CN102304181A - 一种j亚群禽白血病病毒表面蛋白的单克隆抗体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子免疫学和病毒学交叉技术领域，具体涉及一种基于血管瘤型J亚群白血病例分离毒株的杂交瘤细胞，其保藏号为CGMCC No.5018，以及该杂交瘤细胞分泌的J亚群禽白血病病毒（ALV-J）表面蛋白（SU）的高特异性单克隆抗体及其制备方法，采用本发明所制备的高特异性单克隆抗体，为J亚群禽白血病的诊断防治提供技术支撑，有效地降低由J亚群白血病引起的经济损失。

Description

一种J亚群禽白血病病毒表面蛋白的单克隆抗体及其制备方法

技术领域

本发明涉及分子免疫学和病毒学交叉技术领域，具体涉及一种基于血管瘤型J亚群白血病例分离毒株的杂交瘤细胞，及由该杂交瘤细胞分泌的J亚群禽白血病病毒（ALV-J）表面蛋白（SU）的高特异性单克隆抗体及其制备方法。

背景技术

J亚群禽白血病是由J亚群禽白血病病毒（ALV-J）引起的一种肿瘤性疾病。临床感染主要表现为诱发多种肿瘤、免疫耐受、生产性能下降。自然病例中以禽淋巴细胞性白血病最为多见，对养禽业危害最大。

1、J亚群禽白血病在我国鸡群流行的新特点

近年来，J亚群禽白血病在我国鸡群中呈爆发趋势，其发生呈现新特点：如早期感染普遍、发病日龄明显提前；感染率及发病率居高不下；宿主范围扩展；致病性增强。肿瘤趋于多样化等。目前，以ALV-J为主的禽肿瘤性疾病在蛋鸡群中广泛流行，与马立克氏病、网状内皮增生症等肿瘤性疾病混合感染频发，这大大增加了疾病的诊断难度，给养禽业带来巨大的经济损失。

2、ALV-J SU蛋白的生物学功能

ALV为具有囊膜的反转录病毒，其基因组全长约7.6kb，可直接作为mRNA。ALV-J的前病毒基因组主要含有3个结构基因，分别编码病毒结构蛋白、RNA依赖的DNA聚合酶(反转录酶)和囊膜糖蛋白。从5’端至3’端其排列顺序依次为LTR- leader - gag/pol- env- leader- LTR，结构基因两侧为长末端序列(long terminal repeats，LTR)。

对大量囊膜病毒分析发现，病毒亚群特异性由囊膜糖蛋白决定，病毒的囊膜糖蛋白包括gp85基因编码的表面蛋白(surface protein，SU)和gp37基因编码的穿膜蛋白(trans membrane protein，TM)两个结构单位，两者由二硫键相连成二聚体。SU负责识别靶细胞膜上的特异性病毒受体，TM负责将病毒转入细胞， gp85（SU）刺激机体产生中和抗体，它决定了病毒的亚群特异性。与ALV其它亚群相比，ALV-J编码表面蛋白（SU）决定簇（gp85）的核酸序列只有40％的同源性。而作为囊膜糖蛋白主要成分的SU，在感染动物时，可诱导动物产生抗病毒型特异性抗体。

3、J亚群禽白血病的诊断方法研究现状

目前，对J亚群禽白血病病毒感染可通过临床剖检和组织病理学检查初步诊断，进一步确诊需要通过PCR、免疫组织化学、间接免疫荧光和ELISA等方法。PCR方法容易受到很多因素干扰，并可能出现假阳性和假阴性结果； ELISA单克隆抗体试剂盒为国外进口，由于不同来源的ALV－J gp85基因高度变动，进口检测试剂盒对国内毒株的检测结果不确实；免疫组织化学和间接免疫荧光方法也需要高特异性的单克隆抗体。

鉴于以上研究现状，基于我国分离毒株制备高特异性的ALV－J病毒单克隆抗体成为控制我国鸡群ALV－J感染的当务之急。

发明内容

为了克服上述现有J亚群禽白血病诊断技术存在的诸多不足与缺陷，本发明提供了一种基于血管瘤型J亚群白血病例分离毒株的杂交瘤细胞，及由该杂交瘤细胞分泌的J亚群禽白血病病毒（ALV-J）表面蛋白（SU）的高特异性单克隆抗体，克服了现有技术中根据ALV-J常规毒株制备的单克隆抗体的局限性，使之成本更低廉、更符合我国ALV-J流行病学现状。

本发明提供的基于血管瘤型J亚群白血病例分离毒株的杂交瘤细胞及其单克隆抗体的制备，是通过如下步骤实现的：   ALV-J gp85基因的克隆及测序； His-gp85蛋白的表达和纯化； His-gp85蛋白生物学功能及抗原性检测；免疫动物；细胞融合；阳性克隆与亚克隆的筛选；具体步骤如下：

根据ALV-J中国株WS0705前病毒基因组DNAgp85囊膜糖蛋白基因两端的一段序列作为引物。正向引物为5’-CTGGATCCATGGGAGTTCATCTATTGCAACACCCAG-3’如SEQ ID NO.2所示，含BamHⅠ酶切位点；反向引物为5’-TACTGCAGT TAG CGC CTG CTA CGG TGG TGA CC-3’如SEQ ID NO.3所示，含PstⅠ酶切位点。PCR扩增，DNA纯化试剂盒纯化PCR产物。利用pProEXHTB质粒获得pProEXHTB-gp85重组质粒，将该重组质粒按常规方法转化入CaCl₂ 法制备的感受态细胞BL21，酶切法鉴定阳性克隆，阳性克隆送往测序公司测序，所述  ALV-J gp85基因的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

上述ALV-J中国株WS0705的分离克隆及表达方法在2011年第2期的《病毒学报》上151-157页的《诱发血管瘤型J亚群禽白血病病毒gp85基因的克隆与表达》发表。

将上述含有重组质粒的BL21菌接种于含氨苄青霉素(Amp)的LB固体培养基培养，使用1mmol/L IPTG诱导表达出了带有HIS标签的融合蛋白His-gp85，得到以包涵体形式表达His-gp85蛋白。通过透析得到的上清即为纯化完成的His-gp85融合蛋白。使用SDS-PAGE法检测纯化后的蛋白，其分子量为46.3KD。得到的蛋白经过Bradford 法测定蛋白含量，稀释到0.5mg/ml分装-20℃保存备用。

将上述获得的纯化后的原核表达产物His-gp85融合蛋白免疫Balb/C小鼠，经瘤细胞SP2/0与被免疫小鼠的脾细胞融合，通过生物免疫学技术，筛选和克隆得到能分泌抗禽白血病病毒J亚群表面蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞，发明人将该杂交瘤细胞进行生物保藏，保藏号为CGMCC NO 5018，保藏于中国普通微生物保藏管理中心，保藏时间为2011年7月18日。

由上述杂交瘤细胞分泌的禽白血病病毒J亚群（ALV-J）表面蛋白（SU）的单克隆抗体（以下简称单抗1），可与ALV-J的表面蛋白受体特异性结合；

长势良好的该杂交瘤细胞在其培养液中常规培养2-3天，培养液由橘红色变为黄色，这就表明该培养液中含有该杂交瘤细胞株分泌出的单克隆抗体，即单抗1；经间接免疫荧光方法检测，该单抗1与接种ALV-J的DF-1细胞内ALV-J抗原特异性的结合，在荧光显微镜下观察，细胞膜与细胞浆呈现明亮的荧光信号，细胞内的细胞核区域无荧光；经酶联免疫吸附方法检测，酶标仪测OD值：单抗1与纯化后的原核表达产物His-gp85融合蛋白可发生特异性结合，其OD值与阴性对照的OD值得比值不小于2；通过转印免疫印迹方法检测单抗1，结果发现单抗1能与目的蛋白特异性的结合。基于上述的理由，本发明所获得的单克隆抗体为检测、预防J亚群禽白血病奠定了基础。

在筛选杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体时，为了获得抗ALV-J SU蛋白的单克隆抗体，可采用下述三种方法：

1. 将纯化后的原核表达产物His-gp85融合蛋白与该单抗1在体外结合，采用酶联免疫吸附方法筛选抗ALV-J His-gp85的单克隆抗体，筛选时发生特异性结合的OD值与阴性对照的OD值得比值不小于2；

2. 将纯化后的原核表达产物His-gp85融合蛋白与该单抗1在体外结合，采用转印免疫印迹方法确定与抗体发生结合反应的蛋白分子量，出现特异性反应的蛋白条带，筛选得到抗ALV-J His-gp85的单克隆抗体；

3. 将ALV-J WS0705病毒接种DF-1细胞，使该单抗1与病毒结合，采用间接免疫荧光筛选抗ALV-J His-gp85的单克隆抗体，筛选时与接种ALV-J的特异性结合的，在荧光显微镜下观察，细胞膜呈现明亮的荧光信号，细胞内的细胞核区域无荧光。

通过上述方法筛选出的单克隆抗体，具有如下的优点：

1 虽然国外特异性检测ALV-J表面蛋白GP85的单克隆抗体试剂盒已经商品化，但由于gp85基因极易发生抗原变异，世界各地ALV-J分离株gp85的分子变异规律也各不相同，因此，国外试剂盒针对中国J亚型禽白血病的检测不能保证其具有良好的效果，而且价格昂贵，很难大范围使用。近年来我国J亚群白血病蔓延迅速，全国各地均有报道发生，严重危害着养禽业的发展。本发明基于我国血管瘤病例中分离出的WS0705毒株研制出了高特异性的单克隆抗体（简称单抗1），可以克服上述根据ALV-J常规毒株制备的单克隆抗体的局限性，使之成本更低廉、更符合我国ALV-J流行病学现状。这对于快速诊断目前爆发的血管瘤型ALV-J病毒感染，并进一步减少或根除这一疾病具有重要意义。

2 本发明适用于大规模批量生产，经过进一步的研究会根据该单克隆抗体开发出针对ALV-J的治疗药物和疫苗，一旦得到有利推广，可针对禽白血病广泛性的开展研究、预防、治疗等工作。总之，本发明所提供的J亚群禽白血病病毒表面蛋白的单克隆抗体在今后的科技和生产中具有很大的开发潜力。

发明人对本发明所制备的杂交瘤进行了生物保藏，具体保藏信息如下：

保藏信息

保藏时间：2011年7月18日

保藏单位名称：中国普通微生物保藏管理中心   CGMCC 

保藏编号：CGMCC NO 5018

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院 中科院微生物研究所

分类命名: 杂交瘤细胞。

附图说明

图1为 PCR法扩增ALV-J gp85基因电泳图，  

图中M为 DL2000 marker，1为DF1细胞感染ALV-J，2为正常DF1细胞；

图2 为pProEXHTb-gp85重组质粒酶切鉴定电泳图，

图中1为使用BamHⅠ和PstⅠ酶切pFastHTb空质粒 ， 2为使用BamHⅠ和PstⅠ酶切pProEXHTb-gp85，M为1kb DNA Ladder；

图3为 pProEXHTb-gp85重组质粒表达融合蛋白的十二烷基熿酸钠-聚丙烯凝胶电泳（SDS-PAGE）图，

图中M为 Protein marker（KD），2为pProEXHTb-gp85/BL21破碎产物沉淀，可见明显的蛋白包涵体条带，3和4均为 pProEXHTb- gp85/BL21破碎产物上清; 5为pProEXHTb-gp85/BL21全菌体；

图4为 His-gp85蛋白纯化后的十二烷基熿酸钠-聚丙烯凝胶电泳（SDS-PAGE）图，

图中M为Protein marker (KD); 1为His-gp85蛋白纯化产物；

图5 为间接免疫荧光检测法检测单克隆抗体(200倍)结果图，

图中 A为阳性对照; B为 阳性对照; C和D均为单抗1；

图6为单抗1与gp85蛋白特异性结合的蛋白免疫层析杂交图，

图中M为Protein Marker (KD);  1和 2为单抗1。

具体实施方式：

（1）主要试剂

      PEG-1500, HT, HAT为Sigma公司产品；

      弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂购自北京美科美生物有限公司；

      DMEM高糖培养基为Invitrogen公司产品；

      胎牛血清为Hyclone公司产品；

      HRP酶标二抗，FITC标记荧光二抗为博奥森生物有限公司产品；

      TMB单组份底物显色溶液，DAB显色试剂盒为天根公司产品；

      Taq聚合酶，限制性内切酶Ecol I、Xhol I、BamH I、Pst I 、T4 连接酶、dNTP、DNA Marker为大连宝生物有限公司产品；

      PCR产物纯化试剂盒、质粒抽提试剂盒为OMEGA公司产品；

      蛋白预染Marker为北京全式金生物技术有限公司产品；

      胰蛋白胨（Tryptone）及酵母抽提物（Yeast Extract）为Oxiod公司产品；

      蛇皮透析袋（SnakeSkin Pleated）为Thermo公司产品；

      其余试剂为国产分析纯试剂。        

（2）主要仪器    

      细胞培养箱为Healforce公司产品；

      PCR仪、分光光度计为Eppendorf公司产品；

      低温高速离心机为湖北湘仪公司产品；

      荧光倒置显微镜为Nikon公司产品；

      凝胶成像***为北京君意公司产品；

      酶标仪为Thermo公司产品；

      恒温摇床为上海申能***公司产品；

      恒温培养箱、超净工作台为上海博迅公司产品；

      电泳仪、SDS-PAGE电泳槽、Western-blot膜转印装置为北京六一公司产品；

      细胞超声波粉碎机为宁波新芝生物有限公司产品。 

实施例1

ALV-J gp85基因的克隆及测序

根据ALV-J中国株WS0705前病毒基因组DNAgp85囊膜糖蛋白基因两端的序列作为引物。正向引物为5’-CTGGATCCATGGGAGTTCATCTATTGCAACACCCAG-3’如SEQ ID NO.2所示，含BamHⅠ酶切位点；反向引物为5’-TACTGCAGT TAG CGC CTG CTA CGG TGG TGA CC-3’如SEQ ID NO.3所示，含PstⅠ酶切位点。PCR反应条件为：95℃ 4min，充分变性后进入循环体系：95℃ 30 s，59℃ 1 min，72℃ 2 min，共30个循环；然后72℃延伸10 min。使用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物长度为924个碱基对如图1所示，其基因序列如SEQ ID NO.1所示，使用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物。

将pProEXHTb载体与PCR纯化产物分别用限制性内切酶BamH I、Pst I双酶切6h， 按照胶回收试剂盒说明分别回收大片段，于16℃下连接过夜。连接体系为：pProEXHTb载体 1μL，双蒸水3μL，纯化的DNA目的片段4μL，T4连接酶1μL ，10×buffer 1μL，总体积为10μL。

转化产物按常规方法转化入CaCl₂ 法制备的感受态细胞BL21，酶切法鉴定阳性克隆，结果如图2所示，阳性克隆送往测序公司测序。

所采用的BamH I、Pst I均为现有技术。

实施例2

 His-gp85蛋白的表达和纯化

将含有重组质粒的BL21菌接种于含氨苄青霉素(Amp)的LB固体培养基，37℃培养过挑取单菌落接种于含Amp(终浓度为50μg/ml)的LB液体培养基中，37℃振荡(200rpm)，培养至0D600=0.6，加入IPTG至终浓度为 1mmol/L，37℃继续培养3h，同时设未诱导的重组质粒转化BL21菌作为对照。

经SDS-PAGE分析显示，目的蛋白His-gp85以包涵体形式表达，检测步骤如下：

收集培养的工程菌菌液，5000rpm，离心5min，弃上清；称取30g收集到的湿菌于500ml烧杯中，加入300ml的重悬液，加入转子在磁力搅拌器上搅拌20min，使菌体分散均匀；将上述烧杯置于冰浴，用超声破菌仪超声破菌，120W，工作4s,间歇4s，超声1h左右，用枪头吹吸菌液，待菌体不再黏着时，第一次超声破菌结束；将超声破菌液转入500ml离心管中，配平，放入高速冷却离心机中，12000rpm，4℃，离心20min；取沉淀，加入200ml的重悬液，用上述方法进行第二次超声，然后离心，大约超声2～4次后，去沉淀，处理后用SDS-PAGE电泳检测，结果如图3所示；

His-gp85蛋白的纯化步骤如下：

将上述沉淀用9倍体积的洗涤液I 重悬沉淀，静置5min后，12000rpm，15mi弃上清。用9倍体积的洗涤液II重悬沉淀，静置5min后，12000rpm，15min，弃上清，保留粘稠上清。用9倍体积的洗涤液III重悬沉淀，静置5min后，12000rpm，15min，弃上清，保留粘稠上清。按100ml菌液加4ml溶解液，剧烈震荡1h。12000rpm，离心15min。取上清，即为溶解的包涵体。

包涵体纯化所述试剂配制方法：

（1）细菌重悬液(250ml):PBS(NaCl 2g, KCl 0.05g, Na₂HP0₄ 0.36g KH₂PO4 0.06g),1 mm/L EDTA.

（3）洗涤液I（250ml）：500mmol/L Tris-Cl（PH=8.0），100mmol/L NaCl， 100mmol/L EDTA

（3）洗涤液II（250ml）：洗涤液I，2M尿素

（4）洗涤液III（250ml）：洗涤液I，4M尿素

（5）包涵体溶解液（250ml）：洗涤液I，8M尿素

将上述溶解的包涵体装入透析袋中，依次使用20mmol/L Tris-Cl（PH=8.0）， 4M尿素透析2h，20mmol/L Tris-Cl（PH=8.0）， 2M尿素透析2h， 20mmol/L Tris-Cl（PH=8.0）， 4M尿素透析1h， 20mmol/L Tris-Cl（PH=8.0）， 0.5M尿素透析2h, 20mmol/L Tris-Cl（PH=8.0）， 透析6h，12000rpm离心2min 弃掉沉淀，得到的上清即为纯化完成的His-gp85融合蛋白。使用SDS-PAGE法检测纯化后的蛋白，检测结果如图4所示，得到的蛋白经过Bradford 法测定蛋白含量，稀释到0.5mg/ml分装-20℃保存备用。

其中所采用的SDS-PAGE操作步骤如下：

1）将玻璃板洗干净，用夹子固定，垂直放置，配置12%分离胶，快速注入到两玻璃板之间，胶上部加 1mL蒸馏水封口，保持胶平整。待分离胶凝固后（约40min），倒去分离胶表面的液体，用滤纸吸去残留水。注入浓缩胶，快速***梳子，并注意防止气泡的产生。等待其凝固。

2）取纯化后的His-gp85蛋白100μl等量2 x SDS上样buffer，煮沸5-10min。

3）往电泳槽加入1×Tris-甘氨酸缓冲液，待浓缩胶凝固后（约30min），小心拔掉梳子，用缓冲液冲洗加样孔，用微量进样器上样，10μl/孔，正确连接电泳槽正负极，打开电源。先用80V电压电泳，待样品浓缩成一条线并进入分离胶后，提高电压至150V，电泳至溴酚蓝到达胶的底部时停止电泳。

4）染色：取下凝胶，用蒸馏水冲洗，放入考染溶液中，染色4h以上。

5)脱色：将凝胶放入脱色液中，置于摇床上脱色，期间更换3次以上脱色液，待凝胶蓝色背景全部脱去停止，将凝胶放入蒸馏水中终止脱色。拍照保存。

使用上述纯化得到的His-gp85融合蛋白包被ELISA板，使用酶联免疫吸附试验检测该蛋白的生物学活性。以IDEXX公司生产的ALV-J抗体检测试剂盒检测为阳性的鸡血清为阳性对照，健康SPF鸡血清为阴性对照，HRP标记羊抗鼠IgG酶标二抗按说明书使用。结果显示阳性对照与阴性对照的OD值比值大于2，说明该蛋白有良好的生物学活性和抗原性。

其中ELISA具体步骤如下：

1） 包被：取纯化的重组蛋白His-gp85，以碳酸盐缓冲液（每200ml碳酸盐缓冲液含Na₂CO₃ 0.32g，NaHCO₃ 0.58g）稀释至最佳浓度，包被反应板，100μl/孔，4℃过夜。

2） 洗涤：甩去酶标板中的包被液，用PBST（PBS，0.05%Tween-20）加满各孔，室温静置3min，弃去PBST，洗涤3次，3min/次，拍干。

3) 封闭：各孔加入稀释液（5% 脱脂乳），350μl/孔，置37℃培养箱孵育2h，洗涤3次，3min/次，拍干。

4) 加样：将待待检血清按梯度稀释后加入包被板，100μl/孔，同时设立阴阳性血清对照。置37℃培养箱孵育1h，洗涤3次，3min/次，拍干。

5) 用封闭液将HRP羊抗鼠IgG酶标二抗按1:3000稀释，100μl/孔，置37℃培养箱孵育1h，洗涤3次，3min/次，拍干。

6) 显色：使用TMB单组份显色试剂盒（TIANGEN公司产品）按100 μl/孔加入包被板，室温下避光显色20min加终止液，2M H₂SO₄终止显色。

7) 用酶联免疫检测仪测其在波长450nm检测各个孔的OD值，阴性对照OD₄₅₀值为N，阳性对照OD₄₅₀值为P。若P/N>2.0判为阳性。

 

实施例3

动物免疫

以上述提纯的His-gp85融合蛋白免疫6周龄Balb/C雌性小鼠，每次每只的免疫剂量为40ug，免疫方法为腹腔注射，共免疫四次。

第一次免疫使用上述蛋白为抗原与等量弗氏完全佐剂乳化，两周后进行二次免疫，免疫时将灭活抗原与等量弗氏不完全佐剂乳化，两周后进行三次免疫，免疫方法及剂量同二次免疫。三次免疫一周后,小鼠眼眶采血测其效价,监测血清抗体效价。 三免两周后,选择效价最高的小鼠，用不加佐剂的抗原腹腔注射加强免疫一次，3d后取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合。

实施例4

 细胞融合

融合前1～2d按照常规方法制备腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，将其密度调整为2-5×10⁵/ml，按照100ul/孔铺入96孔板。将培养板放入37℃5%CO2培养箱中培养，备用。

融合用免疫小鼠眼球采血，制备血清备用。按照常规方法去得小鼠脾脏，取出脂肪组织后，用无抗无血清DMEM反复冲洗脾脏。使用10ml注射器内芯在200目细胞筛上轻轻研磨，用DMEM冲洗，使细胞充分分散，将细胞悬液转移至离心管中，800rpm离心10min，用适量的DMEM悬浮细胞，活细胞计数后备用。

用无抗无血清DMEM培养基将处于对数生长期的SP2/0吹下，加入融合管内;将免疫小鼠摘眼球处死，收集脾细胞悬液，加入融合管内；1000rpm离心10min后弃上清，将融合管置手掌上来回轻轻震动以使沉淀松散。45s内加入1 mL预热的浓度为50%的PEG1500，再于90s内先慢后快加入无抗无血清DMEM培养基30mL，37℃温育15min后800rpm离心10min，用60mLHAT培养基悬浮，滴加于提前铺入饲养细胞的96孔细胞培养板，置37℃，5-6%CO2的细胞培养箱中培养。5d后每个细胞培养孔补加原孔一半体积的新鲜配置的HAT培养基，然后每天观察SP2/0细胞和脾细胞对照孔，当SP2/0细胞和脾细胞全部死亡时，用新鲜配制的HT培养基全部置换出HAT培养基。逐日观察，待融合的杂交瘤细胞生长至孔底十分之一，且上清变黄时进行检测。

实施例5

阳性克隆的筛选与亚克隆

克隆的筛选主要采用如下3种方法：

（1）酶联免疫吸附试验（ELISA）

使用纯化得到的His-gp85包被ELISA板，25ng/孔，以免疫小鼠血清为阳性对照，未免疫昆明小鼠血清为阴性对照。HRP标记羊抗鼠IgG酶标二抗按说明书使用。具体方法如下：

1） 包被：取纯化的重组蛋白His-gp85，以碳酸盐缓冲液（每200ml碳酸盐缓冲液含Na₂CO₃ 0.32g，NaHCO₃ 0.58g）稀释至最佳浓度，包被反应板，100μl/孔，4℃过夜。

2） 洗涤：甩去酶标板中的包被液，用PBST（PBS，0.05%Tween-20）加满各孔，室温静置3min，弃去PBST，洗涤3次，3min/次，拍干。

3) 封闭：各孔加入稀释液（5% 脱脂乳），350μl/孔，置37℃培养箱孵育2h，洗涤3次，3min/次，拍干。

4) 加样：将待待检血清按梯度稀释后加入包被板，100μl/孔，同时设立阴阳性血清对照。置37℃培养箱孵育1h，洗涤3次，3min/次，拍干。

5) 用封闭液将HRP羊抗鼠IgG酶标二抗按1:3000稀释，100μl/孔，置37℃培养箱孵育1h，洗涤3次，3min/次，拍干。

6) 显色：使用TMB单组份显色试剂盒（TIANGEN公司产品）按100 μl/孔加入包被板，室温下避光显色20min加终止液，2M H₂SO₄终止显色。

7) 用酶联免疫检测仪测其在波长450nm检测各个孔的OD值，阴性对照OD₄₅₀值为N，阳性对照OD₄₅₀值为P。若P/N>2.0判为阳性。

（2）间接免疫荧光检测法（IFA）

使用9日龄SPF鸡胚按常规方法制备DF-1细胞，铺入96孔细胞培养板，使用含10%胎牛血清的DMEM培养待细胞长成单层时接种ALV-J WS0705毒株，37℃作用2h后，更换含1%胎牛血清的DMEM，维持7天后做IFA检测，步骤如下：

倒出细胞培养液，用PBS洗3次 每次3min；丙酮：乙醇（3:2）固定细胞7-8 min，用PBS洗3次，每次5min；以细胞培养上清为一抗按100μL/孔加入，37℃温箱抚育60 min，用PBS洗3次，每次5min；以FITC标记羊抗鼠IgG为二抗，37℃温箱60 min，用PBS洗3次，每次5min；每孔加入100μl 50%甘油；倒置荧光显微镜下观察，拍照，其结果如图5所示。

（3）Western-blot检测法

1）取1mL诱导表达的菌液，12000r/min，离心2min，弃上清，加100μl灭菌双蒸水，悬浮沉淀，加100μl 2x上样缓冲液，煮沸5-10min。取20μl/孔加样，进行SDS-PAGE电泳。

2）剪一张与凝胶大小相同的NC膜，用去离子水浸透，同时将与凝胶大小相同的两张滤纸及纤维垫用转印缓冲液浸透。

3）按三明治法安装转印装置，即负极夹-纤维垫-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸-纤维垫-正极夹，使NC膜位于转印的正极面，凝胶位于负极面，其间无任何气泡间隙。将转印装置放入转移电泳仪中，加入转移缓冲液，140mA电泳2h。

4）转印结束后，将转移后的NC膜用去离子水漂洗一遍，将NC膜浸泡于封闭液中，4℃封闭过夜。

5）用PBST洗涤NC膜三遍，每次10 min。

7）使用免疫小鼠阳性血清为一抗，NC膜与一抗37℃反应1h，用PBST洗膜三次，10 min/次。

8）NC膜置于过HRP标记的羊抗鼠IgG中，37℃反应1h，用PBST洗膜三次，10 min/次。

9）使用DAB显色试剂盒避光显色；此时应密切观察显色过程，并在较浅本底且达到适当显色强度时流水终止显色。拍照保存，其结果如图6所示。

Claims (7)

1.一种J亚群禽白血病病毒表面蛋白的单克隆抗体，其特征在于：是由保藏号为CGMCC NO 5018的杂交瘤产生的。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于：该方法是纯化后的原核表达产物His-gp85融合蛋白免疫Balb/C小鼠，经瘤细胞SP2/0与被免疫小鼠的脾细胞融合，筛选和克隆得到禽白血病病毒J亚群表面蛋白的单克隆抗体，简称单抗1。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的筛选方法为：

将纯化后的原核表达产物His-gp85融合蛋白与单抗1在体外结合，采用酶联免疫吸附方法筛选ALV-J His-gp85的单克隆抗体。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的筛选方法为：

将纯化后的原核表达产物His-gp85融合蛋白与单抗1在体外结合，采用转印免疫印迹方法确定与抗体发生结合反应的蛋白分子量，进一步筛选抗ALV-J His-gp85的单克隆抗体。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的筛选方法为：

将ALV-J 中国株WS0705病毒接种DF-1细胞，使单抗1与病毒结合，采用间接免疫荧光筛选抗ALV-J His-gp85的单克隆抗体。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的纯化后的原核表达产物His-gp85融合蛋白是通过如下方法获得的：将ALV-J 中国株WS0705毒株的gp85基因克隆入表达载体pProEXHTB质粒，得到了重组载体pProEXHTB-gp85重组质粒，使用1mmol/L IPTG诱导表达出了带有HIS标签的融合蛋白His-gp85，其分子量为46.3KD，之后采用SDS-PAGE法检测纯化。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的gp85基因其基因序列如SEQ ID NO.1所示。

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