列的融合基因，Pcmv，IRES，EGFP和SV40pA组成，如图15所示。其中，所述质粒的5’至3’端依次为Pcmv，所述融合基因，IRES，EGFP和SV40pA，如图13所示。Kozak序列，为存在于真核生物mRNA的一段序列，在翻译的起始中有增强蛋白表达量的作用。真核生物基因中起始密码子上、下游的最佳序列为，-3位为嘌呤碱基；+4位为G，起始密码子AUG中的A处于+1位。

作为优选，所述Kozak序列具有如SEQ No.4所示的核苷酸序列。

本发明采用真核表达载体pIRES2-EGFP，购自美国Clontech公司，真核表达载体pIRES2-EGFP为一种双元表达载体，在多克隆位点(MCS)处***的目的基因和EGFP在CMV启动子下共表达，既能对表达进行监控(通过荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达来反应目的蛋白的表达情况)，又能很好地保持目的蛋白本身生物学特性。

该表达载体含有：

(1)用于克隆外源基因的多克隆位点MCS；

(2)允许一条mRNA分子上的两个编码基因得到分宜的人脑心肌炎病毒核糖体内部进入位点IRES；

(3)使用增强型绿色荧光蛋白基因EGFP；

(4)使mRNA分子加上polyA尾巴的SV40polyA信号区；

(5)Pcmv使后面的外源基因和EGFP基因组成型表达。经Xho I和EcoR I双酶切后，得到Pcmv，IRES，EGFP和SV40pA。

真核表达载体pIRES2-EGFP的序列具有如SEQ No.5所示的核苷酸序列，环状图谱见图14。

其中，Pcmv具有SEQ ID NO：6所示核苷酸序列，IRES具有SEQ ID NO：7所示核苷酸序列，EGFP具有SEQ ID NO：8所示核苷酸序列，SV40pA具有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列。

本发明还提供了一种真核表达重组质粒的制备方法，包括：

步骤1：以克隆有rSLAM的质粒pMD18-T-rSLAM为模板，在上游引物、下游引物的存在下扩增获得所述融合基因，所述上游引物序列如SEQ No.2所示，所述下游引物序列如SEQ No.3所示；

步骤2：pIRES2-EGFP载体经酶切，获得Pcmv、IRES、EGFP和SV40pA。

步骤3：取所述融合基因：酶切后，与步骤2中所述Pcmv、所述IRES、所述EGFP和所述SV40pA连接，转化受体菌，鉴定阳性克隆，获得所述质粒。

以质粒pMD18-T-rSLAM为模板，以序列如SEQ No.2所示的P₁：5’-CCG

ATGGATTCCAGGGGCTTCCTC-3’为上游引物，以序列如SEQ No.3所示的P₂：5’-CCG

TCAGTGATGGTGATGGTGATGGCTCTCTGGGAACGTCAC-3’为下游引物(方框为限制酶切位点，加粗的为Kozak序列，下划线为组氨酸标签基因)；进行PCR扩增，以获得目的基因。

反应体系可以为：DNA模板1μL(0.2ng/μL)，上下游引物各1μL(20pmoL/L)，Ex taq酶0.3μL(5U/μL)，dNTP(各2.5mmol/L)2μL，10×PCRbuffer 2.5μL，ddH2O补足25μL。扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，61.8℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃总延伸10min；4℃保存10min。PCR产物通过1％琼脂糖凝胶回收，然后连入到pMD18-T-simple载体，酶切鉴定。

作为优选，所述酶切为Xho I和EcoR I双酶切。

所述貉SLAM基因由所述质粒pMD18-T-rSLAM分别经Xho I和EcoR I双酶切获得。

所述Pcmv，IRES，EGFP和SV40pA由pIRES2-EGFP载体经Xho I和EcoR I双酶切获得。

一种Vero细胞系，Vero细胞基因组中克隆有上述真核表达重组质粒基因，细胞表面能稳定表达有犬瘟热病毒受体貉SLAM(rSLAM)。

Vero细胞系的构建方法可以为：设计1对引物以克隆有貉SLAM基因的pMD18-T-rSLAM质粒为模板，通过PCR方法获得Kozak序列+貉SLAM+6×his融合基因后，构建pIRES2-EGFP-rSLAMhis质粒；将所述pIRES2-EGFP-rSLAMhis质粒转染Vero细胞，通过观察EGFP表达及采用G418压力培养克隆筛选稳定表达SLAM的Vero细胞系。

本发明还提供了上述Vero细胞系在犬瘟热强毒株快速、敏感地分离和犬瘟热病毒研究中的应用。

本发明通过构建并转染真核表达重组质粒pIRES2-EGFP-rSLAMhis(由GeneBank登录号为EU678639的貉SLAM基因、编码6个组氨酸的核苷酸序列和Kozak序列的融合基因，Pcmv，IRES，EGFP和SV40pA组成，其中，所述质粒的5’至3’端依次为Pcmv，所述融合基因，IRES，EGFP和SV40pA。)到Vero细胞系，通过克隆筛选获得表面稳定、高表达量的犬瘟热病毒受体rSLAM的Vero细胞，进而接种含犬瘟热病毒的组织样品分离病毒，接毒试验结果表明，转染rSLAM后的Vero细胞增强了对CDV的敏感性，能够有效分离犬瘟热毒株。

本发明同时提供了由上述Vero细胞系分离得到的犬瘟热强毒株LN(10)f1株。

本发明提供一种真核表达重组质粒及其构建方法，以及稳定表达该质粒的Vero细胞系。为了加强目的蛋白基因(rSLAM)的翻译效率，便于蛋白表达的检测，本发明设计引物时，在rSLAM基因的上游和下游分别引入了Kozak序列。本发明在要表达蛋白的羧基端引入6个组氨酸标签，便于应用组氨酸标签单抗(该单抗在国内外已商品化)用Western blot和细胞免疫组化对SLAM蛋白的表达进行半定量评价，对于构建稳定表达细胞系的鉴定具有重要作用。Kozak序列在质粒表达时可以显著提高SLAM蛋白的表达量，有利于提高CDV与其结合效率，使表达细胞系病毒的分离效率提高。本发明采用真核表达载体pIRES2-EGFP，为一种双元表达载体，***的目的基因和EGFP在CMV启动子下共表达，既能对表达进行监控，又能很好地保持目的蛋白本身属性，可以在细胞筛选初期通过绿色荧光蛋白定位阳性细胞，并进行表达蛋白细胞的单克隆化挑选，结合G418抗性筛选，提高筛选的成功率。将pIRES2-EGFP-rSLAMh质粒转染到Vero细胞中，待转染细胞生长48h，发现pIRES2-EGFP-rSLAMh质粒转染后，EGFP的表达率较高。连续筛选10代后，EGFP依然表达。

本发明通过针对6个组氨酸标签的细胞免疫组化成功检测到转染后SLAM融合蛋白的表达，通过瞬时转染Vero细胞的接毒实验，证明转染SLAM后确实增强了细胞对CDV的敏感性，也同样说明在SLAM的C’端融合6个His标签蛋白并没有使SLAM蛋白失去与CDV H蛋白的识别和结合能力。为稳定转染细胞的建立的可行性提供可靠的实验基础。转染组细胞连续筛选10代后，用细胞免疫组化细胞内检测到SLAM融合蛋白的表达，同时也能检测到EGFP蛋白的表达。由绘制的转染细胞(V-p-rSLAMh细胞)和未转染Vero细胞的生长曲线，可计算Vero细胞和V-p-rSLAMh细胞的细胞倍增时间，Vero细胞的倍增时间最短为16.69h，V-p-rSLAMh细胞的倍增时间大于16.69h，说明表达外源蛋白后的细胞的生长速度变慢，表达外源蛋白增加细胞的代谢负担加重，生长速度变自然变慢，另外V-p-rSLAMh细胞在外型上大小上较Vero细胞大。本发明成功建立稳定表达貉SLAM的Vero细胞系，对于CDV的快速分离和研究平台的建立具有重要意义。

用V-p-rSLAMh细胞和Vero细胞分别接种3份来源死亡狐狸或貉犬瘟热疑似组织样品，V-p-rSLAMh细胞在接种第一代36～48h即可形成可见典型CDV CPE，而Vero细胞连续盲传6代仍未见CPE的形成。证实V-p-rSLAMh细胞较Vero细胞对CDV敏感。经RT-PCR验证所分离到的3株毒均为CDV，对分离的3株CDV H基因克隆测序后比对，结果表明3毒株CDV均为Asia-1基因型野毒株；以其中1株[命名为LN(10)f1株]在V-p-rSLAMh细胞连传4代后进行动物攻毒实验验证其毒力强弱，以4×10^2.39TCID₅₀/只的攻毒剂量可使攻毒组的貉和狐狸(每种动物各3只)全部死亡。证实经V-p-rSLAMh细胞分离的CDV保持其强毒毒力，对接种动物的致死率可达100％。

本发明建立了稳定表达貉SLAM受体的Vero细胞系，并对表达貉SLAM受体的Vero细胞系稳定性及对CDV敏感性进行了***的评价，证实该细胞系目的基因表达稳定，对CDV病毒敏感，分离得到CDV毒力较强。稳定表达貉CDV SLAM的Vero细胞系的建立，为CDV的分离和研究提供了一个平台。此外，预防CD的疫苗研制过程中，疫苗效力评定中毒力稳定的CDV强毒不可或缺，LN(10)f1株CDV细胞强毒的获得，将提供高效疫苗的评价工具，对CD的防疫具有重大意义。

附图说明

图1示PCR后胶回收rSLAM目的片段；其中，泳道1为100bp DNA LadderMarker，泳道2为以质粒pMD18-T-rSLAM为模板经PCR扩增后的目的片段，大小约为1100bp。

图2示重组表达载体酶切鉴定结果；其中，泳道1为100bp DNALadderMarker，泳道2为DL15000DNA Ladder Marker，泳道3为pIRES2-EGFP-rSLAMh经双酶切生成大小约为1100bp和5300bp两条带。

图3示G418工作浓度的确定；其中，图3(a)为无G418的Vero细胞；图3(b)为含200μg/mL G418的Vero细胞；图3(c)为含600μg/mL G418的Vero细胞；图3(d)为含800μg/mL G418的Vero细胞。

图4示重组质粒瞬时转染Vero细胞48h后EGFP的表达；其中，图4(a)为未转染的Vero细胞；图4(b)为pIRES2-EGFP转染的Vero细胞；图4(c)为pIRES2-EGFP-rSLAMh转染的Vero细胞。

图5示重组质粒瞬时转染Vero细胞后CDV接毒60h细胞病变(CPE)；其中，图5(a)为未转染的Vero细胞；图5(b)为pIRES2-EGFP转染的Vero细胞；图5(c)为pIRES2-EGFP-rSLAMh转染的Vero(箭头指示细胞病变位置)。

图6示将转染48h的Vero细胞，换G418含量为800μg/mL的10％FBS的筛选培养基，筛选培养10天左右，用胰酶消化细胞后按1∶40传至100mm的细胞培养皿，继续加筛选培养基筛选得到转染的Vero细胞簇。

图7示细胞免疫组化检测结果；其中，图7(a)为Vero细胞，图7(b)为转染空载体的Vero细胞，图7(c)为转染重组质粒Vero细胞(示SLAMh蛋白表达)。

图8示转染细胞与未转染细胞的生长曲线；其中，

示Vero细胞，示pIRES2-EGFP-rSLAMh转染后的Vero细胞(V-p-rSLAMh细胞)。

图9示接毒后的细胞病变；其中，图9(a)为接毒后的Vero细胞，图9(b)为接种JL(10)r1株CDV 48h的V-p-rSLAMh细胞，图9(c)为接种HeB(10)f1株CDV 48h的V-p-rSLAMh细胞，图9(d)为接种LN(10)f1株CDV 24h的V-p-rSLAMh细胞。

图10示V-p-rSLAMh细胞分离CDV的RT-PCR扩增结果。其中，泳道1为100bp DNALadder Marker，泳道2为JL(10)r1株，泳道3为HeB(10)f1株，泳道4为LN(10)f1株，泳道5为阳性对照。

图11示攻毒和对照貉的体温；其中，

示1号貉的体温，

示2号貉的体温，

示3号貉的体温，

示对照貉的体温。

图12示攻毒和对照狐狸的体温；其中，

示1号狐狸的体温，

示2号狐狸的体温，

示3号狐狸的体温，示对照狐狸的体温。

图13示真核表达载体pIRES2-EGFP图谱。

图14示真核表达载体pIRES2-EGFP环状图谱。

图15示本发明提供的真核表达重组质粒图谱。

具体实施方式

本发明公开了一种真核表达重组质粒及其构建方法，以及稳定表达该质粒的Vero细胞系，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

真核表达载体pIRES2-EGFP购自美国Clontech公司；限制性内切酶XhoI、EcoR I载体购自宝生物(大连)有限公司；Vero细胞为中国农业科学院特产研究所预防兽医研究室保存；Midiprep High-pure质粒提取试剂盒购于Invitrogen公司；DMEM培养基购自Gibco BRL公司；G418购自Promega公司；转染试剂

HD Transfection Reagent购自Roche公司；

Monoclonal Antibody购自Novagen公司；细胞免疫组化试剂盒SP kit(Mouse)购自北京博奥森生物技术有限公司；Trizol购自美国Invitrogen公司；倒置荧光显微镜购(DMI3000B)自德国徕卡公司；疑似犬瘟热狐狸组织样品为中国农业科学院特产研究所预防兽医研究室保存。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1构建真核表达重组质粒pIRES2-EGFP-rSLAMh

PCR扩增与基因克隆：以质粒pMD18-T-rSLAM为模板，以

P₁5’-CCG

ATGGATTCCAGGGGCTTCCTC-3’为上游引物，以P₂5’-CCGTCAGTGATGGTGATGGTGATGGCTCTCTGGGAACGTCAC-3’为下游引物(方框为限制酶切位点，加粗的为Kozak序列，下划线为组氨酸标签基因)，进行PCR扩增，以获得目的基因，反应体系为：DNA模板1μL(0.2ng/μL)，上下游引物各1μL(20pmol/L)，Ex taq酶0.3μL(5U/μL)，dNTP(各2.5mmol/L)2μL，10×PCR Buffer 2.5μL，ddH₂O补足25μL。

扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，61.8℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃总延伸10min；4℃保存10min。PCR产物通过1％琼脂糖凝胶回收，然后连入到pMD18-T载体，酶切鉴定。

以稀释后质粒pMD18-T-rSLAM为模板，PCR扩增目的片段，所得的目的片段经1％的琼脂糖胶回收纯化，经1％的琼脂糖，100V电压下电泳45min，在紫外透射仪下可见到预期大小约为1100bp的条带，ImageQuant 3000凝胶成像***(GE公司)采集图像，如图1所示。

真核表达载体的构建：质粒pMD18-T-rSLAMh用XhoI和EcoRI双酶切，胶回收目的片段在T4连接酶的作用下***到经XhoI和EcoRI双酶切的pIRES2-EGFP胶回收的载体片段。将连接的载体转化到克隆菌株DH5α中，涂在有卡纳青霉素(30μg/mL)抗性的LB平板上；培养24h后，无菌挑单克隆菌株于3～4mL有卡纳青霉素(30μg/mL)抗性的液体LB的试管中，将试管放入恒温振荡培养箱(37℃，200r/min)过夜；用质粒提取试剂盒(杭州博日)按说明书操作提取质粒。

酶切鉴定：pIRES2-EGFP-rSLAMh重组质粒经双酶切生成大小约为1100bp和5300bp两条带。结果如图2所示，表明成功构建真核表达质粒，pIRES2-EGFP-rSLAMh连入目的片段。

将构建的真核表达质粒送生物公司测序，序列具有如SEQ No.1所示的核苷酸序列。

实施例2建立稳定表达pIRES2-EGFP-rSLAMh的Vero细胞系

G418最适浓度的确定：复苏的Vero细胞用10％FBS的DMEM传2～3代后，把要传代的细胞胰酶消化，按每孔1×10⁴个/孔的量铺96孔板，第2日铺满板后吸除培养基，PBS洗细胞一次，加筛选培养基。G418的浓度依次为0、200、300、400、500、600、700、800、900、1000μg/mL，每个梯度设3个重复，每3天左右视培养基的颜色，换筛选培养基，连续培养10天，每天观察细胞死亡情况，以第10天细胞全部死亡的最低的G418浓度为最适筛选浓度。加不同浓度G418的Vero细胞，第2天筛选组均有少量细胞死亡；筛选8天时，800μg/mL组有95％的细胞死亡，900μg/mL组有99％的细胞死亡，1000μg/mL的100％细胞死亡；筛选10日(见图3)，200μg/mL组有40％的细胞死亡，600μg/mL组也有90％的细胞死亡，800μg/mL以上组细胞都死亡，确定Vero细胞G418最适的筛选浓度为800μg/mL。

转染用高纯度质粒的制备：将pIRES2-EGFP和实施例1制得的pIRES2-EGFP-rSLAMh的菌种，分别接于100mL Kan抗性的LB培养液中，37℃，200r/min，过夜。用Midiprep High-pure质粒提取试剂盒按操作说明书，纯化提取双表达载体。按照按说明书操作步骤提取质粒。

细胞瞬时转染：将生长状态良好的细胞以每孔1×10⁵个细胞的密度铺6孔板(6孔分别设置为未转染质粒组、转染pIRES2-EGFP空载体组、转染pIRES2-EGFP-rSLAMh组，转染空载体和重组质粒的Vero细胞分别命名为V-p和V-p-rSLAMh)，在37℃、5％CO₂培养箱中培养过夜后，当细胞汇合度约为80％时按照以下操作步骤进行细胞转染：转染前把无血清的DMEM、纯化质粒和转染试剂放在室温环境；在1.5mL无菌无硅化的EP管中加入100μL无血清和抗生素的DMEM，然后加入2μg的质粒充分混匀，使用无硅化移液枪头的移液器，悬空滴入9μL的HD Transfaction Reagen(加转染试剂前混匀)，颠倒混匀；室温孵育15min，以便形成转染复合物；将EP管内的转染复合物逐滴加入到对应的6孔板中，在滴加过程中轻轻转动6孔板以确保转染复合物均匀的分布于细胞表面；37℃、5％CO₂培养箱中培养48h后，荧光显微镜下采集图像。如图4(a)至图4(c)，发现pIRES2-EGFP-rSLAMh质粒转染后，EGFP的表达率较高。转染该重组质粒组的接种CDV后60h即可看到明显的CPE，未转染组和转染空质粒组的Vero没有出现可见的CPE，见图5(a)至图5(c)，由此可见转染后rSLAM的表达可显著提高CDV对细胞的易感性。

瞬时转染后SLAM表达的验证：

将转染后的细胞板在37℃、5％CO₂培养箱中培养培养48h后，荧光显微镜观察后，选择一板细胞每孔接种200μL处理的犬瘟热狐狸脏器毒LN(10)f1株(吸附1h后换2％FBS的DMEM细胞维持液)，接种后每天观察是否出现典型CDV感染的细胞病变情况。脏器病毒的处理过程如下：

取病变严重的肺组织放入研钵中，用小剪刀将组织绞碎，加少量石英砂和PBS在冰上迅速研磨；病料与PBS之比约为1∶5(g/mL)，放入-80℃冰箱冻融一次；4℃，3000r/min离心30min后，取上清用0.22μm的滤器过滤除菌；接毒前将细胞的培养液吸掉后，用PBS洗涤3次，每孔接毒200μL吸附1h后，加含2％FBS的DMEM的细胞维持液。

稳定表达SLAM细胞的克隆筛选：采用G418压力选择和细胞克隆环相结合的进行稳定转染细胞克隆筛选。将转染后细胞板在37℃、5％CO₂培养箱培养3天后换含800μg/mL G418的10％FBS的DMEM筛选培养基，每天观察细胞的生长状态，每3天换新的的筛选培养基，直至对照孔细胞99％以上都死掉，用0.25％的胰酶消化细胞，按1∶30的稀释度传100mm大板。用含800μg/mL G418的10％DMEM的筛选培养基培养，每3天换新的的培养基，连续培养10天左右，荧光显微镜下观察蛋白表达情况，用记号笔标出有绿色荧光且是细胞簇的位置，用克隆环消化该位置细胞转入100mm的大板，如此反复操作3～4次，即可得到较纯的稳定表达的细胞。在细胞的传代的过程中每间隔5代冻存细胞。

将转染48h的Vero细胞，换G418含量为800μg/mL的10％FBS的筛选培养基，每3天换一次筛选培养基，筛选培养10天左右，正常对照细胞全部死掉，按用胰酶消化细胞后按1∶40传至直径100mm的细胞培养皿，继续加筛选培养基筛选转染的Vero细胞。在显微镜下可见到有细胞簇形成(如图6所示)。荧光显微镜观察，用记号笔将有细胞簇形成且有大量EGFP表达的标记用克隆环消化后，在6孔板内筛选培养，连续培养3-4次即可得比较纯的克隆细胞系。将得到的细胞系标记好代次冻存，V-p和V-p-rSLAMh组连续筛选了10代后，EGFP依然稳定表达。

稳定表达细胞系SLAM蛋白表达的验证：将稳定转染的表达不同受体的细胞与正常细胞和空载体的细胞铺6孔板。用细胞免疫组化技术来验证稳定细胞系蛋白的表达。细胞培养3～4d后，PBS 37℃孵育30min；用2mL甲醇4℃，4h，固定；PBS冲洗3min×3次，甲醇冲洗3min×3次；室温干燥后，用1％Tween-20的PBS冲洗3min×3次；3％H₂O₂的去离子水孵育10～15min，以消除内源过氧化物酶的活性；用封闭液室温孵育10～15min，倾去勿洗；滴加1∶1200稀释的组氨酸一抗，37℃孵育2～3h或4℃过夜；PBS冲洗，3min×3次；滴加生物素标记山羊抗小鼠IgG室温或37℃孵育10～15min；PBS冲洗，3min×3次；滴加辣根酶标记的卵白素，室温或37℃孵育10～15min；PBS冲洗，3min×3次；DAB显色剂显色5～15min，PBS充分冲洗；苏木精复染；PBS冲洗干净，显微镜观察。

筛选5代转染组细胞和未转染Vero细胞铺6孔板，Vero细胞正常DMEM培养基，转染组用筛选培养基培养，在37℃、5％CO₂培养箱中3天，用细胞免疫组化试剂盒SP kit(Mouse)检测目的蛋白表达，结果在转染组细胞内都检测有棕黄色沉淀生成，证明有SLAM的表达，见图7(c)，而在Vero细胞组和空载体组，见图7(a)和图7(b)，没有棕黄色沉淀生成。

绘制细胞生长曲线：复苏冻存稳定筛选2代的表达犬瘟热病毒受体的细胞与正常的Vero细胞，传2代后，铺24孔板，每24h或12h细胞计数一次，根据计数结果绘制细胞生长曲线，见图8。在72～108h间各组细胞生长旺盛；过108h后Vero细胞开始减少。

实施例3

细胞系对CDV的敏感性比较：当Vero和V-p-rSLAMh细胞生长状态好的时候，用两种细胞铺六孔板(丹麦Nunc公司)中各3个孔，Vero细胞用10％FBS的DMEM细胞生长液，V-p-rSLAMh细胞生长液中还加入了800μg/mL的G418，在37℃、5％CO₂的培养箱中培养48h后，分别进行吸附接毒，V-p-rSLAMh细胞的维持液中还含有800μg/mL的G418，每12h观察细胞的病变情况。接种的3种野毒株分别是2010年河北狐狸脏器毒[HeB(10)f1]；2010年吉林九台貉脏器毒[JL(10)r1]；2010连宁锦州狐狸脏器毒[LN(10)f1)]。以上3份犬瘟热样品经RT-PCR检测均为犬瘟热病毒核酸阳性。对没有出现病变的细胞进行盲传，盲传6代仍未出现CPE的视为阴性。

两种细胞对3株野毒株的分离结果：

V-p-rSLAMh细胞：接毒第一代36～48h，3株野毒株都出现明显的细胞融合CPE。LN(10)f1在36h即出现明显的CPE，而其余2株都在48h出现明显的CPE，见图9(b)、图9(c)、图9(d)。

Vero细胞：3株野毒株在第一代中未出现可见CPE，此后细胞盲传6代仍未见CPE，视为病毒分离阴性。见图9(a)

分离病毒的RT-PCR验证及H基因序列分析：

由V-p-rSLAMh细胞分离到的3株CDV，冻融后分别提病毒RNA，反转录cDNA，RT-PCR验证，证实分离到的3株病毒都为CDV，如图10所示。

引物的设计与合成：根据Genbank上发表的CDV N和H基因序列分别在其保守区设计一对检测引物，扩增片度为430bp，上游引物(P1)：5’-ACCAGACAAAGTTGGCTAWGGAT-3’，下游引物(P2)：5’-ATGCTTGGTATTACCTCTACTAACTTG-3’；一对扩增引物，扩增长度为1879bp，上游引物(P3)：5’-TTAGGGCTCAGGTAGTCCA-3’，下游引物(P4)：5’-CTAAGKCCAATTGARATGTGT-3’，设计的引物由大连宝生物工程有限公司合成。

病毒RNA的提取、cDNA的合成和PCR扩增：用Trizol法按说明书对提取CDV病毒RNA，接着反转录合成cDNA，反转录***如下：

以cDNA为模板应用PCR扩增特异片段，PCR反应体系为：DNA模板1μL、上下游引物各1μL(20pmol/L)、Ex Taq DNA聚合酶0.3μL、10×PCR Buffer2.5μL，dNTP(各2.5mmol/L)2μL，用ddH2O补足25μL。PCR扩增程序：95℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火40s(2min)，72℃延伸40s(2min)，35个循环；最后72℃延伸10min。1％的琼脂糖鉴定PCR产物。将PCR扩增产物胶回收后，分别将其克隆入pMD18-T载体。酶切鉴定后每个片段挑取3个阳性克隆送大连宝生物公司测序，以确定一致序列。

CDV H序列分析：将测序正确的H基因，用DNAStar软件MegAlign/Clustal W与GenBank登录的其他CDV毒株基因序列进行比较分析并构建***进化树，并应用NetNGlyc 1.0Server软件来预测的H蛋白潜在N-连接糖基化位点。

V-p-rSLAMh细胞分离到的LN(10)f1、[JL(10)r1]和[HeB(10)f1]株CDV的H基因序列与其他毒株序列比对后表明3株病毒均为CDV，且都属于Asia-1基因型野毒株。H基因潜在的N-连接的糖基化位点个数，野毒株一般有8～9个，疫苗株有4个(Onderstepoort)或7个(CDV₃)，309～311位的N-连接糖基化位点是野毒株特有的糖基化位点，所扩增的3株CDV H基因含有包括309～311位在内共有9个糖基化位点，符合致病性野毒株(强毒株)的特征。其中LN(10)f1株H基因核苷酸序列与疫苗株Onderstepoort(AF305419)和CDV3的同源性仅为91.2％，而与Asia-1基因型的HBF-1野毒株(EU325721)的同源性为98.4％。证实所分离到的LN(10)f1株CDV为Asia-1基因型的野毒株。

CDV病毒含量的测定：选择生长状态良好的V-p-rSLAMh细胞，用0.25％胰酶消化后，用含10％的FBS的DMEM生长液(含有800μg/mL的G418)将细胞浓度为3×10⁵/mL。用排枪以每孔100μL加到96孔板中。将培养板置于5％CO₂培养箱中，37℃培养12-18h，使细胞长成单层。将待测病毒用含2％FBS的DMEM维持液10倍系列稀释，使病毒的液浓度分别为10^-1～10^-6。弃去培养板生长液，各孔细胞用PBS液洗涤2次，从病毒液从10^-2稀释度开始，每孔加入不同稀释度的病毒液100μL，每个稀释度8孔一个重复，剩两排一排做阳性对照，一排做未加病毒液正常对照，37℃吸附1h后，各孔再加入维持液(含有800μg/mL的G418)100μL，轻轻摇匀后，37℃、5％CO₂培养箱静止培养。逐日观察各孔细胞病变，连续观察5天，用Reed-Munch法计算TCID₅₀。

LN(10)f1株动物攻毒实验：将分离到的LN(10)f1株在V-p-rSLAMh细胞连续传4代，将细胞冻融2次用来狐狸(貉)攻毒，攻毒前测定病毒含量。选5只犬瘟热病毒中和抗体阴性(小于1∶4)的狐狸(貉)，3只实验组，2只作为对照组。采用皮下多点注射的方式，对实验组每狐狸(貉)的攻毒，攻毒剂量为4×10^2.39TCID₅₀/只，对照组皮下多点注射同样剂量的DMEM营养液。每日上午测定每只狐狸(貉)的体温，且观察记录每只狐狸(貉)的状态。

攻毒貉临床症状：

攻毒组从4天开始，体温开始升高到39.5℃以上，在5～9天体温达到最高(41℃以上)，随后2、3貉体温下降，2号貉11天开使体温又开始上升，如图11所示，攻毒貉在11～13天死亡。对照组貉试验全程体温正常(39.5℃以下)。

攻毒狐狸临床症状：

狐狸攻毒的病程较长，攻毒组从4天开始，体温开始升高到40℃以上，3号狐狸在第10天的***拭子CDV阳性；第12～13天，攻毒组都开始出现食欲下降，有结膜炎，拉血便、鼻干、足垫有严重增厚发炎；3只攻毒狐狸第18～22天死亡，对照组食欲和精神状态良好，体温正常(39.5℃以下)，如图12所示。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种真核表达重组质粒，其特征在于，具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列。

2.如权利要求1所述质粒的制备方法，其特征在于，包括：

步骤1：以pMD18-T-rSLAM质粒为模板，在上游引物、下游引物的存在下扩增获得所述融合基因，所述上游引物序列如SEQ No.2所示，所述下游引物序列如SEQ No.3所示；

步骤2：pIRES2-EGFP载体经酶切，获得Pcmv、IRES、EGFP和SV40pA；

步骤3：取所述融合基因酶切后，与步骤2中所述Pcmv、所述IRES、所述EGFP和所述SV40pA连接，转化受体菌，鉴定阳性克隆，获得所述质粒。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述酶切为Xho I和EcoR I双酶切。

4.一种Vero细胞系，其特征在于，Vero细胞中转染如权利要求1所述的真核表达重组质粒后，经克隆及筛选，获得细胞表面稳定表达有犬瘟热病毒受体貉SLAM的细胞系。

5.如权利要求4所述的Vero细胞系在犬瘟热强毒株的分离及其在犬瘟热病毒研究中的应用。