CN102260645A - 整合式生物产品生产设备及相关方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了利用氨处理植物生物质以提供经氨预处理的植物生物质的方法，以及使用所述经氨预处理的植物生物质在产酶的微生物中刺激生长或促进酶合成的方法。所述方法能够经济而有效地运用于生物产品的生产设备中。

Description

整合式生物产品生产设备及相关方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及生物质的处理方法，具体地，提供了利用氨处理植物生物质以及使用经过处理的生物质在产酶的微生物中刺激生长和/或促进酶合成的方法以及相关的生物产品生产***和设备。
背景技术
纤维素生物质能用于生产各种生物产品。然而，许多常规方法非常昂贵，要求很高的资本支出，例如需要高压反应器和大量的添加剂。
本发明人首先认识到需要开发由纤维素生物质生产生物产品的改进的方法。
发明内容
本发明的一方面是一种方法，包括：用氨预处理来处理植物生物质以提供经氨处理过的植物生物质，其中所述植物生物质取自一种或多种植物；以及使用所述经氨处理过的植物生物质来在产酶的微生物中刺激生长或促进酶合成。
在一些实施方式中，所述经氨处理的碱性植物生物质含有在产酶的微生物中刺激生长或促进纤维素酶合成的可溶性物质和/或固体。
本文所述的方法还可包括使用溶剂从所述经氨处理的碱性植物生物质中提取至少一部分可溶性物质，从而生产可溶性提取物和经洗涤的预处理过的生物质。在一些实施方式中，所述可溶性提取物用于在产酶的微生物中刺激生长或促进纤维素酶合成。此外，所述经洗涤的预处理过的生物质还可用于在产酶的微生物中刺激生长或促进纤维素酶合成。
本文所述的方法能在利用经氨处理的植物生物质的生物产品生产设备中进行，以在生物产品生产装置中生产生物产品。在一些实施方式中，所述产酶的微生物包含在酶生产装置内，该酶生产装置任选含有可溶性提取物、经洗涤的预处理过的生物质和/或生物产品生产装置的含营养物的副产物。
在一些实施方式中，通过产酶的微生物所生产的酶为解糖酶(saccharolytic enzyme)。例如，所述解糖酶能选自葡聚糖外切酶(exoglucanases)、葡聚糖内切酶(endoglucanases)、β-木糖苷酶(β-xylosidases)、木聚糖内切酶(endoxylanases)、α-***呋喃糖酶(α-arabinofuranosidases)、纤维素诱导蛋白质2(cellulose induced protein 2)、α-***呋喃糖酶(α-arabinofuranosidases)、乙酰基木聚糖酯酶(acetyl xylanesterases)、α-葡糖醛酸酶(α-glucuronidases)、木聚糖内切酶(endoxylanases)、多聚半乳糖醛酸酶(polygalaturonases)、α-半乳糖苷酶(α-galactosidases)、乙酰基酯酶(acetyl esterases)及其组合。
所述产酶的微生物选自酵母、细菌、真菌及其组合。在一些实施方式中，所述产酶的微生物选自里氏木霉(Trichoderma reesei)和泡盛曲霉(Aspergillus Awamori)。
由经氨处理的碱性植物生物质得到的可溶性提取物可包括蛋白质、维生素、单糖、寡糖、脂质和微量元素。
用于从经氨处理的碱性植物生物质提取至少一部分可溶性物质的溶剂可以是水或基于水的溶剂。在一些实施方式中，所述溶剂为水性碱性氢氧化铵溶液。例如，所述水性碱性氢氧化铵溶液可含有约0.01％-30％重量NH4OH。在一些实施方式中，所述水性碱性氢氧化铵溶液的pH在约7-12之间。
所述可溶性提取物含有刺激剂。由此，所述可溶性提取物和/或刺激剂可用于在产酶的微生物中刺激生长。所述可溶性提取物和/或刺激剂还可用于在产酶的微生物中诱导或刺激酶生产。这种生长刺激和/或酶诱导可单独或同时进行，例如，在酶生产装置中进行。
植物生物质可以衍生自一种或多种植物。在一些实施方式中，所述植物为单子叶植物(monocot)。可以得到植物生物质的单子叶植物的实例包括草(grass)、玉米秸秆(corn stover)、高粱(sorghum)、甘蔗渣(sugarcanebagasse)、小麦(wheat)、稻谷(rice)、玉蜀黍(maize)或其组合。在一些实施方式中，所述草为柳枝稷(switchgrass)、芒草(miscanthus)、草芦(reedcanary grass)或其组合。在一种实施方式中，所述植物生物质为玉米秸秆。
氨预处理能使用多种含氨的物质采用多种方式进行。在一些实施方式中，所述氨预处理包括氨纤维膨胀。
本文所述的方法还可包括用酶水解所述经氨处理的植物生物质以产生酶水解产物浆料，其中所述酶为由所述产酶的微生物所分泌的酶，所述酶存在于可溶性提取物内或来自可溶性提取物，和/或所述酶存在于经洗涤的预处理过的生物质内或来自经洗涤的预处理过的生物质。
可将所述酶水解产物浆料进行机械加工，以生产包括可发酵的糖混合物的液体酶水解产物。
本文所述的方法还可包括使所述液体酶水解产物发酵以生产生物产品。
通过本文所述的方法来生产基于生物的产品。例如，通过本文所述的方法产生的基于生物的产品可以是生物燃料、烃或生物化学产物。
本发明的另一方面为根据本文所述的方法生产的生物产品。这种生物产品选自基于生物的化学物质、烃、生物化学产物或生物燃料。
本发明的另一方面为生物燃料生产设备，所述设备含有：生物产品生产装置，该装置被设置成由经氨预处理的生物质来生产生物产品和含营养物的副产物；和与所述生物产品生产装置连通的酶生产装置，并且该装置被设置成由含有由用于生物产品生产装置的经预处理的生物质提取的副产物和可溶性物质的营养物来生产酶。
生物燃料生产设备用来生产生物产品，例如生物燃料、烃、生物化学物质或其组合。在一些实施方式中，所述生物燃料为醇(例如，乙醇)。用于所述生物燃料生产设备的经氨预处理的生物质可以是经氨预处理的玉米秸秆。
本发明的另一方面为生产生物产品的方法，所述方法包括：在含有产酶的微生物、乙醇生产残余物和从经氨预处理的生物质提取的刺激剂的酶生产装置中生产酶；和将所述酶提供到其中生产所述生物产品的生物产品生产装置中。例如，从中提取刺激剂的经氨预处理的生物质可以是经氨处理的玉米秸秆。在一些实施方式中，所述乙醇生产残余物为玉米浆液。乙醇生产残余物可以例如是在所述生物产品生产装置中产生的含营养物的生物产品。此外，酶生产装置可包括稀释的预处理过的生物质。在所述方法中生产的生物产品可以是生物化学物质或生物燃料(例如，醇)。
从经氨预处理的生物质提取的刺激剂可包括能刺激微生物生长的可溶性物质。刺激剂还可含有在产酶的微生物中能刺激或诱导酶生产的可溶性物质。所生产的酶可以例如是解糖酶。例如，所述解糖酶可选自葡聚糖外切酶、葡聚糖内切酶、β-木糖苷酶、木聚糖内切酶、α-***呋喃糖酶、纤维素诱导的蛋白质2、α-***呋喃糖酶、乙酰基木聚糖酯酶、α-葡糖醛酸酶、木聚糖内切酶、多聚半乳糖醛酸酶、α-半乳糖苷酶、乙酰基酯酶及其组合。
在酶生产装置中的产酶的微生物可以选自里氏木霉(Trichodermareesei)和泡盛曲霉(A.Awamori)。
附图说明
图1A是根据各种实施方式，集成式生物产品生产设备的工艺流程图。
图1B是根据各种实施方式，图1A所示集成式生物产品生产设备的一部分的工艺流程图。
图2A图示根据各种实施方式，对于经氨纤维膨胀法(AFEX)处理的柳枝稷(AFEX-SG)，提取温度对蛋白质和生物质增溶率的影响。
图2B图示根据各种实施方式，对于AFEX-SG，氨浓度对蛋白质和生物质增溶率的影响。
图3A图示根据各种实施方式，对于AFEX-SG，提取pH对蛋白质和生物质增溶率的影响。
图3B图示根据各种实施方式，对于未经处理的柳枝稷和AFEX-SG，还原剂对蛋白质增溶率的影响。
图4图示根据各种实施方式，对于未经处理的柳枝稷蛋白质、AFEX-SG蛋白质和天然柳枝稷蛋白质，氨基酸曲线。
图5为根据各种实施方式，在水解之前通过提取进行AFEX处理的工艺流程图。
图6为根据各种实施方式，在水解之后通过提取进行AFEX处理的工艺流程图。
图7说明根据各种实施方式，6％纤维素负载固体负载酶水解的示例性组分输入和结果。
图8说明根据各种实施方式，图8所示过程的示例性质量平衡，包括AFEX处理过程的组分输入和输出的质量平衡。
图9A图示根据各种实施方式，在来自经AFEX处理的玉米秸秆(AFEX-CS)和经AFEX处理的稻草(AFEX-RS)的9％固体负载当量(SolidsLoading Equivalent，SLE)水提取物的发酵中的葡萄糖消耗。
图9B图示根据各种实施方式，在来自AFEX-CS和AFEX-RS的9％CLE水提取物的发酵中的细胞密度。
图9C图示根据各种实施方式，两阶段乙醇发酵和天然酿酒酵母(S.cerevisiae)副产物产生。
图9D图示根据各种实施方式，对于高细胞密度木糖发酵，重组体酿酒酵母的细胞再循环。
图10A图示根据各种实施方式，两阶段发酵的糖和乙醇曲线。
图10B图示根据各种实施方式，经过三代再循环，重组体酿酒酵母424A(LNH-ST)的木糖消耗。
图11A为根据各种实施方式，使用里氏木霉RUT-C30发酵，酶生产的图示。
图11B为根据各种实施方式，比较使用AFEX-CS和乳糖诱导的酶的相对活性。
图11C图示根据各种实施方式，使用AFEX-CS混合物诱导的1∶6稀释的RUT-C30浆，对于1％纤维素负载AFEX-CS的酶水解的净糖产率。
图11D图示根据各种实施方式，使用AFEX-CS水提取物(“WE”)、AFEX-CS固体生物质加上其水提取物(“AFCS+WE”)和乳糖，在诱导过程中差异表达的里氏木霉(RUT-C30)纤维素酶和半纤维素酶分泌的前11种物质。
图12A图示根据各种实施方式，对于使用解糖热厌氧杆菌(T.saccharolyticum)ALK2发酵的AFEX-CS水解产物，单体糖和乙醇的经时浓度。
图12B图示根据各种实施方式，对于使用T.saccharolyticum ALK2发酵的AFEX-CS水解产物，各种单体糖和寡聚糖的经时糖浓度。
图13是根据一种实施方式，使用所包括的内部酶生产和酵母共生产的生物炼制的生物转变部分的工艺流程图。
图14A是说明根据一种实施方式，与模型常规方案相比，模型集成式方案的成本和收入细目的条形图。
图14B是说明根据各种实施方式，四种类型的集成式方案的成本和收入的条形图。
图14C是说明根据各种实施方式，各种集成式方案的经济影响的条形图。
具体实施方式
在下述有关优选实施方式的详细描述中，结合作为本发明之一部分的附图，并且通过举例可实施本发明的具体的优选的实施方式进行说明。这里以使本领域技术人员能够实施本发明技术的程度来对这些实施方式进行描述。应理解的是，可以采用其它实施方式，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以进行化学上、程序上以及其他方面改变。因此，以下详细描述不应看作是限制性的，本发明的范围只是由所附权利要求书以及由这些权利要求所享有的等同物的全部范围所限定。
以下详细描述由定义部分开始，接着是对于由基于纤维素的生物质制备工业产品的当前技术的简述、对各种不同实施方式的描述、实施例部分和简要结论。
定义
本文使用的术语“生物质(biomass)”一般来说是指由可更新的生物来源作为能量来源收获或收集的有机物质。可更新的生物来源可包括植物材料、动物材料和/或通过生物方法生产的材料。认为术语“生物质”不包括化石燃料，化石燃料不可更新。
本文使用的术语“植物生物质(plant biomass)”或“木质纤维素生物质(lignocellulosic biomass)”或“纤维素生物质(cellulosic biomass)”是指实际上基于可持续发展的基础能用于能量的任何衍生自植物的有机物质(木质或非木质)。植物生物质可包括但不限于农作物废料和残余物，例如玉米秸秆、小麦秸秆、稻草、甘蔗渣等。植物生物质还包括但不限于木本能源作物、木材废料和残余物，例如树，包括果树，如结果的树(例如，苹果树、橘子树等)、软木森林疏伐、含树皮的废料、锯末、纸和纸浆行业废物流、木材纤维等。另外的牧草作物可能大规模生产作为另外的植物生物质来源，例如各种大草原草，包括大草原互花米草(prairie cord grass)、柳枝稷(switchgrass)、芒草(miscanthus)、大须芒草(big bluestem)、小须芒草(littlebluestem)、垂穗草(side oats grama)等。对于城市范围，潜在的植物生物质原料包括庭院垃圾(例如，草的修剪、叶子、树的修剪、灌木丛等)和蔬菜加工废物。已知植物生物质为自然界可用的碳水化合物的最普遍的形式，玉米秸秆为目前美国容易获得的植物生物质的最大的来源。
本文使用的术语“生物燃料(biofuel)”是指通过生物方法生产的任何可更新的固体、液体或气态燃料，例如，衍生自生物质的那些。大多数生物燃料起初衍生自生物过程，例如光合作用过程，由此可认为是太阳能或化学能量来源。其它生物燃料，例如天然聚合物(例如，几丁质或微生物纤维素的某些来源)，不是在光合作用过程中合成的，但是由于可生物降解而能看作是生物燃料。通常认为存在三种类型的衍生自在光合作用过程中合成的生物质的生物燃料，即，农业生物燃料(以下定义)、城市废物生物燃料(住宅和照明工业垃圾或废物，其中除去了大多数可再循环的材料如玻璃和金属)和林业生物燃料(例如，树、来自木材产品、木材纤维、纸浆和纸行业的废物或副产物流)。不是在光合作用过程中合成的由生物质生产的生物燃料包括但不限于衍生自几丁质的那些，这些物质为纤维素的化学改性的形式，称为N-乙酰基葡糖胺聚合物。由于含有海产品的壳，几丁质为水产业所生产的废物中的显著的组分。
本文使用的术语“农业生物燃料(agricultural biofuel)”是指衍生自以下物质的生物燃料：农作物(例如，谷物，如玉米)、作物残余物、谷物加工设备废料(例如，小麦/燕麦壳、玉米/豆粉、规格外的材料等)、牲畜生产设备废物(例如，粪肥、尸体等)、牲畜加工设备废物(例如，不需要的部位、清洁流、被污染的材料等)、食品加工设备废物(例如，已分离的废物流，如油脂、脂肪、茎、壳、中间过程残余物、漂洗/清洁流等)、有附加值的农业设备副产物(例如，蒸馏器的湿谷物(DWG)和来自乙醇生产设备的浆等)等。牲畜行业的实例包括但不限于牛肉、猪肉、火鸡、鸡肉、蛋和奶设备。农作物的实例包括但不限于任何类型的非木质植物(例如，棉花)、谷物例如玉米、小麦、大豆、高粱、大麦、燕麦、黑麦等、药草(例如，花生)、短循环草本作物，如柳枝稷、苜蓿等。
本文使用的术语“预处理步骤(pretreatment step)”是指意欲改变天然生物质使其能更有效和经济地转化为反应性中间体化合物(例如糖、有机酸等)的任何步骤，可将这些中间体进一步加工成多种有附加值的产物，如化学物质，例如乙醇。预处理能影响聚合物底物的结晶度，降低木素对生物质转变的影响以及预先水解一些结构上的碳水化合物，由此增加其酶可消化性和加速生物质降解为可用产品。预处理方法可以利用具有不同浓度的酸(包括硫酸、颜色、有机酸等)和/或其它组分例如氨、氢氧化铵、石灰等。预处理方法可以另外或可选择地利用热液处理，包括水、热量、蒸汽或加压蒸汽。预处理可以在各种类型的容器、反应器、管道、流经单元等中发生或展开。大多数预处理方法会引起木素部分或完全增溶和/或使木素去稳定和/或使半纤维素水解成为戊糖单体或低聚物。
本文使用的术语“水分含量(moisture content)”是指生物质的水分百分比。用水的克数除以湿生物质(生物质干物质加上水)的克数乘以100％来计算水分含量。
本文使用的术语“氨纤维***(Ammonia Fiber Explosion)”或“氨纤维膨胀(Ammonia Fiber Expansion)”(下文中称为“AFEX”)预处理是指用氨预处理生物质使得木素/半纤维素增溶和从在植物细胞壁之间再沉积到在生物质的外植物细胞壁表面再沉积的过程。在一些实施方式中，所用的氨为水性液体氨。在一些实施方式中，用于AFEX预处理的生物质的水含量降低。AFEX预处理***木素纤维素基体，由此改变木素的结构，部分水解半纤维素并增加纤维素的可用性，并且剩余的半纤维素进行随后的酶降解。木素为天然生物质酶水解的主要障碍，并且除去或变换木素为一些主要的预处理技术(包括AFEX)的可疑的机理。然而，与许多其它预处理相反，AFEX过程的低温和非酸性条件防止木素和/或半纤维素转化成能不利地影响酶/微生物活性的糠醛、羟甲基糠醛、酚和有机酸。该过程还使纤维素纤维膨胀和溶胀并且在木素纤维素生物质中进一步***无定形半纤维素。这些结构变化打开植物细胞壁结构，能够将木素纤维素生物质更有效和完全转变成有附加值的产物，同时保存物质的营养价值和组成。例如，参见在美国专利6,106,888、7187,176、5,037,663和4,600,590中所述的方法，所有这些专利通过全文引用并入并本申请。
本文使用的术语“生物产品(bio-product)”是指由预处理的生物质的酶水解和/或发酵而得到的产物。生物产品的实例包括由经预处理的生物质生产的生物燃料(例如，一种或多种醇，包括乙醇)、烃和生物化学产物(例如，有机酸，如乳酸或琥珀酸)。
本文使用的术语“生物产品生产装置(bio-product production unit)”是指在生物产品生产设备中的生物产品生产过程的一部分，其中将经预处理的木素纤维素生物质加工并转化为生物产品。
本文使用的术语“集成式生物产品生产设备(integrated bio-productproduction facility)”是指生物产品生产设备，该装置被设置成由经预处理的木素纤维素生物质生产生物产品和含营养物的副产物，并且进一步利用由经预处理的木素纤维素生物质提取的可溶性物质，用于以下两个目的中的至少一个：(1)促进或诱导通过微生物的酶生产，和/或(2)刺激用于发酵和/或产酶的微生物的生长。“集成式生物燃料生产设备(integrated biofuelproduction facility)”采用上述集成式方式生产生物燃料并且还称为“集成式生物炼制(integrated biorefinery)”。
本文使用的术语“含营养物的副产物(nutrient-containing byproduct)”是指由来自木素纤维素生物质的生产生物产品生产的副产物。含营养物的副产物可包括食品前体组分。玉米浆(Corn Steep Liquor，CSL)是含营养物的副产物的一个实例。
本文使用的术语“稀释的预处理过的生物质水解产物(diluted pretreatedbiomass hydrolysate)”是指水含量不少于约3％的预处理的植物生物质水解产物。稀释的预处理过的生物质水解产物可以是稀释的经氨预处理的生物质水解产物。
本文使用的术语“玉米浆(Corn Steep Liquor)”是指玉米湿磨的含营养物的副产物。CSL是可溶性蛋白质、氨基酸、碳水化合物、有机酸(例如，乳酸)、维生素和矿物质的混合物。
本文使用的术语“可溶性物质(solubles)”是指使用适当的溶剂由经预处理的生物质提取的组分。可溶性物质可包括至少一种为微生物生长刺激剂的“刺激剂”和/或诱导由微生物生产酶的试剂。生物质可以是木素纤维素生物质。所用的溶剂通常为水性溶剂。在一些实施方式中，当使用水作为溶剂时，其含有碱性试剂(例如，氢氧化铵)。
生物质转变为工业产物
几乎所有形式的木质纤维素生物质(即，植物生物质，例如单子叶植物)含有三种主要的化学部分：半纤维素、纤维素和木素。半纤维素为大多数具有5个碳的戊糖(木糖和***糖)和较少程度6个碳的己糖(半乳糖、葡萄糖和甘露糖)的短链、高度支化链的聚合物。另一方面，双子叶植物含有高含量的果胶酸盐和/或果胶，果胶为α-连接的葡萄糖醛酸的聚合物。果胶酸盐可以被甘露糖或鼠李糖等“修饰”。这些糖被乙酸高度取代。
由于其支化结构，半纤维素为无定形的且较容易通过酶或稀酸处理而水解(断裂或裂解)成其单个的组分糖。纤维素为葡萄糖的线性聚合物，如淀粉，为干谷物和湿磨乙醇植物中的玉米谷物的主要底物。
然而，与淀粉不同，纤维素的葡萄糖通过β-配糖键连在一起，β-配糖键使得纤维素形成紧密相连的线性链。由于在纤维素链之间能发生的氢键键合的程度高，纤维素形成刚性结晶结构，比起淀粉或半纤维素聚合物，该结构高度稳定并且更耐由化学攻击或酶攻击引起的水解。木素为酚类分子的聚合物，为植物提供结构完整性并且在植物生物质中的糖已发酵成为乙醇之后作为残余物质保留下来。木素为醇生产的副产物，并且由于其接近次烟煤的零硫含量和热值，认为是高品质固体燃料。
植物中半纤维素、纤维素和木素浓度的典型范围可得自以下网站：wwwl.eere.energy.gov/biomass/feedstock databases.html。典型地，纤维素占来自农业、城市和林业来源的残余物的30-50％。纤维素比半纤维素更难水解，但是，一旦水解，比起半纤维素，使用葡萄糖发酵能更有效地转化成乙醇。与此相反，半纤维素的糖聚合物较容易水解，但是使用标准发酵菌株(由葡萄糖生产乙醇)转化不如纤维素有效。虽然半纤维素糖代表用于转变成乙醇的“低悬挂”水果，显著较高含量的纤维素代表醇(例如乙醇)产率最大化的更大的可能，基于每吨植物生物质。
用于将生物质转化为醇的常规方法包括采用浓酸水解预处理的方法、两阶段酸水解预处理以及采用任何已知的常规预处理(例如热液或化学预处理)接着酶水解(即，酶-催化的水解)或同时酶水解和糖化作用的方法。这种预处理方法可包括但不限于稀酸水解、基于高压热水的方法(即，热液处理，例如蒸汽***和水性热水提取)、反应器***(例如，间歇、连续流动、逆流、流通等)、AFEX、氨再循环的渗滤(ARP)、石灰处理和基于pH的处理。然而，植物生物质的预处理-水解通常能导致产生和释放抑制微生物发酵的其它化学物质。这些抑制剂(即，糠醛)主要是糖降解的产物，需要除去这些抑制剂或降低其形成的方法或耐抑制剂的菌株。
这些方法中的一些使得半纤维素部分几乎完全水解，以有效回收高产率的可溶性戊糖。然而，半纤维素的化学增溶也产生毒性产物，例如呋喃衍生物，呋喃衍生物能抑制下游微生物反应(例如，发酵)。无论如何，半纤维素的水解促进周围半纤维素和木素的物理去除，由此将纤维素暴露于后续加工。然而，大多数(即使不是全部)预处理方法不能显著水解生物质的纤维素部分。
生物质转变为醇也提出独特的发酵考虑。用于常规玉米乙醇植物的酿酒酵母酵母菌株例如能使葡萄糖发酵，但是不能使戊糖(如木糖)发酵。此外，目前不存在能将存在于植物生物质中的所有主要的糖有效转化为乙醇的天然存在的微生物。因此，在理论上能将葡萄糖和木糖均发酵成醇的基因工程酵母或细菌用于将生物质转化为醇的过程。然而，在实践中，共同发酵无效，并且葡萄糖发酵仍是乙醇生产的主要反应。
实施方式的描述
在一种实施方式中，集成式生物产品生产设备(例如生物燃料生产设备)被设置成以产生用于形成可用于制备生物产品的生物产品和酶二者的预处理的木素纤维素生物质。在一种实施方式中，这种集成式方法用于生产乙醇和用于乙醇生产的酶，对于经预处理的生物质，无洗涤、解毒或补充增加(外来的)营养物。因此，经预处理的木素纤维素生物质不仅用作碳和氮的来源，而且还为生物燃料生产设备提供其它营养物。在一种实施方式中，所述方法还包括酵母生产。在一种实施方式中，将木素纤维素生物质用氨预处理，例如用氨纤维膨胀(AFEX)处理，通过降低抑制性降解产物的产生和富集经预处理的材料的氮含量来生产反应性、可高度发酵的植物材料。
图1A说明利用生物产品生产装置(BPU)102以生产生物产品15的生物燃料生产设备100的一种实施方式。在图1A所示的实施方式中，将生物质1提供到预处理装置104，该预处理装置104将生物质1预处理以生产经预处理的生物质2。在一种实施方式中，预处理装置104为AFEX处理装置。将一部分经预处理的生物质2提供到提取装置106，使用合适的溶剂(例如，水)从经预处理的生物质2提取可溶性物质，同时将剩余的经预处理的生物质2提供到BPU 102。在一种实施方式中，将约20％-约40％的经预处理的生物质2提供到水提取装置106。在一种实施方式中，将约30％-约35％的经预处理的生物质2提供到水提取装置106。
在一种实施方式中，生物质1为木素纤维素生物质(例如，未经处理的玉米秸秆)。在一种实施方式中，生物质衍生自一种或多种植物。一种或多种植物中的至少一种可以是单子叶植物。单子叶植物可包括但不限于玉米秸秆、草、玉米秸秆、高粱、甘蔗渣、小麦、稻谷、玉蜀黍或其组合。草可包括但不限于柳枝稷、芒草、芦苇金丝雀草或其组合。
在一种实施方式中，经预处理的生物质2为经AFEX预处理的玉米秸秆(AFEX-CS)。如上所述，经预处理的生物质2可以在提取装置106内进行提取。在一些实施方式中，提取一部分经预处理的生物质2。在其它实施方式中，提取大部分经预处理的生物质2。例如，在提取装置中能提取约5％-约70％的生物质2。在一些实施方式中，在提取装置中能提取约20％-50％的生物质2。提取后，可以将至少一部分经提取的预处理过的生物质4送至生物产品生产装置(BPU)102。
提取装置106提取至少一种刺激剂5，可将刺激剂5加入到酶生产装置108。在一种实施方式中，刺激剂5为经预处理的生物质2的水提取物。
酶生产装置108可含有能分泌解糖酶的微生物。在一些实施方式中，产酶的微生物为里氏木霉。在一种实施方式中，产酶的微生物为A.Awamori。在一些实施方式中，产酶的微生物为其中一种为里氏木霉的微生物的组合。
在一种实施方式中，生物产品15为生物燃料，例如醇和/或烃。在一种实施方式中，生物产品15为生物化学物质，例如有机酸和琥珀酸；含营养物的副产物18也可以是CSL。
使用提取添加剂25在提取装置106中提取经预处理的生物质2，以生产经提取的可溶性物质，即，刺激剂5(刺激微生物生长和/或微生物酶生产)和经提取的预处理过的生物质4。可以使用被设置成以提取可溶性物质的任何合适的条件。在一种实施方式中，用水提取可溶性物质作为提取添加剂25。在一种实施方式中，在碱性条件下提取可溶性物质，例如pH在约7-12之间，例如pH在约8-9之间。在一种实施方式中，用水性碱性氢氧化铵溶液提取可溶性物质作为提取添加剂25。在一种实施方式中，使用约0.01-约30％重量的NH4OH。
将经提取的预处理过的生物质4提供到含有经预处理的生物质2的管线；随后，将合并的组分(经提取的预处理过的生物质4和预处理的生物质2)进入BPU 102。
经提取的预处理过的生物质4可具有任何合适的水分含量。在一种实施方式中，水分含量不大于约95％。在一些实施方式中，经提取的预处理过的生物质4中的水分含量低至3％。在其它实施方式中，经提取的预处理过的生物质4中的水分含量为约5％-75％，非常常见的范围是约50％-75％。与经预处理的生物质2相比，经提取的预处理过的生物质4具有降低的碳水化合物含量。在一种实施方式中，与经预处理的生物质2相比，经提取的预处理过的生物质4中的碳水化合物含量降低高达约7％。在一些实施方式中，碳水化合物含量降低至少7％至约40％。
刺激剂5可以具有任何合适的固体负载，即，可以存在任何合适量的固体物质。在一种实施方式中，达到高达约18％的固体负载。在一种实施方式中，固体负载可以较高，例如高达约50％固体负载。随后将刺激剂5提供到酶生产装置108，向酶生产装置108中还提供从生物产品生产装置102离开的含营养物的副产物18(即，产酶的微生物)。随后将所得到的酶6提供到生物产品生产设备102，用于生产生物产品15。在一种实施方式中，酶6为来自里氏木霉发酵的解糖酶。在一种实施方式中，酶6来自泡盛曲霉(A.Awamori)。
将从生物产品生产装置102离开的潮湿的固体残余物8在固-液分离装置110(任选，含有加入的水17)中分离，以产生稀释的预处理过的生物质水解产物11和含有比潮湿的固体残余物8更少水分的固体残余物21。在一种实施方式中，固-液分离装置110含有螺旋压机。可将稀释的预处理过的生物质水解产物11提供到微生物种子培养112和酶生产装置108中，用作用于含营养物的副产物18(即，产酶的微生物)的糖来源。
将用微生物种子培养112生产的微生物13提供到BPU 102。可以使用和/或生产任何合适类型的微生物13。在一种实施方式中，使用和/或生产新鲜的天然和重组体酿酒酵母424A(LNH-ST)。可以使用和/或生产任何合适量的微生物13，其量根据多少微生物13被图1B所示的微生物再循环流19再循环以及多少微生物13在微生物清除流20中离开而变。
如图1B所示，BPU 102含有酶水解装置102，向酶水解装置102中提供酶6以及经预处理的生物质2和经提取的预处理过的生物质4。进行酶水解120之后，生产酶水解产物浆料7，将其提供到机械加工装置12，例如合适类型的压机，以生产残余的固体8和液体酶水解产物9。将液体酶水解产物9提供到发酵装置124和微生物预温育装置128二者中，在发酵装置124中还提供微生物13。
进入发酵装置124(与微生物13一起)的一部分液体酶水解产物9生产含微生物的生物产品14，可任选将其提供到沉降装置126中以生产生物产品15。在包括沉降装置126的实施方式中，残余的微生物17也可以离开沉降装置126。将任何残余的微生物17提供到微生物储罐21，在该微生物储罐21中将输出分成微生物再循环流19和微生物清除流20。例如，在每次再循环过程之后，可以清除不同量的微生物17。例如，在每次再循环过程之后，可以清除约1％-40％的微生物17。在一些实施方式中，可以清除约10％的微生物17。
此外，细胞预温育装置128被设置成以接受来自微生物储罐21的微生物再循环流19以及离开机械加工装置122的液体酶水解产物9。细胞预温育装置128预温育在微生物再循环流19中的微生物，以生产已温育的再循环的微生物16，将已温育的再循环的微生物16提供到发酵装置124。在一种实施方式中，微生物为酵母、真菌和/或细菌。
在一种实施方式中，仅用于举例说明的目的而提供，生物产品生产设备102可以如下操作：基于1000g未经处理的玉米秸秆，生产1020g经AFEX预处理的玉米秸秆(AFEX-CS)。将约1/3的AFEX-CS以18％重量固体负载洗涤，得到可用于酶诱导/生产的经水提取的刺激剂5。可诱导的酶包括来自里氏木霉的解糖酶。将压制的残余的固体中的可溶性糖进一步稀释，以产生用于里氏木霉RUT-C30和酿酒酵母的种子培养制剂的糖流。考虑用于预培养制剂和诱导的碳水化合物流，在输入未经处理的玉米秸秆中10％的碳水化合物用于酶生产。将其中总碳水化合物降低7％的经洗涤的经AFEX预处理的玉米秸秆加料至经预处理的AFEX-CS流，将合并的流进行酶水解(例如，使用解糖酶，其中的一些可以来自里氏木霉)。酶水解4天后，将酶水解产物浆料分离，通过机械加工方式(例如空气压机)得到液体酶水解产物和潮湿的残余的固体。液体酶水解产物含有使用两阶段乙醇发酵发酵成乙醇的糖。发酵可以采用新鲜的天然和/或重组体酿酒酵母424A(LNH-ST)(例如，对于葡萄糖发酵，使用0.05g/L新鲜的天然酿酒酵母，而对于木糖发酵，使用1.0g干重/L新鲜的酿酒酵母424A(LNH-ST)接种物)。也可加入或使用来自再循环流的酵母。在发酵过程中，能以20.8g干酵母细胞/1kg未经处理的玉米秸秆的产率生产天然酵母细胞。在每次再循环过程之后，能清除约10％的重组体酿酒酵母424A(LNH-ST)。
在一种实施方式中，经AFEX处理的酶水解产物例如经AFEX处理的玉米秸秆(AFEX-CS)酶水解产物的营养物含量(蛋白质、维生素和微量元素)的固体负载高达约18％，其中至少85％的碳水化合物溶解。在一种实施方式中，提供了一种支持使用AFEX-CS乙醇和内部酶生产的方法。(还参见实施例6，该实施例提供了示例性过程的经济模型)。
与常规实践相反，本文所述的实施方式不需要利用加入的营养物来支持用于发酵的微生物生长。在一种实施方式中，存在于生物质(例如纤维素生物质)中的营养物溶解于通过AFEX预处理而产生的水解产物的液体提取物中，并用于刺激微生物生长和/或酶合成。在一种实施方式中，由于存在过量的矿物质，经AFEX处理的生物质能超越乙醇生产而支持发酵活性。
通过降低或消除加入的营养物和酶，并且在一些实施方式中，还通过降低或消除加入的酵母，本文所述的方法比常规方法更经济。
在一种实施方式中，内部酶生产将外来的酶需求从10mg/g生物质降至不大于约1mg/g生物质。由于能利用来自用于酶生产的AFEX-CS的糖(单体和低聚物二者)，酶的总成本降低。
意外的是，从经预处理的生物质(例如经AFEX预处理的木素纤维素生物质)分离的水溶性提取物提供了用于生产纤维素酶和半纤维素酶的有效的诱导剂。为了最优化利用经预处理的木素纤维素生物质作为用于生产生物质降解酶的唯一的碳来源，对于工业真菌菌株的其它改进可能大大降低纤维素生物炼制的成本。
在一种实施方式中，通过至少部分再循环的酶进一步降低酶成本，例如将用尽的生物质水解产物与新鲜的未水解的固体逆流接触。降低水解酶(来自15mg蛋白质/g秸秆)的总量也降低酶的成本。使用内部酶生产方法利用大量纤维素生物质作为碳水化合物和矿物质的来源，由此消除对昂贵底物(例如乳糖或槐糖)的需求，同时达到优异的酶诱导。
通过酶生产的“内部”刺激而生产的酶滴定度足以支持高固体负载(至少18％重量固体负载)，其中在15mg蛋白质/g玉米秸秆酶负载下进行酶水解。因此，在各种实施方式中，并且与常规方法相反，不将酶混合物进一步浓缩，不加入蛋白质稳定剂和/或不加入防腐剂。
在一种实施方式中，由于水解产物中的酵母细胞的再循环能力高，无需大量的新鲜的细胞接种物可以进行高细胞密度发酵。由此，来自第一阶段乙醇发酵的天然酵母为可再循环至发酵过程或出售的可用的副产物的一个实例。因此，提出的生物炼制方法产生这样的方案：其中本文所述的方法能增强生长刺激剂、酶生产刺激剂、食品前体和酵母的生产，从而刺激生物燃料行业的生长。这些产物可以再循环回到过程的适当的步骤(参见图1A)或者出售以产生收入。除了食品和动物饲料行业以外，酵母用于产生专用产品，包括蔗糖酶、β-葡聚糖、磷脂和麦角甾醇。由此，酵母细胞为本文所述的方法的有价值的产物。
在一种实施方式中，天然酵母用作捕获和浓缩来自植物生物质的营养物的试剂，同时产生乙醇作为燃料。然而，在一些实施方式中，固-液分离优先于发酵，以促进酵母细胞从浆中分离。因此，这种生物转化能以单独的水解和发酵(SHF)方式完成，而不是同时糖化作用和共发酵(SSCF)方式。
在一种实施方式中，来自经AFEX处理的生物质(例如AFEX-CS)的水解产物，特别是在高固体负载下，富含营养物并且高度可发酵，含有与啤酒生产的麦芽汁类似的营养物水平。这点与常规实践相反，常规实践基于感觉来自生物质的酶水解产物必须优先于解毒和营养物补充以改进其通常的发酵能力。这种感觉可能是由于酸性预处理的性质，在酸性预处理中解毒(例如过量加石灰)和/或洗涤经预处理的材料以除去抑制性化合物使得经预处理的生物质营养物不足。
在一种实施方式中，提供含有两阶段集成式醇(例如，乙醇)发酵和解糖酶发酵的生物燃料生产设备，其中使用经AFEX预处理的生物质(例如，纤维素生物质，如玉米秸秆、柳枝稷、稻草等)作为碳水化合物和矿物质的来源，使用合适的微生物(例如，里氏木霉RUT-C30)进行发酵。
参考以下下实施例来进一步描述本发明的各种实施方式，提供这些实施例用于进一步举例说明本发明的各种实施方式。然而，应理解的是，在保持在本发明的范围内的情况下，可以进行许多变化和修改。
实施例1
通过酶水解针对从春天收获的柳枝稷(switchgrass)中提取蛋白质并且同时生成糖的可行性进行了测试。对采用氨水的固/液提取条件进行了优化，并将其与其他溶剂做了比较。对潜在的工艺流程方案就其糖和蛋白质的产量进行了检验，然后确定了最后处理过程的完全物料平衡。除去一些蛋白质和氨之后的溶液就是微生物生长刺激剂(MGS)。
材料与方法
给料
本实验中所用的给料是从奥本大学(Auburn University)获得并于2005年5月22日收获的阿拉莫柳枝稷(Alamo Switchgrass)(柳枝稷或SG)。该材料的含水率为大约9％。所有材料在试验之前均被研磨为小于2mm。
预处理
本实验中，AFEX预处理是在300mL的不锈钢压力容器内进行的。将水与柳枝稷混合以使其水含量增加至基于干重的80％。加入玻璃球以尽量减少空隙，从而减少气态的氨的含量。盖子用螺栓关闭，在样品桶内装入每克干重生物质计的1(+/-0.04)g NH3，并且允许氨充入到该容器内。反应器是通过400W PARR加热套加热，并在100℃(+/-1℃)下搁置5分钟。通过快速旋转排气阀使压力突然地释放。处理后的样品被移出并被放置于通风橱内过夜以除去残留的氨。
水解
酶水解的过程是以国家可再生能源实验室(the National RenewableEnergy Laboratory，NREL)称为Chemical Analysis and Testing(CAT)StandardProcedures的2004LAP-009规程为基准，而其全部在此通过参考引用被并入本文。样品在锥形烧瓶中通过1M柠檬酸盐缓冲剂而缓冲至pH4.8在10％固体负载进行水解。SpezymeCP(Genencor；Palo Alto，California)纤维素酶以15FPU/g葡聚糖(31mg蛋白质/g)的量加入，而β-葡萄糖苷酶(NOVOZYME188，Bagsvaerd，Denmark)以64pNPGU/g葡聚糖的量加入。所有样品均在50℃及200rpm转速下进行培养。在168小时后通过使用配有Bio-Rad(Richmond，California)Aminex HPX-87P碳水化合物分析柱的Waters高效液相色谱(HPLC)确定糖的浓度。脱气的HPLC水以0.6mL/min的流速作为流动相，而柱内温度被维持在85℃不变
蛋白质提取
使用Dionex(Sunnyvale，California)ASE200型加速溶剂提取器(Accelerated Solvent Extractor)对最佳的蛋白提取条件进行了筛选。在以11∶1液/固比进行AFEX处理之后，对每一试样通过两个单独的提取过程进行两次重复的提取操作，其条件为50℃，用3％氢氧化铵，pH＝10.5。在提取操作中采用1500psi(～102atm)使得逗留时间从约30分钟降至约3分钟。对于涉及不同pH值的实验，利用盐酸来降低pH值。在提取过程完成之后测定溶液的pH值。一旦达到最佳的提取条件，便使所有进一步的提取操作在烧瓶中进行30分钟，具有10∶1的液/固比率并同时不断地搅拌。
由于氨氮的存在，无论是在AFEX预处理还是随后的提取过程中，都无法使用标准的氮分析方法(Kjehldahl或Dumas方法)来测定总蛋白质含量。相反，蛋白质浓度是采用Pierce(Rockford，Illinois)双色酸比色分析试剂盒来测定，其中以牛血清白蛋白(BSA)作为标准。为了减少干扰试剂例如铵盐、木质素成分和葡萄糖的影响，蛋白质首先被沉淀并重新溶解(20)。将100μL的0.15％脱氧胆酸钠加入到100μL蛋白质溶液中，然后被搁置15分钟。将200μL的的15％三氯乙酸溶液加入，然后让其在2℃搁置过夜。该混合物在13,000rpm被离心10分钟，而所得颗粒用丙酮洗涤。所得颗粒重新溶解于含有0.1M三羟甲基氨基甲烷(Tris)、2.5M尿素和4％十二烷基硫酸钠(SDS)的缓冲液。已知浓度的蛋白质提取物被用来校准该方法的蛋白质回收率。
成分分析
在每一操作步骤之后剩余固体组分的重量和水分含量被测量用以确定***中的质量平衡。这些组份数的每种成分是依据NREL的LAP 002规程来确定的。灰分含量是通过将1.5g的生物质在575℃加热24小时然后测量重量损失来测定的。水和乙醇提取物通过使用索氏提取法(soxhletextraction)而被除出。部分的被提取的生物质被溶解在浓(72％)硫酸液中以10∶1的液固比在30℃消化1小时。该溶液被稀释至4％硫酸并且在120℃热压处理1小时，然后采用Bio-Rad(Richmond，California)AminexHPX-87H型HPLC色谱柱并以硫酸成分作为流动相进行糖含量分析。水解后的剩余固体减去固体残渣中的灰分含量之后，测得不溶于酸的的木质素。
结果与讨论
组成
本实施例中所使用阿拉莫柳枝稷的大约80％质量组成如下表1所示。其余的质量主要是水溶性成分，如较小的有机酸，及可溶于酸的木质素。
表1.阿拉莫柳枝稷的不溶于酸的(AI)成分(g/100g干物质)
Figure BSA00000476713700201
如表1所示，蛋白质的含量低于文献报道的其他菌株的柳枝稷。柳枝稷做为一种生物质能源作物生长并且在其生长季节早期被收获时会可能有接近10％的蛋白质含量，这可能更适合用于整合蛋白质和糖的加工。其中的纤维含量与在稍后日期收获的柳枝稷相比也较低，这似乎揭示低的糖产率也可能归因于较早的剪切。然而，早期剪切的柳枝稷与在秋天收获的相比更易于折断。因此，较低的纤维素和半纤维素含量可能并不是重要的因素。木质素含量低可能意味着对水解的干扰作用较低，以及较少的有害降解产物，而其可能会抑制糖产的生成或者会以其他方式存在于蛋白质产物中。与较晚季节收获的柳枝稷，即接近于完全成熟的植物相比，灰分含量较高。
用于这项研究的阿拉莫柳枝稷的主要氨基酸含量以及玉米和大豆的文献值(Parkinson et al.，Aquaculture 186：293-310(1999))被列于表2如下：
表2.阿拉莫柳枝稷(SG)、大豆和玉米的主要氨基酸含量
Figure BSA00000476713700212
表2中从左到右，氨基酸包括：精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、苏氨酸(Thr)和缬氨酸(Val)。如表2所示，柳枝稷具有相对较高含量的赖氨酸。作为一种主要的氨基酸，赖氨酸含量往往是在家禽食物中第一限制性氨基酸。柳枝稷中还有较高含量的苯丙氨酸和缬氨酸。柳枝稷中的亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸的含量较低，而这些氨基酸玉米中相对来说都是比较丰富的。因此，玉米-柳枝稷蛋白食物组合将抵消这些缺失，从而可以提供一种用来替代玉米-大豆食物的替代物。
提取优化
图2A显示提取温度对经AFEX处理的柳枝稷的整体蛋白质和生物质产量的影响，其中误差条表示最高值和最低值。从25℃至40℃，蛋白质产量显著地增加，但温度的进一步提高并没有导致蛋白质产量有较多的增长。这很可能是在柳枝稷中存在的蛋白质的大多数，如果不是全部的话，处于其自然状态，在其实际收获及干燥条件下似乎很少或没有影响。这样，温和的气温可能并没有展开蛋白质或者显著地影响其溶解能力。
图2B显示氨浓度对经AFEX处理的柳枝稷的蛋白质和物质产量的影响。当NH4 +的量以容量计从约1％增加至约3％时，蛋白质产量保持不变，但随后开始下降。这最有可能归因于蛋白的“盐析”，当蛋白质的盐浓度增加而降低了可用来溶解蛋白质的水含量。没有出现任何盐析效应，可能是因为1％容量的盐溶液已经是足够的浓度来溶解蛋白质。如图2B所示，被溶解的总物质未受盐浓度的影响。
图3A显示pH值对于蛋白质和物质产量的影响，其中被提取的蛋白质的量从pH值8至10.5而急剧地增加，然后趋于平缓。因此，本试验表明，该体系的pH值可能是决定蛋白质产量的一个重要因素。大多数蛋白质具有酸性等电点，在相应pH的蛋白质没有净电荷，从而至少能够溶解于极性介质。因此，就如本实验所示，提高pH值就会增加蛋白质的溶解能力。如图3A所示，大多数碱性溶液也使得溶解的总质量产生显著下降。因此，溶液中的生物质的量较少，会使蛋白质更易于提纯。此外，生物质在提取中的损失，很可能都包括半纤维素，其可被水解为糖以生成乙醇。进一步的pH值增加可以用比氨更强的碱而实现。然而，这种做法很可能会降解蛋白质。
使用了多种尝试通过加入非离子型表面活性剂来提高产量，即加入吐温80(TWEEN 80)作为非离子型表面活性剂，十二烷基硫酸钠(SDS)和β-巯基乙醇作为还原剂。图3B显示还原剂针对未经处理的柳枝稷(经水解但未经AFEX处理)以及经AFEX处理的柳枝稷(经水解和经AFEX处理)的蛋白质产量的影响，其中误差条表示最大值和最小值。通过添加表面活性剂或还原剂用于未经处理的柳枝稷并未发现显著地增长。然而，无论是添加TWEEN80或β-巯基乙醇于经过AFEX处理的柳枝稷确实促进了蛋白质的去除。这一结果表明AFEX过程以某种方式对蛋白质产生了影响。这种影响很可能是通过β-巯基乙醇裂解生成的硫-硫键，或者由于蛋白质的伸展和暴露疏水部位，其可通过表面活性剂而被重新溶解。溶解的柳枝稷的总质量也随着表面活性剂的添加而增加，这极可能是由于表面活性剂和柳枝稷的疏水部位之间的相互作用。
为了确定AFEX预处理是否影响各种蛋白质的回收，对各个氨基酸的组成进行了测定。图4显示了未经处理的柳枝稷蛋白质、经AFEX处理的柳枝稷蛋白质、以及原生柳枝稷蛋白质和原生柳枝稷(未经水解也未经AFEX处理)的氨基酸数据。无论是未经处理还是经过AFEX处理的柳枝稷均在最佳氨而且不添加表面活性剂或还原剂的条件下进行提取。虽然在提取过程中被溶解的蛋白质的氨基酸数据与原生柳枝稷中的蛋白质总量的情形相比有相当的不同，然而由未经处理的和经过AFEX处理的柳枝稷的提取物之间只呈现少许的差异。这样看来，虽然AFEX的确破坏了柳枝稷的细胞结构，但AFEX似乎并没有释放其他蛋白质。因此，很有可能是蛋白质本身结构，而不是用于生物质的植物的结构，影响了蛋白质的恢复。因此，对于柳枝稷的最佳提取条件为大约3％氨水在pH 10和温度为40-50℃。总蛋白产产量为大约40％重量。然而，至少在本组特定的测试条件下，AFEX并没有显示出显著地提高蛋白质的产量。
实施例2
本实施例描述了通过在AFEX之后立即进行提取操作或者在水解之后立即进行提取操作来整合糖和蛋白质的回收。除非另有注明，所有百分比均按重量计算。
水解前提取
在水解过程之前进行提取的整合的糖和蛋白质的整体质量平衡如图5所示。图中给出了蛋白质和灰分含量，以及总物质和所生成葡萄糖和木糖的量。最终产量为以每kg干生物质计算的240g葡萄糖、85.4g木糖、以及80.7g蛋白质。糖回收率为理论值的大约74％重量，表明糖的回收率可以进一步提高。发现了在提取物中有大约40％重量的蛋白质而在水解产物中有60％重量的蛋白质，其表明为了经济的考量应该从这两种物流中回收蛋白质。不溶性的生物质在水解之后被清洗，以确保所有的溶解性成分被回收。清洗过程中可能充当了第二次提取以除去与生物质的不溶性部位相结合的剩余蛋白质。总蛋白质产量约为总量的87％重量，其总量同时考虑了柳枝稷蛋白质和用于水解的酶。但是，不溶性蛋白质没有留存在生物质中，从而表明剩余的蛋白质在该过程中的某个时候被分解和失去。
在初始的蛋白质提取步骤中，有大约40％重量的生物质被溶解。在蛋白质被移除之后的生物质的可溶性部分可被用作微生物生长刺激剂(Microbial Growth Stimulant，MGS)。蛋白质可通过超滤或热沉淀而被浓缩或去除，而剩余的溶液可以进行进一步的处理以提供MGS。
在第一提取步骤中，大部分的灰分被从生物质中除去。灰分的去除产生最终的不溶残渣而其可被燃烧以提供热量并为生物质的生产设施提供能量。在本测试中，只有大约3％重量的灰分残留。因此，大部分的灰分可以通过一个单独的步骤进行去除，从而提供了一种生产低灰分含量产品的简约手段。
在整个测试中，有大约17％重量的柳枝稷仍然是不溶的。该残留物主要包含有未经水解的纤维和非溶性的木质素，以及很少或几乎没有的蛋白质或灰分。因此，这样的产物将可用作为生物燃料生产设施提供热量和动力的原料，从而降低天然气和煤炭的需求。此外，不含有蛋白质和灰分就可分别减少产生NOx和结渣的情形。
提取前的水解
图6显示了以种在提取之前主要用来进行水解的单独的操作过程，其中标有反应物和产物的量。图中给出了有关蛋白质和灰分含量的平衡量，也给出了总物质量以及所生成的葡萄糖和木糖的量。在此，糖产量略高，其总量按每kg生物质计算为365g，而采用图5所示的前一方案中的相应量为325g。这主要归因于木聚糖的转换，表明木聚糖低聚物有可能随蛋白质在前一方案中的初始提取步骤被提取。然而，尽管在柳枝稷中有大约60％重量的蛋白质在水解过程中被溶解，但在之后极少被提取。这可能是在水解过程中，产生了其他化合物而干扰比色分析，从而增加了相关的误差。然而，此处的质量平衡仅取决于单个的氨基酸而不是比色反应，从而提供了一种更准确的代表实际蛋白水平的表达方法。后续对最终残留物的提取操作并没有释放出多于一小部分的残留蛋白质，使得不太可能通过进一步处理除去残留的蛋白质
剩余的不溶性物质的量少于当提取是在水解之前进行(图5)情形中的量。不管怎样，仍然保存有可观数量的蛋白质。蛋白质具有与木质素相比较低的含能量，并且燃烧产生NOx。因此，在水解进行提取使得产能量较高，同时使得糖产量略低。
实施例3
在本实施例中，通过在AFEX处理之前进行提取操作而研究了整合糖和蛋白质之回收的选择方案。然而，糖产量比实施例2中所述的实验值低很多。在此可以推测，虽然并不希望受其束缚，提取的蛋白质和其他材料有可能在AFEX之前改变了AFEX预处理的效果。AFEX也产生了可能抑制水解的一些有机酸，以及，虽不确定，在先的提取可能会产生更多的这样的抑制酸。因此，在AFEX处理之后对柳枝稷的清洗使得糖产量提高到接近于没有任何在先提取过程的水解时的相同水平。
实施例4
玉米秸秆(Corn Stover，CS)是由国家可再生能源实验室(NREL)获得。该CS根据测定含有33.2％纤维素、22.4％木聚糖、3.3％***聚糖和2.3％蛋白质，其测定方法是依据国家可再生能源实验室(NREL)描述于NREL Standard Biomass Analytical Procedures，U.S.Department of Energy，2008的成分分析方法，以及描述于S.P.S.Chundawat，R.Vismeh，L.Sharma，J.Humpula，L.Sousa，C.K.Chambliss，A.D.Jones，V.Balan，B.E.Dale，Multifaceted characterization of cell wall decomposition products formedduring ammonia fiber expansion(AFEX)and dilute-acid based pretreatments，Biores Technol，101(2010)8429-8438的方法。
稻草(Rice straw，RS)的生产按照下述的方法：Zhong，C.，Lau，M.W.，Balan，V.，Dale，B.E.&Yuan，Y.J.Optimization of enzymatic hydrolysis andethanol fermentation from AFEX-treated rice straw.Appl.Microbiol.Biotechnol.84，667-676(2009)。所述RS含有4.7％纤维素，15.1％木聚糖和2.2％***聚糖，其测定是根据前述由NREL所规定的方法。
所述CS和RS均根据上述方法经过AFEX处理而分别地制备出经过AFEX处理的CS(AFEX-CS)和经过AFEX处理的RS(AFEX-RS)。所采用的AFEX处理过程也在下述文献中有描述：Zhong，C.，Lau，M.W.，Balan，V.，Dale，B.E.&Yuan，Y.J.Optimization of enzymatic hydrolysis and ethanolfermentation from AFEX-treated rice straw.Appl.Microbiol.Biotechnol.84，667-676(2009)，以及M.W.Lau，B.E.Dale，Cellulosic ethanol production fromAFEX-treated corn stover using Saccharomyces cerevisiae 424A(LNH-ST)，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica，106(2009)1368-1373。
在此试验中，用水对可溶物进行了提取，而水性提取物被用在为生成纤维素酶的里氏木霉(T.reesei)菌的生长介质。
18％SLE水提取物的准备
经过AFEX-预处理的玉米秸秆(AFEX-CS)用蒸馏水以1g干AFEX-CS比4.6g水的比例进行洗涤而得到含水提取物(18％固体负载当量)。在每一批次洗涤中，蒸馏水被预热至60-70℃并加到100g(干重当量)的AFEX-CS之中。浸湿的AFEX-CS的含水量通过压榨而降低。这样的洗涤过程操作进行了三个循环，亦即从前一洗涤循环中的水-提取物被用于下一洗涤循环。在最后的洗涤循环中，经过洗涤的AFEX-CS的水分含量被降至77±3％。该AFEX-CS的水提取物被用于发酵过程。有关准备步骤在Lauet al，Biotechnol.Biofuels 2：30(2009)中有所描述。溶解的总糖量是由通过将水提取物中总的可溶解糖量乘以由一定量的干AFEX-CS所得到的水提取物的总体积而计算得出。
20％w/w CSL的准备
由Cargill，Inc.(Minneapolis，MN)所获得的FermGoldTM玉米浸液(CornSteep Liquor，CSL)(Lot：154-07)被当作蛋白质添加物而用于发酵。为了准备20％w/w CSL，200g的FermGoldTM CSL在采用试剂级KOH调整pH值到5之后被用蒸馏水稀释至总体积1公升。不溶性固形物通过30分钟5,000×g的离心处理而被从液体中分离出来。所述20％w/w CSL经过无菌过滤(0.22μm)并被用于介质的制备。
种子培养液(Seed culture)的准备
介质：2％w/w玉米浸液+20g/L葡萄糖+50mM磷酸盐缓冲液(调整到pH 5.5)；以及培养条件：30℃，200rpm搅动，48小时培养时间。
木霉菌(Trichoderma)发酵
介质：60％v/v的种子培养液和AFEX-CS洗液的5.5％固体负载当量+0.5g的AFEX-CS于总容量50mL中；以及培养条件：pH5.5(每24小时进行调整)，30℃，200rpm搅动，96小时的培养时间。
酶水解
固体负载：1％纤维素含量当量的AFEX-CS；水解混合物：木霉菌发酵液其按1∶6与不同含量的Accellerase稀释；以及水解条件：pH4.8，50℃，250rpm搅动，24小时的培养时间。
养分含量分析
氨(Ammonia)
通过酶测验法(R-Biopharm AG(Cat no：11112732035，Darmstadt，Germany)对AFEX-CS水解产物中的游离氨进行测定。溶液被稀释到适当的浓度以备化验测定。NADH的还原程度，其表明溶液中氨的浓度，是通过采用分光光度计以在340nm波长的吸收度进行测定。还对标准氨溶液(对比实验)进行了测定以确保实验结果的准确性。其他实验细节以及有关酶化学的说明是由制造商提供的。
蛋白质
针对AFEX-CS水解产物中氨基酸浓度的分析是在the MSUMacromolecular Structure Facility使用配有Nova Pak C18(3.9mm×150mm；Waters)的高效液相色谱(HPLC)***而进行的。该***的详细操作被描述于Bergman，T.Carlquist，M.，Advanced Methods in Protein Microsequence Analysis-Amino Acid Analysis by High Performance Liquid Chromatographyof Phenylthiocarbamyl Derivatives，pp.45-55(1986)，其在此通过参考引用而全部并入本文。在分析中所涉及的氨基酸为天冬酰胺(Asp)、谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、苏氨酸(Thr)、精氨酸(Arg)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、赖氨酸(Lys)和苯丙氨酸(Phe)。
复合酶中蛋白质浓度的测定
通过蛋白质沉淀物的氮含量分析测定了商业酶Accelerase1000、Spezyme CP、Novozyme 188、Multifect Xylanase和Multifect Pectinase的蛋白质浓度。每种复合酶都经离心(13,000x g)处理5分钟，而且酶的0.20mL上清液与0.25％mL 100％w/v三氯乙酸(TCA)和0.80mL蒸馏水相结合，以沉淀在酶溶液中的蛋白质。经过5分钟在4℃的培育，该混合物于13,000x g离心5分钟并倒出上清液。所得沉淀物采用1.0mL的冷(4℃)丙酮洗涤两次，每次洗涤后都经离心分离并倒出残留的丙酮。洗过的蛋白质沉淀物被置于坩埚(用于氮分析仪的试样盛器)并真空干燥。
采用Skalar Primacs SN总氮分析仪(Breda，The Netherlands)测定沉淀物中的氮含量。该氮分析的基本原理是基于Dumas法而使用EDTA作为标准。氮含量通过乘以6.25的系数被转化为蛋白质含量。所给出的误差是重复实验的标准误差。据此方案分析得到的商用酶各自的蛋白质浓度被列于表3。
表3：商业酶中含氮化合物的浓度
Figure BSA00000476713700291
游离氨基酸
每种500μL的溶液各自被过滤(Millipore Centricon)，20uL已过滤的洗脱液用AccQ Tag(Waters)被衍生处理，10％的总的衍生样品被注入到HPLC***。
蛋白质氨基酸
所述三种溶液通过真空干燥(SpeedVac，Savant)并用6NHCl于蒸气相在100℃水解24小时。经过水解的干燥样品被溶解于100μL的20mM HCl，而10μL的混合物用AccQTag(Waters)被衍生处理。10％的经过衍生处理的混合物被注入到Nova Pak C18(3.9mm×150mm；Waters)柱。
总氮含量
使用Skalar Primacs SN总氮分析仪(Breda，The Netherlands)测定干燥未经处理的CS、经过AFEX处理的CS、固体残留物、酶溶液和AFEX-CS水解产物的氮含量。液体样品(1mL)在分析之前于110℃干燥过夜。氮分析是基于Dumas法并以EDTA为标准。样品的氮含量通过将被分析材料的氮含量(g)除以分析样品的重量或容积来计算。
矿物质
微量元素是采用the MSU Department of Geological Sciences的电感耦合等离子质谱仪(ICP-MS)进行测定的。
液体样品
大约1mL的液体样品在酸清洗过的Teflon savillex烧杯中采用1.9mLOptima硝酸和0.1mL痕量金属洁净的氢氟酸在加热板上消化、亚沸处理24小时。消化之后，加入0.250mL痕量金属洁净的30％的双氧水，并且样品在加热板上蒸发至近干。然后采用5mL的2％Optima硝酸将样品带至其最终容积，视觉上检测显示所有样品的完全消化。所得溶液通过ICP-MS进行完整的质量扫描分析。
固体样品
将大约100mg的固体样品加到置于经过酸清洗的Teflon savillex小瓶中的5mLOptima硝酸，并超声60分钟使样品均匀。然后样品被消化、亚沸，并被置于加热板上过夜。大约24小时后，加入0.1mL的痕量金属洁净的氢氟酸和1mL的痕量金属洁净的30％过氧化氢，并被消化24小时。最后，样品被允许蒸发至近干，并使用5mL的2％Optima硝酸配至其最终容积。所得溶液通过ICP-MS进行完整的质量扫描分析。
主要元素分析
被分析的主要元素包括钾(K)、镁(Mg)、钙(Ca)、磷(P)和钠(Na)。样品在分析之前被稀释1∶300。对于痕量元素分析：铬(Cr)、钴(Co)、镍(Ni)、铜(Cu))、砷(As)、镉(Cd)、铅(Pb)、钼(Mo)、铀(U)、锰(Mn)、锌(Zn)、硒(Se)、钡(Ba)和铁(Fe)的样品未经稀释而进行测试。
维生素
使用带有Waters Symmetry C-18柱的色谱/质谱/质谱(LC/MS/MS)联用仪(Quattro Micro，Waters)分析了对工业发酵有用的5种维生素。流动相以1mM五氟庚酸和乙腈在0.3mL/min流速下梯度运行。通过正离子模式的电喷雾离子化运行6分钟进行质谱分析。将毛细管电压、提取器电压和RF透镜电压分别设定为3.17kV，4.00V和0.3V。源温度和脱溶剂温度设为110℃和350℃。脱溶剂气流设为400L/hr。采用Waters QuanOptimize软件为各个转换对碰撞能量和源锥电位进行了优化。使用MassLynx4.0采集并利用QuanLynx软件处理质谱数据。
对CS和RS的水提取物的发酵
对AFEX-玉米秸秆和AFEX-稻秸的水提取物以9％固体负荷当量(SLE)进行了制备，其制备是基于以下文献所描述的方法进行：Lau，M.W.et al.，The impacts of pretreatment on the fermentability of pretreatedlignocellulosic biomass：a comparative evaluation between ammonia fiberexpansion and dilute acid pretreatment，Biotechnol Biofuels，vol.2，30pp，2009(Epub Date：December 8，2009)。
将葡萄糖和磷酸盐缓冲液(盐)加入到水提取物至最终浓度分别为100g/L和0.1M。将水提取物的pH值调整到5.5。酿酒酵母(S.cerevisiae)424A(LNH-ST)的种菌培养基是通过接种冷冻的存样到酵母提取物磷酸盐(Yeast Extract Phosphate，YEP)介质(5g/L酵母提取物+10g/L的胰蛋白胨+30g/L葡萄糖+20g/L木糖)，而培养基在30℃微好氧地生长约18小时。生成的培养基被在初始细胞密度2.0单位以及在OD 600nm的条件下用于接种水提取物。在酵母提取物磷酸盐(YEP)和酵母氮源(YeastNitrogen Base，YNB)中进行了并行的比对试验。这些发酵在在旋盖的15mL小瓶中的10mL操作容积以一式三份的方式进行。在选定的时间取样。
两阶段乙醇发酵
原生酿酒酵母S.cerevisiae(ATCC 4124)的冷冻丙三醇样品被接种到2％w/w玉米浸液(CSL)介质，辅助以20g/L葡萄糖并生长18小时。长成的种菌培养基被作为接种体，在相当于0.05单位OD600nm的初始细胞密度的80mL工作容积、用于对载有AFEX-CS酶水解物的6％葡聚糖进行第一阶段发酵具有。发酵进行了15小时且培养液被转移至50mL的锥形管(Falcon，BD)，使得细胞通过在30℃沉淀3小时而分离。澄清的液体水解物用移液器从锥形管中移到无挡板的锥形烧瓶中。
通过将冷冻的样品接种到载有酶水解物并辅以2％w/w CSL的3∶10稀释的6％葡聚糖制备木糖发酵酿酒酵母(S cerevisiae)424A(LNH-ST)的种菌培养基，且培养生长18小时。细胞被采集并在70mL的操作容积以相当于25单位OD600nm的初始细胞密度被接种到从第一阶段发酵的酶水解产物。其发酵过程再进行另外的48小时。在种菌培养基中的S.cerevisiae以及两阶段的乙醇发酵将在30℃，150rpm，pH值在5.5的情况下微好氧地生长在无挡板的锥形烧瓶中，所采用的方法参见下文的描述：Lau，M.W.et al，Cellulosic ethanol production from AFEX-treated corn stover usingSaccharomyces cerevisiae 424A(LNH-ST)，Proc Nat’l Acad Sci USA，Vol.106，Issue 5，pp.1368-73(2009)(Epub Date：December 8，2009)。样品在选定的时间取出，而细胞密度是依照下述文献中所描述的来测定：Lau，M.W.et al.，Ethanolic fermentation of hydrolysates from ammonia fiberexpansion(AFEX)treated corn stover and distillers grain without detoxificationand external nutrient supplementation，Biotechnology and Bioengineering，vol.99，Issue 3，pp.529-539(2008)(Epub Date：January 24，2009)。
里氏木霉(Trichoderma reseei i)RUT-C30的发酵
RUT-C30的冷冻丙三醇袍子材料被接种到2％w/w CSL，在pH为5.5(50mM磷酸缓冲液)补充以20g/L葡萄糖，。预培养液(50mL)在30℃生长在带有挡板的250mL烧瓶中，200rpm，48小时。在酶的诱导阶段期间，18％固体加载当量(SLE)的AFEX-CS的水提取物(加载在27.8％v/v)和/或充分研磨的(通过0.5mm的筛子)AFEX-CS(1％w/v)被添加到预培养液(60％的v/v)中作为酶诱导剂。蒸馏水和磷酸盐缓冲液被加入到各自的混合物中以达到最终体积为50mL。在诱导后24小时，补充额外的CSL相当于1％最终浓度w/w CSL。培养发酵液30℃120小时，并每24小时加入HCl调pH至5.5。在诱导阶段发酵的工作容积为50mL。诱导阶段完成后，发酵培养液离心转2,500x g 30分钟。该无细胞发酵液被用于诱导酶水解在1％葡聚糖加载AFEX-CS。
通过使用装配有51mLHisPrep 26/10脱盐柱(GE Healthcare，Lot#17-5087-01)的FPLC***(GE Healthcare，白金汉郡，英国)从分子量较小的其他背景蛋白分离出糖解酶。用BCA检测仪(Pierce Biotechnology，Rockfort，IL)测定包含有所载糖解酶的该部分的浓度。通过考虑到所涉及的稀释因子的数量，初始的浓度被计算出。
为了比较AFEX-CSCS的提取液相对于乳糖的诱导功效，用18％固体加载当量(SLE)的AFEX-CS的液体提取物(在27.8％v/v被加载)或用4.17g/L的乳糖处理RUT-C30的预培养(60％v/v)。其他发酵程序和参数保持一致，以方便比较。两者诱导剂的初始糖浓度是相同的(4.17g/L升)。
AFEX-CS的酶水解加载1％葡聚糖
RUT-C30的发酵培养液通过1∶6(1份的培养液+5份的蒸馏水)的比被稀释。该稀释的培养液是用来对AFEX-CS进行酶水解，在pH值4.8，50℃加载1.0％葡聚糖24小时。该AFEX-CS是充分细磨的，并通过0.25mm筛子(超离心粉碎机ZM 200，RETSCH，德国)。Accellerase在不同剂量(0.0，1.0，2.0mg蛋白/g干AFEX-CS)被加入到稀释的培养液以探讨补充外源性酶的需要。使用比对试验使用的商用酶混合物来进行比较。这种酶的混合物包括Accellerase 1000(120mL/kgCS)，Multifect木聚糖酶(6.2mL/kgCS)和Multifect果胶酶(4.3mL/kgCS)。
分析方法
使用国家再生能源实验室-LAP-014量化寡糖的水平，其是基于酸水解的一种方法。如Lau et al.，Biotechnology and Bioengineering 99(3)：529-39(2008)中所描述的，使用装配有Biorad Aminex HPX-87H柱的高效液相色谱***量化葡萄糖、木糖、***糖和乙醇。
AFEX-CS的酶水解加载6％葡聚糖
在3L生物反应器(Applikon，Biobundle，加州福斯特市)中进行酶水解(2.0kg总糖化作用)在50℃，pH值4.8，历时96小时。为了实现适当的液化且在整个酶水解过程中搅拌，AFEX-CS和商用酶两者被分批给料。AFEX-CS的是被给料以5个批次(6.0％，3.0％，3.0％，3.0％，3.0％的固体加载)分别增加之间的时间间隔为2，1，1，1.5，1.5小时。关于酶的给料，三分之二的总量的酶被添加是在前8小时(1/3，在0小时；1/6，在4小时；1/6，在8小时)。其余三分之一的酶被给料而送入反应器内是在随后的40小时(1/6，8-24小时；1/6，24-48小时)，每60分钟使给料均匀分布。使用总量蛋白质加载7.4mg蛋白/g生物质。商用酶和其各自所用剂量是Accellerase 1000(120mL/kg CS)，Multifect木聚糖酶(6.2mL/kgCS)和Multifect果胶酶(6.2mL/kgCS)。分析该商用酶的蛋白浓度及构建酶水解的质量平衡如Lau，M.W.et al，Cellulosic ethanol production fromAFEX-treated corn stover using Saccharomyces cerevisiae 424A(LNH-ST)，ProcNat’l Acad Sci USA，Vol.106，Issue 5，pp.1368-73(2009)(Epub Date：December 8，2009)中所述。
木霉属细胞外(Trichoderma Extracellular)蛋白分离的蛋白质组学
用氯仿/甲醇沉淀方法分离来自酵母菌培养基的细胞外蛋白质，该方法如下文描述：Wessel&Flügge，Analytical Biochemistry 138(1)：141-143(1984)and Jiang et al.，Journal of Chromatography A 1023(2)：317-320(2004)。加入四份体积的冷甲醇到一份体积的培养基中并涡旋良好。一份体积的冷氯仿跟着3份体积的冷水被随后添加到混合物中并再次涡旋。该混合物在4℃，15,000g离心转10分钟之后，其水(上)层被舍弃并又加入四份体积的冷甲醇。该混合物在4℃，15,000g离心转30分钟之后，其液体的上清层被小心地移除而不干扰沉淀蛋白颗粒。在进行蛋白质组学分析之前，该蛋白颗粒风干一夜并重新溶解在SDS-PAGE样品缓冲液(
Figure BSA00000476713700351
LDS的样品制备缓冲液，Invitrogen，CA)中。
蛋白质组学和蛋白质同源鉴定
重新溶解的蛋白质(～400g)被加载到SDS-PAGE胶(
Figure BSA00000476713700352
Invitrogen，CA)且在50V进行电泳15分钟，直至在凝胶内堆积蛋白质。然后凝胶带被切出，并受到胶内胰蛋白酶的消化(Shevchenk et al.，Anal.Chem.68(5)：850-58(1996))。提取的缩氨酸被重新悬浮在2％乙腈和0.1％三氟乙酸的溶液中至20μl容积。从该溶液，10μl通过Waters nanoAcquitySample Manager(www.waters.com)被自动注入并被加载达5分钟到WatersSymmetry C18 peptide trap(5μm，180μmx20mm)以4μL/min速率在2％乙腈/0.1％甲酸中。该绑定的缩氨酸，然后使用超高效液相色谱WatersnanoAcquity UPLC(缓冲液A＝99.9％水/0.1％甲酸，缓冲液B＝99.9％乙腈/0.1％甲酸)并(在Michrom MAGIC C18AQ柱((3u，200Angstrom，100μmx150mm，www.michrom.com)洗脱超过60分钟，在46min内用2％B至30％B的递进梯度，并在47分钟飙升至90％B，在49分钟后以流速1μl/min回至5％B。使用Michrom ADVANCE纳喷雾源将已洗脱得缩氨酸喷入ThermoFisher LTQ-FT超质谱仪(www.thermo.com)。测量结果扫描将采取在FT中进行(25,000分辨率在m/z 400确定)且每测量结果扫描的前十位离子会然后受到自动低能量的碰撞而被诱导在质谱仪(LTQ)中解离(CID)。由此产生的MS/MS光谱使用Bio Works Browser v3.3.1(ThermoFisher)被转换为峰值表，使用默认的LTQ-FT超参数以及用Mascot search algorithmv2.3(www.matrixscience.com)搜索以针对酵母菌蛋白质从NCBI进入，数据下载于09年11月13日，而且针对Trichoderma reesei蛋白质数据库，v2.0，从美国能源部联合基因组研究所((JGI)下载。所有数据库的Mascot参数允许多达2个错过的胰蛋白酶位点，脲甲基半胱氨酸的固定修改和由于蛋氨酸氧化的可变修改。缩氨酸和MS/MS碎片公差分别为±10ppm(单一同位素)和0.60Da(单一同位素)。Mascot输出值随后用Scaffold仪器(www.proteomesoftware.com)分析Mascot输出值以有可能性地使用ProteinProphet计算机程序法((Nesvizhskii et al.，Anal.Chem.75(17)：4646-58(2003))来验证蛋白质鉴定。正值蛋白质分配的最低标准是至少有两个缩氨酸并大于95％信任度过滤器通过Scaffold仪器确定。未表征的和/或推测的蛋白质序列被BLAST针对UniprotKB数据库，以确定从其他微生物的相似的蛋白质的同源性。
其他结果和分析
经AFEX处理的玉米秸秆(AFEX-CS)的处理过程中的养分含量及物质平 衡
分析和量化了在加载6％的纤维素的酶水解中的氨基酸、微量元素及维生素含量。其结果如下表4和表5。酶水解物含800±50mg/L氨和1231±44mg氨基酸总量，其中16％重量是以游离氨基酸的形式如表4所示。谷氨酸(Glu)，甘氨酸(Gly)和丙氨酸(Ala)是三种最丰富的氨基酸被发现于水解产物中。氨基酸浓度比应用在啤酒厂(800-900mg/L总氨基酸)中的一种典型麦芽汁还要高。
表4.AFEX玉米秸秆(AFEX-CS)酶水解的氨基酸浓度
Figure BSA00000476713700371
对于微生物的生长有益的十大已知微量元素，与酵母发酵文献建议值相比超量很多。见Walker，G.M.in Advances in Applied Microbiology，Vol.54.(eds.A.I.Laskin，J.W.Bennet&G.M.Gadd)(Elsevier Academic Press，NewYork，NY；2004)(以下简称“Walker”)。镁(269±6mg/L)被认为是在一个足够的水平，如表5所示。泛酸(panthothenic)、，维生素B6、烟酸和维生素H的浓度都高于一种典型的麦芽汁的水平。维生素B1(0.4μM)水平略低于“参考”0.57-2.83μM浓度范围的下限。见引用文Walker。
在水解产物中AFEX-CS是蛋白质、微量元素和维生素的主要来源。商用酶对营养成分水平的贡献很低。
表5.酶水解的AFEX-CS的微量元素与维生素
Figure BSA00000476713700381
表6显示了未经处理的CS，AFEX-CS及酶水解后的残留物的全部矿物质的分析结果。
表6.未经处理的CS，AFEX-CS及酶水解后的残留物的全部矿物质的分析 结果
Figure BSA00000476713700391
Figure BSA00000476713700401
表7显示了AFEX-CS和AFEX-RS的9％SLE的水提取物的全部矿物质的分析结果
表7.的AFEX-CS和AFEX-RS的9％SLE的水提取物的全部矿物质的分 析结果
Figure BSA00000476713700402
Figure BSA00000476713700411
利用市售的酶酶水解AFEX-CS在18％固体加载(6％葡聚糖加载)。约85％的总糖类被水解且溶解于液体流中，实现了总可溶性糖浓度110g/L。见图7。
质量平衡相对于总氮(N)，磷(P)和钾(K)证实乐总氮量的80-82％及来自AFEX-CS的钾(水解)被溶解于液体流。然而，多数的磷(64％)在酶水解后仍留在了残留固体物中。见图8。
利用来自AFEX处理的CS(AFEX-CS)和AFEX处理的RS(AFEX-RS) 的水提取物实证检验乙醇发酵
水提取物带有9％固相加载相当含量，含部分已溶解的生物质成分，均是从AFEX-CS和AFEX-RS生成的。加入葡萄糖作为碳源以生产出最终浓度100g/L。用S.cerevisiae 424A(LNH-ST)发酵48小时后，葡萄糖在两种水提取物中都被完全消耗。酵母的最终酵母细胞密度(在48小时)为4.5～5.5g干重/L(图9A和9B)。这些数值均高于酵母氮碱性发酵(YNB；13.7g/L)，但并不如酵母提取物+蛋白胨(YEP：5g/L的酵母提取物+10g/L的蛋白胨)的高。这些结果表明，养分含量水平大于来自预处理CS和RS的9％固体加载相当量的水平是足够高的以支持酵母发酵。此外，由数据显示，在更高固体加载水解中营养物质是过多的，因而这样的一种水提取物或水解产物可以支持多个发酵。
使用天然和重组的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的两阶段乙醇发酵
为了进一步探讨利用玉米秸秆在高固体加载以支持多种发酵的潜力，通过天然酿酒酵母S.cerevisiae(ATCC 4124)，AFEX-C水解产物从18％w/w加载糖化被发酵达15小时，在酵母细胞从水解产物中被分离之前进行沉淀3小时(图9C)。在第二阶段，高细胞密度(11.25g干重/L)的重组酿酒酵母S.cerevisiae 424A(LNH-ST)被接种以使剩余糖发酵(图9C)。葡萄糖发酵以3.2g/L/hr的速率进行(0-15hr)，并在18hr完成。经过沉淀，收集4.1g干重/L酵母细胞。在高细胞密度发酵的第二阶段，87％的木糖在前24小时被接种的重组酿酒酵母S.cerevisiae消耗。通过代谢的乙醇产量处于最大理论值的92.1％(FIG.10A)而使乙醇最终浓度达到39g/L。
重组酿酒酵母S.cerevisiae 424A((LNH-ST)的细胞可以在随后的三个发酵周期中(图9D条)被回收和使用，。从本质上讲，木糖发酵使用回收的酵母细胞达到了与新细胞相比较(图10B条)之类似的功效(图10B)。这有效地减少了在随后的发酵批次中对新细胞的需求而没有显着降低木糖发酵率，节省了大量成本。
内部酶的生产
木霉属Trichoderma reesei RUT-C30首先被培养在含有2％w/w玉米浆和20g/L的葡萄糖组成的媒介中达36小时。糖解酶通过固体和AFEX-CS的液体提取物的混合物被诱导96小时(图11A条)。表8显示了酶诱导剂用于Trichoderma reesei RUT-C30发酵关于图11B，11C和11DD。
表8.关于图11B-11D用于T.reseei RUT-C30发酵的酶诱导剂
Figure BSA00000476713700421
如图11B所示，产生的糖解酶的浓度为2.7g/L，其提供了18％w/w酶水解按15mg酶蛋白每克水解玉米秸秆计。约13％的蛋白质通过CSL诱导被转化为糖解酶。
T.reesei木霉发酵液按1∶6的比被稀释，且已稀释的培养基在有或没有额外的酶(Accellerase1000)的情况下被用于水解AFEX-CS加载1％的纤维素达24小时。酶水解用1∶6稀释内部的T.reesei培养基在24hr之内达到总可溶性的糖产量在15g/L(理论最大产量的85.6％)(图11B)。总糖产量水平是相比于基于商用酶(15.7g/L；89.4％)的标准酶的混合物的产量，其表明内部酶的生产单位可以有效地支持加载高固体的酶水解(图11B)。对于单体糖，Accellerase加载在1.5-2mg蛋白/g玉米秸秆被用来实现与通过标准的混合物提供的类似的单体糖产量，其中可获得13.7g/Lde总单体葡萄糖和木糖(图11B)。
可发现，用于酶诱导用的AFEX-CS混合物在相同糖重量的基础上比乳糖强约2.5-7倍。当AFEX-CS提取物代替在相同初始糖当量的乳糖被用于诱导的时候，通过T.reesei木霉水解酶达到产糖量净增加10.4g/L(占59％总葡萄糖/木糖水解产量比率)(图11B)。
大部分纤维素酶(如Cel7A，Cel6A，Cel74A，Cel7B，Cel5A和β-甘露聚糖酶在通过使用AFEX-CS或乳糖被T.reesei表达时在丰度上几乎没有差异的(在双重的)。然而，AFEX-CS处理的T.reesei导致显著增加(＞2叠在蛋白质含量方面)在几种endocellulases的表达(Cel61A，Cel12A)和半纤维素(如β-木糖苷酶，endoxylanases，α-arabinofuranosidases，CIP2，，木聚糖乙酰酯酶，α-葡萄糖醛酸酶，polygalaturonase)的表达。以前并未对乳糖诱导的致T.reesei.观察。图11D显示了蛋白质的相对丰度使用AFEX-CS或乳糖被表示，其中AFEX-CS组相对于乳糖比对组在丰度上大于双重的差异。
利用AFEX处理玉米秸秆(用AFCS或AFCS+WE作为诱导剂)导致了几个新的家族endocellulases(Cel61A，Cel12A)和半纤维素(β-木糖苷酶，endoxylanases，α-arabinofuranosidases，CIP2，木聚糖乙酰酯酶，α-葡萄糖醛酸酶，polygalaturonase)在表达上的显著增加，它们通常从乳糖诱导的Trichoderma reesei RUT-C30的蛋白质组中消失。
有趣的是，使用AFEX处理的固体生物质和AFCS水提取物是有利于诱导多种酶(Cel12A，Cel61A，α-葡萄糖醛酸酶，果胶酶，β-半乳糖苷酶，α-半乳糖苷酶，乙酰胆碱酯酶等)，当单独使用AFCS水提取物，其既不被表达也不被表现在非常低的丰度。这表明，固体预处理木质纤维生物质的存在是有用的，比仅仅使用从预处理木质纤维素生物质分离的可溶的诱导物相比有更多套综合酶的诱导表达。
α-葡萄糖醛酸酶，α-半乳糖苷酶和乙酰胆碱酯酶的表达只存在于固体生物质中也表明有一定的不溶性半纤维素组成部分(如木聚糖配有葡萄糖醛酸支链)被限制在细胞壁基质内，这些对于诱导酶是必要的。根据采用的AFEX条件，至少在玉米秸秆细胞壁中应该有10-15％完整的乙酰酯类，其有可能导致乙酰酯的诱导和表达(JGI#121418)。然而，另一木聚糖乙酰胆碱酯酶(JGI#54219)被表达相似的丰度水平在AFCS和AFCS-WE中，，但其不存在于单独的乳糖诱导中。可见，AFCS/AFCS+WE的CIP2丰度10-15倍高于单独的乳糖。
在AFEX处理之后，从玉米秸秆细胞壁中释放出大量的arabino-木聚糖低聚物，这也许可以解释为观测到的β-木糖苷酶表达的大量增加，其很可能是被这些半纤维素低聚物诱导而引起的。
实施例5
使用酶分泌的ethanologen Thermoanaerobacterium saccharolyticum的 AFEX-CS酶水解产物的分批补料发酵
在定制的配有pH探针的发酵罐(NDS Technologies，NJ)中进行分批补料发酵(fed-batch fermentation)。由外部水浴槽循环***控制发酵罐的温度。采用Sartorius A plus***(Goettingen，Germany)控制输料和pH值。反应器的初步容积为120mL，其中包含18％固体负载的20mL水解产物，营养补充剂和蒸馏水(用于稀释)。作为营养补充，加入1g酵母提取物、0.5g蛋白胨、及用于溶液B，C，D和E(见表9)的10mL浓缩液备料。
表9：MTC介质用于T.saccharolyticum ALK2的生长
Figure BSA00000476713700441
Figure BSA00000476713700451
发酵介质采用KOH调整pH值到6.2并用氮喷约10分钟以造成厌氧条件。种菌培养(10mL)被接种到初始发酵。，未经稀释的18％固体负载的酶水解物在pH 6.2(用10g/L的酵母提取物和5g/L蛋白胨补充)用作给料。在接种后的4小时开始，以4mL/hr的速率进行给料，直到180mL的给料量被加进了发酵罐。在选定的时间采集样本。用HPLC分析葡萄糖、木糖、***糖(以单体的形式)和乙醇。对低聚糖通过基于NRELProtocolLAP-014的酸水解进行分析。
在富营养补充发酵中，在水解产物中近90％的总糖(单体和低聚物)被消耗，而获得0.45g EtOH/g耗糖的代谢产率(见图12A及12B)。发酵在接种后的64小时内完成；给料15小时后结束。在这个时间段超过总量60％的低聚糖被消耗。本发明人确定，ALK2能够从包含相当于11.7％固体负载的AFEX-CS的降解化合物的水解产物、以0.45g/L/hr(0-64hr)的速度增加和生产乙醇到30g/L。
实施例6
为了在商用精炼设施确定这些变化的可行性，建立了拟用方案的技术经济模型并与传统的乙醇生产方案进行比较。该模型是基于NREL开发的模型。参见文献，例如Ordonez，C.et al.Bioresour.Technol.78：187-190(2001)以及Lawhon于1986年11月25日所获得的专利U.S.Patent No.4,624,805.该模型被用于AFEX预处理。参见，例如：El-Adaway，T.et al.Food Chem.74：455-462(2001)。
对于模型中有关生物转化的部分做了改变。例如，假设所有的上游和下游工艺过程是相同的。水解产量、酶、乙醇和酵母生产以及营养成分消耗都是根据实验数据进行估算。在分析中所采用的乙醇产量是276L/ton。这一推测是基于Thermoanaerobacterium saccharolyticum ALK2对AFEX-CS的水解产物(实施例4)的分批补料发酵，其中大约有60％的纤维低聚糖在发酵过程中被消耗掉，这样导致乙醇产量从246L/ton增加至276L/ton。
对于在工艺设计的变化，假设在电力使用和设备和大小均尽可能取自于NREL模型，在适当情形由文献值估算。
在最初的模型中，全部水解和发酵的时间被设定为168小时，尽管目前的数据表明水解72小时和发酵72小时就足够了。尽管有可能发生同步的糖化和发酵，但没有如此明确地体现在模型中。相反，水解作用和乙醇产量是基于先前的实验数据进行估算。然而随着酶制剂的改进，预计产量比文献中所提及的会有所增长，而且，相对于低聚糖，单糖能够增加。
所有的热能和电能需求被设定是通过燃烧木质素来提供。在生物转换步骤不考虑使用蒸汽，并且设定所有的温度变化均是“温和”的。因此，在热量需求方面相对于NREL模型并没有进行改变，因为假定通过热能整合可以满足能源的变化。针对电力，包括了对于T.reesei发酵的额外的压力和搅拌。
图13显示了摸拟生物转化计算机模型的工艺流程的一个具体实施方式的流程图，即模拟操作，尚未付诸实施。在此模型中，洗涤台是用来洗湿经AFEX预处理后的生物质的，用稀释后的再生水解液作为水介质。用螺旋压榨机将生物质脱水。污水被设定含有丰富的由AFEX处理过程产生(以及从水解过程回收)的寡聚糖，因此，用来诱导T.reesei酶的生成。作为初始近似值，假设真菌对应于产生每克酶而消耗3g糖。酶生产被模拟为寡聚糖的一级反应而其速率常数为0.05h-1。这就足以产生木质纤维素水解作用所需要的76％的酶。总的T.reesei发酵时间初步设定为96小时。
在此模型中，每公斤生物质消耗10克的玉米浸液(CSL)以提供T.reesei生长和酶的生产所需的养分。糖解酶的负载被设定为3-6mg/g。同样，每公斤生物质中含有乙酰胺形式约6g氮，几乎是酶所需氮量的四倍。乙酰胺没有被T.reesei消耗，而是被其它有机体所消耗。因此，如果酵母菌可以被改良以消耗乙酰胺且能够更充分地适应经AFEX处理的玉米秸秆，所需的营养补充就会低很多。
在酶水解后，一Pneumapress自动压滤机被用来分离固体和液体。这种压滤机利用压缩空气来迫使更多的水分从生物质排出，将其水分重量减少至总重量的50％。这样的装置在NREL模型中也被用于蒸馏操作之后，从而此处的经济条件相同。由于在水解操作之后没有另外的生物质溶解过程出现，本模型在Pneumapress压滤机的花费方面与NREL模型相比没有什么不同。从压力机释放出的液体被用作发酵介质。但是，不溶的生物质仍然保留了一些水分，其中包含水解过的糖。为确保所有已水解的糖被利用，生物质是用清水冲洗的，然后用压滤机脱水。残渣从工艺中移除后，经燃烧以提供热量和动力。冲洗的水被分成多个水流。其中大部分的水是用作T.reesei发酵的介质以及用作进行T.reesei诱导的冲洗水。剩下的水是用来作为用于酵母发酵的种菌培养液或被合并到发酵培养基中。
将发酵工艺在葡萄糖和木糖的发酵操作之间分开。在葡萄糖和木糖发酵设备之间设置有沉淀池用以收回酵母。作为第一近似，根据实验数据设定3小时的逗留时间用来沉淀95％的酵母。沉淀好的酵母在售出之前被置于隧道式干燥机内进行干燥。这种能量是设定以蒸汽的形式计算的，从而能够按总能量的30％减少电力需求。葡萄糖发酵时间为15小时，木糖的为46小时。在木糖发酵后，另一沉淀池被用来回收酵母，而发酵培养基接着被送到蒸馏工艺。
所用的给料是玉米秸秆，而其组成是基于相当的单糖含量。在AFEX预处理后，一些糖类被转化为低聚糖，其是被用来诱导酶的生产。在纤维素水解中，设定18％的固体负载，因为这就足够生产40g/L乙醇(7)。为简便起见，设设自产的和外源的酶对所有的糖类有同样的活性，从而添加恒量10g/kg的酶而不考虑其来源。实际中上，可以做到使添加的活度恒定，这可能意味着根据内部的生产规模而使用不同量的酶。在水解过程中，预计大部分的酶由于永久地与生物质结合而失效。在这项研究中，90％的酶被认为会因失效而损耗，因此所有的再生酶只占酶总量的一小部分。
对于发酵，设定葡萄糖单体完全地被消耗，就如实验数据所表明的那样。寡聚糖没有被消耗，而木糖的最大消耗量只是所有总糖的80％。此外，木糖的总消耗是基于0.05g糖每克酵母每小时的线性率。实验在此表明，木糖的消耗在高细胞密度时基本呈线性关系，而且大约80％的糖被消耗。在没有细胞循环操作的情形，酵母的成长只在葡萄糖发酵过程中出现。一些细胞生长发生在高细胞密度时的木糖发酵过程中，但其程度较低。葡萄糖发酵被认为对于生产乙醇的效率稍微高一些，代谢的乙醇产率为0.48g乙醇每克葡萄糖消耗，与之相比较的是0.45g乙醇每克木糖消耗。***糖的水解和发酵被认为与木糖相同的，因此所有的模型数据都是采用总的戊糖。
图14A-14C显示了改变变量对所建议方案收益率的影响。乙醇的产量及其销售价格主导了这种方案的经济状况，因为乙醇对于所建议方案占总收益超过80％的份额。同样，天然酵母的售价可以有影响，因为在基本方案($28/Mg)的全部利润与酵母($22/Mg原料)的总收入差不多。有趣的是，酶的进价并没有对利润影响很大，因为33％价格的上升转换成10％的盈利的下降。因此，尽管在纤维素乙醇生产中存在一个重要的未知因素，通过生产大多数的生产现场的对酶的成本的减少有影响。其他注意事项，包括木糖发酵时间，T.reesei发酵停留时间和对T.reesei发酵的营养需求，对提炼的盈利并没有大的影响，这表明一般的方法是可行的和可靠的。所有主要过程的设定条件如表10所示。
表10.过程设定
  低   标准   高   单位
  木糖发酵时间   12   24   36   小时
  CSL要求   0   10   20   g/kg BM
  里氏木霉发酵时间   60   96   132   小时
  酶的成本   2400   3600   4800   $/Mg酶
  酵母售价   500   800   1100   $/Mg酵母
  乙醇产量   236   275   311   L/Mg BM
  乙醇销售价格   1.4   1.7   2   $/gal乙醇
实施例8(预示)
将针对其他的生物质材料从事进一步的实验。预计水性提取物会促进潜在的整合的生物工艺生物体，例如梭状芽孢杆菌(Clostridiumthermocellum)的生长和特性。
结论
本文所述的各种具体实施方式提供了由AFEX处理过的生物质的弱碱性水性提取物来开发微生物的生长刺激剂。在一个具体实施方式中，提供了一种方法，包括利用一种纤维素产酶培养基(T.reesei)，在使用水和水性提取物作为纤维素产酶真菌(T.reesei)的培养基时，从经过预处理的木质纤维素生物质(如玉米秸秆)提取可溶物质。在一个具体实施方式中，预处理的木质纤维素生物质是氨纤维膨胀预处理过的木质纤维素生物质。
实施例1-3所述的测试是用来开发微生物的生长刺激剂(MGS)从来自预处理过的生物质的弱碱性的水性提取物，比如，AFEX处理过的生物质，比如通过使用纤维素酶。然而，在这些方法中，仔细考虑了洗涤、净化和/或对AFEX处理过的生物质补充养分，以提供合适的产物作为生物燃料生产设施中的有用原料。与之对照的是，所述具体实施方式中还利用生物质本身所含有的营养物质，比如在酶的生产和发酵过程中的蛋白质和矿物质。因此，本文所述的各种不同的实施方式为生物质产业提供了一种新的范式，其中经过AFEX处理的生物质不仅可以为生物燃料生产过程提供碳和氮的来源，而且还可以提供其他营养素的来源，例如未经洗涤、净化或营养补充的蛋白质和矿物质。
同时实现经济、环境和社会的可持续性发展是对于新兴的可再生液体燃料产业的主要挑战。通过论证纤维素生物炼制的范例，我们针对上述问题通过使用木质纤维素生物质作为糖类和矿物质独有的来源产生乙醇和食物前体物。由经过氨纤维膨胀法(AFEX)预处理具有18％w/w固体负载的玉米秸秆得到的酶水解产物被认为是富有营养的。该水解产物在48小时内通过两个阶段被完全发酵而生成乙醇和原生的酵母细胞作为其产物。在用于内供的糖解酶生产装置中使用经AFEX预处理的玉米秸秆作为诱导物免除了对外源酶的需求。该诱导混合物的效力，基于相同的糖重，为乳糖这种常见的商业酶诱导物的2.5-7倍。相关经济分析表明，相对于2005年NREL的经济模型，本发明的模型能够显著地提高所述过程的经济效益，其主要归因于原生酵母细胞的价值和通过内部生产而使纤维素酶成本降低。
所有相关的公开物、专利和专利文献在此全部地，就如其各自单独地通过引用被纳入本文。如果出现任何内容不一致的情形，以本文所披露的内容和说明以及其中包括的所有定义为准。
在此，虽然具体的实施方式已经被说明和描述，但是应该理解对于本领域的普通技术人员为实现同样目的所作的任何改变和调整均可能用以替换所述的某些特定的具体实施方式。本发明申请旨在包括针对发明主题的任何调整或变化。因此，显然可以认为本发明的具体实施方式仅受限于权力要求及其等同的内容。

Claims (42)

1.一种方法，包括：
用氨预处理来处理植物生物质以提供经氨预处理的植物生物质，其中所述植物生物质来自一种或多种植物；和
使用所述经氨预处理的植物生物质在产酶的微生物中刺激生长和/或促进酶合成。
2.权利要求1的方法，其中所述经氨预处理的植物生物质含有在所述产酶的微生物中刺激生长和/或促进纤维素酶合成的可溶性物质和/或固体。
3.权利要求2的方法，所述方法还包括使用溶剂从所述经氨处理的植物生物质中提取至少部分的所述可溶性物质，以生产可溶性提取物和经提取的氨预处理过的生物质。
4.权利要求3的方法，其中所述可溶性提取物用于在产酶的微生物中刺激生长和/或促进纤维素酶合成。
5.权利要求4的方法，其中部分的所述经提取的氨预处理过的生物质用于在产酶的微生物中刺激生长和/或促进纤维素酶合成。
6.权利要求1的方法，其中所述方法在利用所述经氨预处理的植物生物质的生物产品生产设备中进行，以在生物产品生产装置中生产生物产品。
7.权利要求6的方法，其中所述产酶的微生物包含在酶生产装置内，所述酶生产装置任选包括所述可溶性提取物、所述经提取的氨预处理过的生物质和/或所述生物产品生产装置的含营养物的副产品。
8.权利要求6的方法，其中通过所述产酶的微生物所生产的所述酶为解糖酶。
9.权利要求8的方法，其中所述解糖酶选自葡聚糖外切酶、葡聚糖内切酶、β-木糖苷酶、木聚糖内切酶、α-***呋喃糖酶、纤维素诱导蛋白质2、α-***呋喃糖酶、乙酰基木聚糖酯酶、α-葡糖醛酸酶、木聚糖内切酶、多聚半乳糖醛酸酶、α-半乳糖苷酶、乙酰基酯酶及其组合。
10.权利要求6的方法，其中所述产酶的微生物选自酵母、细菌、真菌及其细合。
11.权利要求10的方法，其中所述产酶的微生物选自里氏木霉(Trichoderma reesei)、泡盛曲霉(Aspergillus Awamori)、杆菌芽孢(Clostridium thermocellum)和解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacteriumsaccharolyticum)。
12.权利要求3的方法，其中所述可溶性提取物包括蛋白质、维生素、单糖、寡糖、脂质、微量元素或其组合。
13.权利要求3的方法，其中所述溶剂为水。
14.权利要求3的方法，其中所述溶剂为水性碱性氢氧化铵溶液。
15.权利要求14的方法，其中所述水性碱性氢氧化铵溶液含有约0.01％至30％重量的NH4OH。
16.权利要求15的方法，其中所述水性碱性氢氧化铵溶液的pH在约7和12之间。
17.权利要求1的方法，其中所述一种或多种植物中的至少一种为单子叶植物。
18.权利要求16的方法，其中所述单子叶植物为草、玉米秸秆、高粱、甘蔗渣、小麦、稻谷、玉蜀黍或其组合。
19.权利要求18的方法，其中所述草为柳枝稷、芒草、草芦或其组合。
20.权利要求6的方法，其中所述植物生物质为玉米秸秆。
21.权利要求3的方法，其中所述可溶性提取物用于在产酶的微生物中刺激生长。
22.权利要求6的方法，其中所述氨预处理包括氨纤维膨胀。
23.权利要求6的方法，还包括用酶水解所述经氨预处理的植物生物质以产生酶水解产物浆料，其中所述酶为由所述产酶的微生物所分泌的酶，存在于所述可溶性提取物内和/或存在于所述经提取的氨预处理过的生物质内。
24.权利要求23的方法，还包括机械加工所述酶水解产物浆料，以生产含有可发酵的糖混合物的液体酶水解产物。
25.权利要求24的方法，还包括使所述液体酶水解产物发酵以提供生物产品。
26.一种生物产品，所述生物产品根据权利要求1-25中任一项的方法来生产。
27.权利要求26的生物产品，含有基于生物的化学物质或生物燃料。
28.一种***，包括：
生物燃料生产设备，含有：
生物产品生产装置，被设置成由经氨预处理的生物质来生产生物产品和含营养物的副产物；和
酶生产装置，其与所述生物产品生产装置连通并且被设置成由用于所述生物产品生产装置的所述经氨预处理的生物质提取的所述含营养物的副产物和/或可溶性物质来生产酶。
29.权利要求28的生物燃料生产设备，其中所述生物产品为生物燃料或生物化学物质。
30.权利要求29的生物燃料生产设备，其中所述生物燃料为乙醇，并且所述经氨预处理的生物质为经氨预处理的玉米秸秆。
31.一种生产生物产品的方法，包括：
在酶生产装置中生产酶，其中所述酶生产装置包含产酶的微生物、乙醇生产残余物和/或从经氨预处理的生物质提取的刺激剂；和
将所述酶提供到生物产品生产装置，其中生产所述生物产品。
32.权利要求31的方法，其中所述经氨预处理的生物质为经氨处理的玉米秸秆。
33.权利要求31的方法，其中所述乙醇生产残余物为在所述生物产品生产装置中产生的含营养物的生物产品。
34.权利要求31的方法，其中所述乙醇生产残余物为玉米浆液。
35.权利要求31的方法，其中所述刺激剂含有能刺激微生物生长的可溶性物质。
36.权利要求31的方法，其中所述刺激剂含有在所述产酶的微生物中能刺激或诱导酶生产的可溶性物质。
37.权利要31的方法，其中所述酶生产装置还包含稀释的预处理过的生物质。
38.权利要求31的方法，其中所述产酶的微生物选自里氏木霉、泡盛曲霉、杆菌芽孢和解糖热厌氧杆菌。
39.权利要求31的方法，其中所生产的所述酶为解糖酶。
40.权利要求39的方法，其中所述解糖酶选自葡聚糖外切酶、葡聚糖内切酶、β-木糖苷酶、木聚糖内切酶、α-***呋喃糖酶、纤维素诱导蛋白质2、α-***呋喃糖酶、乙酰基木聚糖酯酶、α-葡糖醛酸酶、木聚糖内切酶、多聚半乳糖醛酸酶、α-半乳糖苷酶、乙酰基酯酶及其组合。
41.权利要求31的方法，其中所述生物产品为生物化学物质或生物燃料。
42.一种刺激剂，包含：
由经氨预处理过的植物生物质的可溶性提取物；和
经提取的氨预处理过的植物生物质，其中所述可溶性提取物和所述经提取的氨预处理过的植物生物质能够在产酶微生物中刺激生长和/或促进酶合成。
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