CN102288749B

CN102288749B - 敌百虫仿生酶联免疫吸附检测方法

Info

Publication number: CN102288749B
Application number: CN 201110213929
Authority: CN
Inventors: 徐志祥; 孟玲; 乔旭光
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2011-07-28
Filing date: 2011-07-28
Publication date: 2013-07-31
Anticipated expiration: 2031-07-28
Also published as: CN102288749A

Abstract

本发明涉及一种敌百虫仿生酶联免疫吸附检测方法，是以敌百虫分子印迹聚合物膜作为人工抗体代替生物抗体，利用酶联免疫吸附测定原理，建立对敌百虫具有高灵敏度的仿生酶联免疫吸附检测方法。该方法的最低检出限为7μgL^-1，大大低于最高残留限量值，且大大缩短了分析时间（比传统生物免疫分析缩短1.0h），适用于快速检测敌百虫。本发明制备的仿生抗体可以重复使用50次以上，成本大大降低；并且前处理简单，灵敏度高，实验操作简单，适用于各种食品中敌百虫的快速检测。

Description

敌百虫仿生酶联免疫吸附检测方法

技术领域

本发明涉及一种敌百虫仿生酶联免疫吸附检测方法，属于食品安全检测技术领域，特别是一种敌百虫的快速灵敏检测方法。

背景技术

敌百虫（trichlorphon，O,O-二甲基-(2,2,2-三氯-1-羟基乙基) 磷酸酯）是一种有机磷光谱杀虫剂，1952年由德国拜耳公司合成并开始生产。它具有高效、低毒、低残留、水溶性好等特点，因此被广泛应用于农林、园艺、畜牧、卫生等方面。也正因为其应用广泛，滥用现象日趋严重，敌百虫对动物神经***的损害以及致癌性和致突变性也越来越引起人们的重视。GB 16319-1996 规定食品中敌百虫最大残留量不得高于0.1 mg Kg^-1。

目前国内外有关食品中敌百虫检测方法大都采用分光光度法、液相色谱法或液相、气相色谱与质谱联用的方法进行定性、定量的检测，但上述几种检测方法所使用的设备价格昂贵且在敌百虫含量较低（痕量）时很难检出，通常需要复杂样品前处理技术。而酶联免疫法虽然具有高灵敏度和低检出限，但是其存在生物抗体制备周期长，保存不当易失活等问题。分子印迹聚合物作为仿生抗体，不但对敌百虫具有高选择性，而且印迹聚合物制备周期短，不存在失活问题，因此作为人工抗体应用于酶联免疫分析，建立仿生免疫吸附检测技术，用于检测农产品及食品中的敌百虫，具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服传统的敌百虫检测方法存在的检测时间长、仪器价格昂贵、准确度差、前处理烦琐等缺陷，提供一种敌百虫的快速检测方法。

本发明采取的技术方案是：

一种敌百虫仿生酶联免疫吸附检测方法，是按以下步骤完成的：

1）将敌百虫（溶于乙腈和水）、功能单体（甲基丙烯酸，MAA）和交联剂（二甲基丙烯酸乙二醇酯，EGDMA）按照1:2:2的摩尔比例和一定量偶氮二异丁腈（AIBN）充分混匀，然后96孔酶标板上每孔加入200 μL上述混合液聚合反应18h；用1:9（v/v）冰乙酸-甲醇溶液连续洗脱8h以除去敌百虫，再用100%甲醇洗至中性，干燥后得分子印迹聚合物膜；

2）以分子印迹聚合物膜作为仿生抗体，将96孔酶标板第1行酶标孔设为空白组，每孔只加200μLPBS溶液（5倍PBS：Na₂HPO₄·12H₂O：68.8 g，NaH₂PO4：6.9 g，NaCl：45 g，加双蒸水至1L，pH值 6.7）；第2行酶标孔设为对照组，每孔只加200μL1:3000（v/v）辣根过氧化物酶标抗原稀释液；第3-8行酶标孔依次加入100 μL标样梯度稀释液（5倍稀释），然后立即加入100 μL1:3000辣根过氧化物酶标抗原稀释液；

3）将上述96孔酶标板室温孵育1 h后用磷酸盐吐温缓冲液PBST（5倍PBS：200 mL，10%的Tween-20：5mL，加双蒸水定容至1L。）洗板五次。再在每孔中加入150 μL底物液（底物A：8.2 g无水醋酸钠，2.5 g β-环糊精，150 mg过氧化氢脲，加双蒸水至1000 mL，调pH至5.0，4℃保存；底物B：50 mg 3,3,5,5-四甲基联苯胺溶于5 mL二甲基亚砜，室温避光保存。使用前15分钟，14.6 mL底物A和0.45 mL底物B混合成底物液），室温下反应30 min，每孔再加入50 μL 1.25 mol L^-1硫酸，终止反应；

4）在双波长方式（450-650 nm）下用酶标仪读取96孔酶标板第1-8行吸光度值A；

按照下列公式计算不同浓度敌百虫对抗原抗体结合反应的抑制率值：

IC%＝ ×100

式中：

IC% —— 敌百虫对抗原抗体结合反应的抑制率；

A_对照—— 对照孔平均吸光度值；

A_样品—— 敌百虫标准液或样品提取液的平均吸光度值（3-8行）；

A_空白——空白孔的平均吸光度值。

5）以标准溶液浓度对数值为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制标准曲线；

6）将分析物粉碎，按重量体积比（g/mL）1：10加入PBS溶液超声提取3次，0.45μm滤膜过滤得样品提取液。将样品提取液代替标样梯度稀释液，重复步骤2-4操作，根据吸光度值由标准曲线计算出分析物抑制率以及分析物中敌百虫含量。

本发明的优点和积极效果是：

1.本发明提供的敌百虫吸附功能材料具有较高的选择性，可以代替生物抗体应用于酶联免疫技术；该吸附功能材料由化学方法制备，具有较高的稳定性、较长的使用寿命和较强的抗恶劣环境的能力，克服了传统生物抗体制备周期长、易失活、成本高等缺点。

2.本发明将分子印迹技术与酶联免疫技术联用，建立对敌百虫具有高灵敏度的仿生酶联免疫吸附检测方法。该方法的最低检出限为7μg L^-1，大大低于最高残留限量值，能够满足检测需要。并且大大缩短了分析时间（比传统生物免疫分析缩短1.0 h），适用于快速检测敌百虫。

3. 本发明制备的仿生抗体可以重复使用50次以上，成本大大降低；并且前处理简单，灵敏度高，实验操作简单，适用于各种食品中敌百虫的快速检测。

本发明与现有其他检测方法的比较

	本发明检测方法	液-质联用检测法	气相检测方法
				样品前处理方法	PBS提取，过滤，不需要其他前处理。	有机溶剂提取，固相萃取或其他方法进行富集。	有机溶剂提取，氮吹后用丙酮复溶。
最低检测限	7μg L^-1	10 μg Kg^-1	10 μg Kg^-1

附图说明

图1为敌百虫BELISA标准曲线

由图1可知，该方法的灵敏度（抑制率50值）为7 mg L-1，最低检测限（抑制率15值）为7 μg L-1。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明是将敌百虫分子印迹聚合物膜作为仿生抗体与酶联免疫技术联用，从而建立对敌百虫具有高灵敏度的快速检测方法。其具体实施例为：

1）1 mmol ( 257.45 mg) 敌百虫溶于3 mL 乙腈和2 mL水，然后加入2 mmol （86.09 mg）MAA磁力搅拌30 min后加入2 mmol（198.2 mg）EGDMA和0.03g偶氮二异丁腈（AIBN），磁力搅拌1 h。96孔酶标板上每孔加入200 μL上述混合液聚合反应18h，弃去反应液，用1:9（v/v）冰乙酸-甲醇溶液连续洗脱8h以除去敌百虫，再用100%甲醇洗至中性，37℃干燥2h，得分子印迹聚合物膜（仿生抗体）。

2．将96孔酶标板第1行酶标孔设为空白组，每孔只加200μLPBS溶液（5倍PBS：Na₂HPO₄·12H₂O：68.8 g，NaH₂PO4：6.9 g，NaCl：45 g，加双蒸水至1L，pH值6.7。）；第2）行酶标孔设为对照组，每孔只加200μL1:3000（v/v）辣根过氧化物酶标抗原稀释液。第3-8行酶标孔依次加入100 μL标样梯度稀释液（浓度分别为50000,10000, 2000, 400, 80和16 μg L^-1，用PBS稀释），然后立即加入100 μL1:3000辣根过氧化物酶标抗原稀释液(3-8行)。

3）将上述96孔酶标板室温孵育1 h后用磷酸盐吐温缓冲液PBST（5倍PBS：200 mL，10%的Tween-20：5mL，加双蒸水定容至1L。）洗板五次。96孔酶标板每孔加入150 μL底物液（底物A：8.2 g无水醋酸钠，2.5 g β-环糊精，150 mg过氧化氢脲，加双蒸水至1000 mL，调pH至5.0，4℃保存；底物B：50 mg 3,3,5,5-四甲基联苯胺溶于5 mL二甲基亚砜，室温避光保存。使用前15分钟，14.6 mL底物A和0.45 mL底物B混合成底物液），室温下反应30 min。每孔加入50 μL 1.25 mol L^-1硫酸，终止反应。

4）在双波长方式（450-650 nm）下用酶标仪读取96孔酶标板第1-8行吸光度值A。

IC%＝×100

式中：

IC% —— 敌百虫对抗原抗体结合反应的抑制率；

A_对照—— 对照孔平均吸光度值；

A_空白——空白孔的平均吸光度值。

5）以标准溶液浓度对数值为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制标准曲线。

6）准确称取韭菜2 g, 切碎，加入20 mL PBS溶液超声提取3次，提取液定容至100 mL，0.45μm滤膜过滤。

7）将步骤6得到的样品提取液代替标样梯度稀释液（样品提取液浓度分别为50000,10000, 2000, 400, 80和16 μg L^-1，用PBS稀释），重复步骤2-4的操作，得到样品提取液的吸光度值，根据上述公式计算得出韭菜提取液抑制率为29.06%。

8）将上述韭菜提取液抑制率带入敌百虫BELISA标准曲线求出敌百虫提取液浓度为140 μg L^-1，计算出所测韭菜中敌百虫含量为7.0 μg g^-1（140 μg L^-1×100 mL/ 2 g）。

Claims

1.一种敌百虫仿生免疫吸附检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将敌百虫溶于乙腈和水后与功能单体甲基丙烯酸MAA和交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯EGDMA按照1:2:2的摩尔比例和偶氮二异丁腈AIBN充分混匀，然后96孔酶标板上每孔加入200μL上述混合液聚合反应18h；用v/v1:9冰乙酸-甲醇溶液连续洗脱8h以除去敌百虫，再用100%甲醇洗至中性，干燥后得分子印迹聚合物膜；

2）以分子印迹聚合物膜作为仿生抗体，将96孔酶标板第1行酶标孔设为空白组，每孔只加200μLPBS溶液；第2行酶标孔设为对照组，每孔只加200μL1:3000v/v辣根过氧化物酶标抗原稀释液；第3-8行酶标孔依次加入100μL标样梯度稀释液，所述的标样梯度稀释液浓度分别为50000,10000,2000,400,80和16μg L^-1，用PBS稀释，然后立即加入100μL1:3000辣根过氧化物酶标抗原稀释液；先将Na₂HPO₄·12H₂O：68.8g，NaH₂PO4：6.9g，NaCl：45g，加双蒸水至1L配制成5倍PBS，再将5倍PBS稀释5倍得到所述的PBS溶液；

3）将上述96孔酶标板室温孵育1h后用磷酸盐吐温缓冲液PBST，洗板五次；再在每孔中加入150μL底物液，室温下反应30min，每孔再加入50μL1.25mol L^-1硫酸，终止反应；所述的底物液由底物A和底物B组成；所述的底物A为：8.2g无水醋酸钠，2.5gβ-环糊精，150mg过氧化氢脲，加双蒸水至1000mL，调pH至5.0，4℃保存；所述的底物B为：50mg3,3,5,5-四甲基联苯胺溶于5mL二甲基亚砜，室温避光保存；使用前15分钟，14.6mL底物A和0.45mL底物B混合成所述的底物液；使用步骤2）中所述的5倍PBS：200mL，10%的Tween-20：5mL，加双蒸水定容至1L得到所述的PBST溶液；

4）在双波长方式450-650nm下用酶标仪读取96孔酶标板第1-8行吸光度值A；

式中：

IC%——敌百虫对抗原抗体结合反应的抑制率；

A_对照——对照孔平均吸光度值；

A_样品——敌百虫标准液或样品提取液的平均吸光度值；

A_空白——空白孔的平均吸光度值；

6）将分析物粉碎，按重量体积比g/mL1：10加入PBS溶液超声提取3次，0.45μm滤膜过滤得样品提取液；重复步骤2）--4）操作，将步骤2）中样品提取液代替标样梯度稀释液，所述的样品提取液浓度分别为50000,10000,2000,400,80和16μg L^-1，用PBS稀释；根据吸光度值由标准曲线计算出样品提取液抑制率以及分析物中敌百虫含量。