ES2567278T3

ES2567278T3 - Una cepa de corinebacterias para el aumento de la productividad de 5'-guanosín monofosfato y un procedimiento de producción de 5'-guanosín monofosfato utilizando la misma

Info

Publication number: ES2567278T3
Application number: ES09833644.9T
Authority: ES
Inventors: Jinman Cho; Hye Won Kim; Yoon Seok Oh; Jang Hee Park
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2008-12-17
Filing date: 2009-12-17
Publication date: 2016-04-21
Anticipated expiration: 2029-12-17
Also published as: CN102300982A; JP2012511924A; WO2010071366A2; US20110250651A1; WO2010071366A3; EP2358865A2; DK2358865T3; KR20100070218A; CN102300982B; KR101072720B1; EP2358865B1; EP2358865A4; US8530200B2; JP5543488B2

Abstract

Un procedimiento de producción de guanosín 5'-monofosfato (GMP), que comprende: (a) cultivar una cepa de corinebacterias con productividad de ATP mejorada que tiene mayor actividad malato deshidrogenasa que la de la cepa de corinebacterias de tipo silvestre, para preparar de esta manera una solución de cultivo que incluye ATP y xantosín 5'-monofosfato (XMP), en la que la malato deshidrogenasa está codificada por un gen mqo de Corynebacterium, se aumenta la actividad malato deshidrogenasa aumentando el número de copias del gen mqo o sustituyendo un promotor del gen mqo; (b) mezclar la solución de cultivo con XMP aminasa o un microrganismo que tenga actividad XMP aminasa y cultivar la mezcla resultante, para de esta manera convertir el XMP en GMP; y (c) obtener GMP de la mezcla.

Description

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DESCRIPCIÓN

Una cepa de corinebacterias para el aumento de la productividad de 5’-guanosín monofosfato y un procedimiento de

producción de 5’-guanosín monofosfato utilizando la misma

Campo técnico

5 La presente invención se refiere a una cepa de corinebacterias que tiene una actividad malato deshidrogenasa mayor que la endógena la cual puede por lo tanto producir ATP con alto rendimiento. La presente invención también se refiere a un procedimiento de producción de guanosín 5’-monofosfato que utiliza la cepa de corinebacterias en combinación con una enzima o microrganismo que tiene actividad de aminación.

Técnica antecedente

10 El guanosín 5’-monofosfato (de aquí en adelante designado “GMP”) es un aditivo alimentario que se utiliza ampliamente como potenciador del sabor, igual que el inosín monofosfato (de aquí en adelante designado “IMP”). El GMP da lugar a un sabor umami y su uso depende del glutamato monosódico (MSG) que también se utiliza. A menudo se utiliza de manera sinérgica con IMP para aumentar la intensidad del sabor umami del MSG.

Ejemplos de los procedimientos para la preparación de GMP que se conocen hasta ahora incluyen (1) la

15 degradación enzimática del ARN de levaduras, (2) fermentación por microorganismos directa a GMP, (3) fermentación por microorganismos a guanosina, seguida por fosforilación química, (4) fermentación por microorganismos a guanosina, seguida por fosforilación enzimática, (5) fermentación por microorganismos a xantosín 5’-monofosfato (de aquí en adelante designado “XMP”), seguida por la conversión en GMP por una cepa de corinebacterias y (6) fermentación por microorganismos a XMP, seguida por la conversión de XMP a GMP por

20 Escherichia coli, la cual tiene actividad aminasa. De estos, el procedimiento (1) tiene dificultades de suministro de material y no es rentable económicamente y el procedimiento (2) sufre la desventaja de tener un bajo rendimiento debido a la permeabilidad de membrana del GMP. Por lo tanto, los otros procedimientos se utilizan ampliamente en aplicaciones industriales.

Para el procedimiento (6) en el que se produce XMP y se convierte en GMP, es crítico proporcionar ATP como

25 cofactor. La mayoría del ATP que se utiliza en la conversión de XMP a GMP se suministra a partir de una cepa productora de XMP. En la estrategia de conversión, el xileno tiene un importante papel debido a que aumenta la permeabilidad de la membrana al ATP y XMP. El xileno en el medio permite que el ATP y XMP penetren en una cepa productora de GMP, seguido por la conversión de XMP en GMP. Por lo tanto, la estrategia de producción de GMP se sirve de la estrategia de aumento de la productividad de ATP.

30 La conversión a partir de XMP en GMP se representa por la siguiente fórmula de reacción:

XMP + ATP + NH3 > GMP + AMP + PPi

XMP Aminasa

Es decir, es esencial un suministro continuo de ATP, que funciona como cofactor, para el proceso de producción de GMP en el que primeramente se produce XMP por una cepa productora de XMP y luego se convierte en GMP en

35 presencia de una enzima o microorganismo que tiene actividad XMP aminasa. Por lo tanto es muy importante aumentar la productividad de ATP de la cepa productora de XMP. El AMP producido en el proceso de conversión se reutiliza como sustrato para la producción de ATP. De hecho, los nucleótidos que se basan en adenina se reciclan para la producción de ATP.

Por lo tanto, es necesario el aumento de productividad de ATP de la cepa productora de XMP para la producción de

40 alto rendimiento de GMP. La actividad de la malato deshidrogenasa tiene una gran influencia en la producción de GMP. Sin embargo, no hay microorganismos ni procedimientos que estén diseñados para aumentar la actividad de la malato deshidrogenasa para aumentar el rendimiento de la producción de GMP en ningún sitio que se mencione en documentos previos.

El documento KR 2007 0056491 A se refiere a un microorganismo tal como Corynebacterium ammoniagenes que

45 tiene un gen codificante de 5’-fosforibosil-I-pirofosfato amidotransferasa y un procedimiento para producir xantosín 5’-monofosfato con una alta concentración y un alto rendimiento que utiliza el mismo.

Teniendo en mente que es importante aumentar la productividad de ATP de la cepa productora de XMP con el fin de aumentar el rendimiento de GMP con prioridad sobre la conversión en dos etapas, los presentes inventores realizaron una investigación intensiva y descubrieron un gen que es responsable del aumento. También se

50 descubrió que cuando se utilizaba en combinación con XMP aminasa, una cepa de corinebacterias transformada con un vector recombinante que portaba dos copias del gen en tándem, podía producir XMP y ATP con alto rendimiento, aumentando de esta manera la productividad de GMP.

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Divulgación

Problema técnico

Por lo tanto es un objetivo de la presente invención proporcionar una cepa de corinebacterias que tenga actividad malato deshidrogenasa mayor que la endógena que por lo tanto pueda producir ATP con altos rendimientos.

5 Es otro objetivo de la presente invención proporcionar un procedimiento para producir GMP, que comprenda: cultivar el microorganismo transformado; producir XMP en el cultivo; añadir al cultivo una enzima o microorganismo que tenga actividad de aminación de XMP; y obtener GMP del cultivo.

Solución técnica

De acuerdo con un aspecto de la misma, la presente divulgación se refiere a una cepa de corinebacterias con un

10 aumento de actividad malato deshidrogenasa sobre la endógena, produciendo de esta manera ATP con altos rendimientos. La cepa de corinebacterias de la presente invención está modificada para que tenga una actividad malato deshidrogenasa mayor que la actividad endógena, lo que da como resultado un aumento de la productividad de ATP.

La expresión “malato deshidrogenasa”, como se utiliza en el presente documento, significa una enzima que cataliza

15 la conversión de malato en oxaloacetato por deshidrogenación. Esta enzima se encuentra en un amplio espectro de organismos vivos acompañada por la lactato deshidrogenasa y necesita para su actividad DPN y NAD como cofactores, estos se acompañan habitualmente por lactato deshidrogenasa. En la cepa de corinebacterias de acuerdo con la presente invención, la actividad de la malato deshidrogenasa está aumentada para producir ATP con alto rendimiento, lo que da como resultado un aumento de la productividad de GMP.

20 Como se utiliza en el presente documento, se pretende que la expresión “actividad endógena” se refiera a la actividad enzimática de interés en un microorganismo de tipo silvestre.

La expresión “mayor que la actividad endógena” significa el aumento de la actividad enzimática en comparación con la actividad de la variedad endógena, tanto si resulta de un aumento de la actividad de la enzima por sí misma o por un gen endógeno o por un gen ajeno. Por ejemplo, se puede conseguir un aumento de la actividad enzimática por

25 cualquier procedimiento bien conocido en la técnica, que incluye, pero no se limita a, el aumento o disminución del número de copias genéticas, sustitución, modificación o mutación de un promotor de interés, etc.

La enzima malato deshidrogenasa diana cuya actividad se desea aumentar de acuerdo con la presente invención está codificada por el gen mqo de corinebacterias. Siempre que sea biológicamente idéntico o se corresponda con el gen mqo, se puede utilizar cualquier derivado o análogo en la presente invención. Es decir, si su actividad es 30 sustancialmente la misma o similar a la del gen mqo, cualquier gen que entre en el intervalo del gen mqo es útil en la presente invención. De manera ventajosa, el gen útil en la presente invención comparte al menos un 70%, más preferentemente al menos un 80%, incluso más preferentemente un 90%, incluso mucho más preferentemente un 95%, y más preferentemente al menos un 98% de homología con la secuencia del gen mqo. De manera más ventajosa, la malato deshidrogenasa está codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7. El 35 aumento de copias genéticas se puede conseguir por la introducción de genes exógenos y/o la amplificación de los genes endógenos. El número de copias del gen pueden determinarlo fácilmente los expertos en la técnica de acuerdo con las necesidades y los fines. La amplificación del gen endógeno se puede llevar a cabo también utilizando un procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo, por cultivo en un medio selectivo adecuado bajo presión. En un ejemplo preferido, se introduce un vector que porta el gen que codifica la malato deshidrogenasa en

40 una cepa de corinebacterias para generar un microorganismo transformado con un aumento por encima de la actividad endógena.

Siempre que se conozca en la técnica y pertenezca al género de corinebacterias, se puede utilizar cualquier cepa en la presente invención sin limitación. Preferentemente, ejemplos de cepas de corinebacterias útiles en la presente invención incluyen Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, y

45 Brevibacterium lactofermentum, pero no se limita a estas. En detalle, entre las cepas de corinebacterias están Corynebacterium ammoniagenes ATCC6872, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum R, Brevibacterium flavum ATCC 14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 y derivados de las mismas. Se prefiere la Corynebacterium ammoniagenes KCJ-1304 transformada a partir de la Corynebacterium ammoniagenes KCCM-10530.

50 Se puede utilizar un vector recombinante que porte un gen mqo para generar un microorganismo capaz de producir ATP con alto rendimiento.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión “gen mqo”, una abreviatura de gen de la “malato:quinona oxidorreductasa”, significa un gen que codifica malato oxaloacetato que funciona oxidando el malato a oxaloacetato.

Se puede utilizar en la presente invención cualquier vector recombinante habitual, siempre que porte el gen mqo, sin 55 limitación. Es preferible el pDZ-mqo. En un ejemplo preferido de la presente invención, se empleó el gen mqo que

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contiene la SEQ ID NO. 7 para construir un vector pDZ-mqo recombinante (véase la FIG. 1).

El término “vector”, como se utiliza en el presente documento, significa una molécula de ADN que se utiliza como un vehículo para transferir material genético ajeno en una célula hospedadora adecuada y es una construcción de ADN que contiene elementos reguladores que permiten a un transgén recombinarse con un genoma hospedador. 5 Preferentemente, el vector recombinante que porta el gen mqo según la presente invención puede tener la estructura que se muestra en el mapa de escisión de la FIG. 1. El vector representado por el mapa de escisión de la FIG. 1 puede introducirse en corinebacterias secuencial o simultáneamente. De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, el vector recombinante se transforma en la Corynebacterium ammoniagenes KCCM-10530 que entonces se cultiva en un medio selectivo para permitir que se incorporen dos copias del gen

10 mqo en el genoma del hospedador por medio de recombinación homóloga, lo que resulta en la generación de una Corynebacterium ammoniagenes mutante, que se llama Corynebacterium ammoniagenes KCJ-1304. Que se depositó con el número de registro KCCM10972P.

De acuerdo con otro aspecto de la misma, la presente divulgación se refiere a una cepa de corinebacterias transformada con un vector recombinante que porta un gen mqo. El gen mqo derivado de corinebacterias puede

15 utilizarse usando un procedimiento de transformación que se conozca en la técnica sin limitación. Preferentemente, el gen mqo se clona en un vector para su uso en la transformación dentro de las células.

Se puede emplear cualquier procedimiento para la transformación que se conozca en la técnica. Como se utiliza en el presente documento, el término “transformación” es la alteración genética de una célula que resulta de la captación, incorporación genómica y expresión de un ADN ajeno. Los procedimientos típicos de transformación 20 incluyen la precipitación en CaCl2, un procedimiento de Hanahan en el que el efecto de la precipitación en CaCl2 se mejora por combinación con DMSO (dimetilsulfóxido), electroporación, transfección en fosfato cálcico, fusión en protoplastos, transformación mediada por fibra de carburo de silicio, transformación mediada por Agrobacterium, transformación mediada por PEG, sulfato de dextrano, lipofectamina y transformación mediada por inhibición/desecación. La transformación con pDZ-mqo de acuerdo con la presente invención no se limita a los

25 ejemplos de transformación, sino que se puede conseguir utilizando cualquier procedimiento que se conozca en la técnica sin limitación.

La Corynebacterium ammoniagenes KCCM10972P tiene dos copias del gen mqo incorporadas en el genoma de la misma como resultado de la introducción en su interior del pDZ-mqo que tiene la estructura que se muestra en el mapa de escisión de la FIG. 1 y la recombinación homóloga de dos copias del gen mqo con el gen endógeno.

30 De acuerdo con un aspecto adicional de la misma, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir GMP, que comprende: (a) cultivar la cepa de corinebacterias que tiene aumentada la actividad malato deshidrogenasa por encima de la actividad endógena, produciendo de esta manera ATP con alto rendimiento, en el que la malato deshidrogenasa está codificada por un gen mqo de Corynebacterium, la actividad de malato deshidrogenasa se aumenta aumentando el número de copias del gen mqo o sustituyendo el promotor del gen mqo;

35 (b) producir XMP en el cultivo; (c) añadir al cultivo una enzima o microorganismo que tiene actividad de aminación del XMP; y (d) obtener GMP del cultivo. En la presente invención, el XMP se produce con un alto rendimiento a partir del microorganismo transformado y luego se convierte en GMP en presencia de una XMP aminasa o un microorganismo que tiene actividad de aminación de XMP. Preferentemente, el microorganismo transformado es la cepa de corinebacterias que tiene un aumento de la actividad malato deshidrogenasa sobre la actividad endógena.

40 Se puede utilizar cualquier medio conocido en la técnica sin limitación en el cultivo de la cepa capaz de producir XMP o GMP. Preferentemente, el medio contiene glucosa como fuente de carbono y opcionalmente otras varias fuentes de carbono. Para su uso en el cultivo de un microorganismo de interés, un medio debe cumplir las necesidades de crecimiento del microorganismo. Los medios de cultivo para las cepas de corinebacterias se conocen en la técnica (por ejemplo, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology.

45 Washington D.C., EE. UU., 1981). Ejemplos de la fuentes de carbono útiles para las cepas de corinebacterias incluyen azúcares y carbohidratos tales como glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, almidón, celulosa, etc., aceites y lípidos tales como el aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cártamo, aceite de coco, etc., ácidos grasos tales como el ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, etc., alcoholes tales como glicerol, etanol, etc., y ácidos orgánicos tales como el ácido acético. Estas fuentes de carbono se pueden utilizar individualmente o en

50 combinación. Se pueden utilizar materiales orgánicos tales como peptona, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, agua de macerado de maíz, soja, etc., urea, y compuestos inorgánicos tales como el cloruro amónico, fosfato amónico, carbonato amónico y nitrato amónico, individualmente o en combinación, como fuentes de nitrógeno en el medio. Puede ser útil como fuente de fósforo, el fosfato dihidrógeno potásico o el fosfato hidrógeno potásico, o las sales sódicas correspondientes. Además, el medio de cultivo puede contener sales metálicas tales

55 como el sulfato magnésico, sulfato férrico, etc. Además, se pueden necesitar aminoácidos y/o vitaminas como elementos esenciales. El medio de cultivo también puede contener precursores adecuados. Estos materiales pueden añadirse al medio de una manera discontinua o de una manera continua.

Puede ajustarse el pH del medio de cultivo por compuestos básicos tales como el hidróxido sódico, hidróxido potásico, amoniaco, etc. o compuestos ácidos tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. Se puede utilizar un 60 agente antiespumante tal como un éster poliglicólico de ácido graso para evitar la generación de burbujas durante el

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cultivo. El medio se puede airear con oxígeno o un gas que contenga oxígeno (por ejemplo, aire) para mantener la condición aeróbica o con gas nitrógeno, hidrógeno o dióxido de carbono para mantener la condición anaeróbica. La temperatura de cultivo se mantiene habitualmente a 20 °C ~ 45 °C, y preferentemente a 30 °C ~ 35 °C. El cultivo continúa hasta que se obtiene la máxima cantidad de XMP o GMP. A este respecto, se necesita un periodo de

5 tiempo de desde 10 a 160 horas.

El microorganismo que tiene actividad de aminación de XMP útil en la presente invención puede ser Escherichia coli. La E. coli que tiene actividad de aminación de XMP se puede cultivar utilizando cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica. El medio de cultivo para la E. coli puede contener varios nutrientes que incluyen fuentes de nitrógeno inorgánico tales como amoniaco, cloruro amónico, sulfato amónico, etc., fuentes de nitrógeno 10 orgánico tales como peptona, NZ-amina, extracto de carne, extracto de levadura, agua de macerado de maíz, hidrolizado de caseína, pescado o harina de pescado, aglutinado o harina de soja desgrasada, y compuestos inorgánicos tales como fosfato monohidrógeno de potasio, fosfato dihidrógeno de potasio, sulfato magnésico, sulfato ferroso, sulfato de manganeso, y carbonato cálcico. Si es necesario se pueden utilizar vitaminas y bases auxotróficas. Para el cultivo, se puede utilizar un cultivo con agitado o removido para la aireación. La temperatura del

15 cultivo varía desde 30 a 45 °C, y preferentemente desde 37 a 40 °C. Durante el cultivo, es preferible que el pH se ajuste a un nivel casi neutro. El periodo de cultivo es de 1 a 2 días. Como resultado, el microorganismo que tiene actividad de aminación de XMP se acumula en el medio de cultivo.

En la presente invención, se añade un medio de cultivo que contiene XMP al cultivo de E. coli que tiene actividad de aminación de XMP para convertir el XMP en GMP. A este respecto, se puede conseguir la conversión de XMP en 20 GMP con un compuesto que aumente la permeabilidad de membrana de XMP, tal como el xileno. El xileno facilita la entrada de XMP del medio de cultivo en la cepa productora de GMP. Los compuestos útiles para el aumento de la permeabilidad de membrana al XMP se conocen bien en la técnica. Ejemplos de tales compuestos incluyen un material hidrófobo (por ejemplo, xileno, tolueno, benceno, etil acetato), un tensioactivo (tensioactivos catiónicos, por ejemplo, polioxietilenestearilamina, bromuro de cetiltrimetilamonio, Cation FB y Cation F2-40E; tensioactivos

25 aniónicos, por ejemplo, sulfato de oleilamida sódica, Newrex TAB, y Rapizol 80) y un ion metálico (por ejemplo, ion cálcico, ion magnésico), pero no se limitan a los mismos. La cantidad de compuesto para aumentar la permeabilidad de membrana al XMP varía dependiendo de las características del mismo, y la pueden ajustar apropiadamente los expertos habituados en la técnica.

El GMP producido de esta manera puede segregarse al medio de cultivo o permanecer en la célula. El

30 procedimiento de producción de GMP de acuerdo con la presente invención comprende la recuperación de GMP a partir de las células o del medio de cultivo. Para la recuperación del GMP a partir de las células o el medio de cultivo, se puede utilizar cualquier procedimiento bien conocido en la técnica. Ejemplos de tales procedimientos incluyen filtración, cromatografía de intercambio aniónico, cristalización, y HPLC, pero no se limitan a estos.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión “guanosín monofosfato” es un nucleótido, compuesto por

35 guanosina y fosfato, que se encuentra en el ARN. El resto de fosfato puede posicionarse en 5’, 3’ o 2’, que se denomina forma 5’, 3’ o 2’, respectivamente. En la presente invención, el GMP (5’-guanosín fosfato) se produce como un cristal incoloro con forma de agujas, y existe en forma libre en el cuerpo. Tiene una fórmula molecular C10H14N5O8P. El guanosín monofosfato en forma de sus sales, tales como guanilato disódico, guanilato dipotásico y guanilato cálcico, son aditivos alimentarios que se utilizan como potenciadores del sabor basados en ácidos

40 nucleicos para proporcionar el sabor a setas. Cuando se utiliza el microorganismo transformado de acuerdo con la presente invención, el GMP se puede producir con un alto rendimiento que se encuentra con una mejora de aproximadamente un 8,5% en comparación con los microorganismos convencionales.

Efectos ventajosos

La cepa de corinebacterias transformada con el vector recombinante de acuerdo con la presente invención, muestra

45 una mejora de la actividad malato deshidrogenasa y por lo tanto produce ATP con alto rendimiento. Cuando se aplica a la conversión en GMP a partir de XMP, la cepa transformada de la presente invención permite una mayor productividad de GMP que los microorganismos convencionales.

Descripción de los dibujos

La FIG. 1 es un diagrama esquemático que muestra la estructura del vector recombinante pDZ-mqo en el que se 50 insertan dos copias de un gen mqo en un vector pDZ.

Modo de la invención

Se puede obtener un mejor entendimiento de la presente invención por medio de los siguientes ejemplos que se exponen para ilustrar, pero no deben concebirse como limitantes de la presente invención.

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Ejemplo 1: Clonación del mqo derivado de la cepa de Corynebacterium ammoniagenes KCCM-10530 productora de XMP y construcción del vector recombinante (pDZ-mqo) para la incorporación genómica

La secuencia de nucleótidos del gen mqo (NCBI ID_3345228) se obtuvo a partir de los datos del NIH GenBank. Basándose en la secuencia, se sintetizaron dos pares de cebadores (SEQ ID NO. 1 a 4).

5 Mientras que el genoma de Corynebacterium KCCM-10530 funcionaba como matriz, se llevó a cabo la PCR en presencia de la ADN polimerasa de alta fidelidad PfuUltra™ (Stratagene) utilizando los cebadores de las SEQ ID NO. 1 a 4, con 25 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 30 segundos, hibridación a 55 °C durante 30 seg y extensión a 68 °C durante 2 min. Los productos de la PCR obtenidos de esta manera eran dos copias del gen mqo, cada uno de 2,1 kb de longitud (mqo-A, mqo-B), que se amplificaron utilizando dos grupos de SEQ ID NO. 1 y 2, y

10 SEQ ID NO. 3 y 4, respectivamente.

SEQ ID NO: 1; gctctagaATCGGTCATTCCATGAACCC SEQ ID NO: 2; cgcggatccCATCGATATCGCCAACTCCA SEQ ID NO: 3; cgcggatccATCGGTCATTCCATGAACCC SEQ ID NO: 4; gctctagaCATCGATATCGCCAACTCCA

15 Tras tratarse con las enzimas de restricción adecuadas (mqo-A: XbaI + BamHI, mqo-B: BamHI + XbaI), se insertaron los productos de la PCR mqo-A y mqo-B en el vector pDZ que se había tratado previamente con XbaI y fosfatasa alcalina de camarón, por medio de la unión de tres piezas (véase Solicitud de Patente coreana Nº 10-2007-94433). Finalmente, se obtuvo un vector recombinante pDZ-mqo en el que se clonaron dos copias del gen mqo para su incorporación en el genoma de Corynebacterium.

20 Ejemplo 2: Generación de una cepa con mqo insertado

La construcción del vector pDZ-mqo se transformó en la cepa KCCM-10530 y se sometió a recombinación con el genoma para insertar una copia genética de mqo en una posición adyacente al gen mqo del genoma. De esta manera, se obtuvo una nueva cepa productora de XMP, llamada Corynebacterium ammoniagenes KCJ-1304, que tenía dos copias del gen mqo en el genoma de la misma. La inserción de dos copias del gen mqo en tándem se

25 identificó utilizando una PCR que utilizaba un grupo de cebadores (SEQ ID NO. 5 y 6) que se dirigían a secuencias de nucleótidos corriente arriba y corriente abajo de las dos copias del gen mqo.

SEQ ID NO. 5: CTTTTCGATGACGCCCAA

SEQ ID NO. 6: CCACTTTATCGGGTGAGACCA

Ejemplo 3: Actividad malato deshidrogenasa de la cepa con inserción de mqo

30 La Corynebacterium ammoniagenes KCJ-1304 productora de XMP que se preparó en el Ejemplo 2 se ensayó en cuanto a su actividad malato deshidrogenasa de la siguiente manera. La cepa se inoculó en un medio que contenía 10 g/l de bactopeptona, 5 g/l de extracto bacto-carne, 5 g/l de extracto bacto-levadura, 2,5 g/l de NaCl, 50 mg/l de adenina, y 50 mg/l de guanina y se incubó a 30 °C durante 12 h hasta que se obtuvo una DO de 10. Se recuperaron 10 ml del cultivo celular, se lavaron dos veces con un tampón que comprendía 50 mM de HEPES, 10 mM de acetato

35 potásico, 10 mM de CaCl2 y 10 mM de MgCl2, y se suspendieron en 1 ml del mismo tampón. Tras la interrupción con el uso de un sonicador, el lisado celular se centrifugó. El sobrenadante se re-centrifugó para dar un aglomerado que se suspendió entonces en 100 μl de tampón. Se utilizaron 10 μl de esta suspensión como una solución enzimática. Se preparó un tampón de reacción mezclando 50 mM de HEPES, 10 mM de acetato potásico y 50 μM de 2,6dicloroindolfenol (Cl2Ind). El Cl2Ind se descongeló y se mezcló justo antes de la reacción. Se añadieron a 980 μl de

40 la mezcla de reacción 10 μl de malato 100 mM como sustrato y 10 μl de la solución enzimática, seguido por incubación a 30 °C durante 15 min con agitado. La actividad enzimática se determinó midiendo la concentración de Cl2Ind reducido. El Cl2Ind tiene un coeficiente de absorción de 22 cm-1mM-1 a 600 nm.

[Tabla 1]

Cepa: KCCM-10530 KCJ-1304

Cl2Ind reducido (mM): 15,45 20,17

45 Como se muestra en la Tabla 1, se observó que KCJ-1304 aumentó la actividad malato deshidrogenasa un 30,6% en comparación con la cepa madre KCCM-10530.

Ejemplo 4: Nivel de ATP en la cepa con inserción de mqo

La Corynebacterium ammoniagenes KCJ-1304 productora de XMP que se preparó en el Ejemplo 2 se midió en cuanto al nivel intracelular de ATP de la siguiente manera.

5

10

15

20

25

30

35

40

La cepa madre Corynebacterium ammoniagenes KCCM-10530 y la KCJ-1304 se inocularon en respectivos tubos de 14 ml, que contenía cada uno 3 ml del medio de siembra posterior, y se incubaron a 30 °C durante 20 h con agitado a 200 rpm. Luego, se añadió una cantidad de 0,4 ml de los cultivos de siembra a 25 ml del medio de siembra en respectivos matraces de 250 ml con deflectores en las esquinas, seguido por cultivo con agitado a 30 °C y 230 rpm durante 20 h. Se midió la DO y los niveles de ATP de los cultivos celulares. Se descubrió que la KCJ-1304 mutante producía ATP a una tasa mayor por DO que la cepa madre KCCM-10530, indicando que la cepa mutante de la presente invención podía presentar una mayor productividad de GMP en comparación con la cepa madre. Los resultados se resumen en la Tabla 2, a continuación.

[Tabla 2]

Cepa: DO(A562 Nivel de ATP (μM) Nivel de ATP/DO

KCCM-10530: 20,76 32,92 1,59

KCJ-1304: 21,44 69,74 3,25

Como se muestra en la Tabla 2, el nivel intracelular de ATP por DO de KCJ-1304 aumentó aproximadamente un 104% en comparación con el de la cepa madre KCCM-10530.

Ejemplo 5: Fermentación de XMP y producción de GMP de la cepa con inserción de mqo

La cepa de Corynebacterium ammoniagenes KCJ-1304 que se preparó en el Ejemplo 2 se cultivó para producir GMP de la siguiente manera.

La cepa madre de Corynebacterium ammoniagenes KCCM-10530 y la KCJ-1304 mutante se inocularon en respectivos tubos de 14 ml, que contenía cada uno 3 ml del medio de siembra posterior, y se incubaron a 30 °C durante 20 horas con agitado a 200 rpm. Luego, se añadió una cantidad de 0,4 ml de los cultivos sembrados a 32 ml del medio de producción posterior (24 ml de medio principal + 8 ml de medio A) en respectivos matraces de 250 ml con deflectores en las esquinas, seguido por cultivo con agitado a 30 °C y 230 rpm durante 96 h. Con el fin de someter el XMP producido de esa manera a la conversión en GMP, se añadieron los aditivos de conversión posteriores y XMP aminasa de E. coli a los matraces de Erlenmeyer, tras lo cual se llevó a cabo una reacción de conversión a 40 °C durante 4 h. Se descubrió que la KCJ-1304 mutante aumentó la tasa de conversión, que representa la producción de GMP por XMP consumido, en comparación con la cepa madre KCCM-10530. Es decir, la cepa mutante de la presente invención es mejor en productividad de GMP en comparación con la cepa convencional. Los resultados se resumen en la Tabla 3, a continuación.

[Tabla 3]

Cepa: Nivel (g/l) Tasa de conversión (%) (GMP producido/XMP consumido)

XMP: GMP

KCCM-10530: 28,6 21,2 74,1

KCJ-1304: 30,3 23,0 75,9

Como es evidente a partir de los datos de la Tabla 3, se descubrió que la KCJ-1304 aumentaba la tasa de conversión en un 2,4% y el nivel de GMP en un 8,5% en comparación con la cepa madre KCCM-10530. Medio de siembra: glucosa 30 g/l, peptona 15 g/l, extracto de levadura 15 g/l, NaCl 2,5 g/l, urea 3 g/l, adenina 150 mg/l, guanina 150 mg/l, pH 7,2 Medio de producción (principal): glucosa 80 g/l, sulfato de magnesio 10 g/l, sulfato ferroso 20 mg/l, sulfato de zinc 10 mg/l, sulfato de manganeso 10 mg/l, adenina 30 mg/l, guanina 30 mg/l, biotina 100 □/l, sulfato de cobre 1 mg/l, cloruro de tiamina 5 mg/l, cloruro cálcico 10 mg/l, pH 7,2 Medio de producción (medio A): fosfato monopotásico 10 g/l, fosfato dipotásico 10 g/l, urea 7 g/l, sulfato amónico 5 g/l Aditivo de conversión: ácido fítico 1,8 g/l, MgSO4 4,8 g/l, nymeen 3 □/l, xileno 2%, adenina 100 mg/l, Na2HPO4 7,7 g/l, glucosa 46 g/l.

<110> CJ CHEILJEDANG CORPORATION

<120> UNA CEPA DE CORINEBACTERIAS PARA EL AUMENTO DE LA PRODUCTIVIDAD DE 5’-GUANOSÍN MONOFOSFATO Y UN PROCEDIMIENTO DE PRODUCCIÓN DE 5’-GUANOSÍN MONOFOSFATO UTILIZANDO LA MISMA

<130> R 59484

imagen6

<140> EP 09833644.9

<141>

<150> KR10-2008-0128846

<151> 5 <160> 7

<170> KopatentIn 1.71

<210> 1

<211> 28

<212> ADN 10 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador directo para mqo-A

<400> 1

imagen7

15 <210> 2

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 20 <223> cebador inverso para mqo-A

<400> 2

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<210> 3

<211> 29 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador directo para mqo-B

<400> 3

30

imagen9

<210> 4

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

35 <220>

<223> cebador inverso para mqo-B

<400> 4

imagen10

<210> 5 40 <211> 18

<212> ADN

imagen11

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador directo para detectar mqo

<400> 5

imagen12

5

<210> 6

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

10 <220>

<223> cebador inverso para detectar mqo

<400> 6

imagen13

<210> 7

<211> 1503

<212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 7

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Claims

imagen1

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de producción de guanosín 5’-monofosfato (GMP), que comprende:

(a) cultivar una cepa de corinebacterias con productividad de ATP mejorada que tiene mayor actividad malato deshidrogenasa que la de la cepa de corinebacterias de tipo silvestre, para preparar de esta manera una

5 solución de cultivo que incluye ATP y xantosín 5’-monofosfato (XMP), en la que la malato deshidrogenasa está codificada por un gen mqo de Corynebacterium, se aumenta la actividad malato deshidrogenasa aumentando el número de copias del gen mqo o sustituyendo un promotor del gen mqo;

(b) mezclar la solución de cultivo con XMP aminasa o un microrganismo que tenga actividad XMP aminasa y 10 cultivar la mezcla resultante, para de esta manera convertir el XMP en GMP; y

(c) obtener GMP de la mezcla.
2. El procedimiento de acuerdo con reivindicación 1, en el que el aumento de la actividad malato deshidrogenasa resulta de un aumento de la expresión de mqo.
3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que la cepa se transforma con un vector 15 recombinante que porta dos copias de genes mqo en tándem.
4. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la cepa es de Corynebacterium ammoniagenes.

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