CN102282263B - 通过在体内递送的胰岛转录因子基因再生胰岛和逆转糖尿病 - Google Patents

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Abstract

本发明包括用于在胰腺中通过超声靶向破坏微泡，从而再生葡萄糖反应细胞的组合物和方法，其中所述组合物包含与微泡在内部和附近接触的预装配的脂质体-核酸复合物，其中所述预装配的脂质体-核酸复合物包含在启动子控制下的NeuroD基因，其中在胰腺的靶位点微泡的破坏将核酸递送到位于超声破坏位置的胰腺细胞中，其中掺入核酸的细胞对高血糖水平作出反应表达胰岛素。

Description

通过在体内递送的胰岛转录因子基因再生胰岛和逆转糖尿病
发明技术领域 
本发明涉及糖尿病的治疗，更具体而言，涉及用于细胞再生的组合物和方法，所述的细胞是葡萄糖反应的、产生胰岛素的细胞。 
发明背景 
在不限制本发明范围的情况下，就糖尿病描述了本发明的背景。 
糖尿病影响全世界大约2亿人并且越来越流行。据估计，糖尿病是世界上第五大死亡原因，并且导致严重的并发症，这些并发症包括心血管疾病、慢性肾病、失明和神经病。 
尽管对于糖尿病有多种药物治疗，包括胰岛素疗法，但充分的血糖控制常常是困难的，部分原因是这些药物不能复制正常胰岛的葡萄糖调节功能。因此，新的治疗策略已经集中在通过胰岛移植或β细胞再生补充糖尿病的两种主要形式所共有的β细胞量的缺乏。 
授予Kojima的第6,232,288号美国专利中示教了在糖尿病治疗领域中的一个有希望的机会，该专利关于用于提高胰腺功能的组合物。Kojima示教了使用β细胞素(betacellulin，BTC)蛋白自身或其片段以促进未分化的胰腺细胞分化为产生胰岛素的β细胞或产生胰多肽的F细胞。BTC蛋白组合物提高了患者对葡萄糖的耐受性并抑制了未分化的胰腺细胞的生长。还提供了用于治疗包括人类在内的哺乳动物的方法，然而，通过静脉注射向患者提供β细胞素蛋白没有实现糖尿病病情的长期治疗。 
发明概述 
在一个实施方案中，本发明包括用于在胰腺中超声靶向破坏微泡的组合物和方法，所述组合物包括在微泡之内和附近接触的预装配的脂质体-核酸复合物，其中所述预装配的脂质体-核酸复合物包含在启动子控制下的NeuroD基因，其中胰腺的靶点微泡的破坏将核酸递送到位于超声破坏位置的胰腺细胞，其中掺入核酸的细胞对高血糖水平作出反应表达胰岛素。 在一个方面，该组合物还包含与高表达、可调节的胰岛素启动子区可操作地连接的一个或多个胰岛素反应调节基因，所述胰岛素启动子区包含：在NeuroD的转录起始位点上游的区域中SEQ ID NO.：1的50个连续碱基。在另一个方面，该组合物还包含一个或多个基因，所述基因选自与胰岛素启动子区可操作地连接的一个或多个胰岛素反应调节基因，所述胰岛素反应调节基因选自ngn3、GLP1、PDX1、Mafa、β细胞素、Nkx2.2、Nkx6.1、PAX4、Isl1、细胞周期蛋白(Cyclin)D2(和细胞周期蛋白家族的其他成员)、CDK4(和细胞周期蛋白依赖性激酶家族的其他成员)和针对细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的siRNA，例如p16(和INK4家族的其他成员)或p27(和CIP/KIP家族的其他成员)。在又一个方面，该组合物还包含与该组合物联合给药的药物，其中所述药物选自抗细胞凋亡剂、抗炎剂、JNK抑制剂、GLP-1、他克莫司、西罗莫司、阿那白滞素、Dervin聚酰胺或它们的组合。 
在另一个实施方案中，本发明包括在包含NeuroD的微泡的胰腺中利用超声靶向破坏微泡再生胰腺β细胞的组合物和方法。在一个方面，所述的NeuroD是重组的NeuroD。在另一个方面，该组合物还包含在CUBI、RIP2.1、RIP3.1或HIP3.1启动子的控制下的NeuroD基因，并且NeuroD在已通过超声靶向破坏微泡进行靶向表达的细胞中表达。 
本发明的再另一个实施方案是用于在糖尿病患者的体内和原位再生胰岛素反应细胞的方法，该方法包括：向胰腺递送有效量的，其中胰腺中的细胞对血液中的高葡萄糖水平作出反应，引起细胞分泌胰岛素。在一个方面，胰腺细胞中有效量的NeuroD包含递送表达NeuroD基因的外源核酸片段。在另一个方面，通过超声靶向破坏微泡将NeuroD递送至胰腺。在再另一个方面，胰腺细胞中有效量的NeuroD包括递送外源核酸片段，该外源核酸片段表达CUBI、RIP2.1、RIP3.1或HIP3.1启动子控制下的NeuroD基因。 
本发明的再一个实施方案是使得靶细胞变得对胰岛素反应的方法，该方法包括：制备核酸片段，所述核酸片段包含在胰岛素反应启动子的控制下的NeuroD基因，所述胰岛素反应启动子选自CUBI、RIP2.1、RIP3.1或HIP3.1启动子；使该核酸片段载入微泡；向患者注射微泡；将核酸片段递送至胰腺细胞中；和使靶细胞保持在对于表达所述的胰岛素反应调节基因有效的条件下；其中，靶细胞中NeuroD的表达引起细胞对高血糖作出反 应。在一个方面，所述方法还包括将一个或多个基因递送至胰腺，所述基因选自在启动子控制下的PDX1、Nkx2.2、Nkx 6.1、PAX4、MafA、ngn3和它们的组合。在另一个方面，所述方法还包括递送与该组合物联合给药的药物，其中，所述药物选自抗细胞凋亡剂、抗炎剂、JNK抑制剂、GLP-1、他克莫司、西罗莫司、阿那白滞素、Dervin聚酰胺或它们的组合。在一个方面，所述微泡包含预装配的脂质体-核酸复合物脂质体。在另一个方面，所述微泡包含预装配的脂质体-核酸复合物脂质体，所述脂质体-核酸复合物脂质体含有与质粒混合的二棕榈酸磷脂酰胆碱和二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺甘油的预装配的脂质体-核酸复合物脂质体。 
在再另一个实施方案中，本发明包括恢复胰岛素反应性的方法，该方法包括下述步骤：获得分离的核酸片段，该核酸片段包含与高表达胰岛素启动子区可操作地连接的一个或多个胰岛素反应调节基因，所述胰岛素启动子区包含胰岛素启动子的基因组片段，所述胰岛素启动子的基因组片段包括胰岛素基因的5’非翻译区、外显子1、内含子1和外显子2；将该核酸片段转移到靶细胞中；和使靶细胞保持在对于表达胰岛素反应调节基因有效的条件下；其中靶细胞中胰岛素反应调节基因的表达引起细胞对高血糖作出反应。在一个方面，胰岛素反应细胞是动物的。在另一个方面，与胰岛素启动子区可操作地连接的一个或多个胰岛素反应调节基因存在于病毒载体或质粒载体中。在另一个方面，与胰岛素启动子区可操作地连接的一个或多个胰岛素反应调节基因选自NeuroD、ngn3、GLP1、PDX1、Mafa、β细胞素、Nkx2.2、Nkx6.1、PAX4、Isl1、细胞周期蛋白D2(和细胞周期蛋白家族的其他成员)、CDK4(和细胞周期蛋白依赖性激酶家族的其他成员)和针对细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的siRNA，例如p16(和INK4家族的其他成员)或p27(和CIP/KIP家族的其他成员)。 
本发明的另一个实施方案是恢复胰岛素反应性的方法，该方法包括下述步骤：获得分离的核酸片段，该核酸片段包含与胰岛素启动子区可操作地连接的一个或多个胰岛素反应调节基因，所述的胰岛素启动子区包含胰岛素启动子的基因组片段，该胰岛素启动子的基因组片段包括胰岛素基因的5’非翻译区、外显子1、内含子1和外显子2；将所述的核酸片段转移到胰腺细胞中；和使靶细胞保持在对于表达胰岛素反应调节基因有效的条件下；其中靶细胞中胰岛素反应调节基因的表达引起细胞对高血糖作出反应。在一个方面，所述的胰岛素启动子区包括在转录起始位点的区域上游 中SEQ ID NO.：1的100至500个连续碱基。在一个实施方案中，所述的胰岛素启动子区包括SEQ ID NO.：1中转录起始位点上游的全部区域，或者甚至转录起始位点的区域上游中SEQ ID NO.：1的100至500个连续碱基。另一个方面是包含高表达胰岛素启动子区的分离的核酸，该高表达胰岛素启动子区包含：一个或多个胰岛素反应基因的转录起始位点的区域上游中SEQ ID NO.：1的50个连续碱基。 
在又一个实施方案中，本发明是用于在胰腺中超声靶向破坏微泡的组合物，该组合物包含：与微泡接触的预装配的脂质体-核酸复合物，其中预装配的脂质体-核酸复合物包含与高表达、可调节胰岛素启动子区可操作地连接的一个或多个胰岛素反应调节基因，所述胰岛素启动子区包含：胰岛素启动子的基因组片段，所述胰岛素启动子的基因组片段包含胰岛素基因的5’非翻译区、外显子1、内含子1和外显子2，其中在胰腺中靶点处微泡的超声破坏将核酸递送到超声破坏位置的胰腺细胞。在一个方面，所述的预装配的脂质体-核酸复合物包含阳离子脂质、阴离子脂质或它们的混合物和组合。在另一个方面，在药学上可接收的载体中处理所述的微泡。在另一个方面，活性剂核酸包含胰岛素基因。在一个方面，所述的活性剂核酸包含含有启动子控制下的己糖激酶基因的核酸载体。在另一个方面，所述的活性剂核酸包含含有启动子控制下的NeuroD基因的核酸载体。所述的预装配的脂质体-核酸复合物脂质体可以是例如与质粒混合的二棕榈酸磷脂酰胆碱和二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺甘油。在另一个方面，所述组合物还可以包含覆盖层。在另一个方面，所述组合物还可以包含与胰岛素启动子区可操作地连接的一个或多个胰岛素反应调节基因，该胰岛素反应调节基因选自NeuroD、ngn3、GLP1、PDX1、Mafa、β细胞素、Nkx2.2、Nkx6.1、PAX4、Isl1、细胞周期蛋白D2(和细胞周期蛋白家族的其他成员)、CDK4(和细胞周期蛋白依赖性激酶家族的其他成员)和针对细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的siRNA，例如p16(和INK4家族的其他成员)或p27(和CIP/KIP家族的其他成员)。 
通过以下方法使得细胞成为胰岛素反应的，所述方法包括向细胞中注射预装配的脂质体-核酸微泡复合物，其中，该预装配的脂质体-核酸复合物包含胰岛素启动子控制下的NeuroD基因，所述胰岛素启动子包含与胰岛素启动子区可操作地连接的一个或多个胰岛素反应调节基因，该胰岛素启动子区包含胰岛素启动子的基因组片段，该胰岛素启动子的基因组片段 包含胰岛素基因的5’非翻译区、外显子1、内含子1和外显子2，其中，在胰腺中靶位点处微泡的破坏将核酸递送至超声破坏位置的胰腺细胞，其中，掺入核酸的细胞对高血糖水平作出反应，表达胰岛素。在一个方面，所述细胞还包含与可调节胰岛素启动子区可操作地连接的一个或多个胰岛素反应调节基因，所述可调节胰岛素启动子区包含来自NeuroD基因的胰岛素起始位点上游的区域上游的50个连续碱基。在另一个方面，所述细胞还包含一个或多个基因，所述基因选自与胰岛素启动子区可操作地连接的一个或多个胰岛素反应调节基因，该胰岛素反应调节基因选自ngn3、GLP1、PDX1、Mafa、β细胞素、Nkx2.2、Nkx6.1、PAX4、Isl1、细胞周期蛋白D2(和细胞周期蛋白家族的其他成员)、CDK4(和细胞周期蛋白依赖性激酶家族的其他成员)和针对细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的siRNA，例如p16(和INK4家族的其他成员)或p27(和CIP/KIP家族的其他成员)。 
附图的简要说明 
附图中相同的参考编号在分离的视图中是指相同或功能上类似的元件，将其并入说明书中并形成说明书的一部分，附图进一步说明本发明并与发明详述一起用于解释本发明的原理。 
图1是大鼠胰岛素启动子区和外显子1、内含子1和外显子2的示意图。大鼠胰岛素启动子显示具有已知的序列元件和融合的外显子1与外显子2； 
图2：顶部的图(top panel)是在三种不同的葡萄糖浓度下转染rips-luc之后48小时INS-1细胞溶解的荧光素酶活性。底部的图(bottom panel)是在高葡萄糖浓度下转染rips-luc之后，在不同的培养时间，培养基溶液的荧光素酶活性，在没有葡萄糖和正常葡萄糖浓度中没有荧光素酶活性(数据未显示)； 
图3：(3A)：RIP3.1-DsRed载玻片，顶部左侧：绿色表示抗胰岛素；顶部中间：红色表示抗-dsred；顶部右侧表示它们的共聚焦图像。底部表示连续的切片和类似的胰岛结构，底部左侧：绿色表示抗胰高血糖素；底部中间：红色表示抗-dsred。底部右侧表示它们的共聚焦图像。(3B)：RIP-4.1-dsred；(3C)：RIP-1.1-dsred；(3D)：RIP-1.1-dsred载玻片；(3E)：pCMV-dsred；F：正常对照； 
图4：(4A)：喂食10％葡萄糖的RIP3.1-DsRed大鼠的图像，顶部右侧绿色表示抗胰岛素；顶部中间红色表示抗-dsred；顶部左侧表示它们的共聚焦图像。底部右侧绿色表示抗胰高血糖素；底部中间红色表示抗-dsred；底部左侧：它们的共聚焦图像；(4B)pRIP3.1-DsRed大鼠禁食过夜的图像； 
图5：顶部的图：来自对照大鼠(左侧)和UTMD处理的大鼠(中间表示喂食的大鼠，右侧表示禁食的大鼠)的显微切片(400×)。采用原位PCT对DsRed质粒DNA进行染色，其在整个处理的胰腺中可以看到。胰岛清晰可见(箭头所示)。底部的图：来自使用对照大鼠(左侧)和UTMD处理的大鼠的RIP6.1-DsRed切片(400×)(中间表示喂食大鼠，右侧表示禁食大鼠)。采用原位PCT对DsRed mRNA染色，其位于胰岛中心(中间/喂食)。在胰岛边缘进行染色(右侧/禁食大鼠)； 
图6显示了免疫荧光显微镜的结果。顶部的图显示了来自30天实验的胰岛的代表性实例。FITC标记的抗胰岛素(绿色)证明了β细胞，而DsRed标记的抗胰高血糖素证明了α细胞。利用Nkx2.2、Nkx6.1、Pax4、Ngn3和MafA的超声靶向的基因治疗导致了α细胞占优势的胰岛的形成。相反，NeuroD1处理的大鼠具有接近正常的胰岛结构，其中周围α细胞围绕中央的β细胞。底部左侧图显示了不同组中每个载玻片的胰岛数。正常对照和NeuroD1处理的大鼠具有的每载玻片的胰岛数均显著高于所有其他组(通过ANOVA，*p＜0.0001)。底部右侧图显示了每个胰岛β细胞的数量。正常对照和NeuroD1处理的大鼠具有的每个胰岛的β细胞的比例均显著高于所有其他组(通过ANOVA，*p＜0.0001)； 
图7显示了在30天实验中血糖(右侧上面的图)、血液胰岛素(右侧下面的图)和C肽(右侧上面的图)的结果。在第3天，与正常对照相比，所有STZ处理的大鼠均具有明显升高的血糖以及降低的胰岛素和C肽(p＜0.0001)。但是，到第30天之前，仅NeuroD1处理的大鼠的血糖、胰岛素和C肽恢复到了正常或接近正常的水平。底部右侧图显示了与正常对照(n＝3)和DsRed处理的大鼠(n＝3)相比，6只NeuroD1处理的大鼠(n＝6)的不同的组中葡萄糖耐量试验的结果。在STZ诱发糖尿病之后，用NeuroD1进行基因治疗导致葡萄糖耐量恢复正常； 
图8显示了细胞增殖的标记物。顶部左侧和中间图显示了用FICT标记的抗胰岛素(绿色)和DsRed标记的抗BrdU(左侧)和抗-Ki67(中间) 共染色的胰岛。顶部右侧图显示了Ki67阳性、胰岛素阳性细胞的数量，在NeuroD1处理的STZ大鼠中该数值在统计学上显著地高于正常对照、STZ处理对照大鼠、或通过UTMD采用DsRed处理的STZ处理大鼠(p＜0.0001)。底部的图显示了来自采用抗Ck19(左侧，绿色)、抗胰岛素(左侧中间，红色)、抗ngn3(蓝色，右侧中间)染色的NeuroD1处理的STZ大鼠的胰岛和它们的共聚焦图像(右侧)。胰岛素阳性的β细胞由ngn3而不是Ck19共染，表明再生的胰岛不是从导管细胞起源的； 
图9显示了来自通过UTMD用各种基因和基因的组合处理大鼠的实验中的代表性胰岛图像。采用DAPI(对于细胞核为蓝色染色)、抗胰岛素(绿色)和抗胰高血糖素(红色)的三重染色。当用组合处理时的细胞周期蛋白D2、CDK4和GLP1(胰岛稳定时间多达180天)。上面左侧图显示了来自未经UTMD处理的正常对照大鼠的代表性胰岛。表达胰岛素的β细胞的致密胰岛核心(绿色)被表达胰高血糖素(红色)的周围α细胞的小囊环绕。上部右侧图显示了在STZ诱发糖尿病之后的代表性胰岛残余物。仅存在少数β(beat)细胞。底部左侧图显示了在采用GLP1基因通过UTMD处理之后胰岛再生的实例。比正常小的胰岛存在一些β细胞(绿色)和α细胞(红色)，但结构不正常。对于利用细胞周期蛋白D2、CDK4和CDK6的单个基因通过UTMD处理的大鼠存在类似发现(未显示)。底部右侧图显示了在采用细胞周期蛋白D2、CDK4和GLP1的组合通过UTMD处理后几乎正常的胰岛(这些胰岛稳定时间多达180天，并伴随逆转糖尿病使其具有正常血糖、胰岛素和C肽水平)； 
图10是线图，显示了对于利用UTMD基因治疗处理的大鼠以及正常对照和未采用UTMD处理的STZ糖尿病大鼠的各组胰岛，随时间的血糖水平。可以看出，采用细胞周期蛋白D2、CDK4、CDK6或GLP1的单基因治疗未导致血糖的正常化。然而，在该具体实验中，包含细胞周期蛋白D2、CDK4和GLP1的组合，或者细胞周期蛋白D2、CDK4、CDK6和GLP1的组合的组合物使血糖恢复至正常水平，持续4周。对另一组动物进行的更长时期的研究证实了效应的持续时间多达180天； 
图11是HIP-hNeuroD1质粒的图谱； 
图12是RIP3.1-DsRed质粒的图谱； 
图13是RIP-DsRed 4.1质粒的图谱； 
图14是RIP-DsRed 5.1质粒的图谱；和 
图15是RIP-DsRed 2.1质粒的图谱。 
发明详述 
通过研究以下本发明的详细描述，本发明的新特征对于本领域技术人员来说将变得明显。但是，应当理解，所提供的发明详述和具体实例在表明本发明的特定实施方案的同时仅用于说明目的，因为通过发明详述和随后的权利要求书，在本发明的精神和范围内进行的各种改变和修改对于本领域的技术人员来说将变得明显。 
在不脱离随后的权利要求书的精神和范围的情况下，本发明可以包括根据本文所描述的教导可能的各种修改和变化。预期本发明的用途可以涉及具有不同特征的组分。意图是通过所附的权利要求书来定义本发明的范围，对各方面的等同替代给出完整认识。 
如本文所用，术语“大体上如SEQ ID NO.(#)中记载的序列”，“类似于......的序列”，“核苷酸序列”和类似术语，针对核苷酸，实质上指相当于本文确定称作SEQ ID NO.：1.的序列的任何部分。这些术语是指合成的以及天然得到的的分子，并包括具有生物学上、免疫学上、实验地或其他功能上相等的活性，例如关于通过核酸片段的杂交或者编码所有或者具有编码全部或部分NeuroD活性的能力的序列。自然地，这些术语意在包括如通过其线性顺序所指定的此序列中的信息。 
如本文所用，术语“基因”是指编码功能蛋白、多肽或肽的单位。本领域的技术人员将理解，该功能术语包括基因组序列、cDNA序列或其片段或组合，以及基因产物，基因产物包括通过人类劳动可以改变的那些。纯化的基因、核酸、蛋白质等用于指代当从至少一个污染了其通常相关的核酸或蛋白质中鉴定和分离的这些实体。 
如本文所用，术语“载体”是指将DNA片段(或者多个片段)从一个细胞转移到另一个细胞的核酸分子。该载体可以进一步地定义为用于传送特定的序列的载体或者包括可操作地连接至该特定的序列的启动子的表达载体，或者用于引起该启动子被引入的载体。该载体可以独立于宿主细胞染色体的状态存在，或者可以被整合到宿主细胞染色体中。 
如本文所用，术语“宿主细胞”是指已被改造为包含核酸片段或改变的片段的细胞，无论是古菌、原核或真核细胞。因此，改造的或者重组的细胞能与自然存在的不含通过人类劳动经重组引入的基因的细胞相区分。 
如本文所用，术语“控制序列”是指对于特定宿主有机体内可操作连接的序列的表达必须的DNA序列。适合于原核生物的控制序列，例如包括启动子、任选地包括操纵序列、核糖体结合位点和转录终止子。当细胞培养物生长并成熟时，例如对数期过程中，可以使用高度调节的可诱导启动子，其将Fab’多肽合成抑制在生长抑制量以下。 
如本文所用，术语“可操作地连接”是指第一和第二核酸序列之间的有功能的联系。例如前导肽或分泌导肽的DNA如果其被表达为参与多肽分泌的前蛋白质，则被可操作地连接至多肽的DNA；启动子或增强子如果其影响序列的转录，则可操作地连接至编码序列；或者核糖体结合位点如果其定位在有利于翻译的位置，则可操作地连接至编码序列。一般来说，“可操作地连接”意味着要连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导的条件下是连续的并处在同一个阅读框。增强子不必是连续的。连接通过在合适的限制性位点的接合来完成。如果此位点不存在，则按照常规做法使用合成的寡核苷酸接头或连接子。 
如本文所用，术语“细胞”和“细胞培养物”可交换地使用，最终目的是此名称包括后代。因此，单词“转化体”和“转化细胞”包括原代的受试者细胞和从其中衍生的培养物，不考虑转移的数量。还应理解，由于有意或偶然突变，可能不是所有后代的DNA含量都恰好完全相同。与最初转化细胞具有相同的所筛选的功能或生物学活性的突变后代包括在内。不同名称从上下文中将变得清楚。 
如本文所用，“质粒”通过小写字母p开头和/或接着是大写字母和/或数字来命名。起始质粒可以是商业上可得的，在不受限的基础上可以买到，或者可以根据公开的步骤由该可买到的质粒构建。此外，其他等同质粒在本领域中是已知的并且对于普通技术人员来说是显而易见的。 
如本文所用，术语“蛋白质”、“多肽”或“肽”是指包含经肽键连接的氨基酸的化合物并且可以交换地使用。 
如本文所用，术语“内源性”是指其来源来自细胞之内的物质。内源性物质通过细胞的代谢活性产生。但是，内源性物质仍然可以通过操作细胞代谢，例如，使细胞表达编码该物质的基因来产生。 
如本文所用，术语“外源性”是指其来源为细胞之外的物质。当涉及核酸时，“外源性”是指细胞的外部，或者与细胞同源但位于宿主细胞核酸之内的位置的核酸序列，在宿主细胞核酸内通常找不到该元件。外源性 物质仍然可以通过本领域技术人员已知的多种代谢或诱导方式中的任一种，通过细胞进行内化。 
基因的基因组形式或克隆包含由称为“内含子”或“间隔区(interveningregion)”或“间隔序列(intervening sequence)”的非编码序列隔开的编码区。内含子是被转录为核RNA(hnRNA)的基因的片段；内含子可以包含调节元件例如增强子。内含子可以从核或初级转录物中去除(removed)、切割(excised)或“剪切(spliced out)”；因此在信使RNA(mRNA)转录物中不存在内含子。在翻译过程中，mRNA起作用，指定新生多肽中氨基酸的序列或顺序。 
除了包含内含子之外，基因的基因组形式也可以包含位于存在于RNA转录物中的序列的5’和3’端的序列。这些序列称作“侧翼”序列或区域(这些侧翼序列位于存在于mRNA转录物中的非翻译序列的5’和3’端)。5’侧翼区可以包含调节序列，例如控制或影响基因的转录的启动子和增强子。3’侧翼区可以包含指导转录终止、转录后剪切和多聚腺苷酸化的序列。 
将DNA分子称为具有“5’端”和“3’端”，因为采用使一个单核甘酸五糖环的5’磷酸根与其临近的3’氧在一个方向经磷酸二酯键连接的方式使单核甘酸反应为寡核苷酸。因此对于寡核苷酸的末端而言，如果其5’磷酸根未与单核甘酸戊糖环的3’氧连接则称之为5’端”，如果其3’氧未与随后的单核甘酸戊糖环的5’磷酸根连接则称为3’端”。如本文所用，即使在较长寡核苷酸之内的核酸序列也可以称为具有“5’端”和“3’端”。在线型或环状DNA分子中，分立元件(discrete element)称之为5’的“上游”或3’的“下游”元件。该术语反映了这样的事实，即转录沿DNA链以5’到3’的方式进行。 
如本文所用，术语“转化”是指一种方法，通过该方法使外源DNA进入和改变受体细胞，所述的外源DNA例如包括启动子和编码序列的一个或多个质粒，所述的编码序列表达NeuroD、ngn3、GLP1、PDX1、Mafa、β细胞素、Nkx2.2、Nkx6.1、PAX4、Isl1、细胞周期蛋白D2(和细胞周期蛋白家族的其他成员)、CDK4(和细胞周期蛋白依赖性激酶家族的其他成员)和针对细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的siRNA，例如p16(和INK4家族的其他成员)或p27(和CIP/KIP家族的其他成员)。其可以在自然条件下发生，或者利用本领域中熟知的各种方法在人工条件下发生。转化可以依赖于任何用于将外源核酸序列***到原核或真核宿主细胞中的已知 的方法。所述方法基于所转化的宿主细胞来选择并且可以包括但不限于：病毒感染、电穿孔、脂质转染和粒子轰击(particle bombardment)。此种“经转化的”细胞包括稳定地转化的细胞，其中所***的DNA能够作为自主地复制的质粒，或者作为宿主染色体的一部分复制。 
如本文所用，术语“转染”是指将外来的DNA引入到真核细胞中。转染可以通过本领域中已知的多种方式来实现，这些方式包括，例如磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、微注射、脂质体融合、脂质转染、原生质体融合、反转录病毒感染和基因枪法(biolistics)。因此，术语“稳定的转染”或“稳定地转染的”是指将外来的DNA引入并整合到被转染的细胞的基因组中。术语“稳定的转染子”是指已将外来的DNA稳定地整合到基因组DNA的细胞。该术语还包含在有限的时间内瞬时表达***的DNA或RNA的细胞。因此，术语“瞬时转染”或者“瞬时地转染的”是指将外来的DNA引入到细胞中，在该细胞中外来的DNA未整合到转染细胞的基因组中。外来的DNA在被转染的细胞的核中停留数天。在该时间期间，所述的外来的DNA受到控制染色体中外源基因表达的调节控制。术语“瞬时转染子”是指已接受外来的DNA但未能整合该DNA的细胞。 
如本文所用，术语“载体(vector)”与核酸分子有关地使用，所述核酸分子将DNA片段(或者多个片段)从一个细胞转移到另一个细胞。术语“载体(vehicle)”有时与“载体(vector)”交换使用。如本文所用的术语“载体(vector)”也包括与重组DNA分子有关的表达载体，所述的重组DNA分子包含需要的编码序列和合适的核酸序列，其对于在特定宿主生物中表达可操作地连接的编码序列是必需的。对于在原核生物中表达，核酸序列通常必需包括常与其他序列一起存在的启动子、操纵基因(任选)和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、增强子以及终止和多聚腺苷酸化信号。 
如本文所用，术语“扩增”当用于核酸时是指通过本领域中已知的任何方法生成核酸序列的大量拷贝。扩增是涉及模板特异性的核酸复制的特殊情况。模图特异性频繁地以“靶”特异性的术语进行描述。靶序列在探寻与其他核酸区分的意义上是“靶”。扩增技术已主要设计用于该区分。 
如本文所用，术语“引物”是指寡核苷酸，无论是在纯化的限制性酶切产物中自然产生的还是合成产生的，当置于诱导合成与核酸链互补的引 物延伸产物的条件下(即，在核苷酸和诱导剂例如DNA聚合酶的存在下并在合适的温度和pH下)，其能够作为合成的起始点。为了进行最大效率扩增，引物可以是单链的，但也可选地为双链的。如果是双链的，则在用于制备延伸产物之前，首先将引物处理，从而将其链分离。引物必须足够长从而在诱导剂存在下引导延伸产物的合成。引物的准确长度将取决于多种因素，包括温度、引物的来源和方法的应用。 
如本文所用，术语“探针”是指寡核苷酸(即核苷酸序列)，无论其是在纯化的限制性酶切物中自然产生的还是合成、重组或者通过PCR扩增产生的，其能够杂交至另一个目的寡核苷酸。探针可以是单链的或者双链的。探针在具体基因序列的检测、鉴定和分离中是有用的。预期在本发明中使用的任何探针将用任何“报告分子”标记，以便在任何检测***中均可检测到，所述检测***包括但不限于酶(例如ELISA，以及基于酶的组织化学试验)、荧光的、放射性的和发光***。本发明无意于受到任何特定检测***或标记的限制。 
如本文所用，术语“靶”如果用于聚合酶链式反应，是指与用于聚合物链式反应的引物结合的核酸区域。因此，试图将“靶”与其他核酸序列区别。将“片段”定义为靶序列之内的核酸区。当靶用在细胞或组织时，是指靶向利用细胞的外源载体(例如病毒、脂质体甚至裸露的核酸)将核酸递送到细胞中，从而使其改变细胞的功能例如表达一个或多个BTC或PDX1基因。 
如本文所用，术语“聚合酶链式反应”(“PCR”)是指K.B.Mullis的第4,683,195、4,683,202和4,965,188号美国专利的方法，据此通过引用并入本文，其描述了不克隆或纯化，增加基因组DNA混合物中靶序列的片段的浓度的方法。这种用于扩增靶序列的过程包括：相对于包含需要的靶序列的DNA混合物，远远过量的两种寡核苷酸引物，接着是在DNA聚合酶存在下按照精确顺序的热循环。该两种引物与双链靶序列中其相应的链互补。为了使扩增有效，使混合物变性，然后使引物退火到靶分子内其互补序列上。在退火之后，采用聚合酶延伸引物从而形成一对新互补链。变性、引物退火和聚合物延伸的步骤可以重复多次(即变性、退火和延伸构成一个“循环”；可以有多个“循环”)以便获得需要的靶序列的高浓度扩增片段。需要的靶序列的扩增片段的长度由各引物之间的相对位置确定，因此，该长度为可控制的参数。由于过程的重复方面，该方法被称之为“聚 合酶链式反应”(下文称“PCR”)。由于靶序列的需要的扩增片段成为混合物中主要的序列(在浓度上)，因此将它们称为“PCR扩增的”。通过PCR，可以通过几种不同的方法(例如，采用标记探针的杂交；并入生物素化引物，接着是亲和素-酶缀合物检测；将32P标记的脱氧核苷三磷酸例如dCTP或dATP包括于扩增片段中)将基因组中特异性靶序列的单拷贝扩增至可检测的水平。除了基因组DNA外，任何寡核苷酸序列都可以采用合适的引物分子进行扩增。特别地，通过PCR方法自身产生的扩增片段本身是随后PCR扩增的有效模板。 
如本文所用，术语“染色试剂(staining reagent)”是指包含该试剂的核酸序列的全部杂交带(hybridization pattern)。对部分基因组特异的染色试剂提供靶向和非靶向染色体物质之间的对比。通过采用一种或多种颜色(多色染色带)和/或其他指示剂方法检测到的部分基因组上的任何需要的染色带可以检测到大量不同的畸变。 
如本文所用，术语“转基因”是指可以人工***到哺乳动物基因组，例如活体动物的哺乳动物细胞中的遗传物质。本文使用术语“转基因动物”来描述非人类动物，通常是哺乳动物中存在的非内源(即异源)核酸序列，该序列作为其细胞的一部分中的染色体外元件存在或者稳定地整合到种系DNA中(即在其细胞的大部分或全部的基因组序列中)。根据本领域中熟知的方法，通过例如宿主细胞的胚胎或胚胎干细胞的基因操作，将异源核酸引入到该转基因动物的种系中。 
如本文所用，术语“转基因”是指这样的异源核酸，例如，诸如表达构建物(例如用于生成“敲入”转基因动物)等形式的异源核酸或者通过***在靶基因之内或者邻近导致靶基因表达(例如用于生产“敲除”转基因动物)降低的异源核酸。基因的“敲除”意思是基因的序列的改变，这种改变导致了靶基因的功能降低，优选地，使得靶基因表达不能检测到或者不明显。转基因敲除动物包括靶基因的异源敲除或者靶基因的同源敲除(homozygous knock-out)。 
如本文所用，术语“干细胞”是指全能或多能干细胞，例如胚胎干细胞，以及胚胎发育的非常早期中的这种多能细胞，包括但不限于发育的囊胚期中的细胞。在本发明中应用的一个具体实例中，干细胞可以是尚未分化为腺泡细胞或β细胞的胰腺细胞前体，并且用作靶点以表达NeuroD、ngn3、GLP1、PDX1、Mafa、β细胞素、Nkx2.2、Nkx6.1、PAX4、Isl1、 细胞周期蛋白D2(和细胞周期蛋白家族的其他成员)、CDK4(和细胞周期蛋白依赖性激酶家族的其他成员)和针对细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的siRNA，例如p16(和INK4家族的其他成员)或p27(和CIP/KIP家族的其他成员)。 
在先前的专利申请中，本发明人证明了利用超声靶向破坏微泡(UTMD)可以使基因治疗在正常大鼠中靶向胰岛。通过超声，在胰腺微循环内选择性地破坏携带质粒DNA的静脉注射微泡，从而局部地递送质粒。通过在质粒DNA内并入大鼠胰岛素-I启动子实现胰岛特异性。现已发现，使用UTMD可以用于递送单独的和与PDX1联合的β细胞素(BTC)至链脲霉素(STZ)诱导的糖尿病大鼠中。在采用BTC和PDX1处理的大鼠中观察到导致胰高血糖素染色细胞的原始胰岛样细胞团的靶细胞的转化。在该研究中，在处理之后，细胞团消失了30天。在使用UTMD将胰腺腺泡细胞转化为具有β细胞标记物的产胰岛素细胞之后，尽管未观察到正常胰岛的再生，但使糖尿病逆转多达15天。 
糖尿病越来越流行，影响全世界超过5％的人口。正在大力寻找包括新药物、胰岛移植和基因治疗在内的新的治疗策略以治疗糖尿病。在体内控制胰腺基因靶向胰岛递送是用于糖尿病基因治疗的关键方法。到目前为止，研究表明在体内腺病毒、腺相关病毒、慢病毒(lentivirus)和单纯性疱疹病毒-1载体呈现出向胰岛中的有效基因转移，但遭受宿主免疫反应和载体细胞毒性。包括裸露DNA和DNA复合物的非病毒基因递送***也已经证明，由于具有瞬时转基因表达，胰岛细胞转染水平要低得多。然而，似乎可能的是非病毒载体***将更容易满足临床试验中的生物安全性问题。 
超声靶向破坏微泡(UTMD)已被用于在体内递送基因或药物至胰岛。简单地说，将基因掺入到阳离子脂质体中，然后连接到含气体微泡的磷脂外壳，然后将其静脉注射并通过超声在完整胰岛的微循环内破坏。UTMD方法使能够转染存在大部分β细胞的整个胰岛中心。已将UTMD与大鼠胰岛素启动子(RIP)结合以增强β细胞的特异性。本发明通过改变RIP片段的长度，极大地提高了基因表达的差异效率。使胰岛素基因的外显子1和外显子2的非编码区融合，以使质粒的下游基因功能增强。在转录水平上，胰岛素mRNA的融合在如此高的水平上调基因表达，以至于使得它们模拟正常胰岛β细胞中的正常胰岛素mRNA水平。随后，使用UTMD 将在大鼠胰岛素启动子驱动的控制下的胰岛素基因融合质粒递送至成人、活体动物的完整胰岛中，从而提供了用于糖尿病的基因治疗的安全的、组织特异性的、高效有效的和受调节的基因表达。 
新的启动子 
材料和方法。大鼠胰岛素启动子和质粒构建物。利用分别含有KpnI和xhol限制性位点的PCR RIP正向引物(5′-G CTG AGC TAA GAA TCC A-3′)(SEQ ID NO.：3)、RIP2.1反向引物(5′-CTGAGC ATTTTCCACC-3′)(SEQ ID NO.：4)、RIP1.1反向引物(5’-GGGAGTTACTGGGTCTCCA-3’)(SEQ ID NO.：5)、RIP4.1反向引物(5’-GCAGAATTCCTGCTTGCTGATGGTCTA-3’)(SEQ ID NO.：6)、RIP3.1反向引物(5’-GTTGGAACAATGACCTGGA-3’)(SEQ ID NO.：7)和反向引物(5-GGCAGAAGGACAGTGATCT-3)(SEQ ID NO.：8)，从SD大鼠DNA中扩增得到大鼠胰岛素基因1启动子片段(RIP2.1(-412到-303)、RIP1.1(-412到-1)、RIP4.1(-412到+43)、RIP3.1(-412到+165)，Genbank登记号J00747，其在本文中被定义为SEQ ID NO.：1，和人胰岛素启动子的Genbank登记号NC_000011-定义为SEQ ID NO.：2，通过引用将二者并入本文)。这些引物的序列列于表1中。将产生的DNA片段亚克隆至pGL2-basic萤火虫报告质粒和pDsRed1-1报告载体中。SV40-启动子萤火虫荧光素酶报告质粒、pGL2-Control来自Promega，pDsRed1-1和pCMV-DsRed-express-1来自Clonetech。大鼠基因组DNA采用QIAampBlood试剂盒(Qiagen Inc，Valencia，CA)，按照生产商的说明从大鼠的外周血液中提取。相应的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳验证并通过QIAquickGel Extraction试剂盒(QIAGEN)纯化。为了确认序列，采用dRhodamineTerminator Cycle Sequencing Kit(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)在ABI 3100 Genomic Analyzer上对PCR产物直接进行测序。质粒切割、连接、亚克隆、分离和纯化通过标准程序进行，并再次测序以确认不存在人工突变。 
表1：引物序列(利用相同正向引物的大鼠胰岛素基因启动子) 
大鼠UTMD方案。经腹膜内使用***(100mg/kg)和赛拉嗪(5mg/kg)麻醉SD大鼠(250-350g)。通过切开，向右颈内静脉***聚乙烯管(PE 50，Becton Dickinson，MD)。将前腹部剃毛并放置S3探针(Sonos 5500，PhilipsUltrasound，Andover，MA)，以成像容易指认的左肾和脾脏。胰脏位于其之间，因此将探针调节至靶向胰脏的位置并在适当的位置将其夹紧。利用输液泵，在20分钟内以3ml/h的恒定速率输入1ml的微泡溶液。在输液的持续时间内，利用机械指数为1.2-1.4并且深度为4cm的超谐波(发送1.3MHz/接收3.6MHz)实现微泡的破坏。ECG(心电)触发(在R波达峰后80ms)超声脉冲以便在每4个心动周期递送一股4帧的超声。这些设置之前已显示为利用UTMD进行基因递送的最佳超声参数。在每次递送结束时结扎颈静脉并封闭皮肤。在递送之后检测所有大鼠的常态行为。4天后处死大鼠并获取胰腺。 
含有质粒的脂质稳定微泡的生产。制备了脂质稳定的微泡5，6。简单地说，将DPPC(二棕榈酸磷脂酰胆碱，Sigma，St.Louis，MO)2.5mg/ml、DPPE(二棕榈酰磷脂酰乙醇胺，Sigma，St.Louis，MO)0.5mg/ml和10％甘油的溶液与2mg质粒溶液以2∶1的比例混合。将0.5ml该磷脂-质粒溶液的等分置于1.5ml干净的小瓶中，留下的顶部空间用全氟丙烷气体(AirProducts，Inc，Allentown，PA)填充。将每个小瓶在40℃下孵育30分钟，然后通过牙科用混汞器(VialmixTM，B ristol-Myers Squibb Medical Imaging，N.Billerica，MA)机械震荡20秒。脂质稳定的微泡的外观显示出为乳白色悬浮液，漂浮在含有未接触的质粒DNA的液体层的顶部。丢弃下层清液并用PBS清洗微泡3次以去除未连接的质粒DNA。上层中微泡的平均直径和浓度通过粒子计数器(Beckman Coulter Multisizer III)测定。 
用于DsRed DNA检测的原位PCR。DsRed引物。使用直接导向DsRedDNA的一对DsRed引物，该对引物为DsRed 125+(5’-GAGTTCATGCGCTTCAAGGTG-3’)和DsRed 690-(5’-TTGGAGTCCACGTAGTAGTAG-3’)。在处死大鼠之后，立即用200ml动脉内冷却盐水从大鼠中去除血液，接着用100ml的2％多聚甲醛和0.4％戊二醛灌注固定。将胰腺切割成0.5cm的片并置于20％蔗糖溶液中，在4℃下过夜，然后在-86℃下将其置于OTC模型中。将5μm厚的冷冻切片放置在涂有甲硅烷的载玻片上并在4℃下在4％多聚甲醛中固定15分钟，使用PBS中的10mM甘氨酸淬冷、PBS冲洗、用0.5％PBS中的Triton X-100 进行可渗透化处理10分钟和使用PBS冲洗10分钟。将盖玻片在一侧用一滴指甲油固定。之后，将载玻片直接放置在热循环仪的小格(block)上的铝‘皿(boat)’中。按照生产商的说明利用Assembly Tool(Perkin Elmer)，将50μl PCR反应溶液(0.8单位的Taq DNA聚合物、2μl DsRed引物、3μlDIG-dNTP、5μl 10×缓冲液和40μl水)加至每个载波片中并盖上AmpliCoverDisc和Clips。采用Perkin-Elmer GeneAmp system 1000如下地进行原位PCR：在94℃下起始的保持(1分钟)之后，进行PCR 11个循环(94℃1分钟、54℃1分钟和72℃2分钟)。扩增之后，将载玻片分两次浸入2×SSC10分钟，0.5％多聚甲醛5分钟和PBS 5分钟。利用用于DIG检测(Roche)的荧光抗体增强子，之后进行组织化学染色(PCR DIG Prob Synthesis Kit(Roche Co.；Cat.NO：1636090))检测掺入地高辛的DNA片段。首先，将切片与封闭液一起孵育30分钟以减少抗体与胰腺组织的非特异性结合。然后，在保湿室中，将切片与50μl抗-DIG溶液(1∶25)一起在37℃下孵育1小时。接着，用PBS清洗载玻片3次并伴随摇动，每次持续5分钟，再一次地将载玻片与50μl抗小鼠-IgG-地高辛抗体溶液(1∶25)一起在37℃下孵育1小时。用PBS清洗载玻片3次并伴随摇动，每次持续5分钟。将载玻片与50μl抗-DIG荧光溶液(1∶25)一起在37℃下孵育1小时。然后，用PBS清洗载玻片3次并伴随摇动，每次持续5分钟。最后，将切片在70％EtOH、95％EtOH和100％EtOH中进行脱水，各进行2分钟，用二甲苯清洗并盖上盖玻片。 
用于检测DsRed mRNA的原位RT-PCR。DsRed引物。采用针对DsRedcDNA的一对引物，该对引物为DsRed 125+(5’-GAGTTCATGCGCTTCAAGGTG-3’)和DsRed690-(5’-TTGGAGTCCACGTAGTAGTAG-3’)。如上所述，制备灌注固定的冷冻切片。在每个载玻片上，用50μl的混合溶液(Invitrogen)(5μl DNase I、5μl 10×DNase缓冲液和40μl水)进行DNase处理，盖上盖玻片，在25℃下孵育过夜，之后用PBS清洗2次每次5分钟。 
反转录：在具有50μl的混合溶液(RT-PCR的逆转录酶第一链合成***(Superscript First-strand synthesis system)，Invitrogen试剂盒#11904-018)(1μl的DsRed727-引物(5’-GATGGTGATGTCCTCGTTGTG-3’)、5μl DTT溶液、2.5μl dNTP、5μl 10×缓冲液、5μl的25mM MgCl、29μl的水和2.5μl的SuperScript II RT)的50μl总体积中，在每个载玻片上合成第一链cDNA。 覆盖玻片，然后将载玻片在42℃下孵育2小时，用PBS清洗2次每次5分钟，用100％EtOH冲洗1分钟并干燥。 
用于检测DsRed蛋白质、胰岛素和胰高血糖素的免疫组织化学。在4℃下，将5-8μm厚的低温组织切片器切片在4％多聚甲醛中固定15分钟并且用PBS中的10mM甘氨酸淬冷5分钟。然后用PBS冲洗切片3次，用0.5％PBS中的Triton X-100可渗透化处理10分钟。切片采用10％山羊血清在37℃下封闭1小时和使用PBS冲洗3次。加入初级抗体(Sigma Co.)(用封闭液稀释为1∶10000)并在4℃下孵育过夜。用PBS在清洗3次5分钟之后，加入二抗(Sigma Co.，结合FITC的抗小鼠IgG)(用封闭液稀释为1∶500)并在37℃下孵育1小时。用PBS冲洗切片5次，共10分钟，然后包埋。 
细胞培养和瞬时转染分析。将INS-1细胞系(大鼠胰岛素瘤，由DukeUniversity的Newgard lab提供)保持在对细胞适当的培养基(cell-appropriate media)中。用1μg的荧光素酶报告基因质粒、0.02μg的pTS-RL海肾荧光素酶作为内对照质粒和3μl Lipofectamine 2000，在100μl不含血清的DMEM的每个孔中转染INS-1细胞。在转染之后48小时，利用双荧光素酶检测***(Dual Luciferase Assay system)(Promega)和TurnerTD 20/20光度计测定细胞收获和萤火虫与海肾荧光素酶的活性。 
统计分析。通过双因素ANOVA比较了研究小组之间荧光素酶活性的差异。认为p值＜0.05具有统计学上的显著性。只有当ANOVA F值具有统计学上的显著性时才进行Post-hoc Scheffe检验。 
图1是大鼠胰岛素启动子区与外显子、内含子1和内含子2的示意图。大鼠胰岛素启动子显示具有已知的序列元件和融合的外显子1和外显子2。 
图2：顶部的图是INS-1细胞在三种不同的葡萄糖浓度下转染rips-luc后48小时的荧光素酶活性。底部的图是培养基溶液在高葡萄糖浓度下转染rips-luc后在不同的培养时间内的荧光素酶活性，在不添加葡萄糖和正常的葡萄糖浓度下没有荧光素酶活性(数据未显示)。 
图3A：RIP3.1-DsRed载玻片，顶部左侧：绿色为抗胰岛素；顶部中间红色为抗-dsred；顶部右侧为它们的共聚焦图像。底部为连续的切片和相似的胰岛结构，底部左侧：绿色为抗胰高血糖素；底部中间为抗-dsred，底部右侧为它们的共聚焦图像。B：RIP-4.1-dsred；C：RIP-1.1-dsred；D：RIP-1.1-dsred载玻片；E：pCMV-dsred；F：正常对照。 
图4：A图像为喂食10％葡萄糖的pRIP3.1-DsRed。A顶部右侧绿色为抗胰岛素；A顶部中间红色为抗-dsred，A顶部左侧为它们的共聚焦图像；A底部右侧绿色为抗胰高血糖素；A底部中间红色为抗-dsred；A底部右侧：它们的共聚焦图像；B图像为pRIP3.1-DsRed大鼠禁食过夜。 
图5：顶部的图。来自对照大鼠(左)和UTMD处理的大鼠的显微切片(400X)(中间为喂食大鼠，右侧为禁食大鼠)。使用原位PCR对DsRed质粒DNA染色，其在整个处理的胰腺可看到。明显地观察到胰岛(箭头标示)。底部的图。来自对照大鼠(左)和UTMD处理的大鼠的RIP6.1-DsRed切片(400X)(中间为喂食大鼠，右侧为禁食大鼠)。使用原位PCR对DsRedmRNA染色，其位于胰岛中心(中间/喂食)。在胰岛边缘染色(右侧/禁食大鼠)。 
发现大鼠胰岛素启动子驱动荧光素酶基因在大鼠胰岛素瘤细胞系(INS-1)中的转染。驱动在质粒中表达的传统大鼠胰岛素启动子显示出低的组织表达效率并且在体内递送***中无高度的组织特异性。本发明包括胰岛素启动子，胰岛素启动子包括胰岛素1基因外显子1和内含子1和之前未用于胰岛素基因调节的部分外显子2。在特定实施方案中，胰岛素启动子为大鼠胰岛素启动子、人类胰岛素启动子或者它们的组合。图2显示了在正常的葡萄糖水平下，RIP3.1的荧光素酶活性显示出比RIP2.1(截短的RIP启动子)增加4726倍，比RIP1.1(全长的传统RIP)增加20倍，甚至为CMV荧光素酶的3.1倍。在没有葡萄糖的条件下，对于所有构建体，INS-1的基因表达均受到显著抑制，RIP3.1的荧光素酶活性仍然为RIP1.1的6.6倍，CMV的2.6倍。在高葡萄糖水平下，RIP3.1的荧光素酶活性为RIP2.1的3515倍，RIP1.1的6.9倍，CMV的0.6倍。出人意料的是在高葡萄糖条件下，在转染后第8、16、24、32和48小时，从RIP3.1培养皿的培养基溶液中可以检测到荧光素酶活性。在没有葡萄糖和正常的葡萄糖培养条件下没有发现分泌物(数据未显示)。RIP3.1驱动的荧光素酶不仅具有高的效率和已证明的葡萄糖依赖性，其还将表达的蛋白质分泌到INS-1细胞系中的培养基溶液中。 
RIP驱动的DsRed质粒递送到UTMD处理的活的大鼠的胰岛中。为了更好的理解在实际条件下，在活的动物胰岛中，不仅仅在细胞系中的基因表达和这些RIP启动子的调节，将这些RIP启动子的驱动DsRed质粒递送到用超声靶向破坏微泡(UTMD)处理的活的大鼠的胰腺中，在UTMD 处理后4天杀死大鼠。图3显示了在包括胰岛核心和边缘的完整胰岛中检测到RIP3.1和RIP4.1的DsRed蛋白，但在非胰岛区域观察不到。出人意料地，共聚焦图像显示，在胰岛的β细胞和α细胞中检测到DsRed蛋白。DsRed蛋白信号在全长RIP1.1中非常低，在截短的RIP2.1中几乎看不到。DsRed蛋白的信号在CMV-DsRed质粒处理的大鼠的胰腺载玻片上的每个地方均可看到。但在正常的大鼠对照胰腺载玻片上，检测不到DsRed信号。 
接着，确定递送的RIP质粒的基因表达是否与发现在体外具有INS-1细胞系一样在大鼠胰岛中通过葡萄糖水平可调节。选择RIP3.1DsRed并用于处理大鼠，将大鼠分为数组：禁食(12小时)和喂食(10％葡萄糖)，并在随后处死。图4显示了在顶部的图中(喂食10％葡萄糖)，在胰岛的β细胞和α细胞中观察到DsRed信号。在底部的图中(禁食12小时)，仅在胰岛的α细胞中观察到DsRed信号，但在胰岛的β细胞中没有观察到。这表明，葡萄糖供给诱导了在全部的胰岛细胞中RIP3.1-DsRed基因表达的上调，禁食诱导了在β细胞中RIP3.1-DsRed基因表达的下调，并在α细胞中保持Rip3.1-DsRed基因的运行。 
用于质粒DNA的原位PCR和用于DsRed mRNA的原位RT-PCR：图5(顶部和中间供给10％葡萄糖，左侧图为禁食)显示了控制为针对RIP3.1-DsRed质粒DNA的原位PCR的结果。在胰腺中包括胰岛中观察到核状分布的质粒DNA。在处于超声波束内的左肾、脾和部分的肝脏中观察到质粒的同源核状组织定位的类似型式。质粒在位于超声波束外面的右肾或者骨骼肌、器官中不存在。对照(顶部右侧图)(没有质粒的微泡或者未经超声的质粒微泡)没有显示胰腺内质粒的任何迹象。这些结果证明了超声处理在胰腺中和其临近部位释放了质粒。 
图5(底部中间的图(10％葡萄糖供给)显示了原位RT-PCR的代表性实例，原位RT-PCR针对与在RIP3.1启动子控制下表达的DsRed转录物相对应的mRNA。DsRed mRNA在全部的胰岛中观察到，但在胰腺实质中观察不到，表明RIP启动子仅在内分泌胰腺中控制UTMD-递送的DsRedcDNA的转录。底部左侧的图(禁食)显示了DsRed mRNA分布于胰岛的边缘区域，而在胰岛中心区域没有分布。在对照中没有检测到信号。另外的构建物显示于图11-15中。 
通过在体内递送的胰岛转录因子基因再生胰岛和逆转链脲佐菌素诱导的糖尿病。 
由于包括胰岛素置换在内的药物治疗不能复制正常胰岛的葡萄糖调节功能，因此对糖尿病的血糖控制常常不充分。因此，新的治疗策略已集中在通过胰岛移植或者β细胞再生来补充糖尿病的两种主要形式所共有的β细胞量的缺乏1，2。胰岛移植已受到供体胰岛的供给和对免疫抑制治疗的需要的限制3。胰岛再生已在动物模型中已经成功，主要是利用病毒载体靶向肝组织4-7，出于安全性原因该方法不大可能被用于人类。发明人之前已经证明利用超声靶向破坏微泡(UTMD)，基因治疗可以靶向胰岛8。通过超声在胰腺微循环内将携带质粒DNA的经静脉内的微泡破坏，实现了局部基因表达，所述的局部基因表达可以通过利用大鼠胰岛素-I启动子进一步靶向β细胞的。在链脲佐菌素(STZ)诱导的大鼠糖尿病中，UTMD已被用于递送β细胞素和PDX1，通过将胰腺腺泡细胞重新转变为产生胰岛素的细胞，使糖尿病逆转多达15天9。本发明使用UTMD从而利用编码NeuroD1的质粒再生胰岛，使血糖、胰岛素和C肽正常化多达30天。 
大鼠胰岛素启动子和质粒构建物。采用QIAamp Blood试剂盒(QiagenInc，Valencia，CA)按照生产商的说明从大鼠外周血中提取SD(Sprague-Dawley)大鼠基因组DNA。利用PCR由SD大鼠基因组DNA扩增大鼠胰岛素基因1启动子片段(-412至+165)。将所产生的DNA片段亚克隆至pDsRed1-1报告基因载体(Clonetech，CA)。hMafA cDNA和仓鼠Nkx6.1cDNA由位于Michigan State University的Olson实验室和位于DukeUniversity Medical Center的Newgard实验室捐赠/诚挚赠送。大鼠Ngn3、NeuroD1、Pax4和Nkx2.2cDNA为来自SD新生大鼠胰腺cDNA库的PCR产物，SD新生大鼠胰腺cDNA库按照生产商的说明由它们的总RNA反转录得到。新生大鼠胰腺样品用液态氮快速冷冻并储存于-86℃下。用1ml的RNA-STAT溶液解冻冷冻的样品，并立即用均质机(polytronhomogenizer)以10,000rpm的转速均质30s。通过利用具有oligo(dT)的Sensiscript RT试剂盒(Qiagen Inc，Valencia，CA)在20μl中反转录总RNA(30ng)16。将反应混合物在42℃下孵育50分钟，接着在70℃下进一步孵育15分钟。利用GeneAmp PCR System 9700(PE ABI，Foster City，CA，USA)，以50μl的体积对所有样品进行PCR，50μl反应体积包含2μl cDNA，25μl的HotStarTaq Master Mix(Qiagen Inc，Valencia，CA)和20pmol的每种引物。相应的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行验证并通过QIAquick GelExtraction试剂盒(Qiagen Inc，Valencia，CA)进行纯化。为了确认序列，采 用dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems，FosterCity，CA)在ABI 3100Genomic Analyzer上对PCR产物直接测序。将所有转录因子基因cDNA亚克隆至RIP3.1驱动载体中。通过标准程序进行质粒的酶切、连接、亚克隆、分离和纯化，并再一次测序以确认不存在人工突变(artifactual mutations)。 
动物规程和UTMD。全部动物研究按照美国国立卫生研究院(NIH)推荐规范和在机构动物研究委员会(institutional animal research committee)的批准下进行。通过腹腔注射***(60mg/kg)和甲苯噻嗪(5mg/kg)麻醉的雄性SD大鼠，从左腹部和颈部开始剃毛，并通过切断右侧内部的颈静脉将聚乙烯管(PE 50，Becton Dickinson，Franklin Lakes，TN，USA)***到其中。 
总计有45只大鼠接受下述9种处理之一：(1)无处理(正常对照大鼠，n＝3)；(2)单独的STZ(60mg/kg/ip.，Sigma，St Louis，MO，USA)，无UTMD(N＝3)；(3)STZ和使用DsRed的UTMD(n＝3)；(4)STZ和使用ngn3的UTMD(n＝6)；(5)STZ和使用NeuroD的UTMD(n＝6)；(6)STZ和使用Pax4的UTMD(n＝6)；(7)STZ和使用Nkx2.2的UTMD(n＝6)；(8)STZ和Nkx6.1的UTMD(n＝6)；(9)STZ和使用MafA的UTMD(n＝6)。所有基因在RIP3.1启动子的控制下作为质粒cDNA递送。在STZ注射后12小时测定血糖。认为空腹血糖超过250mg/dl的动物是成功的1型糖尿病模型，并在随后，在STZ处理的48小时内进行UTMD。在10分钟内通过泵(Genie，Kent Scientific，Torrington，CT，USA)输注微泡或对照溶液(0.5ml，经0.5ml磷酸盐缓冲液(PBS)稀释)。在输注期间，利用商业上可得的超声传感器(S3，Sonos 5500，Philips Ultrasound，Bothell，WA，USA)将超声波导向胰腺。在适当的位置将探针夹紧。然后在机械指数为1.4的超谐波模式(发送1.3MHz/接收3.6MHz)中应用超声。利用每隔三次的末端-收缩压来引发四次超声波，引发利用心电图，在R波的峰值之后延迟45-70ms进行。这些设置已显示对于利用该仪器，通过UTMD处理进行质粒递送是最佳的8。泡的破坏在所有大鼠中明显可见。在UTMD之后，结扎颈静脉，包扎皮肤并使动物苏醒。在12小时过夜基线禁食之后和在处理后的不同天抽取血液样品。重复该规程3次，并在第10、20和30天利用过量用药的戊巴比妥钠(120mg/kg)处死大鼠。收获胰腺、肝、脾和肾用于组织学。利用血糖测试条(Precision，Abbott，Abbott Park，IL，USA)测定血糖水平；利用RIA试剂盒 (Linco Research，Radioimmunoassay，Billerica，MA，USA)测定血液胰岛素、C肽。 
包含质粒的脂质稳定的微泡的制备。如前所述，在我们的实验室中制备脂质稳定的微泡。简单地说，将DPPC(二棕榈酸磷脂酰胆碱，Sigma，St.Louis，MO)2.5mg/ml、DPPE(二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺，Sigma，St.Louis，MO)0.5mg/ml和10％甘油的溶液与2mg质粒溶液以2∶1的比例混合。将该磷脂-质粒溶液的0.5ml等分置于1.5ml干净小瓶中；将剩余的顶部空间填充全氟丙烷气体(Air Products，Inc，Allentown，PA)。将每个小瓶在4℃下孵育30分钟，然后通过牙科用混汞器(VialmixTM，Bristol-Myers SquibbMedical Imaging，N.Billerica，MA)机械震荡30秒。脂质稳定的微泡表现为乳白色悬浮液，漂浮在包含未连接的质粒DNA的液体的顶层。通过粒子计数器(Beckman Coulter Multisizer III)测定上层中微泡的平均直径和浓度。 
免疫组织化学。将厚度为5-8μm的低温组织切片器切片用4％的多聚甲醛在4℃下固定15分钟，并用PBS中的10mM甘氨酸淬冷5分钟。然后，用PBS冲洗切片3次，并用PBS中的0.5％Triton X-100渗透10分钟。利用10％山羊血清在37℃封闭切片1小时，并且用PBS清洗3次。加入第一抗体(小鼠抗胰岛素抗体，1∶500稀释；兔抗胰高血糖素，1∶500；兔抗生长激素抑制素，1∶500；兔抗胰多肽，1∶500；兔抗NeuroD1 1∶500；兔抗-Ki-67，兔抗BrDu，1∶500(Sigma，St.Louis，MO)；小鼠抗-ck19，1∶2000稀释(Chemicon，Temecula，CA)，并在室温下孵育2小时。用PBS清洗5分钟，3次以后，加入二抗(Sigma，St；Louis，MO)，与FITC缀合的抗小鼠IgG；与Cy5缀合的抗兔IgG(用封闭液1∶500稀释)并且在室温下孵育1小时。切片在10分钟内用PBS清洗5次，之后装载。 
数据分析。采用Statview软件(SAS，Cary，NC，USA)分析数据。结果表达为平均值的一个标准差。通过利用Fisher的事后检验重复测定ANOVA分析差异，并且认为P＜0.05时差异具有显著性。 
内分泌胰腺的胚胎发育与编码各种转录因子和其他蛋白质的多种基因的活化相关10，11。认识到，新生儿的内分泌发育和患有糖尿病的成年动物中的胰岛再生之间可能存在重大差异，我们试图评价后者是否可以通过基因治疗来实现，该基因治疗通过UTMD处理靶向胰腺。在截短版的大鼠胰岛素启动子(RIP3.1)的控制下，构建编码Ngn3、NeuroD1、Pax4、Nkx2.2、Nkx6.1和MafA的cDNA的质粒。在20分钟的时间内通过静脉灌注包含这 些基因的微泡，同时使用超声波破坏胰腺微循环内的微泡。在通过腹腔注射STZ(60mg/kg)诱导糖尿病之后48小时进行UTMD。对照包括使用标记基因(RIP3.1-DsRed)的UTMD、仅STZ无基因治疗和没有接收STZ的正常对照。为此实验进行三次不同的重复，并在第10天、20天和30天处死以评价胰岛的形态和基因表达。本文讨论了30天的研究的结果并汇总于图6-8中。 
图6显示了利用FITC标记的抗胰岛素抗体(绿色)和CY5标记的抗胰高血糖素抗体(红色)染色的有代表性的组织样品。从在UTMD处理之后30天处死的一组大鼠中得到这些切片。正常胰岛包含在胰岛的外周被较少数量的α细胞(红色)环绕的中央核心的β细胞(绿色)。在给药STZ之后，正常胰岛的结构实际上被破坏，剩余零散分离的β细胞或者β细胞的小团。Ngn3、Pax4、Nkx2.2、Nkx6.1和MafA的基因治疗导致胰岛的若干再生，但具有异常的胰岛结构，其中α细胞占大部分。相反，采用NeuroD1的基因治疗导致具有接近正常形态的胰岛的再生。有趣的是，在UTMD基因治疗组中有少数细胞同时染色抗胰岛素和抗胰高血糖素，而在正常胰岛中没有。之前已经将该发现报道为内分泌增殖的标记12。与在单独的STZ处理之后仅3±2个胰岛相比，在正常大鼠中每个载玻片有61±6个胰岛。NeuroD1引起每个载玻片具有37±4个胰岛，该数值在统计学上显著高于处理正常对照之外的所有其他组(p＜0.0001)。每个胰岛的β细胞的百分比在正常对照中平均为77±10％，在用NeuroD1基因治疗处理的大鼠中为60±6％。其他组的每个胰岛具有显著减少数量的β细胞。NeuroD1处理的大鼠的β细胞的百分比统计学上显著地(p＜0.0001)高于所有其他基因和对照组，但低于正常对照组(p＝0.0006)。此外，图中显示的那些相邻切片分别用抗生长激素抑制素和抗多肽染色以评估δ细胞和多肽细胞的存在(数据未显示)。NeuroD1导致了胰岛中央核心的大量的δ细胞和多肽细胞，与正常对照类似。其他转录因子没有在胰岛内产生大量的δ细胞或多肽细胞。 
图7显示了在基线、STZ处理之后3天和STZ处理之后30天，葡萄糖(顶部左侧图)、胰岛素(底部左侧图)和C肽(顶部右侧图)的血液水平。在STZ(大约400mg/dl)处理的所有大鼠中，到第3天之前血糖急剧增加，并且在第30天除了NeuroD1处理的大鼠之外，其他组保持升高水平。在第30天，NeuroD1处理的大鼠中血糖为101±11mg/dl，在统计 学上显著低于所有其他STZ处理的组(p＜0.0001)，但与正常对照组相比无显著性差异。在较短期实验中，在NeuroD1处理的大鼠中第10天和20天血糖也是正常的。图7的中间和底部图显示了所有STZ处理的大鼠中，在第3天胰岛素和C肽水平显著降低。到第30天之前，在NeuroD1处理的大鼠中，胰岛素和C肽水平接近正常，在统计学上显著高于第3天或者所有其他STZ处理组的水平(p＜0.0001)。为了确定这些胰岛素和C肽水平是否具有葡萄糖反应性，6只NeuroD1处理的大鼠的独立组和对照(3只正常，3只STZ-DsRed)在UTMD处理后30天接受葡萄糖耐受性测试。如图7的底部右侧图显示，NeuroD1处理的大鼠的葡萄糖耐受性测试与正常对照组几乎相同。 
图8显示了BrdU(顶部左侧)和Ki67(顶部中间)染色的结果，该结果显示了细胞的增殖。这些是来自NeuroD1处理的大鼠的单个胰岛的高功率图像。采用BrdU(红色，顶部左侧图)和Ki67(红色，顶部中间图)的核染色存在于胰岛素阳性(绿色)细胞中。与正常和STZ处理的对照组相比，BrdU和Ki67阳性细胞的数量统计上显著地较多，分别为30±2％和10±2％的胰岛素阳性细胞(p＜0.0001)。正常对照组无BrdU染色的迹象，并且仅有极少数细胞对Ki67为阳性。底部图显示了对于CK19(绿色，远左侧图)、胰岛素(红色，左侧中间图)、neurogenin 3(蓝色，右侧中间图)和结合的图像(远右侧图)的免疫荧光染色。不存在CK19、导管细胞标记与胰岛素或者neurogenin 3的共定位；然而，由于后面的两种标记在胰岛中心的β细胞内共定位。这表明，胰岛再生可能不起源于导管细胞。 
该研究显示，靶向STZ处理的大鼠的胰脏，在体内递送NeuroD1导致几乎正常表现胰岛的再生以及正常血液水平的葡萄糖、胰岛素和C肽的恢复。UTMD方法允许基因递送非介入性的靶向胰腺，胰腺是胰岛的正常环境。通过UTMD处理，作为质粒递送的报告基因的峰表达有4天，之后快速降解8。因此，通过该方法的瞬时基因表达能够诱导胰岛再生，而理论上将可能与外源性基因治疗的延长表达相关的肿瘤发生的风险最小化。 
NeuroD1是在胰腺、肠和中枢神经***中发现的一种碱性螺旋-环-螺旋转录因子13。NeuroD1存在于胰芽发育中并在所有成熟的胰岛细胞类型中仍可检测到。在NeuroD1敲除的小鼠中，所有内分泌细胞类型都发育，但胰岛的数量降低并且β细胞凋亡增加14。人们认为，NeuroD1对于β细 胞的早期分化不是必要的，但在后期分化和维持以及在细胞命运决定中具有重要作用15，16。NeuroD1在内分泌发育中的作用的这种观点，尽管主要基于转基因小鼠研究，但与本研究中的胰岛再生的所观察到的发现一致，所述的再生为包含多种细胞类型的胰岛的再生。 
其他转录因子，特别是Ngn3、Pax4、Nkx2.2、Nkx6.1和MafA也导致胰岛再生，但该胰岛主要由α细胞组成，并且血糖、胰岛素和C肽没有正常化。有趣的是，在Pdx1启动子的调节下表达Ngn3的转基因小鼠显示出胰高血糖素一般阳性的细胞17，与我们在体内递送Ngn3之后的发现一致。当Ngn3在发育鸡内脏中过表达时，其也主要产生α细胞18。这些转录因子当外源地递送到具有糖尿病的成年动物时，其功能可以与其在胚胎发育中的功能不同。在胰腺发育或者细胞周期中涉及到的转录因子基因或其他基因的各种组合导致比在本研究中所观察到的甚至更稳健的胰岛再生也是可能的。例如，Chen等人展示了通过在体内递送的β细胞素和Pdx1质粒的组合，在STZ处理的大鼠中可以诱导腺泡细胞产生胰岛素，并使正常血糖和胰岛素恢复多达15天9。最近，Zhou等人报道了Ngn3、MafA和Pdx1的组合通过直接将腺病毒注射到免疫缺陷大鼠的胰脏中进行递送导致将外分泌细胞重构为β细胞表型19。这些新的β细胞被分散为单独的细胞或者仅有少数细胞的小团，而不是聚集成小岛。血糖、胰岛素和C肽得到了提高但未恢复到正常水平。当递送单个转录因子时，没有观察到大量新的β细胞。本研究在至少两个潜在地重要的方面不同。第一，与直接注射不同，使用非病毒基因递送方法靶向整个胰腺。第二，使用β细胞特异性启动子来靶向内分泌胰腺。通常使用的CMV启动子对外分泌胰腺高度有效，而对内分泌胰腺不如此20。类似地，腺病毒在外分泌胰腺中比在内分泌胰腺中更加稳健21。 
图9显示了采用UTMD组合物处理的稳定胰岛的图像，当采用组合处理时UTMD组合物包含细胞周期蛋白D2、CDK4和GLP1的组合(在多达180天内胰岛是稳定的)。上面左侧图显示了来自未经UTMD处理的正常对照大鼠的代表性胰岛。存在表达胰岛素的β细胞的致密胰岛核心(绿色)，其被表达胰高血糖素(红色)的周围α细胞的小囊环绕。上部右侧图显示了在STZ诱发糖尿病之后的代表性胰岛残余物。仅存在少数β(beat)细胞。底部左侧图显示了在采用GLP1基因通过UTMD处理之后胰岛再生的实例。存在比正常小的胰岛，其具有一些β细胞(绿色)和α细胞(红色)，但结构不正常。对于利用单个基因细胞周期蛋白D2、CDK4和CDK6通过UTMD处理的大鼠存在类似发现(未显示)。底部右侧图显示了在采用细胞周期蛋白D2、CDK4和GLP1的组合通过UTMD处理后几乎正常的胰岛(这些胰岛稳定时间多达180天，并伴随具有正常血糖、胰岛素和C肽水平的糖尿病的逆转)。 
图10是线图，显示了对于利用UTMD基因治疗处理的大鼠以及正常对照和未采用UTMD处理的STZ糖尿病大鼠的各组胰岛，随时间的血糖水平。可以看出，采用细胞周期蛋白D2、CDK4、CDK6或GLP1的单基因治疗未导致血糖的正常化。然而，在该具体实验中，包含细胞周期蛋白D2、CDK4和GLP1的组合，或者细胞周期蛋白D2、CDK4、CDK6和GLP1的组合的组合物使血糖恢复至正常水平，持续4周。对另一组动物进行的较长时期的研究证实了效应的持续时间多达180天。 
通过使用腺病毒将多种基因递送到肝脏，在STZ介导的糖尿病中已实现了胰岛再生，结果恢复正常血糖4-6。然而，由于安全性考虑，腺病毒不适合人类使用。尽管肝脏是胰岛再生和胰岛移植的适合器官，但本发明使用超声介导破坏微泡将质粒cDNA递送到具有相对有效的器官特异性的完整胰腺中8，9。由于胰腺是胰岛的正常生理环境，因此靶向胰腺为胰岛再生和维持提供了益处。 
再生的胰岛可以代表STZ处理后存活的分散的β细胞的复制。使用导管细胞标记物Ck19的免疫组织化学染色在再生的胰岛中未显示任何显著的吸收。只有当在STZ处理后或者在STZ处理后48小时内立即给予基因递送时，才观察到发生胰岛再生。在STZ处理后7天，通过基因递送重复实验，在这一时间段中在STZ对照大鼠中几乎没有胰岛素染色细胞，没有观察到胰岛再生并且发展出重度高血糖症和体重减轻。使用了修饰的大鼠胰岛素I启动子，该修饰具有强烈的β细胞特异性8，并且预期在外分泌胰腺中没有实质的活性。这些考虑与认为β细胞复制是增加β细胞的主要机制的普遍观点相一致12，22，23。令人感兴趣的是，利用各种转录因子在β细胞特异性启动子的控制下刺激存活的β细胞产生了大量的α细胞、δ细胞和多肽细胞。这意味着这些转录因子，尤其是NeuroD1，不仅诱导β细胞增殖并聚集为胰岛，而且还形成胰岛细胞类型。这种情况发生所经的机制有待阐明。 
图11是HIP-hNeuroD1质粒的图谱的示意图，显示了人类胰岛素启动 
子区和外显子1、内含子1和外显子2区域。图12是RIP3.1-DsRed质粒的图谱的示意图，显示了外显子1、内含子1和外显子2区域。图13是RIP-DsRed 4.1质粒的图谱的示意图，显示了大鼠胰岛素1和外显子1、内含子1和外显子2。图14是RIP-DsRed 5.1质粒的图谱的示意图，显示了大鼠胰岛素区以及外显子1和外显子2。图15是RIP-DsRed 2.1质粒的图谱的示意图，显示了大鼠胰岛素启动子区以及外显子1和外显子2。 
使用基因治疗以促进糖尿病患者的胰岛再生的构思似乎是合理的。 Meier等人展示了来自患有长期1型糖尿病的成年人的88％的尸检样本具有大量的β细胞，以及β细胞凋亡和T淋巴细胞渗透24。因此，现有的β细胞是采用NeuroD1，单独的或者与其他转录因子组合，进行再生基因治疗的潜在靶点。再生胰岛的任何策略将必须说明通过凋亡、炎症或者自身免疫潜在破坏新胰岛的原因。可能的是将再生性基因与抑制凋亡25-28和/或抑制自身免疫反应的基因或者药物合并。关于后者，最近的证据表明他克莫司和西罗莫司对β细胞可能具有直接的毒性作用12。基于患者的需要和免疫反应(如果有的话)建立了最佳的免疫抑制方案。最后，在啮齿类和人类胰岛生物学之间有重要差异2，因此在可以预期人类试验之前，这些发现需要在较高级的动物中得到证实。 
预期在本说明书中讨论的任何实施方案可以结合本发明的任何方法、试剂盒、试剂或者组合物实施，反之亦然。此外，本发明的组合物可以用于实现本发明的方法。 
应当理解，本文描述的具体实施方案通过说明的方式显示，而不是作为本发明的限制。本发明的主要特征在不脱离本发明的范围的情况下，可以用于各种实施方案中。仅仅使用常规的实验，本领域的技术人员将认识到，或者能够确定本文描述的具体程序的大量等同替代方式。认为这些等同替代方式在本发明的范围之内并且由权利要求所覆盖。 
在说明书中提到的所有出版物和专利申请表明本发明所属技术领域的技术人员的水平。通过引用将所有出版物和专利申请并入本文，其程度与每个单独的出版物或者专利申请特别地和单独地通过引用并入相同。 
在权利要求书和/或说明书中当单词“一个(a)”或者“一种(an)”的使用与术语“包含(comprising)”结合使用时，可以指“一个”，但其也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或一个以上”一致。在权利要求书中术语“或者”的使用用于指“和/或”，除非明确指明是指仅仅替代或者替代互相排除，尽管公开内容支持仅替代和“和/或”的定义。贯穿本申请自始至终，术语“约”用于指数值包括设备误差的内在变化、用于确定数值的方法或者存在于研究对象之间的变化。 
如本说明书和权利要求书所用，单词“包含(comprising)”(和包含的任何形式，例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(和具有的任何形式，例如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(和包括的任何形式，例如“包括(include)”和“包括(includes)”)或者“含 有(containing)”(和含有的任何形式，例如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包含的或者开放末端的并且不排除其他的未列举的元件或者方法步骤。 
如本文所用，术语“或它们的组合”是指术语之前列出项目的所有的排列和组合。例如“A、B、C或它们的组合”试图包括至少一个：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，并且如果在具体上下文中顺序是重要的，则还有BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续来看该实例，清楚地包括的是包含一个或多个项目或术语的重复，例如BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等。本领域的技术人员将理解，通常在任何组合中通常没有限制项目或术语的数目，除非上下文中另外明显。 
本文所公开和请求保护的所有的组合物和/或方法，可以根据本公开内容在没有不适当实验的情况下制备和进行。虽然已经结合优选的实施方案描述了本发明的组合物和方法，但对于本领域的技术人员来说显而易见的是在不脱离本发明的构思、精神和范围的情况下，可以将变化应用于本文描述的组合物和/或方法和应用于方法的步骤或者步骤的顺序中。如通过所附的权利要求书所定义的那样，对于本领域的技术人员来说显而易见的所有这些替代和修改被认为在本发明的精神、范围和构思之内。 
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Claims (33)

1.一种用于在胰腺中超声靶向破坏微泡的组合物，所述组合物包含：
预装配的脂质体-核酸微泡复合物，
其中所述预装配的脂质体-核酸复合物包含核酸，所述的核酸包含在大鼠或人胰岛素启动子的控制下的GLP1、CDK4和细胞周期蛋白D2基因的组合，其中在胰腺的靶位点微泡的破坏将核酸递送到位于超声破坏位置的胰腺细胞中，其中掺入核酸的细胞对高血糖水平作出反应表达胰岛素，
其中所述的胰岛素启动子由该胰岛素启动子的基因组片段组成，该基因组片段由5’非翻译区和外显子1，和/或内含子1和外显子2组成。
2.权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含一个或多个基因，所述基因选自ngn3、PDX1、Mafa、β细胞素、Nkx2.2、Nkx6.1、PAX4、Isl1和Neuro D。
3.权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含与所述组合物联合给药的药物，其中，所述药物选自抗细胞凋亡剂、抗炎剂、GLP-1、阿那白滞素或它们的组合。
4.权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含与所述组合物联合给药的药物，其中，所述药物选自JNK抑制剂、他克莫司、西罗莫司或它们的组合。
5.一种用于在胰腺中利用超声靶向破坏微泡再生胰腺β细胞的组合物，所述组合物包含：
微泡，所述微泡包含GLP1、CDK4和细胞周期蛋白D2基因的组合，其中，所述微泡包含脂质，所述脂质在胰腺中通过超声破坏释放GLP1、CDK4和细胞周期蛋白D2基因，其中所述的GLP1、CDK4和细胞周期蛋白D2基因包含在RIP4.1或者RIP3.1启动子控制下的GLP1、CDK4和细胞周期蛋白D2基因，并且所述的GLP1、CDK4和细胞周期蛋白D2基因在已通过超声靶向破坏微泡进行靶向表达的细胞中表达。
6.一种组合物在制备用于治疗糖尿病的药物中的用途，所述的治疗通过在糖尿病患者的体内和原位再生胰岛素反应细胞来进行：
所述的组合物包含有效量的GLP1、CDK4和细胞周期蛋白D2基因的组合和超声靶向的微泡，其中所述的GLP1、CDK4和细胞周期蛋白D2基因包含在RIP4.1或者RIP3.1启动子控制下的GLP1、CDK4和细胞周期蛋白D2基因，并且所述的GLP1、CDK4和细胞周期蛋白D2基因能够在已通过超声靶向破坏微泡进行靶向表达的细胞中表达，其中该细胞对血液中的高葡萄糖水平作出反应分泌胰岛素。
7.权利要求6所述的用途，其中，所述有效量的GLP1、CDK4和细胞周期蛋白D2基因包含表达GLP1、CDK4和细胞周期蛋白D2基因的外源核酸片段。
8.一种使得靶细胞变得对胰岛素反应的方法，该方法用于非治疗的目的，所述方法包括：
制备核酸片段，所述核酸片段包含在胰岛素反应启动子的控制下的GLP1、CDK4和细胞周期蛋白D2基因的组合，所述胰岛素反应启动子选自RIP4.1或RIP3.1启动子；
将该核酸片段载入微泡中；
向患者注射微泡；
将核酸片段递送到胰腺细胞中；和
将靶细胞保持在对于表达所述的胰岛素反应调节基因有效的条件下；其中，在靶细胞中GLP1、CDK4和细胞周期蛋白D2基因的表达引起细胞对高血糖作出反应。
9.权利要求8所述的方法，所述核酸片段还包含在所述的启动子的控制下的PDX1。
10.权利要求8所述的方法，所述方法还包括将药物与所述组合物联合给药，其中，所述药物选自抗细胞凋亡剂、抗炎剂、GLP-1、阿那白滞素或它们的组合。
11.权利要求8所述的方法，所述方法还包括将药物与所述组合物联合给药，其中，所述药物选自JNK抑制剂、他克莫司、西罗莫司或它们的组合。
12.权利要求8所述的方法，其中，所述微泡包含预装配的脂质体-核酸复合物脂质体。
13.权利要求8所述的方法，其中，所述微泡包含预装配的脂质体-核酸复合物脂质体，所述脂质体-核酸复合物脂质体包含与质粒混合的1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱和1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺甘油。
14.可操作地连接到大鼠或人胰岛素启动子区域的胰岛素反应调节基因在制备用于治疗糖尿病患者的药物中的用途，所述的治疗通过恢复胰岛素反应性来进行，其中所述的治疗包括以下步骤：
获得分离的核酸片段，所述核酸片段包含与胰岛素启动子区可操作地连接的所述的胰岛素反应调节基因，所述胰岛素启动子区由胰岛素启动子的基因组片段组成，所述胰岛素启动子的基因组片段由胰岛素基因的5’非翻译区、外显子1、内含子1和外显子2组成；
将核酸片段转移到靶细胞中；和
将靶细胞保持在对于表达胰岛素反应调节基因有效的条件下；其中，在靶细胞中胰岛素反应调节基因的表达引起细胞对高血糖作出反应，其中所述的可操作地连接到胰岛素启动子区域的胰岛素反应调节基因包含GLP1、CDK4和细胞周期蛋白D2基因的组合。
15.权利要求14所述的用途，其中，所述胰岛素反应细胞在动物中。
16.权利要求14所述的用途，其中，与胰岛素启动子区可操作地连接的所述胰岛素反应调节基因在病毒载体或质粒载体中。
17.权利要求14所述的用途，其中，与胰岛素启动子区可操作地连接的胰岛素反应调节基因还包含ngn3、PDX1、Mafa、β细胞素、Nkx2.2、Nkx6.1、PAX4、Isl1和Neuro D。
18.权利要求14所述的用途，其中所述的靶细胞是胰腺细胞。
19.权利要求14所述的用途，其中，所述胰岛素启动子区包含在转录起始位点上游的区域中SEQ ID NO.:1的100到500个连续碱基。
20.权利要求14所述的用途，其中，所述胰岛素启动子区包含SEQ IDNO.:1中转录起始位点上游的整个区域。
21.权利要求14所述的用途，其中，所述胰岛素启动子区包含SEQ IDNO.:2中转录起始位点上游的整个区域。
22.一种用于在胰腺中超声靶向破坏微泡的组合物，所述组合物包含：
与微泡接触的预装配的脂质体-核酸复合物，其中，所述预装配的脂质体-核酸复合物包含与高表达、可调节的大鼠或人胰岛素启动子区可操作地连接的胰岛素反应调节基因，所述胰岛素启动子区由胰岛素启动子的基因组片段组成，所述胰岛素启动子的基因组片段由胰岛素基因的5’非翻译区、外显子1、内含子1和外显子2组成，其中在胰腺中靶位点处采用超声波破坏微泡，将核酸递送到位于超声破坏位置的胰腺细胞中，其中所述的可操作地连接到大鼠或人胰岛素启动子区域的胰岛素反应调节基因包含GLP1、CDK4和细胞周期蛋白D2基因的组合。
23.权利要求22的组合物，其中，所述预装配的脂质体-核酸复合物包含阳离子脂质、阴离子脂质或者它们的混合物和组合。
24.权利要求22的组合物，其中，所述微泡置于药学上可接受的载体中。
25.权利要求22的组合物，其还包含胰岛素基因。
26.权利要求22的组合物，其还包含在启动子控制下的己糖激酶基因。
27.权利要求22的组合物，其中，所述预装配的脂质体-核酸复合物脂质体包含与质粒混合的1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱和1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺甘油。
28.权利要求22的组合物，其中，所述组合物还包含覆盖层。
29.权利要求22的组合物，其中，所述组合物还包含与胰岛素启动子区可操作地连接的一个或多个胰岛素反应调节基因，所述一个或多个胰岛素反应调节基因选自ngn3、PDX1、Mafa、β细胞素、Nkx2.2、Nkx6.1、PAX4、Isl1和Neuro D。
30.通过以下方法成为胰岛素反应性的细胞，所述方法包括：
将该细胞与预装配的脂质体-核酸微泡复合物接触，其中所述预装配的脂质体-核酸复合物包含在大鼠或人胰岛素启动子的控制下的GLP1、CDK4和细胞周期蛋白D2基因的组合，所述胰岛素启动子由胰岛素启动子的基因组片段组成，所述胰岛素启动子的基因组片段由胰岛素基因的5’非翻译区、外显子1、内含子1和外显子2组成，其中微泡的破坏将核酸递送至所述的细胞中，其中该细胞对高血糖水平作出反应表达胰岛素。
31.权利要求30的细胞，所述细胞还包含与胰岛素启动子区可操作地连接的一个或多个胰岛素反应调节基因，所述的一个或多个胰岛素反应调节基因选自ngn3、PDX1、Mafa、β细胞素、Nkx2.2、Nkx6.1、PAX4、Isl1和Neuro D；和针对细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的siRNA、INK4家族的成员，或CIP/KIP家族的成员。
32.权利要求31的细胞，其中所述INK4家族的成员是p16。
33.权利要求31的细胞，其中所述CIP/KIP家族的成员是p27。
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