CN112915107A - 美洲大蠊乙酸乙酯提取物在制备抗急性髓系白血病药物和/或保健品中的应用及产品 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及美洲大蠊乙酸乙酯提取物在制备抗急性髓系白血病药物和/或保健品中的应用及产品，属于医药技术领域。美洲大蠊乙酸乙酯提取物对急性髓系白血病细胞具有显著的选择毒性作用，能够有效抑制急性髓系白血病细胞增殖；同时，该提取物使急性髓系白血病细胞具有典型的髓样分化形态学特征，能够增加急性髓系白血病细胞NBT阳性率，促进急性髓系白血病细胞分化标志物CD14和CD11b的表达。该提取物不但能够促进急性髓系白血病细胞分化，还能够抑制其增殖，具有开发为抗急性髓系白血病药物的潜力，为治疗急性髓系白血病提供一种新的途径。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及美洲大蠊乙酸乙酯提取物在制备抗急性髓系白血病药物和/或保健品中的应用及产品。
背景技术
白血病(Leukemia)是一类造血干细胞的克隆性恶性疾病。急性髓系白血病(Acutemyelocytic leukemia，AML)包括所有非淋巴细胞来源的急性白血病，是造血***的髓系原始细胞克隆性恶性增殖性疾病，以骨髓和外周血中原始与幼稚髓性细胞增殖失控、凋亡受阻、分化障碍为主要特征。多数发生在儿童和老人身上，且病情急重，预后凶险。近年来的研究表明，AML患病人群的死亡率在60％左右，且患者存活率在患病之后逐年下降。现目前的治疗方式主要有以下三种：(1)干细胞移植：该方式存在匹配率低、来源匮乏等缺点；(2)化疗：该治疗方式会导致患者出现一系列的副作用，如毛发脱落、血细胞减少、生存质量普遍下降等；(3)给予分化诱导剂：目前临床上现有的分化诱导剂较少，作为代表的全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)会导致维甲酸综合征，使患者头痛、颅内压增高、骨痛、低血压、急性肾衰竭甚至死亡。
在传统的中医辩证理论中，白血病属于“热症”、“热劳”，善以活血化瘀药辅以治疗。美洲大蠊(Periplaneta americana)是我国传统中药材，味咸、寒，用于血瘀、症坚、寒热、破积聚，具有通利血脉、养阴生肌的功效。现代药理研究表明，美洲大蠊在抗肿瘤、增强机体免疫、护肝、促进组织修复和抗菌等方面均具有较强的作用，其在治疗疾病方面具有重要意义与潜力。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供美洲大蠊乙酸乙酯提取物在制备抗急性髓系白血病药物和/或保健品中的应用；目的之二在于提供美洲大蠊乙酸乙酯提取物的制备方法；目的之三在于提供一种兼具促进急性髓系白血病细胞分化作用和抑制急性髓系白血病细胞增殖作用的药物；目的之四在于提供一种兼具促进急性髓系白血病细胞分化作用和抑制急性髓系白血病细胞增殖作用的保健品。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、美洲大蠊乙酸乙酯提取物在制备抗急性髓系白血病药物和/或保健品中的应用，所述药物和保健品兼具促进急性髓系白血病细胞分化作用和抑制急性髓系白血病细胞增殖作用。
优选的，所述促进急性髓系白血病细胞分化作用表现在美洲大蠊乙酸乙酯提取物使急性髓系白血病细胞具有典型的髓样分化形态学特征、增加急性髓系白血病细胞NBT阳性率或促进急性髓系白血病细胞分化标志物CD14和CD11b的表达。
优选的，所述典型的髓样分化形态学特征为核质比例缩小，胞浆染色变浅，部分呈半月形或马蹄形核。
优选的，所述抑制急性髓系白血病细胞增殖作用表现在美洲大蠊乙酸乙酯提取物对急性髓系白血病细胞具有选择毒性作用。
2、美洲大蠊乙酸乙酯提取物的制备方法，所述方法如下：
(1)通过渗漉、超声或回流的方式对美洲大蠊虫体干燥粉末进行粗提，获得美洲大蠊总提物；
(2)将步骤(1)中获得的美洲大蠊总提物加水混悬，获得混悬液，将所述混悬液先以低极性有机溶剂萃取后，再以乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯萃取液，将所述乙酸乙酯萃取液浓缩、冷冻干燥后，获得乙酸乙酯提取物。
优选的，步骤(1)中，通过渗漉、超声或回流的方式对美洲大蠊虫体干燥粉末进行粗提时，均先对美洲大蠊虫体干燥粉末进行脱脂处理。
优选的，步骤(1)中，所述通过渗漉的方式对美洲大蠊虫体干燥粉末进行粗提的方法如下：
将美洲大蠊虫体干燥粉末置于所述干燥粉末2～10倍重量的石油醚中脱脂12～48h，然后再置于所述干燥粉末2～8倍重量的石油醚中脱脂12～48h，接着于所述干燥粉末1～10倍重量的25～100vol％的乙醇溶液中浸泡1～24h后转入渗漉筒，加入所述干燥粉末5～30倍重量的25～100vol％的乙醇溶液浸泡24～72h后进行渗漉，最后再渗漉0～4次，每次渗漉加入所述干燥粉末5～30倍重量的25～100vol％的乙醇溶液进行，收集每次渗漉液，混匀后减压浓缩至无醇味，获得美洲大蠊总提物。
优选的，步骤(1)中，所述通过超声的方式对美洲大蠊虫体干燥粉末进行粗提的方法如下：
将美洲大蠊虫体干燥粉末置于所述干燥粉末2～10倍重量的石油醚中脱脂12～48h，然后再置于所述干燥粉末2～8倍重量的石油醚中脱脂12～48h，接着于所述干燥粉末5～30倍重量的25～100vol％的乙醇溶液中浸泡1～24h后进行超声提取，共提取1～6次，每次超声10～60min，过滤后将滤液减压浓缩至无醇味，冷冻干燥后获得美洲大蠊总提物。
优选的，步骤(1)中，所述通过回流的方式对美洲大蠊虫体干燥粉末进行粗提的方法如下：
将美洲大蠊虫体干燥粉末置于所述干燥粉末2～10倍重量的石油醚中脱脂12～48h，然后再置于所述干燥粉末2～8倍重量的石油醚中脱脂12～48h，接着于所述干燥粉末5～30倍重量的25～100vol％的乙醇溶液中浸泡1～24h后进行回流提取，共提取1～6次，每次回流10-120min，过滤后将滤液减压浓缩至无醇味，获得美洲大蠊总提物。
优选的，步骤(2)中，所述低极性有机溶剂为石油醚、环己烷、二氯甲烷或氯仿中的一种。
优选的，步骤(2)中，所述美洲大蠊总提物与水的质量比为1:1～10；所述混悬液、低极性有机溶剂和乙酸乙酯的体积比为1:0.5～3:0.5～3。
3、一种兼具促进急性髓系白血病细胞分化作用和抑制急性髓系白血病细胞增殖作用的药物，所述药物包括美洲大蠊乙酸乙酯提取物和可药用载体。
优选的，所述药物的剂型为但不限于口服液、片剂、颗粒剂、胶囊剂、滴丸、注射剂、透皮吸收制剂、外用洗剂或体内植入制剂中的一种。
4、一种兼具促进急性髓系白血病细胞分化作用和抑制急性髓系白血病细胞增殖作用的保健品，所述保健品中包括美洲大蠊乙酸乙酯提取物。
本发明的有益效果在于：本发明提供了美洲大蠊乙酸乙酯提取物在制备抗急性髓系白血病药物和/或保健品中的应用及产品，美洲大蠊乙酸乙酯提取物对急性髓系白血病细胞具有显著的选择毒性作用，能够有效抑制急性髓系白血病细胞增殖；同时，该提取物使急性髓系白血病细胞具有典型的髓样分化形态学特征，能够增加急性髓系白血病细胞NBT阳性率，促进急性髓系白血病细胞分化标志物CD14和CD11b的表达。该提取物不但能够促进急性髓系白血病细胞分化，还能够抑制其增殖，具有开发为抗急性髓系白血病药物的潜力，为治疗急性髓系白血病提供一种新的途径。
本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：
图1为美洲大蠊石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物对急性髓系白血病细胞(HL-60细胞)存活率的影响测试结果图；
图2为美洲大蠊乙酸乙酯提取物对急性髓系白血病细胞(HL-60细胞)增殖的影响测试结果图；
图3为美洲大蠊乙酸乙酯提取物对人正常细胞(293T细胞)存活率的影响测试结果图；
图4为美洲大蠊石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物对急性髓系白血病细胞(HL-60细胞)NBT阳性率的影响测试结果图；
图5为美洲大蠊乙酸乙酯提取物对急性髓系白血病细胞(HL-60细胞)分化形态学的影响测试结果图；
图6为美洲大蠊乙酸乙酯提取物对急性髓系白血病细胞(HL-60细胞)分化标记物CD14、CD11b的影响测试结果图；
图7为美洲大蠊乙酸乙酯提取物对人源急性髓系白血病(AML)-M2型细胞分化形态学的影响测试结果图；
图8为美洲大蠊乙酸乙酯提取物对人源急性髓系白血病(AML)-M2型细胞分化标记物CD14的影响测试结果图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
实施例1
制备美洲大蠊石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物
(1)将500g美洲大蠊虫体干燥粉末置于该干燥粉末6倍重量的石油醚中脱脂24h，然后再置于该干燥粉末4倍重量的石油醚中脱脂24h，接着于该干燥粉末2倍重量的75vol％的乙醇溶液中浸泡2h后转入渗漉筒，加入该干燥粉末10倍重量的75vol％的乙醇溶液浸泡48h后进行渗漉，最后再渗漉2次，每次渗漉加入该干燥粉末10倍重量的75vol％的乙醇溶液进行，收集每次渗漉液，混匀后减压浓缩至无醇味，获得230g美洲大蠊渗漉提取浸膏，即美洲大蠊总提物；
(2)取200g步骤(1)中获得的美洲大蠊总提物加1kg三级水混悬，获得混悬液，依次以与混悬液等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，收集各部分的萃取液，分别将各部分的萃取液和经上述三种溶剂萃取后的混悬液浓缩、冷冻干燥，得到石油醚提取物12.8g，乙酸乙酯提取物1.4g，正丁醇提取物32.7g，水提取物21.9g。
实施例2
测试美洲大蠊石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物对急性髓系白血病细胞(HL-60细胞)存活率的影响
以HL-60细胞为实验对象，取实施例1中制备的美洲大蠊石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物，经灭菌水配制，均以终浓度(0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mg/ml)处理细胞72h，同时将32nmol阿霉素(ADR)作为阳性对照组，使用SRB法进行检测。结果如图1所示，可知美洲大蠊石油醚提取物、正丁醇提取物和水提取物对HL-60细胞均未表现出明显的毒性，而美洲大蠊乙酸乙酯提取物能够明显抑制急性髓系白血病细胞HL-60的存活率。此外，以Kasumi-1细胞为实验对象，参照上述方法进行实验，发现美洲大蠊乙酸乙酯提取物对该细胞同样表现出一定选择毒性作用。
实施例3
测试美洲大蠊乙酸乙酯提取物对急性髓系白血病细胞(HL-60细胞)增殖的影响
以HL-60细胞为实验对象，取实施例1中制备的美洲大蠊乙酸乙酯提取物，经灭菌水配制，以终浓度(0、0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2mg/ml)处理该细胞120h，每隔24h使用苔盼蓝染色，进行活细胞计数，绘制细胞生长曲线，如图2所示，可知美洲大蠊乙酸乙酯提取物能够抑制该细胞的增殖，且随着给药浓度的增加，抑制作用越显著。此外，以Kasumi-1细胞为实验对象，参照上述方法进行实验，发现美洲大蠊乙酸乙酯提取物对该细胞同样表现出抑制增殖作用。
实施例4
测试美洲大蠊乙酸乙酯提取物对人正常细胞(293T细胞)存活率的影响
以293T细胞为实验对象，取实施例1中制备的美洲大蠊乙酸乙酯提取物，经灭菌水配制，以终浓度(0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mg/ml)处理该细胞72h，同时将32nmol阿霉素(ADR)作为阳性对照组，使用SRB法进行检测。结果如图3所示，可知美洲大蠊乙酸乙酯提取物对人正常细胞(293T)的毒性较小。
实施例5
测试美洲大蠊石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物对急性髓系白血病细胞(HL-60细胞)分化过程中耗氧量的影响
以HL-60细胞为实验对象，取实施例1中制备的美洲大蠊石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物，经灭菌水配制，均以终浓度(0、0.025、0.1mg/ml)处理该细胞72h，同时以0.1mg/ml实施例1中制备的美洲大蠊总提物(PA)按照上述方法处理该细胞作为对照组。因细胞在分化过程中，耗氧量增加，代谢增强，代谢过程中所脱的氢使硝基四氮唑蓝(NBT)还原成蓝黑色的点状或块状，沉积于细胞质中。故本实验将药物处理后的细胞与NBT在37℃下孵育40min，过程中加佛波酯刺激甲朊颗粒的形成，利用甲朊沉淀颗粒溶于DMSO的性质，于570nm下检测吸光值。结果如图4所示，可知美洲大蠊石油醚提取物、正丁醇提取物和水提取物无明显作用，美洲大蠊乙酸乙酯提取物增加HL-60细胞NBT实验阳性细胞率。
实施例6
测试美洲大蠊乙酸乙酯提取物对急性髓系白血病细胞(HL-60细胞)分化形态学的影响
以HL-60细胞为实验对象，取实施例1中制备的美洲大蠊乙酸乙酯提取物，经灭菌水配制，以终浓度(0、0.025、0.05、0.1mg/ml)处理细胞72h，同时以1μM全反式维甲酸(ATRA)按照上述方法处理该细胞作为阳性对照组，均使用瑞氏-吉姆萨进行染色处理，显微镜下观察细胞形态，并以50个细胞为一组，记录分化细胞数目，共三组，结果如图5所示，可知美洲大蠊乙酸乙酯提取物促使急性髓系白血病细胞HL-60出现典型的髓样分化：核质比变小，细胞核呈现马蹄形或半月形，且分化细胞数目随着药物浓度的增大而呈现增加趋势。此外，以Kasumi-1细胞为实验对象，参照上述方法进行实验，发现以上分化特征在kasumi-1细胞上也能观察到。
实施例7
测试美洲大蠊乙酸乙酯提取物对急性髓系白血病细胞(HL-60细胞)分化标记物CD14、CD11b的影响
以HL-60细胞为实验对象，取实施例1中制备的美洲大蠊乙酸乙酯提取物，经灭菌水配制，以终浓度(0、0.025、0.1mg/ml)处理细胞72h，同时以1μM全反式维甲酸(ATRA)按照上述方法处理该细胞作为阳性对照组，均以流式检测单核/巨噬分化标记物CD14以及粒/单核细胞分化标记物CD11b的表达，结果如图6所示，分化标记物CD14、CD11b的荧光强度值随着给药浓度的增加而升高，表明美洲大蠊乙酸乙酯提取物能够促进急性髓系白血病细胞分化标记物CD14、CD11b的表达，且随着给药浓度的增加，促进作用更显著。
实施例8
测试美洲大蠊乙酸乙酯提取物对人源急性髓系白血病(AML)-M2型细胞分化形态学的影响
以人源急性髓系白血病(AML)-M2型细胞为实验对象，取实施例1中制备的美洲大蠊乙酸乙酯提取物，经灭菌水配制，以终浓度(0.1mg/ml)处理该细胞72h，同时以0.2mg/ml实施例1中制备的美洲大蠊总提物、1μM全反式维甲酸(ATRA)按照上述方法分别处理该细胞作为阳性对照组，均使用瑞氏-吉姆萨进行染色处理，结果如图7所示，可知美洲大蠊总提物、美洲大蠊乙酸乙酯提取物均出现了典型的髓样分化特征：核质比变小，细胞核呈马蹄形或半月形，但美洲大蠊乙酸乙酯提取物在浓度更低的情况下呈现出更好的效果。
实施例9
测试美洲大蠊乙酸乙酯提取物对人源急性髓系白血病(AML)-M2型细胞分化标记物CD14的影响
以人源急性髓系白血病(AML)-M2型细胞为实验对象，取实施例1中制备的美洲大蠊乙酸乙酯提取物，经灭菌水配制，以终浓度(0.1mg/ml)处理该细胞72h，同时以0.1mg/ml实施例1中制备的美洲大蠊总提物、1μM全反式维甲酸(ATRA)按照上述方法分别处理该细胞作为阳性对照组，均以流式检测分化标记物CD14的表达，结果如图8所示，可知美洲大蠊总提物、美洲大蠊乙酸乙酯提取物均能促进人源急性髓系白血病细胞分化标记物CD14的表达，但美洲大蠊乙酸乙酯提取物作用更显著。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.美洲大蠊乙酸乙酯提取物在制备抗急性髓系白血病药物和/或保健品中的应用，其特征在于，所述药物和保健品兼具促进急性髓系白血病细胞分化作用和抑制急性髓系白血病细胞增殖作用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述促进急性髓系白血病细胞分化作用表现在美洲大蠊乙酸乙酯提取物使急性髓系白血病细胞具有典型的髓样分化形态学特征、增加急性髓系白血病细胞NBT阳性率或促进急性髓系白血病细胞分化标志物CD14和CD11b的表达。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述典型的髓样分化形态学特征为核质比例缩小，胞浆染色变浅，部分呈半月形或马蹄形核。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制急性髓系白血病细胞增殖作用表现在美洲大蠊乙酸乙酯提取物对急性髓系白血病细胞具有选择毒性作用。
5.美洲大蠊乙酸乙酯提取物的制备方法，其特征在于，所述方法如下：
(1)通过渗漉、超声或回流的方式对美洲大蠊虫体干燥粉末进行粗提，获得美洲大蠊总提物；
(2)将步骤(1)中获得的美洲大蠊总提物加水混悬，获得混悬液，将所述混悬液先以低极性有机溶剂萃取后，再以乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯萃取液，将所述乙酸乙酯萃取液浓缩、冷冻干燥后，获得乙酸乙酯提取物。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，通过渗漉、超声或回流的方式对美洲大蠊虫体干燥粉末进行粗提时，均先对美洲大蠊虫体干燥粉末进行脱脂处理。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述低极性有机溶剂为石油醚、环己烷、二氯甲烷或氯仿中的一种。
8.一种兼具促进急性髓系白血病细胞分化作用和抑制急性髓系白血病细胞增殖作用的药物，其特征在于，所述药物包括美洲大蠊乙酸乙酯提取物和可药用载体。
9.如权利要求8所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型为但不限于口服液、片剂、颗粒剂、胶囊剂、滴丸、注射剂、透皮吸收制剂、外用洗剂或体内植入制剂中的一种。
10.一种兼具促进急性髓系白血病细胞分化作用和抑制急性髓系白血病细胞增殖作用的保健品，其特征在于，所述保健品中包括美洲大蠊乙酸乙酯提取物。
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