TW201029669A - Regeneration of pancreatic islets and reversal of diabetes by islet transcription factor genes delivered in vivo - Google Patents

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201029669 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於糖尿病之治療，且更特定言之，係關於使 葡萄糖反應性、胰島素產生細胞再生之組合物及方法。 【先前技術】 在不限制本發明範疇之情況下，就糖尿病描述其先前技 術。 糖尿病影響全世界約2億人口且發病率逐漸增加。據估 計，其為世界上第五大死亡主導原因且導致嚴重併發症， 包括心血管疾病、慢性腎病、失明及神經病變。 儘官存在多種針對糖尿病之藥物治療，包括騰島素療 法，但部分因為此等藥劑不能複製正常胰島之葡萄糖調節 功能，而通常難以適當控制血糖。因此，新的治療策略集 中於藉由胰島移植或β細胞再生來補充兩種主要形，式之糖 尿病所共有的β細胞群缺乏。 頒予Kojima的關於改良胰臟功能之組合物的美國專利第 6,232,2 88號中教示了糖尿病治療領域的—個頗具前景的機 會。Kojima教示使用β細胞調節素蛋白本身或其片段來促 進未分化之胰臟細胞分化成產生胰島素之ρ細胞或產生胰 多肽之F細胞。BTC蛋白質組合物可改良患者之葡萄糖耐 受性且抑制未分化姨臟細胞之生長。亦提供治療哺乳動物 (包括人類）之方法，然而，糖尿病病狀之長期治療無法藉 由將β細胞調節素蛋白經靜脈内提供給患者達成。 【發明内容】 144673.doc 201029669 在一實施例中，本發明包括用於在胰臟中進行超音波靶 向微泡破壞（ultrasound-targeted microbubble destruction)的 組合物及方法，該等組合物包含在微泡内及微泡周圍且與 微泡接觸的預組裝之脂質體-核酸複合物，其中該預組裝 之脂質體-核酸複合物包含受啟動子控制之NeuroD基因， 其中該微泡在胰臟中之靶位點處破裂，將核酸遞送至胰臟 細胞内超音波破裂之位置處，其中含有核酸之細胞會回應 高血糖含量而表現騰島素。在一態樣中，組合物進一步包 含一或多個胰島素反應性調節基因操作性連接至高表現、 可調節之胰島素啟動子區，該胰島素啟動子區包含SEQ ID NO ·: 1之NeuroD之轉錄起始位點上游區域的5 0個連續驗 基。在另一態樣中，組合物進一步包含一或多個選自一或 多個操作性連接至胰島素啟動子區之胰島素反應性調節基 因的基因，該等胰島素反應性調節基因選自ngn3、 GLP1、PDX1、Mafa、β細胞調節素、Nkx2.2、Nkx6.1、 PAX4、Isll、細胞週期素D2(及細胞週期素家族之其他成 員）、CDK4(及細胞週期素依賴性激酶家族之其他成員）及 針對細胞週期素依賴性激酶抑制因子（諸如pi6及INK4家族 之其他成員，或p27及CIP/KIP家族之其他成員）之siRNA。 在另一態樣中，組合物進一步包含與該組合物共投與的藥 劑，其中該藥劑係選自抗細胞凋亡劑、消炎劑、JNK抑制 劑、GLP-1、他克莫司（tacrolimus)、西羅莫司（sirolimus)、阿 那白滞素（anakinra)、德爾溫（Dervin)聚驢胺或其組合。 在另一實施例中，本發明包括在胰臟中使用超音波靶向 144673.doc 201029669 微泡破壞法破壞包含胰臟之NeuroD的微泡，使胰臟β細胞 再生的組合物及方法。在一態樣中，NeuroD為重組Neuro D。在另一態樣中，組合物進一步包含受CUBI、RIP2.1、 RIP3.1或HIP3.1啟動子控制之NeuroD基因，且NeuroD係在 受到超音波靶向微泡破壞法靶向作用以進行表現之細胞中 表現。 本發明之又一實施例為一種使糖尿病患者之胰島素反應 性細胞在體内及原位再生的方法，其包含：向胰臟遞送有 效量NeuroD，其中胰臟中之細胞使細胞回應血液中之高葡 萄糖含量而分泌騰島素。在一態樣中，姨臟細胞中有效量 之NeuroD包含遞送表現NeuroD基因之外源核酸區段。在 另一態樣中，藉由超音波靶向微泡破壞法將Neuro D遞送 至胰臟。在又一態樣中，胰臟細胞中有效量之NeuroD包含 遞送受CUBI、RIP2.1、RIP3.1或HIP3.1啟動子控制表現 NeuroD基因的外源核酸區段。 本發明之另一實施例為一種使靶細胞具有胰島素反應性 之方法，其包含：製造包含受選自CUBI、RIP2.1、RIP3.1 或HIP3.1啟動子之胰島素反應性啟動子控制之NeuroD基因 的核酸區段；將該核酸區段裝載至微泡中；對患者注射該 微泡；將該核酸區段遞送至胰臟細胞中；及在有效表現胰 島素反應性調節基因之條件下維持靶細胞；其中靶細胞中 NeuroD之表現使該細胞對高血糖起反應。在一態樣中，該 方法進一步包含向胰臟遞送一或多個選自以下之受啟動子 控制之基因：PDX1、Nkx2.2、Nkx 6_1、PAX4、MafA、 144673.doc 201029669 ngn3及其組合。在另一態樣中，該方法進一步包含遞送與 該組合物共投與的藥劑，其中該藥劑係選自抗細胞凋亡 劑、消炎劑、JNK抑制劑、GLP-1、他克莫司、西羅莫 司、阿那白滯素、德爾溫聚醯胺或其組合。在一態樣中， 微泡包含預組裝之脂質體-核酸複合物脂質體。在另一態 樣中’微泡包含預組裝之脂質體-核酸複合物脂質體，該 複合物脂質體包含二棕櫊醯基_sn-甘油-3-磷脂醯膽鹼 (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine)及 1,2-二 標櫚醯基-sn-甘油-3-磷脂醢乙醇胺甘油（i，2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamine glycerol)與質體混 合。 在又一實施例中，本發明包括一種恢復胰島素反應性之 方法，其包含以下步驟：獲得包含一或多個騰島素反應性 調節基因操作性連接至高表現胰島素啟動子區之經分離核 酸區段，該胰島素啟動子區包含胰島素啟動子之基因組片 段，該胰島素之基因片段包含胰島素基因之5，非轉譯區、 外顯子1、内含子丨及外顯子2 ;將該核酸區段轉移至靶細 胞中；及在有效表現胰島素反應性調節基因之條件下維持 靶細胞；#中靶細胞中胰島素反應性調節基因之表現使該 細胞對高血糖起反應。在—態樣中，該胰島素反應性細胞 係在動物體内。在另一態樣中，一或多個操作性連接至胰 島素啟動子區之胰島素反應性調節基因係在病毒載體或質 體載體中。在另—態樣中’―或多個操作性連接至胰島素 啟動子區之胰島素反應性調節基因係選自如⑽、卿3、 144673.doc 201029669 GLPl、PDXl、Mafa、β細胞調節素、Nkx2 2、Nkx6^、 PAX4、Isl 1、細胞週期素D2(及細胞週期素家族之其他成 員）、CDK4(及細胞週期素依賴性激酶家族之其他成員）及 針對細胞週期素依賴性激酶抑制因子（諸如pl6&INK4家族 之其他成員，或p27及CIP/KIP家族之其他成員）2siRNA。 本發明之另一實施例為一種恢復胰島素反應性之方法， 其包含以下步驟：獲得包含一或多個胰島素反應性調節基 因操作性連接至姨島素啟動子區之經分離核酸區段，該騰 島素啟動子區包含胰島素啟動子之基因組片段，該騰島素 啟動子之基因組片段包含騰島素基因之5,非轉譯區、外顯 子1、内含子1及外顯子2 ;將該核酸區段轉移至胰臟細胞 中，及在有效表現肤島素反應性調節基因之條件下維持把 細胞；其中靶細胞中胰島素反應性調節基因之表現使該細 胞對高血糖起反應。在一態樣中，胰島素啟動子區包含 SEQ ID NO.: 1之轉錄起始位點上游區域之1〇〇至5〇〇個連續 驗基。在一實施例中，胰島素啟動子區包含託卩ID NO.: 1 中轉錄起始位點上游之全部區域，或甚至在SEq ID N〇 : i 之轉錄起始位點上游區域中的100至500個連續鹼基。另一 態樣為包含南表現胰島素啟動子區之經分離核酸，該騰島 素啟動子區包含SEQ ID NO·: 1之一或多個胰島素反應性基 因之轉錄起始位點上游區域之5〇個連續驗基。 在另一實施例中，本發明為一種用於在胰臟中進行超音 波勒·向微泡破壞的組合物，其包含：與微泡接觸的預組裝 之脂質體-核酸複合物’其中該預組裝之脂質體_核酸複合 144673.doc -8 - 201029669

:包3-或多個胰島素反應性調節基因操作性連接至高表 可調節之胰島素啟動子區，該騰島素啟動子區包含騰 島素啟動子之基因組片段，該胰島素啟動子之基因組片段 包含騰島素基因之5,非轉譯區、外顯B、内含^及外顯 子2’其令在胰臟中之靶位點處以超音波破裂微泡，將核 酸遞送至胰臟細胞内超音波破裂之位置。在一態樣中，預 組襄之脂質體·核酸複合物包含冑離子㈣、陰離子脂質 或其混合物及組合。在另一態樣中，微泡係安置於醫藥學 上可接党之媒劑中。在另一態樣中，活性劑核酸包含胰島 素基因。在一態樣中，活性劑核酸包含包括受啟動子控制 之己醣激酶基因之核酸載體。在另一態樣中，活性劑核酸 包含包括受啟動子控制之NeuroD基因之核酸載體。預組裝 之脂質體-核酸複合物脂質體可為例如1>2_二棕櫚醯基_sn_ 甘油-3-磷脂酿膽鹼及丨，2_二棕櫚醯基_sn_甘油_3_磷脂醯乙 醇胺甘油與質體之混合物。在另一態樣中，組合物可進一 步包含塗層。在另一態樣中，組合物可進一步包含一或多 個騰島素反應性調節基因操作性連接至胰島素啟動子區， 該等基因係選自 NeuroD、ngn3、GLP1、PDX1、Mafa、β 細胞調節素、Nkx2.2、Nkx6.1、ΡΑΧ4、Isll、細胞週期素 D2(及細胞週期素家族之其他成員）、CDK4(及細胞週期素 依賴性激酶家族之其他成員）、及針對細胞週期素依賴性 激酶抑制因子（諸如pi6及INK4家族之其他成員，或P27及 CIP/KIP家族之其他成員）之siRNA。 一種藉由以下方法處理而具有腺島素反應性之細胞，該 144673.doc •9- 201029669 方法包含：向細胞中注入預組裝之脂質體_核酸微泡複合 物，其中該預組裝之脂質體-核酸複合物包含受胰島素啟 動子控制之NeUroD基因，其包含一或多個胰島素反應性調 節基因操作性連接至胰島素啟動子區，該胰島素啟動子區 包含胰島素啟動子之基因組片段，該胰島素啟動子之基因 組片段包含胰島素基因之5,非轉譯區、外顯子丨、内含子1 及外顯子2其中在胰臟中之把位點處破裂微泡將核酸遞 送至胰臟細胞内超音波破裂之位置，其中含有核酸之細胞 回應高血糖含量而表現胰島素。在一態樣中，細胞進一步 包含一或多個胰島素反應性調節基因操作性連接至可調節 之胰島素啟動子區，該胰島素啟動子區包含在Neur〇D基因 上游之騰島素起始位點上游區域之5〇個連續驗基。在另— 態樣中，細胞進一步包含一或多個選自一或多個操作性連 接至胰島素啟動子區之胰島素反應性調節基因的基因，該 等胰島素反應性調節基因選_自ngn3、GLP1、PDX1、 Mafa、β細胞調節素、Nkx2.2、Nkx6.1、PAX4、Isll、細 胞週期素D2(及細胞週期素家族之其他成員）、CDK4(及細 胞週期素依賴性激酶家族之其他成員）及針對細胞週期素 依賴性激酶抑制因子（諸如pl6及INK4家族之其他成員，或 P27及CIP/KIP家族之其他成員）之siRNA。 【實施方式】 隨附圖式將進一步說明本發明，且連同[實施方式]一起 用於闡明本發明之原則，隨附圖式中之相同參考數字係指 所有獨立視圖中相同或功能類似之元件，且該等圖式併人 144673.doc -10- 201029669 接至忒夕肽之DNA，若啟動子或強化子影響編碼序列之轉 錄，則其可操作性連接至該序列；或若核糖體結合位點經 定位以有助於轉譯，則其可操作性連接至編碼序列。一般 而η 可操作性連接」意謂所連接之DNA序列俜鄰接 的，且在分泌性前導序狀情況下，其係鄰接的

一閱讀框架中。強化子不必為鄰接的。連接係藉由在適宜 限制性位㈣合來實現。若該等位點不存在，則根據慣例 使用〇成春核普酸接附子（a(Japt〇r)或連接子。 如本文中所用 術語「細胞」及「細胞培養物」可互換 使用且所有該等名稱均包括子代。因此，詞語「轉型子」 及「經轉型之細胞」包括原代目標細胞（subject cell)及源 自其之培養物（不考慮轉移次數）。亦應瞭解所有子代可能 會由於有意或無意突變而不具有正好相同之dna含量。包 括具有與針對原始經轉型細胞所篩選相同之功能或生物活 性的突變子代。不同名稱可根據上下文關係而明確。 如本文中所用，「質體」係由在大寫字母及/或數字之前 及/或之後加小寫字母P表示。起始質體可為市售的可不 受限制地公開獲得，或可根據公開的程序由該等可用質體 構築。此外，此項技術中已知其他相當的質體且對於一般 技術人員將顯而易知。 如本文中所用，術語「蛋白質」、「多肽」或「肽」係指 包含經由肽鍵連接之胺基酸的化合物且其可互換使用。 如本文中所用，術語「内源」係指源自於細胞内之物 質。内源物質係藉由細胞之代謝活性而產生。然而，仍然 H4673.doc -13- 201029669 可成由操縱細胞代謝以例如走 J如便細胞表現編碼該物質之基因 來產生内源物質。 如本文中所用，術語「外源」係指源自於細胞外部之物 質田提及核酸時，「外源」係指對於細胞而言為外來的 或者與該細胞㈣但位於宿主細胞核酸内通常未發現該元 件之位置的核酸序列。外源物質仍然可藉由熟習此項技術 者已知之多種代謝或誘導方式中之任一種被細胞内化。 「基因之基因組形式或純系含有編碼區，纟中間雜有稱為 内含子」或「介入區」或「介入序列」之非編碼序列。 内含子為轉錄成核RNA(hnRNA)的基因區段；内含子可含 有諸如強化子之調節元彳。内含子自核轉錄物或初級轉錄 物移除、切除或「剪接去除」；因此在信使RNA(mRNA)轉 錄物中不存在内含子。mRNA在轉譯期間起到指定新生多 肽中胺基酸之序列或次序的作用。 除含有内含子外，基因之基因組形式亦可包括位於RNA 轉錄物上存在之序列的5'端及3,端之序列。此等序列稱為 「側接」序列或區域（此等側接序列位於mRNA轉錄物上存 在之非轉譯序列之5'端或3’端）。5,側接區可含有控制或影 響基因轉錄之調節序列，諸如啟動子及強化子。3,側接區 可含有引導轉錄終止、轉錄後剪切及聚腺苷酸化之序列。 因為單核苷酸以使得一個單核苷酸戊糖環之5,磷酸在一 個方向上經由磷酸二酯鍵連接至其相鄰單核苷酸戊糖環之 3'氧的方式反應而產生寡核苷酸，所以認為DNA分子具有 「5'端」及「3'端」。因此’若募核苷酸之5,磷酸未連接至 144673.doc -14- 201029669 其類似物用於指經鑑別且與通常與其締合之至少一種污染 核酸或蛋白質分離之該等實體。 如本文中所用，術語「載體」係指將DNA區段自一個細 胞轉移至另一個細胞之核酸分子。載體可進一步定義為經 設計成傳遞（propagate)特定序列者，或定義為包括啟動子 操作性連接至特定序列之表現載體’或經設計成使此類啟 動子引入者。載體可以獨立狀態存在於宿主細胞染色體 中，或可整合至宿主細胞染色體中。 如本文中所用，術語「宿主細胞」係指經工程改造以含 有核酸區段或經改變之區段的細胞’其可為古菌（archeal) 細胞、原核細胞或真核細胞。因此，經工程改造成重組之 細胞可與不含有經由人工重組引入之基因的天然存在之細 胞區別開。 如本文中所用，術語「控制序列」係指表現特定宿主生 物體中可操作性連接之編碼序列所必需的DNA序列。適於 原核生物之控制序列例如包括啟動子、視情況存在之操作 子序列、核糖體結合位點及轉錄終止子。可使用高度調節 之誘導性啟動子’其可在細胞培養物於例如對數期期間生 長及成熟時’抑制Fab之多肽合成且使其含量低於生長抑 制量。 如本文中所用，術語「可操作性連接」係指第一核酸序 列與第二核酸序列之間的功能關係。舉例而言，若前序列 (presequence)或分泌性前導序列（secret〇ry ieacjer)之 dna表 現為參與多肽分泌之前蛋白（preprotein)，則其可操作性連 144673.doc -12- 201029669 本說明書中並形成本說明書之一部分。 在檢查以下[實施方式]後，熟習此項技術者對於本發明 之新穎特徵將顯而易知。然而，應瞭解所提供之本發明之 詳細描述及具體實例雖然簡述本發明之某些實施例，但其 僅僅出於說明性目的而提供，因為熟習此項技術者將自下 文之[實施方式]及申請專利範圍顯而易知在本發明之精神 及範疇内之各種變化及修改。 本發明可包括在不脫離以下申請專利範圍之精神及範售 的情況下，根據本文描述之教示可能存在之每一修改及變 更。預期本發明之使用可涉及具有不同特性之組份。本發 明之範疇意欲由隨附申請專利範圍界定，表明完全認定在 各方面均等效。 如本文中所用’關於核苷酸之術語「基本上如SEQ m NO. (#)闡述之序列」、「類似於…之序列」、「核苷酸序列」 及類似術語係指實質上對應於本文中標識為犯卩1〇 :工 〇 之序列之任何部分的序列。該等術語係指合成來源以及天 然來源之分子，且包括在生物學上、免疫學上、實驗上或 其他功能上具有相當之活性（例如關於利用核酸區段之雜 交，或編碼所有或部分NeuroD活性的能力）的序列。當 然，該等術語意謂包括如以線性次序指定之序列之資訊。 如本文中所用，術語「基因」係指編碼功能蛋白、多肽 或肽之單元。熟習此項技術者將瞭解，此功能術語包括基 因組序列、cDNA序列或其片段或組合，以及基因產物， 包括可藉助於人工改變者。經純化基因、核酸、蛋白質及 144673.doc 201029669 單核*酸戊糖環之3|氧’則將寡核苷酸之該端稱為「5, 端」，且若其3,氧未連接至後一單核苷酸戊糖環之5,磷酸， 則該端稱為「3’端」。如本文中所用’即使在較大募核苷酸 内部之核酸序列亦可被認為具有5,及3,端。在線性或環狀 DNA分子中，離散元件稱為「下游」或3，元件之「上游」 或5'元件。此術語反映了轉錄係沿DNA鏈以$，至之方式 進行。 如本文中所用，術語「轉型」係指使外源DNA進入受體 擊 細胞且改變受體細胞的方法，例如一或多種包括啟動子及 表現以下之編碼序列的質體：Neur〇D、ngn3、GIjP1、 PDX1、Mafa、β細胞調節素、Nkx2.2、Nkx6.1、PAX4、 . Isl1、細胞週期素D2(及細胞週期素家族之其他成員）、 CDK4(及細胞週期素依賴性激酶家族之其他成員）及針對細 胞週期素依賴性激酶抑制因子（諸如pl6&INK4家族之其他 成員，或P27及CIP/KIP家族之其他成員）之siRNA。其可在 φ 自然或人工條件下使用各種此項技術中熟知之方法進行。 轉型可依靠將外來核酸序列***原核或真核宿主細胞中之 任何已知方法實現。該方法係基於所轉型之宿主細胞選擇 ' 且可包括（但不限於）病毒感染、電穿孔、脂質體轉染及粒 子轟擊。該等「轉型」細胞包括所***之DN A能夠作為自 主複製質體或作為宿主染色體之一部分複製的穩定轉型細 胞。 如本文中所用’術語「轉染」係指將外來DNA引入真核 細胞中。轉染可藉由此項技術中已知之多種方式實現，包 144673.doc •15- 201029669 括例如磷酸鈣-DNA共沈澱法、DEAE-葡聚糖介導之轉 染、聚凝胺（polybrene)介導之轉染、電穿孔法、顯微注射 法、脂質體融合法、脂質體轉染法、原生質體融合法、逆 轉錄病毒感染法及基因槍法（bioli stic)。因此，術語「穩定 轉染」或「經穩定轉染」係指將外來DNA引入並整合至經 轉染細胞之基因組中。術語「穩定轉染子」係指已將外來 DNA穩定整合至基因組DNA中的細胞。該術語亦涵蓋在有 限時段内短暫表現所***之DNA或RNA的細胞。因此，術 語「短暫轉染」或「經短暫轉染」係指將外來DNA引入該 外來DN A無法整合至經轉染細胞之基因組中的細胞中。外 來DNA在經轉染細胞之細胞核中可持續存在數天。在此期 間，外來DNA經受影響染色體中内源基因之表現的調節控 制。術語「短暫轉染子」係指已接受外來DNA但無法整合 此DNA之細胞。 如本文中所用’術語「載體」用以指將DNA區段自一個 細胞轉移至另一個細胞之核酸分子。術語「運載工具 (vehicle)」有時可與「載體」互換使用。如本文中所用之 術語「載體」亦包括有關含有所要編碼序列及在特定宿主 生物體中表現可操作性連接之編碼序列所必需之適當核酸 序列之重組DN A分子的表現載體。在原核生物中表現所必 需之核酸序列通常包括啟動子、操作子（視情況存在）及核 糖體結合位點，以及通常其他序列。已知真核細胞可利用 啟動子、強化子以及終止及聚腺苦酸化信號。 如本文中所用，當用於核酸時，術語「擴增」係指藉由 144673.doc 16 201029669 此項技術中已知之任何方法產生大量核酸序列之複本。擴 增為涉及模板特異性之核酸複製的特例。模板特異性常常 依據「靶」特異性來描述。靶序列在有待自其他核酸中分 選出來之意義上為「靶」。擴增技術主要設計用於此分 選。 如本文中所用，術語「引子」係指在經純化之限制性消 化物中天然存在或經合成產生的寡核苷酸，其當處於誘導 合成與核酸股互補之引子延長產物之條件（亦即存在核苷 酸及諸如DNA聚合酶之誘導劑，以及合適溫度及口11值）下 時能夠充當合成之起始點。引子可為單股以產生最大擴增 • 效率，但或者可為雙股。若引子為雙股，則首先對其進行 • 處理以在用於製備延長產物之前分離其各股。引子必須足 夠長以在誘導劑存在下起動延長產物之合成。引子之確切 長度將視許多因素而定，包括溫度、引子來源及使用方 法。 • 如本文中所用，術語「探針」係指在經純化之限制性消 化物中天然存在或者經合成、重組或？(：尺擴增產生的募核 苷酸（亦即核苷酸序列），其能夠與另一相關寡核皆酸雜 • 交。探針可為單股或雙股。探針可用於特定基因序列之偵 , _、鑑似分離。預期本發明中所使用之任何探針均將經 任-「報導分子」標記，以使其可以任㈣測系統偵測， 該等偵測系統包括（但不限於）：酶（例如ELISA，以及美於 酶之組織化學檢定）、螢光、放射性及發光系統。本ς明 並不意欲偈限於任何特定彳貞測系統或標記。 144673.doc 17 201029669 如本文中所用，當用於聚合酶鏈反應時，術語「靶」係 指由用於聚合酶鏈反應之引子定界之核酸區域。因此， 「靶」有待自其他核酸序列中分選出來。「區段」定義為 在靶序列内之核酸區域。當用於細胞或組織時，靶係指靶 (geting)，即使用細胞之外源載體（例如病毒、脂質體 或甚至裸核酸（naked nucleic acid))將核酸遞送至細胞中， 以致其改變細胞之功能，例如表現一或多個BTC或PDX1 基因。 如本文中所用，術語「聚合酶鏈反應」（「pCR」）係指 0 K.B. Mullis之美國專利第4683 195號、第4 683,2〇2號及第 4’965,188號（其以引用的方式併入本文）中之方法，該等專 利描述一種在不經選殖或純化之情況下增加基因組dna之 混0物中靶序列區段之濃度的方法。此擴增靶序列之方法 包括向含有所要靶序列之〇]^人混合物中加入大量過量之兩 種募核苷酸引子，隨後在DNA聚合酶存在下進行精確熱循 環定序。兩種引子與其雙股靶序列之各別股互補。為實現 擴增’使混合物變性且接著將該等引子黏接至在挺分+内Θ 之其互補序列。黏接之後，以聚合酶延長該等引子以便形 成一對新的互補股。變性、引子黏接及聚合酶延長步驟可 重複多次（亦即變性、黏接及延長構成一個「循環」；可存 在許夕個循環」），以獲得高濃度的經擴增之所要拓序 列區段。經擴增之所要靶序列區段之長度係由各引子相互 之間之相對位置決定，且因此，此長度為可控制的參數。 根據該方法之重複態樣’將該方法稱為「聚合酶鏈反應」 144673.doc 201029669

(下文中稱為「PCR」）。因為經擴增之所要％序列區段成 為混合物中之主要序列（依據濃度），所以認為其為「pcR 擴增」的。使用PCR，有可能將基因組]〇>1八中特定靶序列 之單個複本擴增至可藉由若干不同方法（例如，與經標記 探針雜併入生物素標記之引+，隨後進行抗生物素蛋 白-酶結合物偵測；將諸如DCTp或DATp之經Up標記之三 磷酸脫氧核苷酸併入擴增區段中）偵測之水準。除基因組 DNA外，任何寡核苷酸序列皆可用適當之引子分子集擴 增。特定言之，由PCR方法自身產生之擴增區段本身為用 於後續PCR擴增之有效模板。 如本文中所用，術語「染色試劑」係指包含該試劑之核 酸序列的整體雜交模式。對一部分基因組具特異性之染色 試劑使靶與非靶染色體物質之間形成對比。可在用一或多 種顏色（多色染色模式）及/或其他指示劑法偵測之基因組部 分上以任何所要染色模式偵測多種不同像差。 如本文中所用’術語「轉殖基因」係指可人工***哺乳 動物基因組（例如活動物之哺乳動物細胞）中之遺傳物質。 本文使用術語「轉殖基因動物」描述具有非内源（亦即異 源）核酸序列之非人類動物，通常為哺乳動物，該等核酸 序列可作為染色體外元件存在於該動物之一部分細胞中或 穩定整合至該動物之生殖細胞系DNA中（亦即大多數或所 有細胞之基因組序列中）。根據此項技術中熟知之方法， 藉由例如宿主動物之胚胎或胚胎幹細胞之遺傳操作將異源 核酸引入該等轉殖基因‘動物之生殖細胞系中。 144673.doc -19- 201029669 如本文中所用，術語「轉殖基因」係指例如以下異源核 酸：呈例如表現構築體形式的異源核酸（例如用於產生 「基因敲入（knock-in)」之轉殖基因動物），或當***靶基 因内或鄰近靶基因位置時導致靶基因表現減少的異源核酸 (例如用於產生「基因剔除（kn〇ck_〇ut)」之轉殖基因動 物）。基因之「剔除」意謂導致靶基因功能減弱，較佳致 使乾基因之表現不可偵測或可忽略的基因序列改變。基因 剔除之轉殖基因動物包括靶基因之異型接合基因剔除 (heterozygous knock-out )，或靶基因之同型接合基因剔 除。 如本文中所用，術語「幹細胞」係指全能（t〇tip〇tent)或 多能（plunpotent)幹細胞，例如胚胎幹細胞，及胚胎發育 極早期的該等多能細胞，包括（但不限於）胚細胞發育階段 之細胞。在本發明所用之一個具體實例中，幹細胞可為尚 未分化成腺泡細胞或β細胞之胰臟細胞前驅體，且用作表 現以下之靶：NeUr〇D、ngn3、GLP1、pDxl、Mafa、_ 胞調節素、Nkx2.2、Nkx6·!、ρΑχ4、IsU、細胞週期素 D2(及細胞週期素家族之其他成貞卜⑶以（及細胞週期 素依賴性激酶家族之其他成貢）及針對細胞週期素依賴性 激酶抑制因子（諸如pl6及跳4家族之其他成員，或p27及 CIP/KIP家族之其他成員）之siRNA。 在先前專利申請案中，發明者說明可使用超音波歡向微 泡破壞法（UTMD)使基因療絲向正常大鼠之姨島。 臟微循環内藉由超音波選擇性破壞載運質體職之靜脈内 144673.doc 201029669 微泡’來局部遞送該等質體。胰島特異性係藉由將大鼠胰 島素-I啟動子併入質體DNA内來達成。目前已發現使用 UTMD可用於將單獨β細胞調節素（Btc)及β細胞調節素與 PDX1之組合遞送至經鏈佐黴素（strept〇z〇t〇cin，stz)誘發 糖尿病之大鼠中。在經BTC及PDX1處理之大鼠中可見產 生初期胰島樣升糖素染色細胞簇的乾細胞轉型。在此研究 中’該等簇在處理30天後消失。儘管未見到正常胰島之再 生’但在利用UTMD藉由將胰臟腺泡細胞轉型成具有β細 胞標記物之胰島素產生細胞後，糖尿病在至多丨5天内得到 治療。 糖尿病發病率逐漸增加，影響了全世界超過5 %之人 口。亟待研究出治療糖尿病之新穎治療策略，包括新藥 物，胰島移植及基因療法。靶向胰島之直接體内胰臟基因 遞送為糖尿病基因療法之關鍵方法。迄今為止，眾多研究 顯示腺病毒、腺相關病毒、慢病毒及疱疹單純型病毒_丨載 ❹ 體已使有效基因體内轉移至胰島，但受宿主免疫反應及載 體細胞毒性之損害。非病毒基因遞送系統（包括裸Dna及 DNA複合物）亦已表明胰島細胞轉染之水準比短暫轉殖基 因表現低得多。然而，非病毒載體系統似乎可能更易於滿 足臨床試驗中所關心之生物安全。 已使用超音波靶向微泡破壞法（UTMD)將基因或藥物體 内遞送至胰島。簡言之，將基因併入陽離子脂質體中且接 著連接至充氣微泡的磷脂外殼，接著靜脈内注射微泡並在 完整跌島之微循環内藉由超音波破壞。UTMD法使存在大 144673.doc -21 · 201029669 多數β細胞之整個胰島核心能夠實現轉染。UTMD已與大 鼠胰島素啟動子（RIP)組合以增強β細胞特異性。本發明藉 由改變RIP區段之長度來極大地改良基因表現之效率差 異》融合胰島素基因之外顯子1及外顯子2中之非編碼區以 在質體中提供增強之下游基因功能。在轉錄層面上’胰島 素mRNA之融合將下游基因表現上調至一較高水準以致其 能模擬正常胰島β細胞中之正常胰島素mRNA含量。接著使 用UTMD，將在大鼠胰島素啟動子驅動之控制下之胰島素 基因融合質體遞送至成年活動物之完整胰島’從而為糖尿 病基因療法提供安全、具組織特異性、高效且經調節之基 因表現。 新啟動子。 材料及方法。大鼠胰島素啟動子及質體構築體。使用 PCR自史泊格多利（Sprague-Dawley，SD)大鼠DNA擴增大 鼠胰島素基因1啟動子片段（RIP2.1(-412至-303) ; RIP1,1(-412 至-1) ; RIP4.1(-412 至 +43) ; RIP3.1(-412 至 +165)， GenBank寄存編號J00747，其在本文中定義為SEQ ID NO.: 1，及GenBank寄存編號為NC_000011之人類胰島素啟動 子，二者皆以引用的方式併入本文中）。RIP前置引子（5·-G CTG AGC TAA GAA TCC A-3')(SEQ ID NO.: 2) ； RIP2.1 反置引子（5’-CTGAGC ATTTTCCACC -3')(SEQ ID NO.: 3) ; RIP1.1 反置弓I 子（5'-GGGAGTTACTGGGTCTCCA-3') (SEQ ID NO·: 4); RIP4.1反置引子（5'-GCAGAATTCCTGC TTGCTGATGGTCTA-3')(SEQIDNO·: 5); RIP3.1反置引子 144673.doc -22- 201029669 (5'-GTTGGAACAATGACCTGGA-3，）（SEQ ID NO·: 6);及反 置引子（5-GGCAGAAGGACAGTGATCT-3)(SEQ ID NO.: 7)，其各自含有及Moi限制性位點。此等引子之序列 列於表1中。將所得DNA片段次選殖至pGL2-basic螢火蟲 報導質體及pDsRedl-Ι報導載體、SV40啟動子螢火蟲螢光 素酶報導質體、來自Promega之pGL2-Control、來自 Clonetech 之 pDsRedl-Ι 及 pCMV-DsRed-express-Ι 中。根據 製造商說明書，利用QIAamp血液套組（QIAamp Blood kit)(Qiagen Inc, Valencia, CA)自大鼠周邊金液中提取大鼠 基因組DNA。藉由瓊脂糖凝膠電泳法驗證相應PCR產物， 並藉由 QIAquick凝耀·提取套組（QIAquick Gel Extraction kit)(QIAGEN)純化。為確定該等序列，用二氯羅丹明螢光 標記終止物循環定序套組（dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Kit)(PE Applied Biosystems, Foster City，CA)在 ABI 3100基因組分析器（ABI 3100 Genomic Analyzer)上進 行PCR產物之直接定序。質體消化、接合、次選殖、分離 及純化均係藉由標準程序進行，且再次定序以確定不存在 人為突變。 大鼠UTMD方案。用腹膜内氣胺酮（ketamine)(100 mg/kg)及賽拉嗓（xylazine)(5 mg/kg)麻醉史泊格多利大鼠 (250至350 g)。藉由血管切開術（cutdown)將聚乙烯管（PE 50，Becton Dickinson，MD)***右侧内頸靜脈中。劃開前 腹並置放 S3 探針（Sonos 5500，Philips Ultrasound，Andover， MA)以使左腎及脾成像，以便利鑑別。胰臟位於左腎與脾 144673.doc -23- 201029669 之間，因此將探針調至靶向胰臟並在適當位置夾住。使用 輸注泵以3 ml/h之恒·定速率經20分鐘輸注1 ml微泡溶液。 在整個輸注持續時間中，使用機械指數為1.2至1.4且深度 為4 cm之超諧波模式（發射1.3 MHz/接收3.6 MHz)達成微泡 破壞。以ECG觸發超音脈衝（R波峰之後80毫秒）以便每4個 心動週期（cardiac cycle)遞送一陣4巾貞之超音脈衝。先前已 顯示此等設置為使用UTMD進行基因遞送之最佳超音波參 數。在每次遞送結束時，結紮頸靜脈並將皮膚閉合。在遞 送後監測所有大鼠之正常行為。4天後殺死大鼠並收集胰 臟。 製造含質體之脂質穩定之微泡。製備經脂質穩定之微 泡。5’6簡言之，將DPPC(1,2-二棕櫊醯基-sn-甘油-3-磷脂醯 膽驗，Sigma, St. Louis, MO)2.5 mg/ml ; DPPE(1,2-二棕禍 醯基-sn-甘油-3-麟脂醯乙醇胺，Sigma, St· Louis, ΜΟ)0·5 mg/ml ;及10%甘油之溶液與2 mg質體溶液以2:1比率混 合。將0.5 ml此磷脂-質體溶液之等分試樣置放於1.5 ml透 明小瓶中；剩餘頂部空間以全氟丙烷氣體（Air Products, Inc, Allentown，PA)填充。在40°C下培育各小瓶30分鐘且接 著藉由牙科用混汞器（dental amalgamator)(VialmixTM， Bristol-Myers Squibb Medical Imaging, N. Billerica, ΜΑ)機 械震盪20秒。經脂質穩定之微泡作為乳白色懸浮物浮於含 有未連接質體DNA之液體層上部。棄去下層清液，並用 PBS洗滌微泡3次以移除未連接質體DNA。藉由粒子計數 器（Beckman Coulter Multisizer III)量測上層中微泡之平均 144673.doc -24- 201029669 直徑及濃度。 偵測DsRed DNA之原位PCR。DsRed引子。使用針對 DsRed DNA 之單一對 DsRed 引子；其為 DsRed 125+(5'-GAGTTCATGCGCTTGAAGGTG-3')(SEQ ID NO: 8)及 DsRed 690 (5,-TTGGAGTCCACGTAGTAGTAG-3')(SEQ ID * NO: 9)。在殺死大鼠之後立即用200 ml動脈内冷生理食鹽 水移除大鼠之血液，隨後用100 ml 2%三聚曱醛及0.4%戊 二醛灌注固定。將胰臟切成0.5 cm之小塊並在4°C下置於 ® 20%蔗糖溶液中隔夜，且接著在-86°C下放入OTC模具中。 將5 μηι厚之冷凍切片置放於塗覆矽烷之載片上且在4°C下 • 於4%三聚甲醛中固定15分鐘，以10 mM甘胺酸之PBS溶液 • 中止5分鐘，以PBS沖洗，用含0.5%曲拉通X-100(Triton X- 100)之PBS滲透10分鐘，並以PBS沖洗10分鐘。在一側用 一滴指甲油錨定蓋片。接著將載片置放於直接位於溫控循 環器（thermocycler)之塊體上的鋁『舟（boat)』中。將50 μΐ PCR反應溶液（〇·8單位Taq DNA聚合酶、2μ1 引子、3 μΐ DIG-dNTP、5 μΐ 1〇χ緩衝液及40 μΐ水）添加至各載片， 且根據製造商說明書使用裝配工具（Assembly Tool) (Perkin

• Elmer)藉由 AmpliCover Disc 及 Clips 覆蓋。使用 Perkin-. Elmer GeneAmp系統1000如下進行原位PCR :最初在94°C 下保持（1分鐘）之後，進行11個循環之PCR(94°C下1分鐘， 54°C下1分鐘’及72°C下2分鐘）。擴增之後，將載片以 2xSSC浸潰10分鐘且以0.5〇/〇三聚曱醛浸潰5分鐘，並用PBS 浸潰5分鐘2次。使用供DIG偵測之螢光抗體增強劑套裝 144673.doc -25- 201029669 (fluorescent antibody enhancer set)(Roche)偵測含有地高辛 (digoxigenin)之DNA片段，隨後進行組織化學染色（PCR DIG探針合成套組（Roche Co.;目錄號：1636090)。首先， 用阻斷溶液培育切片30分鐘以減少抗體與胰臟組織之非特 異性結合。接著，在潮濕腔室中於37°C下用50 μΐ抗DIG溶 液（1:25)培育切片1小時。接著，在震盪下用PBS洗滌載片 3次，每次5分鐘，再在37°C下用50 μΐ抗小鼠-IgG-地高辛 抗體溶液（1:25)培育載片1小時。在震盪下用PBS洗滌載片 3次，仍為每次5分鐘。在37°C下用50 μΐ抗DIG螢光溶液 (1:25)培育載片1小時。接著在震盪下用PBS洗滌載片3 次，仍為每次5分鐘。最後，使切片在70% EtOH、95% EtOH及100% EtOH中脫水，每次2分鐘，在二曱苯中洗淨 並蓋上蓋片。 偵測DsRed mRNA之原位RT-PCR。引子。使用針 對 DsRed cDNA 之單一對 DsRed引子，其為DsRed 125+(5·-GAGTTCATGCGCTTCAAGGTG-3'KSEQ ID NO: 10)及 DsRed 690 (5'-TTGGAGTCCACGTAGTAGTAG-3')(SEQ ID NO: 11)。如上所述製備經灌注固定之冷凍切片。在各載 片上用 50 μΐ 混合溶液（Invitrogen)(5 μΐ DNase I、5 μΐ lOxDNase緩衝液及40 μΐ水）進行DNase處理，蓋上蓋片， 在25°C下培育隔夜，且接著用PBS洗滌5分鐘（2次）。

反轉錄：在各載片上以50 μΐ總體積用50 μΐ混合溶液（用 於RT-PCR之Superscript第一股合成系統’ Invitrogen套組 第 11904-018 號）（1 μΐ DsRed727 引子（5'-GATGGTGATGT 144673.doc -26- 201029669 CCTCGTTGTG-3’）（SEQ ID NO: 12)、5 μΐ DTT溶液、2·5 μΐ dNTP、5 μΐ 1〇χ緩衝液、5 μΐ 25 mM MgC卜 29 μΐ水及 2.5 μΐ Superscript II RT)進行第一股cDNA之合成。置放蓋 片且在42°C下培育載片2小時；用PBS洗滌5分鐘（2次），以 100%ETOH沖洗1分鐘並乾燥。 偵測DsRed蛋白、胰島素及升糖素之免疫組織化學。在 4°C下於4%三聚甲醛中固定5-8 μιη厚之冷凍切片15分鐘且 以10 mM甘胺酸之PBS溶液中止5分鐘。接著以PBS沖洗切 片3次，並用含0.5%曲拉通X-1 〇〇之PBS滲透10分鐘。在 3 7°C下用10%山羊血清阻斷切片1小時，並用PBS洗滌3 次。添加初級抗體（Sigma Co.)(在阻斷溶液中稀釋1:10000 倍）且在4°C下培育隔夜。在用PBS洗滌3次歷時5分鐘之 後，添加二次抗體（Sigma Co.，與FITC結合之抗小鼠IgG) (在阻斷溶液中稀釋1:500倍）並在37°C下培育1小時。以PBS 沖洗切片10分鐘（5次），且接著安裝。 細胞培養及短暫轉染檢定。將INS-1細胞株（由Newgard lab(Duke University)免費提供之大鼠騰島瘤）維持在適當細 胞培養基中。用每孔1〇〇 μΐ無血清DMEM中之1 pg螢光素 酶報導質體及0.02 pg作為内對照質體之pTS-RL海腎 螢光素酶以及3 μΐ Lipofectamine 2000 轉染 INS-1 細胞。在轉染後48小時收集細胞且使用雙螢光素酶檢定系 統（Dual Luciferase Assay system)(Promega)及 Turner TD 20/20光度計量測螢火蟲及海腎螢光素酶活性。 統計學分析。藉由雙因子ANOVA比較各研究組之間螢 I44673.doc - 27· 201029669 光素酶活性的差異。P值小於0 05被視為統計學上顯著。 僅當A Ν Ο VA F值在統計學上顯著時進行事後謝佛測試 (Post-hoc Scheffe test) ° 圖1為大鼠胰島素啟動子區以及外顯子1、内含子丨及外 顯子2的示意圖。大鼠胰島素啟動子係以已知序列元件以 及融合外顯子1及外顯子2顯示。 圖2 :上圖為rips-luc轉染之後48小時在三種不同葡萄糖 濃度下INS-1細胞溶解產物之螢光素酶活性。下圖為rips_ luc轉染之後在高濃度葡萄糖下培養不同培養時間之培養 液的螢光素酶活性’在無葡萄糖情況下及在正常葡萄糖濃 度下無螢光素酶活性（資料未圖示）。 圖3 : A : RIP3.1_DsRed載片，左上圖：綠色為抗胰島 素’中上圖.紅色為抗dsred，及右上圖為其共焦影像。下 圖為連續切片及類似胰島結構，左下圖：綠色為抗升糖 素；中下圖··紅色為抗dsred ;右下圖為其共焦影像。B: RIP-4.1-dsred ; C : RIP-l.l-dsred ; D : Rip-i.usred 載 片；E : pCMV-dsred ; F :正常對照組。 圖4 : A為餵食1〇%葡萄糖之pRIP31_DsRed大鼠之影 像’ A右上圖·綠色為抗肤島素，A中上圖：紅色為抗 dsred ; A左上圖為其共焦影像；A右下圖：綠色為抗升糖 素；A中下圖：紅色為抗dsred ; A左下圖：其共焦影像；B 為禁食隔夜之pRIP3.1-DsRed大鼠之影像。 圖5 :上圖：來自對照大鼠（左圖）及經UTMD處理之大氣 (中圖為餵食大鼠，且右圖為禁食大鼠）之顯微切片 144673.doc • 28· 201029669 (400X)。使用原位PCR對DsRed質體DNA染色，其在整個 經處理胰臟中可見。胰島清晰可見（箭頭）。下圖：來自對 照大鼠（左圖）及使用RIP6.1-DsRed經UTMD處理之大鼠（中 圖為餵食大鼠，且右圖為禁食大鼠）之切片（4〇〇χ)。使用 原位RT-PCR對DsRed mRNA染色，其係位於胰島中心（中 « 圖/餵食）。騰島邊界染色（右圖/禁食大鼠）。 發現大鼠腺島素啟動子驅動大鼠騰島瘤細胞株1)上 • 之螢光素酶基因轉染。驅動質體中之表現的傳統大鼠胰島 素啟動子顯示低效率之組織表現且在體内遞送系統中不具 有高組織特異性。本發明包括一種胰島素啟動子，其包括 先前未用於胰島素基因調節之胰島素〗基因外顯子〗及内含 - 子1以及一部分外顯子2。在某些實施例中，胰島素啟動子 為大鼠胰島素啟動子、人類胰島素啟動子或其組合。圖2 顯示在正常葡萄糖含量下，RIp3」顯示為Rlp2 1(截短之 RIP啟動子）之4726倍、為RIP1.U全長傳統RIP)之20倍且甚 • 至為CMV螢光素酶之3.1倍的螢光素酶活性。在無葡萄糖 條件下，所有構築體於INS_ j中之基因表現均明顯受抑 制，RIP3.1之瑩光素酶活性仍為RIpi」之6 6倍，為〔财之 2.6倍。在高葡萄糖含量下’ RIp31之螢光素酶活性為 RIP2.1之3515倍，為RIP1 !之69倍且為之〇6倍。令 人驚舒的是，在高葡萄糖條件下，可在轉染之後8、16、 24 32及48小時自RIp31培養皿之培養液中摘測到榮光素 酶活I·生纟無葡萄糖及正常葡萄糖培養條件下未發現分泌 (資料未圖示）。咖·1驅動之螢光素酶不僅具有高效且經 144673.doc -29· 201029669 證實之葡萄糖反應性，其亦在INS-1細胞株中分泌經表現 蛋白至培養液中。 用UTMD將具有RIP驅動之DsRed之質體遞送至活大鼠之 胰島中。為了能更好地瞭解在實際條件下（不僅僅在細胞 株中）活動物之胰島中此等RIP啟動子之基因表現及調節， 用超音波靶向微泡破壞法（UTMD)將此等具有RIP啟動子驅 動之DsRed之質體遞送至活大鼠之胰臟中，UTMD實施4天 後殺死大鼠。圖3顯示在完整胰島（包括胰島核心及邊界）中 偵測到RIP3.1及RIP4.1驅動之DsRed蛋白，但在非胰島區 中未見到。令人驚訝的是，在胰島β細胞及α細胞中偵測到 顯示DsRed蛋白之共焦影像。在全長RIP1.1中，DsRed蛋白 之信號非常低，且在截短之RIP2.1中幾乎見不到。DsRed 蛋白之信號在經CMV-DsRed質體處理之大鼠之胰臟載片中 到處可見。但在正常大鼠對照組之胰臟載片中，不能偵測 到DsRed信號。 接著，確定大鼠胰島中所遞送之RIP質體之基因表現是 否可受葡萄糖含量調節，如同在活體外利用INS-1細胞株 所發現。選擇RIP3.1 DsRed並用於處理大鼠，大鼠被分成 數組：禁食（12小時）及餵食（用10%葡萄糖），且接著殺死。 圖4展示在上圖（餵食10%葡萄糖）中，在胰島β細胞及α細胞 中可見DsRed信號。在下圖（禁食12小時）中，僅在胰島α細 胞中可見DsRed信號，而在胰島β細胞中不可見。此表明葡 萄糖餵食誘導全部胰島細胞中RIP3.1-DsRed之基因表現上 調，且禁食誘導β細胞中RIP3.1-DsRed之基因表現下調並 144673.doc •30- 201029669 保持α細胞中RIP3.1-DsRed之基因操作。 質體DNA之原位PCR及DsRed mRNA之原位RT-PCR:圖 5(中上圖為銀食1 0%葡萄糖，左圖為禁食）顯示針對Ripg. 1 _ DsRed質體DNA之原位PCR的結果。在整個胰臟（包括胰 島）中可見核型（nuclear pattern)質體DNA。在處於超音波 束内之左腎、脾及部分肝臟中觀測到類似的均質核型質體 組織定位。在右腎或骨骼肌（在超音波束外之器官）中不存 在質體。對照組（右上圖）（無質體之微泡或未經超音波處理 眷 之質體-微泡）未顯示胰臟内有質體之任何跡象。此等結果 說明超音波處理使質體在胰臟内及其緊鄰位置釋放。 圖5(中下圖（餵食1〇〇/0葡萄糖）顯示針對對應於受RIp3丨啟 動子控制而表現之DsRed轉錄物之mRNA的原位RT-PCR之 代表性實例。在整個胰島中可見DsRed mRNA，但在騰臟 實質中不可見，表明RIP啟動子僅在内分泌胰臟中引導經 UTMD遞送之DsRed cDNA之轉錄。左下圖（禁食）顯示在胰 φ 島邊界區中存在DsRed mRNA分布，但胰島核心中無。在 對照組中未偵測到信號。圖9至〗丨顯示其他構築體。 胰島再生及藉由體内遞送胰島轉錄因子基因而治療鏈佐 黴素誘發之糖尿病。 因為藥物療法（包括胰島素替代療法）不能複製正常胰島 之葡萄糖調節功能，所以糖尿病患者之血糖控制通常不 足。因此，新治療策略已集中於藉由胰島移植或p細胞再 生來補充兩種主要形式之糖尿病所共有的β細胞群缺乏。 〗’2胰島移植受供體胰島供應之限制且需要免疫抑制療法。 144673.doc -31 · 201029669 3胰島再生已在動物模型中取得成功’其主要使用病毒載 體靶向肝臟組織，4-7但出於安全原因’其不可能用於人 類。發明者先前已說明可使用超音波乾向微泡破壞法 (UTMD)使基因療法把向胰島。8利用超音波在胰臟微循環 内破壞載運質體DNA之靜脈内微泡’達成局部基因表現， 該表現可藉由使用大鼠胰島素-1啟動子而進一步靶向β細 胞。已使用UTMD將β細胞調節素及PDX1遞送至經鏈佐黴 素（STZ)誘發糖尿病之大鼠中，且藉由將胰臟腺泡細胞重 編程（reprogramming)成為胰島素產生細胞’在至多15天内 使糖尿病得到治療。9本發明使用UTMD ’使用編碼 NeuroD 1之質體歷時30天使胰島再生，且使血糖、胰島素 及C肽正常化。 大鼠胰島素啟動子及質體構築體。根據製造商說明書， 用QIAamp血液套組（Qiagen Inc，Valencia，CA)自史泊格多 利大鼠周邊血液中提取大鼠基因組DNA。使用PCR擴增來 自SD大鼠基因組DNA之大鼠胰島素基因1啟動子片段（-412 至+165)。將所得DNA片段次選殖至報導載體 (Clonetech，CA)中 〇 /ίΜα/4 cDNA及倉鼠 cDNA係來 自 Michigan State University之Olson lab及Duke University Medical Center之Newgard lab的捐贈/饋贈禮物。大鼠 、Pax萃及 Α^:λ：·2·2 cDNA 為來自史泊格多利 新生大鼠胰臟cDNA庫之PCR產物，其係根據製造商說明 書由其總RNA反轉錄得到。將新生大鼠胰臟樣品快速冷凍 於液氮中且在-86°C下儲存。在1 ml RNA-STAT溶液中解凍 144673.doc -32- 201029669 冷束樣品並立即使用？〇1丫1：1：〇11均質機以1〇,〇〇〇叩111歷時3〇秒 均質化。藉由使用Sensiscript RT套組（Qiagen Inc, Valencia, CA)利用 oligo(dT)反轉錄總 RNA(30 ng)(共 20 μΐ)16。在42°C下培育反應混合物50分鐘，隨後在70°C下再 培育 15 分鐘。使用 GeneAmp PCR 系統 9700(PE ABI，Foster City, CA, USA)，於含有 2 μΐ cDNA、25 μΐ HotStarTaq Master Mix(Qiagen Inc，Valencia, CA)及 20 pmol各引子之 50 μΐ體積中對所有樣品進行PCR。藉由瓊脂糖凝膠電泳驗 證相應PCR產物並藉由QIAquick凝膠提取套組（Qiagen Inc， Valencia，CA)純化。為確定該等序列，用二氣羅丹明螢光 標記終止物循環定序套組（Applied Biosystems, Foster City， CA)在ABI 3100基因組分析器上進行PCR產物之直接定 序。將所有轉錄因子基因cDNA次選殖至RIP3.1驅動之載 體中。質體消化、接合、次選殖、分離及純化均係藉由標 準程序進行，且再次定序以確定不存在人為突變。 動物方案及UTMD。所有動物研究皆係根據美國國家衛 生研究院（National Institute of Health，NIH)之建議且由動 物實驗委員會（institutional animal research committee)批 准進行。用腹膜内***（60 mg/kg)及赛拉嗪（5 mg/kg)麻 醉雄性史泊格多利大鼠（230至270 g)，劃開左腹及頸，且 藉由血管切開術將聚乙稀管（PE 50，Becton Dickinson, Franklin Lakes, TN，USA)***右側内頸靜脈中。 總共45隻大鼠接收以下九種處理之一 ：（1)不處理（正常 對照大鼠，n=3) ; (2)單獨 STZ(60 mg/kg/i.p_，Sigma, St 144673.doc -33- 201029669

Louis，MO，USA)，未經 UTMD處理（n=3) ; (3)STZ及利用 DMd 之 UTMD(n=3) ; (4)STZ 及利用 之 UTMD 處理 (n=6) ; (5)STZ 及利用 卿£>之 UTMD(n=6) ; (6)STZ及利

用尸之 UTMD(n=6) ; (7)STZ 及利用 之 UTMD (n=6) ; (8)STZ及利用 iVibcdi之UTMD(n=6) ; (9)STZ及利用 Λ/α/J之UTMD(n=6)。所有基因皆在RIP3.1啟動子控制下以 質體cDNA形式遞送。在STZ注射之後12小時量測血糖。具 有超過250 mg/dl之禁食金糖之動物被視作成功的第1型糖 尿病模型，且隨後在STZ處理之48小時内經歷UTMD。經 由果（Genie, Kent Scientific, Torrington, CT，USA)經 10分 鐘輸注微泡或對照溶液（0.5 ml，經0.5 ml磷酸鹽緩衝之生 理食鹽水溶液（PBS)稀釋）。在輸注期間，使用市售超音波 換能器（S3，Sonos 5500，Philips Ultrasound, Bothell，WA， USA)將超音波導向胰臟。在適當位置夾住探針。接著在 1.4之機械指數下以超諧波模式（發射1.3 MHz/接收3.6 MHz)施加超音波。使用R波峰之後45至70毫秒之延遲藉由 心電圖在每第四個收縮末期（end-systole)觸發四次超音脈 衝。已顯示此等設置對於使用此儀器藉由UTMD遞送質體 最佳。8在所有大鼠中，微泡破壞皆為顯而易見的。UTMD 後，結紮住頸靜脈，閉合皮膚，且使該等動物康復。在12 小時之隔夜禁食後抽取基線血樣，並在治療後不同天數時 抽取血樣。重複該方案3次，且在第10天、第20天及第30 天使用超劑量之戊巴比妥納（sodium pentobarbital)(120 mg/kg)殺死大鼠。收集胰臟、肝臟、脾及腎用於組織學研 144673.doc -34- 201029669 究。用金糖測試條（Precision, Abbott, Abbott Park, IL， USA)量測血糖含量；用RIA套組（Linco Research, Radioimmunoassay，Billerica，MA，USA)量測血液騰島素、 C肽。 製造含質體之脂質穩定之微泡。如先前所述，在吾人之 實驗室中製備經脂質穩定之微泡。簡言之，將DPPC(1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷脂醯膽鹼，Sigma，St. Louis， ΜΟ)2·5 mg/ml ; DPPE(1，2-二掠網醯基-sn-甘油-3-鱗脂酿 乙醇胺，Sigma, St· Louis，MO)0.5 mg/ml;及 10%甘油之 溶液與2 mg質體溶液以2:1比率混合。將0.5 ml此磷脂-質 體溶液之等分試樣置放於1.5 ml透明小瓶中；剩餘頂部空 間以全氟丙烧氣體（Air Products, Inc，Allentown，PA)填 充。在4°C下培育各小瓶30分鐘且接著藉由牙科用混汞器 (VialmixTM, Bristol-Myers Squibb Medical Imaging, N. Billerica，MA)機械震盪30秒。經脂質穩定之微泡作為乳白 色懸浮物浮於含有未連接質體DNA之液體層上部。藉由粒 子計數器（Beckman Coulter Multisizer III)量測上層中微泡 之平均直徑及濃度。 免疫組織化學。在4°C下於4%三聚甲醛中固定5至8 μπι 厚之冷凍切片15分鐘且以10 mM甘胺酸之PBS溶液中止5分 鐘。接著以PBS沖洗切片3次，並用含0.5%曲拉通X-1〇〇之 PBS滲透10分鐘。在37°C下用10%山羊血清阻斷切片1小 時，並用PBS洗滌3次。添加初級抗體（小鼠抗胰島素抗 體，1:500稀釋液；兔抗升糖素，1:500 ;兔抗生長抑素， 144673.doc -35- 201029669 1:500 ;兔抗胰多肽，1:500 ;兔抗NeuroDl，1:500 ;兔抗 Ki-67 ’ 兔抗BrDu ’ l:500(Sigma，St. Louis, MO);小鼠抗 ckl9’ 1:2000稀釋液（Chemicon，Temecula，CA)，且在室溫 下培育2小時。在用PBS洗滌3次歷時5分鐘之後，添加二次 抗體（Sigma, St; Louis，MO)抗小鼠IgG與FITC之結合物； 抗兔IgG與Cy5之結合物）（在阻斷溶液中以1:500稀釋）且在 室溫下培育1小時。以PBS沖洗切片10分鐘，5次，且接著 安裝。 數據分析。用Statview軟體（SAS，Cary, NC, USA)分析數 據。結果表示為平均值之一個標準差（mean one standard deviation) ° 用費雪事後測試（Fisher's post hoc test)藉由重 複量測ANOVA來分析差異且認為P<0.05為顯著。 胚胎内分泌胰臟之發育與編碼各種轉錄因子及其他蛋白 質之許多基因之活化相關。1(M1認識到在新生動物内分泌 發育與患糖尿病之成年動物胰島再生之間可能存在重要差 異，吾人設法評估是否能藉由UTMD使基因療法靶向胰臟 來實現患糖尿病之成年動物之胰島再生。構築在截短形式 之大鼠胰島素啟動子（RIP3.1)控制下之編碼、 NeuroDl、Pax4、Nkx2.2、Nkx6‘l 良 MafA 之 cONA之笮馥。 經20分鐘時期靜脈内輸注含有此等基因之微泡，同時使用 超音波在胰臟微循環内破壞該等微泡。在以腹膜内STZ(60 mg/kg)誘發糖尿病之後48小時進行UTMD。對照組包括利 用標記基因之UTMD ;僅STZ而無基因療 法；及不接收STZ之正常對照組。進行3次不同的重複實 144673.doc -36· 201029669 驗，其中在第10天、第20天及第30天殺死大鼠，以評估騰 島形態及基因表現。本文中論述30天研究之結果且概述於 圖6至圖8中。 圖6顯示用FITC標記之抗胰島素抗體（綠色）及經cy5標記 之抗升糖素抗體（紅色）染色的代表性組織學樣品。此等切 片係自在UTMD後30天殺死之一組大鼠獲得。正常姨島含 有由胰島周邊較少數目之α細胞（紅色）圍繞之中央核心p細 胞（綠色）。STZ後’正常胰島結構實際上廢除，且剩餘不 多的經分離β細胞或小簇β細胞。利用、户似4、 及Ma/J之基因療法使一些胰島再生，但具 有異常胰島結構’其中α細胞佔優勢。相比之下，利用 ㈣之基因療法使胰島再生且具有接近正常之形態。 令人感興趣的是，在UTMD基因療法組中存在少許與抗騰 島素及抗升糖素共染色的細胞，但在正常胰島中不存在。 先前已報導此發現為内分泌增殖之標記物。在正常大鼠 中’母個載片存在61±6個騰島，相比較而言，經單獨stz 處理後每個載片僅存在3±2個胰島。造成每個載片 37±4個胰島，此數字在統計學上顯著高於除正常對照組之 外的所有其他組（p<〇,000丨）。正常對照組中每個胰島之^細 胞百分數平均為77± 10%，且在經基因療法處理之 大鼠中為60±6%。所有其他組中每個胰島之p細胞數目皆 明顯減少》處理之大鼠的β細胞百分數在統計學 上顯著高於所有其他基因組及對照組（ρ<〇〇〇〇1)，但小於 正常對照組（ρ=0.0006)。此外，對與圖中所示相鄰之切片 144673.doc •37· 201029669 用抗生長抑素及抗多肽染色以分別評定δ細胞及多肽細胞 之存在（資料未圖示）。使騰島中央核心中產生相 當大量δ細胞及多肽細胞，類似於正常對照組。其他轉錄 因子不會使胰島内產生相當大量δ細胞或多肽細胞。 圖7顯示葡萄糖（左上圖）、胰島素（左下圖）及C肽（右上 圖）在基線、STZ後3天及STZ後30天時之血液含量。在所 有經STZ(約400 mg/dl)處理之大鼠中，到第3天時血糖顯著 增加，且在第3 0天時除經iVeMroDi處理之大鼠以外皆保持 升高。在第30天，經TVewroDi處理之大鼠的血糖為101士11 mg/dl，其在統計學上顯著低於所有其他經STZ處理之組 (p<0.0001)，但在統計學上與正常對照組並無不同。在較 短期實驗中，經處理之大鼠的血糖在第10天及第 20天亦正常。圖7之中圖及下圖顯示在所有經STZ處理之大 鼠中，第3天之胰島素及C肽含量皆明顯降低。到第30天 時，經處理之大鼠的騰島素及C肽含量接近正 常，在統計學上顯著高於第3天或所有其他經STZ處理之組 (p<0.0001)。為確定此等胰島素及C肽含量是否具葡萄糖反 應性，使具有6隻經NeuroDl處理之大鼠之獨立組及對照組 (3隻正常，3隻經STZ-DsRed處理）在UTMD後30天經歷葡 萄糖财受性測試。如圖7之右下圖中所示，經iVe wroZ)i處理 之大鼠之葡萄糖耐受性測試與正常對照組幾乎一致。 圖8顯示BrdU(左上圖）及Ki67(中上圖）染色之結果，其指 示細胞增殖。此等圖為經處理之大鼠的單一胰島 之高放大率影像。在胰島素陽性（綠色）細胞中存在經 144673.doc -38 - 201029669

BrdU(紅色，左上圖）及Ki67(紅色，中上圖）染色之核。與 正常對照組及經STZ處理之對照組相比，以犯及Ki67陽性 細胞的數目在統計學上顯著較高，分別為3〇±2%及丨〇±2〇/〇 個胰島素陽性細胞（ρ<〇·〇〇〇1)。正常對照組不具有Brdu染 色之跡象，且僅有極少細胞為Ki67陽性。下圖顯示對於 CK19(綠色，最左圖）、騰島素（紅色，左中圖）、神經元素 3(neUrogenin 3)(藍色，右中圖）的免疫螢光染色及組合影 像（最右圖）。不存在CK19(一種腺導管細胞標記物）與胰島 素或神經元素3之共定位（colocalization);而後兩種標記物 係共定位於胰島中心之β細胞内。此表明胰島再生不可能 ' 為腺導管細胞起源。 • 此研究顯示體内遞送靶向經STZ處理之大鼠之胰臟的 導致再生接近正常外觀之胰島，且具有恢復正常 之葡萄糖、胰島素及C肽之血液含量。UTMD法允許將基 因非侵襲性靶向遞送至胰臟，其為適於胰島之正常環境。 φ 藉由UTMD以質體形式遞送之報導基因的峰值表現為4 天，此後迅速降解。8因此，藉由此方法進行短暫基因表 現能夠誘導胰島再生，同時在理論上使可能與外源基因療 法之表現延長相關的腫瘤形成之風險減到最小。 為胰臟、腸及中樞神經系統中發現之鹼性螺旋_ 環-螺旋轉錄因子。存在於胰芽（bud)發育中且在 所有成熟胰島細胞類型中仍可偵測。在剔除之小 鼠中，所有内分泌細胞類型均發育，但出現胰島數目減少 及β細胞之細胞凋亡增加。丨4普遍認為並非早期分 144673 .doc •39· 201029669 化所必需’但在後期分化及維持p細胞以及決定細胞命運 方面起重要作用。15’16此有關#在内分泌發育中之 作用的觀點雖然主要基於轉殖基因小鼠研究，但亦與本研 究中所觀測的關於含有多種細胞類型之胰島之胰島再生的 發現一致》 其他轉錄因子’尤其#別3、以、#以2.2、jvhiy及 Μα/4 ’亦使胰島再生，但該等胰島主要包含α細胞，且血 糖、胰島素及C肽不正常。令人感興趣的是’在Pdxl啟動 子調節下表現之轉殖基因小鼠顯示大多數為升糖素陽 性細胞’ 17類似於吾人在體内遞送之後的發現。當 在正在發育之雞消化道中過度表現時，其亦主要產生 α細胞。18當將此等轉錄因子外源遞送至患有糖尿病之成年 動物時’該等轉錄因子之作用可能與其在胚胎發育中之作 用不同。轉錄因子基因或者與胰臟發育或細胞週期關聯之 其他基因的各種組合亦有可能引起甚至比此研究中所觀測 更穩疋之胰島再生。舉例而言，Chen等人顯示可在經STZ 處理之大鼠中藉由體内遞送A細廣縛藏爹與尸办；質體之組 合誘導腺泡細胞產生胰島素，且使血糖及胰島素在至多15 天内恢復正常。9近年來，Zh〇u等人報導藉由將腺病毒直 接注入免疫缺陷小鼠之胰臟中來遞送^^”3、與戶必^ 之組合使外分泌細胞重編程成為β細胞表型。19此等新ρ細 胞分離成單個細胞或僅少數細胞之小簇，而非聚集成姨 島。血糖、胰島素及C肽得到改良，而非恢復至正常水 準。當遞送單個轉錄因子時，未見到大量數量之新ρ細 144673.doc •40- 201029669

。首先， 因遞送法來乾向整個騰 子來靶向内分泌胰臟。 -，但在内分泌胰臟中不 _比在内分泌胰臟中穩 s送至肝臟而達成患STZ ，並由此使血糖恢復正 常。然:而，出於安全考慮，腺病毒不適用於人類。儘管 肝臟為胰島再生及胰島移植之適當器官，但本發明使用超 音波介導之微泡破壞法將質體£51^入遞送至整個胰臟，具 有相對有效之器官特異性。因為胰臟為胰島之正常生理 環境，所以靶向胰臟將提供胰島再生及維持之益處。 再生之胰島可能體現STZ處理後殘存之分散p細胞之複 製。利用Ckl9(一種腺導管細胞標記物）之免疫組織化學染 色在再生之騰島中不顯示任何顯著吸收。僅在stz處理之 後即刻或在STZ處理後48小時内投與基因遞送時能見到胰 島再生之發生。當在STZ之後7天（在STZ對照大鼠中實際 上不存在胰島素染色細胞之時期）利用基因遞送重複實驗 時，見不到胰島再生且發展嚴重高血糖及體重減輕。使用 大鼠胰島素I啟動子之修飾型’其具有極強的β細胞特異 性，8且預期其在外分泌胰臟中實質上不具有活性。此等 考慮與β細胞複製為增加β細胞群之主要機制的普遍觀點一 致。12’22,23令人感興趣的是，以在β細胞特異性啟動子控制 144673.doc 41 201029669 下之各種轉錄因子刺激殘存β細胞產生相當大量之α細胞、 δ細胞及多肽細胞。此表明此等轉錄因子，尤其八^， 不僅誘使β細胞增殖並聚集成胰島，而且亦形成其他胰島 細胞類型。出現此情形之機制有待闡明。 使用基因療法促進糖尿病患者之胰島再生之概念似乎可 能。Meier等人顯示88%之來自患有長期第J型糖尿病之成 人之屍檢試樣具有相當大量之β細胞，以及β細胞細胞凋亡 及Τ淋巴細胞浸潤。24因此，現存之β細胞為用單獨 ⑴或历與其他轉錄因子之組合進行再生基因 _ 療法的可能標靶。然而，使胰島再生之任何策略亦須考慮 細胞凋亡、發炎或自體免疫對新狹島可能引起之破壞。有 可能將再生基因與抑制細胞凋亡25心及/或自體免疫反應之 基因或藥物組合。關於抑制自體免疫反應之藥物，近期有 證據表明他克莫司及西羅莫司可能對爲細胞具有直接毒性 作用。12最佳的免疫抑制方案係基於患者需求及免疫反應 (若有的話)而制定。最後，齧齒動物與人類在胰島生物學 方面存在重要差異’2因此在打算進行人類試驗之前需❿ 要在高級動物中證實此等發現。 預期本說明書中所論述之任何實施例均可關於本發明之 任何方法、套組、試劑或組合物來實施，且反之亦然。此 外’本發明組合物可用來達成本發明之方&。 ^瞭解本文描述之特定實施例係以說明方式顯示而不限 又發Θ本發明之主要特徵可在*脫離本發明範嘴之 況下用於各種實施例中。熟習此項技術者僅使用常規實驗 144673.doc -42- 201029669 metabolism 17:92-100, 2006 4. McClane SJ, Chirmule N, Burke CV, Raper SE: Characterization of the immune response after local delivery of recombinant adenovirus in murine pancreas and successful strategies for readministration. Human Gene Ther 8:2207-2216, 1997

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當在申請專利範圍及/或說明書中結合術語「包含」使 用時，δ§) #「-」之使用可意謂「-個（種）」，但其亦與 「一或多個（種）」、「至少一個（種）」及「一個（種）或一個 (種）以上」之含義—致。除非明確表示僅指二中擇一的或 供選擇者互相排斥，否則在中請專利範圍中使用術語 「「或」係用於意謂「及/或」，但本案支持僅二中擇一及 「及/或」之定義。在本中請案全文中，術語「約」用於 指示值包括用以測定該值之裝置、方法固有的誤差變化或 研究個體間存在之變化。 「如本說明書及申請專利範圍中所使用，詞語「包含」、 、有」匕括」或「含有」均為包括一切在内的或開放 式的且不排除其他未列舉之要素或方法步驟。 如本文中所用’術語「或其組合」係指該術語前所列 目之所有排列及組合。舉例而言，「A、b、c或其组合」 意欲包括以下至少-種：a、b、c ab ac bc^ ABC ’且若在特定情形中次序很重要，則亦可為BA、 144673.doc -43· 201029669 CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC 或 CAB。繼續此實 例，明顯包括含有一或多個項目或術語之重複的組合，諸 如 BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、 CAB ABB，諸如此類。熟習此項技術者將瞭解，除非另外 自上下文中顯而易知，否則通常對項目或術語在任何組合 中之數目並無限制。 可根據本發明在無過度實驗之情況下製造及執行本文所 揭示及主張之所有組合物及/或方法。雖然已依據較佳實 施例描述本發明之組合物及方法，但熟習此項技術者將顯 而易知，在不脫離本發明之概念、精神及範疇的情況下可 將對本文描述之組合物及/或方法以及該方法之步驟或步 驟之順序施行變更。認為熟習此項技術者顯而易知之所有 該等類似取代及修改均在如隨附申請專利範圍所界定之本 發明之精神、範疇及概念内。 參考文獻 新載體 1. Newgard CB: While tinkering with the β-cell metabolic regulatory mechanisms and new therapeutic strategies: American Diabetes Association Lilly Lecture, 2001. Diabetes 51:3141-3 150, 2002 2. Bonner-Weir, S·及 Weir, G.C. New sources of pancreatic β-cells. Nat. Biotechnol. 23:857-861, 2005 3. Samson, SL, Chan L. Gene therapy for diabetes: reinventing the islet. Trends in endocrinology and 144673.doc -44- 201029669 in mice. iVai. Mec/· 9，596-603 (2003) 〇 6. Kaneto，H.等人，PDX-1/VP16 fusion protein, together with NeuroD or Ngn3, markedly induces insulin gene transcription and ameliorates glucose tolerance. Diabetes 54, 1009-1022 (2005)。 7. Wang, A. Y.，Ehrhardt, A.，Xu，H,及 Kay, M.A. Adenovirus transduction is required for the correction of diabetes using Pdx-1 or Neurogenin-3 in the liver. Mol.

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23· Teta, M·，Rankin，M.M.，Long，S.Y” Stein，G.M.,及 Kushner, J.A. Growth and regeneration of adult β cells does not involve specialized progenitors. Dev. Cell 12, 817-826 (2007)° 24. Meier, J.J., Bhushan, A., Butler, A.E., Rizza, R.A., Butler, P.C. Sustained beta cell apoptosis in patients with long-standing type I diabetes: indirect evidence for islet regeneration? Diabetologia 48, 2221-2228 (2005) ° 25. Dror, V.等人，Notch signaling suppresses apoptosis in 144673.doc -49- 201029669 adult human and mouse pancreatic islet cells. Diabetologia 50, 2504-2515 (2007)。 26. Drucker, D.J. Glucagon-like peptide-1 and the islet beta-cell: augmentation of cell proliferation and inhibition of apoptosis.五144，5145-5148 (2003) 0 27. Noguchi，H.等人，Activation of c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) pathway during islet transplantation and prevention of islet graft loss by intraportal injection of JNK inhibitor. 50, 612-619 (2007)。 28. Lin, C.Y., Gurlo, T., Haataja, L., Hsueh, W.A., Butler, P.C. Activation of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma by rosiglitazone protects human islet cells against human islet amyloid polypeptide toxicity by a phosphatidyl inositol 3'-kinase-dependent pathway. J. Clin. Endocrinol. Metab. 90, 6678-6686 (2005) ° 【圖式簡單說明】 圖1為大鼠騰島素啟動子區以及外顯子1、内含子1及外 顯子2的示意圖。大鼠胰島素啟動子係以已知序列元件以 及融合外顯子1及外顯子2顯示； 圖2 :上圖為ripS_iuc轉染之後48小時在三種不同葡萄糖 濃度下INS-1細胞溶解產物之螢光素酶活性。下圖為rips_ luc轉染之後在高濃度葡萄糖下培養不同培養時間之培養 液的螢光素酶活性，在無葡萄糖情況下及在正常葡萄糖濃 度下無螢光素酶活性（資料未圖示）； 144673.doc -50- 201029669 圖3 : (3A) : RIP3.1-DsRed載片，左上圖：綠色為抗胰 島素；中上圖：紅色為抗dsred ;及右上圖為其共焦影像。 下圖為連續切片及類似胰島結構，左下圖··綠色為抗升糖 素；中下圖：紅色為抗dsred ;右下圖為其共焦影像。 (3B) ： RIP-4.1-dsred ； (3C) ： RIP-1.1-dsred ； (3D) ： RIP-1.1-dsred載片；（3E) : pCMV-dsred ; F :正常對照組； 圖4 : (4A):餵食10%葡萄糖之pRIP3.1-DsRed大鼠之影 像，A右上圖：綠色為抗胰島素；A中上圖：紅色為抗 dsred，A左上圖為其共焦影像，A右下圖：綠色為抗升糖 素；A中下圖：紅色為抗dsred ; A左下圖：其共焦影像； (4B)為禁食隔夜之pRIPSJ-DsRed大鼠之影像； 圖5 :上圖：來自對照大鼠（左圖）及經UTMD處理之大鼠 (中圖為餵食大鼠且右圖為禁食大鼠）之顯微切片（400X)。 使用原位PCR對DsRed質體DNA染色，其在整個經處理之 胰臟中可見。胰島清晰可見（箭頭）。下圖：來自對照大鼠 (左圖）及使用RIP6.1-DsRed之經UTMD處理之大鼠（中圖為 餵食大鼠且右圖為禁食大鼠）之切片（400X)。使用原位RT-PCR對DsRed mRNA染色，其係位於胰島中心（中圖/餱 食）。胰島邊界染色（右圖/禁食大鼠）； 圖6顯示免疫螢光顯微法之結果。上圖顯示來自30天實 驗之胰島之代表性實例。經FITC標記之抗胰島素（綠色）顯 示β細胞，而經DsRed標記之抗升糖素顯示α細胞。用 Nkx2.2、Nkx6· J、Pax4、Ngn3反MafA進行的超音波乾向基 因療法使得形成α細胞佔優勢之胰島。相比之下，經 144673.doc •51 - 201029669 iVewroZ)/處理之大鼠具有中央β細胞由周邊α細胞圍繞之接 近正常之胰島結構。左下圖顯示不同組中每個載片之胰島 計數。正常對照組及經NeuroDl處理之大鼠在每個載片中 具有明顯多於所有其他各組之胰島（根據ANOVA， *p<0.0001)。右下圖顯示每個胰島之β細胞數目。正常對照 組及經WewroDJ處理之大鼠每個胰島之β細胞百分數明顯高 於所有其他各組（根據ANOVA，*ρ<0.0001); 圖7顯示血糖（右上圖）、血液胰島素（右下圖）及c肽（右上 圖）在30天實驗中之結果。在第3天，相對於正常對照組， 所有經STZ處理之大鼠皆具有明顯升高之血糖以及減少之 胰島素及C肽（ρ<0·0001)。然而，到第30天時，僅經 處理之大鼠具有恢復至正常水準或接近正常之水 準之血糖、胰島素及C肽。右下圖顯示具有6隻經iVwroDi 處理之大鼠的獨立組（n=6)與正常對照組（n=3)及經處 理之大鼠（n=3)之葡萄糖耐受性測試結果的比較。在STZ誘 發糖尿病後利用之基因療法使葡萄糖耐受性恢復 正常； 圖8顯示細胞增殖之標記物。左上圖及中上圖顯示與經 FICT標記之抗胰島素（綠色）以及經DsRed標記之抗Brdu(左 圖）及抗Ki67(中圖）共染色之胰島。右上圖顯示Ki67陽性' 胰島素陽性細胞之數目，在經處理之STZ大鼠中 該等細胞之數目在統計學上顯著高於正常對照組、經STZ 處理之對照大鼠或藉由UTMD用DMec/處理之經8ΤΖ處理之 大鼠（P<0.0001)。下圖顯示用抗Ckl9(左圖，綠色）、抗胰 144673.doc -52- 201029669 島素（左中圖，紅色）、抗ngn3(右中圖，藍色）染色的經 處理之STZ大鼠的胰島及其共焦影像（右圖）。胰島 素陽性β細胞與ngn3共染色，而不與Ckl9共染色，表明再 生之胰島並非起源於腺導管細胞； 圖9為HIP-hNeuroDl質體之圖譜； 圖10為RIP3.1-DsRed質體之圖譜；及 圖11為RIP-DsRed 4.1質體之圖譜。

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201029669 序列表 <πο>美商貝勒研究協會 <120>胰島再生及藉由體内遞送腺島轉錄因子基因而治療 糖尿病之方‘ <130〉聽:2243 <140> PCT/US09/64467 <141> 2009-11-13 <150> US 61/114,407 <151> 2008-11-13 <160> 12 <170> Patcntln version 3.5 <210> 1 <21〗> 5425 <212> DNA <213>褐家鼠 <400> 1 ggatcctcag gcagttcaat gtccaatttt ctgaggaacc tccagactga tttccagaat ggttttacca gtctgcaatc ccaccaacaa tggaggagtg ttcctctttc tccacatcct cgccagcatc tgctgtcacc tgagtttttg atcttagcca ttctcactgg tgigaggtga aatctcaggg ttgttttgat ttgcatttcc cttatgacta aagatgttga acatttcttt aggtgtttct cagccattcg gcattcctca gctgtgaatt ctttgtttag ctctgaaccc cattttttaa tagggttatt tgtttccctg cggtctaact tettgagtte tttgtatatt ttggatataa ggcctctatc tgttstagga ttggtaaaga tcttttccca atctgttggt tgccgttttg tcctaaccac agtgtccttt gccttacaga agctttgcag ttttatgaga tcccatttat egattettga tettggagea taagccattg gtgttttgtt caggaaattt tttccagtgc ctatgt£ttc cagatgcttc cctagttttt ettetattag tttgagtgtg tctggtttga tgtggaggtc catgatccac ttggacttaa gctttgtaca £g£tgataag catggatcga tetgeattet tctacatgtt gccctccagt tgaaccagca ccatttgctg aaaatgctat cttttttcca ttggatggtt ttggctcctt tgtcaaaaat caagtgacca taggtgtgtg ggttcatttc tgggtcttca attctattcc attggtctat ctgtctgtct ctgtaccaat accatgcagt tttatcacca ttgctctgta atactgcttg agttcaggga tagtgattcc ccctgaagtc cttttattgt tgaggatage tttagetate ctgggttttt tgttattcca gatgaatttg caaattgttc tgtctaactc tttgaagaat tggattggta ttttgatggg gattgeattg aatctgtaga ttgcttttgg taaaatggcc atttttacta tattaatcct gccaatccat sagcatggga gatctttcca tettetgagg tcttcttcaa tttctttcct cagtgtcttg aagttcttat tgtacagatc ttttacttgc ttggttaaag tcacaccgag gtactttata ttatttgggt ctattatgaa gggtgtcatt tccctaattt ctttctcggc ttgtttctct tttgtataga ggaagscaac tgatttattt gagttaattt tatacccagc cactttgctg aagttgttta teagetttag tagttctctg gtggaacttt tgggatcact taaatatact atcatgtcat ctgcaaatag tgatattttg acctcttctt 144673.doc 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 201029669 ttccgatctg tatccctttg atctcctttt gttgtctgat tgctctggct agaacttcaa 1500 gaactatatt gaaaaastag ggagagagtg ggcagccttg tctagtccct gattttagtg 1560 ggattgcttc aagtttctct ccatttagtt taatgttagc aactggtttg ctgtatatgg 1620 cttttactat gtttagtatg ggccttgaat tcctattctt tccaggactt ttatcatgaa 1680 aacacgataa tttaatggag atgtttatgt ttgggaggac cttgagagaa 1740 aggcactggt ccaagtcatt atagaatcat agtctaagcc aaaaatactc atatatgttc 1800 agtttcacta ccctccttct cctcgagacg tgtgacctaa stagctgtct gtatacggta 1860 atatacttgc cagttcctga gataagcagg cgcacagtgc cccattccga aataagtgtg 1920 cagccagtgt tctagcttta gtctccgatg gaatcccctg gttcaagtga tgatctcatg 1980 ttgtc£〇atc ccatttcctt ccagggagct ccctcaggag aacgactgct cacccgcgac 2040 ctttccacag gattgaagct cagggaagga aacaatattt gaagtttcag tccagtggtg 2100 catatgaact ttagaatcac tccaccacta tctacaacga caaaagtcac atggctaaag 2160 aagagtgtca gaaaagagct ccttaaaaaa taaaattcaa ttcaattcaa ttcttgagca 2220 gtcctagtct cgtccatcag ccttctctct ggtccctcta attctctgac tcactctctg 2280 accagtgtag ccagtaaagg ggacattttc tctaaataaa tgttttcttc caacttgaaa 2340 cctaatgttt acaagccttt atattacagt accttggttt ctccactctg atgaaataca 2400 aacatcttac ctatcattca gtcatgggtt ttctttcttt gttctcagct ctctgggtac 2460 ctgtcatgga ctgccacatg atgattggct gagcagtggt gaagacacta acctcactgg 2520 aatcataaag tagatttcta attaagaaaa aggastgcca cccattgttc aaaggaacac 2580 tgtgttaatt tagttagagt ggagggtgca aattctaaga ggaaagctaa tttataaaca 2640 cggtgccaga acctgtttcc caaasttctg ttgtgccggg ctagaaccac acatttgagg 2700 ttgtagtcaa tggctgagaa caggagagat caagcacccc cagaaaggtc ctctttttga 2760 acaaagatta tcagtgcatc cagttaaata agaaagttga cagtggttga gagaagcaac 2820 caggtgcttg ccagccccac ataactccag gctagcagca aagatgacct tactctcccg 2880 atacaagctg ggtcacttac agtgctatac ttcgctattt tcctctactc atacccttta 2940 gaaaactgcc aaattgatat ^ttttccata cctataatca gactaagaaa aagaggcaga 3000 aacaagtttt aaaagctttc atggatggca ctggagaagt taaatttttt tgctgtataa 3060 cctatgttta ttttatacca taaggacttc acaaactaac ttaacgttat tgaaccagta 3120 caaacctact ttctttaatg gcttctgagt tacttgaaga caagtaacgt gtctacttta 3180 ttatggcgcc tacattggaa cccactgcac atcaccagag atttttctca gcaaatgttt 3240 gttgacltaa ttgaatgctg tcattgacag aaagtctggt ttgcatttcc tctcaactcc 3300 ttgaaaatag ctacctttcc taattgaccc tgttggcaga tgtttaaact ggggtgaacg 3360 ctgtgctact gaggcctgat gctttgtgga aaatcaatta gaatgagacc aaatgttcca 3420 cctaattcaa atggttgtca aaaaatagaa tttgagtatc tatatttcgt cccagctgac 3480 ccctgagtgg gctatgggtt tgtggaagta gagatagagg agaagggacc attacatgtc 3540 ctgctgcctg agttctgctt tccttctccc tttgaaggtg agctggggtc tcagctgagc 3600 taagaatcca gctatcaata gaaactatga aacagttcca gggacaaaga taccaggtcc 3660 -2- 144673.doc

201029669 ccaacaactg caactttctg ggaaatgagg tggaaaatgc tcagccaagg aaaaagaggg ccttaccctc tctgggacaa tgattgtgct gtgaactgct tcatcacggc atctggcccc ttgttaataa tctaattacc ctaggtctaa gtagagttgt tgacgtccaa tgagcgcttt ctgcagactt agcactaggc aagtgtttgg aaattacagc ttcagcccct ctcgccatct gcctacctac ccctcctaga gcccttaatg ggccaaacgg caaagtccag g£ggcagaga ggaggtgctt tggactataa agctagtgga gacccagtaa ctcccaaccc taagtgacca gctacaatca tagaccatca gcaagcaggt atgtactctc ctgggtgagc ccggttcccc cagccaaaac tctagggact ttaggaagga tgtgggitcc tctcttacat ggaccttttc ctagcctcaa ccctgcctat cttccaggtc attgttccaa catggccctg tggatgcgct tcctgcccct gctggccctg ctcgtcctct gggagcccaa gcctgcccag gcttttgtca aacagcacct ttgtggtcct cacctggtgg aggctctgta cctggtgtgt ggggaacgtg gtttcttcta cacacccaag tcccgtcgtg aagtggagga cccgcaagtg ccacaactgg agctgggtg£ aggcccggag gccggggatc ttcagacctt ggcactggag gttgcccggc agaagcgtgg cattgtggat cagtgctgca ccagcatctg ctccctctac caactggaga actactgcaa ctgagtccac oactccccgc ccacccctct gcaatgaata aagcctttga atgagcacca aaatgagaga gtttttatga alacaaaggg attgtgtgaa cgggaatctt tttctctgtc atttagtatc gtgctagcgt attactaagc agttgttaaa actgcatgat tgtgtaacca tttaagaagc tcatgataaa acacgacata attcaaagta tccagaattt ggataataag agagtcaaag ggtaaatgcc actgaagtta ctagtccaaa agtgatttgc ttctgtcttg gctcaccccc ctggtactat ttagctcaca attccaggtt acagttcatc cacagaaggg gagtggaata gagacggata aataaatgta cccatacatc aacctatcta gatagtgtcc cactgagaat ccccttccta gattatccta gactatcaag tagacagtta aaacatcaca atcactttgc acatcccaca ccatcctgca ataattcatt cactttctca tatacatcag agagatcact ccttccacag ataactacag tggtaaaggt cagtgtgagt tcctatacag ctgtggagtg atacagtctg tgcccttaac actttggttc cagacagagg aaggaggaat aaacacgaga acacaggtat gcggtttgta aaccagtaca cgaatgttta gatttttaaa aagatttttg tgggccaact aaggagtgag tgtctgttgc cagaaaatgt ctttccaacc ttggtgtgaa cactgaccca tcaacactag aatacaaggt tctgacttcc aggctttcta agtcagaact cctgttgtca cagctgtagc tatgaatcta acaaaagctc ttcagtcttc gtatgaatag gatcc <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213>人工 <220> <223>人工引子 <400> 2 gctgagctaa gaatcca <210> 3 <211> 16 144673.doc 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920 4980 5040 5100 5160 5220 5280 5340 5400 5425 201029669 <212> IM <213>人工 <220> <223>人工引子 <400> 3 ctgagcattt tccacc <210> 4 <2Π> 19 <212> DNA <213>人工 <220> <223>人工引子 <400> 4 gggagttact gggtctcca <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213>人工 <220> <223>人工引子 <400> 5 gcagaattcc tgcttgctga tggtcta <210> 6 <2Π> 19 <212> DNA <213>人工 <220> <223>人工引子 <400> 6 gttggaacaa tgacctgga <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213>人工 <220> <223>人工引子 <400> 7 ggcagaagga cagtgatct <210> 8 <211> 21 <212> IM <213>人工 人工引子 <220> <223> <400> 8 gagttcatgc gcttcaaggt g <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213>人工 144673.doc 201029669 <220> <223>人工引子 <400> 9 ttggagtcca cgtagtagta g 0>1>2>3> 11 1* «i 11 <2<2<2<2 <220> <223>人工引子 <400> 10 21 gagttcatgc gcttcaaggt g η-人 07ι7β Ί* 1 n lx <2<2<2<2 <220> 參 <223>人工引子 <400> 11 21 ttggagtcca cgtagtagta g <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213>人工 <220> <223>人工引子 <400> 12 gatggtgatg tcctcgttgt g

144673.doc

Claims (1)

1. 201029669 七、申請專利範圍： 1. 一種用於在胰臟中進行超音波靶向微泡破壞的組合物， 其包含： 預組裝之脂質體-核酸微泡複合物，其中該預組裝之脂 質體-核酸複合物包含受胰島素啟動子控制之Neur〇D基 因，其包含一或多個胰島素反應性調節基因操作性連接 至胰島素啟動子區，該胰島素啟動子區包含該胰島素啟 動子之基因組片段，該胰島素啟動子之基因組片段包含 〇 胰島素基因之5’非轉譯區、外顯子1、内含子！及外顯子 2 ’其中該微泡在該胰臟中之靶位點處破裂，將該核酸 - 遞送至胰臟細胞内該超音波破裂之位置，其中含有該核 酸之細胞會回應高血糖含量而表現胰島素。 2. 如请求項1之組合物，其進一步包含一或多個姨島素反 應性調節基因操作性連接至可調節之胰島素啟動子區， 該騰島素啟動子區包含在NeuroD基因上游之胰島素起始 位點上游區域的50個連續鹼基。 3. 如凊求項1之組合物，其進一步包含一或多個選自一或 多個操作性連接至胰島素啟動子區之胰島素反應性調節 基因的基因’該一或多個胰島素反應性調節基因係選自 ngn3、GLP1、PDX1、Mafa、β細胞調節素（betacellulin)、 Nkx2.2、Nkx6.1、PAX4、Isll、細胞週期素（Cyclin) D2(及細胞週期素家族之其他成員）、CDK4(及細胞週期 素依賴性激酶家族之其他成員）及針對細胞週期素依賴性 激酶抑制因子（諸如p16及INK4家族之其他成員，或p27 144673.doc 201029669 及CIP/KIP家族之其他成員）之siRNA。 4. 如請求項1之組合物，其進一步包含與該組合物共投與 的藥劑，其中該藥劑係選自抗細胞凋亡劑、消炎劑、 JNK抑制劑、GLP-1、他克莫司（tacrolimus)、西羅莫司 (sirolimus)、阿那白滯素（anakinra)、德爾溫（Dervin)聚 酿胺或其組合。 5. —種在胰臟中使用超音波靶向微泡破壞來使胰臟β細胞 再生的組合物，其包含： 包含NeuroD之微泡，其中該等微泡包含在該胰臟中藉 由超音波破裂而釋放NeuroD的脂質。 6. 如請求項5之組合物，其中NeuroD為重組Neuro D。 7. 如請求項5之組合物，其中NeuroD包含受CUBI、 RIP2.1、RIP3.1或HIP3.1啟動子控制之NeuroD基因，且 NeuroD係在受到該超音波靶向微泡破壞法靶向作用以進 行表現之細胞中表現。 8. —種NeuroD之用途，其用於製造供遞送至胰臟以使糖尿 病患者之胰島素反應性細胞在體内及原位再生之藥物， 其中該姨臟中之細胞使該細胞回應血液中之高葡萄糖 含量而分泌騰島素。 9. 如請求項8之用途，其中該藥物在該等胰臟細胞中遞送 表現NeuroD基因之外源核酸區段。 10. 如請求項8之用途，其中Neuro D係藉由超音波靶向微泡 破壞遞送至該胰臟。 11. 如請求項8之用途，其中該藥物在該等胰臟細胞中遞送 144673.doc 201029669 受CUBI、RIP2.1、RIP3.1或HIP3.1啟動子控制而表現 NeuroD基因的外源核酸區段。 12. —種核酸區段之用途，其用於製造供遞送至標靶胰臟細 胞以使該細胞具胰島素反應性之藥物，其中 該核酸區段包含所製備受選自CUBI、RIP2.1、RIP3.1 或HIP3.1啟動子之胰島素反應性啟動子控制之Neur〇D基 因，且裝載至微泡中，且其中該把細胞維持在有效表現 該胰島素反應性調節基因之條件下；其中該乾細胞中 NeuroD之表現使該細胞對高血糖起反應。 13. 如请求項12之用途，其中該核酸區段進一步包含一或多 個受該啟動子控制之選自PDX1、Nkx2.2、Nkx 6>1、 PAX4、MafA、ngn3、GLP1、細胞週期素 m、cdk4& 其組合的基因。 14. 如請求項12之用途，其中該藥物進一步包含選自以下之 藥劑或係與選自以下之藥劑共投與：抗細胞社劑、消 炎劑、JNK抑制劑、gljm、他克莫司、西羅莫司、阿 那白滯素、德爾溫聚醯胺或其組合。 .如請求項12之用途，其中該微泡包含預組裝之脂質體-核 酸複合物脂質體。 16. 如請求項12之用途，其中該微泡包含預組裝^旨f體_核 酸複合物脂質體’其包含U2_二棕摘酿基甘油小填 脂酿膽驗及i，2-二標橺酿基，甘油_3•碟脂酿乙醇胺甘 油與質體混合。 17. -種恢復胰島素反應性之方法，其包含以下步驟： 144673.doc 201029669 獲得包含-或多個膦島素反應性調節基因操作性連接 至高表現胰島素啟動子區之經分離核酸區段，該胰島素 啟動子區包含胰島素啟動子之基因組片段，該胰島素啟 動子之基因組片段包含胰島素基因之5，非轉譯區、外顯 子1、内含子1及外顯子2 ; 將該核酸區段轉移至無細胞中；及 在有效表現該胰島素反應性調節基因之條件下維持該 靶細胞；其中在該靶細胞中該胰島素反應性調節基因之 表現使該細胞對高血糖起反應。 18. 如請求項17之方法，其中該胰島素反應性細胞係在動物 體内。 19. 如s青求項17之方法，其中一或多個操作性連接至騰島素 啟動子區之胰島素反應性調節基因係在病毒载體或質體 載體中。 20. 如请求項17之方法，其中該一或多個操作性連接至胰島 素啟動子區之胰島素反應性調節基因係選自Neur〇D、 ngn3、GLP1、PDX1、Mafa、β 細胞調節素、Nkx2 2 ' Nkx6.1、PAX4、Isll、細胞週期素D2(及細胞週期素家 族之其他成員）、CDK4(及細胞週期素依賴性激酶家族之 其他成員）及針對細胞週期素依賴性激酶抑制因子（諸如 pi 6及INK4家族之其他成員，或p27及CIP/KIP家族之其 他成員）之siRNA。 21. —種恢復胰島素反應性之方法，其包含以下步驟： 獲得包含一或多個胰島素反應性調節基因操作性連接 144673.doc 201029669 至胰島素啟動子區之經分離核酸區段 區包含mu##/·! 孩姨島素啟動子 广胰島素啟動子之基因組片段 基因組片段包令腌良喜句震啟動子之 月段包3胰島素基因之5,非轉譯 含子1及外顯子2’· 卜顯子卜内 將該核酸區段轉移至胰臟細胞中；及 在有效表現該騰島素反應性調節基因之條件下維持該 參 乾細胞；其中在該無細胞中該縢島素反應性調節基因之 表現使s亥細胞對高血糖起反應。 如"月求項21之方法，其中該姨島素啟動子區包含π。出 Ν〇·: 1之轉錄起始位點上游區域中之⑽至$⑼個連續驗 基0 23. 如請求項21之方法，其中該胰島素啟動子區包含剛ι〇 NO_: 1中該轉錄起始位點上游之全部區域。 24. 如請求項21之方法，其中該胰島素啟動子區包含該胰島 素轉錄起始位點上游之全部區域。 25. —種經分離核酸，其包含胰島素啟動子區，該胰島素啟 動子區包含胰島素啟動子之基因組片段，該胰島素啟動 子之基因組片段包含在一或多個胰島素反應性基因上游 的胰島素基因之5'非轉譯區、外顯子1、内含子丨及外顯 子2。 26. —種用於在胰臟中進行超音波靶向微泡破壞的組合物， 其包含： 與微泡接觸的預組裝之脂質體_核酸複合物，其中該預 組裝之脂質體-核酸複合物包含一或多個胰島素反應性調 144673.doc 201029669 節基因操作性連接至高表現、可調節之胰島素啟動子 區，該騰島素啟動子區包含騰島素啟動子之基因組片 “胰島素啟動子之基因組片段包含胰島素基因之5' 非轉譯區、外顯子1、内含子1及外顯子2，其中在該騰 臟中之乾位點處以超音波破裂該微泡，將該核酸遞送至 胰臟細胞内該超音波破裂之位置。 27·如請求項26之組合物，其中該預組裝之脂質體-核酸複合 物包含陽離子脂質、陰離子脂f或其混合物及組合。 28_如請求項26之組合物，其中該微泡係安置於醫藥學上可 接受之媒劑中。 29.如請求項26之組合物，其中該活性劑核酸包含胰島素基 因0 30.如明求項26之組合物，其中該活性劑核酸包含核酸載 體，該核酸載體包含受該啟動子控制之己醣激酶基因。 31·如請求項26之組合物，其中該活性劑核酸包含核酸載 體，該核酸載體包含受該啟動子控制之Neur〇D基因。 32.如請求項26之組合物，其中該預組裝之脂質體_核酸複合 物月曰質體包含1，2-二棕櫚醯基_sn_甘油_3_磷脂醯膽驗及 1,2-二棕櫚醯基_sn_甘油_3 _磷脂醯乙醇胺甘油與質體混 合0 33. 如請求項26之組合物，其進一步包含塗層。 34. 如請求項26之組合物，其進一步包含一或多個胰島素反 應性調節基因操作性連接至胰島素啟動子區，該一或多 個胰島素反應性調節基因係選自NeuroD、ngn3、 144673.doc 201029669 GLPl、PDX1、Mafa、β細胞調節素、Nkx2 2、Nkx6」、 PAX4、Isll、細胞週期素D2(及細胞週期素家族之其他 成員）、CDK4(及細胞週期素依賴性激酶家族之其他成 員）及針對細胞週期素依賴性激酶抑制因子（諸如pl6及 INK4家族之其他成員，或p27及CIp/KIp家族之其他成 員）之 siRNA。 3 5. —種載體，其包含受啟動子控制之己醣激酶基因，該啟 動子包含一或多個胰島素反應性調節基因操作性連接至 胰島素啟動子區，該胰島素啟動子區包含胰島素啟動子 之基因組片段，該胰島素啟動子之基因組片段包含胰島 素基因之5'非轉譯區、外顯子丨、内含子丨及外顯子 36. 如請求項35之载體，其中該己醣激酶基因包含包含受該 啟動子控制之NeuroD基因的核酸載體。 37. 如明求項35之載體，其中該己醣激酶基因包含包含受該 啟動子控制之GLP-1(7-37)基因的核酸載體。 38. 如叫求項35之载體，其中該己聽激酶基因包含包含受該 啟動子控制之細胞週期素D2基因的核酸載體。 39. 如請求項35之載體，其中該預組裝之脂質體_核酸複合物 月曰質體包含1,2-二棕櫚醯基_sn_甘油_3_磷脂醯膽鹼及丨，^ 二棕櫚醯基-sn-甘油·3-磷脂醯乙醇胺甘油與質體混合。 4〇·如請求項35之載體，其進一步包含一或多個騰島素反應 性調節基因操作性連接至該啟動子區，該一或多個胰島 素反應性調節基因係選自NeuroD、ngn3、glpi、 PDX1、Mafa、β細胞調節素、Nkx2_2、Nkx6.1、ΡΑχ4、 144673.doc 201029669 Isll、細胞週期素D2(及細胞週期素家族之其他成員）、 CDK4(及細胞週期素依賴性激酶家族之其他成員）及針對 細胞週期素依賴性激酶抑制因子（諸如p丨6及INK4家族之 其他成員，或P27及CIP/KIP家族之其他成員）之siRNA。 41. 一種藉由以下方法處理而具胰島素反應性之細胞，該方 法包含： 向細胞中注入預組裝之脂質體_核酸微泡複合物，其中 該預組裝之脂質體-核酸複合物包含受胰島素啟動子控制 之NeuroD基因，其包含一或多個胰島素反應性調節基因 操作性連接至胰島素啟動子區，該胰島素啟動子區包含 胰島素啟動子之基因組片段，該胰島素啟動子之基因組 片段包含胰島素基因之5,非轉譯區、外顯子丨、内含子i 及外顯子2，其中在該胰臟中之靶位點處破裂該微泡， 將該核酸遞送至胰臟細胞内該超音波破裂之位置，其中 含有該核酸之細胞回應高血糖含量而表現胰島素。 42.如請求項41之細胞，其進一步包含一或多個胰島素反應 性調節基因操作性連接至可調節之胰島素啟動子區該 胰島素啟動子區包含NeuroD基因上游之胰島素起始位點 上游區域的50個連續鹼基。 43·如請求項41之細胞，其進一步包含一或多個選自—或多 個操作性連接至胰島素啟動子區之騰島素反應性調節基 因的基因，該一或多個胰島素反應性調節基因係選自 ngn3、GLP1、PDX1、Mafa、β 細胞調節素、Nkx2 2、 Nkx6.1、PAX4、Isll、細胞週期素D2(及細胞週期素家 144673.doc 201029669 族之其他成員）、CDK4(及細胞週期素依賴性激酶家族之 其他成員）及針對細胞週期素依賴性激酶抑制因子（諸如 pl6及INK4家族之其他成員，或P27及CIP/KIP家族之其 他成員）之siRNA。

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