CN103278622A - 96孔酶标板氯霉素分子印迹聚合膜的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种96孔酶标板氯霉素分子印迹聚合膜的制备方法，按如下步骤进行：将模板分子氯霉素、功能单体甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯和交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯按照摩尔比1：4：0.2溶解于致孔剂四氢呋喃中，超声30min；所述四氢呋喃的用量为5ml/0.25mmol氯霉素；加入引发剂偶氮二异丁腈，超声15min，加入量为5mg/0.25mmol氯霉素；将b步骤所得溶液滴加到96孔酶标板上，之后将96孔酶标板放入密封袋中，充入氮气，密封且紫外灯照射条件下，引发聚合6小时；再将96孔酶标板置于体积比为3:1的甲醇—乙酸混合液中，超声洗脱48小时；50℃干燥96孔酶标板2小时，得到氯霉素分子印迹聚合膜。
Description
技术领域
本发明涉及一种分子印迹聚合物膜的制备方法，尤其是一种对氯霉素高选择性吸附的96孔酶标板氯霉素分子印迹聚合膜的制备方法。
背景技术
氯霉素（Chloramphenicol，CAP） 是1947年首次从微生物代谢物中分离得到的抗生素，由于其优良的抗菌性、稳定的药性、低廉的价格，已广泛作为饲料添加剂，用于治疗细菌性疾病。然而，由于其苯环上带硝基，其分解半衰期较长而且具有严重的毒副作用，易引起人体血中毒，导致不可逆的再生障碍性贫血等严重的毒副作用，对人类的健康构成巨大的潜在威胁。因此，欧盟、美国均在法规中规定CAP的残留限量标准为“零容许量”，我国农业部也规定CAP及其盐、脂等在食品动物的所有可食组织中不得检出。目前，对于样品中残留的CAP检测方法主要有微生物法、免疫分析法、气相色谱法、色谱质谱联用法、超临界流体色谱法以及免疫荧光毛细管电泳技术等。现有检测方法对于样品前处理步骤繁琐，加之样基体成分复杂、CAP残留浓度低，难以实现快速有效检测。
免疫分析法具有操作简单、快速、灵敏度高、特异性强及检测费用低等优点，被国外许多国家列为优先研究、开发和利用的农药残留分析技术。目前使用的免疫分析技术主要是酶联免疫（ELISA）分析方法，但检出限在0.1μg/L，有时候难以达到药残检测标准要求。化学发光免疫测定是继酶免技术后发展的一种新兴免疫测定技术，是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。化学发光免疫分析仪包含两个部分，即免疫反应***和化学发光分析***。免疫反应***是将发光物质（在反应剂激发下生成激发态中间体）直接标记在抗原（化学发光免疫分析） 或抗体（免疫化学发光分析）上，或酶作用于发光底物。化学发光分析***是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化，形成一个激发态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时，同时发射出光子（hM），利用发光信号测量仪器测量光量子产额。虽然化学发光免疫检测技术的灵敏度很容易达到0.01μg/L水平，但是免疫反应***所用的试剂盒中抗体的制备过程繁琐复杂、费用高、所用仪器昂贵，不适用于大批量样品药物残留的检测。
分子印迹技术（molecular imprinting technology MIT）其基本原理是将模板分子（待分离、识别的分子）同具有适合官能团的功能单体相互作用，在交联剂和引发剂的作用下形成具有大孔、网状的聚合物，通过溶剂洗脱或在一定条件下水解除去模板分子，聚合物中就留下了大小、形状及功能基团与模板分子匹配的“记忆”空穴，这样的空穴便可以与混合物中待分离的模板分子进行特异性的亲和作用，从而达到分离、纯化、预富集模板分子等，继而用酶联免疫等化学发光方法，可实现对样品中模板分子的快速、有效检测。但是，迄今为止还没有关于制备氯霉素分子印迹聚合物膜的相关报道。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种对氯霉素高选择性吸附的96孔酶标板氯霉素分子印迹聚合膜的制备方法。
本发明的技术解决方案是：一种96孔酶标板氯霉素分子印迹聚合膜的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：
a. 将模板分子氯霉素、功能单体甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯和交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯按照摩尔比1：4：0.2溶解于致孔剂四氢呋喃中，超声30min；所述四氢呋喃的用量为5ml/0.25mmol氯霉素；
b. 加入引发剂偶氮二异丁腈，超声15min，加入量为5mg/0.25mmol氯霉素；
c. 将b步骤所得溶液滴加到96孔酶标板上，之后将96孔酶标板放入密封袋中，充入氮气，密封且紫外灯照射条件下，引发聚合6小时；
d. 再将96孔酶标板置于体积比为3:1的甲醇—乙酸混合液中，超声洗脱48小时；
e. 50℃干燥96孔酶标板2小时，得到氯霉素分子印迹聚合膜。
所述a步骤是称取0.25mmol氯霉素于烧瓶中，向其中加入5ml四氢呋喃，超声5min；待氯霉素溶解后，加人1mmol甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯，超声20min；再将0.05mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯加入到烧瓶中，超声5min。
本发明是以甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯为功能单体，以乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂、四氢呋喃为致孔剂、偶氮二异丁腈为引发剂，并按照特定比例及生产条件等，生产出具有非常高的选择性和特异性的氯霉素分子印迹聚合物膜，有较高的稳定性、较长的使用寿命和较强的抗恶劣环境能力。本发明成本低廉、操作简单、反应条件容易控制。
附图说明
图1是本发明实施例直接竞争ELISA检测氯霉素的标准曲线图。
具体实施方式
a. 称取0.25mmol氯霉素于烧瓶中，向其中加入5ml四氢呋喃，超声5min；待氯霉素溶解后，加人1mmol甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯，超声20min；再将0.05mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯加入到烧瓶中，超声5min；
b. 加入5mg引发剂偶氮二异丁腈，超声15min；
c. 将b步骤所得溶液滴加到96孔酶标板上，之后将96孔酶标板放入密封袋中，充入氮气，密封且100W紫外灯（λ=365nm）照射条件下，引发聚合6小时；
d. 再将96孔酶标板置于体积比为3:1的甲醇—乙酸混合液中，超声洗脱48小时，每四小时换一次洗脱液，去除模板分子；
e. 50℃干燥96孔酶标板2小时，得到氯霉素分子印迹聚合膜。
试验：
1．合成酶标抗原（酶标氯霉素）：
用戊二醛法将氯霉素偶联到辣根过氧化物酶上来合成酶标抗原，步骤如下：
（1）取100mg的氯霉素，加入到10ml 0.6mol／L的盐酸中；
（2）待氯霉素溶解后，往其中加入60mg的锌粉，于80℃反应30min；
（3）取上清液冷却到室温，在搅拌下缓缓加入到含辣根过氧化物酶的缓冲溶液中，然后再滴加0.2ml 25％的戊二醛，磁力搅拌室温反应5h；
（4）搅拌结束后，在4℃下将合成的产物对0.1mol／L、pH=7．2的PBS缓冲液（磷酸盐缓冲***）透析3d，每天更换2次PBS缓冲液，以除去未反应的小分子物质戊二醛、氯霉素等；
（5）量取透析袋中酶标抗原溶液的体积，再加入等体积的甘油，于-20℃冰箱避光保存备用。
2.氯霉素标准品的准备
配制100mg/L氯霉素甲醇溶液，然后将其用含有5%甲醇的PBS缓冲溶液稀释成30mg/L，再依次稀释至3mg/L、0.3mg/L、0.03mg/L、0.003mg/L、0.0003mg/L。测得各个浓度的发光值，来绘制氯霉素的标准曲线。
3．直接竞争酶联免疫法检测：
（1）在氯霉素分子印迹聚合膜的96孔板上，每孔先加入100μl氯霉素样品标准溶液或氯霉素添加样品溶液；
（2）然后往每孔加100μl酶标抗原溶液，以不加氯霉素标准溶液的孔为对照孔；
（3）室温孵育1h后，弃上清，用PBST洗板4-5次；
（4）在洗板同时配制好发光液（鲁米诺和H2O21:1混合），将板放入化学免疫分析仪，加入发光液250μl/孔，在化学发光仪上读取发光强度发光值；
（5）重复测定6次，将样品发光值均值代入氯霉素标准曲线，得到氯霉素残留量。
4．待测样品的准备和氯霉素试剂盒的验证
取一只健康海参，经液相检测，其体腔液中无氯霉素，用注射器从其中分别抽取体腔液于试管中，用0.45μm的滤膜过滤后，分别取1ml于3个试管中（给试管编号1，2，3），将0.02ml、0.1ml、0.2ml的浓度为0.05mg/L的氯霉素甲醇溶液分别填加到1、2、3号试管中，用体腔液配制成1μg/L、5μg/L、10μg/L的待测样品。应用氯霉素快速检测试剂盒和直接竞争ELISA（应用人工抗体）的检测结果如下：
直接竞争 ELISA（应用人工抗体）和氯霉素试剂盒对海参体腔液样品中添加氯霉素的检测结果
| 添加浓度(μg·L-1) | 氯霉素试剂盒(μg·L-1) | ELISA (μg·L-1) |
| 1 | 0.98±0.01 | 0.90±0.02 |
| 5 | 4.89±0.01 | 4.79±0.02 |
| 10 | 9.87±0.01 | 9.34±0.02 |
5．应用人工抗体的ELISA检测氯霉素的标准曲线
以IC％（氯霉素对酶标抗原和抗体结合反应的抑制率）为纵坐标，氯霉素标准品的对数为横坐标绘制直接竞争ELISA检测氯霉素的标准曲线，如图1所示。
Claims (2)
1.一种96孔酶标板氯霉素分子印迹聚合膜的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：
a. 将模板分子氯霉素、功能单体甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯和交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯按照摩尔比1：4：0.2溶解于致孔剂四氢呋喃中，超声30min；所述四氢呋喃的用量为5ml/0.25mmol氯霉素；
b. 加入引发剂偶氮二异丁腈，超声15min，加入量为5mg/0.25mmol氯霉素；
c. 将b步骤所得溶液滴加到96孔酶标板上，之后将96孔酶标板放入密封袋中，充入氮气，密封且紫外灯照射条件下，引发聚合6小时；
d. 再将96孔酶标板置于体积比为3:1的甲醇—乙酸混合液中，超声洗脱48小时；
e. 50℃干燥96孔酶标板2小时，得到氯霉素分子印迹聚合膜。
2.根据权利要求1所述的96孔酶标板氯霉素分子印迹聚合膜的制备方法，其特征在于：所述a步骤是称取0.25mmol氯霉素于烧瓶中，向其中加入5ml四氢呋喃，超声5min；待氯霉素溶解后，加人1mmol甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯，超声20min；再将0.05mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯加入到烧瓶中，超声5min。
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