CN102268421A - 一种β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种能够分解乳糖的在高温和低温条件下都具备很强活性的β-葡萄糖苷酶，并能够高效表达的分泌型β-葡萄糖苷酶的基因工程菌。本发明公开了一种具有如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的β-葡萄糖苷酶，并构建出能高效分泌所述β-葡萄糖苷酶的基因工程菌，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNo.4891。本发明所述方法生产的β-葡萄糖苷酶具有很强的半乳糖苷酶的活性，可应用于乳品工业，同时被发明所述的β-葡萄糖苷酶在较大的pH值范围及温度范围内具有稳定的活性。

Description

一种β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种能够分解乳糖的在高温和低温条件下都具备很强活性的β-葡萄糖苷酶，并能够高效表达的分泌型β-葡萄糖苷酶的基因工程菌。

背景技术

β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase，EC3.2.1.21)***名称为β-D-葡萄糖苷水解酶，属于水解酶类。它可以催化水解结合于末端非还原性的β-D-糖苷键，同时释放出配基和葡萄糖体。1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁中发现β-葡萄糖苷酶，多年来许多学者分别从苦杏仁、葡萄、刀豆、玉米、黑樱桃、水稻、大豆中分离纯化得到了β-葡萄糖苷酶。在哺乳动物的小肠粘膜上皮细胞也存在β-葡萄糖苷酶，如果该酶缺乏，将引起相应碳水化合物的吸收受到限制。β-葡萄糖苷酶广泛存在于自然界的植物、动物以及微生物中，但酶活普遍较低，且不易纯化；而通过液态发酵得到的β-葡萄糖苷酶活性也普遍较低；固态发酵生产的β-葡萄糖苷酶则成分复杂，不易提取。因此运用基因工程手段构建高效表达β-葡萄糖苷酶的基因工程菌成为当今研究β-葡萄糖苷酶的热点，并具有重要的现实意义。

β-葡萄糖苷酶的相对分子量一般在几十kDa至几百kDa之间。不同来源的β-葡萄糖苷酶的相对分子量由于其结构和组成不同而差异很大。迄今为止，β-葡萄糖苷酶主要是从曲霉菌以及部分嗜热细菌中分离得到的，从嗜热细菌中分离出β-葡萄糖苷酶具有很强的热稳定性。对于工业应用来说，酶的热稳定性越高越有利，因此从嗜热细菌中分离得到的β-葡萄糖苷酶逐渐引了人们的兴趣。美国专利US6355467B1公开了一种Pyrococcus furiosus菌种中含有的β-葡萄糖苷酶，其可以将纤维素分解得到葡萄糖，并且其耐热温度高达95℃。中国专利CN1245507C公开了一种耐高温β-葡萄糖苷酶，并通过基因工程的手段构建出一种可耐高温的新型β-葡萄糖苷酶。

β-葡萄糖苷酶它主要作用于β-(1,4)糖苷键，β-葡萄糖苷酶的生物学功能使它在生产中有着广泛的应用，同时微生物生产的β-葡萄糖苷酶种类众多，不同来源的β-葡萄糖苷酶具有多方面不同的性质，从而导致各具特色的应用范围。对于β-葡萄糖苷酶的水解作用人们早已认识，比如应用到葡萄酒、茶叶中增加香味，将纤维素降解等等。中国专利CN101619336 “一种生物催化转化生产毛蕊花糖苷的方法”就是利用β-葡萄糖苷酶的水解作用来生产毛蕊花糖苷。β-葡萄糖苷酶有7个家族组成，第1家族的高温β-葡萄糖苷酶不但具有葡萄糖苷酶活性，而且还具有很强的半乳糖苷酶的作用（Km=2.3mm,Kcat(s^-1)=2050±86），所以耐高温β-葡萄糖苷酶也称为乳糖酶，可应用于乳品工业来分解乳糖，将乳糖分解为低聚半乳糖和葡萄糖。β-葡萄糖苷酶能参与生物体的糖代谢，对维持生物体的正常生理功能起着重要作用，乳糖是肌体组织和细胞能量的主要来源，尤其是乳糖的分解产物-低聚半乳糖，改善脂质代谢，降低血清胆固醇，促进钙吸收，促进B族维生素合成，对胎儿、婴幼儿非常重要。

目前乳品及食品工业用乳糖酶主要从酵母和曲霉中得到，帝斯曼公司使用kluyveromyces lactis产生的乳糖酶的最适pH为6.6-6.8，与新鲜牛乳的天然pH相近，该酶的分子量为116KD，在35℃、pH6.2-7.0时，该酶的活性较稳定，但超出此范围其酶活迅速下降。较高浓度的Ca²⁺对酶有抑制作用，酶的水解产物半乳糖和葡萄糖均对该酶的活性有强烈的抑制作用。

现在商业用酶均为胞内酶，然而不仅产率低并且分离及纯化程序比较复杂，使得现今商业用酶的市场价格比较昂贵。同时纯度较低的酶在使用时增加许多无用的酵母蛋白，影响牛奶的质量。

在高温条件下，乳糖很容易水解。高温时酶的活性很高，在牛奶巴氏消毒或高温消毒时进行乳糖水解会得到好的结果。由于巴氏消毒或高温消毒时间较短，制备牛奶的工艺很长时间主要在低温条件下进行，为了使乳糖彻底水解，要求高温乳糖酶在低温区仍有很高的活性，以达到完全水解乳糖的目的。从食品安全性考虑，在乳业生产上加入低温酶容易引起污染，而高温酶在100℃几十个小时不会影响活性，所以乳糖酶可以被“消毒”处理，添加乳糖酶不会导致乳制品的污染。

麦芽汁培养基是做为啤酒生产的培养基，安全性可达100%，所以高温β-葡萄糖苷酶以麦芽汁作为培养基。

因此，目前来说研发一种新型乳糖酶兼具高温、低温酶活性，和建立安全、有效、经济的工业化生产工艺是研究的重点和难点。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于现有技术中的β-葡萄糖苷酶无法同时兼顾高温活性和低温活性，因而不适于中国乳业工业生产乳糖分解的问题，进而提供一种能够适用于乳制品行业的β-葡萄糖苷酶以及能够得到该β-葡萄糖苷酶的基因工程菌。

为解决上述技术问题，本发明提供一种新型的重组β-葡萄糖苷酶，其包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

本发明所述的重组β-葡萄糖苷酶可以含有信号肽，从而引导外源蛋白定位到细胞特定的空间，例如被表达的蛋白可以分泌到细胞外，进而有利于外源蛋白的纯化。

本发明还提供了一种β-葡萄糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

一种编码上述β-葡萄糖苷酶的基因，包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

一种编码上述的β-葡萄糖苷酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供了一种含有上述的β-葡萄糖苷酶基因的表达载体。

所述的表达载体为为不含抗菌素基因的载体。

所述的表达载体为重组质粒pGAPHa/β-glucosidase。

本发明还公开了一种含上述的表达载体的重组菌，所述的重组菌为生产β-葡萄糖苷酶的毕氏酵母工程菌。

所述的重组菌为生产β-葡萄糖苷酶的毕氏酵母工程菌，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏单位地址：中国.北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。其保藏编号为 CGMCC No.4891，保藏日期是2011年5月23日。

本发明还公开了一种构建重组菌的方法，将含有如SEQ ID NO:1所示的β-葡萄糖苷酶基因的表达载体导入毕氏酵母宿主菌株，并进行可操作的连接，使所述表达载体在所述宿主中有效表达。

所述的构建重组菌的方法，包括以下步骤：

(1)构建重组质粒β-glucosidase/pCR2.1，所述的重组质粒β-glucosidase/pCR2.1是目的基因pyrococcus furiosus CelB***到质粒pCR2.1中形成的重组质粒；

(2)以重组质粒β-glucosidase/pCR2.1为模板，设计如下突变引物：

371-F：5′-ctaccaatgataattgcagagaacggtatggccgatgcagca-3′；

371-R：5′-ggccataccgttctctgcaattatcattggtagctcgatgg-3′；

经过PCR反应将目的基因的第1111-1113位的TAC突变为GCA，使得目的基因突变后第371位编码为亮氨酸，制备出重组突变质粒pGAPHa/β-glucosidase；

(3) 将重组突变质粒pGAPHa/β-glucosidase转入大肠杆菌Top10进行扩增后用AvrII/BglII酶切，除去抗氨苄西林抗性基因，电击转化入毕赤酵母宿主菌中，用组氨酸缺陷培养基和X-gal染色双重筛选出阳性菌落，即构建成表达β-葡萄糖苷酶的酵母工程菌；

(4) 将步骤(4)构建的重组菌株，再经过β-半乳糖苷酶和乳糖水解筛选，选出高效表达β-葡萄糖苷酶的酵母工程菌。

本发明还公开了所述重组菌产β-葡萄糖苷酶的方法：在适于毕赤酵母菌株生长的培养条件下培养本发明所述的重组菌。

进一步的，将所述重组菌接入含有碳源、氮源的发酵培养基中，调节溶氧量DO≥20%，控制pH4.8-5.2、温度28℃-30℃，发酵培养4-5天。

所述YPD培养基中含有酵母营养盐10-20g/L、麦芽汁30-50g/L、葡萄糖10-20 g/L，以上均为质量体积比，单位为g/L培养基，以下均相同。

进一步的，所述YPD培养基优选酵母营养盐10g/L、麦芽汁40g/L、葡萄糖20 g/L。

所述酵母营养盐为市售产品，购于郑州龙海啤酒物资有限公司。

进一步的，所述的产β-葡萄糖苷酶的方法还包括从发酵产物中分离β-葡萄糖苷酶的步骤，此步骤可以采用本领域公知的技术方案实现，如离心或超滤去除菌体，取上清即得含有β-葡萄糖苷酶的粗酶液。

本发明还公开了一种β-葡萄糖苷酶，其是由保藏编号为 CGMCC No.4891的菌株所编码的。

本发明还公开了所述的β-葡萄糖苷酶在转化乳糖方面的应用。

本发明还公开了含有β-葡萄糖苷酶的重组菌在转化乳糖中方面的应用。

本发明还公开了上述重组菌的培养增殖方法，包括如下步骤：

(1)一级种子液培养：挑选单菌落接入YPD培养基，控制pH4.8-5.5，温度28℃-30℃条件下震荡培养19-24小时，至OD600nm≥2.0；

(2)二级种子液培养：将上述一级种子液按1%（v/v）的接种量接入YPD培养基中，控制pH4.8-5.5，温度28℃-30℃条件下震荡培养19-24小时，至OD600nm≥4.0；

(3)发酵罐发酵培养：将二级种子液按10%（v/v）接种量转入初始pH5.0的YPD培养基中，调节溶氧量DO≥20%，发酵过程中控制pH4.8-5.2、温度28℃-30℃，培养24小时后以葡萄糖补料，继续发酵培养78-90小时。

所述步骤(3)中，所述补料方式包括：选用400 g/L的葡萄糖以0.5ml/min速度，连续流加50小时。

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点，1、本发明从pyrococcus furiosus中分离其基因组DNA，通过PCR方法克隆其β-葡萄糖苷酶基因，构建了以毕氏酵母（pichia pastoris）GS115为表达宿主并含有重组质粒pGAPHa/β-glucosidase的基因工程菌株，在生产过程中无需甲醇诱导，极大地增加了产品的安全性；同时用营养缺陷性筛选高效表达的菌株，不引入抗生素基因，产品安全性进一步加强；使得β-葡萄糖苷酶在信号肽的引导下分泌到培养基中，为产品的后续处理工艺提供了方便；而且毕氏酵母本身有很好的安全性，酵母培养基中不会含有热源；

2、本发明采用麦芽汁做培养基生产β-葡萄糖苷酶，为β-葡萄糖苷酶在乳品、食品、医药、饲料等方面提供了安全的保证；

3、本发明方法生产的β-葡萄糖苷酶具有很强的半乳糖苷酶的活性，用于乳品工业，能将乳糖水解成半乳糖和葡糖糖，再将半乳糖转化为低聚半乳糖，可为营养失调的儿童和体弱的病人提供高质量的蛋白质和特别的糖源，可为乳糖不耐和牛奶不耐受人群解除不能饮用牛奶的痛苦；

4、本发明生产的β-葡萄糖苷酶，在100℃下仍有很强的稳定性，而且在30℃左右的较低温度下仍能保持很强的40%的活性，由于本发明生产的β-葡萄糖苷酶在广泛的温度范围具有稳定性，因此为乳品工业生产低乳糖奶提供了多种添加方式，可以在乳制品高温灭菌时同步添加，减少了二次污染的机会，另外可以根据乳品的要求在低温时添加，仍能达到理想的效果。同时耐高温这一优点为乳品工业提供了生产低乳糖奶粉的良好途径；

5、本发明生产的β-葡萄糖苷酶，在pH3.0到pH7.5范围均有良好的稳定性，基于产品pH的稳定性，因此也可用于酸奶中乳糖的水解，亦可应用于乳制品、液态奶、奶粉等产品中乳糖的水解，为乳品工业提供了多思路多元化低乳糖产品开发的方法；

6、本发明生产的β-葡萄糖苷酶，可水解水果、奶制品中的风味前体物--糖苷，几乎所有的天然糖苷是β-糖苷，所以可以利用β-葡萄糖苷酶水解水果、奶制品中的风味前体物--糖苷，释放出挥发性糖苷配基，用以增强葡萄酒等果酒、果汁的香气，因此β-葡萄糖苷酶作为水果、奶制品风味增香酶最为合适。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1为表达载体pGAPHa/β-glucosidase的构建示意图；

图2为毕氏酵母表达的β-glucosidase各时段的SDS-PAGE电泳图。

具体实施方式

实施例1：重组质粒的构建

提取总DNA模板：取pyrococcus furiosus 菌体20毫克，加入DNA提取液(包括20ml Tris-HCl pH8，25mM EDTA，0.1M NaCl，0.5%SDS，10μg/ml蛋白酶K)消化12 小时。使用苯酚/氯仿（二者体积比为24：1）萃取两次，再使用氯仿萃取一次。分离取得上清，并加入其两倍体积的乙醇（100%浓度）沉淀DNA。离心收取DNA，溶解到TE缓冲液中，测定浓度后进行PCR反应。

构建出重组质粒β-glucosidase/pCR2.1：根据β-glucosidase基因序列（Genebank pF0073），设计两个PCR引物：

分别为：G001  5′-atgaagttcccaaaaaacttcatgtttgg-3′；

G002  5′-ctactttcttgtaacaaatttgaggtctgcg-3′；

用PCR扩增其基因，然后直接克隆到PCR2.1-Top10质粒，其结构示意图如图1所示，该重组质粒是目的基因pyrococcus furiosus CelB***到质粒pCR2.1中形成的重组质粒，具体方法参见Invitrogen公司的Multi-Copy Pichia Expression Kit操作手册，以后的突变操作就是在该重组质粒上完成的。

实施例2：重组质粒的定点突变

参考应用Stratagene公司的在线引物设计软件QuikChange?? Primer Design Program，以重组质粒β-glucosidase/pCR2.1为模板，设计两个突变引物，分别为：

371-F：5′-ctaccaatgataattgcagagaacggtatggccgatgcagca-3′；

371-R：5′-ggccataccgttctctgcaattatcattggtagctcgatgg-3′；

对重组质粒β-glucosidase/pCR2.1的第371位氨基酸进行定点突变，制备出重组突变质粒pGAPHa/β-glucosidase。其中，将目的基因的第1111-1113位的TAC突变为GCA，使得第371位的苏氨酸突变为亮氨酸，基因定点突变反应体系如表1所示，PCR反应参数如表2所示。

PCR结束后，经过DpnI酶37℃水解1小时后，将突变质粒转化进大肠杆菌(E.Coli)体内进行扩增，采用TaKaRa公司的质粒DNA小量纯化试剂盒提取质粒，送测序，选出想要得到的质粒。

定点突变方法流程如下：第一步，以设计好的突变引物为指导并以质粒β-glucosidase/pCR2.1为模板进行PCR扩增；第二步，将扩增好的质粒用DpnI酶37℃水解1小时进行消化，除去和母链相同的DNA链，得到只含有突变位点的DNA链；第三步，将消化好的质粒DNA转化进大肠杆菌Top10感受态细胞中进行扩增。

表1 基因定点突变反应体系

                                                 

表2 PCR反应参数

实施例3：目的DNA的准备及毕赤酵母的电转化

 提取质粒pGAPHa/β-glucosidase，采用AvrII/BglII进行酶切线性化后，通过琼脂糖电泳纯化得到线性的目的DNA；制取毕赤酵母GS115的电感受态细胞；将50ul的电感受态细胞与5ul（3微克）的线性化DNA混合，转入0.4cm间距电转化杯中，在电压800V条件下进行电击，将其转化入毕赤酵母宿主菌GS115中，即构建成表达β-葡萄糖苷酶的酵母工程菌。

实施例4：转化子的筛选

（1）组氨酸缺陷性培养基和x-gal染色双重筛选法

筛选板培养基配方：0.67%无氨基酸的酵母氮（购于上海博蕴生物科技有限公司），2%葡萄糖，10%缺乏组氨酸的氨基酸营养液，20μg/ml X-gal，2%琼脂。

将电击转化后的酵母，均匀涂布在上述筛选板上，放入30℃温箱培养2-4天，挑出20个蓝色单菌落，然后将挑选出的蓝色酵母单菌落接入5ml CM Glucose Broth minus histidine培养基（TEKNOVA  C8115），30℃、200rpm摇床培养48小时，离心取上清得到含β-葡萄糖苷酶的粗酶液，并分别测定各粗酶液的β-葡萄糖苷酶活性。

酶活单位定义：1个β-葡萄糖苷酶活性单位（IU）为每分钟转化1umol 邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG）所需的酶量。

β-glucosidase活性检测反应体系为：pH5.6、0.02M磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，5%碳酸钠、硝基苯酚-β-D半乳糖苷（ONPG，购自Solarbio公司）、邻硝基酚（ONP，购自Aldrich公司）。

筛选出一株高效表达β-葡萄糖苷酶的酵母工程菌，测定其基因序列与SEQ ID No.1所示一致，命名为Piccia Pastoris GS115-371，并将该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC No.4891。

（2）重组酵母菌表达

挑取CGMCC No.4891菌株的单克隆菌落，接种至25ml YPD培养基中，28-30℃，250-300rpm培养至OD₆₀₀=4；于4℃、500rpm离心5min，去除上清收集细胞，用YPD溶液重悬细胞至OD₆₀₀=1.0，进行诱导表达；

在1L摇瓶中加入上述培养物，加盖两层灭菌纱布，放入摇床继续生长诱导。

实施例5：重组β-葡萄糖苷酶的纯化

每间隔6小时取实施例4中菌种CGMCC No.4891所培养的发酵液，并离心去除菌体后得到不同时段的粗酶液，直至发酵至90小时结束。分别将得到的不同时段的粗酶液经Amicon XM-50超滤浓缩，并冻干干燥作为粗酶。将粗酶上样到预先用柠檬酸-磷酸缓冲液（0.02mol/L，pH5.0）平衡的Sephadex G-150柱（2.5*90cm），收集β-葡萄糖苷酶活力峰，超滤浓缩除盐后，上样到相同缓冲液平衡的DEAE-Sephadex A-50柱（3.3*30cm），用0-0.4mol/L氯化钠线性梯度洗脱，收集高活力蛋白峰，确定目的样品所在的收集管，得到电泳纯的目标蛋白，送测序，其氨基酸序列与SEQ ID No.2一致，即为预期的β-葡萄糖苷酶。

如图2所示，是经纯化酶液的SDS-PAGE图谱。其中M为标准分子量蛋白，可见纯化得到的酶与预期相同。

将90小时发酵终止时取得的粗酶液根据实施例4中所述的定义及方法测定其酶活力，同时以相同的培养方法培养本发明所述重组菌的出发菌株以及市售的含β-葡萄糖苷酶菌株，并收集粗酶液以相同的手段及体系分别测定其酶活力，具体结果见下表所示。

实施例6：β-葡萄糖苷酶的制备

本发明所述的YPD培养基含有酵母营养盐10g/L、麦芽汁30g/L、葡萄糖20 g/L，以上均为质量体积比，单位为g/L培养基，以下均相同。

一级种子培养：挑毕氏酵母单菌落一环置于YPD培养基中，控制pH4.8-5.5，温度28℃-30℃条件下震荡培养19-24小时，至OD600nm≥2.0；

二级种子培养：将一级种子按1%（v/v）接种量接入YPD培养基中，控制pH4.8-5.5，温度28℃-30℃条件下震荡培养19-24小时，至OD600nm≥4.0；

上罐发酵：将二级种子按10%（v/v）接种量转入YPD培养基中，调节初始pH值为5.0。接种后调节溶氧量DO≥20%，pH4.8-5.2，温度28℃-30℃,培养16-24小时后，选用400g/L的葡萄糖以0.5ml/min速度，连续流加补料50小时，78-90小时左右下罐。

离心去除菌体，收集上清，得到粗酶液。将粗酶液按照实施例5所述的方法纯化并经过冷冻干燥或喷雾干燥，得到β-葡萄糖苷酶粉剂。

实施例7：β-葡萄糖苷酶的制备

    本实施例所述的YPD培养基含有酵母营养盐20g/L、麦芽汁50g/L、葡萄糖10 g/L。其他培养条件均与实施例6所述的方法及条件相同。

实施例8：酶学性质分析

    1、最适温度

分别在20、30、40、50、60、70、80、90、100℃条件下按照实施例6所述的培养方法与条件培养重组菌CGMCC No.4891及该重组菌的出发菌株以及市售毕赤酵母菌株，并分别检测收集到的β-葡萄糖苷酶粗酶液的活性。所测结果下表所示(IU/mg酶液)：

表明本发明生产的β-葡萄糖苷酶是一种耐高温的酶，在90℃到100℃时仍有极强的活性，而该酶在25-40℃的低温状态仍有较好的活性。

2、最适pH

将实施例6所得到的含β-葡萄糖苷酶粗酶液分别放在起始pH为3、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5的溶液中，将溶液室温25℃放置，检测48小时的活性。所测结果见下表所示(以pH4.5时的酶活定义为100%)：

结果表明，本发明的β-葡萄糖苷酶在广泛的pH范围均有很好的稳定性。

实施例8：β-葡萄糖苷酶水解乳糖的应用

取150μl实施例6所得到的含β-葡萄糖苷酶粗酶液加入1升牛奶中，85℃下反应5分钟，24小时后经醋酸铅沉淀，0.45um滤膜过滤，以果糖-葡萄糖-蔗糖-乳糖做混标，色谱柱为氨基酸柱，流动相为乙腈，比较加β-葡萄糖苷酶前后牛奶中乳糖的变化情况。检测结果发现加入所述β-葡萄糖苷酶之后体系中的乳糖含量较少，而葡萄糖含量大幅增多，可见本发明所述的β-葡萄糖苷酶不仅对乳糖有很强的水解活性，而且发明得到的β-葡萄糖苷酶对乳糖的转化率高达70%以上。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

                         序列表

<110>  山西恩泽生物技术有限公司

<120>  一种β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及应用

<130>  AJ111569_XSQ_AZ120110435

<160>  6    

<170>  PatentIn version 3.5

<210>  1

<211>  1419

<212>  DNA

<213>  Piccia Pastoris GS115-371

<400>  1

atgaagttcc caaaaaactt catgtttgga tattcttggt ctggtttcca gtttgagatg       60

ggactgccag gaagtgaagt ggaaagcgac tggtgggtgt gggttcacga caaggagaac      120

atagcatcag gtctagtaag tggagatcta ccagagaacg gcccagcata ttggcacctc      180

tataagcaag atcatgacat tgcagaaaag ctaggaatgg attgtattag aggtggcatt      240

gagtgggcaa gaatttttcc aaagccaaca tttgacgtta aagttgatgt ggaaaaggat      300

gaagaaggca acataatttc cgtagacgtt ccagagagta caataaaaga gctagagaaa      360

attgccaaca tggaggccct tgaacattat cgcaagattt actcagactg gaaggagagg      420

ggcaaaacct tcatattaaa cctctaccac tggcctcttc cattatggat tcatgaccca      480

attgcagtaa ggaaacttgg cccggatagg gctcctgcag gatggttaga tgagaagaca      540

gtggtagagt ttgtgaagtt tgccgccttc gttgcttatc accttgatga cctcgttgac      600

atgtggagca caatgaacga accaaacgta gtctacaatc aaggttacat taatctacgt      660

tcaggatttc caccaggata tctaagcttt gaagcagcag aaaaggcaaa attcaactta      720

attcaggctc acatcggagc atatgatgcc ataaaagagt attcagaaaa atccgtggga      780

gtgatatacg cctttgcttg gcacgatcct ctagcggagg agtataagga tgaagtagag      840

gaaatcagaa agaaagacta tgagtttgta acaattctac actcaaaagg aaagctagac      900

tggatcggcg taaactacta ctccaggctg gtatatggag ccaaagatgg acacctagtt      960

cctttacctg gatatggatt tatgagtgag agaggaggat ttgcaaagtc aggaagacct     1020

gctagtgact ttggatggga aatgtaccca gagggccttg agaaccttct taagtattta     1080

aacaatgcct acgagctacc aatgataatt gcagagaacg gtatggccga tgcagcagat     1140

agatacaggc cacactatct cgtaagccat ctaaaggcag tttacaatgc tatgaaagaa     1200

ggtgctgatg ttagagggta tctccactgg tctctaacag acaactacga atgggcccaa     1260

gggttcagga tgagatttgg attggtttac gtggatttcg agacaaagaa gagatattta     1320

aggccaagcg ccctggtatt cagagaaata gccactcaaa aagaaattcc agaagaatta     1380

gctcacctcg cagacctcaa atttgttaca agaaagtag                            1419

<210>  2

<211>  472

<212>  PRT

<213>  Piccia Pastoris GS115-371

<400>  2

Met Lys Phe Pro Lys Asn Phe Met Phe Gly Tyr Ser Trp Ser Gly Phe

1               5                   10                  15     

Gln Phe Glu Met Gly Leu Pro Gly Ser Glu Val Glu Ser Asp Trp Trp

            20                  25                  30          

Val Trp Val His Asp Lys Glu Asn Ile Ala Ser Gly Leu Val Ser Gly

        35                  40                  45             

Asp Leu Pro Glu Asn Gly Pro Ala Tyr Trp His Leu Tyr Lys Gln Asp

    50                  55                  60                  

His Asp Ile Ala Glu Lys Leu Gly Met Asp Cys Ile Arg Gly Gly Ile

65                  70                  75                  80 

Glu Trp Ala Arg Ile Phe Pro Lys Pro Thr Phe Asp Val Lys Val Asp

                85                  90                  95     

Val Glu Lys Asp Glu Glu Gly Asn Ile Ile Ser Val Asp Val Pro Glu

            100                 105                 110        

Ser Thr Ile Lys Glu Leu Glu Lys Ile Ala Asn Met Glu Ala Leu Glu

        115                 120                 125            

His Tyr Arg Lys Ile Tyr Ser Asp Trp Lys Glu Arg Gly Lys Thr Phe

    130                 135                 140                

Ile Leu Asn Leu Tyr His Trp Pro Leu Pro Leu Trp Ile His Asp Pro

145                 150                 155                 160

Ile Ala Val Arg Lys Leu Gly Pro Asp Arg Ala Pro Ala Gly Trp Leu

                165                 170                 175    

Asp Glu Lys Thr Val Val Glu Phe Val Lys Phe Ala Ala Phe Val Ala

            180                 185                 190        

Tyr His Leu Asp Asp Leu Val Asp Met Trp Ser Thr Met Asn Glu Pro

        195                 200                 205            

Asn Val Val Tyr Asn Gln Gly Tyr Ile Asn Leu Arg Ser Gly Phe Pro

    210                 215                 220                

Pro Gly Tyr Leu Ser Phe Glu Ala Ala Glu Lys Ala Lys Phe Asn Leu

225                 230                 235                 240

Ile Gln Ala His Ile Gly Ala Tyr Asp Ala Ile Lys Glu Tyr Ser Glu

                245                 250                 255    

Lys Ser Val Gly Val Ile Tyr Ala Phe Ala Trp His Asp Pro Leu Ala

            260                 265                 270        

Glu Glu Tyr Lys Asp Glu Val Glu Glu Ile Arg Lys Lys Asp Tyr Glu

        275                 280                 285            

Phe Val Thr Ile Leu His Ser Lys Gly Lys Leu Asp Trp Ile Gly Val

    290                 295                 300                

Asn Tyr Tyr Ser Arg Leu Val Tyr Gly Ala Lys Asp Gly His Leu Val

305                 310                 315                 320

Pro Leu Pro Gly Tyr Gly Phe Met Ser Glu Arg Gly Gly Phe Ala Lys

                325                 330                 335    

Ser Gly Arg Pro Ala Ser Asp Phe Gly Trp Glu Met Tyr Pro Glu Gly

            340                 345                 350        

Leu Glu Asn Leu Leu Lys Tyr Leu Asn Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Met

        355                 360                 365            

Ile Ile Ala Glu Asn Gly Met Ala Asp Ala Ala Asp Arg Tyr Arg Pro

    370                 375                 380                

His Tyr Leu Val Ser His Leu Lys Ala Val Tyr Asn Ala Met Lys Glu

385                 390                 395                 400

Gly Ala Asp Val Arg Gly Tyr Leu His Trp Ser Leu Thr Asp Asn Tyr

                405                 410                 415    

Glu Trp Ala Gln Gly Phe Arg Met Arg Phe Gly Leu Val Tyr Val Asp

            420                 425                 430          

Phe Glu Thr Lys Lys Arg Tyr Leu Arg Pro Ser Ala Leu Val Phe Arg

        435                 440                 445            

Glu Ile Ala Thr Gln Lys Glu Ile Pro Glu Glu Leu Ala His Leu Ala

    450                 455                 460                  

Asp Leu Lys Phe Val Thr Arg Lys

465                 470          

<210>  3

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  引物

<400>  3

atgaagttcc caaaaaactt catgtttgg                                         29

<210>  4

<211>  31

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  引物

<400>  4

ctactttctt gtaacaaatt tgaggtctgc g                                      31

<210>  5

<211>  42

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  引物

<400>  5

ctaccaatga taattgcaga gaacggtatg gccgatgcag ca                          42

<210>  6

<211>  41

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  引物

<400>  6

ggccataccg ttctctgcaa ttatcattgg tagctcgatg g                           41 

Claims (16)

1.一种β-葡萄糖苷酶，其特征在于：包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

2.一种β-葡萄糖苷酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种编码权利要求1或2所述的β-葡萄糖苷酶的基因，其特征在于：包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

4.一种编码权利要求1或2所述的β-葡萄糖苷酶的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

5.一种含有权利要求3或4所述的β-葡萄糖苷酶基因的表达载体。

6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于：所述的表达载体为不含抗菌素基因的载体。

7.根据权利要求5或6所述的表达载体，其特征在于：所述的表达载体为重组质粒pGAPHa/β-glucosidase。

8.一种含有权利要求5-7任一所述的表达载体的重组菌，其特征在于：所述的重组菌为生产β-葡萄糖苷酶的毕氏酵母工程菌。

9.根据权利要求8所述的重组菌，其特征在于：所述的重组菌已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为 CGMCC No.4891。

10.一种构建权利要求8或9所述的重组菌的方法，其特征在于：将权利要求5-7任一所述的表达载体导入毕氏酵母宿主菌株，以使所述表达载体在所述宿主中有效表达。

11.根据权利要求10所述的构建重组菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建重组质粒β-glucosidase/pCR2.1，所述的重组质粒β-glucosidase/pCR2.1是目的基因pyrococcus furiosus CelB***到质粒pCR2.1中形成的重组质粒； 

(2)以重组质粒β-glucosidase/pCR2.1为模板，设计如下突变引物：

371-F：5′-ctaccaatgataattgcagagaacggtatggccgatgcagca-3′；

371-R：5′-ggccataccgttctctgcaattatcattggtagctcgatgg-3′；

经过PCR反应将目的基因的第1111-1113位的TAC突变为GCA，使得目的基因突变后第371位编码为亮氨酸，制备出重组突变质粒pGAPHa/β-glucosidase；

(3) 将重组突变质粒pGAPHa/β-glucosidase转入大肠杆菌Top10中进行扩增后用AvrII/BglII酶切，除去抗氨苄西林抗性基因，电击转化入毕赤酵母宿主菌中，用组氨酸缺陷培养基和X-gal染色双重筛选出阳性菌落，即构建成表达β-葡萄糖苷酶的酵母工程菌；

(4) 将步骤(4)构建的重组菌株，再经过β-半乳糖苷酶和乳糖水解筛选，选出高效表达β-葡萄糖苷酶的酵母工程菌。

12.根据权利要求8或9所述的重组菌产β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于：在适于毕赤酵母菌株生长的培养条件下培养本发明所述的重组菌。

13.根据权利要求12所述的重组菌产β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于：将所述重组菌接入含有碳源、氮源的发酵培养基中，调节溶氧量DO≥20%，控制pH4.8-5.2、温度28℃-30℃，发酵培养4-5天。

14.一种β-葡萄糖苷酶，其是由保藏编号为 CGMCC No.4891的菌株所编码的。

15.根据权利要求1或2或14所述的β-葡萄糖苷酶在转化乳糖方面的应用。

16.根据权利要求8或9所述的含有β-葡萄糖苷酶的重组菌在转化乳糖方面的应用。

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