KR101056872B1 - 핵산계 물질의 생산성이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 그를 이용한 핵산계 물질의 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 퓨린 생합성 경로에 관여하는 중요 효소들, 바람직하게는 ⅰ)포스포리보실피로포스페이트 아미도트랜스퍼라아제, ⅱ)포스포리보실아민 글리신 리가아제, ⅲ)포스포리보실글리신아마이드 포밀트랜스퍼라아제, ⅳ)포스포리보실포밀글리신아미딘 신세타아제, ⅴ)포스포리보실포밀글리신아미딘 신세타아제 Ⅱ, ⅵ)포스포리보실아미노이미다졸 신세타아제, ⅶ)포스포리보실아미노이미다졸 카복실라아제, ⅷ)포스포리보실아미노이미다졸 썩시노카복사마이드 신세타아제, ⅸ)아데닐로썩시네이드 리아제 및 ⅹ)이노신산 싸이클로하이드롤라아제의 군으로부터 선택된 효소의 활성이 보다 강화된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 핵산계 물질, 바람직하게는 5'-크산틸산 또는 5'-이노신산, 또는 이노신을 생산하는 방법에 관한 것이다.

코리네박테리움 속 미생물, 5'-크산틸산, 5'-이노신산, 이노신, purF, purD, purN, purS, purL, purM, purKE, purC, purB, purH

Description

핵산계 물질의 생산성이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 그를 이용한 핵산계 물질의 생산 방법{MICROORGANISMS OF CORYNEBACTERIUM HAVING ENHANCED NUCLEOTIDE OR NUCLEOSIDE PRODUCTIVITY AND METHOD OF PRODUCING NUCLEOTIDE OR NUCLEOSIDE USING THE SAME}

본 발명은 퓨린 생합성 경로 중 중요 효소인 ⅰ) 포스포리보실피로포스페이트 아미도트랜스퍼라아제(phosphoribosylpyrophosphate amidotransferase), ⅱ) 포스포리보실아민 글리신 리가아제(phosphoribosylamine-glycine ligase), ⅲ) 포스포리보실글리신아마이드 포밀트랜스퍼라아제(phosphoribosylglycinamide formyltransferase), ⅳ) 포스포리보실포밀글리신아미딘 신세타아제(phosphoribosylformylglycinamidine synthetase), ⅴ) 포스포리보실포밀글리신아미딘 신세타아제 Ⅱ(phosphoribosylformylglycinamidine synthetase Ⅱ), ⅵ) 포스포리보실아미노이미다졸 신세타아제(phosphoribosylaminoimidazole synthetase), ⅶ) 포스포리보실아미노이미다졸 카복실라아제(phosphoribosylaminoimidazole carboxylase), ⅷ) 포스포리보실아미노이미다졸 썩시노카복사마이드 신세타아제(phosphoribosylaminoimidazole succinocarboxamide synthetase), ⅸ) 아데닐로썩시네이트 리아제(adenylosuccinate lyase) 및 ⅹ) 이노신산 싸이클로하이드롤라 아제(inosinate cyclohydrolase)의 군으로부터 선택된 효소의 활성이 보다 강화된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 5'-크산틸산 또는 5'-이노신산 또는 이노신을 생산하는 방법에 관한 것이다.

핵산계 물질 중 하나인 5'-구아닐산(5'- guanylic acid: 이하 GMP라 칭함)은 식품 조미 첨가제로 널리 이용되고 있는 물질로서, 그 자체로 버섯의 맛을 내는 것으로 알려져 있으나, 주로 모노소디움 글루탐산(MSG)의 풍미를 강화하는 것으로 알려져 있다. 이러한 성질은 특히 5'-이노신산(5'-inosinic acid; 이하 IMP라 칭함)과 같이 쓰여졌을 때 강하게 나타난다.

지금까지 알려진 GMP의 제조방법은 (1) 효모세포로부터 추출한 리보핵산(RNA)를 효소로 분해하는 방법, (2) 미생물 발효법으로 GMP를 직접 발효하는 방법, (3) 미생물 발효법으로 생산한 구아노신을 화학적 방법으로 인산화 시키는 방법, (4) 미생물 발효법으로 생산한 구아노신을 효소적 방법으로 인산화 시키는 방법, (5) 미생물 발효법으로 생산한 5'-크산틸산(5'-xanthylic acid: 이하 XMP)을 코리네박테리움속 미생물을 이용하여 GMP로 전환하는 방법, (6) 미생물 발효법으로 생산한 XMP를 대장균을 이용하여 GMP로 전환시키는 방법을 들 수 있다. 이중 (1)의 방법은 원료 수급 및 경제성에 문제가 있으며, (2)의 방법은 GMP의 세포막 투과성의 문제로 인하여 수율이 낮다는 단점이 있으므로 그 외의 방법이 공업적으로 주로 이용되고 있다.

위에서 전기한 방법들 중 XMP를 생산하여 GMP로 전환시키는 방법을 이용하여 GMP를 생산할 경우 XMP의 생산성을 강화하는 전략이 필요하다. 때문에 종래 XMP 생합성 관련 유전자가 강화된 코리네박테리움 균주 및 이를 이용한 XMP 생산 방법이 알려져 있었다. 예를 들면, 대한민국 등록특허 제0117443호에는 XMP 수율을 높이기 위하여 아데닌과 구아닌 반영양 요구성 형태의 크산틸산아미나아제 불활성 균주이며 구아노신 유사체 내성을 가지고 있고 세포벽 분해 효소인 라이소자임에 감수성이 매우 높은 균주를 제작하여 개시하였다. 대한민국 등록특허 제0402320호는 XMP를 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)를 친주로 자외선 조사, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 등의 변이 유발제를 통상적인 방법에 따라 처리하여 친주의 형질을 변형시켜 XMP의 생합성에 영향을 주는 발린(valine)에 대한 유사체(analogue)인 노르발린(norvaline) 내성주를 선별하여 그 결과 XMP를 고수율, 고농도로 배양액중에 직접 축적시키는 미생물을 이용한 XMP 생산 방법을 개시하였다.

또 다른 핵산계 물질 중 하나인 IMP는 핵산 생합성 대사계의 중간 물질로서, 동식물의 체내에서 생리적으로 중요한 역할을 수행할 뿐 아니라, 식품, 의약품 및 각종 의료적 이용 등 다방면에 이용되고 있으며, 특히 모노소디움 글루탐산과 같이 사용하면 맛의 상승효과가 커서 정미성 조미료로 각광을 받고 있는 핵산계 조미료 중 하나이다.

IMP를 제조하는 방법으로는 효모 세포로부터 추출한 리보핵산을 효소로 분해하는 방법(일본 특허공고 제1614/1957호 등), 발효에 의해 생산된 이노신을 화학적 방법으로 인산화하는 방법(Agri. Biol. Chem., 36, 1511(1972) 등) 및 IMP를 생산 할 수 있는 미생물을 배양하고 배지에 축적된 IMP를 회수하는 방법 등이 있다. 이러한 방법 중에서 현재 가장 많이 사용되고 있는 방법이 미생물을 이용하여 IMP를 생산하는 방법이다. IMP를 생산하는데 이용하는 미생물 중 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 균주, 예를 들어 코리네박테리움 암모니아게네스 균주를 발효시킴으로써 제조하는 방법(대한민국 등록특허 제0446113호) 등이 공지되어 있다.

또 다른 핵산계 물질중 하나인 이노신은 정미성 조미료로 각광 받고 있는 IMP의 화학적 합성 및 효소전이 반응에 의한 합성에 있어서 중요한 기질이다. 또한 이노신은 핵산 생합성 대사계의 중간물질로 동식물의 체내에서 생리적으로 중요한 의미를 가질 뿐 아니라 식품, 의약품 및 각종 의료적 이용 등 다방면에서 이용되고 있다. 이러한 이노신을 생산하기 위하여 종래에는 바실러스(Agric. Biol. Chem., 46, 2347 (1982); 대한민국 등록특허 제27280호) 또는 코리네박테리움 암모니아게네스(Agric. Biol. Chem., 42, 399 (1978)) 등의 미생물을 이용한 직접 발효법이나 IMP의 열분해법(일본 특허 공소 제43-3320호) 등을 이용하여 제조하였다. 그러나, 열분해법의 경우 IMP를 분해하는데 대량의 열 소비가 요구되어 실용성이 문제되며, 직접 발효에 의한 제조방법은 대장균을 이용한 다양한 유전자형의 균주들이 제작 및 연구(Biosci Biotechnol Biochem. 2001 Mar; 65(3): 570-8)되었으나 이노신 생산 균주의 역가가 낮아 생산 원가가 높아진다는 단점이 있었다. 또한 기존 이노신 연구는 대장균과 바실러스균에 치중되어 있는데, 더 높은 수율과 농도를 위해 코리네박테리움 암모니아게네스 균주를 이용한 이노신 생산 균주 개발이 보고된 바 있 다(대한민국 등록특허 제0330705호, 제0671080호 및 제0671081호).

종래 퓨린 생합성 관련 유전자가 강화된 코리네박테리움 균주 및 이를 이용한 IMP 또는 XMP 생산 방법이 알려져 있었다. 예를 들면, 대한민국 등록특허 제0785248호에서는 포스포리보실아미노이미다졸 썩시노카복사마이드 신세타아제를 코딩하는 유전자 purC가 과발현된 미생물 및 이를 이용한 IMP의 생산 방법이 개시 되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허 제0857379호에서는 purKE에 의해 암호화되는 포스포리보실아미노이미다졸 카복실라아제 유전자가 과발현된 미생물 코리네박테리움 암모니아게네스 균주와 이를 육종 및 배양하여 IMP를 고농도 및 고수율로 생산하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 공개특허 제10-2007-0056491호에서는 purF에 의해 암호화되는 포스포리보실피로포스페이트 아미도트랜스퍼라아제 효소가 강화된 코리네박테리움 암모니아게네스 균주와 이를 이용한 XMP를 제조하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 출원특허 제10-2008-006537호(미공개)에서는 purN에 의해 암호화되는 포스포리보실글리신아마이드 포밀트랜스퍼라아제와 purH에 의해 암호화되는 이노신산 싸이클로하이드롤라아제 효소의 활성이 내재적 활성보다 강화되어 있고, 바람직하게는 추가로 5'-뉴클레오티다제가 불활성화 되어 있는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용하여 고농도 XMP를 생산하는 방법에 관한 것이 개시 되어 있다.

본 발명의 목적은 핵산계 물질인 XMP 또는 IMP 또는 이노신을 고농도로 생산 할 수 있는 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 코리네박테리움 속 미생물들을 배양하여, 그 배양액으로부터 XMP 또는 IMP 또는 이노신을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 포스포리보실피로포스페이트 아미도트랜스퍼라아제, 포스포리보실아민 글리신 리가아제, 포스포리보실글리신아마이드 포밀트랜스퍼라아제, 포스포리보실포밀글리신아미딘 신세타아제, 포스포리보실포밀글리신아미딘 신세타아제 Ⅱ, 포스포리보실아미노이미다졸 신세타아제, 포스포리보실아미노이미다졸 카복실라아제, 포스포리보실아미노이마다졸 썩시노카복사마이드 신세타아제, 아데닐로썩시네이트 리아제 및 이노신산 싸이클로하이드롤라아제의 효소 활성을 보다 강화시켜 퓨린 생합성 경로의 활성을 강화시킴으로써, XMP 또는 IMP 또는 이노신의 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 코리네박테리움 속 미생물을 배양하여, 그 배양액으로부터 XMP 또는 IMP 또는 이노신을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따라 코리네박테리움 속 미생물의 퓨린 생합성 경로의 효소 들의 활성을 강화시킴으로써, XMP 또는 IMP 또는 이노신을 고농도로 생산하여 수율 향상에 의한 생산 원가 절감을 이룰 수 있다.

본 발명은 포스포리보실피로포스페이트 아미도트랜스퍼라아제, 포스포리보실아민 글리신 리가아제, 포스포리보실글리신아마이드 포밀트랜스퍼라아제, 포스포리보실포밀글리신아미딘 신세타아제, 포스포리보실포밀글리신아미딘 신세타아제 Ⅱ, 포스포리보실아미노이미다졸 신세타아제, 포스포리보실아미노이미다졸 카복실라아제, 포스포리보실아미노이마다졸 썩시노카복사마이드 신세타아제, 아데닐로썩시네이트 리아제 및 이노신산 싸이클로하이드롤라아제의 효소 활성을 강화시켜 퓨린 생합성 경로의 활성을 강화시킴으로써, XMP 또는 IMP 또는 이노신의 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.

보다 바람직하게는, 본 발명은 포스포리보실아민 글리신 리가아제, 포스포리보실글리신아마이드 포밀트랜스퍼라아제, 포스포리보실포밀글리신아미딘 신세타아제, 포스포리보실포밀글리신아미딘 신세타아제 Ⅱ, 아데닐로썩시네이트 리아제 및 이노신산 싸이클로하이드롤라아제를 암호화하는 유전자가 도입되어 활성이 강화된 코리네박테리움 속 미생물, 여기에 부가적으로 포스ㅊ포리보실피로포스페이트 아미도트랜스퍼라아제와 포스포리보실아미노이미다졸 신세타아제를 암호화하는 유전자 또는 포스포리보실아미노이미다졸 카복실라아제와 포스포리보실아미노이미다졸 썩시노카복사마이드 신세타아제를 암호화하는 유전자가 도입되어 활성이 강화된 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다. 또한, 상기 언급된 효소를 암호화하는 유전자가 모두 도입되어 활성이 강화된 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.

상기 유전자 purF, purD, purN, purS, purL, purM, purKE, purC, purB 및 purH 의 뉴클레오티드 서열들은 이미 공지되어 있으며, 각각 서열번호 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 및 44의 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 바람직하게는, 상기 유전자들은 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401(KCCM-10610)로부터 유래된 것일 수 있다.

본 발명에서 상기 내재적 유전자는 코리네박테리움 속 미생물이 천연의 상태로 가지고 있는 유전자를 의미하며, 상기 효소들의 활성을 강화시키는 방법은 유전자 카피 수의 증가 및 돌연변이에 의하여 효소활성을 증가 또는 이 둘 모두에 의한 것이 포함된다. 상기 유전자 카피 수의 증가는 외래 유전자의 도입에 의한 개수의 증가뿐만 아니라 내재적 유전자의 증폭에 의한 것도 포함된다. 내재적 유전자의 증폭은 당업계에 알려진 방법, 예를 들면 적당한 선택 압력하에서 배양하는 방법 등에 의하여 용이하게 이루어질 수 있다.

본 발명에서 상기 효소의 활성은 바람직하게는 코리네박테리움 속 미생물이 천연상태로 가지고 있는 내재적 유전자에 더하여 1 카피 이상의 유전자를 새로 도입함으로써 달성되며, 바람직하게는 2개 카피의 유전자가 상동 재조합에 의하여 내재적 유전자 옆에 1 카피의 유전자가 더 삽입되고, 최종적으로는 2개 카피의 유전자가 증폭되고 돌연변이를 일으킴으로써 효소의 활성이 강화되는 것이다.

본 발명은 상기 효소를 암호화하는 각각의 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에서 외래 유전자의 도입시 사용 가능한 벡터는 바람직하게는 염색체 삽입용 벡터 pDZ이며, 더욱 바람직하게는 각각 도 2, 3, 4, 5, 6 및 7의 개열지도를 갖는 염색체 삽입용 벡터 pDZ-2purFM, pDZ-2purDB, pDZ-2purNH, pDZ-2purSL, pDZ-2purKE, pDZ-2purC일 수 있다. 이들 벡터는 순서대로 또는 조합되어 상기 코리네박테리움 속 미생물에 도입될 수 있으며, 상기 유전자의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동 재조합에 의하여 이루어질 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 발명은 XMP를 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXFT0301(KCCM-10530)와 IMP를 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401(KCCM-10610) 및 이노신을 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIS-H273(KCCM-10905)에 각각 상기 벡터 pDZ-2purFM, pDZ-2purDB, pDZ-2purNH, pDZ-2purSL, pDZ-2purKE, pDZ-2purC를 순서대로 또는 조합하여 도입하고, 선택배지에 배양한 균주를 제공한다.

본 발명에서, 상기 형질전환된 미생물들은 각각 XMP를 고농도로 생산하도록 형질전환된 코리네박테리움 암모니아게네스 CN02-0058, CN02-0078, CN02-0120 균주들, IMP를 고농도로 생산하도록 형질전환된 코리네박테리움 암모니아게네스 CN01-0118, CN01-0300균주들, 그리고 이노신을 고농도로 생산하도록 형질전환된 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0049, CN04-0050 균주들이다. 상기 코리네박테리움 암모니아게네스 CN01-0118 균주는 부다페스트 조약 하에 서울 서대문구 홍제1동 소재의 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2008년 09월 23일자로 기탁하였다(수탁번호 KCCM 10965P). 상기 균주들은 각각 XMP 또는 IMP 또는 이노신 생산 효율이 각각의 모균주보다 높다.

또한, 본 발명은 상기의 형질전환된 각각의 코리네박테리움 속 미생물을 배 양하여 그 배양액으로부터 XMP 또는 IMP 또는 이노신을 생산하는 방법에 관한 것이다.

상기의 형질전환된 각각의 코리네박테리움 속 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.

탄소원으로는 글루코오스와 프룩토오스가 사용될 수 있고, 질소원으로는 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄과 같은 각종 무기질소원 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크, 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 무기화합물로는 인산1수소칼륨, 인산2수소칼륨, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 이외에 필요에 따라 비타민 및 영양요구성 염기 등이 첨가될 수 있다.

배양은 호기적 조건 하에서 예를 들면, 진탕배양 또는 통기 교반 배양에 의해, 바람직하게는 20 내지 40℃의 온도에서 수행될 수 있다. 배지의 pH는 배양하는 동안 중성근처에서 유지하는 것이 바람직하다. 배양은 4 내지 5일 동안 수행할 수 있다. 구체적 실시예에서, 본 발명에 의하여 형질전환된 각각의 코리네박테리움 속 미생물은 형질전환하지 않은 코리네박테리움 속 미생물에 비하여 높은 수율로 XMP 또는 IMP 또는 이노신을 생산하였다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예

참고예 1 : 염색체 삽입용 벡터 (pDZ)를 이용한 유전자의 삽입 방법

염색체 삽입용 벡터 pDZ를 이용하여 유전자의 염색체 삽입을 진행한다. 코리네박테리움 암모니아게네스의 염색체로 여분의 유전자를 삽입하기 위하여, 대상이 되는 유전자를 연속적으로 2개를 포함하고 있는 pDZ 벡터를 제작한다. 도 1은 염색체 삽입용 벡터 pDZ를 나타낸다.

본 발명에서는 XMP 생산 균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXFT0301(KCCM-10530) 균주에, IMP 생산 균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401(KCCM-10610) 균주에, 이노신 생산 균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIS-H273(KCCM-10905) 균주에 일렉트로포레이션법(electroporation)으로 형질전환한 후, 카나마이신(kanamycin) 25㎎/l를 함유한 선별 배지에서 염색체상의 동 유전자와 상동성에 의해 삽입된 균주를 선별하였다.

벡터의 성공적인 염색체 삽입은 X-gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-B-D-갈락토시드)을 포함한 고체배지에서 푸른색을 나타나는가의 여부를 확인함으로써 가능하다.

1차 염색체 삽입된 균주를 영양배지에서 진탕 배양 (30℃, 4시간) 한 후, 각각 10^-4으로부터 10^-10으로 X-gal을 포함하고 있는 고체배지에 도말한다. 대부분의 콜로니가 푸른색을 띄는데 반해 낮은 비율로 나타나는 백색 콜로니를 선별함으로 써, 2차교차(crossover)에 의해 삽입된 염색체상의 벡터 서열이 제거된 균주를 선별한다.

이상과 같이 선별된 균주는 최종적으로 항생제 카나마이신에 대한 감수성 여부의 확인 및 PCR을 통하여 유전자 구조 확인 과정을 거쳐 최종 선정된다.

실시예 1: IMP 생산 균주 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401(KCCM-10610)균주 유래의 purFM 유전자 클로닝 및 재조합벡터(pDZ-2purFM) 제작, purFM 삽입 균주 개발

본 실시예에서는 purF 유전자와 purM 유전자가 근접거리에 위치하고 있어, 두 유전자를 동시에 발현시키기 위하여 프로모터 부위를 포함한 purFM 벡터를 제작하기로 하였다.

코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401 균주의 염색체를 분리하고, 이를 주형으로 하여 중합효소는 PfuUltra ^TM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 30초와 어닐링 53℃, 30초 및 중합반응 72℃, 2분을 30회 반복하였다. 그 결과, 프로모터 부위를 포함한 purFM 유전자 두 쌍(purFM-A, purFM-B)을 얻었다. purFM-A는 서열번호 1과 2를 프라이머로 사용하여 증폭된 것이며, purFM-B는 서열번호 3과 4를 프라이머로 사용하여 증폭된 것이다.

상기 pDZ-2purFM 벡터를 XMP 생산 균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXFT0301(KCCM-10530) 균주에, IMP 생산 균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401(KCCM-10610) 균주에, 이노신 생산 균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIS-H273(KCCM-10905) 균주에 일렉트로포레이션법을 통하여 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상의 내재적 purFM 유전자의 바로 옆에 1개의 purFM 유전자를 추가로 삽입하여 총 개수를 2개로 증가시킨 균주를 얻었다. 연속적으로 삽입된 purFM 유전자는 2개의 purFM 연결부위를 증폭할 수 있는 서열번호 5와 6의 프라이머를 이용한 PCR을 통하여 최종 확인하였다.

pDZ-2purFM 벡터를 제작하기 위한 PCR 반응에 사용된 프라이머들과 제작된 해당 증폭 균주를 확인하기 위하여 사용된 프라이머들의 서열은 각각 다음과 같다.

서열번호 1 : cgacgagaat tccccgaccc gcatgagatg

서열번호 2 : gtatcgtcta gagcggtagc ggtggcttcg

서열번호 3 : cgacgatcta gacccgaccc gcatgagatg

서열번호 4 : gtatcgaagc ttgcggtagc ggtggcttcg

서열번호 5 : gctatcgttt cccctgaa

서열번호 6 : tgattctact aagtttgc

실시예 2: IMP 생산 균주 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401(KCCM-10610) 균주 유래의 purDB 유전자 클로닝 및 재조합벡터(pDZ-2purDB) 제작, purDB 삽입 균주 개발

본 실시예에서는 purD 유전자와 purB 유전자가 근접 거리에 위치하고 있어, 두 유전자를 동시에 발현시키기 위하여 프로모터 부위를 포함한 purDB 벡터를 제작 하기로 하였다.

코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401 균주의 염색체를 분리하고, 이를 주형으로 하여 중합효소는 PfuUltra ^TM 고-신뢰 DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 30초와 어닐링 53℃, 30초 및 중합반응 72℃, 2분을 30회 반복하였다. 그 결과, 프로모터 부위를 포함한 purDB 유전자 두 쌍(purDB-A, purDB-B)을 얻었다. purDB-A는 서열번호 7과 8을 프라이머로 사용하여 증폭된 것이며, purDB-B는 서열번호 9와 10을 프라이머로 사용하여 증폭된 것이다.

상기 증폭 산물을 TOPO 클로닝 키트를 이용하여 대장균 벡터 pCR2.1에 클로닝하여 pCR-purDB-A와 pCR-purDB-B 벡터를 얻었다. 상기 pCR 벡터에 purDB-A와 purDB-B의 각 말단에 포함된 제한효소(purDB-A: HindⅢ+SpeI, purDB-B: SpeI+XbaI)를 처리하여, 상기 pCR 벡터로부터 각각의 purDB 유전자를 분리하였다. 다음으로, 제한효소 HindⅢ와 XbaI이 처리된 pDZ 벡터에 3 조각 접합을 통하여 클로닝하여, 최종적으로 purDB 유전자 2개가 연속적으로 클로닝된 pDZ-2purDB 재조합 벡터를 제작하였다. 도 3은 코리네박테리움 염색체 삽입용 벡터 pDZ-2purDB을 나타내는 도면이다.

상기 pDZ-2purDB 벡터를 XMP 생산 균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXFT0301 균주에, IMP 생산 균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401 균주에, 이노신 생산 균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIS-H273 균주에 일렉트로포레이션법을 통하여 형질전환 하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상의 내재적 purDB 유전자의 바로 옆에 1개의 purDB 유전자를 추가로 삽입하여 총 개수를 2개로 증가시킨 균주를 얻었다. 연속적으로 삽입된 purDB 유전자는 2개의 purDB 연결부위를 증폭할 수 있는 서열번호 11과 12의 프라이머를 이용한 PCR을 통하여 최종 확인하였다.

pDZ-2purDB 벡터를 제작하기 위한 PCR 반응에 사용된 프라이머들과 제작된 해당 균주를 확인하기 위하여 사용된 프라이머들의 서열은 각각 다음과 같다.

서열번호 7 : ggcacaagct tccgcgtagt atcataagca gtc

서열번호 8 : cagcactagt gctggctcta gtgcgaagtc at

서열번호 9 : cagcactagt ccgcgtagta tcataagcag tc

서열번호 10 : gccctctaga gctggctcta gtgcgaagtc at

서열번호 11 : tcgctgacaa gcacgcgttt atcggc

서열번호 12 : ggtagcgggg tcggccgcaa ggcc

실시예 3: IMP 생산 균주 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401(KCCM-10610) 균주 유래의 purNH 유전자 클로닝 및 재조합벡터(pDZ-2purNH) 제작, purNH 삽입 균주 개발

본 실시예에서는 purN 유전자와 purH 유전자가 근접 거리에 위치하고 있어, 두 유전자를 동시에 발현시키기 위하여 프로모터 부위를 포함한 purNH 벡터를 제작하기로 하였다.

코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401 균주의 염색체를 분리하고, 이를 주형으로 하여 중합효소는 PfuUltra ^TM 고-신뢰 DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 30초와 어닐링 53℃, 30초 및 중합반응 72℃, 2분을 30회 반복하였다. 그 결과, 프로모터 부위를 포함한 purNH 유전자 두 쌍(purNH-A, purNH-B)을 얻었다. purNH-A는 서열번호 13과 14를 프라이머로 사용하여 증폭된 것이며, purNH-B는 서열번호 14와 15를 프라이머로 사용하여 증폭된 것이다. 상기 증폭 산물을 TOPO 클로닝 키트를 이용하여 대장균 벡터 pCR2.1에 클로닝하여 pCR-purNH-A와 pCR-purNH-B 벡터를 얻었다. 상기 pCR 벡터에 purNH-A와 purNH-B의 각 말단에 포함된 제한효소(purNH-A: BamHI+SalI, purNH-B: SalI)를 처리하여, 상기 pCR 벡터로부터 각각의 purNH 유전자를 분리하였다.

다음으로, 제한효소 BamHI과 SalI이 처리된 pDZ 벡터에 3 조각 접합을 통하여 클로닝하여, 최종적으로 purNH 유전자 2개가 연속적으로 클로닝된 pDZ-2purNH 재조합 벡터를 제작하였다. 도 4는 코리네박테리움 염색체 삽입용 벡터 pDZ-2purNH을 나타내는 도면이다.

상기 pDZ-2purNH 벡터를 XMP 생산 균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXFT0301 균주에, IMP 생산 균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401 균주에, 이노신 생산 균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIS-H273 균주에 일렉트로포레이션법을 통하여 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상의 내재적 purNH 유전자의 바로 옆에 1개의 purNH 유전자를 추가로 삽입하여 총 개수를 2개로 증가시킨 균주를 얻었다. 연속적으로 삽입된 purNH 유전자는 2개의 purNH 연결부위 를 증폭할 수 있는 서열번호 16과 17의 프라이머를 이용한 PCR을 통하여 최종 확인하였다.

pDZ-2purNH벡터를 제작하기 위한 PCR 반응에 사용된 프라이머들과 제작된 해당 증폭 균주를 확인하기 위하여 사용된 프라이머들의 서열은 각각 다음과 같다.

서열 번호 13 : cgggatcccg aggcgaagac gatattgagg acag

서열 번호 14 : acgcgtcgac gtgggaaacg cagacgagaa ca

서열 번호 15 : acgcgtcgac gaggcgaaga cgatattgag gacag

서열 번호 16 : tcgatgcctg catcttgg

서열 번호 17 : ggcgataagg cttcgagt

실시예 4: IMP 생산 균주 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401 균주 유래 purSL 유전자 클로닝 및 재조합벡터(pDZ-2purSL) 제작, purSL 삽입 균주 개발

본 실시예에서는 purS 유전자와 purL 유전자가 근접 거리에 위치하고 있어, 두 유전자를 동시에 발현시키기 위하여 프로모터 부위를 포함한 purSL 벡터를 제작하기로 하였다.

코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401 균주의 염색체를 분리하고, 이를 주형으로 하여 중합효소는 PfuUltra ^TM 고-신뢰 DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 30초와 어닐링 53℃, 30초 및 중합반응 72℃, 2분을 30회 반복하였다. 그 결과, 프로모터 부위를 포함한 purSL 유전자 두 쌍(purSL-A, purSL-B) 을 얻었다. purSL-A는 서열번호 18과 19를 프라이머로 사용하여 증폭된 것이며, purSL-B는 서열번호 20과 21을 프라이머로 사용하여 증폭된 것이다.

상기 증폭 산물을 TOPO 클로닝 키트를 이용하여 대장균 벡터 pCR2.1에 클로닝하여 pCR-purSL-A와 pCR-purSL-B 벡터를 얻었다. 상기 pCR 벡터에 purSL-A와 purSL-B의 각 말단에 포함된 제한효소(purSL-A: BamHI+SalI, purSL-B: SalI+BamHl)를 처리하여, 상기 pCR 벡터로부터 각각의 purSL 유전자를 분리하였다. 다음으로, 제한효소 BamHI이 처리된 pDZ 벡터에 3 조각 접합을 통하여 클로닝하여, 최종적으로 purSL 유전자 2개가 연속적으로 클로닝된 pDZ-2purSL 재조합 벡터를 제작하였다. 도 5는 코리네박테리움 염색체 삽입용 벡터 pDZ-2purSL을 나타내는 도면이다

상기 pDZ-2purSL벡터를 XMP 생산 균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXFT0301 균주에, IMP 생산 균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401 균주에, 이노신 생산 균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIS-H273 균주에 일렉트로포레이션법을 통하여 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상의 내재적 purSL 유전자의 바로 옆에 1개의 purSL 유전자를 추가로 삽입하여 총 개수를 2개로 증가시킨 균주를 얻었다. 연속적으로 삽입된 purSL 유전자는 2개의 purSL 연결부위를 증폭할 수 있는 서열번호 22와 23의 프라이머를 이용한 PCR을 통하여 최종 확인하였다.

pDZ-2purSL벡터를 제작하기 위한 PCR 반응에 사용된 프라이머들과 제작된 해당 증폭 균주를 확인하기 위하여 사용된 프라이머들의 서열은 각각 다음과 같다.

서열 번호 18 : gctcggatcc gcgatactca gccccagcaa cagcagaaaa tgaagc

서열 번호 19 : cagcgtcgac gcagccgtcg caggcaccat cgcagcagt

서열 번호 20 : cagcgtcgac gcgatactca gccccagcaa cagcagaaaa tgaagc

서열 번호 21 : gctcggatcc gcagccgtcg caggcaccat cgcagcagt

서열 번호 22 : acttgacctc cagcccta

서열 번호 23 : aagaacaacg tcggcgtc

실시예 5: IMP 생산 균주 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401 균주 유래 purKE 유전자 클로닝 및 재조합벡터(pDZ-2purKE) 제작, purKE 삽입 균주 개발

본 실시예에서는 purK 유전자와 purE 유전자가 근접 거리에 위치하고 있어, 두 유전자를 동시에 발현시키기 위하여 프로모터 부위를 포함한 purKE 벡터를 제작하기로 하였다.

코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401 균주의 염색체를 분리하고, 이를 주형으로 하여 중합효소는 PfuUltra ^TM 고-신뢰 DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 30초와 어닐링 53℃, 30초 및 중합반응 72℃, 2분을 30회 반복하였다. 그 결과, 프로모터 부위를 포함한 purKE 유전자 두 쌍(purKE-A, purKE-B)을 얻었다. purKE-A는 서열번호 24와 25를 프라이머로 사용하여 증폭된 것이며, purKE-B는 서열번호 26과 27을 프라이머로 사용하여 증폭된 것이다.

상기 증폭 산물을 TOPO 클로닝 키트를 이용하여 대장균 벡터 pCR2.1에 클로닝하여 pCR-purKE-A와 pCR-purKE-B 벡터를 얻었다. 상기 pCR 벡터에 purKE-A와 purKE-B의 각 말단에 포함된 제한효소(purKE-A: BamHI+KpnI, purKE-B: KpnI+XbaI)를 처리하여, 상기 pCR 벡터로부터 각각의 purKE 유전자를 분리하였다. 다음으로, 제한효소 BamHI과 XbaI이 처리된 pDZ 벡터에 3 조각 접합을 통하여 클로닝하여, 최종적으로 purKE 유전자 2개가 연속적으로 클로닝된 pDZ-2purKE 재조합 벡터를 제작하였다. 도 6은 코리네박테리움 염색체 삽입용 벡터 pDZ-2purKE을 나타내는 도면이다.

상기 pDZ-2purKE벡터를 XMP 생산 균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXFT0301 균주에, IMP 생산 균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401균주에, 이노신 생산 균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIS-H273 균주에 일렉트로포레이션법을 통하여 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상의 내재적 purKE 유전자의 바로 옆에 1개의 purKE 유전자를 추가로 삽입하여 총 개수를 2개로 증가시킨 균주를 얻었다. 연속적으로 삽입된 purKE 유전자는 2개의 purDB 연결부위를 증폭할 수 있는 서열번호 28과 29의 프라이머를 이용한 PCR을 통하여 최종 확인하였다.

pDZ-2purKE벡터를 제작하기 위한 PCR 반응에 사용된 프라이머들과 제작된 해당 균주를 확인하기 위하여 사용된 프라이머들의 서열은 각각 다음과 같다.

서열 번호 24 : acgtcaggat cccctatcgt gctttgctgt

서열 번호 25 : ctctaaggta ccattggtac tagtagccgc

서열 번호 26 : acgtcaggta cccctatcgt gctttgctgt

서열 번호 27 : ctctaatcta gaattggtac tagtagccgc

서열 번호 28 : ccagctgggg ttccggtt

서열 번호 29 : tttcgatgcg cttcgttt

실시예 6: IMP 생산 균주 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401 균주 유래 purC 유전자 클로닝 및 재조합벡터(pDZ-2purC) 제작, purC 삽입 균주 개발

코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401 균주의 염색체를 분리하고, 이를 주형으로 하여 중합효소는 PfuUltra ^TM 고-신뢰 DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 30초와 어닐링 53℃, 30초 및 중합반응 72℃, 2분을 30회 반복하였다. 그 결과, 프로모터 부위를 포함한 purC 유전자 두 쌍(purC-A, purC-B)을 얻었다. purC-A는 서열번호 30과 31을 프라이머로 사용하여 증폭된 것이며, purC-B는 서열번호 31과 32을 프라이머로 사용하여 증폭된 것이다.

상기 증폭 산물을 TOPO 클로닝 키트를 이용하여 대장균 벡터 pCR2.1에 클로닝하여 pCR-purC-A와 pCR-purC-B 벡터를 얻었다. 상기 pCR 벡터에 purC-A와 purC-B의 각 말단에 포함된 제한효소(purC-A: BamHI+SalI, purC-B: SalI)를 처리하여, 상기 pCR 벡터로부터 각각의 purC 유전자를 분리하였다. 다음으로, 제한효소 BamHI과 SalI이 처리된 pDZ 벡터에 3 조각 접합을 통하여 클로닝하여, 최종적으로 purC 유전자 2개가 연속적으로 클로닝된 pDZ-2purC 재조합 벡터를 제작하였다. 도 7은 코리네박테리움 염색체 삽입용 벡터 pDZ-2purC를 나타내는 도면이다.

상기 pDZ-2purC벡터를 XMP 생산 균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXFT0301 균주에, IMP 생산 균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401 균주에, 이노신 생산 균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIS-H273 균주에 일렉트로포레이션법을 통하여 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상의 내재적 purC 유전자의 바로 옆에 1개의 purC 유전자를 추가로 삽입하여 총 개수를 2개로 증가시킨 균주를 얻었다. 연속적으로 삽입된 purC 유전자는 2개의 purC 연결부위를 증폭할 수 있는 서열번호 33과 34의 프라이머를 이용한 PCR을 통하여 최종 확인하였다.

pDZ-2purC벡터를 제작하기 위한 PCR 반응에 사용된 프라이머들과 제작된 해당 증폭 균주를 확인하기 위하여 사용된 프라이머들의 서열은 각각 다음과 같다.

서열 번호 30 : gctcggatcc cgcagtggct gttgcgctga acatgcg

서열 번호 31 : gcaggtcgac cacggacata tcggtttgct tcacgcggg

서열 번호 32 : gcaggtcgac cgcagtggct gttgcgctga acatgcg

서열 번호 33 : gagcgcttgt ccggcaagcg tttc

서열 번호 34 : ggtggttgcg gtaagaaccc ggcc

실시예 7: 퓨린 생합성 유전자 강화에 의한 고수율 XMP 균주 개발

상기 실시예에서 제작된 pDZ-2purFM, pDZ-2purDB, pDZ-2purNH, pDZ-2purSL, pDZ-2purKE 및 pDZ-2purC 벡터를 XMP를 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXFT0301 균주에 조합 또는 모두 도입하였다. 벡터 도입 순서는 임의로 선택하였으며, 도입 방법 및 확인은 상기 실시예에서 표기한 바와 같다.

아래는 퓨린 생합성 유전자 강화에 의해 개발된 XMP를 생산하는 능력이 증진된 코리네박테리움 암모니아게네스 균주들의 유전자 형질을 나타낸다.

CN02-0058 유전자 형질

: CJXFT0301 + 2purDB + 2purNH + 2purSL

CN02-0078 유전자 형질

: CJXFT0301 + 2purDB + 2purNH + 2purSL + 2purFM

CN02-0120 유전자 형질

: CJXFT0301 + 2purDB + 2purNH + 2purSL + 2purKE + 2purC + 2purFM

실시예 8: 퓨린 생합성 유전자 강화에 의한 고수율 IMP 균주 개발

상기 실시예에서 제작된 pDZ-2purFM, pDZ-2purDB, pDZ-2purNH, pDZ-2purSL, pDZ-2purKE 및 pDZ-2purC 벡터를 IMP를 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401 균주에 조합 또는 모두 도입하였다. 벡터 도입 순서는 임의로 선택하였으며, 도입 방법 및 확인은 상기 실시예에서 표기한 바와 같다.

아래는 퓨린 생합성 유전자 강화에 의해 개발된 IMP를 생산하는 능력이 증진된 코리네박테리움 암모니아게네스 균주들의 유전자 형질을 나타낸다.

CN01-0118 유전자 형질

: CJIP2401 + 2purDB + 2purNH + 2purSL + 2purKE + 2purC

CN01-0300 유전자 형질

: CJIP2401 + 2purDB + 2purNH + 2purSL + 2purKE + 2purC + 2purFM

실시예 9: 퓨린 생합성 유전자 강화에 의한 고수율 이노신 균주 개발

상기 실시예에서 제작된 pDZ-2purFM, pDZ-2purDB, pDZ-2purNH, pDZ-2purSL, pDZ-2purKE 및 pDZ-2purC 벡터를 이노신을 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIS-H273 균주에 조합 또는 모두 도입하였다. 벡터 도입 순서는 임의로 선택하였으며, 도입 방법 및 확인은 상기 실시예에서 표기한 바와 같다.

아래는 퓨린 생합성 유전자 강화에 의해 개발된 이노신을 생산하는 능력이 증진된 코리네박테리움 암모니아게네스 균주들의 유전자 형질을 나타낸다.

CN04-0049 유전자 형질

: CJIS-H273 + 2purDB + 2purNH + 2purSL + 2purKE + 2purC

CN04-0050 유전자 형질

: CJIS-H273 + 2purDB + 2purNH + 2purSL + 2purKE + 2purC + 2purFM

실시예 10: XMP 삼각 플라스크 발효역가 시험

하기 종배지 3㎖을 함유하는 14㎖ 튜브에 모균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXFT0301 균주와 당 특허에서 제작된 코리네박테리움 암모니아게네스 CN02-0058, CN02-0078, CN02-0120 균주들을 접종하고 30℃에서 20시간 동안 200rpm으로 진탕 배양하였다. 하기 생산 배지 32㎖(발효배지 24㎖ + 별살배지 8㎖)을 포함하고 있는 250㎖ 코너-바플 플라스크에 0.4㎖의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 96시간 동안 230rpm으로 진탕 배양하였다.

상기 종배지 및 발효배지의 조성은 다음과 같다.

종배지: 포도당 30g/l, 펩톤 15g/l, 효모엑기스 15g/l, 염화나트륨 2.5g/l, 우레아 3g/l, 아데닌 150㎎/l, 구아닌 150㎎/l, pH 7.2

플라스크 발효 배지: 포도당 80g/l, 황산마그네슘 10g/l, 황산철 20㎎/l, 황산아연 10㎎/l, 황산망간 10㎎/l, 아데닌 30㎎/l, 구아닌 30㎎/l, 비오틴 100㎍/l, 황산구리 1㎎/l, 티아민염산염 5㎎/l, 염화칼슘 10㎎/l, pH 7.2

플라스크 별살 배지: 인산제1칼륨 10g/l, 인산제2칼륨 10g/l, 우레아 7g/l, 황산암모늄 5g/l

배양 종료 후 HPLC를 이용한 방법에 의해 XMP의 생산량을 측정하였으며, 배양액 중의 XMP 결과는 아래 표 1과 같다.

균주명	Cell OD (배양 4일후)	생산성(g/l/hr) (배양 4일후)
대조군(CJXFT0301)	45.3	0.298
CN02-0058	43.3	0.327
CN02-0078	42.1	0.340
CN02-0120	43.9	0.315

배지 내 XMP 축적량을 모균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXFT0301 균주와 비교한 결과, 코리네박테리움 암모니아게네스 CN02-0058, CN02-0078 및 CN02-0120 균주들이 동일한 조건하에서 모균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXFT0301 균주 대비 단위 시간당 생산하는 XMP 생산성이 10.6~11.4% 증가함을 나타낸다.

또한 코리네박테리움 암모니아게네스 CN02-0058 균주가 갖고 있는 증폭 유전자 조합(2purDB+2purNH+2purSL)만으로도 모균주 대비 생산 수율이 크게 증진됨을 알 수 있었으며, 생산 수율이 가장 많이 증진된 유전자 조합은 코리네박테리움 암모니아게네스 CN02-0078 균주가 갖고 있는 조합으로써 코리네박테리움 암모니아게네스 CN02-0058 균주대비 purFM 유전자의 증폭만이 추가되었음을 확인할 수 있었다. 그리고 모든 퓨린 생합성 경로상의 유전자가 증폭된 경우는 다소 수율 증진 폭이 낮음을 알 수 있었다.

실시예 11: IMP 삼각 플라스크 발효역가 시험

하기 종배지 3㎖를 지름18㎜ 시험관에 분주하고 가압 살균한 후, 모균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401 균주와 당 특허에서 제작된 코리네박테리움 암모니아게네스 CN01-0118 및 CN01-0300 균주들을 접종하고 30℃ 온도에서 24시간 진탕 배양하여 종 배양액으로 사용하였다. 하기 발효배지 27㎖를 500㎖ 진탕용 삼각플라스크에 분주하고, 120℃ 온도에서 10분간 가압 살균한 후, 플라스크 배양액 3㎖을 접종하여 5 내지 6일간 배양하였다. 배양 조건은 회전수 200rpm, 온도32℃, pH 7.2로 조절하였다.

상기 종배지 및 발효배지의 조성은 다음과 같다.

종배지: 포도당 1%, 펩톤1%, 육즙 1%, 효모엑기스 1%, 염화나트륨 0.25%, 아데닌 100㎎/l, 구아닌100㎎/l, pH 7.2

플라스크 발효배지: 글루타민산 나트륨 0.1%, 암모늄클로라이드 1%, 황산마그네슘1 .2%, 염화칼슘 0.01%, 황산철 20㎎/l, 황산망간 20㎎/l, 황산아연 20㎎/l, 황산구리 5㎎/l, L-시스테인 23㎎/l, 알라닌 24㎎/l, 니코틴산 8㎎/l, 비오틴 45㎍/l, 티아민염산 5㎎/l, 아데닌 30㎎/l, 인산(85%) 1.9%, 포도당4.2%, 원당 2.4% 되게 첨가하여 사용

배양 종료 후 HPLC를 이용한 방법에 의해 IMP의 생산량을 측정하였으며, 배양액 중의 5'-이노신산 결과는 아래 표 2와 같다.

균주명	Cell OD (배양 5일후)	생산성(g/l/hr) (배양 5일후)
대조군(CJIP2401)	31.2	0.136
CN01-0118	32.4	0.152
CN01-0300	31.5	0.145

배지 내 IMP 축적량을 모균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401 균주와 비교한 결과, 코리네박테리움 암모니아게네스 CN01-0118과 CN01-0300 균주들이 동일한 조건하에서 모균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401 균주 대비 단위 시간당 생산하는 IMP의 생산성이 10.6~11.2% 증가함을 나타낸다.

실시예 12: 이노신 삼각 플라스크 발효역가 시험

하기 종배지 3㎖를 지름18㎜ 시험관에 분주하고 가압 살균한 후, 모균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIS-H273 균주와 당 특허에서 제작된 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0049, CN04-0050 균주들을 접종하고 30℃ 온도에서 24시간 진탕 배양하여 종 배양액으로 사용하였다. 하기 발효배지 27㎖를 250㎖ 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 120℃ 온도에서 10분간 가압살균 후 종배양액 3㎖을 접종한 다음 5 내지 6일 동안 배양하였다. 배양 조건은 회전수 220rpm, 온도 32℃, pH 7.2 로 조절하였다.

상기 종배지 및 발효배지의 조성은 다음과 같다.

종배지: 포도당 5%, 펩톤 0.5%, 육즙 0.5%, 염화나트륨 0.25%, 효모 추출물 1%, 아데닌 100㎎/l, 구아닌 100㎎/l, pH 7.2

플라스크 발효배지: 글루타민산나트륨 0.1%, 암모늄클로라이드 1%, 황산마그네슘 1.2%, 염화칼슘 0.01%, 황산철 20㎎/l, 황산망간 20㎎/l, 황산아연 20㎎/l, 황산구리 5㎎/l, L-시스테인 23㎎/l, 알라닌 24㎎/l, 니코틴산 8㎎/l, 바이오틴 45㎍/l, 티아민염산염 5㎎/l, 아데닌 50㎎/l, 구아닌 30㎎/l, 인산(85%) 1.9%, 과당, 포도당 및 당밀을 혼합하여 환원당으로 6%가 되게 첨가하여 사용, pH 7.2

배양 종료 후 HPLC를 이용한 방법에 의해 이노신의 생산량을 측정하였으며, 배양액 중의 이노신 결과는 아래 표 3과 같다.

균주명	Cell OD (배양 5일후)	생산성(g/l/hr) (배양 5일후)
대조군(CJIS-H273)	70.1	0.100
CN04-0049	69.8	0.113
CN04-0050	68.7	0.121

배지 내 이노신 축적량을 모균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIS-H273 균주와 비교한 결과, 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0049 와 CN04-0050균주가 동일한 조건하에서 모균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIS-H273 균주 대비 단위 시간당 생산하는 이노신 생산성이 11.3~12.1% 증가함을 나타낸다. 또한 XMP 생산 균주 및 IMP 생산 균주의 경우와는 달리, 이노신 생산 균주의 경우 모든 퓨린 유전자의 증폭된 조합이 생산 수율의 증진 폭이 가장 큼을 알 수 있었다.

도 1은 코리네박테리움 염색체내 삽입용 벡터 pDZ 벡터를 나타낸다.

도 2는 코리네박테리움 염색체내 삽입용 벡터 pDZ-2purFM을 나타낸다.

도 3은 코리네박테리움 염색체내 삽입용 벡터 pDZ-2purDB를 나타낸다.

도 4는 코리네박테리움 염색체내 삽입용 벡터 pDZ-2purNH를 나타낸다.

도 5는 코리네박테리움 염색체내 삽입용 벡터 pDZ-2purSL을 나타낸다.

도 6은 코리네박테리움 염색체내 삽입용 벡터 pDZ-2purKE를 나타낸다.

도 7은 코리네박테리움 염색체내 삽입용 벡터 pDZ-2purC를 나타낸다.

<110> CJ Cheiljedang Corporation <120> Microorganisms of corynebacterium having enhanced nucleotide or nucleoside productivity and method of producing nucleotide or nucleoside using the same <130> PA08-0233 <160> 44 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 cgacgagaat tccccgaccc gcatgagatg 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gtatcgtcta gagcggtagc ggtggcttcg 30 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cgacgatcta gacccgaccc gcatgagatg 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gtatcgaagc ttgcggtagc ggtggcttcg 30 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gctatcgttt cccctgaa 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tgattctact aagtttgc 18 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ggcacaagct 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<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 tcgatgcctg catcttgg 18 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 ggcgataagg cttcgagt 18 <210> 18 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gctcggatcc gcgatactca gccccagcaa cagcagaaaa tgaagc 46 <210> 19 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 cagcgtcgac gcagccgtcg caggcaccat cgcagcagt 39 <210> 20 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 cagcgtcgac gcgatactca gccccagcaa cagcagaaaa tgaagc 46 <210> 21 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 gctcggatcc gcagccgtcg caggcaccat cgcagcagt 39 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 acttgacctc cagcccta 18 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 aagaacaacg tcggcgtc 18 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 acgtcaggat cccctatcgt gctttgctgt 30 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 ctctaaggta ccattggtac tagtagccgc 30 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 acgtcaggta cccctatcgt gctttgctgt 30 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 ctctaatcta gaattggtac tagtagccgc 30 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 ccagctgggg ttccggtt 18 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 tttcgatgcg cttcgttt 18 <210> 30 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 gctcggatcc cgcagtggct gttgcgctga acatgcg 37 <210> 31 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 gcaggtcgac cacggacata tcggtttgct tcacgcggg 39 <210> 32 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 gcaggtcgac cgcagtggct gttgcgctga acatgcg 37 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 gagcgcttgt ccggcaagcg tttc 24 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 ggtggttgcg gtaagaaccc ggcc 24 <210> 35 <211> 1500 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 35 gtggtgaaca ctactttccc cagcgacgtg aatttagatg accaaggcga gcaagaaccc 60 cgcgaagagt gcggtgtctt tggcgtctgg gctcctggtg aagatgttgc gacactgacc 120 tactttggtc tgttcgcatt gcagcatcgt gggcaggaag ctgcaggtat cggcgtcggt 180 gatggagacc gcctcgttgt cttcaaagac atgggcttgg tctcgaatat tttcgatgag 240 tccattttaa attccctcca tggctccgtg ggcgtggggc atacgcgcta ctcgactgcc 300 ggtggcaaag agtggtcgaa tgtccagccg atgtttaata ccacctcaaa tggggtagac 360 atcgctttgt gccacaacgg caacttggtg aactaccaag aactgcgcga tgaagcagta 420 gctctgggac tttaccgaga gaatgaaaaa tccctgtcgg attccatgat catgacagct 480 ttgctggcgc acggagtcgg ggaaggcaac tctgtctttg acgccgctaa gcaactgctg 540 ccaagcatca aaggcgcttt ttgcttgacc tttaccgatg gcaagacctt gtacgccgcg 600 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ggtctgcgag ccggtagcta agcaaatggt cgagcgcgga 780 accccatact ccggcctgct gtacgcaggt ctggcatggg gccaagaagg cccctccgtc 840 attgagttca actgccgctt cggcgaccca gaaacccagc cgctgctgtc gctgttgaag 900 acgccgctgg caggggttct caacgcagtt gcaaccggaa ctctcgacga acttcctgcg 960 ctggagtggg aagacgccta tgccgtgacc gtagtgctgg cggctgcgaa ttatccagaa 1020 tctccacgca agggcgatgc catcacctcg ccagatctgg cagataccga caagattttg 1080 cacgcgggta ccgcggtaaa ggacgcagag gttatctcca atggcggtcg cgtgcttaac 1140 gtaatcggca agggtgagac cctatctgcc gcgcgcgctg ccgcgtatga ggtgctcgag 1200 aacattgagc tggcggatag cttctaccgc accgacattg gccaagctgc tgaagaaggt 1260 cgcatcagca ttgactctta g 1281 <210> 37 <211> 606 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 37 gtgactgaat cgccttcgca agttttgaaa gcacaagacc cgcttcaagt agtggtgctg 60 gtatctggca ccggatcttt gctgcaaaat attatcgaca accaagatga ctcctatcgg 120 gttatcaagg tagtcgcgga taagccctgc ccggggatta accgagccca agatgcaggc 180 atcgacaccg aagtcgtgct tttaggctca gaccgcgcgc agtggaacaa agaccttgtc 240 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120 cgcccaaccg atgctgagct gacggtttac tccgtgatgt ggtcggagca ctgctcttac 180 aagtcttcca agacccacct acgctacttt ggcgagacca ccactgagga aatggcgtcg 240 aagattcttg ccggtatcgg tgagaacgct ggtgtcgttg acatcggcga cggtgacgca 300 gtgaccttcc gcgtcgaatc ccacaaccac ccatccttcg tcgagcctta ccagggtgcc 360 gcgaccggtg ttggcggcat cgtccgcgac atcatggcga tgggtgcacg tccaatcgca 420 gtgatggatc agctgcgctt cggcccagct gatgccccgg ataccgcacg tgttctgccg 480 ggcgttgttt ccggcatcgg cggttacggc aactccctcg gcctgccgaa catcggcggc 540 gagaccgtct ttgatgagtc ttatgccggc aacccactgg tcaacgcact gtgcgtgggt 600 accttgcgcg tggaagacct gaagctggct tttgcttccg gtactggcaa caaggtgatg 660 ctctttggct cccgcacggg cctcgacggc atcggcggcg tatccgtttt gggttctgct 720 tccttcgaag aaggcgaaga gcgcaagctt cctgcagtcc aggtcggcga cccattcgcg 780 gaaaaagtcc tcatcgaatg ctgcctggag ctctacgctg cgggcgtcgt tgtcggtatt 840 caggaccttg gtggcggtgg cctcgcatgt gcgacctctg agctggcagc agctggcgac 900 ggcggcatgg tggtcaacct ggataatgtt ccactgcgtg cagagaacat gtccgccgca 960 gaaatcctgg cttccgaatc ccaggagcgc atgtgtgctg ttgtctcccc agataacgtg 1020 gagaagttcc gcgagatctg tgaaaagtgg gacgtaacgt gtgctgaaat cggtgaagtt 1080 accgataaga aagacaccta cctcgtgtac cacaacggtg agctggtagt agacgctccg 1140 ccatcaacta tcgatgaagg ccctgtctac gagcgcccat acgcacgccc tcagtggcag 1200 gatgagatcc agcaggctcc ggaaattgca cgtccggaat ccttggtaca ggcattcaag 1260 gacatggtgt cctccccagc tctgtcatcg cgtgcattta tcactgagca gtatgaccgc 1320 tacgtgcgcg gtaacaccgt caaggcgaag cagtctgact ccggcgttct gcgtatcaat 1380 gaggaaactt ctcgcggtgt cgcaatttct gccgatgcct ccggtcgcta caccaagctg 1440 gacccaaaca tgggtgcacg tttggcgctg gctgaggcat accgcaacgt tgctgtgacc 1500 ggcgcacgac catatgcggt gaccaactgc ttgaacttcg gttctccaga aaacaccgac 1560 gtgatgtggc aattccgcga ggccgttcac ggtctggctg acggttctaa ggaactgaat 1620 atcccagtct ccggcggtaa cgtctccttc tacaaccaga ctggtgatga gccaattctg 1680 ccgaccccag ttgttggcgt gctcggtgtc attgatgatg ttcacaaggc actggcacat 1740 gacttgggcg gcattgatga gcctgaaacc ctgattctgc ttggtgagac caaggaagaa 1800 ttcggcggct ccatctggca gcaggtctcc ggcggcggcc tgcagggtct gccaccacag 1860 gtggatctgg cgaatgaggc aaagctggcg gacttcttcg tcggcaacac ctccgttgca 1920 gcctcccacg acctctctga gggcggtctg gctatcgcgg cgtttgagat ggcgcaaaag 1980 aacaacgtcg gcgtcgacct tgatttgagc gttgtacacg aggatgcact gaccgcactg 2040 tttagtgagt ccgcatcgcg tgttctgatt tccaccgcgt ctgaccacct cgatggaatc 2100 ttgcagcgtg cttccgagct gggcattcca gctgtcgtgg taggaaccac caatgattcc 2160 ggcaacatca ccttcgctgg tgaagaagtt gctaccgctg agctgcgcga ggcatggtct 2220 gcaaccttgc caaacctgtt tggccacgct gttggcgcta attccgtagt cgaataa 2277 <210> 40 <211> 1056 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 40 atgtctgaaa atacttacgc cgcggcaggc gtcaacattg aagaaggcga ccgcgccgtt 60 gagcttttcg ctccactggc taagcgcgct acccgtccag aggtaatggg tggactcggt 120 ggcttcgcgg gactgtttaa gctcggcgaa tacaaagagc caatccttgc agctggctcc 180 gacggcgtgg gcaccaagct cgccgttgcc caggcaatgg ataagcacga caccatcggc 240 attgacctgg ttgcaatgtg cgtcgatgac ttggtcgtgt gtggtgctga gccactattt 300 ctccaggact acatcgcagt aggcaaggtt gttccggaaa aggttgcgca gattgttgcc 360 ggtattgctg agggctgcgt gcaggcaggc tgtgcacttc ttggtggcga gaccgctgag 420 cacccgggcg taatgaatga aaaggactac gatgtttccg ccaccgctgt cggcgttgtc 480 gaagcagacg agcttctcgg accagacaag gttcgcgacg gcgatgtttt gattgccatg 540 ggctcatccg gactgcactc caatggttac tccttggcgc gccacgtctt gttagagcag 600 gcaggattgc cgctcgatgg ctacatcgat gaccttggcc gcacgcttgg tgaagagctc 660 ctggagccga cccgcatcta cgccaaggac tgcctggcgc tagtttctga gtgtgacgtt 720 gctactttct gccacgtcac cggcggtggc ttggcaggca acctcgagcg cgtgctacct 780 gaaggccttg tcgcagaggt taaccgcgca tcgtggaccc cagcagcgat tttccgcacc 840 atcgcgtctt tcggcaaggt cagcctggaa gagatggaaa agaccttcaa catgggcgtt 900 ggcatgatcg ctatcgtttc ccctgaagac cgtgaccgcg ccttggcgat gctaactgcg 960 cgccacgttg atgcatggga gctgggctcg gttcgcacca agaaggaaga cgacaccgca 1020 ggtgttgtca tgcaaggtga gcactctaac ttctaa 1056 <210> 41 <211> 1779 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 41 atgaaacgcg tgagtgaaca agcaggaaac ccagacggaa accctcaagc 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tggaccctag atggttctgt gacctcccaa tttgagcagc acctgcgcgc ggtgatggat 960 gagccactgg gggatacatc cacgcttgcc ccagtcaccg tgatggccaa cgtcttaggc 1020 gctgacgaag acccaaagat gccaatgggc gagcgtgccc gagaagtggc gcgccgcttc 1080 ccgcgagcca aagtccatct ctacggcaag gggcatcgcc caggccgtaa gattggccac 1140 gtgaacctca ccggtgagga cgtagaggca acccgtcgcg atgctcgctt ggctgcggat 1200 ttcctcgtga acgccgcgtg gtctgataac tggtccgcta aatagcaaga tgtatcaaga 1260 tatataagga aagaaatgac tgcaccgcta gttgggctca tcatgggctc tgattctgat 1320 tggccaaccg ttgaaccagc agctgaggtt ctcgccgaat tcggtgttcc ttttgaggtg 1380 ggcgtggtct ctgcgcaccg cacgccggaa aagatgctgg attacgccaa gcaagcccac 1440 actcgcggca tcaaggtgat tgttgcttgt gccggtgggg cagcgcacct accaggcatg 1500 gtggctgcag caactccttt gccagttatt ggtattccac gtgccttgaa agatttggaa 1560 ggtctggact ctttgctgtc tatcgtgcag atgccagctg gggttccggt tgcgaccgtg 1620 tctatcggcg gcgctaagaa tgctggcttg ctcgccatcc gtaccctggg cgtgcagtac 1680 tcagaattgg ttgaacgcat ggccgattac caagaaaata tggccaagga agttgagcaa 1740 aaagacgcca atcttcgcgc caagctcatg ggggactag 1779 <210> 42 <211> 888 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 42 atgcgcccac agctttctga ttatcagcac gtatcctccg gcaaagtccg cgatatctac 60 gaagtagatg acaacacttt gctcatggtg gtcaccgacc gcatctccgc ctatgacttc 120 gcactagagc cagccatccc cgataaaggc cgggttctta ccgcaaccac catgttcttc 180 ttcgacgcca tcgatttccc gaaccatttg gcaggaccca tcgatgatgc gcggattcca 240 gaagaagtat tgggccgagc gatcatcgtt aagaagctca acatgctgcc ctttgagtgc 300 gttgcccgcg gttacctcac cggttccggc ttgaaggaat acaacgctaa cggcaccgtg 360 tgcggcatcg agctgccaga aggcttggtt gaggcgtcgc gtctgccaga gccaattttc 420 accccagcca ccaaggcaga gcagggcgac cacgatgaaa acgtcagctt cgagcgcgtg 480 gtgcaggacc ttggccaaga gcgcgcagag cagcttcgcg atgaaaccct gcgcatctac 540 tccgccgccg ccaagattgc cgaagaaaag ggcatcatct tggctgatac gaagtttgaa 600 ttcggccttg attccgaagg caatctggtc ttgggcgatg aagtacttac gcctgattcc 660 tcccggtact ggccagcaga cacctacgcg gaaggcattg tgcagcccag ctttgacaag 720 cagtacgtgc gcaactggtt gacctcggag gaatccggct gggatgtgga gtcggaaacc 780 cagccgccag tgcttcccga tgacatcgtc gccgccaccc gcctgcgcta catcgaggct 840 tatgagcgct tgtccggcaa gcgtttcatc gacttcattg gcggttaa 888 <210> 43 <211> 1440 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 43 atgaagcccg tggctgataa gaagaagatt tccaacgttt tgtcctcgcg ttacgcctct 60 gcagagttat ccaacttgtg gagcccggaa cacaaaatca tcatggagcg ccagctctgg 120 atcgcggtca tgcgcgccca gaaagacctc ggcgttgaca ttccatctga agcaattgac 180 gcatacgaag cagtcattga ccaggtagac ctaggttcca tcgcggatcg tgagcgcgtg 240 acgcgccatg acgtgaaagc tcgcatcgaa gaattcaacg cgctggctgg tcatgagcac 300 attcacaagg gcatgacctc ccgtgacctg acggagaacg tcgagcagct gcaaatctac 360 cgctccctgg agctcattcg tgataaagcc atcgcggttg cagcgcgcat tggtgagcac 420 gccgcgaaat accagacttt ggtcatggcg ggccgctctc acaacgttgc cgcgcaggcg 480 accaccttgg gtaagcgttt cgcatcggct ggtgatgaaa tgctgctcgc cattgagcgc 540 gtagaaaacc tccttgcccg ctacccactg cgcggcatca agggaccaat gggcacttcc 600 caggacatgc tggacttgat gggcggcgac gaaaacaagc tcgcagcgct cgaaaccgac 660 atcgcggacc acttgggctt tgcccgcgtg ttcaactcgg tgggccagat ttacccacgc 720 acccttgatt ttgatgcggt ttccgcgctg gttgagctgg gtgcctcgcc atcgtctctg 780 gctaccacca tccgcttgat ggccggcaac gaaaccgtca ccgaaggttt caaggaaggc 840 caagttggct cttccgcgat gccgcacaag atgaatgccc gctcctgcga acgcgtcggt 900 ggcctccagg ttatcttgcg cggctacctg actatggttg cagaccttgc tggtcagcag 960 tggaacgaag gcgacgtatt ctgctcggtg gttcgccgtg tagccctgcc ggacgctttc 1020 ttcgccatcg atggccagtt tgaaaccttc cttaccgtgt tggatgagtt cggcgcattc 1080 ccagcaatga tcgaccgcga actcgagcgc tacctgccat tcttggccac cacccgcatc 1140 cttatggctg cggtgcgcgc aggcgttggc cgcgaaaccg cacacgaagt catcaaggaa 1200 aacgcagtgg ctgttgcgct gaacatgcgc gaaaacggcg gggaacaaga cctactggag 1260 cgccttgctg ccgatgagcg cctgcccatg agcaaggaac agctcgaaga agcactcgct 1320 gacaagcacg cgtttatcgg cgctgctgaa tcccaggtag atgcagttct tagacgcatt 1380 aaggaactcg cggaccagca tccgaaggcg gccgcctaca ccccaggcga aatcttgtaa 1440 1440 <210> 44 <211> 1551 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 44 atgagtgatg accgcaagca gatcaagcgt gcactaatta gcgtttatga caagacaggg 60 ctcgaagagc tcgctcgcac gcttgacagc gcaggcgtag agattgtgtc caccggctcc 120 accgccgcca agattgctga tcttggtatt aacgtcactc cggttgaatc tctcaccgga 180 ttcccagagt gcctcgaagg ccgcgttaag accttgcacc cacgcgtgca tgcgggcatt 240 ttggctgata cccgcaagcc ggatcacctt aatcagctgg aagagcttga gattgagcca 300 ttccagttgg tcgtggttaa cctgtaccca tttaaagaga ctgtagcttc tggcgcagac 360 ttcgatggtt gcgtcgagca gattgatatc ggcggtccat ccatggtccg tgctgctgcc 420 aagaaccacc catcggtggc ggttgttgta gacccagcgc gttacggcga catcgctgag 480 gctgtcgctc agggcggatt cgatctggcg cagcgtcgtc agctggccgc gactgcgttt 540 aagcacacgg cagattatga tgttgcagtt tctggctggt ttgcccagca gcttgccgat 600 gactctgttg cctctgctga gcttgaaggc gacgcgctgc gttatggtga gaaccctcac 660 cagcaggctt ccatcgttcg tgaaggcacg accggtgttg ctaatgcgaa gcagctgcac 720 ggtaaggaaa tgagctacaa caactaccag gacgcggatg ccgcatggcg cgcggcttgg 780 gatcatgaac gtccatgtgt agcaattatt aagcacgcta acccttgcgg tatcgctgtt 840 tctgatgagt ccatcgcagc agcacacgca gcggcacacg cctgtgaccc aatgtccgct 900 ttcggtggcg ttattgcggt caaccgcgaa gtcaccaagg aaatggcaac ccaggttgct 960 gacatcttca ccgaggtcat catcgcaccg tcctacgaag atggagccgt cgagattttg 1020 cagggcaaga agaatattcg catccttgtt gctgagcatg aagtaccagc agtagaggtc 1080 aaagaaatct ctggtggccg tctgctgcag gaagcagacg tttaccaggc tgagggcgat 1140 aaggcttcga gttggacttt ggctgccggc gaagctgcat ccgaggaaaa gctcgcggag 1200 ctggaattcg cttggcgcgc agtacgctcg gtaaagtcca acgccatctt gttggcgcat 1260 gaaggtgcaa ccgttggcgt gggtatgggc caggtcaacc gcgttgattc ggcgaagttg 1320 gctgttgacc gcgcgaatac tttggctgat tccgcagagc gtgctcgcgg ttccgtcgca 1380 gcatcggatg cgttcttccc attcgccgat ggcttgcagg tgcttatcga tgccggcgtt 1440 tccgccgttg tccagcccgg cggctccatc cgcgatgaag aagttattgc tgccgctgaa 1500 gcagccggta tcaccatgta cttcactggc acccgccact tcgcgcacta a 1551

Claims (13)

1. ⅳ)포스포리보실포밀글리신아미딘 신세타아제 및 ⅴ)포스포리보실포밀글리신아미딘 신세타아제 Ⅱ 효소 활성이 강화됨과 동시에, ⅰ)포스포리보실피로포스페이트 아미도트랜스퍼라아제, ⅱ)포스포리보실아민 글리신 리가아제, ⅲ)포스포리보실글리신아마이드 포밀트랜스퍼라아제, ⅵ)포스포리보실아미노이미다졸 신세타아제, ⅶ)포스포리보실아미노이미다졸 카복실라아제, ⅷ)포스포리보실아미노이미다졸 썩시노카복사마이드 신세타아제, ⅸ)아데닐로썩시네이트 리아제, 및 ⅹ)이노신산 싸이클로하이드롤라아제의 군으로부터 선택된 두개 또는 그 이상의 효소 활성을 강화시킴으로써 핵산계 물질인 5'-크산틸산(XMP) 또는 5'-이노신산(IMP) 또는 이노신의 생산능이 향상된 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 미생물.
2. 제1항에 있어서,

   ⅱ)포스포리보실아민 글리신 리가아제, ⅲ)포스포리보실글리신아마이드 포밀트랜스퍼라아제, ⅳ)포스포리보실포밀글리신아미딘 신세타아제, ⅴ)포스포리보실포밀글리신아미딘 신세타아제 Ⅱ, ⅸ)아데닐로썩시네이트 리아제 및 ⅹ)이노신산 싸이클로하이드롤라아제의 효소 활성을 강화시키는 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 미생물.
3. 제2항에 있어서,

   부가적으로 ⅰ)포스포리보실피로포스페이트 아미도트랜스퍼라아제 및 ⅵ)포스포리보실아미노이미다졸 신세타아제의 효소 활성을 더 강화시키는 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 미생물.
4. 제2항에 있어서,

   부가적으로 ⅶ)포스포리보실아미노이미다졸 카복실라아제 및 ⅷ)포스포리보실아미노이미다졸 썩시노카복사마이드 신세타아제의 활성을 더 강화시키는 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 미생물.
5. 제1항에 있어서,

   i)포스포리보실피로포스페이트 아미도트랜스퍼라아제, ⅱ)포스포리보실아민 글리신 리가아제, ⅲ)포스포리보실글리신아마이드 포밀트랜스퍼라아제, ⅳ)포스포리보실포밀글리신아미딘 신세타아제, ⅴ)포스포리보실포밀글리신아미딘 신세타아제 Ⅱ, ⅵ)포스포리보실아미노이미다졸 신세타아제, ⅶ)포스포리보실아미노이미다졸 카복실라아제, ⅷ)포스포리보실아미노이미다졸 썩시노카복사마이드 신세타아제, ⅸ)아데닐로썩시네이트 리아제 및 ⅹ)이노신산 싸이클로하이드롤라아제의 활성 모두를 강화시키는 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 미생물.
6. 제1항에 있어서,

   상기 효소들을 암호화하는 유전자는 각각 purF, purD, purN, purS, purL, purM, purKE, purC, purB 및 purH이며, 상기 각각의 유전자들은 서열번호 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 및 44의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 미생물.
7. 삭제
8. 제1항에 있어서,

   상기 효소의 활성은 코리네박테리움 속 미생물이 천연상태로 가지고 있는 내재적 purF, purD, purN, purS, purL, purM, purKE, purC, purB 및 purH 유전자 각각에 더하여 1개 이상의 purF, purD, purN, purS, purL, purM, purKE, purC, purB 및 purH 유전자 각각이 더 도입됨으로써 강화되고, 상기 유전자들은 서열번호 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 및 44의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 미생물.
9. 제1항에 있어서,

   상기 코리네박테리움 속 미생물은 도 2, 3, 4, 5, 6 및 7의 개열지도를 가지는 벡터 pDZ-2purFM, pDZ-2purDB, pDZ-2purNH, pDZ-2purSL, pDZ-2purKE 및 pDZ-2purC로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 또는 그 이상의 벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 미생물.
10. 삭제
11. 제1항에 있어서,

    상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 암모니아게네스 CN01-0118 (KCCM10965P)인 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 미생물.
12. 제1항 내지 제6항, 제8항 내지 제9항 및 제11항 중 어느 한 항에 따른 코리네박테리움 속 미생물을 배양하고, 그 배양액으로부터 핵산계 물질인 5'-크산틸산(XMP) 또는 5'-이노신산(IMP) 또는 이노신을 생산하는 방법.
13. 삭제

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