CN102300982A - 用于提高5’-鸟苷一磷酸生产力的棒状菌菌株和用其生产5’-鸟苷一磷酸的方法 - Google Patents
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Abstract
公开利用新的微生物生产5′-鸟苷一磷酸的方法,该微生物具有较野生型更高的苹果酸脱氢酶活性,因此显示提高的ATP生产力。还公开新的微生物。该方法包括:培养苹果酸脱氢酶活性较内源性活性提高的棒状菌(Corynebacteria)菌株;因此以高产率产生ATP;在培养物中产生XMP;向培养物中加入具有XMP胺化活性的酶或微生物;和从培养物获得GMP。
Description
【技术领域】
本发明涉及棒状菌(Corynebacteria)菌株,其具有较内源性苹果酸脱氢酶更高的活性,因此能以高产率产生ATP。本发明还与使用该棒状菌菌株结合具有胺化活性的酶或微生物生产5’-鸟苷一磷酸的方法有关。
【背景技术】
5’-鸟苷一磷酸(在下文中被称作“GMP”)是广泛使用的作为增味剂的食品添加剂,如同肌苷一磷酸(在下文中被称作“IMP”)。GMP引出鲜味(umami taste),其用途取决于也正被使用的谷氨酸一钠(MSG)。它通常与IMP协同使用以增加MSG鲜味的强度。
迄今已知的制备GMP的方法的实例包括(1)酵母RNA的酶促降解,(2)直接微生物发酵成GMP,(3)微生物发酵成鸟苷,然后化学磷酸化,(4)微生物发酵成鸟苷,然后酶促磷酸化,(5)微生物发酵成黄苷5’-一磷酸(在下文中被称作“XMP”),然后通过棒状菌菌株转化成GMP,和(6)微生物发酵成XMP,然后通过具有氨基酶活性的大肠杆菌(Escherichia coli)将XMP转化成GMP。其中,方法(1)具有材料供应的困难和在经济上不是有益的,方法(2)由于GMP的膜通透性而遭受低产率的缺点。因此,其它方法在工业应用中广泛使用。
对于生产XMP并将其转化成GMP的方法(6),关键是提供ATP作为辅因子。XMP到GMP的转化中使用的大多数ATP由XMP的生产菌株提供。在该转化方法中,二甲苯起到重要的作用,因为其增加ATP和XMP的膜通透性。培养基中的二甲苯允许ATP和XMP穿透进入GMP的生产菌株,然后将XMP转化成GMP。因此,GMP的生产方法采取增加ATP生产力的策略。
从XMP到GMP的转化通过以下反应式表示:
即,充当辅因子的ATP的连续供应对GMP的生产过程是必需的,在该过程中XMP 主要由XMP的生产菌株产生,然后在具有XMP氨基酶活性的酶或微生物存在的情况下转化成GMP。因此,提高XMP的生产菌株的ATP生产力非常重要。在该转化过程中产生的AMP被重新用作ATP生产的底物。实际上,基于腺嘌呤的核苷酸被循环用于ATP的产生。
因此,提高XMP生产菌株的ATP生产力对高产率的GMP生产是必需的。苹果酸脱氢酶的活性对ATP的产生具有重大影响。然而,前述文件中任何地方都没有提及经设计提高苹果酸脱氢酶活性以增加XMP产率的微生物和方法。
考虑到,增加XMP生产菌株的ATP生产力以增加GMP产率并且优于两步转化至关重要,本发明人进行了集中研究并发现了引起该增加的基因。并且发现当与XMP氨基酶结合使用时,用串联携带该基因的两个拷贝的重组载体转化的棒状菌菌株能以高产率生产XMP和ATP,从而增加GMP的生产力。
【发明内容】
【技术问题】
因此本发明的目的是提供具有较内源性苹果酸脱氢酶更高活性的棒状菌菌株,其因此能以高产率生产ATP。
本发明的另一个目的是提供生产GMP的方法,包括:培养转化的微生物;在培养物中产生XMP;向培养物中加入具有XMP胺化活性的酶或微生物;和从培养物获得GMP。
【技术方案】
根据其方面,本发明涉及较内源性苹果酸脱氢酶活性增强的棒状菌菌株,从而以高产率生产ATP。将本发明的棒状菌菌株进行修饰,以具有较内源活性更高的苹果酸脱氢酶活性,造成ATP的生产力增加。
如本文所用,术语“苹果酸脱氢酶”,指通过脱氢作用催化苹果酸盐转化成草酰乙酸盐的酶。该酶伴随乳酸脱氢酶在非常广谱的活体生物中被发现,并且需要DPN和NAD作为其活性的辅因子,这些辅因子通常伴随乳酸脱氢酶。在根据本发明的棒状菌菌株中,增加苹果酸脱氢酶活性,从而以较高产率产生ATP,造成GMP的生产力增加。
如本文所用,术语“内源活性”意欲指野生型微生物中的目标酶活性。术语“高于内源活性”指与内源品种的活性相比酶活性增加,不论起因于由酶自身引起的活性增加还是内源基因或外源基因引起的活性增加。例如,酶活性增加可通过本领域公知 的任何方法实现,包括但不限于,增加或减少基因拷贝数、替换、修饰目标启动子或使目标启动子突变等。
根据本发明所述的其活性将被增加的目标酶苹果酸脱氢酶由棒状菌的mqo基因编码。只要它与mqo基因在生物学上相同或相应,任何衍生物或类似物均可用于本发明。即,如果其活性与mqo基因的活性基本上相同或相似,落入mqo基因范围内的任何基因均可用于本发明。有利地,在本发明中有用的基因与mqo基因序列共有至少70%,更优选至少80%,甚至更优选至少90%,甚至远更优选至少95%和最优选至少98%同源性。更有利地,苹果酸脱氢酶由核苷酸序列SEQ ID NO.:7编码。基因拷贝的增加可通过外源基因的导入和/或内源基因的扩增而实现。基因拷贝数目可容易地被本领域的技术人员根据需要和目的确定。内源基因的扩增也可利用本领域已知的方法进行,例如,通过在压力下在合适的选择性培养基中培养。在优选的实施例中,将携带为苹果酸脱氢酶编码的基因的载体导入棒状菌菌株,以产生较内源活性增强的转化的微生物。
只要其在本领域已知并且属于棒状菌属,任何菌株可毫无限制地在本发明中使用。优选地,本发明中有用的棒状菌菌株的实例包括产氨棒杆菌、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)和乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum),但不限于此。具体地,这些棒状菌菌株之中是产氨棒杆菌ATCC6872、热产氨棒状杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)FERM BP-1539、谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒状杆菌R、黄色短杆菌ATCC 14067、乳酸发酵短杆菌ATCC 13869及其衍生物。优选的是从产氨棒杆菌KCCM-10530转化的产氨棒杆菌KCJ-1304。
携带mqo基因的重组载体可用于产生能以高产率生产ATP的微生物。
如本文所用,术语“mqo基因”、简称“苹果酸盐:醌氧化还原酶”基因,指为用作将苹果酸盐氧化成草酰乙酸盐的苹果酸盐草酰乙酸盐编码的基因。
只要携带mqo基因,任何常见的重组载体均能没有限制地在本发明中被使用。优选的是pDZ-mqo。在本发明的优选实施例中,利用含有SEQ ID NO.7的mqo基因以构建重组的pDZ-mqo载体(参见图1)。
术语“载体”,如本文所用,指用作载体以将外源遗传物质转移到合适宿主细胞中的DNA分子,是含有使转基因与宿主基因组重组的调节元件的DNA构建物。优选地,携带根据本发明的mqo载体的重组载体可具有图1的切割图显示的结构。图1的切割图表示的载体可被依次或同时导入棒状菌。根据本发明的优选实施方式,将重组载体转化到产氨棒杆菌KCCM-10530中,然后将该菌在选择性培养基中培养,以使mqo基因的两个拷贝通过同源重组参入到宿主的基因组,导致产氨棒杆菌突变体产生,称 为产氨棒杆菌KCJ-1304。其以登录号KCCM10972P保藏(韩国微生物保藏中心(韩国,首尔),保藏日期2008年12月3日)。
根据其另一个方面,本发明涉及用携带mqo基因的重组载体转化的棒状菌菌株。利用本领域已知的转化方法可没有限制地使用来自棒状菌的mqo基因。优选地,将mqo基因克隆到载体中,以用于转化到细胞中。
如果在本领域已知,任何方法可用于转化。如本文所用,术语“转化”是由外源DNA的摄取、基因组参入和表达引起的细胞的遗传改造。典型的转化方法包括CaCl2沉淀、Hanahan法——其中与DMSO(二甲基亚砜)结合,CaCl2沉淀的作用得到提高、电穿孔、磷酸钙转染、原生质体融合、碳化硅纤维介导的转化、土壤杆菌(agrobacterium)介导的转化、PEG介导的转化、葡聚糖硫酸酯、阳离子脂质体(lipofectamine)和干燥/抑制介导的转化(desiccation/inhibition-mediated transformation)。根据本发明以pDZ-mqo进行的转化不限于这些转化的实例,而可没有限制地利用本领域已知的任何方法完成。
产氨棒杆菌KCCM10972P的基因组其中有mqo基因的两个拷贝参入,该基因组是由具有图1的切割图显示的结构的pDZ-mqo向其中的导入和mqo基因的两个拷贝与内源基因的同源重组而产生的。
根据其另外的方面,本发明涉及生产GMP的方法,包括:(a)培养苹果酸脱氢酶活性比内源活性提高的棒状菌菌株,从而以高产率生产ATP;(b)在培养物中产生XMP;(c)向培养物中加入具有XMP胺化活性的酶或微生物;和(d)从培养物获得GMP。在本发明中,XMP以较高的产率从转化的微生物生成,然后在具有XMP胺化活性的XMP氨基酶或微生物存在的情况下转化成GMP。优选地,转化的微生物是苹果酸脱氢酶活性比内源活性提高的棒状菌菌株。
本领域已知的任何培养基可没有限制地用于培养能产生XMP或GMP的菌株。优选地,培养基含有葡萄糖作为碳源和任选地各种其它碳源。对于在培养目标微生物中的使用,培养基必须满足微生物生长的需求。棒状菌菌株的培养基在本领域已知(例如Manual of Methods for General Bacteriology.American Society for Bacteriology.Washington D.C.,USA,1981)。对棒状菌菌株有用的碳源实例包括糖和碳水化合物诸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉、纤维素等;油和脂类诸如大豆油、葵花子油、蓖麻油、椰子油等;脂肪酸诸如棕榈酸、硬脂酸、亚麻酸等;醇类诸如甘油、乙醇等;和有机酸诸如乙酸。这些碳源可单独或组合使用。有机物诸如胨、酵母提取物、牛肉膏、麦芽汁、玉米浆、大豆等;尿素;和无机化合物诸如氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵可单独或组合用作培养基中的氮源。磷酸二氢钾或磷酸氢二钾、或相应的钠盐可用作磷源。此外,培养基可含有金属盐诸如硫酸镁、硫酸亚铁(iron sulfate) 等。另外,可需要氨基酸和/或维生素作为必需成分。培养基还可含有合适的前体。可以分批方式或连续方式将这些物质加入到培养基中。
可通过碱性化合物诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氨等,或酸性化合物诸如磷酸或硫酸调节培养基的pH。消泡剂诸如脂肪酸聚乙二醇酯可用于防止培养期间泡沫的产生。可用氧气或含有氧气的气体(例如空气)对培养基充气以保持有氧状态,或用氮气、氢气或二氧化碳气体对培养基充气以保持无氧状态。培养温度通常保持在20℃~45℃,优选地在30℃~35℃。持续培养直到获得XMP或GMP的最大量。从这一点上,需要10至160小时的时间段。
在本发明中有用的具有XMP胺化活性的微生物可以是大肠杆菌。可利用本领域公知的任何方法培养具有XMP胺化活性的大肠杆菌。大肠杆菌的培养基可含有多种营养素,包括无机氮源诸如铵、氯化铵、硫酸铵等,有机氮源诸如胨、NZ胺、牛肉膏、酵母提取物、麦芽汁、玉米浆、酪蛋白水解物、鱼肉或鱼粉、脱脂大豆饼或大豆粉,和无机化合物诸如磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰和碳酸钙。需要时,可使用维生素和营养缺陷型碱。对于培养,可利用通气的摇动培养或搅拌培养。培养温度的范围为30℃至45℃,优选地为37℃至40℃。培养期间,优选将pH调到相当中性的水平。培养期是1到2天。由此,具有XMP胺化活性的微生物积聚在培养基中。
在本发明中,将含有XMP的培养基加入大肠杆菌的培养物中,该大肠杆菌具有将XMP转化成GMP的XMP胺化活性。在这一点上,XMP到GMP的转化可用增加XMP膜通透性的化合物诸如二甲苯实现。二甲苯促进XMP从培养基进入GMP的生产菌株。对增加XMP的膜通透性有用的化合物在本领域公知。这样的化合物的实例包括疏水性物质(例如二甲苯、甲苯、苯、醋酸乙酯)、表面活性剂(阳离子表面活性剂,例如聚氧乙烯硬脂胺、十六烷基三甲基溴化铵、Cation FB和Cation F2-40E;阴离子表面活性剂,例如油烯酰胺硫酸钠(sodium oleyl amide sulfate)、Newrex TAB和Rapizole 80)、和金属离子(例如钙离子、镁离子),但不限于此。用于增加XMP的膜通透性的化合物量取决于其特性而发生变化,可由本领域的普通技术人员适当调节。
由此产生的GMP可被分泌到培养基中或保持在细胞内。根据本发明的生产GMP的方法包括从细胞或培养基中回收GMP。对于从细胞或培养基中回收GMP,可利用本领域公知的任何方法。这样的方法的实例包括过滤、阳离子交换层析、结晶和HPLC,但不限于此。
如本文所用,术语“鸟苷一磷酸”是在RNA中发现的由鸟苷和磷酸盐组成的核苷酸。磷酸盐部分可位于5’、3’或2’,分别称为5’-、3’-或2’-型。在本发明中, GMP(5′-鸟苷一磷酸)以无色针状晶体产生,并以游离形式存在于体内。其具有分子式C10H14N5O8P。鸟苷一磷酸其盐形式,诸如鸟苷酸二钠、鸟苷酸二钾和鸟苷酸钙(calcium guanylate)是食品添加剂,其被用作基于核酸的增味剂以提供蘑菇的味道。当使用根据本发明转化的微生物时,能以高产率生产GMP,该产率被发现与常规的微生物相比提高了约8.5%。
【发明的有益效果】
用根据本发明的重组载体转化,棒状菌菌株显示提高的苹果酸脱氢酶活性,因此以增加的产率产生ATP。当用于从XMP向GMP的转化时,本发明的转化菌株的GMP生产力较常规的微生物更高。
【附图简述】
图1是显示重组载体pDZ-mqo的结构的示意图,其中mqo基因的两个拷贝被***到pDZ载体中。
【发明的方式】
通过以下实施例可获得对本发明的更好的理解,这些实施例被提出以进行举例说明,但不是被解释为限制本发明。
实施例1:来自XMP的生产菌株产氨棒杆菌KCCM-10530的mqo的克隆和用于基因组参入的重组载体(pDZ-mqo)的构建
mqo基因(NCBI ID_3345228)的核苷酸序列从来自NIH GenBank的数据获得。基于该序列,合成两对引物(SEQ ID NOS.1至4)。
当棒状菌KCCM-10530的基因组充当模板时,在高保真性DNA聚合酶PfuUltraTM(Stratagene)存在的情况下使用SEQ ID NOS.1至4的引物进行PCR,在95℃变性30sec、在55℃退火30sec和在68℃延伸2min,进行25个循环。由此获得的PCR产物是mqo基因的两个拷贝,每个2.1kb长(mqo-A、mqo-B),它们分别使用SEQ ID NOS:1和2以及SEQ ID NOS:3和4两组得到扩增。
SEQ ID NO:1;gctctagaATCGGTCATTCCATGAACCC
SEQ ID NO:2;cgcggatccCATCGATATCGCCAACTCCA
SEQ ID NO:3;cgcggatccATCGGTCATTCCATGAACCC
SEQ ID NO:4;gctctagaCATCGATATCGCCAACTCCA
用合适的限制酶(mqo-A:XbaI+BamHI,mqo-B:BamHI+XbaI)处理之后,通过 三重连接(three-piece junction)将PCR产物mqo-A和mqo-B***先前已被XbaI和虾碱性磷酸酶处理的pDZ载体中(参见韩国专利申请号10-2007-94433)。最后,获得重组pDZ-mqo载体,其中mqo基因的两个拷贝被串联克隆。图1是显示用于参入到棒状菌基因组中的重组pDZ-mqo载体的结构示意图。
实施例2:***mqo的菌株的产生
将pDZ-mqo载体构建物转化到KCCM-10530菌株中,并与该基因组进行同源重组以在基因组上与mqo基因相邻的位置***一个mqo基因拷贝。因此,获得新的XMP生产菌株,称为产氨棒杆菌KCJ-1304,该菌株在其基因组上具有mqo基因的两个拷贝。mqo基因的两个拷贝的串联***是通过利用使用引物组(SEQ ID NOS.5和6)的PCR鉴定的,该引物组靶向mqo基因的两个拷贝的上游和下游核苷酸序列。
SEQ ID NO.5:CTTTTCGATGACGCCCAA
SEQ ID NO.6:CCACTTTATCGGGTGAGACCA
实施例3:mqo***的菌株的苹果酸脱氢酶活性
如下测定实施例2中制备的产生XMP的产氨棒杆菌KCJ-1304的苹果酸脱氢酶活性。将菌株接种到含有10g/l细菌用蛋白胨、5g/l细菌用牛肉膏、5g/l细菌用酵母抽提物、2.5g/l NaCl、50mg/l腺嘌呤和50mg/l鸟嘌呤的培养基中,并在30℃培养12小时直到获得OD 10。回收10mL细胞培养物,将其在含有50mM HEPES、10mM乙酸钾、10mM CaCl2和10mM MgCl2中洗涤两次,并悬浮在1mL同样的缓冲液中。使用声波仪打断之后,将细胞裂解物离心。将上清液再次离心以产生沉淀物,然后将该沉淀物悬浮在100μL缓冲液中。将10μL该悬浮液用作酶溶液。反应缓冲液通过混合50mM HEPES、10mM乙酸钾和50μM 2,6-二氯靛酚(dichloro indolphenol)(Cl2Ind)制备。反应之前将Cl2Ind解冻和混合。向980μL反应混合物中加入10μL 100mM苹果酸盐作为底物和10μL酶溶液,然后在30℃摇动温育15min。酶活性通过测量减少的Cl2Ind的浓度而测定。Cl2Ind在600nm具有吸收系数22cm-1mM-1。
【表1】
菌株 | KCCM-10530 | KCJ-1304 |
减少的Cl2Ind(μM) | 15.45 | 20.17 |
如表1所示,观察到与母体菌株KCCM-10530相比,KCJ-1304的苹果酸脱氢酶活性增加30.6%。
实施例4:mqo***的菌株中的ATP水平
如下测量实施例2中制备的XMP的生产菌株产氨棒杆菌KCJ-1304的细胞内ATP水平。
将母体菌株产氨棒杆菌KCCM-10530和突变体KCJ-1304接种到各自的14mL管中,每管含有3mL以下种子培养基,并将其以200rpm摇动在30℃温育20小时。然后,以0.4mL的量将种子培养物添加到在各自250mL corner-baffle flask中的25mL种子培养基中,然后在30℃以230rpm摇动培养20小时。测量细胞培养物的OD和细胞内ATP水平。发现突变体KCJ-1304以每OD较母体菌株KCCM-10530更高的产率产生ATP,表明本发明的突变菌株可显示与母体菌株相比较高的GMP生产力。结果概括在以下的表2中。
【表2】
菌株 | OD(A562 | ATP水平(μM) | ATP水平/OD |
KCCM-10530 | 20.76 | 32.92 | 1.59 |
KCJ-1304 | 21.44 | 69.74 | 3.25 |
如表2所示,与母体菌株KCCM-10530相比,KCJ-1304的细胞内ATP水平每OD增加约104%。
实施例5:mqo***的菌株的XMP发酵和GMP产生
如下培养实施例2中制备的XMP的生产菌株产氨棒杆菌KCJ-1304以产生GMP。
将母体菌株产氨棒杆菌KCCM-10530和突变体KCJ-1304接种到各自的14mL管中,每管含有3mL以下种子培养基,并将其以200rpm摇动在30℃温育20小时。然后,以0.4mL的量将种子培养物添加到在各自250mL corner-baffle flask中的32mL以下生产培养基(24mL主要培养基+8mL培养基A)中,然后在30℃以230rpm摇动培养96小时。为了使这样产生的XMP进行GMP转化,将以下的转化添加剂和大肠杆菌XMP氨基酶加入到Erlenmeyer瓶中,然后在40℃进行转化反应4hrs。与母体菌株KCCM-10530相比,发现突变体KCJ-1304的转化率增加,该转化率表明单位消耗的XMP的GMP产生。即,本发明的突变菌株的GMP生产力与常规的菌株相比得到提高。结果概括在以下的表3中。
【表3】
根据表3的数据明显的是,发现与母体菌株KCCM-10530相比,KCJ-1304的转化率增加2.4%,GMP水平增加8.5%。
种子培养基:葡萄糖30g/l、蛋白胨15g/l、酵母提取物15g/l、NaCl 2.5g/l、尿素3g/l、腺嘌呤150mg/l、鸟嘌呤150mg/l,pH 7.2
生产培养基(主要):葡萄糖80g/l、硫酸镁10g/l、硫酸亚铁20mg/l、硫酸锌10mg/l、硫酸锰10mg/l、腺嘌呤30mg/l、鸟嘌呤30mg/l、生物素100μg/l、硫酸铜1mg/l、氯化硫胺素5mg/l、氯化钙10mg/l,pH 7.2
生产培养基(培养基A):磷酸二氢钾10g/l、磷酸氢二钾10g/l、尿素7g/l、硫酸铵5g/l
转化添加剂:肌醇六磷酸1.8g/l、MgSO4 4.8g/l、nymeen 3ml/l、二甲苯2%、腺嘌呤100mg/l、Na2HPO4 7.7g/l、葡萄糖46g/l。
尽管本发明的优选实施方式以示例为目的被公开,但是本领域的技术人员将理解不背离如所附权利要求书中所公开的本发明的范围和精神的各种改变、增加和替换是可能的。
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CHUNG-KU,首尔,
大韩民国
1第6.4(d)条适用时,该日期是获得国际保藏机构状态的日期;于布达佩斯条约之外进行的保藏在获得国际保藏机构状态后转变为布达佩斯条约下的保藏时,该日期是国际保藏机构收到该微生物的日期。
表BP/4 单页
韩国微生物保藏中心——韩国联邦菌物保藏中心
361-221 Hongje-1 dong,Seodaemun-gu,首尔,120-091,韩国;电话:82-2-391-0950、396-0950;
传真:82-2-392-2859;邮箱:kfcckccm.or.kr。
Claims (5)
1.一种棒状菌(Corynebacteria)菌株,其具有较野生型更高的苹果酸脱氢酶活性,因此显示提高的ATP生产力。
2.根据权利要求1所述的棒状菌菌株,其中所述苹果酸脱氢酶活性因mqo表达增加而提高。
3.根据权利要求1所述的棒状菌菌株,在其中参入具有图1的切割图显示的结构的载体。
4.根据权利要求3所述的棒状菌菌株,所述菌株是产氨棒杆菌KCCM10972P。
5.产生GMP的方法,其包括:
(a)培养权利要求1所述的棒状菌菌株;
(b)在所述培养物中产生XMP;
(c)向所述培养物中加入具有XMP胺化活性的酶或微生物;和
(d)从所述培养物获得GMP。
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