恶性血液病的治疗
相关申请
本申请要求2009年9月23日提交的的美国申请序列号61/245,196、2009年8月4日提交的61/231,278、2009年5月22日提交的61/180,768、2009年2月24日提交的61/155,057、2009年1月6日提交的61/142,845和2008年11月13日提交的61/114,434的权益,其通过引用的方式全部并入本文。
技术领域
本发明属于治疗学和药物化学领域。具体而言,本发明关于某些喹唑啉衍生物用于治疗恶性血液病和某些其它疾病的用途。
背景技术
通过3′-磷酸化磷酸肌醇的细胞信号转导已参与多种细胞过程,例如恶性转化、生长因子信号转导、炎症和免疫。负责产生这些磷酸化信号转导产物的酶-磷脂酰肌醇3-激酶(PI 3-激酶;PI3K)被最初确认为与病毒癌蛋白和生长因子受体酪氨酸激酶有关的活性,其使磷脂酰肌醇(PI)及其磷酸化衍生物在肌醇环的3′-羟基处磷酸化。
认为PI 3-激酶活化参与包括细胞生长、分化和凋亡的各种细胞应答。
PI 3-激酶的最初纯化和分子克隆显示它是由p85和p110亚基组成的二聚体。已经鉴定了4类完全不同的I类PI3K,指定为PI3Kα、β、δ和γ,各由不同的110kDa催化亚基和调节亚基组成。更具体而言,催化亚基中的三个,即p110α、p110β和p110δ,各与相同的调节亚基p85相互作用;而p110γ与不同的调节亚基p101相互作用。这些PI3K中的每一个在人细胞和组织中的表达方式也是不同的。
Chantry等人,J Biol Chem,272:19236-41(1997)描述了PI 3-激酶p110δ同种型的鉴定。观察到人p110δ同种型以组织限制性方式被表达。它在淋巴细胞和淋巴组织中以高水平被表达,表明该蛋白质可能在免疫***的PI 3-激酶介导的信号转导中起作用。PI3K的p110β同种型也在某些癌症中的PI3K介导的信号转导中起作用。
存在治疗与癌症、炎性疾病和自身免疫病相关的PI3K介导的疾病的需要。
概述
本发明提供一类喹唑啉酮类化合物和使用这些化合物治疗癌症、炎症和自身免疫病的方法。具体而言,癌症是用本文的方法治疗的恶性血液病,例如白血病和淋巴瘤。还提供了在需要其的患者中与其它治疗性治疗组合使用喹唑啉酮化合物的方法。
一个方面,本发明提供化合物在制备用于治疗受试者体内疾病的药物的用途,其中所述疾病是癌症或自身免疫病;其中所述化合物是式A的化合物,
其中R是H、卤素或C1-C6烷基;R′是C1-C6烷基;或其可药用盐;和任选地可药用赋形剂。
在一个实施方案中,化合物主要是S-对映体。
在一些前述实施方案中,R是氟(F)并且与喹唑啉环的5或6位连接。
在一些前述实施方案中,R是H或F;R′是甲基、乙基或丙基。
在一些实施方案中,化合物是
在一些实施方案中,化合物是
在一些前述实施方案中,所述自身免疫病是变应性鼻炎、哮喘、COPD或类风湿性关节炎。
在一些前述实施方案中,所述疾病是癌症。
在一些前述实施方案中,所述癌症是恶性血液病。
在一些前述实施方案中,所述恶性血液病是白血病。
在一些前述实施方案中,所述恶性血液病是淋巴瘤。
在一些前述实施方案中,所述恶性血液病选自急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、多发性骨髓瘤(MM)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡型淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom′smacroglobulinemia,WM)、B细胞淋巴瘤和弥漫型大B细胞性淋巴瘤(DLBCL)。
在一些前述实施方案中,所述癌症是急性淋巴细胞白血病(ALL)。
在一些前述实施方案中,所述癌症是急性髓性白血病(AML)。
在一些前述实施方案中,所述癌症是慢性淋巴细胞白血病(CLL)。
在一些前述实施方案中,所述癌症是多发性骨髓瘤(MM)。
在一些前述实施方案中,所述癌症是B细胞淋巴瘤。
在一些前述实施方案中,所述癌症是弥漫型大B细胞性淋巴瘤(DLBCL)。
在一些前述实施方案中,所述癌症是B细胞或T细胞ALL。
在一些前述实施方案中,所述癌症是霍奇金淋巴瘤。
在一些前述实施方案中,所述癌症是乳癌、肺癌、结肠癌、***癌或卵巢癌。
在一些前述实施方案中,受试者对化学疗法治疗是难治的,或者用化学疗法治疗后复发。
在一些前述实施方案中,制备化合物用于与至少一种另外的治疗剂一起施用。
在一些前述实施方案中,另外的治疗剂是蛋白酶体抑制剂。
在一些前述实施方案中,将另外的治疗剂与式A化合物组合。
在一些前述实施方案中,另外的治疗剂选自硼替佐米(bortezomib)卡非佐米(carfilzomib,PR-171)、PR-047、双硫仑、乳胞素(lactacystin)、PS-519、依波尼霉素(eponemycin)、环氧霉素(epoxomycin)、阿克拉霉素、CEP-1612、MG-132、CVT 63417、PS-341、乙烯砜三肽抑制剂、利托那韦、PI-083、(+/-)7methylomuralide、(-)-7-methylomuralide。
在一些前述实施方案中,另外的治疗剂是硼替佐米。
在一些前述实施方案中,制备化合物用于与至少两种药物的至少一组一起施用,其中所述药物组选自a-q,
a)CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、***);
b)R CHOP(利妥希玛CHOP);
c)hyperCVAD(超分割环磷酰胺、长春新碱、阿霉素、***、甲氨蝶呤、阿糖胞苷);
d)R-hyperCVAD(利妥希玛-hyperCVAD);
e)FCM(氟达拉滨、环磷酰胺、米托蒽醌);
f)R-FCM(利妥希玛、氟达拉滨、环磷酰胺、米托蒽醌);
g)硼替佐米和利妥希玛;
h)坦罗莫司(temsirolimus)和利妥希玛;
i)坦罗莫司和
j)碘-131托西莫单抗和CHOP;
k)CVP(环磷酰胺、长春新碱、***);
l)R-CVP(利妥希玛-CVP);
m)ICE(异环磷酰胺、卡铂、依托泊苷);
n)R-ICE(利妥希玛-ICE);
o)FCR(氟达拉滨、环磷酰胺、利妥希玛);
p)FR(氟达拉滨、利妥希玛);和
q)D.T.PACE(***、沙立度胺、顺铂、环磷酰胺、依托泊苷)。
在一些前述实施方案中,以包含式A化合物和至少一种可药用赋形剂的药物组合物提供式A化合物。
另一方面,本发明提供化合物在制备用于治疗受试者体内疾病的药物的用途,其中所述疾病选自多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、B细胞淋巴瘤、弥漫型大B细胞性淋巴瘤(DLBCL)、B细胞ALL、T细胞ALL、霍奇金淋巴瘤、乳腺和卵巢癌,其中所述化合物是式I″或式II″化合物:
在一些前述实施方案中,受试者对化学疗法治疗是难治的,或者用化学疗法治疗后复发。
在一些前述实施方案中,受试者患有组成性表达Akt磷酸化活性的癌症。
在一些前述实施方案中,受试者患有具有高p110δ活性和低p110α活性的癌症。
在一些前述实施方案中,化合物与硼替佐米组合使用。
另一方面,本发明提供化合物I″或II″在制备用于治疗血液癌症的药物的用途,其中制备药物用于与硼替佐米或卡非佐米一起施用。
在一些前述实施方案中,从施用化合物开始后至少12小时期间化合物保持高于在嗜碱性粒细胞中PI3Kδ活化的EC50水平并且低于PI3Kγ活化的EC50水平的平均血液浓度。
在一些前述实施方案中,从施用化合物开始后至少12小时期间化合物保持100nM至1100nM的平均血浆浓度。
在一些前述实施方案中,受试者对标准化学疗法治疗抵抗。
在一些前述实施方案中,受试者具有至少一个***肿大。
在一些前述实施方案中,受试者对至少两种标准或具有至少两种现有化学疗法治疗的实验性化学疗法治疗是难治的。
在一些前述实施方案中,各个化学疗法治疗选自氟达拉滨、烷化剂、利妥希玛、阿仑单抗(alemtuzumab)和上面列出的a-q的治疗。
附图简述
图1显示使用LB细胞,多发性骨髓瘤(MM)细胞生长与变化浓度的细胞因子IGF-I和IL-6与化合物I组合的函数关系简图。
图2显示多发性骨髓瘤(MM)细胞的细胞生长与变化浓度的化合物I和骨髓基质细胞(BMSC)存在或不存在下48小时后的函数关系简图。
图3显示慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞凋亡与变化浓度的式I化合物的函数关系简图。
图4显示在几种不同急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞系中化合物I对细胞存活率、Akt(Ser473)磷酸化的减少和胱天蛋白酶3活化影响的简表。
图5显示化合物I对急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞系的细胞周期影响的简表。
图6显示变化浓度的化合物I在48小时和72小时对乳腺癌T47D和HS-578T细胞系中细胞生长影响的简图。
图7显示变化浓度的化合物I在48小时和72小时对卵巢IGROV-I和OVCAR-3细胞系中细胞生长影响的简图。
图8显示化合物I对许多白血病和淋巴瘤细胞系中的Akt磷酸化影响的表。
图9显示存在或不存在化合物I对各种造血癌症细胞系中Akt和pAkt影响的SDS-PAGE图片和显示,说明化合物I抑制Akt磷酸化。
图10显示乳腺癌细胞系中凋亡和活细胞群与变化浓度的式I化合物的函数关系的简图,证明化合物诱导凋亡。
图11显示健康人受试者口服50、100和200mg剂量的所述化合物后12小时内血液中化合物I的浓度。
图12显示用化合物I治疗28天(1个周期)后诊断有套细胞淋巴瘤的人患者中损伤区域与治疗前损伤区域的比较。
图13显示用式I化合物治疗28天(1个周期)后4周时间患者血液中的ALC(绝对淋巴细胞计数)。
图14显示与采用相同给药方案或用100BID化合物I给药在第7天(D7)正常健康志愿者血液中的浓度相比,在第28天施用(50mg BID)后6小时患有和未患有套细胞淋巴瘤(MCL)的患者血液中化合物I浓度。
图15显示PI3K同种型在一组淋巴瘤和白血病细胞系中的表达。
图16A显示暴露于化合物I的白血病细胞系中细胞存活率和凋亡数据。在图16B中膜联蛋白染色表明经处理细胞中凋亡增加。
图17A-D显示在CLL患者细胞中不同PI3K同种型表达的PAGE结果。
图18显示在化合物I存在下(A)胱天蛋白酶3和(B)PARP裂解的诱导。
图19显示来自不良预后患者的慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞由暴露于化合物I引起的凋亡增加,证明化合物I对耐药患者有效。
图20显示来自难治/复发患者的慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞由暴露于式I化合物引起的凋亡增加。
图21显示不存在或存在0.1,1.0,10μM化合物I下磷酸Akt产生的结果。
图22显示涉及嗜碱性粒细胞中PI3K信号转导的流式细胞术结果,证明与没有刺激(A)相比(B)抗FCεRl或(C)fMLP增加了CD63表达。
图23显示嗜碱性粒细胞中由化合物I引起的PI3K抑制的抑制,并且证明化合物I对p110δ通路诱导的CD63表达的抑制尤其有效,而且在微摩尔浓度下对抑制p110γ通路诱导的表达有效。
图24显示(A)在健康志愿者中以不同剂量单剂量施用化合物I的药代动力学数据,(B)在12小时期间维持有效剂量的药代动力学数据。
图25显示不同剂量的化合物I对(A)葡萄糖和(B)胰岛素水平的影响,表现出很小的脱靶活性。
图26A显示在一组DLBCL细胞系中PI3K同种型的表达。
图26B显示在存在或不存在化合物I下pAkt在DLBCL细胞系中的SDS-PAGE图像。
图27显示在SDS-PAGE中,10μM浓度的化合物I对ALL细胞系中Akt和S6磷酸化的影响。
图28显示用系列化合物I稀释液处理后Akt、S6和GS K-3β磷酸化的剂量依赖性下降。
图29显示在cFLIP的下调、胱天蛋白酶3裂解和PARP裂解中化合物I对ALL细胞系的剂量依赖性作用。
图30显示p110δ在A)MM细胞系和B)患者MM细胞;和C)MM.1S和LB细胞中的表达。
图31A显示用p110δsiRNA(Si)或对照siRNA(模拟)转染的LB和INA-6细胞中p110δ的表达。
图31B显示用p110δsiRNA(Si)或对照siRNA(模拟)转染后INA-6细胞生长的曲线。
图31C显示用或不用化合物I培养48小时存活细胞%。
图31D显示用化合物I以0至20μM的浓度培养48小时后存活MM细胞%。
图31E显示用化合物I以不同浓度培养72小时后健康供体的存活外周血单核细胞%。
图31F显示用化合物I(0-5μM)培养120小时INA-6细胞裂解物的免疫印迹结果。
图32显示A)用化合物I或LY294002培养INA-6细胞12小时;B)用不同浓度的化合物I培养INA-6和MM.1S细胞6小时;C)用化合物I培养LB和INA-6细胞0-6小时后免疫印迹AKT和ERK表达图像。
图33A显示用化合物I处理6小时的INA-6和LB MM细胞以及LC3积累的荧光和透射电镜图;箭头指自噬体。
图33B显示用5μM化合物1或血清饥饿处理6小时的INA-6细胞的荧光显微图。
图33C显示用或不用化合物I和3-MA(3-甲基腺嘌呤,已知的自吞噬抑制剂)的INA-6细胞LC3和beclin-1蛋白水平的免疫印迹。
图33D显示用高达100μM 3-MA处理24小时后p110δ阳性LB细胞的%生长。
图34显示在不同量的IL-6或IGF-I存在或不存在下用0、5和10μM化合物I共同培养的A)LB或B)INA-6细胞的生长抑制水平;图例:对照培养基(■);化合物I 5.0μM或10μM(□)。
图34C和34D显示在BMSC存在下MM细胞生长抑制。34C的图例:仅对照培养基(□)、化合物I 5.0μM5.0μM和10μM(■)。
图34E显示从用化合物I或对照培养基培养48小时的BMSC得到的培养上清液中的IL-6的免疫印迹。
图34F显示有或没有BMSC,用化合物I处理的INA-6细胞中的AKT和ERK表达的免疫印迹图。
图34G显示用化合物I培养48小时后两个不同患者体内的%BMSC细胞生长。
图35A显示用0、1和10μM化合物I培养8小时的HuVEC(人脐静脉内皮细胞)的显微图和估计的微管形成。
图35B显示总结用化合物I处理的HuVEC细胞中内皮细胞管形成的柱形图。
图35C显示HuVEC的%细胞生长与增加浓度的化合物I的函数关系图。
图35D显示用化合物I培养8小时后减少了HuVEC细胞裂解物中Akt和ERK表达。
图36A绘出了用0、10mg/kg或30mg/kg化合物II处理的具有人MM异种移植物的SCID小鼠体内肿瘤体积与时间的函数关系图,说明对人异种移植肿瘤具有强的体内活性。
图36B显示比较来自用化合物II处理12天的小鼠上的人MM异种移植物的肿瘤与对照小鼠的照片。
图36C显示用0、10和30mg/kg化合物II处理的具有人MM异种移植物的SCID小鼠随时间的存活率。
图36D显示从用化合物II处理的小鼠获得的肿瘤与对照比较的免疫组织化学分析的图像;其中CD31和P-AKT阳性细胞是深棕色的。
图36E显示检测从用化合物II处理的小鼠获得的肿瘤组织中的PDK-1和AKT水平与对照比较的免疫印迹。
图36F显示如ELISA所测定的,用0、10mg/kg或30mg/kg化合物II处理4周的小鼠中测得的sIL6R水平图。
图37A显示用化合物I与不同量的硼替佐米(B)处理后存活LB或INA-6MM细胞的%;图例:培养基(■),化合物I 1.25μM2.5μM或5.0μM(□)。
图37B显示比较用化合物I和/或硼替佐米处理6小时的INA-6细胞中AKT磷酸化水平的免疫印迹。
图38显示(A)一组套细胞淋巴瘤细胞系中PI3K同种型表达;(B)暴露于化合物I后pAkt、Akt、pS6和S6表达的下降;和(C)暴露于化合物I后PARP和胱天蛋白酶-3的裂解以剂量依赖方式增加。
图39显示(A)在不同量的化合物I中原发性MCL细胞中组成型PI3K信号转导的量;(B)含有存活因子和不同量的化合物I的MCL细胞系中pAkt产生的下降。
图40显示(A)用化合物I治疗前和(B)用化合物I治疗1个周期后患有CLL的患者体内肿大***病的计算机化断层显像腋下图像。
具体实施方式
除非另有说明,否则本文所用的所有术语、表示法和其它科学术语或专门用语意在具有本发明所属领域中的技术人员所通常理解的含义。在一些情况中,为了清楚和/或便于参考,本文对具有通常理解的含义的术语进行了定义,本文对这种定义的包括不一定理解为表示对本领域通常所理解的实质性差别。本领域技术人员使用常规方法学能很好地理解和一般地使用本文描述或引用的许多技术和程序。如果合适,除非另有说明,否则根据制造商规定的方案和/或参数一般地进行包括市售试剂盒和试剂的使用的程序。
本文给出的一般方法的讨论只是用于说明目的。其它备选的方法和实施方案对于本领域技术人员在阅读该公开后将是显而易见的。
除非另有说明,否则与连词“或”连接的一组项目不应被当作需要在该组中相互排他地,相反应被当作“和/或”。尽管本发明的项目、要素或成分可能以单数形式被描述或要求保护,但是除非明确说明限制在单数,否则复数也被包括在本发明的范围内。
本发明提供与治疗癌症和炎性疾病的新治疗策略有关的方法。一方面,本发明提供治疗受试者体内的癌症或自身免疫病的方法,包括给所述受试者施用式A化合物
其中R是H、卤素或C1-C6烷基;R′是C1-C6烷基;或其可药用盐;和任选地可药用赋形剂。
在一个具体实施方案中,卤素是F;R′是甲基、乙基或丙基。
在一个具体实施方案中,R与喹唑啉环的5位连接,具有结构
在一个具体实施方案中,R与喹唑啉环的6位连接,具有结构
除非另有说明,否则本文所用的术语“化合物”指式A化合物,例如化合物I、化合物II或对映体,例如I″或II″,或对映体混合物。
“式I化合物”或“化合物I”指化合物5-氟-3-苯基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-丙基]-3H-喹唑啉-4-酮,式I的结构:
本文显示了化合物I的S-对映体,指定为I″:
(I″,S-对映体)。
“式II化合物”或“化合物II”指化合物2-(1-(9H-嘌呤-6-基氨基)乙基)-6-氟-3-苯基喹唑啉-4(3H)-酮,式II的结构:
本文显示了化合物II的S-对映体,指定为II″:
(II″,S-对映体)。
在一个实施方案中,式A化合物是式I的化合物。在另一实施方案中,式A化合物是式II的化合物。在某些实施方案中,化合物是R-和S-对映体的外消旋混合物。在某些实施方案中,化合物作为对映体的混合物被使用,并且经常富含S-对映体。在一些实施方案中,化合物主要是S-对映体。在一些实施方案中,在本文所述的方法中使用的式A化合物是至少80%S-对映体。在某些实施方案中,化合物主要由S-对映体组成,其中化合物包含至少66-95%或85-99%S-对映体。在一些实施方案中,化合物具有至少90%或至少95%S-对映体的对映体过量(e.e.)。在一些实施方案中,化合物具有至少98%或至少99%的S-对映体过量(e.e.)。在某些实施方案中,化合物包含至少95%S-对映体。在实施例部分给出的细胞和患者实验中,所用的化合物I的样品是超过95%S-对映体。
在具体实施方案中,在本文所述的方法中使用的式I或II化合物是至少80%S-对映体。在某些实施方案中,式I或II化合物主要由S-对映体组成,其中化合物包含至少66-95%或85-99%S-对映体。在一些实施方案中,式I或II化合物具有至少90%或至少95%S-对映体的对映体过量(e.e.)。在一些实施方案中,式I或II化合物具有至少98%或至少99%的S-对映体过量(e.e.)。在某些实施方案中,式I或II化合物包含至少95%S-对映体。在实施例部分给出的细胞和患者实验中,所用的化合物I的样品是超过95%S-对映体。
在一个具体实施方案中,化合物相对于其它PI3K同种型选择性地抑制PI3K p110δ。
在一个具体实施方案中,自身免疫病是变应性鼻炎、哮喘、COPD或类风湿性关节炎。
在一个具体实施方案中,癌症是恶性血液病和/或实体瘤。在另一具体实施方案中,恶性血液病是白血病或淋巴瘤。
在一些实施方案中,淋巴瘤是成熟(外周)B细胞癌。在具体实施方案中,成熟B细胞癌选自B细胞慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤;B细胞幼淋巴细胞白血病;淋巴浆细胞淋巴瘤;边缘区淋巴瘤,例如脾边缘区B细胞淋巴瘤(+/-绒毛淋巴细胞)、结内边缘区淋巴瘤(+/-单核细胞样B细胞)和粘膜相关淋巴组织(MALT)型结外边缘区B细胞淋巴瘤;多毛细胞白血病;浆细胞骨髓瘤/浆细胞瘤;滤泡中心滤泡型淋巴瘤;套细胞淋巴瘤;弥漫型大B细胞性淋巴瘤(包括纵隔大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤和原发性渗出性淋巴瘤);伯基特氏淋巴瘤/伯基特氏细胞白血病。
在一些实施方案中,淋巴瘤选自多发性骨髓瘤(MM)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡型淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)、B细胞淋巴瘤和弥漫型大B细胞性淋巴瘤(DLBCL)。
在另一具体实施方案中,白血病选自急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)。急性淋巴细胞白血病也被称为急性淋巴母细胞白血病并且本文可互换使用。两个术语均描述从骨髓中的白细胞——淋巴细胞开始的一类癌症。
在一些实施方案中,非霍奇金淋巴瘤(NHL)属于侵袭性NHL或惰性NHL这两类中的一类。侵袭性NHL快速生长并且可较快地导致患者死亡。未治疗的存活可被测量为数月或甚至数周。侵袭性NHL的实例包括B细胞癌、弥漫型大B细胞性淋巴瘤、T/NK细胞癌、间变性大细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、前体B淋巴细胞白血病/淋巴瘤、前体T淋巴细胞白血病/淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、成熟T细胞淋巴瘤/白血病(HTLV1+)、原发性CNS淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、多形性移植后淋巴增生疾病(PTLD)、AIDS-相关淋巴瘤、真性组织细胞性淋巴瘤和母细胞性NK细胞淋巴瘤。侵袭性NHL的最常见类型是弥漫性大细胞淋巴瘤。
惰性NHL缓慢生长并且对于大多数患者直到疾病发展到晚期时才会表现出明显的症状。患有惰性NHL的未治疗的存活可被测量为数年。非限制性实例包括滤泡型淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤(例如结外边缘区淋巴瘤(也称为粘膜相关淋巴组织-MALT淋巴瘤)、结内边缘区淋巴瘤(单核细胞样B细胞淋巴瘤)、脾边缘区淋巴瘤)和淋巴浆细胞淋巴瘤(瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)。
在一些情况中,可发生组织形态的转变,例如患者体内的惰性NHL可转化为侵袭性NHL。
在一些实施方案中,本发明提供治疗患有侵袭性NHL或惰性NHL的患者的方法。
在一些实施方案中,本发明提供治疗患有选自以下的疾病的患者的方法:套细胞淋巴瘤(MCL)、弥漫型大B细胞性淋巴瘤(DLBCL)、滤泡型淋巴瘤(FL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、多发性骨髓瘤(MM)和边缘区淋巴瘤。
在一些实施方案中,给患有复发或难治疾病的患者施用本发明的方法。
在另一实施方案中,癌症是乳腺、肺、结肠或***癌。
在一个具体实施方案中,癌症或自身免疫病与没患癌症或自身免疫病的受试者体内的PI3K活性相比异常的PI3K活性有关。
在一个具体实施方案中,优选的受试者对化学疗法治疗是难治的,或者用化学疗法治疗后复发。在一个备选实施方案中,受试者是初治患者(denovo patient)。
在一个具体实施方案中,方法包括降低所述患者体内的PI3Kδ活性的水平。
在一个具体实施方案中,受试者是人受试者。
经历用已知治疗剂治疗的受试者可能经历对治疗的抵抗。例如,尽管硼替佐米是FDA批准用于复发/难治、复发和新诊断的MM,但是一些患者没有响应而其它患者获得对硼替佐米的抵抗。在一些实施方案中,本文所述的喹唑啉酮化合物协同增加已知治疗剂的疗效。在一些实施方案中,本文所述的化合物可增加本文所述的任一治疗剂的疗效。在更具体的实施方案中,本文所述的化合物协同增加蛋白酶体抑制剂的疗效。在一些前述实施方案中,受试者对化学疗法治疗抵抗。在一些前述实施方案中,受试者对蛋白酶体抑制剂抵抗。在一些前述实施方案中,受试者对硼替佐米或卡非佐米抵抗。在一个实例中,本文所述的化合物协同增加硼替佐米诱导的MM细胞毒性。在不受理论束缚的情况下,在一些实施方案中,本文所述的化合物抑制硼替佐米诱导的AKT磷酸化。在一些实施方案中,本文所述的方法被用于克服对蛋白酶体抑制剂治疗的抵抗。在一些实施方案中,本发明提供治疗对治疗剂抵抗或已形成抵抗的受试者的方法。
尽管不受理论束缚,式A化合物与常规治疗之间的协同效应可归因于本发明化合物诱导肿瘤细胞动员到外周循环的能力。诱导肿瘤细胞的外周循环提高了常规治疗起作用的能力并且更有效地中和肿瘤。已经在CLL患者中证明了这种协同作用。
因此,方法包括除了给患者施用式A化合物外,还施用被选择以治疗所述患者体内所述癌症或自身免疫病的治疗有效量的至少一种另外的治疗剂和/或治疗方法。如本文所用的,“治疗剂”可指一种或多种化合物。治疗剂可以是标准或实验化学治疗药物。治疗剂可包括多于一种化学治疗药物的组合。本文a-q列出了典型的化学治疗药物组合。可根据被治疗的疾病类型选择具体治疗剂。在后来章节中描述了用于具体血液疾病的常规化学疗法治疗的非限制性实例。在一个具体实施方案中,本发明提供用硼替佐米和式A化合物(例如,式I、II、I”或II”)治疗造血癌症患者例如CLL患者的方法,其中组合提供协同效应。
在一个具体实施方案中,所述治疗剂选自以下:硼替佐米卡非佐米(PR-171)、PR-047、双硫仑、乳胞素、PS-519、依波尼霉素、环氧霉素、阿克拉霉素、CEP-1612、MG-132、CVT 63417、PS-341、乙烯砜三肽抑制剂、利托那韦、PI-083、(+/-)-7-methylomuralide、(-)-7-methylomuralide、哌立福辛(perifosine)、利妥希玛、柠檬酸西地那非(万艾)、CC-5103、沙立度胺、依帕珠单抗((hLL2-抗-CD22人源化抗体)、辛伐他汀、enzastaurin、Campath-1H、***、DT PACE、奥利默森(oblimersen)、抗瘤酮A10(antineoplaston A10)、抗瘤酮AS2-1、阿仑单抗、beta alethine、环磷酰胺、盐酸阿霉素、聚乙二醇化脂质体盐酸阿霉素、***、***龙、克拉屈滨、硫酸长春新碱、氟达拉滨、非格司亭、美法仑、重组干扰素α、卡氮芥、顺铂、环磷酰胺、阿糖胞苷、依托泊苷、美法仑、多拉司他汀10、铟In 111单克隆抗体MN-14、钇Y 90人源化依帕珠单抗、抗胸腺细胞球蛋白、白消安、环孢菌素、甲氨蝶呤、麦考酚酸吗乙酯、治疗性同种异型淋巴细胞、钇Y 90替伊莫单抗、西罗莫司、他克莫司、卡铂、噻替派、紫杉醇、阿地白介素、重组干扰素α、多西他赛、异环磷酰胺、美司钠、重组白细胞介素-12、重组白细胞介素-11、Bcl-2家族蛋白抑制剂ABT-263、地尼白介素2、tanespimycin、依维莫司、聚乙二醇化非格司亭、vorinostat、alvocidib、重组flt3配体、重组人血小板生成素、白介素活化的杀伤细胞、氨磷汀三水合物、氨基喜树碱、盐酸依立替康、醋酸卡泊芬净、氯法拉滨、阿法依泊汀、奈拉滨、喷司他丁、沙格司亭、双酒石酸长春瑞滨、WT-1类似物肽疫苗、WTl 126-134肽疫苗、芬维A胺、伊沙匹隆、奥沙利铂、单克隆抗体CD19、单克隆抗体CD20、ω-3脂肪酸、盐酸米托蒽醌、醋酸奥曲肽、托西莫单抗和碘I 131托西莫单抗、莫特沙芬钆、三氧化二砷、替吡法尼、自体人肿瘤来源的HSPPC-96、veltuzumab、苔藓抑素1、抗CD20单克隆抗体、苯丁酸氮芥、喷司他丁、鲁昔单抗、阿泊珠单抗(apolizumab)、抗CD40和Ofatumumab或其组合。治疗剂的组合在目前和实验治疗中被使用,例如上面a-q列出的那些组合。
在一些实施方案中,治疗剂优选蛋白酶体抑制剂。在一些实施方案中,所述方法包括施用化合物与蛋白酶体抑制剂。蛋白酶体抑制剂包括天然和合成化合物。蛋白酶体抑制剂的非限制性实例包括硼替佐米([(1R)-3-甲基-1-({(2S)-3-苯基-2-[(吡嗪-2-基羰基)氨基]丙酰基}氨基)丁基]硼酸),其由Millennium pharmaceutical以销售;卡非佐米(PR-171)和口服类似物PR-047,它们均由Proteolix,Inc开发。蛋白酶体抑制剂的其它实例包括双硫仑;乳胞素;合成化合物例如PS-519、依波尼霉素、环氧霉素和阿克拉霉素;钙蛋白酶抑制剂,例如CEP-1612、MG-132、CVT 63417、PS-341;乙烯砜三肽抑制剂;利托那韦;PI-083;(+/-)-7-methylomuralide和(-)-7-methylomuralide。在具体的实施方案中,式A化合物与硼替佐米或卡非佐米组合施用。在更具体的实施方案中,式I化合物与硼替佐米或卡非佐米组合施用。在其它具体的实施方案中,式II化合物与硼替佐米或卡非佐米组合施用。
一个方面,本发明提供包含式I化合物的药物组合物:
或其可药用盐;和至少一种可药用赋形剂。在一个实施方案中,组合物富含S-对映体。
另一方面,本发明提供包含式II化合物的药物组合物:
或其可药用盐;和至少一种可药用赋形剂。在一个实施方案中,组合物富含S-对映体。
一个方面,本发明提供治疗患者体内的多发性骨髓瘤(MM)的方法,包括施用式A化合物与另外治疗剂的组合。在一些实施方案中,式A是化合物I或II。在具体实施方案中,式A是化合物I″。在其它实施方案中,式A是化合物II″。在一些前述实施方案中,另外的治疗剂是蛋白酶体抑制剂。在具体实施方案中,另外治疗剂是硼替佐米。在一个具体实施方案中,治疗患者体内的多发性骨髓瘤的方法包括施用化合物I″与硼替佐米。在一个具体实施方案中,治疗患者体内的多发性骨髓瘤的方法包括施用化合物II″与硼替佐米。在一些前述实施方案中,化合物I″或II″具有至少60%对映体过量。在一些前述实施方案中,化合物I″或II″具有至少70%对映体过量。在一些前述实施方案中,化合物I″或II″具有至少80%对映体过量。在一些前述实施方案中,化合物I″或II″具有至少90%对映体过量。在一些前述实施方案中,化合物I″或II″具有至少95%对映体过量。在一些前述实施方案中,化合物I″或II″具有至少98%对映体过量。在一些前述实施方案中,化合物I″或II″具有至少99%对映体过量。
在一个具体实施方案中,将治疗剂的组合与式A化合物一起施用,其中所述组合选自
a)CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、***);
b)R-CHOP(利妥希玛CHOP);
c)hyperCVAD(超分割环磷酰胺、长春新碱、阿霉素、***、甲氨蝶呤、阿糖胞苷);
d)R-hyperCVAD(利妥希玛-hyperCVAD);
e)FCM(氟达拉滨、环磷酰胺、米托蒽醌);
f)R-FCM(利妥希玛、氟达拉滨、环磷酰胺、米托蒽醌);
g)硼替佐米和利妥希玛;
h)坦罗莫司和利妥希玛;
i)坦罗莫司和
j)碘-131托西莫单抗和CHOP;
k)CVP(环磷酰胺、长春新碱、***);
l)R-CVP(利妥希玛-CVP);
m)ICE(异环磷酰胺、卡铂、依托泊苷);
n)R-ICE(利妥希玛-ICE);
o)FCR(氟达拉滨、环磷酰胺、利妥希玛);
p)FR(氟达拉滨、利妥希玛);和
q)D.T.PACE(***、沙立度胺、顺铂、环磷酰胺、依托泊苷)。
在备选实施方案中,化合物与治疗方法组合使用,在一个具体实施方案中,治疗方法选自外周血干细胞移植、自体造血干细胞移植、自体骨髓移植、抗体治疗、生物治疗、酶抑制剂治疗、全身照射、干细胞输注、具有干细胞支持的骨髓消融、体外处理的外周血干细胞移植、脐带血移植、免疫酶技术、免疫组织化学染色法、药理学研究、低-LET钴-60γ射线治疗、博来霉素、常规外科手术、放射治疗、高剂量化学治疗和非骨髓根除同种异型造血干细胞移植。
在一个具体实施方案中,方法进一步包括从所述患者获得生物样品;和用选自以下的分析方法分析所述生物样品:血液化学分析、染色体易位分析、针活检、荧光原位杂交、实验室生物标记分析、免疫组织化学染色法、流式细胞术或其组合。
为了命名的目的,相应地对化合物的喹唑啉基和嘌呤基组分进行编号:
嘌呤喹唑啉
如本文所用的,术语“烷基”包括直链、支链和环状单价烃基和这些的组合,当它们未被取代时只含C和H。实例包括甲基、乙基、异丁基、环己基、环戊基乙基等。本文有时描述了每个这种基团中的碳原子的总数,例如当基团含最高达10个碳原子时,它可以以1-10C或C1-C10或C1-10来表示。
如本文所用的,“卤素”包括氟、氯、溴和碘。通常优选氟和氯。
如本文所用的,术语“选择性PI3Kδ抑制剂”或“选择性PI3Kβ抑制剂”等指与PI3K家族的至少另一种同工酶相比更有效地分别抑制PI3Kδ或PI3Kβ同工酶的化合物。选择性抑制剂也可以对PI3K的其它同工酶起作用,但是更高的浓度以达到对该其它同工酶同样程度的抑制。“选择性”还可被用来描述与相当化合物相比尤其抑制特定的PD-激酶的化合物。“选择性PI3Kδ抑制剂”化合物应理解为对于PI3Kδ的选择性比常规和一般定为PI3K抑制剂例如渥曼青霉素或LY294002的更大。同时,认为渥曼青霉素或LY294002是“非选择性PI3K抑制剂”。在某些实施方案中,选择性地负调节PI3Kδ表达或活性的任何类型的化合物可被用作本发明方法中的选择性PI3Kδ抑制剂。而且,选择性地负调节PI3Kδ表达或活性并且具有可接受的药理学特性的任何类型的化合物可被用作本发明治疗方法中的选择性PI3Kδ抑制剂。在不受理论束缚的情况下,用本发明化合物靶定p110δ抑制提供了治疗恶性血液病的新方法,因为该方法抑制组成型信号转导,从而导致肿瘤细胞的直接破坏。此外,在不受理论束缚的情况下,p110δ抑制抑制了对肿瘤细胞归巢、存活和增殖关键的微环境信号。
在一个备选实施方案中,选择性地负调节PI3Kβ表达或活性的任何类型的化合物可被用作本发明方法中的选择性PI3Kβ抑制剂。而且,选择性地负调节PI3Kβ表达或活性并且具有可接受的药理学特性的任何类型的化合物可被用作本发明治疗方法中的选择性PI3Kβ抑制剂。
如本文所用的“治疗”指抑制疾病,即阻止其发展;缓解疾病,即引起其消退;或改善疾病,即减小与疾病有关的至少一种症状的严重度。在一些实施方案中,“治疗”指预防疾病在易患该疾病但还没有被诊断为患有该疾病的动物中发生。“疾病”没有限制地被用来包括医学障碍、疾病、病情、症状等。
如本文所用的“自身免疫病”指组织损伤与对生物体自身组成部分的体液或细胞介导的应答有关的任何疾病组。
在另一个实施方案中,本发明包括抑制嗜碱性粒细胞和/或肥大细胞的功能,从而能治疗特征在于过度的或不期望的嗜碱性粒细胞和/或肥大细胞活性的疾病或障碍的方法。根据该方法,可以使用选择性抑制嗜碱性粒细胞和/或肥大细胞中的磷脂酰肌醇3-激酶δ(PI3Kδ)的表达或活性的本发明化合物。优选地,该方法以足以抑制嗜碱性粒细胞和/或肥大细胞的受激组胺释放的量使用PI3Kδ抑制剂。因此,这种化合物和其它PI3Kδ选择性抑制剂的使用可在治疗特征在于组胺释放的疾病,即过敏性疾病,包括例如慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、ARDS、肺气肿和相关疾病中具有价值。
本发明能够提供治疗如以下这样的疾病的方法:关节炎疾病,例如类风湿性关节炎、银屑病关节炎、单关节炎、骨关节炎、痛风性关节炎、脊椎炎;白塞病(Behcet disease);脓毒症、脓毒性休克、内毒素休克、革兰氏阴性脓毒症、革兰氏阳性脓毒症和中毒性休克综合征;由败血病继发的多器官损伤综合征、创伤或出血;眼部疾病,例如变应性结膜炎、春季结膜炎、葡萄膜炎和甲状腺相关眼病;嗜酸细胞肉芽肿;肺部或呼吸疾病例如哮喘、慢性支气管炎、变应性鼻炎、ARDS、慢性肺部炎性疾病(例如慢性阻塞性肺病)、硅肺病、肺结节病、胸膜炎、齿槽炎、血管炎、肺气肿、肺炎、支气管扩张和肺氧中毒;心肌、脑或四肢的再灌注损伤;纤维化例如囊性纤维化;瘢痕疙瘩形成或瘢痕组织形成;动脉粥样硬化;自身免疫病,例如***性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性甲状腺炎、多发性硬化、一些形式的糖尿病和雷诺综合症;移植排斥疾病例如移植物抗宿主病(GVHD)和同种异体抑制物排斥;慢性肾小球肾炎;炎性肠病例如慢性炎性肠病(CIBD)、克隆病、溃疡性结肠炎和坏死性小肠结肠炎;炎性皮肤病例如接触性皮炎、特应性皮炎、银屑病或荨麻疹;由于感染引起的发烧和肌痛;中枢或周围神经***炎性疾病例如脑膜炎、脑炎和由微小创伤引起的脑或脊髓损伤;干燥综合征;涉及白细胞渗出的疾病;酒精性肝炎;细菌性肺炎;抗原-抗体复合物介导的疾病;低血容量性休克;1型糖尿病;急性和迟发性超敏反应;由白细胞体液不调和转移引起的疾病状态;热伤;粒细胞输血相关综合征;和细胞因子诱导的毒性。
所述方法可在治疗易患或可能易患再灌注损伤的受试者中有用,再灌注损伤由再灌注后组织或器官经历一段时间缺血的情况导致的损伤。术语“缺血”指由动脉血流入阻塞导致的局部组织缺血。再灌注后的短暂缺血典型地导致嗜中性粒细胞活化和通过受影响区域的血管上皮的移行。活化的嗜中性粒细胞的积累于是导致活性氧代谢产物的产生,其损坏所涉及的组织或器官的成分。该“再灌注损伤”的现象通常与例如血管中风(包括全脑和局部缺血)、失血性休克、心肌缺血或梗死、器官移植和脑血管痉挛的疾病有关。为了说明,再灌注损伤发生在心脏旁路过程的终端或心脏停搏期间,此时心脏一旦不能接受血液就开始再灌注。期望PI3Kδ活性的抑制将导致这种情况中再灌注损伤的量减小。
在某些实施方案中,本发明提供治疗实体瘤的方法。在具体实施方案中,癌症是乳腺、肺、结肠或***癌。在某些实施方案中,本发明提供治疗与PI3Kβ介导的异常或不期望的细胞信号活性有关的实体瘤的方法。在某些实施方案中,实体瘤选自胰腺癌;膀胱癌;结肠直肠癌;乳腺癌,包括转移性乳腺癌;***癌,包括雄激素依赖的和雄激素独立的***癌;肾癌,包括例如转移性肾细胞癌;肝细胞癌;肺癌,包括例如非小细胞肺癌(NSCLC)、细支气管肺泡癌(BAC)和肺的腺癌;卵巢癌,包括例如进行性上皮或原发性腹膜癌;子***;胃癌;食道癌;头颈癌,包括例如头颈鳞状细胞癌;黑素瘤;神经内分泌癌,包括转移性神经内分泌瘤;脑瘤,包括例如神经胶质瘤、间变性少突胶质细胞瘤、成人多形性胶质母细胞瘤和成人间变性星形细胞瘤;骨癌;和软组织肉瘤。
已经发现P110δ的遗传消融导致限于免疫***的轻微表型。一般观察包括没有大体解剖或行为异常的能育生物。组织学检查显示大部分器官表现正常。B和T细胞中总的I类PI3K活性降低30-50%。此外,没有观察到对感染易感性的增加。而且,对造血***的影响包括正常的外周血细胞计数、脾和***中出现淋巴发育不全和缺乏生发中心、骨髓中B220+IgM+B细胞祖细胞数量减少、血清免疫球蛋白水平减小和胸腺中正常的T细胞发育。
P110δ的遗传消融影响骨髓和B细胞信号转导,这对瘤形成是重要的。特别地,髓样细胞中的酪氨酸激酶信号转导、发育、增殖和存活受到影响。B细胞功能受到的影响最大并且包括增殖、分化、凋亡和对B细胞存活因子(BCR、CD40、IL-4、趋化因子)的应答。因此,本发明包括治疗疾病状态的方法,所述疾病状态中这些髓样和B细胞功能中的一种或多种异常或是不期望的。
靶向分子水平p110α、p110β、p110δ、p110γ的pan PI3K抑制剂(hvPS34、mTOR、DNA-PK和其它)转而靶向所有组织。可能的临床适应症包括癌症,但临床不良事件包括癌症患者中的超高胰岛素血症。靶向细胞介导的炎症和癌细胞(其中可能的临床适应症包括癌症、类风湿性关节炎、哮喘、过敏症和COPD)的p110δ选择性抑制剂的优点是治疗被很好地耐受,并且避免了例如超高胰岛素血症的副作用。因此一方面,本发明提供治疗患有胰岛素抵抗或2型糖尿病的患者的癌症、类风湿性关节炎、哮喘、过敏症和COPD或用本发明化合物可治疗的其它疾病的方法。对于患有过度胰岛素疾病或趋势的需要这种治疗的患者,本发明化合物比pan-PI3K抑制剂尤其更有利。在某些实施方案中,优选式I或I″化合物,因为它提供治疗恶性血液病的治疗益处而没有不利地影响胰岛素信号转导。
在一个实施方案中,本发明涉及抑制PI3K p110δ的方法。在另一实施方案中,本发明涉及抑制PI3K p110β或p110γ的方法。
在某些实施方案中,本文所述的方法具有很小的或没有脱靶活性。特别地,方法中使用的式I化合物对包括实施例16的表3中总结的那些超过300个蛋白激酶显示很小的活性。在某些实施方案中,与包括施用pan-PI3K抑制剂的方法相比,本文所述的方法在癌症患者中没有或有极小的超高胰岛素血症效应。在某些实施方案中,本文所述的方法在靶向介导Akt磷酸化的细胞中有用,因为式A化合物抑制Akt磷酸化。在一个实施方案中,因此可通过选择与造血癌症例如淋巴瘤、白血病或多发性骨髓瘤相关的表现出升高的Akt磷酸化的患者,来选择适合于用本发明化合物治疗的患者。
本文的方法避免了脱靶倾向并且特征在于不利地导致受体革兰氏筛选,没有hERG抑制并且没有明显的P450抑制。
本发明方法的另一优点是不存在安全药理学研究中证明的不利的心血管、呼吸或中枢神经***影响。此外,大鼠和狗中28天的毒性研究证明高的治疗指数,例如NOAEL(无可观察到的副作用水平)>>10μM。这是化学物质的最高实验剂量,在此剂量下,暴露组和其适当对照之间毒理学作用的频率或严重度没有统计学或生物学显著增加。副作用定义为导致功能性损伤和/或病理损害的任何作用,它可影响整个生物的行为或者减小生物对另外挑战应答的能力。
在另一实施方案中,本发明方法在标准成套试验中无遗传毒性。
本发明的另一优点是与具有pan-PI3K抑制的化合物相比,对一种或多种PI3K同种型具有选择性的化合物产生改善的安全性质。在又一优点中,化合物I具有良好目标覆盖的有利的药动学性质,对葡萄糖或胰岛素水平无副作用并且在通常使用的治疗剂量以上的剂量下被正常健康志愿者很好地耐受。本发明的另一优点包括如本文实施例所证明的治疗宽范围恶性血液病的能力。
在某些实施方案中,本发明方法针对治疗癌症或自身免疫病。在某些实施方案中,癌症是恶性血液病。在具体实施方案中,恶性血液病选自急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多发性骨髓瘤(MM)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)。在某些实施方案中,非霍奇金淋巴瘤选自弥漫型大B细胞性淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)和淋巴浆细胞淋巴瘤。
许多恶性血液病中涉及到PI3K并且已经建立了与用化合物I治疗有关概念的临床前证据。下表总结了特定的恶性血液病和对原代患者细胞或疾病细胞系的作用方法。
此处提供的数据证明本发明化合物可用于治疗淋巴瘤和白血病。淋巴瘤和白血病通常选择性地表达p110的δ同种型,例如图15证明了p110δ在大部分淋巴细胞系中是普遍的,而通常观察不到p110α。而且,图16A中给出的数据说明来自6个不同白血病细胞系的细胞培养物对化合物I敏感,并且受5-10微摩尔浓度的该化合物强烈地影响。图8和9支持化合物I在几种细胞系中减少Akt(Ser473)产生。
例如,为了信号转导目的,CLL主要产生p110δ和较小程度的产生p110γ,因此期望抑制p110δ和/或p110γ的化合物对这些细胞表现出选择性细胞毒性。例如在实施例3中,显示了化合物I在CLL细胞中的剂量依赖性细胞毒性(图3),包括取自不良预后患者的细胞(图19)和取自对其它CLL治疗显示抵抗的患者的细胞(图20)。此外,实施例13和图13证明以50mg BID的速度给CLL患者施用化合物I达28天周期提供了显著的疗效。观察到淋巴细胞中ALC百分比浓度下降。因此一个方面,本发明提供使用式A化合物治疗具有抗药性CLL的CLL患者的方法。另一方面。实施例17表明主要依赖p110α进行信号转导的成纤维细胞细胞系对化合物I不敏感。因此一个方面,患者选择可包括排除患有主要依赖p110α进行信号转导的癌症的患者。
式A化合物还可用于治疗淋巴瘤,包括B细胞和T细胞淋巴瘤。图4中的数据证明6个不同ALL细胞系对化合物I敏感,化合物I引起所有6个细胞系中细胞存活率的显著下降。
图12和实施例12证明用50mg BID的化合物I治疗28天的套细胞淋巴瘤患者经历平均44%的肿瘤负荷减少。而且,图14证明28天周期结束时的MCL患者施用50mg剂量后经历与正常健康志愿者(NHV)中所观察到化合物I的类似的血浆水平;因此在治疗周期过程中化合物没有过度积累,而且患者在治疗周期过程中也没有由新陈代谢增加变得耐受。
此外,式A或式I化合物可用于治疗组成性表达Akt磷酸化活性的造血癌症。实施例8以及图8和9列出了显示组成型Akt磷酸化的癌细胞系,包括B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、ALL、恶性组织细胞增生症、DLBCL和AML。细胞暴露于化合物I导致Akt磷酸化减少。还可参见实施例19,其显示化合物I在全部13个细胞系中抑制了组成型Akt磷酸化。
在某些实施方案中,癌症是实体瘤。在具体实施方案中,癌症是乳腺、卵巢、肺、结肠或***癌。例如图6显示化合物I减少了两种乳腺癌细胞系的细胞增殖,图10说明了对三种不同乳腺癌细胞系的细胞毒性。类似地,图7证明化合物I对两种卵巢癌细胞系的细胞毒性。
对于实体瘤的治疗,使用对p110β表现良好活性的式A化合物(例如,IC50小于约1μM,并且优选小于约250nM-见实施例15)是有利的,因为实体瘤通常利用该同工酶而不是或不仅利用p110δ。因此具有小于约250nM的式A化合物优选用于治疗实体瘤;如本文所证明的,化合物I、I″、II或II″适合于该用途。
在一些实施方案中,本文所述的用于治疗的受试者是已被诊断患有通过使用式A化合物能治疗的至少一种本文所述疾病的人。在一些实施方案中,受试者已被诊断患有本文所指定的癌症,并且已被证实对至少一种常规化学治疗剂的治疗是难治的。例如,对例如蛋白酶体抑制剂、自体干细胞移植、CHOP方案、利妥希玛、氟达拉滨、阿仑单抗、常规抗癌核苷类似物和烷化剂的治疗没有反应的患者通常对本文所述的治疗方法有反应。因此,在一个实施方案中,本发明的治疗针对已接受一种或多种此类治疗的患者。
在某些实施方案中,自身免疫病是变应性鼻炎、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)或类风湿性关节炎。
在某些实施方案中,本发明方法针对B细胞或B淋巴细胞相关疾病。B细胞在自身免疫病的发病机理中起作用。
式A化合物(特别是式I、I″、II和II″)适合于治疗患有本文所述的疾病的各种受试者,尤其是人体内的血液学癌症。在一些实施方案中,选择受试者以治疗在其它治疗后经历复发或对其它治疗难治的恶性血液病。在一些实施方案中,选择受试者以治疗对其它癌症药物抵抗的恶性血液病。在一些实施方案中,选择受试者以治疗显示出高水平p110δ活性的恶性血液病。在一些实施方案中,选择受试者以治疗显示出相对较低水平p110α活性的恶性血液病。在一些实施方案中,选择受试者以治疗组成型表达Akt磷酸化活性的恶性血液病。
在一个实施方案中,本文所述的方法包括与用于治疗癌症或自身免疫病的治疗组合给受试者施用本文所述的式A化合物。如本文所用的,“疗法”或“治疗”是通过用于治疗癌症或自身免疫病的任何公知常规或实验形式的治疗对癌症或自身免疫病的治疗,其不包括使用式A化合物。在某些实施方案中,式A化合物与用于治疗癌症或自身免疫病的常规或实验性治疗的组合提供了比用没有组合的治疗获得的结果更好的有益和/或期望的治疗结果。在某些实施方案中,用于治疗癌症或自身免疫病的疗法对本领域普通技术人员是公知的并且被描述于文献中。疗法包括但不限于化学疗法、化学疗法的组合、生物疗法、免疫疗法、放射免疫疗法和单克隆抗体及疫苗的使用。
在一些前述实施方案中,组合方法规定与实施疗法同时施用或在实施疗法方法中施用式A化合物。在一些前述实施方案中,将式A化合物与其它化学治疗剂同时施用。在某些实施方案中,组合方法规定在实施疗法之前或之后施用式A化合物。
在一些前述实施方案中,受试者对至少一种标准或实验化学疗法是难治的。在一些前述实施方案中,受试者对至少两种标准或实验化学疗法是难治的。在一些前述实施方案中,受试者对至少三种标准或实验化学疗法是难治的。在一些前述实施方案中,受试者对至少四种标准或实验化学疗法是难治的。
在一些前述实施方案中,受试者对选自以下的至少一种标准或实验化学疗法是难治的:氟达拉滨、利妥希玛、烷化剂、阿仑单抗和上面列出的化学疗法治疗a-q。
在一些前述实施方案中,受试者对选自以下的至少两种标准或实验化学疗法是难治的:氟达拉滨、利妥希玛、烷化剂、阿仑单抗和上面列出的化学疗法治疗a-q。
在一些前述实施方案中,受试者对选自以下的至少三种标准或实验化学疗法是难治的:氟达拉滨、利妥希玛、烷化剂、阿仑单抗和上面列出的化学疗法治疗a-q。
在一些前述实施方案中,受试者对选自以下的至少四种标准或实验化学疗法是难治的:氟达拉滨、利妥希玛、烷化剂、阿仑单抗和上面列出的化学疗法治疗a-q。
可根据实验确定关于组合施用的确切细节。将根据各个受试者、受试者体内待治疗的疾病的性质和通常主治医师的判断调节施用式A化合物与所选疗法的顺序和时间的细化。
下文描述了实验或标准疗法的非限制性实例。此外,Cheson,B.D.,Leonard,J.P.,“Monoclonal Antibody Therapy for B-CeIl Non-Hodgkin′sLymphoma”The New England Journal of Medicine 2008,359(6),p.613-626;和Wierda,W.G.,“Current and Investigational Therapies forPatients with CLL”Hematology 2006,p.285-294对某些淋巴瘤的治疗作了综述。Morton,L.M.等人“Lymphoma Incidence Patterns by WHO Subtypein the United States,1992-2001”Blood 2006,107(1),p.265-276简要描述了在美国淋巴瘤的发病率模式。
特别是B细胞起源的非霍奇金淋巴瘤的治疗包括但不限于单克隆抗体、标准化学疗法方法(例如CHOP、CVP、FCM、MCP等)、放射免疫治疗和其组合的使用,尤其是抗体治疗与化学疗法的结合。
用于非霍奇金淋巴瘤/B细胞癌的非缀合的单克隆抗体的非限制性实例包括利妥希玛、阿仑单抗、人或人源化抗CD20抗体、鲁昔单抗、抗TRAIL、贝伐单抗、加利昔单抗(galiximab)、依帕珠单抗、SGN-40和抗CD74。治疗非霍奇金淋巴瘤/B细胞癌中使用的实验抗体药物的非限制性实例包括ofatumumab、ha20、PRO131921、阿仑单抗、加利昔单抗、SGN-40、CHIR-12.12、依帕珠单抗、鲁昔单抗、阿泊珠单抗、米拉珠单抗和贝伐单抗。可将任何单克隆抗体与利妥希玛、氟达拉滨或化学疗法剂/方案组合。
用于非霍奇金淋巴瘤/B细胞癌的化学疗法标准方案的非限制性实例包括CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、***)、FCM(氟达拉滨、环磷酰胺、米托蒽醌)、CVP(环磷酰胺、长春新碱和***)、MCP(米托蒽醌、苯丁酸氮芥和***龙)、R-CHOP(利妥希玛加CHOP)、R-FCM(利妥希玛加FCM)、R-CVP(利妥希玛加CVP)和R-MCP(R-MCP)。
用于非霍奇金淋巴瘤/B细胞癌的放射免疫疗法的非限制性实例包括钇-90标记的替伊莫单抗和碘-131标记的托西莫单抗。这些治疗剂被认可用于患有复发或难治性滤泡或低恶度淋巴瘤的受试者。
用于套细胞淋巴瘤的治疗性治疗包括组合化学疗法,例如CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、***)、hyperCVAD(超分割环磷酰胺、长春新碱、阿霉素、***、甲氨蝶呤、阿糖胞苷)和FCM(氟达拉滨、环磷酰胺、米托蒽醌)。此外,可以用单克隆抗体利妥希玛(美罗华)对这些方案进行补充以形成组合疗法R-CHOP、hyperCVAD-R和R-FCM。其它方法包括将上述疗法中的任一种与干细胞移植或ICE(异环磷酰胺、卡铂和依托泊苷)治疗组合。
治疗套细胞淋巴瘤的另一种方法包括免疫疗法,例如使用单克隆抗体像利妥希玛(美罗华)。利妥希玛还对其它惰性B细胞癌有效,包括边缘区淋巴瘤、WM、CLL和小淋巴细胞淋巴瘤。利妥希玛与化学疗法剂的组合尤其有效。改进的方法是放射免疫疗法,其中将单克隆抗体与放射性同位素颗粒结合,例如碘-131托西莫单抗(Bexxar)和钇-90替伊莫单抗在另一实施例中,与CHOP用于顺序治疗中。另一免疫疗法实例包括使用癌症疫苗,其是基于个别患者肿瘤的遗传组成。淋巴瘤疫苗实例是GTOP-99
治疗套细胞淋巴瘤的另一种方法包括自体干细胞移植加上高剂量化学疗法。
治疗套细胞淋巴瘤的另一种方法包括施用蛋白酶体抑制剂例如(硼替佐米或PS-341)、或抗血管发生剂例如沙立度胺,尤其与美罗华组合。另一治疗方法是施用导致Bcl-2蛋白降解并增加癌细胞对化学疗法敏感度的药物,例如奥利默森(Genasense)与其它化学治疗剂组合。另一治疗方法包括施用mTOR抑制剂,其可导致细胞生长的抑制甚至细胞死亡;非限制性实例是坦罗莫司(CCI-779),坦罗莫司与美罗或其它化学治疗剂的组合。
用于MCL的其它最近治疗已经公开(Nature Reviews;Jares,P.2007)。非限制性实例包括Flavopiridol、PD0332991、R-roscovitine(Selicilib,CYC202)、苯乙烯基砜、Obatoclax(GX15-070)、TRAIL、抗TRAIL DR4和DR5抗体、坦罗莫司(CCI-779)、依维莫司(RADOOl)、BMS-345541、姜黄素、伏立诺他(SAHA)、沙立度胺、来那度胺(CC-5013)和格尔德霉素(17-AAG)。
用于治疗瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症的其它治疗剂的非限制性实例包括哌立福辛、硼替佐米利妥希玛、柠檬酸西地那非(万艾)、CC-5103、沙立度胺、依帕珠单抗(hLL2-抗-CD22人源化抗体)、辛伐他汀、enzastaurin、campath-1H、***、DT PACE、奥利默森、抗瘤酮A10、抗瘤酮AS2-1、阿仑单抗、beta alethine、环磷酰胺、盐酸阿霉素、***、硫酸长春新碱、氟达拉滨、非格司亭、美法仑、重组干扰素α、卡氮芥、顺铂、环磷酰胺、阿糖胞苷、依托泊苷、美法仑、多拉司他汀10、铟In 111单克隆抗体MN-14、钇Y 90人源化依帕珠单抗、抗胸腺细胞球蛋白、白消安、环孢菌素、甲氨蝶呤、麦考酚酸吗乙酯、治疗性同种异基因淋巴细胞、钇Y 90替伊莫单抗、西罗莫司、他克莫司、卡铂、噻替派、紫杉醇、阿地白介素、重组干扰素α、多西他赛、异环磷酰胺、美司钠、重组白细胞介素-12、重组白细胞介素-11、Bcl-2家族蛋白抑制剂ABT-263、地尼白介素(denileukin diftitox)、坦螺旋霉素、依维莫司、培非司亭、伏立诺他、alvocidib、重组flt3配体、重组人血小板生成素、淋巴因子激活的杀伤细胞、氨磷汀三水合物、氨基喜树碱、盐酸伊立替康、醋酸卡泊芬净、氯法拉滨、阿法依泊汀、奈拉滨、喷司他丁、沙格司亭、双酒石酸长春瑞滨、WT-1类似物肽疫苗、WTl 126-134肽疫苗、芬维A胺、伊沙匹隆、奥沙利铂、单克隆抗体CD19、单克隆抗体CD20、ω-3脂肪酸、盐酸米托蒽醌、醋酸奥曲肽、托西莫单抗和碘I-131托西莫单抗、莫特沙芬钆、三氧化二砷、替吡法尼、自体人肿瘤来源的HSPPC-96、veltuzumab、苔藓抑素1和聚乙二醇化脂质体盐酸阿霉素及其任何组合。
用于治疗弥漫型大B细胞性淋巴瘤(DLBCL)药物疗法(Blood 2005Abramson,J.)的其它治疗剂的非限制性实例包括环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、***、抗CD20单克隆抗体、依托泊苷、博来霉素、用于瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症所列举的许多药物和其任何组合,例如ICE和R-ICE。
用于治疗瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症的治疗方法的非限制性实例包括外周血干细胞移植、自体造血干细胞移植、自体骨髓移植、抗体治疗、生物治疗、酶抑制剂治疗、全身照射、干细胞输注、具有干细胞支持的骨髓消融、体外处理的外周血干细胞移植、脐带血移植、免疫酶技术、药理学研究、低-LET钴-60γ射线治疗、博来霉素、常规外科手术、放射治疗和非骨髓根除同种异型造血干细胞移植。
用于治疗慢性淋巴细胞白血病的其它治疗剂的非限制性实例(Spectrum,2006,Fernandes,D.)包括苯丁酸氮芥(瘤可宁)、环磷酰胺(Cyloxan、Endoxan、Endoxana、Cyclostin)、氟达拉滨(Fludara)、喷司他丁(Nipent)、克拉屈滨(Leustarin),阿霉素(Adriblastine)、长春新碱(Oncovin)、***、***龙、阿仑单抗(Campath,MabCampath)、用于瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症所列举的许多药物、和化学疗法与化学免疫疗法的组合,包括常规组合方案:CVP(环磷酰胺、长春新碱、***);R-CVP(利妥希玛-CVP);ICE(异环磷酰胺、卡铂、依托泊苷);R-ICE(利妥希玛-ICE);FCR(氟达拉滨、环磷酰胺、利妥希玛);和FR(氟达拉滨、利妥希玛)。
在某些实施方案中,方法包括除了给所述患者施用化合物I或II之外,还施用治疗有效量的经挑选以治疗所述患者体内的所述癌症或自身免疫病的至少一种治疗剂和/或治疗方法。在某些实施方案中,方法包括除了给所述患者施用化合物I或II之外,还施用治疗有效量的选自以下治疗剂的组合:a)CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、***);b)R-CHOP(利妥希玛-CHOP);c)hyperCVAD(超分割环磷酰胺、长春新碱、阿霉素、***、甲氨蝶呤、阿糖胞苷);d)R-hyperCVAD(利妥希玛-hyperCVAD);e)FCM(氟达拉滨、环磷酰胺、米托蒽醌);f)R-FCM(利妥希玛、氟达拉滨、环磷酰胺、米托蒽醌);g)硼替佐米和利妥希玛;h)坦罗莫司和利妥希玛;i)坦罗莫司和;j)碘-131托西莫单抗和CHOP;k)CVP(环磷酰胺、长春新碱、***);l)R-CVP(利妥希玛-CVP);m)ICE(异环磷酰胺、卡铂、依托泊苷);n)R-ICE(利妥希玛-ICE);o)FCR(氟达拉滨、环磷酰胺、利妥希玛);和p)FR(氟达拉滨、利妥希玛)。
可采用本领域公知的通常理解的配制技术配制本发明化合物以给动物受试者施用。可在最新版本的Remington′s Pharmaceutical Sciences Mack,Publishing Company,Easton,PA中找到适合于具体施用方式和式A化合物的制剂。
可以前药的形式制备本发明化合物,前药即在给受试者施用后释放本发明化合物的保护形式。典型地,保护基在例如血流的体液中被水解从而释放活性化合物,或者在体内被氧化或还原以释放活性化合物。在Smithand Williams Introduction to the Principles of Drug Design.Smith,HJ.;Wright,第二版,London(1988)中能找到前药的讨论。
可以以纯化学药品施用本发明化合物,但是典型地优选以药物组合物或制剂的形式施用化合物。因此,本发明还提供药物组合物,其包含式A化合物和生物相容性药物载体、佐剂或载体。组合物可包括式A化合物作为唯一活性部分或与其他物质组合,例如与赋形剂或其它可药用载体混合的寡核苷酸或多核苷酸、寡肽或多肽、药物或激素。载体和其它成分就它们与制剂的其它成分相容并且对其接受者无害而言可被认为是可药用的。
药物组合物被配制以含适合的可药用载体,并且可任选包含促进活性化合物加工成可药用制剂中的赋形剂和辅料。施用形式通常将决定载体的性质。例如,用于肠胃外施用的制剂可包含可溶于水形式的活性化合物的水溶液。适合于肠胃外施用的载体可选自盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水和其它生理相容性溶液。对于肠胃外施用优选的载体是生理相容性缓冲溶液,例如Hank′s溶液、Ringer′s溶液或生理缓冲盐水。对于组织或细胞施用,在制剂中使用适合于要被穿透的特定屏障的渗透剂。这种渗透剂在本领域中通常是已知的。对于包含蛋白的制剂,该制剂可包括稳定材料,例如多元醇(例如蔗糖)和/或表面活性剂(例如非离子型表面活性剂)等。
或者,肠胃外使用的制剂可包含以适当的油质注射混悬剂制备的活性化合物的分散体或混悬剂。适合的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油例如芝麻油、和合成脂肪酸酯例如油酸乙酯或甘油三酯、或脂质体。水性注射混悬剂可含增加混悬剂粘度的物质,例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地,混悬剂还可含适合的稳定剂或增加化合物的溶解度使得可以制备高浓度溶液的物质。也可使用提供pH-敏感性增溶作用和/或活性物质缓释的水性聚合物作为涂层或基质结构,例如甲基丙烯酸聚合物,例如从RohmAmerica Inc.(Piscataway,NJ.)可得到的系列。还可使用乳剂,例如水包油和油包水分散体,其任选被乳化剂或分散剂(表面活性材料;表面活性剂)稳定。混悬剂可含助悬剂,例如乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和山梨聚糖酯、微晶纤维素、氢氧化铝、膨润土、琼脂、西黄蓍胶及其混合物。
还可使用含式A活性化合物的脂质体用于肠胃外施用。脂质体来自磷脂或其它脂质。脂质体形式的组合物还可含其它成分,例如稳定剂、防腐剂、赋形剂等。优选的脂质包括天然和合成的磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)。形成脂质体的方法在本领域中是已知的,参见例如Prescott(Ed.),Methodsin Cell Biology,Vol.XIV,p.33,Academic Press,New York(1976)。
可使用本领域公知的可药用载体配制适合于口服的含一定剂量式A化合物的药物组合物。为口服而配制的制剂可以是片剂、丸剂、胶囊剂、扁囊剂、糖锭剂、锭剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、膏剂(slurries)、酏剂、混悬剂或散剂。为了说明,可以如下获得用于口服的药物制剂:将活性化合物与固体赋形剂混合,任选研磨得到的混合物,如果需要,在加入适合的辅料后对颗粒的混合物进行加工,得到片剂或糖锭剂芯。口服制剂可使用类型上与为肠胃外使用所述的那些类似的液体载体,例如缓冲水溶液、混悬剂等。
优选的口服制剂包括片剂、糖锭剂和明胶胶囊剂。这些制剂可含一种或多种赋形剂,赋形剂没有限制地包括:
a)稀释剂,例如糖,包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇;
b)粘合剂,例如硅酸镁铝、从玉米、小麦、稻、马铃薯等得到的淀粉;
c)纤维素材料,例如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素和羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮,树胶,例如***树胶和西黄蓍胶,和蛋白质,例如明胶和胶原;
d)崩解剂或增溶剂,例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、淀粉、琼脂、海藻酸或其盐,例如海藻酸钠、或泡腾组合物;
e)润滑剂,例如二氧化硅、滑石粉、硬脂酸或其镁或钙盐和聚乙二醇;
f)调味剂和甜味剂;
g)着色剂或色素,例如为了识别产品或为了表征活性化合物的数量(剂量);和
h)其它成分,例如防腐剂、稳定剂、溶胀剂、乳化剂、溶解促进剂、调节渗透压力的盐和缓冲剂。
在一些优选的口服制剂中,药物组合物包含至少一种上面组(a)中的材料、或至少一种上面组(b)中的材料、或至少一种上面组(c)中的材料、或至少一种上面组(d)中的材料、或至少一种上面组(e)中的材料。优选地,组合物包含选自上面组(a)-(e)中的两组各至少一种材料。
明胶胶囊剂包括由明胶制成的推入配合胶囊剂、以及由明胶制成的软的密封胶囊剂和例如甘油或山梨醇的包衣。推入配合胶囊剂可含与填充剂、粘合剂、润滑剂和/或稳定剂等混合的活性成分。在软胶囊剂中,可将活性化合物溶于或混悬于适合液体中,例如有或没有稳定剂的脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中。
可为糖锭剂芯提供适合的包衣例如浓的糖溶液,其还可含***树胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普凝胶、聚乙二醇、和/或二氧化钛、漆溶液和适合的有机溶剂或溶剂混合物。
可以以活性化合物的盐提供药物组合物。盐比相应的游离酸或碱形式在水性或其它质子溶剂中更易溶解。可药用盐在本领域中是公知的。含酸性部分的化合物可与适合的阳离子形成可药用盐。适合的可药用阳离子包括,例如碱金属(例如钠或钾)和碱土金属(例如钙或镁)阳离子。
含碱性部分的结构式(A)化合物可与适合的酸形成可药用酸加成盐。例如,Berge等人在J Pharm Sci,66:1(1977)中详细描述了可药用盐。可在本发明化合物的最终分离和纯化过程中原位制备盐或者通过使游离碱官能团与适合的酸反应单独制备盐。
代表性酸加成盐包括但不限于醋酸盐、己二酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、延胡索酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘化物、2-羟基乙磺酸盐(异硫代羟酸盐(isothionate))、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐或硫酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、三甲基乙酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、磷酸盐或磷酸氢盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐和十一酸盐。可被用于形成可药用酸加成盐的酸的实例包括但不限于,如盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸这样的无机酸,和如草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸这样的有机酸。
碱性含氮基团可被如下物质季铵化:低级卤代烷,例如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物;二烷基硫酸酯,例如硫酸二甲酯、二乙酯、二丁酯和二戊酯;长链卤代烷,例如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂酰氯化物、溴化物和碘化物;芳基烷基卤化物,例如苄基和苯乙基溴化物;和其它。从而得到了具有改善的溶解性或分散性的产物。
以可药用载体配制的含本发明化合物的组合物可被制备、放入适合的容器中,并被贴上治疗适应症的标签。因此,也可包括制成品,例如含本发明化合物剂型的容器和含化合物的使用说明书的标签。本发明也包括试剂盒。例如,试剂盒可包含药物组合物的剂型和含组合物治疗医学疾病的使用说明的药品说明书。在任何情况中,标签上指出的疾病可包括治疗炎性疾病、癌症等。
施用方法
可通过任何常规方法,包括肠胃外和肠内技术,给受试者施用含式A化合物的药物组合物。肠胃外施用形式包括通过除了胃肠道之外的途径施用组合物的那些,例如静脉内、动脉内、腹膜内、髓内、肌肉内、关节内、鞘内和心室内注射。肠内施用形式包括,例如口(包括***和舌下)和直肠施用。经上皮施用形式包括,例如经粘膜施用和经皮施用。经粘膜施用包括,例如肠内施用以及鼻、吸入和深部肺施用;***施用;和直肠施用。经皮施用包括被动或主动经皮或透皮形式,包括例如贴剂和离子电渗装置以及糊剂、油膏或软膏的局部应用。还可采用高压技术例如POWDERJECTTM进行肠胃外施用。
外科技术包括植入贮库(储库)组合物、渗透泵等。用于治疗炎症的优选施用途径可以是对于局部疾病例如关节炎局部或局域递送,或者对于分布式疾病***给药,例如对再灌注损伤或例如败血病的***疾病静脉内递送。对于其它疾病,包括涉及呼吸道的那些,例如慢性阻塞性肺病、哮喘和肺气肿,可通过喷雾剂、气溶胶、散剂等的吸入或深部肺施用进行施用。
在一些前述实施方案中,在施用化学疗法、放射治疗和/或外科手术之前、期间或之后施用式A化合物。将根据个别受试者、受试者体内待治疗的疾病性质和通常主治医师的判断来调整所选的制剂和施用途径。
可通过修改或衍生化合物以靶向递送到表达能识别细胞本身的标志的癌细胞来增强式A化合物的治疗指数。例如,可将化合物与识别对癌细胞具有选择性或特异性的标志的抗体连接,从而化合物被带到细胞附近以局部发挥其作用,如之前所述的(参见例如Pietersz等人,Immunol Rev,129:57(1992);Trail等人,Science,261:212(1993);和Rowlinson-Busza等人,Curr Opin Oncol,4:1142(1992))。这些化合物的肿瘤定向递送尤其通过减小可由放射治疗或化学疗法导致的可能的非特异性毒性而增加了治疗益处。在另一方面,可将式A化合物和放射性同位素或化学治疗剂与同一种抗肿瘤抗体缀合。
药物本身的性质和药物的制剂可影响被施用药物的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。可通过临床前体外和体内研究收集这种药动学和药效学信息,以后临床试验过程中在人体内证实。因此,对于本发明方法中所用的任何化合物,可最初由生物化学和/或基于细胞的分析估计治疗有效剂量。然后,可在动物模型中配制剂型以获得调节特定PI3K同种型或同种型组合的表达或活性的期望循环浓度范围。当进行人研究时,关于对各种疾病和状况的适合的剂量水平和治疗持续时间将出现其他信息。
尽管本发明化合物被很好地耐受,但对治疗剂量限制的实例是升高的肝脏功能试验(LFT)。LFT涉及对患者的血清或血浆的标准临床生物化学试验以提供关于患者肝状态的信息。例如丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、碱性磷酸酶、胆红素和γ谷氨酰转肽酶水平在正常水平之外可能表明肝毒性。可以对治疗化合物的给药进行调节以避免或减小升高的肝脏功能试验值和随后肝毒性的可能性。例如,可给受试者施用逐渐增加的化合物剂量。在某一剂量下,受试者开始形成在正常范围之外的升高的LFT水平,表明在该剂量下可能的肝毒性。作出反应时,可将剂量减少至一个量以使LFT水平被降至根据治疗医生的判断可接受的范围,例如对于被治疗受试者正常范围内的水平或在正常的约25%至50%内。因此,肝脏功能试验可被用于滴定化合物的施用剂量。
可通过细胞培养或实验动物中的标准药学方法确定这种化合物的毒性和疗效,例如确定LD50(使群体的50%死亡的剂量)和ED50(在群体的50%中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是“治疗指数”,其典型地以LD50/ED50比来表示。优选显示出较大治疗指数的化合物,即中毒剂量大大高于有效剂量。从这种细胞培养分析和另外的动物研究中获得的数据可被用于制定人用剂量范围。这种化合物的剂量优选在包括几乎没有或没有毒性的ED50的循环浓度范围内。
可通过治疗相关的中毒症状限制剂量。除了升高的肝脏功能试验之外这种症状还包括贫血、视觉模糊、腹泻、呕吐、疲劳、粘膜炎、外周水肿、发烧、周围神经病变、胸腔积液、盗汗和端坐呼吸或其组合。在某一剂量下,如果受试者发展到这种症状不能忍受的水平,则可减小剂量以便不利事件被消除并且不再不利或者被减小至根据治疗医生的判断可接受的水平。
确定化合物对于患者适合剂量的另一考虑是在血浆中循环的期望浓度。在一个优选实施方案中,从施用开始12小时期间化合物在血中的浓度是40-3,000ng/mL。在另一具体实施方案中,从施用开始12小时期间化合物在血中的浓度是75-2,000ng/mL。在另一具体实施方案中,从施用开始12小时期间化合物在血中的浓度是500-2,000ng/mL。在一个优选的实施方案中,从施用开始12小时期间化合物在血中的浓度是40-3,000ng/mL,其中化合物是式I、I″、II或II″并且以约50mg、100mg或200mg的量经口施用。在一个优选实施方案中,从施用开始12小时期间化合物在血中的浓度是40-3,000ng/mL,其中化合物是式I并且以约50mg、100mg或200mg的量被经口施用。在一个优选实施方案中,从施用开始12小时期间化合物在血中的浓度是40-3,000ng/mL,其中化合物是式II并且以约50mg、100mg或200mg的量被经口施用。在一些前述实施方案中,在施用两小时内达到血浆中的最大浓度。
在某些实施方案中,对式I或II化合物的剂量进行选择以在8至12小时期间产生平均约10nM或10nM以上的血浆浓度,并且提供约500nM或500nM以上的峰血浆浓度,优选约1000nM或1000nM以上。在某些实施方案中,对式I或II化合物的剂量进行选择以在8至12小时期间产生平均约100nM或100nM以上的血浆浓度,并且提供约500nM或500nM以上的峰血浆浓度,优选约1000nM或1000nM以上。在某些实施方案中,对式I或II化合物的剂量进行选择以在8至12小时期间产生平均约200nM或200nM以上的血浆浓度,并且提供约500nM或500nM以上的峰血浆浓度,优选约1000nM或1000nM以上。
在某些实施方案中,对式I或II化合物的剂量进行选择以产生血浆浓度,其中化合物的谷浓度在能观察到例如癌细胞凋亡的疗效范围内。在某些实施方案中,对式I或II化合物的剂量进行选择以产生血浆中处于或高于EC50PI3Kδ同种型活化的谷血浆浓度。在某些实施方案中,对式I或II化合物的剂量进行选择以在化合物施用后至少12小时期间产生在细胞中PI3Kδ活化EC50水平以上和PDKγ活化EC50水平以下的谷血药浓度。例如,如果在全血浆中对于PI3Kδ嗜碱性粒细胞活化的EC50值是65nM并且对于PI3Kγ嗜碱性粒细胞活化的EC50值是1100nM,则所选的化合物剂量提供从化合物施用后8-12小时期间60nM至1100nM的化合物谷血浆浓度。类似地,可对剂量进行选择以产生PI3Kδ嗜碱性粒细胞活化EC50水平以上和PI3K-α、-β或-γ嗜碱性粒细胞活化EC50水平以下的谷血药浓度。体内PI3K同种型活化或抑制的EC50值可由本领域普通技术人员确定。在备选实施方案中,药物谷浓度的上限可超过血浆中PI3K-γ、-α或-β同种型的EC50值并且不受该值限制。而且,药物的血浓度范围在对治疗恶性血液病治疗上有益同时减少不期望的副作用的水平。
例如,尽管是δ-选择性的,但化合物也可对p110γ显示出足够活性以在临床上有用,即对依赖p110γ进行信号转导的癌症有效,因为可达到对p110γ抑制的有效剂量以上的血浆水平同时相对于其它同种型、特别是α同种型具有选择性。因此,在一些实施方案中,对化合物的剂量进行选择以产生对选择性抑制p110δ和p110γ有效的血药浓度。
在一些实施方案中,化合物的剂量提供从化合物施用后8至12小时期间65nM至1100nM之间的谷血浆浓度。在一些前述实施方案中,所述期间是从化合物施用后至少12小时。
在一个具体实施方案中,以治疗有效量施用化合物。
在一个具体实施方案中,以20-500mg/天的剂量施用化合物。在一个具体实施方案中,以50-250mg/天的剂量施用化合物。
在一个具体实施方案中,以每个剂量25至150mg的剂量施用化合物,每天施用两个剂量(例如以25至150mg剂量的BID给药)。在一个优选实施方案中,用50mg至100mg式A化合物每天两次治疗受试者。
在一个具体实施方案中,方法包括给所述患者施用20-500mg化合物的初始日剂量和通过增量增加所述剂量直到达到临床疗效。可采用约25、50或100mg的增量来增加剂量。可每天、每隔一天、每周两次或每周一次增加剂量。
在一个具体实施方案中,方法包括通过施用达到临床疗效的相同剂量的化合物继续治疗所述患者,或者通过增量将所述剂量减小至可维持疗效的水平。
在一个具体实施方案中,方法包括给所述患者施用20-500mg化合物的初始日剂量和将所述剂量在至少6天内增加至每天50-400mg的总剂量。任选地,可将剂量进一步增加至约750mg/天。
在一个具体实施方案中,每天至少两次施用化合物。
在一个具体实施方案中,经口、静脉内或通过吸入施用化合物。优选地,经口施用化合物。在一些实施方案中,以约50mg BID的剂量或约100mg BID的剂量经口施用。
对于本发明的方法,可采用调节剂量时间和顺序的有效施用方案。药物剂量优选包括包含有效量药物的药物剂量单位。如本文所用的,“有效量”指通过施用一个或多个药物剂量单位足以调节PI3Kδ表达或活性和/或得到受试者生理参数可测量的变化的量。“有效量”还可指改善受试者体内的疾病或障碍所需的量。
对于式A化合物适合的剂量范围根据这些考虑变化,但通常,以10.0μg/kg-15mg/kg体重、1.0μg/kg-10mg/kg体重或0.5mg/kg-5mg/kg体重施用化合物。因此,对于典型的70-kg人受试者,剂量范围是每一剂700μg-1050mg、70μg-700mg或35mg-350mg,每天可施用两剂或两剂以上剂量。与例如静脉内施用相比,当经口或经皮施用化合物时剂量可更高。式A化合物的毒性减少允许相对较高剂量的治疗施用。在一些前述实施方案中,经口施用高达750mg/天的本发明化合物是适合的。在一些前述实施方案中,以50mg BID的剂量施用式A化合物。在一些前述实施方案中,以100mg BID的剂量施用式A化合物。在一些前述实施方案中,以200mgBID的剂量施用式A化合物。在一些前述实施方案中,以350mg BID的剂量施用式A化合物。在具体实施方案中,对于治疗白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤,每天经口施用一次或优选两次,每剂约50-350mg的剂量通常是适合的。
在一些前述实施方案中,经口施用高达750mg/天化合物I″或II″是适合的。在一些前述实施方案中,以50mg BID的剂量施用式I″或II″化合物。在一些前述实施方案中,以100mg BID的剂量施用式I″或II″化合物。在一些前述实施方案中,以200mg BID的剂量施用式I″或II″化合物。在一些前述实施方案中,以350mg BID的剂量施用式I″或II″化合物。在一些前述实施方案中,对于治疗白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤,每天经口施用一次或优选两次,式I″或II″化合物每剂约50-350mg的剂量通常是适合的。
可以以单次推注剂量、一段时间内的剂量如静脉内注射或经皮施用、或多剂量施用化合物。
给药可持续至少7天。在一些实施方案中,每天给药持续约28天。在一些实施方案中,给药持续约28天,然后中断至少7天。在一些实施方案中,完整周期是连续每天给药达28天。可在每个周期后测量患者临床反应的评价。临床结果可被用于决定增加、减少、中断或维持剂量。
取决于施用途径,可根据体重、体表面积或器官尺寸计算适合的剂量。最终剂量方案将由主治医师鉴于良好的医疗实践,考虑改变药物作用的各种因素,例如药物的比活性、疾病状态的身份和严重程度、患者的响应性、患者的年龄、状况、体重、性别和饮食、和任何感染的严重程度来确定。可被考虑进去的其它因素包括施用时间和频率、药物组合、反应敏感性和对治疗的耐受性/应答。熟练的从业人员经过有限实验能常规地进行涉及本文所述任何制剂的适合于治疗的剂量的进一步改进,尤其是根据所公开的剂量信息和试验以及在人临床试验中观察到的药动学数据。可通过使用已建立的用于确定药物在体液或其它样品中的浓度和剂量反应数据的测定法确定适合的剂量。
给药频率将取决于式A化合物的药动学参数和施用途径。对剂量和施用进行调整以提供足够水平的活性部分或维持所需的效果。因此,如维持化合物的期望最低水平所需的,可以以单剂量、多个分离的剂量、连续输注、缓释贮库或其组合施用药物组合物。可以一天一次或多于一天一次(例如一天两次、三次或四次)施用短效药物组合物(即短的半衰期)。可以每3-4天、每周或每两周一次施用长效药物组合物。泵,例如皮下、腹膜内或硬膜下泵可被优选用于连续输注。
将有利地对本发明方法反应的受试者通常包括医疗和兽医受试者,一般包括人患者。本发明方法对其尤其有用的受试者是猫、狗、大的动物、鸟类例如鸡等。一般而言,将从式A化合物获益的任何受试者均适合于本发明方法的施用。在一些前述实施方案中,患者具有del(17p)或del(l1q)的细胞遗传特征。在一些前述实施方案中,患者具有***病。在一些前述实施方案中,化合物I、I″、II或II″的使用减小了患者中***病的尺寸。在一些前述实施方案中,化合物I、I″、II或II″的使用在一个治疗周期后减小了***病的尺寸。在一些前述实施方案中,化合物I、I″、II或II″的使用在一个治疗周期后将***病的尺寸减小了至少10%。在一些前述实施方案中,化合物I、I″、II或II″的使用在一个治疗周期后将***病的尺寸减小了至少25%。在一些前述实施方案中,化合物I、I″、II或II″的使用在一个治疗周期后将***病的尺寸减小了至少30%。在一些前述实施方案中,化合物I、I″、II或II″的使用在一个治疗周期后将***病的尺寸减小了至少40%。在一些前述实施方案中,化合物I、I″、II或II″的使用在一个治疗周期后将***病的尺寸减小了至少50%。在一些前述实施方案中,化合物I、I″、II或II″的使用在一个治疗周期后将***病的尺寸减小了至少75%。
一个方面,本发明提供治疗疾病的方法,包括给需要这种治疗的受试者施用式I、II化合物或其可药用盐和一种或多种治疗剂,其中所述疾病是癌症或自身免疫病。在优选的实施方案中,治疗剂是蛋白酶体抑制剂。在更具体的实施方案中,治疗剂是硼替佐米。在一些前述实施方案中,疾病是恶性血液病。在优选的实施方案中,疾病选自多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤、弥漫型大B细胞性淋巴瘤、B细胞ALL、T细胞ALL和霍奇金淋巴瘤。在优选的实施方案中,化合物基本上由S-对映体组成。在特定实施方案中,化合物包含至少95%S-对映体。在一些前述实施方案中,所述化合物和治疗剂的施用提供比没有化合物和治疗剂的组合获得的结果更优异的协同益处。
提供以下实施例用于说明但不是用于限制本发明。在下面的实施例中,对“式I化合物”或“化合物I”的参考指本文显示的S-对映体,并且如用手性HPLC方法所测得的,用于这些实施例的样品显示出98.2%ee:
(S-对映体)
此外,该化合物的分析揭示了以下材料的特征:
试验 |
试验结果 |
外观 |
稍稍灰白色粉末 |
1H-NMR |
与参比一致的光谱 |
HPLC分析 |
98.1%(无水、无溶剂) |
手性纯度(HPLC) |
98.2%ee |
试验 |
试验结果 |
炽灼残渣 |
0.11% |
红外光谱(FTIR) |
与参比一致的光谱 |
13C-NMR |
与参比一致的光谱 |
粒度分析 |
中间粒径:11.3μm |
水(卡氏水分测定仪) |
0.56% |
实施例1
MM细胞中细胞生长的抑制
该实施例证明式I化合物在多发性骨髓瘤(MM)细胞中抑制细胞因子(IGF-I和IL-6)的细胞生长刺激作用。用对照培养基;用式I化合物,在IL-6或IGF-I存在或不存在下培养LB细胞(骨髓单核细胞骨髓瘤细胞系)48h。通过测定溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四钠(MTT;Chemicon International)染料吸光度评价式I化合物对MM细胞生长的抑制作用。在48小时培养的最后4小时对每个孔将10μL 5mg/mL MTT脉冲细胞,随后加入含0.04N HCl的100μL异丙醇。使用分光光度计(Molecular Devices)在570/630nm处测量吸光度。图1显示了结果的总结。即使在细胞生长刺激性细胞因子的存在下暴露于0.625μM-2.5μM化合物I也抑制了MM细胞生长。
实施例2
BMSC对细胞毒性的作用
该实施例证明骨髓基质细胞(BMSC)不能保护不受化合物I诱导的LB细胞细胞毒性。在BMSC存在或不存在下,用对照培养基和式I化合物培养LB细胞48小时。采用[3H]-胸苷摄入分析评价细胞增殖。所有数据表示一式三份实验的平均值(±SD)。图2显示了结果的总结。即使在BMSC存在下暴露于0.625μM-10μM化合物I后也减少了LB细胞生长。
实施例3
化合物对CLL细胞凋亡的影响
该实施例证明式I化合物诱导患者体内慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞的凋亡。通过俄亥俄州立大学的CLL联合研究中心(CLL ResearchConsortium)从患有B-CLL的患者获得外周血。采用Rosette-Sep(StemCellTechnologies)分离原代CD 19-阳性细胞。在37℃、5%CO2和高湿度下在补充有10%热灭活的胎牛血清、2mmol/L L-谷氨酰胺和青霉素(100单位/mL)/链霉素(100μg/mL;Invitrogen)的RPMI 1640(Invitrogen)中维持细胞。用式I化合物或培养基培养96小时后,用PBS洗涤5x105个细胞,然后将其重悬浮于含2μL膜联蛋白V-FITC储备液(BioWhittaker,Inc)和10μL 20μg/mL PI(Sigma)的结合缓冲液(10mmol/L HEPES/NaOH,pH 7.4,150mmol/L NaCl 5mmol/L KCl,1mmol/L MgCl2,1.8mmol/LCaCl2)中。在避光区室温下培养10分钟,通过FACScanTM(BectonDickinson)流式细胞术对样品进行定量。
从图3可以看出,用化合物I处理CLL患者细胞导致凋亡并且结果看起来是剂量依赖性的。
如图19中的数据指出的,从不良预后的患者的CLL细胞看出化合物I诱导的凋亡。
如图20所示,还看出化合物I诱导的凋亡在来自难治/复发患者的CLL细胞中有效。
实施例4
化合物在ALL细胞系中的作用
该实施例证明式I化合物导致T-ALL和B-ALL(急性淋巴细胞型白血病)白血病细胞系中Akt磷酸化下降和细胞增殖减少伴随有细胞死亡。采用AlamarBlue分析(Invitrogen)进行细胞系的存活率分析。将100μL体积的细胞(每孔1x106个)置于96-孔平底板中,将式I化合物(以2x终浓度每孔100μL)或单独的培养基加入到板中。所有的进行一式四份。将细胞培养固定的时间(48小时)。培养后,将10μL加入到各个孔中。将细胞培养4小时,使用M5平板读取器2001获得530-560nm处的光密度。细胞存活率以经处理细胞/对照样品之间的吸收百分比来表示。图4显示的表中总结了这些结果。暴露于化合物I导致各种ALL细胞系中细胞存活率大大下降以及Akt磷酸化的减少。
实施例5
化合物对ALL细胞周期的影响
该实施例证明用式I化合物处理急性淋巴细胞型白血病(ALL)细胞系CCRF-SB导致G0/G1细胞周期阻滞。碘化丙锭染色的CCRF-SB细胞在正常生长条件下的代表性荧光激活细胞分选(FACS)分析,和在式I化合物存在下的生长。在频率分布图下面的表中计算了在Go-G1、S和G2-M期中细胞的平均百分比。图5显示了结果。
实施例6
乳腺癌细胞增殖的抑制
该实施例证明式I化合物抑制乳腺癌细胞系的增殖。在血清和指出浓度的式I化合物存在下使T47D和HS-578T细胞系生长。通过分析(Invitrogen)96-孔板在一式三份孔中测量增殖。增殖分析的结果以平均细胞百分比值来表示并且显示于图6中。
实施例7
卵巢癌细胞系的增殖抑制
该实施例证明式I化合物抑制了卵巢癌细胞系的增殖。在血清和指出浓度的式I化合物存在下使IGROV-I和OVCAR-3细胞系生长。通过分析(Invitrogen)96-孔板在一式三份孔中测量增殖。增殖分析的结果以平均细胞百分比值来表示并且显示于图7中。
实施例8
Akt磷酸化的减少
该实施例证明式I化合物减少了显示出组成型Akt磷酸化的造血肿瘤细胞系中组成型Akt磷酸化。对一大组白血病和淋巴瘤细胞系的组成型Akt磷酸化进行了评价。这些细胞系代表B淋巴瘤、T淋巴瘤、ALL、恶性组织细胞增多症、DLBCL和AML。用式I化合物处理证明血清依赖性Akt磷酸化的细胞系2小时。之后,使细胞溶解、按照大小分级分离并用针对phospho-Akt(Ser473)的抗体进行免疫印迹。图8显示了结果。暴露于化合物I后所有的细胞系均获得了Akt(Ser473)的减少。
实施例9
化合物I在DLBCL中有效
该实施例提供了化合物I在弥漫型大B细胞性淋巴瘤细胞中阻断PI3K信号转导和诱导凋亡的证据。如图26A所示p110δ在DLBCL细胞系中被表达。图26B显示暴露于化合物I减少了几种DLBCL细胞系中的pAKT水平。
实施例10
乳腺癌细胞中凋亡的诱导
该实施例证明式I化合物在乳腺癌细胞系中诱导凋亡。用式I化合物或相应DMSO浓度处理HS-578T、T47D和MCF7细胞24h。通过膜联蛋白V-FITC/7AAD染色确定凋亡细胞的百分比。左下方,活细胞(膜联蛋白V-FITC/PI阴性);右下方,早期凋亡细胞(仅膜联蛋白V-FITC阳性);右上方,中晚期凋亡细胞(膜联蛋白V-FITC/7AAD双重阴性);和左上方,晚期凋亡/坏死(仅7AAD阳性)。除了左下方象限(活细胞)之外指出了每个象限中的细胞百分比。图10显示了给出相似结果的3个不同实验中的一个代表性实验。
实施例11
健康志愿者中第7天时稳态血药浓度
该实施例提供了涉及在健康人受试者的血液中第7天时式I化合物浓度的数据。在研究的第7天口服50、100或200mg BID式I化合物后在12小时期间监测浓度。图11是从施用开始12小时期间药物血浆浓度的结果。对于所有剂量在2小时内达到了最大药物浓度。施用50、100或200mgBID所述化合物导致超过嗜碱性粒细胞中PI3KδEC50浓度至少12小时的浓度水平。
此外,进行了给健康志愿者施用17-400mg式I化合物的单剂量研究。从施用开始24小时期间测定了血液中化合物浓度,结果示于图24A中。在约6小时时,对于所有施用剂量化合物I在血液中的浓度是至少约100nM。在约12小时时,对于50mg剂量化合物I在血液中的浓度超过50nM。施用2小时内达到了化合物I在血液中的最大浓度。
在另一实验中,在健康志愿者中(N=6)在50mg BID给药的第7天测定了平均化合物I浓度。如图24B全血嗜碱性粒细胞激活分析中所测定的,平均谷浓度高于PI3Kδ的EC50,平均峰浓度低于PDKγ的EC50。该实施例证明以50mg BID施用的化合物I的浓度范围处于以下水平:在全血中至少12小时高于ED50PI3Kδ嗜碱性粒细胞激活水平但低于最小ED50PI3Kγ嗜碱性粒细胞水平激活水平。
下面表1提供了研究中受试者的总结,其中以变化的量给受试者施用单剂量(SD)或多剂量(MD)式I化合物。“n”值指每组中受试者的数目。
表1
组 |
方案 |
化合物I |
安慰剂 |
1(n=8) |
SD |
17mg(n=6) |
安慰剂(n=2) |
2(n=8) |
SD |
50mg(n=6) |
安慰剂(n=2) |
3(n=8) |
SD |
125mg(n=6) |
安慰剂(n=2) |
4(n=8) |
SD |
250mg(n=6) |
安慰剂(n=2) |
5(n=8) |
SD |
400mg(n=6) |
安慰剂(n=2) |
6(n=8) |
MD |
50mg BID×7d(n=6) |
安慰剂BID×7d(n=2) |
7(n=8) |
MD |
100mg BID×7d(n=6) |
安慰剂BID×7d(n=2) |
8(n=8) |
MD |
200mg BID×7d(n=6) |
安慰剂BID×7d(n=2) |
实施例12
对患有套细胞淋巴瘤患者体内损伤的影响
该实施例提供了涉及用式I化合物治疗1个周期(28天)后患有套细胞淋巴瘤患者的损伤面积的数据。在治疗前和治疗1个周期后测量了6个损伤的面积。对28天口服50mg BID式I化合物的反应导致与治疗前的面积相比损伤面积的减小并且相当于肿瘤负荷减少了44%。图12中的柱形图总结了结果。
实施例13
患有CLL的患者对治疗的反应
该实施例提供涉及口服式I化合物治疗1个周期(28天)后患有CLL患者的血液中淋巴细胞绝对数(ALC)的浓度的数据。在完成1个周期治疗后4周期间测定血液ALC浓度。观察到作为治疗的结果,淋巴细胞增多减少了55%,***病减少了38%。在第1周和第2周之间观察到ALC浓度的显著下降,图13。
实施例14
淋巴瘤患者与健康志愿者的比较
该实施例提供了比较淋巴瘤患者与正常健康志愿者中的式I化合物浓度的数据。在患有套细胞淋巴瘤的患者口服50mg BID化合物的第28天,服药后6小时期间测定血液中化合物的浓度。还观察了正常健康志愿者口服50和100mg在服药第7天时的浓度。图14总结了结果。因此,化合物在治疗周期过程中没有过度积累,患者也没有由于治疗周期过程中新陈代谢增加而变得耐受。
实施例15
化合物I在各种激酶中的活性
该实施例说明化合物I对表2中总结的几类激酶的IC50情况。尽管对p110δ尤其有效,但由于所阐明的化合物的高NOAEL水平,化合物I对p110γ也有活性,甚至在无毒剂量下对p100β是治疗上有用的;同时对II-V类磷酸肌醇激酶几乎没有显示出活性。因此在对δ具有选择性的同时,化合物可对p110γ显示足够的活性从而是临床上有用的,即对依赖p110γ进行信号转导的癌症有效,因为可达到对抑制p110γ有效的剂量以上的血浆水平同时相对其它同种型特别是α同种型仍具有选择性。
表2
InvitroGen Adapta assay
*ND=未测定
实施例16
化合物I在kinome范围的蛋白激酶筛选中没有脱靶活性
该实施例证明化合物I在kinome范围的蛋白激酶筛选中几乎没有或没有脱靶活性。采用Ambit KINOMEscanTM,超过350个蛋白激酶的基因组范围筛选在10μM处没有检测到任何活性。下面表3显示了筛选中一些激酶的实例。
表3
实施例17
化合物I对p110δ的选择性
如在基于同种型特异性细胞分析中所测得的,该实施例证明化合物I对p110δ具有选择性。
将Swiss-3T3成纤维细胞和RAW-264接种在96孔组织培养板上并使其达到至少90%汇合。使细胞挨饿并用载体或系列稀释的化合物I处理2小时,用PDGF或C5a分别刺激。通过ELISA测定Akt磷酸化和总AKT。在加入纯化的山羊抗人IgM之前在室温下用载体或系列稀释的化合物I处理纯化的B细胞30分钟。结果以由IgM交联诱导的相对[3H]腺苷掺入来表示。
表4
实施例18
p110δ在白血病和淋巴瘤细胞系中的表达
该实施例证明PI3K p110δ在宽范围的白血病和淋巴瘤细胞系中被高度表达。
PI3K p110δ在宽范围的白血病和淋巴瘤细胞系中促进增殖和存活。在研究的细胞类型中是MCL、DLBCL、AML、ALL和CML。
图15证明了PI3K p110α、β、γ和δ在一组淋巴瘤和白血病细胞系中的表达。通过SDS-PAGE对来自106个细胞的蛋白质进行分离并采用对α、β、γ和δ同种型特异性的抗体通过Western免疫印迹进行分析。经纯化的重组p110蛋白用作对照。抗肌动蛋白被用于评价样品的等同上样。p110δ始终以高水平表达,而其它p110同种型变化很大。如Sujobert等人,Blood2005106(3),1063-1066所讨论的,已知PI3K p110δ在患者AML细胞中均匀表达。
实施例19
化合物I对p110δ的抑制作用
实施例19说明化合物I对p110δ的抑制阻断了具有组成型通路激活的白血病和淋巴瘤细胞系中的PI3K信号转导。
PI3K通路经常在白血病和淋巴瘤细胞系中失调。48%的细胞系或27种细胞系中的13种被发现具有组成型p-AKT。此外,PI3K通路激活依赖于p110δ。发现化合物I在全部13种细胞系中抑制组成型AKT磷酸化。
图9的PAGE结果证明在包括B细胞和T细胞淋巴细胞的11种细胞系中由于化合物I的存在而抑制了组成型AKT磷酸化。用10μM化合物I培养细胞2小时。将细胞裂解物在SDS-PAGE上电泳,转移到PDVF膜上,用适合的抗体探测。发现化合物I在全部11种细胞系中抑制组成型AKT磷酸化。图27显示T-ALL和B-ALL细胞系的另外的细胞系数据。通过密度测定对暴露于一定浓度范围化合物I(0.1μM至10μM)后的Akt和S6磷酸化的减少进行定量,以百分变化表示,图28。
实施例20
化合物I在白血病细胞系中抑制增殖和凋亡
实施例20证明化合物I在白血病细胞系中抑制增殖和诱导细胞凋亡。图16A-B显示用化合物I处理24小时以剂量依赖的方式减小细胞存活率。
在10%FBS血清存在下对生长的ALL细胞系增殖分析和测定在24小时进行。在96孔板中一式三份的孔中测定增殖。化合物I对PI3K信号转导的抑制导致细胞周期进展的阻断和/或细胞死亡。在6种白血病细胞系中的每一种中,10微摩尔浓度的化合物I使存活率降低了40-50%,图16A。
化合物I对凋亡的诱导。用DMSO(载体)、1μM或10μM化合物1处理细胞24小时。通过膜联蛋白V-FITC/7AAD染色测定凋亡细胞的百分比。图16B显示代表给出相似结果的不同实验的一个实验。
实施例21
p110δ在CLL细胞中的表达
该实施例证明在患者CLL细胞中PI3K p110δ和p110δ同种型的表达。
CLL中已涉及PI3K介导的信号转导通路。这些通路在细胞增殖、防止细胞凋亡和细胞迁移中起作用。已进行努力以确定患者CLL细胞中PI3K同种型表达。
下面在表5中总结了CLL患者人口统计数据。
表5CLL患者人口统计数据(总共N=24)
I)细胞遗传异常 |
|
13q14.3 |
58% |
11q22.3 |
33% |
17p13.1 |
20% |
三体性12 |
12% |
II)治疗历史 |
|
氟达拉滨难治的 |
29% |
未知的 |
54% |
II)IgVH状态 |
|
突变的 |
33% |
未突变的 |
33% |
未知的 |
33% |
图17A-D的PAGE图像比较了p110α、p110δ、p110β和p110γ在患者A-E的CLL细胞中的表达。与其它PI3K同种型相比,p110δ和p110γ在每个患者中被表达。
实施例22
化合物I诱导胱天蛋白酶3和PARP裂解
该实施例证明化合物I诱导胱天蛋白酶3和PARP裂解。图18A-B显示在1、10μM化合物I或25μM LY294002存在下胱天蛋白酶3和PARP(聚(ADP)核糖聚合酶)裂解的结果。
进一步的实验提供化合物I诱导胱天蛋白酶2和PARP裂解的证据。用化合物I或单独的载体培养细胞24小时。之后,使细胞裂解、大小分级分离并用针对FLIP的抗体进行免疫印迹,图29。另外,将全细胞裂解物加入到用总胱天蛋白酶-3、裂解的胱天蛋白酶-3、裂解的PARP和BSA包被的MDS(Meso Scale Diagnostics)多点96孔4点板中。用标记有SULFO-TAG试剂的抗体检测蛋白质并对其进行定量。在暴露于5或10μM化合物I后得到了胱天蛋白酶3和PARP裂解的剂量依赖性反应。
实施例23
化合物I阻断PI3K信号转导
该实施例证明化合物I阻断患者AML细胞中的PI3K信号转导。PI3Kδ参与AML患者细胞中的信号转导。图21显示不存在或存在0.1、1.0、10μM化合物I下磷酸-Akt产生的结果。这提供了化合物I减少患者AML细胞中磷酸-Akt的产生的证据。
实施例24
建立嗜碱性粒细胞的全血中PI3K信号转导的测量
该实施例证明通过诱导CD63表面表达采用流式细胞术测量嗜碱性粒细胞中PI3K信号转导的全血分析。
嗜碱性粒细胞中PI3K信号转导的抑制允许化合物I成为有用的药效学标记物。PI3K信号转导通过CD63表面表达来监测。特别而言,p110δ介导FCεR1信号转导并且p110γ介导fMLP受体信号转导。在嗜碱性粒细胞上PI3K介导的CD63的表达包括以下顺序步骤:
1.收集外周血
2.嗜碱性粒细胞刺激(fMLP或抗FCεR1单抗)
3.标记嗜碱性粒细胞(抗CCR3-FITC和抗CD63-PE)
4.使细胞裂解和固定
5.通过流式细胞术分析
图22A-C比较了A)没有刺激、B)用抗FCεR1刺激或C)用fMLP刺激的结果。
图23显示化合物I在p110δ介导的信号转导最重要的情况下尤其有活性,而在使用p110γ的情况下相对有活性:对于p110δ试验在<<1μM下获得了SD63表达减少50%,而对于p110γ试验为约10μM。采用Flow2试剂盒测定了人全血中嗜碱性粒细胞激活。在用抗FCεR1单抗或fMLP激活嗜碱性粒细胞之前用载体或系列稀释的化合物I处理全血样品。用抗人CD63-FITC和抗人CCR3-PE单抗的组合对细胞进行染色。测定了不同处理组中门控的嗜碱性粒细胞群中CD63阳性细胞百分比并将其对载体对照归一化。
实施例25
化合物I减少CLL患者中的***病
该实施例提供具有del[17p]的CLL患者体内大的***肿大的尺寸减小的证据。具有del(17p)的患者患有腋下***病,其通过计算机断层摄影(CT)成像提供了5.9cm x 4.1cm的基线测量,图40A。用化合物I治疗1个周期后,***肿大减小至3.8x 1.8cm的尺寸,图40B。1个治疗周期是连续口服28天200mg BID或350mg BID的化合物I。
实施例26
化合物I对受试者体内葡萄糖和胰岛素水平的有限影响
该实施例证明用化合物I治疗对葡萄糖和胰岛素水平有很小的或没有影响。以50-200mg量BID给受试者施用化合物I达10天。如图25A-B所示随时间测定了血液葡萄糖和胰岛素浓度并将其与安慰剂结果比较。
血液葡萄糖浓度即使在用最高剂量的化合物I治疗10天后也保持稳定。胰岛素水平在用化合物I治疗7天后保持在正常范围内。这提供了化合物I对葡萄糖和胰岛素水平有很小的或没有影响的证据。
实施例27
材料和方法
该实施例提供进行实施例28-35所述的实验的材料和方法的信息,这些实验涉及使用化合物I治疗多发性骨髓瘤。
材料
p110δ抑制剂化合物I和化合物II由Calistoga Pharmaceuticals(西雅图,华盛顿州)提供。所用的化合物I和II的样品超过95%S对映体。化合物I以10mM被溶解于二甲亚砜中并在-20℃下储存用于体外研究。化合物II被溶解于1%羧甲基纤维素(CMC)/0.5%吐温80并在4℃下储存用于体内研究。用含0.1%BSA的无菌磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)对重组人p110α、β、γ和δ进行重建。硼替佐米由Millennium Pharmaceuticals(剑桥,莫萨诸塞州)提供。3-甲基腺嘌呤购于Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州)。
细胞培养
Dex-敏感(MM.1S)和抵抗的(MM.1R)人MM细胞系由Steven Rosen博士(西北大学,芝加哥,伊利诺州)友情提供。H929、RPMI8226和U266人MM细胞系获自美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)(马纳萨斯(维吉尼亚州)。抗美法仑RPMI-LR5和抗阿霉素(Dox)RPMI-Dox40细胞系由William Dalton博士(Lee Moffitt Cancer Center,坦帕,佛罗里达州)提供。OPM1浆细胞白血病细胞由Edward Thompson博士(德克萨斯大学医学部,加尔维斯敦)提供。IL-6-依赖性人MM细胞系INA-6由Renate Burger博士(基尔大学,基尔,德国)提供。LB人MM细胞系是在实验室中构建的。表型分析显示没有细胞遗传异常。表6显示了表型分析。LB细胞系的CD表达谱由流式细胞术分析确定。
表6
LB表达
所有的MM细胞系都在RPMI l640培养基中培养。骨髓基质细胞(BMSC)在含15%胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺(Life Technologies)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素(Life Technologies)的Dulbecco′s改良的Eagle′s培养基(DMEM)(Sigma)中培养。通过Ficoll-PaqueTM梯度处理从人志愿者采集的血样,获得外周血单核细胞(PBMNC)。根据赫尔辛基宣言和Institutional Review Board of the Dana-Farber Cancer Institute(波士顿,马萨诸塞州)的批准获得知情同意书后,从BM样品得到患者MM和BM细胞。采用Ficoll-PaqueTM密度沉降法分离BM单核细胞,通过具有抗CD138磁激活细胞分离微珠(Miltenyi Biotec,奥本,加利福尼亚州)的正选择纯化浆细胞(>95%CD 138+)。还采用RosetteSep负选择***(StemCellTechnologies,温哥华,不列颠哥伦比亚,加拿大)从MM患者的BM纯化肿瘤细胞。
生长抑制分析
通过测定溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四钠(MTT;Chemicon International,特曼库拉,加利福尼亚)染料吸收评价化合物I对MM细胞系、PBMC和BMSC生长的生长抑制作用。
化合物I对BM中旁分泌MM细胞生长的影响
在药物存在或不存在下,在BMSC包被的96-孔板(Costar,剑桥,马萨诸塞州)中培养MM细胞(2x 104个细胞/孔)48小时。在48小时培养的最后8个小时期间加入[3H]-胸苷(0.5μCi/孔),通过[3H]-胸苷(Perkin-Elmer,波士顿,马萨诸塞州)吸收测定DNA合成。所有实验进行一式四份。
p110δ表达的瞬时敲除
使用细胞系核转染试剂盒V(Amaxa Biosystems,盖瑟斯堡,马里兰州)用siRNA ON-TARGET plus SMART库p110δ或非特异性双重对照(Dharmacon Lafayette,Co)瞬时转染INA-6细胞和LB细胞。
免疫荧光
通过使用细胞离心涂片器***(Thermo Shandon,匹兹堡,宾夕法尼亚州)在500rpm下离心5分钟将活的MM细胞(2.5X104)沉淀到载玻片上。在冷的无水丙酮和甲醇中固定细胞10分钟。固定后,在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中洗涤细胞,然后用PBS中的5%FBS封闭60分钟。然后在4℃下用抗CD138抗体(Santa Cruz Biotechnology,圣塔克鲁兹,加利福尼亚州)孵育载玻片24小时,在PBS中洗涤,在4℃下用山羊抗小鼠IgG孵育1小时,用Nikon E800荧光显微镜分析。
用吖啶橙染色的酸性囊状细胞器(AVO)的检测和定量
自吞噬的特征在于细胞质蛋白的隔离与AVO的生成。为了检测和定量化合物I或3MA处理的细胞中的AVO,用1μg/ml最终浓度的吖啶橙进行活体染色15分钟。在荧光显微镜下检查样品。
血管发生分析
使用体外血管发生分析试剂盒(Chemicon,Temecula,CA)测定化合物I的抗血管发生活性。HUVEC和血管内皮细胞生长培养基得自Lonza(沃克斯维尔,马里兰州,美国)。在37℃下在聚合基质凝胶上用化合物I培养HUVEC。8小时后,使用Leika DM IL显微镜(Leica Microsystems,韦茨拉尔,德国)评价血管发生并用IM50软件(Leica Microsystems ImagingSolutions,剑桥,英国)分析。使HUVEC细胞迁移和重排可视化,对分支点的数量计数。
蛋白质印迹
用或不用化合物I培养MM细胞;收集;洗涤;用放射免疫沉淀分析(RIPA)缓冲液、2mM Na3VO4、5mM NaF、1mM苯甲基磺酰氟化物(5mg/ml)使细胞裂解。使全细胞裂解物经历十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,转移至纯硝酸纤维素膜(Bio-Rad Laboratories,Hercules,加利福尼亚州),用抗AKT、磷酸(p)-AKT(Ser473、Thr 308)、ERK1/2、P-ERK1/2、P-PDKl、STAT、P-STAT、P-FKRHL、P-70S6K、LC3和PI3K/p110αAbs(Cell Signaling Danvers,MA);抗p110β、PI3K/p110δ、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、α-微管蛋白和肌动蛋白Abs(Santa Cruz Biotechnology,CA);和抗p110γAb(Alexis,圣地亚哥,加利福尼亚州)及抗LC3Ab(Abgent,圣地亚哥,加利福尼亚州)进行免疫印迹。
ELISA
通过ELISA评价与MM细胞共同培养的人BMSC的细胞因子分泌。有或没有INA-6细胞的情况下,用变化浓度的化合物I在96孔板中培养BMSC。48小时后,收集上清液并在-80℃下储存。使用Duo set ELISADevelopment Kit(R&D Systems,Minneapolis,MN)测定细胞因子。所有的测定进行一式三份。
人细胞因子阵列
使用Proteome Profiler Antibody Arrays Panel A(R&D Systems,Minneapolis,MN)评价培养上清液中的细胞因子水平。根据制造商的使用说明,用排列有抗37种细胞因子的Abs的膜孵育与BMSC共同培养的上清液4小时。
人MM的鼠异种移植物模型
CB 17SCID小鼠(48-54天龄)购自Charles River Laboratories(威尔明顿,马萨诸塞州)。根据达纳-法伯癌症研究所的动物伦理委员会批准的协议进行所有的动物研究。用100μL RPMI-1640中的3X106LB细胞在右侧腹皮下接种小鼠。当肿瘤可触知时,将小鼠分到每天两次接受10mg/kg或30mg/kg管饲的治疗组;对照组中的7只小鼠只接受载体。每隔一天进行最长垂直肿瘤直径的卡尺测量以使用表示椭圆3D体积的下式估算肿瘤体积:4/3X(宽度/2)2X(长度/2)。当肿瘤达到2cm或小鼠看起来濒死时将动物处死。从第一天治疗到死亡对存活率进行评价。从第一天治疗到首次处死那一天(对于对照组是第12天,对于治疗组是17至19天)使用卡尺测量评价肿瘤生长。用佳能IXY 700数码相机进行照相。用LEICA DM IL显微镜和40u/0.60的LEICA DFC300FX照相机((Leica,海德尔堡,德国)捕获肿瘤图像的离体分析。
将人胎儿骨移植物移植到CB 17SCID-小鼠(SCID-hu)。骨移植后4周,将2.5X 106INA-6细胞以100μl RPMI-1640培养基的终体积直接注射到移植物中的人BM腔。来自INA-6细胞的可溶性人IL-6受体(shuIL-6R)水平的增加被用作MM细胞生长和SCID-hu小鼠中疾病负荷的指标。INA-6细胞注射后约4周小鼠产生可测量的血清shuIL-6R,然后每天接受10或30mg/kg药物或单独的载体达7周。采集血样,采用酶联免疫吸附测定(ELISA,R&D Systems,明尼阿波利斯,明尼苏达州)评价shuIL-6R水平。
统计学分析
通过Dunn′s多比较检验确定统计学显著性。最小显著性水平是p<0.05。采用Kaplan-Meier曲线和log-rank分析评价存活率。采用CalcuSyn软件程序(Biosoft,Ferguson,密苏里州)通过等效线图解法分析来分析化合物I与硼替佐米的组合作用;组合指数(CI)<0.7表明协同作用。
实施例28
p110δ在MM细胞中的表达
该实施例证明p110δ在患者MM细胞中高度表达。为了评价PI3K/p110表达,使用针对重组人PI3K/p110α、β、γ和δ蛋白的Abs,其对这些同种型具有特异免疫反应性。对p110δ在11种MM细胞系(MM.1S、OPM1、OPM2、RPMI8226、DOX40、LR5、MM.1R、U266、INA-6、H929和LB)中的表达以及24个患者MM样品进行了评价,图30A和30B显示了免疫印迹。图30A显示使用特异性抗体通过免疫印迹检测的p110-α、-β、-γ和-δ在MM细胞系中的表达。抗α微管蛋白单抗用作上样对照。采用抗p110δAb通过免疫印迹检测患者MM细胞中的p110δ(图30B)。
抗GAPDH单抗用作上样对照。INA-6和LB细胞强烈表达p110δ,而MM.1S、OPM1、MM.1R、Dox40、U266或H929缺乏p110δ表达(图30A)。
通过免疫荧光分析(图30C)证明了MM.1S和LB细胞中的p110δ表达。在加到凝胶(每个泳道10-20μg)之前将SDS样品缓冲液中的人重组p110-α、-β、-γ、-δ蛋白加热3分钟。通过免疫印迹分析检测重组人p110-α、-β、-γ、-δ蛋白。采用p110δ特异性FITC缀合的二级抗体测定MM1S和LB细胞中的p110δ水平。p110δ染成绿色,核酸(DAPI)染成蓝色。
蛋白质印迹揭示p110δ表达和其它同种型(α、β和γ)表达之间没有相关性。重要的是,所有患者MM细胞都表达p110δ(图30B)。
实施例29
化合物I对MM细胞的细胞毒性
该实施例证明化合物I对带有p110δ的细胞具有选择性细胞毒性。具体而言,化合物I在p110δ阳性MM细胞以及原代患者MM细胞中强效地诱导细胞毒性,而在健康供体的外周血单核细胞中没有细胞毒性,表明了有利的治疗指数。
评价了在MM细胞中p110δ敲除的生长抑制作用。用P110δsiRNA(Si)或对照siRNA(模拟物)转染LB和INA-6细胞。24小时后,通过蛋白质印迹分析确定P110δ的表达,见图31A。用p110δsiRNA或对照siRNA转染INA-6细胞,然后培养72小时。通过MTT测定评价细胞生长,见图31B。数据指出一式三份培养物的平均值±SD,以对照的倍数表示。用p110δsiRNA而不是模拟siRNA转染在72小时下调了p110δ并抑制了MM细胞生长(图31A和31B)。评价了p110δ特异性小分子抑制剂化合物I在MM细胞系、PBMC和患者MM细胞中的生长抑制作用。
化合物I以剂量和时间依赖的方式诱导对LB和INA-6MM细胞(P110δ阳性)的细胞毒性;相反,在P110δ阴性细胞系中记录了极小的细胞毒性(图31C)。图31C的图例:用或不用化合物I培养LB(□)、INA-6(△)、RPMI 8226(○)、OPM2(◇)、H929(●)、U266(◆)、RPMI-LR5(▲)和OPM1(■)MM细胞48小时。
重要的是,化合物I还诱导对患者MM细胞的细胞毒性(图31D),在高达20μM浓度下在4个健康志愿者的PBMC中无细胞毒性(图31E)。用化合物I培养通过负选择从BM分离的患者MM细胞48小时。用化合物I培养从健康供体分离的外周血单核细胞72小时。数据表示通过一式三份培养物的MTT分析评价的平均值±SD存活率,以未处理对照的百分比表示。这些结果强有力地表明化合物I的灵敏度与P110δ表达有关,并且表明有利的治疗窗。
为了确定化合物I诱导的细胞毒性是否通过细胞凋亡进行,通过蛋白质印迹分析检测了胱天蛋白酶和PARP的裂解。用化合物I(0-5μM)培养INA-6细胞120小时。使用抗胱天蛋白酶-3、-8、-9、PARP和α-微管蛋白Abs对总细胞裂解物进行免疫印迹。FL指全长蛋白,CL指裂解的蛋白。用化合物I处理120小时的INA-6MM细胞中观察到胱天蛋白酶-8、胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-3和PARP的裂解显著增加(图31F)。这些结果表明由化合物I触发的细胞毒性至少部分通过胱天蛋白酶-依赖的(固有的和外部的)细胞凋亡介导。
实施例30
化合物I抑制AKT和ERK磷酸化
该实施例证明化合物I抑制AKT和ERK的磷酸化。
PI3K的一个重要的下游效应物是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT,其通过磷酸化激酶结构域激活环中的Thr308和在C-端尾的Ser473被激活。两个位点的磷酸化都需要AKT的N-末端普列克底物蛋白同源结构域与PI3K产生的膜磷酸肌醇之间的相互作用。显示化合物I抑制两个结构域,表明P110δ是负责MM细胞系中PI3K信号转导的主要同种型。
检查了化合物I对INA-6细胞中的AKT和ERK途径的抑制。用化合物I或LY294002培养INA-6细胞12小时,图32A。肌动蛋白Ab用作上样对照。用化合物I(0、0.25、1.0、5.0μM)培养INA-6和MM.1S细胞6小时,图32B。用化合物I培养LB和INA-6细胞0-6小时,图32C。使用AKT、P-AKT(Ser473和Thr308)、ERK1/2、P-ERK1/2、P-PDK1和P-FKRHL抗体对全部细胞裂解物进行免疫印迹。α-微管蛋白用作上样对照。
化合物I在P110δ阳性的INA-6细胞中显著阻断AKT和ERK1/2的磷酸化(图32A),而没有影响具有P110δ低表达的MM.1S细胞中AKT或ERK的磷酸化(图32B)。化合物I还以时间和剂量依赖的方式显著抑制INA-6和LB细胞中的上游PDK-I和下游FKHR的磷酸化L(图32C),从而进一步证明这些细胞中PI3K/AKT和ERK途径的抑制。
实施例31
化合物I诱导AVO形成和自吞噬
该实施例证明化合物I触发细胞凋亡和自吞噬的能力。
AKT调节自吞噬,因此进行了化合物I在LB和INA-6MM细胞中诱导自吞噬的研究。
用5μM化合物I处理INA-6和LB MM细胞6小时。荧光显微术或透射电镜证明,化合物I处理诱导在LB和INA-6细胞中LC3的积累。通过LC3的积累定义自噬体形成;箭头指出自噬体,图33A。
用5μM化合物I或血清饥饿处理INA-6细胞6小时,用1μg/mL吖啶橙染色15分钟,用荧光显微镜分析,图33B。
在用或不用3-MA下,使用来自用化合物I处理的INA-6细胞的裂解物的LC3和beclin-1抗体通过蛋白质印迹测定LC3和beclin-1蛋白水平,图33C。GAPDH用作上样对照。
免疫荧光分析显示化合物I(5μM,6h)处理触发了INA-6和LB细胞中LC3染色的显著增加(图33A)。电镜分析也显示用化合物I处理的MM细胞中自吞噬泡的增加。由于自吞噬的特征在于酸性囊状细胞器(AVO)形成,所以进行了吖啶橙染色。如图33B所示,用吖啶橙的活体染色揭示化合物I处理的LB和INA-6细胞中AVO的形成。而且,用化合物I处理6小时后在INA-6MM细胞中检测到LC3-II和Beclin1蛋白的显著增加,其被3-MA自吞噬抑制剂阻断(图33C)。
高达100μM浓度的3-MA没有在INA-6和LB细胞中诱导细胞毒性,图33D。用3-MA(0-100μM)处理P110δ阳性LB细胞(◆)24小时。数据表示三份培养物的平均值(±SD)。
这些结果表明与诱导胱天蛋白酶/PARP裂解相比,化合物I在较早的时间点诱导AVO的形成和自吞噬。
自吞噬降解细胞成分,使细胞成分再循环并对多种细胞应激作出应答。在该实施例中,在p110δ阳性的MM细胞系中通过化合物I处理诱导自吞噬的标志LC3-II。重要的是,化合物I处理导致自吞噬的显著增加,由细胞质中自吞噬泡的存在、AVO的形成、LC3的微管相关蛋白I与自噬体的膜结合和LC3-II蛋白的显著诱导所证明的。电镜分析证明化合物I诱导自噬体。LC3-II通过LC3-I转化表达。相反,由化合物I诱导的自吞噬被3-MA抑制,3-MA是自吞噬的特异性抑制剂。这些研究表明化合物I的早期细胞毒性作用与自吞噬有关。
实施例32
在BMSC存在下化合物I抑制细胞生长
该实施例证明化合物I与BMSC抑制旁分泌MM细胞生长的能力。
因为IL-6和IGF-I在MM细胞中诱导生长和抗凋亡,所以检测了化合物I在INA-6和LB MM细胞中克服这些细胞因子的作用。在存在或不存在IL-6(1和10ng/ml)(图34A)、或存在或不存在IGF-I(10和100ng/mL)的情况下,用对照培养基(■)或用5.0μM或10μM(□)的化合物I培养LB和INA-6细胞48小时。通过测定72小时培养的最后8小时期间[3H]-胸苷掺入来确定DNA合成。数据表示一式三份培养物的平均值(±SD)。IL-6或IGF-I均没有防止化合物I诱导的生长抑制(图34A和34B)。
BM微环境赋予MM中增殖和耐药性,因此在BMSC存在下检测了化合物I的MM细胞生长抑制作用。
在BMSC存在或不存在下,用对照培养基(□)和2.5μM5μM及10μM(■)化合物I培养LB和INA-6MM细胞48小时,图34C。通过[3H]-腺苷掺入测定DNA合成,数据表示一式三份培养物的平均值(±SD)。
通过ELISA测定用化合物I(0-2.5μM)处理的来自BMSC的培养上清液中的IL-6,图34D。误差线表示SD(±)。
用1.0μM化合物I或对照培养基培养BMSC48小时;采用细胞因子阵列检测培养上清液中的细胞因子,图34E。
用化合物处理用或不用BMSC培养的INA-6细胞48小时。使用指定的抗体对总的细胞裂解物进行免疫印迹,图34F。肌动蛋白用作上样对照。
用化合物I(0-20μM)培养来自2个不同患者(□,◇)的BMSC 48小时。通过MTT分析评价细胞存活率,图34G。值表示一式三份培养物的平均值±SD。
重要的是,化合物I抑制由BMSC诱导的生长和细胞因子分泌(图34C-E)以及AKT和ERK的磷酸化(图34F)。相反,没有观察到BMSC的显著生长抑制(图34G)。这些结果表明化合物I在BM微环境中阻断旁分泌MM细胞生长。
实施例33
化合物I抑制血管发生性HuVEC小管形成
该实施例证明化合物I抑制HuVEC小管形成的能力。研究了PI3K特别是p110同种型在血管发生中的作用。内皮细胞是用于肿瘤生长的血管发生的必不可少的调节剂。Akt和ERK途径与内皮细胞生长和血管发生的调节有关;并且重要的是,内皮细胞表达p110δ。该实施例还证明化合物I在体外阻断与Akt磷酸化的下调有关的毛细血管样管形成。
研究了p110δ抑制对血管发生的作用。用0、1.0或10μM化合物I处理HuVEC 8小时,评价了由内皮细胞引起的管形成(图35A)。在化合物I存在或不存在下,将HuVEC细胞平板接种在Matrigel包被的表面上并历经8小时使其形成小管。通过显微镜分析测定内皮细胞管形成,图35B。*P<0.005。
用化合物I(0-20μM)培养HuVEC 48小时,通过MTT分析评价存活率,图35C。显示的数据是代表性实验的一式三份孔的平均值±SE。所以,化合物I以剂量依赖的方式抑制毛细血管样管形成(p<0.05)(图35B),没有相关细胞毒性(图35C)。
用化合物I处理显著下调了HuVEC细胞中AKT和ERK1/2的磷酸化和表达。用化合物I(0-200μM)培养HuVEC达8小时,使用指定抗体通过免疫印迹分析细胞裂解物,图35D。肌动蛋白用作上样对照。
这些发现表明化合物I可抑制与AKT和ERK活性的下调有关的血管发生。
实施例34
化合物II在体内抑制MM细胞生长
该实施例证明化合物II在体内抑制人MM细胞生长的能力。
在异种移植物模型中评价p110δ抑制剂的体内功效,在该模型中用人MM细胞皮下注射SCID小鼠。
用对照载体(·)和化合物II 10mg/kg(□)或30mg/kg(○)每天两次经口治疗注射有5x106LB细胞的小鼠。如材料和方法中所述计算平均肿瘤体积,图36A。误差线表示SD(±)。
用对照载体(上图)或化合物II(30mg/kg)(下图)治疗12天的小鼠的代表性全身图像,图36B。
使用CD31和P-AKT Abs对从经化合物II(30mg/kg)治疗的小鼠(右图)和对照小鼠(左图)获得的肿瘤进行免疫组织化学分析。CD31和P-AKT阳性细胞呈深棕色,图36D。
用化合物II 10mg/kg(--)、30mg/kg(...)或对照载体(-)治疗小鼠。采用Kaplan-Meier曲线评价从治疗第一天到处死的存活率,图36C。
从用对照载体或化合物II(30mg/kg)治疗的小鼠获得肿瘤组织。通过细胞裂解物的蛋白质印迹测定PDK-I和AKT(Ser473)磷酸化的蛋白水平,图36E。肌动蛋白用作上样对照。
通过shuIL-6R的连续血清测量监测移入SCID小鼠中人骨碎片中INA-6细胞的生长。用化合物II 10mg/kg(□)、30mg/kg(A)或对照载体(·)治疗小鼠,通过ELISA每周测定shuIL-6R水平,图36F。误差线表示SD(±)。
与对照小鼠(n=7)相比,治疗组(n=7)中化合物II(p110δ抑制剂)显著减少MM肿瘤生长。肿瘤体积的比较显示对照与治疗组之间的统计学显著差别(对10mg/kg,P<0.05;对30mg/kg,P<0.01)(图36A)。在第12天观察经治疗与对照小鼠相比肿瘤生长的显著减少(图36B)。Kaplan-Meier曲线和log-rank分析显示平均总存活率(OS)如下,对照小鼠为15天(95%置信区间,12-17天),10mg/kg和30mg/kg化合物II治疗组分别为23天(95%CI,15-34天)和32天(95%CI,27-49天)。还观察到治疗组(对10mg/kg,P=0.086;对30mg/kg,P=0.056)中与对照小鼠相比平均OS的统计学显著延伸(图36C)。重要的是,只用载体或用化合物II治疗没有影响体重。此外,免疫组织化学(图36D)和免疫印迹(图36E)分析证明化合物II治疗(30mg/kg)显著抑制p-Akt和p-PDK-1,并且显著减少CD31阳性细胞和微血管密度(p<0.01)(图36D)。这表明化合物II可通过抑制Akt途径在体内抑制血管发生。
为了检测化合物II在体内人BM微环境中对MM细胞生长的活性,使用SCID-hu模型,其中IL-6依赖性INA-6细胞被直接注射到皮下植入SCID小鼠的人骨碎片中。该模型概括了具有INA-6人MM细胞的人IL-6/BMSC-依赖性生长的人BM微环境。用化合物II或单独的载体处理这些SCID-hu小鼠4周,监控血清SCID-hu作为标记肿瘤负荷。如图36F所示,与载体对照相比化合物II处理显著抑制了肿瘤生长。由INA-6细胞释放的血清shuIL-6R水平降低所证明的,观察到该模型中显著的肿瘤生长抑制,从而证明p110δ抑制在体内阻断了BM微环境的MM生长促进活性。总体而言,这些数据证明化合物II对p110δ的抑制显著抑制了体内MM生长并延长了存活。
实施例35
化合物I与硼替佐米组合显示出协同细胞毒性
该实施例证明化合物I与硼替佐米组合介导协同MM细胞毒性的作用。
研究了化合物I与硼替佐米组合在诱导协同MM细胞毒性中的作用。在硼替佐米(0-5nM)存在或不存在下,用培养基(■)和用化合物I 1.25μM2.5μM或5.0μM(□)培养LB和INA-6MM细胞。通过MTT分析评价细胞毒性;数据表示一式四份培养物的平均值±SD,图37A。
用化合物I(5μM)和/或硼替佐米(5nM)处理INA-6细胞6小时。使用磷酸AKT(ser473)抗体通过细胞裂解物的蛋白质印迹测定AKT的磷酸化,图37B。肌动蛋白用作上样对照。
化合物I增强了硼替佐米的细胞毒性。增加添加到硼替佐米(2.5,5.0nM)中的化合物I的浓度(1.5-5.0μM)触发了LB和INA-6MM细胞中的协同细胞毒性(图37A和表7)。重要的是,在化合物I存在下抑制了由硼替佐米处理引起的磷酸Akt的诱导(图37B)。
表7
组合指数(CI)
实施例36
化合物I在滤泡型淋巴瘤细胞系中有效
该实施例提供化合物I在滤泡型淋巴瘤细胞中阻断PI3K信号转导和诱导凋亡的证据。如图38A所示,p110δ在FL细胞系中被表达。当细胞暴露于化合物I时,某些细胞系显示pAkt、Akt、pS6和S6产生的减少,图38B。暴露于0.1μM和0.5μM化合物I后24小时观察到PARP和胱天蛋白酶-3的剂量依赖方式的裂解。
实施例37
化合物I在原代MCL细胞中有效
该实施例证明化合物I对MCL有效。当暴露于0.1μM或1μM化合物I时,发现化合物I在两个患者的原代MCL细胞中以剂量依赖方式阻断组成型PI3K信号转导,图39A。还观察到化合物I在MCL细胞系中抑制存活因子和趋化因子信号转导。图39B显示在化合物I存在下暴露于不同存活因子的MCL系中pAkt的显著减少。