CN101974441A - 一种α-葡萄糖苷酶基因工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种α-葡萄糖苷酶基因工程菌及其应用，属于酶工程技术领域。该基因工程菌是携带一种重组质粒的毕赤酵母PichapastorisGS115，重组质粒为含有黑曲霉Aspergillusnigerα-葡萄糖苷酶cDNA的质粒pPIC9K-aglu，利用P.pastorisGS115表达A.niger来源的α-葡萄糖苷酶。用所构建的重组P.pastorisGS115/pPIC9K-aglu作为生产菌种，溶氧反馈调控补料流加策略高密度培养P.pastoris生产重组α-葡萄糖苷酶，通过在发酵18~20h后连续补加甘油实现P.pastoris的高密度培养，发酵24~26h后连续补加甲醇控制一定残余甲醇浓度，发酵培养120h后，重组α-葡萄糖苷酶的酶活达到3.5U/mL以上。本发明采用价格低廉的无机盐和甘油为原料进行生产，发酵工艺简单易行，适于大规模生产。

Description

一种α-葡萄糖苷酶基因工程菌及其应用

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，涉及一种α-葡萄糖苷酶基因工程菌及其发酵生产α-葡萄糖苷酶的方法。

背景技术

α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)，又名α-D-葡萄糖苷水解酶，可以催化水解低聚糖类生成葡萄糖。α-葡萄糖苷酶在自然界中广泛分布，种类繁多，性质各异。来源于曲霉、酿酒酵母、芽孢杆菌的α-葡萄糖苷酶不仅能够水解糖苷，还可以通过转苷反应合成某些低聚糖。其中，黑曲霉（A. niger） α-葡萄糖苷酶由于其优良的转苷能力，在工业上具有巨大的应用前景。

A. niger α-葡萄糖苷酶能够切割开麦芽糖的α-1, 4糖苷键，并将游离出来的葡萄糖残基以α-1, 6形式转移到其他糖底物上，形成低聚异麦芽糖(IMOs)。IMOs能够促进人体内有益细菌的生长繁殖，具有防龋齿、降低胆固醇、改善肠道功能、增强肌体免疫力等功能，在食品和医药行业应用广泛。

作为制备IMOs的关键用酶，A. niger α-葡萄糖苷酶受到国内外研究人员的广泛关注。我国对此酶的研究主要集中在天然α-葡萄糖苷酶酶学性质及产酶菌株的筛选培养方面。然而，由于天然A. niger α-葡萄糖苷酶表达量低，依靠单纯的筛菌和发酵条件优化较难实现产酶量的较大突破，而传统的诱变育种存在着一定的随机性，且开发周期长，表达量在短时间内较难快速提高。目前，α-葡萄糖苷酶在我国尚未实现自主生产，完全依赖进口，且价格昂贵(约30万元/吨)，导致IMOs的生产成本居高不下。

为了克服野生A. niger菌株α-葡萄糖苷酶产量低，运用基因工程的方法实现α-葡萄糖苷酶的高效表达已成为当今研究的热点。Nakamura等(Nakamura A, Nishimura I, Yokoyama A, et al. Cloning and sequencing of an alpha-glucosidase gene fromAspergillus niger and its expression in A. nidulans. J. Biotechnol., 1997, 53: 75-84)以Asperigilius nidulans为宿主构建了基因工程菌，最高比酶活为0.04 U/mg。Lee等(Lee D G,Nishimura-Masuda I, Nakamura A, et al. Overproduction of aphla-glucosidase in Aspergillus nigertransformed with the cloned gene aglA. J. Gen. Appl. Microbiol., 1998, 44: 177-181)通过基因重组的方法在A. niger染色体上引入多拷贝的α-葡萄糖苷酶基因提高α-葡萄糖苷酶产量，通过筛选纯合子得到高产量的重组菌，最高比酶活达到0.24 U/mg。Ogawa等(Ogawa M, Nishio T, Minoura K, et al. Recombinant alpha-glucosidase from Aspergillus niger.Overexpression by Emericella nidulans, purification and Characterization. J.Appl.Glycosci., 2006, 53: 13-16)以Emericell nidulans为宿主表达A. niger来源的α-葡萄糖苷酶基因，最高比酶活为0.96 U/mg，酶活为0.65 U/mL。于岚等(于岚, 张云开, 苏艳等. 黑曲霉??-葡萄糖苷酶cDNA的克隆及表达. 生物技术, 2006, 16(2): 5-8)通过RT-PCR方法扩增得到A. niger α-葡萄糖苷酶cDNA，构建重组质粒在大肠杆菌中表达，然而所表达的重组蛋白是胞内酶，分离纯化的成本相对较高；同时酶活偏低。本实验室前期工作中，童星等(童星, 唐秋嵩, 吴玉飞等. 黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达. 微生物学报, 2009, 49(2): 262-268)通过overlap PCR获得A. niger α-葡萄糖苷酶cDNA，在P. pastoris KM71中表达，然而生化活性较低。陈董力等(Dongli Chen,Xing Tong, Shangwei Chen, Sheng Chen, Dan Wu, Shuguang Fang, Jing Wu and Jian Chen. Heterologous expressionand biochemical characterization of α-glucosidase from Aspergillus niger by Pichia pastroris, J. Agric. Food Chem., 2010, 58, 4819-4824)通过RT-PCR获得A. niger α-葡萄糖苷酶cDNA，在P. pastoris KM71中表达，终酶活达到2.07 U/mL。

虽然本实验室前期开发的工程菌在产量上已经一定的进步，但是α-葡萄糖苷酶产量依然偏低。在前期研究的基础上，本实验室成功构建重组菌株P. pastoris GS115/pPIC9K-aglu，实现了α-葡萄糖苷酶的高效胞外表达。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种α-葡萄糖苷酶基因工程菌，该菌种可以高效分泌表达重组α-葡萄糖苷酶，解决了现有菌株分泌α-葡萄糖苷酶活性不高的问题。

所述α-葡萄糖苷酶基因工程菌是将来源于黑曲霉Aspergillus niger α-葡萄糖苷酶基因导入毕赤酵母Picha pastoris GS115获得的重组菌。

其中，黑曲霉Aspergillus niger来源于黑曲霉No. CICIM F0620，其核苷酸序列与GeneBank登陆号4991096的黑曲霉 α-葡萄糖苷酶基因相同。

本发明还要解决的技术问题是提供一种采用所述重组菌生产α-葡萄糖苷酶的方法。

为解决上述问题，所述重组菌发酵方法如下：

(1) 菌株：α-葡萄糖苷酶基因工程菌P. pastorisGS115/ pPIC9K-aglu；

(2) 种子培养阶段：从甘油管中吸取200 μL菌液接种于种子培养基中，使用回转恒温调速摇床进行培养，控制转速200 rpm，培养温度30°C，培养20 h左右；

(3) 发酵培养：将种子培养液按10%的接种量接入发酵培养基中，通过控制搅拌转速使溶氧维持20~30%，控制温度为28.5 °C，流加质量浓度为25%的氨水控制pH 5.0，培养18~20小时；

(4) 甘油补料：发酵培养进行到18~20小时后，溶氧开始反弹，通过补加甘油补料培养基，使OD₆₀₀达到100；

(5) 甲醇诱导：发酵培养24-26小时后，通过补加甲醇诱导培养基，诱导重组α-葡萄糖苷酶表达，发酵液剩余甲醇浓度控制在0.2~0.4%(v/v)。

所述种子培养基的组成为：酵母膏10 g/L，蛋白胨 20 g/L，甘油10 g/L，生物素 4×10^-4 g/L，磷酸钾缓冲液0.1mol/L (pH6.0)。

所述发酵培养基的组成为：CaSO₄ 0.93 g/L，K₂SO₄ 18.2 g/L，MgSO₄·7H₂O 14.9 g/L，KOH 4.13 g/L，甘油30.0 g/L，85%磷酸26.7 mL/L，PTM₁ 4.35 mL/L。

PTM₁溶液的组成为：CuSO₄·5H₂O 6 g/L，KI 0.08 g/L，MnSO₄·H₂O 3 g/L，Na₂MoO₃·2H₂O 0.2 g/L，H₃BO₃ 0.02 g/L，CoCl₂ 0.5 g/L，ZnCl₂ 20 g/L，FeSO₄·7H₂O 65 g/L，生物素0.2 g/L，H₂SO₄ 5.0 mL/L。

所述甘油补料培养基：500 g/L甘油，5 mL/L PTM₁。

所述甲醇诱导培养基：100%甲醇，12 mL/L PTM₁。

本发明的有益效果：

(1) 本发明成功构建了一种高效分泌表达重组α-葡萄糖苷酶的基因工程菌P. pastoris GS115/pPIC9K-aglu，首次实现了利用P. pastoris GS115表达A. niger来源的α-葡萄糖苷酶；

(2) 本发明解决了现有发酵工艺中α-葡萄糖苷酶活性不高的问题；

(3) 本发明采用价格低廉的无机盐和甘油等原料进行生产，适于大规模生产。

具体实施方式

实施例1：基因工程菌P. pastorisGS115/pPIC9K-aglu的构建

(1) A.niger总RNA的提取：收集A. niger菌丝体离心，用0.1%的DEPC处理过的缓冲液冲洗数次，将菌丝体放入液氮中速冻，在研钵中快速研磨。取研磨好的样品100 mg放入1.5 mL EP管中，加入1 mL TRI REAGENT (Sigma T9424)，用移液枪反复吹吸以裂解细胞；12,000×g、4°C离心10 min。将上清液转移到一个干净的离心管，将样品在室温下放置5 min。加入0.2 mL氯仿，剧烈摇晃15 s，在室温下放置10 min，4°C离心12,000×g，15 min。取上层无色水相置于一干净的离心管，加入500 μL异丙醇，混匀，在室温下放置10 min。4°C，12,000×g离心10 min，弃上清。加入1 mL 75%乙醇，漩涡混匀，12,000×g，4°C离心5 min。弃上清，让RNA自然干燥10 min。加40 μL DEPC水溶解沉淀，得A.niger总RNA样品。

(2) 引物设计：根据NCBI数据库中A. niger CBS 513.88的α-葡萄糖苷酶序列(登录号：4991096)，采用Primer Premier软件方法设计引物如下所示(Not                                                

酶切位点由下划线标出)：

上引物：5’-ATTAATGCGGCCGCGTCCACCACTGCCCCTTCG-3’

下引物：5’- AGCACTAGCGGCCGCCCATTCCAATACCCAGTTTTCC-3’

(3) cDNA第一链的合成

① 在一PCR管中添加下列物质：

总RNA(1 μg/μL)	1 μL
		Primer(50   μM oligo dT)	1 μL
dNTP mix(10   mM)	1 μL
		DEPC水	7 μL

② 在另一PCR管中，按顺序依次添加下列物质：

10×RT   Reaction Buffer	2 μL
		25 mM MgCl2	4 μL
100 mM DTT	2 μL
		RNaseOUT(40   U/μL)	1 μL
SuperScript    Reverse   transcriptase	1 μL

③ 将步骤①所配制的混合物于65°C保温5 min，随后置于冰上冷却至少1 min。

④ 将10 μL步骤②所配制的混合物加入步骤③所得的混合液中，混合均匀，在50°C保温50 min。

⑤ 将反应液于85°C放置5 min以终止反应，迅速置于冰上。

⑥ 离心管短时离心一次后加入1 μL RNaseH，37°C保温20 min。

⑦ 所得溶液作为PCR反应的模板。

(3) PCR反应

50 μL PCR反应体系如下：

水	17 μL
		高保真酶体系	25 μL
上引物	1.5 μL
		下引物	1.5 μL
cDNA模板	5 μL

PCR反应程序：95°C预变性4 min，然后进行以下循环：95°C变性45 s，58°C退火45 s，72°C延伸4 min，30个循环；72°C延伸10 min，4°C保温。1%琼脂糖凝胶电泳检测有无适当大小目标条带。

(4) 重组P. pastorisGS115/pPIC9K-aglu的构建

将纯化回收的PCR产物经Not 

酶切过夜，胶回收。P. pastoris表达载体pPIC9K于37°C经Not 

酶切2 h后经CIAP处理1.5 h，胶回收。分别将回收到的基因片段和质粒纯化后，于16°C用T4 DNA连接酶进行连接，并转化大肠杆菌感受态细胞JM109。100 mg/L氨苄青霉素的LB固体平板，经37^oC培养过夜，挑选转化子于含100 mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基进行培养，然后抽提质粒，得到pPIC9K-aglu。将此质粒进行测序，结果表明此序列全长2883 bp，编码960个氨基酸，与A. niger CBS 513.88 α-葡萄糖苷酶氨基酸序列(NCBI 登录号：XP_001402053)完全一致。

将pPIC9K-aglu线性化后，电击转化P. pastoris GS115宿主菌，在MD平板上经30^oC培养3~4 d，挑取在MD平板长出的单克隆子，点种于YPD/G418平板筛选多拷贝转化子，G418浓度筛选梯度依次为0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL。在2 mg/mL浓度的YPD/G418平板上得到可高效分泌α-葡萄糖苷酶的重组菌P. pastorisGS115/pPIC9K-aglu。

实施列2：重组P. pastorisGS115/pPIC9K-aglu的3 L罐发酵

(1) 菌株：重组菌P. pastorisGS115/pPIC9K-aglu。

(2) 种子培养：从甘油管中吸取200 μL菌液接种于种子培养基中(酵母膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，甘油10 g/L，生物素4×10^-4 g/L，磷酸钾缓冲液0.1mol/L，pH6.0)，使用回转恒温调速摇床进行培养，控制转速200 rpm，培养温度30°C，培养20 h左右；

(3) 发酵产酶：

分批发酵阶段：将种子培养液(酵母膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，甘油10 g/L，生物素4×10^-4 g/L，磷酸钾缓冲液0.1mol/L，pH 6.0)按10%的接种量接入3 L发酵罐中的发酵培养基(CaSO₄ 0.93 g/L，K₂SO₄ 18.2 g/L，MgSO₄·7H₂O 14.9 g/L，KOH 4.13 g/L，甘油30.0 g/L，85%磷酸26.7 mL/L，PTM₁ 4.35 mL/L)，通过控制搅拌转速使溶氧维持20~30%，控制温度为28.5°C，流加质量浓度为25%的氨水控制pH 5.0，培养18~20 h。

补料发酵阶段：待溶氧出现反弹，开始补加甘油补料培养基(500 g/L甘油，5 mL/L PTM₁)，控制温度为28.5°C，溶氧维持在30%，流加质量浓度为25%的氨水控制pH 5.0。

诱导培养阶段：当OD₆₀₀达到100，停止流加甘油补料培养基，待溶氧反弹后，维持基质缺乏状态1~2 h，一次性补加5~7 mL甲醇诱导培养基(100%甲醇，12 mL/L PTM₁)，使得发酵液中的甲醇初始浓度为0.5%(v/v)，待溶氧开始下降后，以溶氧反馈调控控制甲醇流加。初始甲醇流速为2 mL/h/L，维持8~10 h后将流速提高至4 mL/h/L，每隔8~12 h暂停一次甲醇，待溶氧急剧上升后再开始流加，以防止甲醇过度积累。诱导72 h以后将甲醇流速调整至5~6 mL/h/L。

PTM₁溶液的组成为：CuSO₄·5H₂O 6 g/L，KI 0.08 g/L，MnSO₄·H₂O 3 g/L，Na₂MoO₃·2H₂O 0.2 g/L，H₃BO₃ 0.02 g/L，CoCl₂ 0.5 g/L，ZnCl₂ 20 g/L，FeSO₄·7H₂O 65 g/L，生物素0.2 g/L，H₂SO₄ 5.0 mL/L。

发酵培养结束后，最终α-葡萄糖苷酶酶活为3.5 U/mL。

实施例3：重组P. pastorisGS115/pPIC9K-aglu的30 L罐发酵

(1) 菌株：本实验室自行构建重组P. pastorisGS115/pPIC9K-aglu。

(2) 种子培养：从甘油管中吸取200 μL菌液接种于种子培养基中(酵母膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，甘油10 g/L，生物素4×10^-4 g/L，磷酸钾缓冲液0.1mol/L，pH6.0)，使用回转恒温调速摇床进行培养，控制转速200 rpm，培养温度30°C，培养20 h左右；

(3) 发酵产酶：

分批发酵阶段：将种子培养液(酵母膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，甘油10 g/L，生物素4×10^-4 g/L，磷酸钾缓冲液0.1mol/L，pH 6.0)按10%的接种量接入30 L发酵罐中的发酵培养基(CaSO₄ 0.93 g/L，K₂SO₄ 18.2 g/L，MgSO₄·7H₂O 14.9 g/L，KOH 4.13 g/L，甘油30.0 g/L，85%磷酸26.7 mL/L，PTM₁ 4.35 mL/L)，通过控制搅拌转速使溶氧维持20~30%，控制温度为28.5°C，流加质量浓度为25%的氨水控制pH 5.0，初始通气量1.0 vvm，罐压0.05 MPa，培养16~19 h。

补料发酵阶段：待溶氧出现反弹，开始补加甘油补料培养基(500 g/L甘油，5 mL/L PTM₁)，控制温度为28.5°C，溶氧维持在30%，流加质量浓度为25%的氨水控制pH 5.0。

诱导培养阶段：当OD₆₀₀达到100，停止流加甘油补料培养基，待溶氧反弹后，维持基质缺乏状态1~2 h，一次性补加50~60 mL甲醇诱导培养基(100%甲醇，12 mL/L PTM₁)，使得发酵液中的甲醇初始浓度为0.5%(v/v)，待溶氧开始下降后，以溶氧反馈调控控制甲醇流加。初始甲醇流速为2~3 mL/h/L，维持8~10 h后将流速提高至4~5 mL/h/L，每隔8~12 h暂停一次甲醇，待溶氧急剧上升后再开始流加，以防止甲醇过度积累。诱导60 h以后将甲醇流速调整至5~6 mL/h/L，直至发酵结束(诱导96 h)。

PTM₁溶液的组成为：CuSO₄·5H₂O 6 g/L，KI 0.08 g/L，MnSO₄·H₂O 3 g/L，Na₂MoO₃·2H₂O 0.2 g/L，H₃BO₃ 0.02 g/L，CoCl₂ 0.5 g/L，ZnCl₂ 20 g/L，FeSO₄·7H₂O 65 g/L，生物素0.2 g/L，H₂SO₄ 5.0 mL/L。

发酵培养结束后，最终α-葡萄糖苷酶酶活为5.1 U/mL。

序列表

<110>  江南大学

<120>  一种α-葡萄糖苷酶基因工程菌及其应用

<160>  2     

<170>  PatentIn version 3.5

<210>  1

<211>  33

<212>  DNA

<213>  人工合成序列

<220>

<223>根据基因序列设计，用于基因扩增

<400>  1

attaatgcgg ccgcgtccac cactgcccct tcg                                    33

<210>  2

<211>  37

<212>  DNA

<213>  人工合成序列

<220>

<223>根据基因序列设计，用于基因扩增

<400>  2

agcactagcg gccgcccatt ccaataccca gttttcc                                37

Claims (10)

1.一种α-葡萄糖苷酶基因工程菌，是将黑曲霉 α-葡萄糖苷酶基因导入毕赤酵母GS115获得的重组菌。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因来源于黑曲霉No. CICIM F0620，其核苷酸序列与GeneBank登陆号4991096的黑曲霉 α-葡萄糖苷酶基因相同。

3.根据权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，表达载体采用pPIC9K。

4.根据权利要求1所述的基因工程菌，其构建方法为：

1）提取黑曲霉总RNA；

2）设计引物，通过RT-PCR，获得PCR产物；

3）将PCR产物克隆到质粒pPIC9K，构建表达载体pPIC9K-aglu；

4）将pPIC9K-aglu线性化后，电击转化毕赤酵母GS115宿主菌得到重组菌株毕赤酵母 GS115/pPIC9K-aglu。

5.一种应用权利要求1所述基因工程菌生产α-葡萄糖苷酶的方法，包括如下步骤：

 (1) 种子培养：种子培养阶段：从甘油管中吸取200 μL菌液接种于种子培养基中，使用回转恒温调速摇床进行培养，控制转速200 rpm，培养温度30°C，培养20 h左右；

(2) 发酵培养：将种子培养液按10%的接种量接入发酵培养基中，通过控制搅拌转速使溶氧维持20~30%，控制温度为28.5°C，流加质量浓度为25%的氨水控制pH 5.0，培养18~20小时；

(3) 甘油补料：通过补加甘油补料培养基，使OD₆₀₀达到100，停止流加甘油；

(4) 甲醇诱导：待溶氧反弹后，维持基质缺乏状态1~2 h，添加甲醇诱导培养基，使甲醇终浓度为0.5%，待溶氧下降后，开始流加甲醇诱导培养基，诱导重组α-葡萄糖苷酶表达，发酵液剩余甲醇浓度控制在0.2~0.4%。

6.根据权利要求5所述的方法，所述种子培养基的组成为：酵母膏10 g/L，蛋白胨 20 g/L，甘油10 g/L，生物素 4×10^-4 g/L，磷酸钾缓冲液0.1mol/L。

7.根据权利要求5所述的方法，所述发酵培养基为：CaSO₄ 0.93 g/L，K₂SO₄ 18.2 g/L，MgSO₄·7H₂O 14.9 g/L，KOH 4.13 g/L，甘油30.0 g/L，85%磷酸26.7 mL/L，PTM₁ 4.35 mL/L。

8.根据权利要求7所述的方法，PTM₁溶液的组成为：CuSO₄·5H₂O 6 g/L，KI 0.08 g/L，MnSO₄·H₂O 3 g/L，Na₂MoO₃·2H₂O 0.2 g/L，H₃BO₃ 0.02 g/L，CoCl₂ 0.5 g/L，ZnCl₂ 20 g/L，FeSO₄·7H₂O 65 g/L，生物素0.2 g/L，H₂SO₄ 5.0 mL/L。

9.根据权利要求5所述的方法，诱导初始阶段OD₆₀₀为100。

10.根据权利要求5所述的方法，诱导初始阶段的甲醇添加浓度为0.5%。