CN102256998A - 新的转运蛋白构建物和转运蛋白货物结合分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通式(I)DlLLLxDm(LLLyDn)a的新转运蛋白构建物和其变体。本发明还涉及转运蛋白货物结合分子，特别是所述新转运蛋白构建物与货物部分的结合物，货物部分例如蛋白或肽、核酸、细胞毒性剂、有机分子等。此外，本发明公开了包括这些结合物的(药物)组合物和涉及这样的转运蛋白构建物的治疗方法和用途。

Description

新的转运蛋白构建物和转运蛋白货物结合分子
本发明涉及新的通式(I)DlLLLxDm(LLLyDn)a的转运蛋白构建物及其变体。本发明还涉及转运蛋白货物结合分子，特别是具有货物部分的新的转运蛋白构建物结合物，货物部分例如蛋白质或肽、核酸、细胞毒性剂、有机分子等。此外，本发明公开了包括这些结合物的(药物)组合物和牵涉这样的转运蛋白构建物的治疗方法和用途。
使感兴趣的物质，如核酸、蛋白质或细胞毒性剂，而且还有其它(治疗上有用的)化合物能够从外部介质有效地转移进组织或细胞，特别是转移到细胞核的技术在生物技术领域相当受关注。这些技术可适于体外和体内运输并翻译核酸进细胞，并因此适于蛋白质或肽生产、适于基因表达调节、适于细胞毒性效应或凋亡效应的诱导、适于细胞内过程的分析以及适于运输各种不同货物进细胞(或细胞核)的影响的分析等。
感兴趣货物从外部介质到组织或细胞的这种转移的一个重要应用是基因治疗，其中所述货物通常是核酸或基因。管该技术在过去十年已显示一些相当有前景的发展，但是基因转移通常受限于基因转移载体不能有效地将生物活性货物转移进将被治疗的宿主的细胞质或细胞核而不影响宿主基因组或改变活性货物的生物学性质。
在这方面，已发展了几项技术，以努力更有效地将例如核酸，如DNA或RNA，转染进细胞。通过基因转移的方法将核酸转染进患者的细胞或组织是分子医学的重要方法并在众多疾病的治疗和预防中起关键作用。
基因转移方法的代表性例子包括普通(物理的或物理化学的)方法如用磷酸钙或DEAE-葡聚糖共沉淀核酸，这是能使核酸穿透质膜然后进入细胞和/或细胞核的方法。然而，该技术遭受低转移效率和高百分比细胞死亡的困扰。另外，由于其本身的性质，该方法局限于体外或离体方法，但不适用于体内情况。
对于涉及体外电穿孔的方法同样如此。体外电穿孔基于高压电流的使用，使细胞膜变得可透过，以允许新的核酸，例如DNA或RNA引入细胞。然而，这样的方法通常不适于体内。此外，该技术同样遭受低转移效率和高百分比细胞死亡的困扰。
另外熟知的物理或物理化学方法包括(裸)核酸的(直接)注射或生物射弹基因转移。生物射弹基因转移(也称作生物射弹粒子轰击)是在康奈尔大学开发的方法，其允许将遗传物质引入组织或培养细胞。生物射弹基因转移通常通过表面包被金属的颗粒，如金或银颗粒而完成，并通过使用基因枪将包括被吸附的DNA的这些金属颗粒射进细胞。与上面所讨论的相似，该方法局限于体外或离体方法，但通常不适用于体内情况。
其它方法利用所谓的转运分子的转运能力。将在该上下文中使用的转运分子通常可以被分为：病毒载体，即转运分子，其包括病毒元件(viral element)；以及非病毒载体。
当今可利用的最成功的基因治疗策略依赖于病毒载体，如腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒和疱疹病毒。这些病毒载体通常应用对DNA和核酸具有强亲和力的病毒相关物质的结合物。由于其感染性质，病毒或病毒载体具有非常高的转染速率。以在转染的细胞中不形成功能性感染颗粒的方式，基因修饰通常使用的病毒载体。然而，尽管有这个安全措施，但是存在许多与涉及免疫原性、细胞毒性和***诱变的病毒载体有关的问题。举例来说，不能排除引入的治疗上有活性的基因或病毒基因的不受控增殖的危险，例如，由于可能的重组事件。另外，病毒结合物难于利用并通常在治疗之前需要长期的制备(参考，例如，美国专利号5,521,291)。
尽管非病毒载体不象病毒载体一样有效，但是已开发了许多非病毒载体以在基因治疗中提供更安全的选择。最常见的非病毒载体中的一些包括聚乙稀亚胺、树状聚体、壳聚糖、聚赖氨酸和基于肽的转运蛋白***，例如许多种类的肽，它们通常本性是阳离子的并能与核酸诸如质粒DNA通过静电相互作用而相互作用。
为了成功的输送，非病毒载体，特别是基于肽的转运***必须能克服许多障碍。这样的障碍包括在运输期间货物部分，例如DNA或其它化合物的保护，以及货物部分在体内早期降解或代谢的预防。在核酸，如DNA和RNA分子的情况下，非病毒载体必须另外能特异性地输送这些分子，以在靶细胞中有效表达基因。
尤其是对于核酸，如DNA和RNA分子，非病毒载体目前必须克服4个障碍以达到成功地输送基因(参考，例如Martin et al.，The AAPS Journal 2007；9(1)Article 3)。非病毒载体必须能1)紧密地结合并保护核酸，2)它必须能靶向特异的细胞表面受体，3)非病毒载体必须能***内体膜，和4)它必须将核酸货物输送到核并允许编码的蛋白质或肽序列的翻译。
这样的非病毒载体，特别是基于肽的非病毒载体，相对于其它非病毒策略有利，因为它们一般而言能到达所有这4个目的，然而，关于不同的障碍具有不同的效率。
举例来说，富含碱性残基如赖氨酸和/或精氨酸的阳离子肽能有效地将核酸如DNA浓缩成可以稳定于血清中的小的紧密的颗粒。此外，肽配体与多聚物/核酸复合物(polyplex)的连接允许靶向特异受体和/或特异细胞类型。如上述的多聚物/核酸复合物或阳离子聚合物通常与带负电荷的核酸形成复合物，所述复合物导致核酸的浓缩，并保护这些核酸免于降解。利用多聚物/核酸复合物(阳离子聚合物)向运细胞运输通常通过受体介导的胞吞作用而发生。因此，通过例如结合到表面受体并触发胞吞作用的多聚物/核酸复合物聚左旋赖氨酸(PLL)，将DNA偶联到独特的分子，如转铁蛋白。多聚物/核酸复合物(阳离子聚合物)包括例如聚左旋赖氨酸(PLL)、壳聚糖、聚乙稀亚胺(PEI)、聚甲基丙烯酸二甲胺乙酯(polydimethylaminoethylmethacrylate)(PD-MAEMA)、聚酰胺(PAMAM)。这样的作用还从纳米颗粒/核酸复合物(nanoplexes)(纳米颗粒***)或脂质/核酸复合物(lipoplexes)(脂质体***)得知。纳米颗粒/核酸复合物(纳米颗粒***)通常包括聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚苯乙烯、氰基丙烯酸酯、聚乳酸(polylactat)(PLA)、聚(乳酸乙醇酸共聚物)(PLGA)等的使用。脂质/核酸复合物或脂质体***通常包括能模拟细胞膜的阳离子脂质的使用。因此，脂质带有正电荷的部分与核酸带有负电荷的部分相互作用，并因而能够与细胞膜融合。脂质/核酸复合物或脂质体***包括，例如DOTMA、DOPE、DOSPA、DOTAP、DC-Chol、EDMPC等。
在该上下文中，受体介导的胞吞作用在实验***中同样被广泛利用，以向细胞靶内向输送货物如核酸或治疗剂。在受体介导的胞吞作用期间，含有货物的复合物被位于细胞膜中的对该货物特异的受体或者位于细胞膜组分中的特异抗体选择性地内在化。针对包括IgG Fc、生长抑素、胰岛素、IGF-I和-II、转铁蛋白、EGF、GLP-1、VLDL或整合素受体等在内的许多受体，已经描述了胞吞作用活性。
通过受体介导的胞吞作用，已经广泛检验了不同的肽或蛋白质序列在基因转移方法中的用途。令人惊奇地，通过噬菌体展示技术的应用，已经深深地推动了指导有效的受体介导的胞吞作用的肽序列的分离。噬菌体展示文库是极其强大的工具，其为细胞受体提供分子变体的实际上无限的来源以及短肽，所述变体包括对天然配体或货物部分的修饰。相似的文库也已被直接注射进小鼠中，并且肽序列已被成功地分离，所述序列显示对脑和肾的13倍的选择性。
前蛋白转化酶可作为可用于将分子运输至细胞的肽或蛋白质序列的例子。前蛋白转化酶是细胞表面受体的例子，其通过受体介导的胞吞作用变得内在化。已经显示，这些蛋白质是造成肽激素、神经肽和许多其它蛋白质的前体转变成其生物学活性形式的原因。前蛋白转化酶家族的所有切割位点遵从共有序列R-X-X-R。哺乳动物前蛋白转化酶在其组织分布的基础上可以分成三组。弗林蛋白酶、PACE4、PC5/PC6和LPCIPC7/PC8/SPC7在广泛范围的组织和细胞系中表达。相反，PC2和PC1/PC3的表达限于神经内分泌组织，如胰岛、垂体、肾上腺髓质和许多脑区域。PC4的表达高度局限于睾丸生***。神经内分泌特异转化酶——PC2和PC1/PC3主要位于分泌颗粒中。也已经报道PC5/PC6A位于分泌颗粒中。此外，间接的证据已经表明，一部分前蛋白转化酶分子存在于细胞表面上，并且已经显示，弗林蛋白酶在TGN和细胞表面之间循环。总之，这些性质表明，前蛋白转化酶将细胞外配体运输进细胞内间隙。
所谓的易位蛋白(translocatory protein)或蛋白转导结构域(PTDs)也是有利的。来源于易位蛋白或蛋白转导结构域(PTDs)的肽序列通常能在其酸性环境中选择性地裂解内体膜，导致多聚物/核酸复合物的胞质释放。易位蛋白被认为是能影响大分子在细胞(易位蛋白)之间转运的一组肽，如HIV-1 TAT(HIV)、触角(果蝇属(Drosophila)触角)、HSV VP22(单纯疱疹)、FGF或乳铁蛋白等。相反，蛋白转导结构域(PTDs)被认为是能指导与这些序列共价结合的蛋白质和肽通过细胞膜进入细胞的一组肽(Leifert and Whitton：Translocatory proteins and protein transduction domains：a criticalanalysis of their biological effects and the underlying mechanisms.Molecular Therapy Vol.8 No.1 2003)。易位蛋白共有的以及PTDs共有的是碱性区，由于所述碱性区能结合聚阴离子如核酸，其被认为是造成融和肽转运的主要原因。利用受体依赖的非饱和吸附胞吞作用，在没有结合到其上的情况下，PTDs可以发挥与阳离子转染试剂相似的作用。当给予基于疫苗的肽时，为了实现或增强CTL应答，PTDs通常与蛋白质或肽偶联(参考综述：Melikov and Chernomordik，Arginine-rich cell penetrating(poly-)peptides s：from endosomal uptake to nuclear delivery，Cell.Mol.Life Sci.2005)。
令人遗憾的是，由于肽酶，基于肽的转运蛋白***典型地在体内遭受蛋白质水解性降解，导致截短的转运蛋白(和/或货物)序列。可将这样的肽酶区分为外肽酶和内肽酶，它们都是能通过被称作蛋白水解的过程催化蛋白质***成较小的肽部分甚至***成单个氨基酸的酶。在该上下文中，内肽酶是典型地蛋白水解肽酶，其破坏非末端氨基酸(即分子内)的肽键。内肽酶对某些氨基酸是典型地特异的。内肽酶的例子包括例如胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶和内肽酶V等。已知胰蛋白酶在Arg或Lys之后切割，除非后面跟着Pro。已知糜蛋白酶在Phe、Trp或Tyr之后切割，除非后面跟着Pro。糜蛋白酶在Asn、His、Met或Leu之后较慢地切割。弹性蛋白酶在Ala、Gly、Ser或Val之后切割，除非后面跟着Pro。嗜热菌蛋白酶是一种热稳定的内切蛋白酶，其在Ile、Met、Phe、Trp、Tyr或Val之前切割，除非前面是Pro。嗜热菌蛋白酶有时在Ala、Asp、His或Thr之后切割。已知胃蛋白酶在Leu、Phe、Trp或Tyr之前切割，除非前面是Pro。最后，已知内肽酶V8在Glu之后切割。与内肽酶不同，外肽酶是催化将氨基酸从多肽链的末端去除并因此切割所述多肽链末端的酶。可根据它们的切割位点将外肽酶区分为氨肽酶和羧肽酶。氨肽酶是典型地锌依赖性酶并由小肠的腺体产生。氨肽酶通常切割来自肽或蛋白质序列的氨基末端的单个氨基酸。羧肽酶是水解肽键的羧基末端(C末端)的典型的酶。人类、动物和植物含有几种类型的具有范围从分解代谢到蛋白质成熟的不同功能的羧肽酶，该酶是存在于胰液中的消化酶，将从肽的羧基端切割单个氨基酸。特定的例子是羧肽酶N(CPN)，由两个具有酶活性的小亚基和两个保护酶抵御降解的大亚基组成的血浆锌金属蛋白酶。CPN切割来自生物学上有活性的肽诸如补体过敏毒素、激肽和血纤肽的羧基末端氨基酸精氨酸和赖氨酸。
为了改变如上面所定义的基于肽的转运蛋白***的蛋白酶剪切，基于肽的转运蛋白***可完全由D-氨基酸组成，因此形成“逆反肽序列(retro-inverso peptidesequences)”。术语“逆反(肽)序列”指线性肽序列的异构体，其中序列的方向是反向的，每个氨基酸残基的手性是颠倒的(参见例如Jameson et al.，Nature，368，744-746(1994)；Brady et al.，Nature，368，692-693(1994))。组合D-对映体氨基酸和反向合成的优点是交换每个酰胺键的羰基和氨基的位置，而保持侧链基团在每个α碳的位置。由于基于肽的转运蛋白的肽序列天然存在的L-对映体氨基酸的构象改变为D-对映体氨基酸，体内蛋白酶剪切的危险消除了，这对货物部分转染进细胞的目的是有利的和高度有效的。相反，术语“反向序列”指序列的方向是反向的序列(但是每个氨基酸残基的手性不是颠倒的(例如D-Arg-L-Arg-L-Arg→L-Arg-L-Arg-D-Arg)。
然而，尽管作为如上面所定义的转运蛋白分子有效地工作，但是这样的基于肽的转运蛋白的肽序列天然存在的L-对映体氨基酸的构象改变为D-对映体氨基酸使承担在细胞的整个生命期间这些转运蛋白在细胞中显著积累或在更长时间里这些转运蛋白在(周围)组织或器官中显著积累的危险。因此，即使期间切割开或代谢连接的货物部分，这样的转运蛋白仍可残留在细胞中并参与进一步的细胞间和细胞内过程，导致未知的和不需要的副作用。
因此，在本领域中需要提供可选的非病毒转运蛋白分子，优选地是如上面所定义的基于肽的转运蛋白***，其避免在细胞或组织中这样的不需要的积累但仍然允许货物部分有效地转移进细胞。
如所附的权利要求书中所定义的主题，特别是如权利要求书中所定义的新的转运蛋白构建物和其结合物(转运蛋白货物结合分子)解决了上面的目的。利用如权利要求书中所定义的新的转运蛋白构建物和其结合物的方法和用途进一步解决了上面的目的。
根据本发明的第一个方面，通过包括通式(I)(SEQ ID NO：1)的至少一个序列的新型转运蛋白构建物或由通式(I)(SEQ ID NO：1)的至少一个序列组成的新型转运蛋白构建物解决本发明的目的：
DlLLLxDm(LLLyDn)a
其中：D是D-氨基酸；
L是L-氨基酸；
a是0-3，优选地0-2，更优选地0、1、2或3，甚至更优选地0、1或2，最优选地1；
l、m和n相互独立地是1或2，优选地1；
x和y相互独立地是0、1或2，优选地1。
如本文所用，术语“转运蛋白构建物”指含有氨基酸的化合物，其能易位跨过生物膜。如本文所用，术语“运输序列”(或转运蛋白序列)指提供跨过生物膜易位的氨基酸序列。因此，根据本发明转运蛋白构建物包括允许转运蛋白构建物易位跨过生物膜的运输序列。因此，根据通式(I)的新的转运蛋白构建物有效地允许并可提供货物部分，例如蛋白质或肽、核酸、小的有机分子、抗原、细胞毒性剂等，运输进器官、组织、细胞(例如将被治疗的)、细胞亚区室和/或细胞核。
有利地，发明的根据通式(I)的转运蛋白构建物足够稳定以防止在将货物部分运输到其靶位之前被蛋白酶降解。另一方面，发明的根据通式(I)的转运蛋白构建物不是永久地存在于细胞中，可在相当长的期限内被蛋白酶降解以避免不良副作用诸如新的发明转运蛋白或其结合物在细胞中的不需要的积累。如本发明人所令人惊讶地发现，只有通过上面定义的通式(I)的发明模式(本文也被描述为D-/L-模式)，可将这样的有益性质给予运输序列，特别是在本领域已知的任何运输序列，用如通式(I)中所定义的L-氨基酸的特定内容代替D-氨基酸的特定的内容和位置。该发明的D-/L-模式允许熟练的技术人员将如上面所定义的本发明新型转运蛋白构建物在细胞中的体内或体外持久性足够精确地定义为足够长的时间，以保证在相当长的期限内本发明新型转运蛋白构建物被蛋白酶降解之前本发明新型转运蛋白构建物给予到和进入细胞或细胞核。该细胞中本发明新型转运蛋白构建物的体内或体外持久性实际上依赖用如通式(I)中所定义的L-氨基酸的特定内容代替的D-氨基酸的特定内容和位置。此外，显示发明的上面定义的通式(I)的D-/L-模式的转运蛋白构建物足够短以避免诸如下面定义的转运蛋白货物结合分子中本发明新型转运蛋白构建物对货物部分的空间位阻。它还允许这样的本发明新型转运蛋白构建物的有成本效益的制备。另外，可容易地形成上面定义的通式(I)的转运蛋白肽或蛋白与蛋白质或肽、核酸诸如DNA和RNA分子或与细胞毒性剂或甚至小的有机分子等的结合物。
根据上面定义的通式(I)，本发明新型转运蛋白构建物包括根据如通式(I)所提出的特定D-/L-模式的L-氨基酸和D-氨基酸。
在本发明的背景中，L-氨基酸，也称作L-对映体氨基酸，优选地是选自天然存在的氨基酸或其衍生物的氨基酸。天然存在的氨基酸典型地选自标准的(蛋白原的)氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸、以及选自非标准氨基酸诸如鸟氨酸、瓜氨酸、同型半胱氨酸、S-腺苷甲硫氨酸、羟脯氨酸、硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸、羊毛硫氨酸、2-氨基异丁酸、脱氢丙氨酸、γ-氨基丁酸等。
来自这样的L-氨基酸或L-对映体氨基酸的衍生物典型地包括这些氨基酸的任何天然或非天然存在的衍生物，包括，但不限于如上所定义的氨基酸，其包括翻译后修饰或合成修饰，包括乙酰化作用(在肽序列的N端，在赖氨酸残基处等)、脱乙酰作用、烷化诸如甲基化、乙基化等(优选地在肽序列内的赖氨酸或精氨酸残基处)、脱烷基化诸如脱甲基化、脱乙基作用等、酰胺化(优选地在肽序列的C端)、甲酰化、γ-羧化作用、谷氨酰化(glutamylation)、糖基化(优选地在肽序列内的天冬酰胺、赖氨酸、羟赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基处等)、血红素或血红素部分的加成、羟基化、碘化作用、类异戊二烯部分诸如法尼基或牻牛儿基牻牛儿醇(geranylgeraniol)等的异戊二烯化加成)、硫辛酰化(lipoylation)((硫辛酸官能团的连接)，诸如异戊二烯化、GPI锚的形成，包括豆蔻酰化、法尼基化、牻牛儿基忙牻儿基化(geranylgernaylation)等、氧化、磷酸化(例如对肽序列内的丝氨酸、酪氨酸(tytosine)、苏氨酸或组氨酸部分等)、硫酸化作用(例如酪氨酸的硫酸化作用)、硒化(selenoylation)、硫酸化作用等。
L-氨基酸的衍生物也包括、但不限于：修饰的L-氨基酸，其已经通过引入以下标记之一被修饰：
(i)放射性标记，即放射性磷酸化或带有硫、氢、碳、氮等的放射性标记；
(ii)彩色染料(例如，地高辛配基(digoxygenin)等)；
(iii)荧光基团(例如，荧光素、罗丹明、如下面所定义的荧光染料蛋白等)；
(iv)化学发光基团；
(v)根据(i)至(iv)所述的两种或更多种标记的组合。
L-氨基酸衍生物的尤其特别的例子包括、但不限于：AMC(氨基甲基香豆素)、Dabcyl(二甲氨基苯基偶氮卞酰(dimethylaminophenylazobenzoyl))、Dansyl(二甲氨基萘磺酰(dimethylaminonaphtalenesulfonyl))、FAM(羧基荧光素(carboxyfluoroscein))、Mca(甲氧基香豆素乙酰基)、Xan(呫吨基)、Abu(氨基丁酸)、β-Ala(β-丙氨酸)、E-Ahx(6-氨基己酸)、α-Aib(α-氨基异丁酸)、Ams(氨基丝氨酸(aminoserine))、Cha(环己胺)、Dab(二氨基丁酸)、Hse(高丝氨酸)、Hyp(羟脯氨酸)、Mpr(巯基丙酸)、Nal萘丙氨酸(naphtylalanine)、Nva(正缬氨酸)、Orn(鸟氨酸)、Phg(苯甘氨酸)、Sar(肌氨酸)、Sec(硒代半胱氨酸)、Thi(噻吩丙氨酸)等。
此外，针对如上面所定义的本发明新型转运蛋白构建物选择的L-对映体氨基酸可进一步选自上面定义的L-对映体氨基酸或其衍生物的特定组合。这样的组合可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多个上面定义的L-对映体氨基酸或其衍生物。组合还可能是通式(I)或如本文所定义的任何子式的定义之内任何上面定义的L-对映体氨基酸或其衍生物和任何上面定义的D-对映体氨基酸或其衍生物之间。这样的氨基酸的特定组合可显示对肽酶的较高或较低的稳定性，因此可提供另外的可能性以提供如上面所定义的本发明新型转运蛋白构建物对较高或较低稳定性的体内或体外稳定性。举例来说，本发明新型转运蛋白构建物可含有以D型和/或L型(即作为D-对映体氨基酸或作为L-对映体氨基酸或混合的D-和L-对映体氨基酸)，优选地以L型的二肽序列Arg-Lys，其显示对肽酶的较低的稳定性，因此可用于使本发明新型转运蛋白构建物的肽序列不稳定，因此进一步减少其体内半衰期。
在本发明的上下文中，D-氨基酸，也被称作D-对映体氨基酸，优选地是非天然的(非蛋白原的)“逆反”氨基酸，其中这些非天然的(非蛋白原的)“逆反”氨基酸优选地衍生自如上面所定义的天然存在的L-氨基酸和/或它们的衍生物。在本文中，术语“逆反”指如上面所定义的天然存在的L-氨基酸(和从此制备的肽)的异构体，其中天然存在的L-氨基酸残基的手性在相应的D-氨基酸中是反向的(参见，例如Jameson et al.，Nature，368，744-746(1994)；Brady et al.，Nature，368，692-693(1994))。换言之，在D-氨基酸的肽键中，羰基和氨基基团的位置被调换，同时在每一个α碳，侧链的位置是保留的。因此，D-氨基酸可被***到由L-氨基酸组成或包括L-氨基酸的肽序列中，因此可通过本领域已知的方法将D-氨基酸与如上面所定义的L-氨基酸结合。本领域已知的这样的方法包括，例如，但不限于液相肽合成方法或固体肽合成方法，例如根据Merrifield的固体肽合成方法、t-Boc固相肽合成、Fmoc固相肽合成、基于BOP(苯并***-1-基-氧-三-(二甲氨基)-磷六氟磷酸盐)的固相肽合成等。根据上面的通式(I)的D-/L-模式，D-氨基酸在本发明新型转运蛋白构建物中的含量另外提供许多种有用的性质。例如，这样的新的转运蛋白构建物更有效地进入细胞并是更稳定(尤其是体内)并显示较相应的基于L-氨基酸序列的转运蛋白构建物较低的免疫原性。然而，它们不象完全由D-氨基酸制备的转运蛋白构建物在细胞中是持久的，特别是由于几乎所有的分解酶，象蛋白酶或肽酶，在相邻的L-氨基酸之间切割肽键的事实。所以，由D-对映体氨基酸和L-对映体氨基酸组成的肽在很大程度上抵抗快速蛋白水解分解，而不导致由于缺少蛋白酶的降解而在细胞中积累。
上面定义的根据通式(I)的本发明新型转运蛋白构建物，优选地包括如上面所定义的L-氨基酸和D-氨基酸或它们的衍生物。这样的衍生物可以以约0％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或甚至约100％的含量包含在整个本发明新型转运蛋白构建物中。换言之，整个本发明转运蛋白肽可含有约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26和更多个这样的衍生物，其中可能的衍生物的最大数目当然受限于包含在上面定义的根据通式(I)的本发明新型转运蛋白构建物的氨基酸的最大数目。
根据上面定义的通式(I)，本发明新型转运蛋白构建物包括L-氨基酸和D-氨基酸的特定的D-/L-模式，其由整数a、l、m、n、x和y限定。
根据通式(I)的上面的定义，a是限定如通式(I)DlLLLxDm(LLLyDn)a中所定义的亚组(LLLyD)的重复数的决定因子。根据上面的定义，a可以是选自0-3，优选地选自0-2，更优选地选自10-1的任何数，或可选自单个数0、1、2或3，更优选地选自单个数0、1或2，最优选地a＝1。根据a＝0、1、2或3的特定的重复数，根据通式(I)DlLLLxDm(LLLyDn)a的本发明新型转运蛋白构建物可由以下子式(Ia)至(Id)的至少之一组成或包括以下子式(Ia)至(Id)的至少之一：
(Ia)：DlLLLxDm(SEQ ID NO：2)；
(Ib)：DlLLLxDmLLLyDn(SEQ ID NO：3)；
(Ic)：DlLLLxDmLLLyDnLLLyDn(SEQ ID NO：4)或
(Id)：DlLLLxDmLLLyDnLLLyDnLLLyDn(SEQ ID NO：5)。
此外，根据通式(I)的上面的定义，l、m和n是限定出现在如本文所定义的通式(I)和子式(Ia)至(Id)中的D-氨基酸数的整数。整数l、m和n可相互独立地选择。这对于决定因子n特别如此，其可在如本文所定义的通式(I)或子式(Ia)至(Id)中出现几次，即如果n出现几次，每个n可相互独立地选择。根据上面的定义，整数l、m和n相互独立地可以是选自1-2的任何数，或可选自单个数1或2，更优选地l、m和/或n＝1。
另外，根据通式(I)的上面的定义，x和y是限定出现在如本文所定义的通式(I)和子式(Ia)至(Id)中的L-氨基酸数的整数。整数x和y可相互独立地选择。根据上面的定义，整数x和y相互独立地可以是选自0-2的任何数，优选地选自0-1，或可选自单个数0、1或2，更优选地选自单个数1或2，最优选地x和/或y＝1。
根据一个特别优选的实施方式，本发明的目的通过包括特定子式(Ie)的至少一个序列或由特定子式(Ie)的至少一个序列组成的新型转运蛋白构建物解决：
DLLLD(LLLD)a(SEQ ID NO：6)；
其中D、L和a是如上面针对通式(I)或子式(Ia)至(Id)所定义的。
根据另一个特别优选的实施方式，本发明的目的通过包括特定子式(If)的至少一个序列或由特定子式(If)的至少一个序列组成的新型转运蛋白构建物解决：
DLLLDLLLD(SEQ ID NO：7)；
其中D和L是如上面针对通式(I)或子式(Ia)至(Id)所定义的。
根据通式(I)或根据任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的本发明新型转运蛋白构建物，特别地是包括新的D-/L-模式转运蛋白构建物，可与本领域已知的任何运输序列一起使用或应用于本领域已知的任何运输序列，其中那些运输序列的邻接的(连续的)氨基酸的选择数目通过如通式(I)或任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)所定义的氨基酸数目确定。这样的运输序列典型地指导货物部分运输进细胞或细胞核或另外的特定靶区并可包括，但不限于，如上面所定义的易位蛋白，例如衍生自HIVTAT(HIV)，例如天然蛋白诸如例如TAT蛋白(例如美国专利号5,804,604和5,674,980中所描述的，这些参考文献中的每个通过引用被并入本文)，例如衍生自HIV tat(HIV)、HSV VP22(单纯疱疹)(在例如WO 97/05265；Elliott and O′Hare，Cell 88：223-233(1997)中被描述)、非病毒蛋白(Jackson et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10691-10695(1992))，运输序列，其衍生自触角足，特别是衍生自果蝇属触角(例如其触角载体序列)、FGF、乳铁蛋白等，或衍生自碱性肽，例如具有长度为5至15个氨基酸，优选地10至12个氨基酸，并包括至少80％，更优选地85％或甚至90％的碱性氨基酸，诸如例如精氨酸、赖氨酸和/或组氨酸的肽，或可选自例如富含精氨酸的肽序列，诸如R9、R8、R7、R6、R5等，衍生VP22，衍生自PTD-4衍生的蛋白或肽，衍生自RGD-K16，衍生自PEPT1/2或PEPT1/2衍生的蛋白或肽，衍生自SynB3或SynB3衍生的蛋白或肽，衍生自PC抑制剂，衍生自P21衍生的蛋白或肽，或衍生自JNKI衍生的蛋白或肽。此外，在此公开了用作运输序列的天然蛋白之一的变体、片段和衍生物。
形成如上面所定义的根据通式(I)或任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的新的转运蛋白构建物基础的运输序列的特定例子可选自，但不限于所谓的TAT细胞渗透序列，其衍生自HIV-1 TAT蛋白的碱性运输序列。优选地，HIV-1 TAT蛋白的碱性运输序列可包括来自人免疫缺陷病毒HIV-1 TAT蛋白的序列，例如如在例如通过引用被并入本文的美国专利号5,804,604和5,674,980中所描述的。在该上下文中，全长HIV-1 TAT蛋白具有由HIV TAT基因的两个外显子编码的86个氨基酸残基[SEQ IDNO：8]。TAT氨基酸1-72由外显子1编码，而氨基酸73-86由外显子2编码。全长TAT蛋白被表征为含有两个赖氨酸和六个精氨酸(氨基酸49-57)的碱性区和含有七个半胱氨酸残基(氨基酸22-37)的富含半胱氨酸区。碱性区(即氨基酸49-57)被认为对核定位是重要的。Ruben，S.et al.，J.Virol.63：1-8(1989)；Hauber，J.et al.，J.Virol.631181-1187(1989)。富含半胱氨酸区介导体外金属连接的二聚体的形成(Frankel，A.D.et al，Science 240：70-73(1988)；Frankel，A.D.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA 85：6297-6300(1988))并它作为对反式作用子的活性是必需的(Garcia，J.A.et al.，EMBO J.7：3143(1988)；Sadaie，M.R.et al.，J.Virol.63：1(1989))。如在其它调节蛋白中，N端区可参与防护细胞内蛋白酶(Bachmair，A.et al.，Cell 56：1019-1032(1989))。利用通式(I)或子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的任何一个的优选的TAT运输序列，优选地被表征为TAT碱性区氨基酸序列(天然存在的tat蛋白的氨基酸49-57)的存在；TAT富含半胱氨酸区氨基酸序列(天然存在的TAT蛋白的氨基酸22-36)的缺失和TAT外显子2编码的羧基端结构域(天然存在的TAT蛋白的氨基酸73-86)的缺失。
根据更优选的实施方式，形成如上面所定义的根据通式(I)或任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的新的转运蛋白构建物基础的运输序列可选自含有TAT残基48-57或49至57的氨基酸序列，最优选地是根据SEQ ID NOs：8至14任何一个的TAT序列，或选自通用TAT序列NH2-Xn b-RKKRRQRRR-Xn b-COOH(L类TAT(s))[SEQ IDNO：16]和/或XXXXRKKRRQ RRRXXXX(L类TAT)[SEQ ID NO：15]。在该上下文中，每个X典型地代表这样的氨基酸残基，其优选地选自如本文所定义的任何(天然存在的)氨基酸残基。此外，每个Xn b可选自任何如本文所定义的氨基酸残基，其中n(X的重复数)是0-5、5-10、10-15、15-20、20-30或更多。优选地，Xn b代表衍生自根据SEQ ID NO：8(TAT(1-86))的序列的一段连续肽残基。可选地，形成如上面所定义的根据通式(I)或任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的新的转运蛋白构建物基础的运输序列可选自，例如，含有氨基酸序列NH2-GRKKRRQRRR-COOH(L-TAT(s1a))[SEQ ID NO：17]或氨基酸序列NH2-RKKRRQRRR-COOH(L-TAT(s1b))[SEQID NO：18]的肽。
本领域的技术人员将理解这样的短语，象根据通式(I)或根据任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的序列可与特定的(运输)序列一起使用或应用于特定的(运输)序列，或可形成通式(I)或任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)等的转运蛋白肽构建物的基础，旨在举例说明请求保护一个序列，其显示关于以下的某些特征：
i)表征特定氨基酸实体的侧链残基序列，和
ii)所述的序列中的D和L氨基酸的序列。
为了给出示例性的例子：如果子式(If)与TAT(1-86)(SEQ ID NO：8)一起使用或应用于TAT(1-86)(SEQ ID NO：8)，那么侧链残基的序列(i)如SEQ ID NO：8中所显示。然而，该请求保护的序列不是纯的L-氨基酸序列，而是某处包括子式(If)的基序。这样的实施方式的例子将是以下序列(以小写字母表示的D-氨基酸，以大写字母表示的L氨基酸)：
MEPVDPRLEP WKHPGSQPKT ACTNCYCKKC CFHCQVCFIT KALGISYGrKKRrQRRrPPQ GSQTHQVSLS KQPTSQSRGD PTGPKE。
由于SEQ ID NO：8包括86个氨基酸，所以当然存在将子式(If)的基序放在该序列中别处的几个另外的可能性。还可想象在特别的实施方式中该序列可包括通式和/或子式一个以上的基序。
形成如上面所定义的通式(I)或任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的转运蛋白构建物基础的运输序列的特别优选的例子可选自，但不限于，根据以下表1所定义的序列或其部分，或其任何片段或变体或衍生物(只要它保留跨过生物膜易位的功能)。
表1
Figure BPA00001390404200121
Figure BPA00001390404200131
Figure BPA00001390404200141
Figure BPA00001390404200151
形成如上面所定义的根据通式(I)或任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的转运蛋白构建物基础的运输序列的特定例子还可选自本文所提到的序列，例如如表1所显示的，其显示该特定序列的反向序列，即，其中氨基酸在该序列中从N端到C端的顺序是反向的。
形成如上面所定义的根据通式(I)或任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的转运蛋白构建物基础的运输序列的特别优选的例子可选自上面的序列的片段或变体(前提条件是这样的片段或变体保持提供跨过生物膜易位的功能)。在该特定的上下文中，那些运输序列的变体和/或片段优选地包括具有如上面所定义的这样的运输序列的天然序列全长的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或85％，优选地至少90％，更优选地至少95％和最优选地至少99％的肽序列或由该肽序列组成。另外，这样的运输序列的片段可另外包括全长运输序列的表位(也称作“抗原决定簇”)。本发明的上下文中的表位典型地是位于如本文所定义的(天然)蛋白或肽序列的外表面的片段，优选地具有5至15个氨基酸，更优选地具有5至12个氨基酸，更优选地具有6至9个氨基酸，其可被抗体识别，即以它们的天然形式。
在该特定的上下文中，如上面所定义的，特别是表1或3中的运输序列的“片段”，优选地被理解为其截短的序列，即与天然序列的氨基酸序列相比N端、C端和/或序列内截短的氨基酸序列。
此外，在本发明的特定上下文中，如上面所定义的，特别是如表1或3中所定义的运输序列或其片段的“变体”优选地被理解为这样的序列：其中变体的氨基酸序列与如本文所定义的天然运输序列或其片段差异一个或更多个突变，诸如一个或更多个置换的(或者，必要时，***的和/或缺失的)氨基酸。优选地，与全长天然序列相比，如上面所定义的这样的运输序列的变体具有相同的生物学功能或比活性，即转运进细胞和细胞核。更优选地，在上述含义中，如上面所定义的这样的运输序列的变体可包括约1至50、1至20，更优选1至10，最优选地1至5、4、3、2或1个氨基酸改变。如上面所定义的这样的运输序列的变体也可包括保守氨基酸置换。保守氨基酸置换可以包括组内同义的氨基酸残基，其具有足够相似的物理化学性质，以便组成员之间的置换将保留分子的生物活性(参见，例如Grantham，R.(1974)，Science 185，862-864)。对本领域的技术人员来说显然的是，也可在上面定义的序列中***和/或缺失氨基酸而不改变它们的功能，特别是如果***和/或缺失仅仅涉及到少量的氨基酸，例如少于20个，而优选地少于10个，并且不会去除或替换对于功能性活性是非常重要的氨基酸。特别地，保守氨基酸置换优选为这样的置换，其中起源于同一类氨基酸(碱性氨基酸、酸性氨基酸、极性氨基酸等)的氨基酸彼此进行交换。特别地，它们是氨基酸、脂肪族侧链、带正电荷或负电荷的侧链、氨基酸侧链中的芳基、能进入氢桥的侧链，例如具有羟基官能的侧链。这意味着，例如具有极性侧链的氨基酸被另一个具有同样极性侧链的氨基酸替换，或者，例如以疏水侧链为特征的氨基酸被具有同样疏水侧链的另一种氨基酸置换(例如，丝氨酸(苏氨酸)被苏氨酸(丝氨酸)或亮氨酸(异亮氨酸)被异亮氨酸(亮氨酸)置换)。优选地，被分类为同组并典型地通过保守氨基酸置换可交换的同义氨基酸残基限定在表2中。
表2
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用于如上面所定义的转运蛋白构建物的运输序列的长度，即选自如上面所定义的任何运输序列的连续氨基酸的数目在特定的实施方式中可通过如上面所定义的通式(I)或任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的氨基酸的数目确定。根据通式(I)或根据任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的本发明新型转运蛋白构建物的(序列)长度可因此偏离如本文所显示的，例如表1或3或如本文所概括地定义的示例性运输序列的长度。换言之，如上面所定义的根据通式(I)或根据任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的转运蛋白构建物的长度可确定氨基酸序列的长度，假如该氨基酸序列取自所述运输序列的一段连续氨基酸，该氨基酸序列可取自如本文所定义的运输序列。举例来说，如上面所定义的根据通式(I)或根据任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的转运蛋白构建物的长度是9个氨基酸，适合作为转运蛋白构建物的序列来自如上面所定义的运输序列的9个连续氨基酸，其中选择的氨基酸序列可来自所述运输序列的任何位置或区域。这同样适用于通过如上面所定义的通式(I)或任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)确定的任何其它长度。也考虑在一些实施方式中，根据本发明的转运蛋白构建物的运输序列长度小于150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20和/或小于10个氨基酸。
根据另一个优选的实施方式，根据通式(I)或根据任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的本发明新型转运蛋白构建物包括上面定义的序列的至少一个变体和/或片段或由之组成。优选地，这些变体和/或片段保留如上面所公开的根据通式(I)或根据任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的本发明新型转运蛋白构建物的生物学活性。这样的片段或变体的功能性可通过各种试验，例如转染效率、由货物核酸编码的蛋白的正确表达，或通过生物物理学方法，例如光谱学、计算机模拟、结构分析等检测。特别地，如上面所公开的根据通式(I)或根据任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的本发明新型转运蛋白构建物或其变体和/或片段可通过亲水性分析方法而被分析(参见例如Hopp and Woods，1981.ProcNatl Acad Sci USA 78：3824-3828)，该分析方法能被用于识别肽的疏水区和亲水区，因此在用于实验操作的底物的设计中提供帮助。也可进行二级结构分析以识别如上面所公开的根据通式(I)或根据任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的本发明新型转运蛋白构建物或其变体和/或片段的区域，该区域呈现为特定的结构基序(参见例如Chou and Fasman，1974，Biochem 13：222-223)。使用本领域可利用的计算机软件程序能实现操作、翻译、二级结构预测、亲水性和疏水性分布、开放阅读框架预测和绘图、以及序列同源性的测定。结构分析的其它方法包括，例如X射线结晶学(参见，例如Engstrom，1974.Biochem Exp Biol11：7-13)、质谱法和气相色谱法(参见，例如METHODS IN PROTEIN SCIENCE，1997，J.Wiley and Sons，New York，NY)，也可以应用计算机建模(参见，例如Fletterick andZoller，eds.，1986.Computer Graphics and Molecular Modeling，In：CURRENTCOMMUNICATIONS IN MOLECULAR BIOLOGY，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY)。
同样，上面的根据通式(I)或根据任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的本发明新型转运蛋白构建物，包括上面定义的转运蛋白构建物的至少一个变体(和/或片段)或由之组成。在本发明的上下文中，这些新的转运蛋白构建物的变体(和/或片段)可以与他们天然的根据通式(I)或根据任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的转运蛋白构建物，在如上面所定义的天然转运蛋白构建物的全长范围内具有至少70％、80％或85％，优选地至少90％，更优选地至少95％和最优选地至少99％的序列同一性。
上面的根据通式(I)或根据任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的本发明新型转运蛋白构建物的“片段”，优选地被理解为其截短的序列，即与天然序列，例如上面的根据通式(I)或根据任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的天然本发明新型转运蛋白构建物的氨基酸序列相比，N端、C端和/或序列内截短的新的转运蛋白构建物的氨基酸序列。
上面的根据通式(I)或根据任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的本发明新型转运蛋白构建物的“变体”，优选地包括这样的序列，其中转运蛋白构建物变体的氨基酸序列与如本文所定义的转运蛋白构建物的天然序列差异一个或更多个突变，诸如一个或更多个置换的(或者，必要时，***的和/或缺失的)氨基酸。优选地，与上面所定义的全长天然的发明转运蛋白构建物相比，这样的发明转运蛋白构建物的变体具有相同的生物学功能或比活性。更优选地，在上述含义中，发明的转运蛋白构建物的变体可包括约1至50、1至20，优选地1至10和更优选地1至5、1至4、1至3、1至2或1个氨基酸改变(或多个)。这样的改变可包括尤其是如上面所定义的氨基酸的修饰、将标记引入到如上面所定义的氨基酸、用本文提到的(修饰的或标记的)氨基酸置换氨基酸、氨基酸的缺失或***。如本文所定义的变体此外优选地包括保守氨基酸置换，优选地诸如上面已经定义的。
为了测定两个氨基酸序列的同一性百分比，特别是上面根据通式(I)或根据任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的本发明新型转运蛋白构建物的氨基酸序列，或如本文所定义的任何另外的氨基酸序列，为了随后相互比较，可将该氨基酸序列进行比对。因此，举例来说，例如能将空位***进第一氨基酸序列的序列，能比较第二个氨基酸序列的相应位置处的组成。如果第一氨基酸序列中的一个位置被第二氨基酸序列中的一个位置的相同组成占据，那么这两个序列在该位置是相同的。两个序列的同一性百分比是相同的位置数除以位置总数的函数。当然同样还因此应用于核酸序列。在上面的上下文中，与本发明的查询氨基酸序列具有至少，例如95％“共有序列同一性”序列的氨基酸序列，意欲表示：除了在查询氨基酸序列的每100个氨基酸中目标氨基酸序列可以包括达5个氨基酸改变之外，目标氨基酸序列的序列与查询序列一致。换言之，为了获得具有与查询氨基酸序列至少95％同一性的序列的氨基酸序列，目标序列中达5％(100个中有5个)的氨基酸残基可以被***或用另外的氨基酸置换或者缺失，优选地在变体或片段的上述定义中。当然同样也相似地应用于核酸序列。
对于没有准确对应的(氨基酸或核酸)序列，相对于第二序列可以确定第一序列的“％同一性”。一般地，比对将被比较的这两个序列，以在序列之间产生最大相关性。这可以包括在一个或两个序列中***“空位”，以增强比对度。然后，可以在正被比较的每一个序列的整个长度范围确定％同源性(所谓的总体比对)，这尤其适于具有相同或相似长度的序列；或在较短的、定义的长度范围确定％同一性(所谓的局部比对)，这更适于具有不同长度的序列。
比较两个或更个序列的同一性和同源性的方法在本领域是众所周知的。使用数学算法，能例如确定两个序列是一致的百分比。可以使用的数学算法的优选但非限制性的例子是Karlin et al.(1993)，PNAS USA，90：5873-5877的算法。这样的算法被整合到BLAST程序家族中，例如BLAST或NBLAST程序(同时参见Altschul et al.，1990，J.Mol.Biol.215，403-410或Altschul et al.(1997)，Nucleic Acids Res，25：3389-3402)，通过在万维网站ncbi.nlm.nih.gov的NCBI主页可以获得，以及FASTA(Pearson(1990)，Methods Enzymol.183，63-98；Pearson and Lipman(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A85，2444-2448)。与其它序列在一定程度上相同的序列可以被这些程序识别。此外，在Wisconsin序列分析包(Wisconsin Sequence Analysis Package)，version 9.1(Devereuxet al.，1984，Nucleic Acids Res.，387-395)中可获得的程序，例如程序BESTFIT和GAP可用于确定两个多核苷酸之间的％同一性和两个多肽序列之间的％同一性和％同源性或同一性。BESTFIT使用(Smith and Waterman((1981)，J.Mol.Biol.147，195-197)的“局部同源性”算法，并发现两个序列之间相似性的最佳单一区域。
根据特别优选的实施方式，如上面所定义的本发明新型转运蛋白构建物包括如上面所定义的子式(If)DLLLDLLLD(SEQ ID NO：7)，其中该转运蛋白序列选自任何上面提到的(特定)序列，更优选地选自以下序列：
表3
Figure BPA00001390404200201
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在上面的表中，将子式(If)DLLLDLLLD(SEQ ID NO：7)应用于上面的特定序列，即如上面所定义的新的发明的转运蛋白构建物包括9个氨基酸，其中D对映体氨基酸在本文用小写字母表示，L对映体氨基酸用大写字母表示。
在特定的实施方式中，本发明的转运蛋白构建物包括根据rXXXrXXXr(SEQ IDNO：252)的至少一个序列或由之组成，其中：
r代表D-精氨酸对映体；
X为任何L-氨基酸；
并且其中每个X可以单独并独立于SEQ ID NO：252中的任何其它X而被选择。优选地，SEQ ID NO：252中的所述6个X L-氨基酸中的至少4个为K或R。在另一个实施方式中，根据本发明的转运蛋白构建物包括序列rX1X2X3rX4X5X6r(SEQ ID NO：252)或由之组成，其中，X1为K，X2为K，X3为R且X4、X5和X6为彼此独立选择的任何L-氨基酸。相似地，根据本发明的转运蛋白构建物可以包括序列rX1X2X3rX4X5X6r(SEQ ID NO：252)或由之组成，其中，X4为Q，X5为R，X6为R且X1、X2和X3为彼此独立选择的任何L-氨基酸。本发明的转运构建物也可以包括序列rX1X2X3rX4X5X6r(SEQ ID NO：252)或由之组成，其中，1、2、3、4、5或6个X氨基酸残基选自：X1为K，X2为K，X3为R、X4为Q，X5为R，X6为R，而并非选自上述集合的剩余的X氨基酸残基可以是彼此独立选择的任何L-氨基酸。X1于是优选地为Y和/或X4优选地为K或R。相似地，考虑的是上面提到的序列的反向序列和SEQ IDNO：252的实施方式。
令人惊讶的是本发明人发现，在上面式(I)的位置2的酪氨酸(Y)不但显著增加了摄取，而且在接种之后显著增加了细胞内浓度，持续25小时。特别是在包括衍生自如表1所显示的HIV-1 TAT蛋白的运输序列的转运蛋白构建物中观察到该现象，其显示位置2是Y，优选地具有9个aa和显示共有序列rXXXrXXXr(SEQ ID NO：252)。根据本发明特别优选的实施方式，如上面所定义的本发明新型转运蛋白构建物因此包括上面定义的通式(I)，或更优选地根据如上面所定义的子式(If)的转运蛋白构建物，其中转运蛋白序列与衍生自HIV-1 TAT蛋白的运输序列一起使用，或应用于衍生自HIV-1 TAT蛋白的运输序列，在TAT衍生的序列的位置2具有酪氨酸(Y)。更优选地，转运蛋白序列与衍生自HIV-1 TAT蛋白的运输序列一起使用，或应用于衍生自HIV-1TAT蛋白的运输序列，在TAT衍生的序列的位置2具有酪氨酸(Y)转运蛋白序列，其中上面定义的通式(I)或根据如上面所定义的子式(If)的转运蛋白构建物优选地具有9个aa和共有序列rXXXrXXXr(SEQ ID NO：252，其中D对映体氨基酸在本文用小写字母表示，L对映体氨基酸用大写字母表示)。最优选地，该转运蛋白序列与衍生自HIV-1 TAT的运输序列一起使用，或应用于衍生自HIV-1 TAT的运输序列，其中上面定义的通式(I)或根据如上面所定义的子式(If)的转运蛋白构建物优选地具有9个aa和共有序列rXXXrXXXr(SEQ ID NO：252)，运输序列选自序列TAT(s2-91)(SEQID NO：116)。
上面的根据通式(I)或根据任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的本发明新型转运蛋白构建物可另外包括至少一个修饰，优选地在它们的末端，C端或N端或两端。C端可优选地通过酰胺修饰进行修饰，而N端可通过任何合适的NH2保护基团，诸如例如酰化，或如上面已表明的对L-氨基酸和D-氨基酸的任何进一步的修饰进行修饰。这样的修饰还包括引入如上面所定义的标记。
上面的根据通式(I)或根据任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的本发明新型转运蛋白构建物可通过本领域熟知的方法获得或产生，例如通过如上面所定义的化学合成或通过基因工程方法。
根据本发明的第二个方面，潜在的目的通过发明的转运蛋白货物结合分子解决，该转运蛋白货物结合分子包括作为组分(A)的上面根据通式(I)或根据任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的本发明新型转运蛋白构建物和作为组分(B)的效应分子，例如选自蛋白或肽，诸如在治疗上有活性的蛋白或肽、蛋白激酶抑制剂，特别是蛋白激酶c-Jun氨基末端激酶或因子的抑制剂、抗原、抗体、凋亡因子、病理状态中牵涉的蛋白酶，优选地是肽蛋白酶抑制剂、BH3结构域唯BH3蛋白(BH3-only protein)，或选自核酸、siRNAs、反义RNAs或选自细胞毒性剂、小的有机化合物等。
在本发明的上下文中，适合作为本发明的转运蛋白货物结合分子组分(B)的效应分子的在治疗上有活性的蛋白或肽可选自，但不限于，能刺激或抑制细胞中信号转导的蛋白，例如细胞因子、抗体等。在治疗上有活性的蛋白可因此包括细胞因子家族的I类细胞因子，具有4个位置保守的半胱氨酸残基(CCCC)和包括保守的序列基序Trp-Ser-X-Trp-Ser(WSXWS；SEQ ID NO：253)，其中X是非保守的氨基酸。细胞因子家族的I类细胞因子包括GM-CSF亚家族，例如IL-3、IL-5、GM-CSF，IL-6-亚家族，例如IL-6、IL-11、IL-12，或IL-2-亚家族，例如IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15等，或细胞因子IL-1α、IL-1β、IL-10等。在治疗上有活性的蛋白还可包括细胞因子家族的II类细胞因子，其也包括4个位置保守的半胱氨酸残基(CCCC；SEQ ID NO：254)，但没有保守的序列基序Trp-Ser-X-Trp-Ser(WSXWS；SEQ ID NO：253)。细胞因子家族的II类细胞因子包括例如IFN-α、IFN-β、IFN-γ等。在治疗上有活性的蛋白可另外包括肿瘤坏死因子家族的细胞因子，例如TNF-α、TNF-β等，或趋化因子家族的细胞因子，其包括7个跨膜螺旋并与G-蛋白相互作用，例如IL-8、MIP-1、RANTES、CCR5、CXR4等，或细胞因子特异性受体，诸如TNF-RI、TNF-RII、CD40、OX40(CD134)、Fas，或来自其的片段或变体。优选地，这样的片段以及变体显示与上面所显示或描述的蛋白或肽序列之一约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％的序列同源性或同一性。在该上下文中，片段和变体优选地是如上面针对本发明的转运蛋白货物结合分子的组分(A)所定义的。
适合作为本发明的转运蛋白货物结合分子组分(B)的效应分子的在治疗上有活性的蛋白也可选自以下给出的任何蛋白：0ATL3、0FC3、0PA3、0PD2、4-1BBL、5T4、6Ckine、707-AP、9D7、A2M、AA、AAAS、AACT、AASS、ABAT、ABCA1、ABCA4、ABCB1、ABCB11、ABCB2、ABCB4、ABCB7、ABCC2、ABCC6、ABCC8、ABCD1、ABCD3、ABCG5、ABCG8、ABL1、ABO、ABRACAA1、ACACA、ACADL、ACADM、ACADS、ACADVL、ACAT1、ACCPN、ACE、ACHE、ACHM3、ACHM1、ACLS、ACPI、ACTA1、ACTC、ACTN4、ACVRL1、AD2、ADA、ADAMTS13、ADAMTS2、ADFN、ADH1B、ADH1C、ADLDH3A2、ADRB2、ADRB3、ADSL、AEZ、AFA、AFD1、AFP、AGA、AGL、AGMX2、AGPS、AGS1、AGT、AGTR1、AGXT、AH02、AHCY、AHDS、AHHR、AHSG、AIC、AIED、AIH2、AIH3、AIM-2、AIPL1、AIRE、AK1、ALAD、ALAS2、ALB、HPG1、ALDH2、ALDH3A2、ALDH4A1、ALDH5A1、ALDH1A1、ALDOA、ALDOB、ALMS1、ALPL、ALPP、ALS2、ALX4、AMACR、AMBP、AMCD、AMCD1、AMCN、AMELX、AMELY、AMGL、AMH、AMHR2、AMPD3、AMPD1、AMT、ANC、ANCR、ANK1、ANOP1、AOM、AP0A4、AP0C2、AP0C3、AP3B1、APC、aPKC、APOA2、APOA1、APOB、APOC3、APOC2、APOE、APOH、APP、APRT、APS1、AQP2、AR、ARAF1、ARG1、ARHGEF12、ARMET、ARSA、ARSB、ARSC2、ARSE、ART-4、ARTC1/m、ARTS、ARVD1、ARX、AS、ASAH、ASAT、ASD1、ASL、ASMD、ASMT、ASNS、ASPA、ASS、ASSP2、ASSP5、ASSP6、AT3、ATD、ATHS、ATM、ATP2A1、ATP2A2、ATP2C1、ATP6B1、ATP7A、ATP7B、ATP8B1、ATPSK2、ATRX、ATXN1、ATXN2、ATXN3、AUTS1、AVMD、AVP、AVPR2、AVSD1、AXIN1、AXIN2、AZF2、B2M、B4GALT7、B7H4、BAGE、BAGE-1、BAX、BBS2、BBS3、BBS4、BCA225、BCAA、BCH、BCHE、BCKDHA、BCKDHB、BCL10、BCL2、BCL3、BCL5、BCL6、BCPM、BCR、BCR/ABL、BDC、BDE、BDMF、BDMR、BEST1、β-联蛋白/m、BF、BFHD、BFIC、BFLS、BFSP2、BGLAP，BGN、BHD、BHR1、BING-4、BIRC5、BJS、BLM、BLMH、BLNK、BMPR2、BPGM、BRAF、BRCA1、BRCA1/m、BRCA2、BRCA2/m、BRCD2、BRCD1、BRDT、BSCL、BSCL2、BTAA、BTD、BTK、BUB1、BWS、BZX、C0L2A1、C0L6A1、C1NH、C1QA、C1QB、C1QG、C1S、C2、C3、C4A、C4B、C5、C6、C7、C7orf2、C8A、C8B、C9、CA125、CA15-3/CA 27-29、CA195、CA19-9、CA72-4、CA2、CA242、CA50、CABYR、CACD、CACNA2D1、CACNA1A、CACNA1F、CACNA1S、CACNB2、CACNB4、CAGE、CA1、CALB3、CALCA、CALCR、CALM、CALR、CAM43、CAMEL、CAP-1、CAPN3、CARD15、CASP-5/m、CASP-8、CASP-8/m、CASR、CAT、CATM、CAV3、CB1、CBBM、CBS、CCA1、CCAL2、CCAL1、CCAT、CCL-1、CCL-11、CCL-12、CCL-13、CCL-14、CCL-15、CCL-16、CCL-17、CCL-18、CCL-19、CCL-2、CCL-20、CCL-21、CCL-22、CCL-23、CCL-24、CCL-25、CCL-27、CCL-3、CCL-4、CCL-5、CCL-7、CCL-8、CCM1、CCNB1、CCND1、CCO、CCR2、CCR5、CCT、CCV、CCZS、CD1、CD19、CD20、CD22、CD25、CD27、CD27L、cD3、CD30、CD30、CD30L、CD33、CD36、CD3E、CD3G、CD3Z、CD4、CD40、CD40L、CD44、CD44v、CD44v6、CD52、CD55、CD56、CD59、CD80、CD86、CDAN1、CDAN2、CDAN3、CDC27、CDC27/m、CDC2L1、CDH1、CDK4、CDK4/m、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2A/m、CDKN1A、CDKN1C、CDL1、CDPD1、CDR1、CEA、CEACAM1、CEACAM5、CECR、CECR9、CEPA、CETP、CFNS、CFTR、CGF1、CHAC、CHED2、CHED1、CHEK2、CHM、CHML、CHR39C、CHRNA4、CHRNA1、CHRNB1、CHRNE、CHS、CHS1、CHST6、CHX10、CIAS1、CIDX、CKN1、CLA2、CLA3、CLA1、CLCA2、CLCN1、CLCN5、CLCNKB、CLDN16、CLP、CLN2、CLN3、CLN4、CLN5、CLN6、CLN8、C1QA、C1QB、C1QG、C1R、CLS、CMCWTD、CMDJ、CMD1A、CMD1B、CMH2、MH3、CMH6、CMKBR2、CMKBR5、CML28、CML66、CMM、CMT2B、CMT2D、CMT4A、CMT1A、CMTX2、CMTX3、C-MYC、CNA1、CND、CNGA3、CNGA1、CNGB3、CNSN、CNTF、COA-1/m、COCH、COD2、COD1、COH1、COL10A、COL2A2、COL11A2、COL17A1、COL1A1、COL1A2、COL2A1、COL3A1、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL4A6、COL5A1、COL5A2、COL6A1、COL6A2、COL6A3、COL7A1、COL8A2、COL9A2、COL9A3、COL11A1、COL1A2、COL23A1、COL1A1、COLQ、COMP、COMT、CORD5、CORD1、COX10、COX-2、CP、CPB2、CPO、CPP、CPS1、CPT2、CPT1A、CPX、CRAT、CRB1、CRBM、CREBBP、CRH、CRHBP、CRS、CRV、CRX、CRYAB、CRYBA1、CRYBB2、CRYGA、CRYGC、CRYGD、CSA、CSE、CSF1R、CSF2RA、CSF2RB、CSF3R、CSF1R、CST3、CSTB、CT、CT7、CT-9/BRD6、CTAA1、CTACK、CTEN、CTH、CTHM、CTLA4、CTM、CTNNB1、CTNS、CTPA、CTSB、CTSC、CTSK、CTSL、CTS1、CUBN、CVD1、CX3CL1、CXCL1、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL16、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CYB5、CYBA、CYBB、CYBB5、、CYFRA21-1、CYLD、CYLD1、CYMD、CYP11B1、CYP11B2、CYP17、CYP17A1、CYP19、CYP19A1、CYP1A2、CYP1B1、CYP21A2、CYP27A1、CYP27B1、CYP2A6、CYP2C、CYP2C19、CYP2C9、CYP2D、CYP2D6、CYP2D7P1、CYP3A4、CYP7B1、CYPB1、CYP11B1、CYP1A1、CYP1B1、CYRAA、D40，DAD1、DAM、DAM-10/MAGE-B1、DAM-6/MAGE-B2、DAX1、DAZ、DBA、DBH、DBI、DBT、DCC、DC-CK1、DCK、DCR、DCX、DDB 1、DDB2、DDIT3、DDU、DECR1、DEK-CAN、DEM、DES、DF，DFN2、DFN4、DFN6、DFNA4、DFNA5、DFNB5、DGCR、DHCR7、DHFR、DHOF、DHS、DIA1、DIAPH2、DIAPH1、DIH1、DIO1、DISCI、DKC1、DLAT、DLD、DLL3、DLX3、DMBT1、DMD、DM1、DMPK、DMWD、DNAI1、DNASE1、DNMT3B、DPEP1、DPYD、DPYS、DRD2、DRD4、DRPLA、DSCR1、DSG1、DSP、DSPP、DSS、DTDP2、DTR、DURS1、DWS、DYS、DYSF、DYT2、DYT3、DYT4、DYT2、DYT1、DYX1、EBAF、EBM、EBNA、EBP、EBR3、EBS1、ECA1、ECB2、ECE1、ECGF1、ECT、ED2、ED4、EDA、EDAR、ECA1、EDN3、EDNRB、EEC1、EEF1A1L14、EEGV1、EFEMP1、EFTUD2/m、EGFR、EGFR/Her1、EGI、EGR2、EIF2AK3、eIF4G、EKV、ElIS、ELA2、ELF2、ELF2M、ELK1、ELN、ELONG、EMD、EML1、EMMPRIN、EMX2、ENA-78、ENAM、END3、ENG、ENO1、ENPP1、ENUR2、ENUR1、EOS、EP300、EPB41、EPB42、EPCAM、EPD、EphA1、EphA2、EphA3、肝配蛋白A2、肝配蛋白A3、EPHX1、EPM2A、EPO、EPOR、EPX、ERBB2、ERCC2 ERCC3，ERCC4、ERCC5、ERCC6、ERVR、ESR1、ETFA、ETFB、ETFDH、ETM1、ETV6-AML1、ETV1、EVC、EVR2、EVR1、EWSR1、EXT2、EXT3、EXT1、EYA1、EYCL2、EYCL3、EYCL1、EZH2、F10、F11、F12、F13A1、F13B、F2、F5、F5F8D、F7、F8、F8C、F9、FABP2、FACL6、FAH、FANCA、FANCB、FANCC、FANCD2、FANCF、FasL，FBN2、FBN1、FBP1、FCG3RA，FCGR2A、FCGR2B、FCGR3A、FCHL、FCMD、FCP1、FDPSL5、FECH、FEO、FEOM1、FES、FGA、FGB、FGD1、FGF2、FGF23、FGF5、FGFR2、FGFR3、FGFR1、FGG、FGS1、FH、FIC1、FIH、F2、FKBP6、FLNA、FLT4、FMO3，FMO4、FMR2、FMR1、FN、FN1/m、FOXC1、FOXE1、FOXL2、FOXO1A、FPDMM、FPF、Fra-1、FRAXF、FRDA、FSHB、FSHMD1A、FSHR、FTH1、FTHL17、FTL、FTZF1、FUCA1、FUT2、FUT6、FUT1、FY、G250、G250/CAIX、G6PC、G6PD、G6PT1、G6PT2、GAA、GABRA3、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7b、GAGE-8、GALC、GALE、GALK1、GALNS、GALT、GAMT、GAN、GAST、GASTRIN17、GAIA3、GATA、GBA、GBE、GC、GCDH、GCGR、GCH1、GCK、GCP-2、GCS1、G-CSF、GCSH、GCSL、GCY、GDEP，GDF5、GDI1、GDNF、GDXY、GFAP、GFND、GGCX、GGT1、GH2、GH1、GHR、GHRHR、GHS、GIF、GINGF、GIP、GJA3、GJA8、GJB2、GJB3、GJB6、GJB1、GK、GLA、GLB、GLB1、GLC3B、GLC1B、GLC1C、GLDC、GLI3、GLP1、GLRA1、GLUD1、GM1(fuc-GM1)、GM2A、GM-CSF、GMPR、GNAI2、GNAS、GNAT1、GNB3、GNE、GNPTA、GNRH、GNRH1、GNRHR、GNS、GnT-V、gp100、GP1BA、GP1BB、GP9、GPC3、GPD2、GPDS1、GPI、GP1BA、GPN1LW、GPNMB/m、GPSC、GPX1、GRHPR、GRK1、GROα、GROβ、GROγ、GRPR、GSE、GSM1、GSN、GSR、GSS、GTD、GTS、GUCA1A、GUCY2D、GULOP、GUSB、GUSM、GUST、GYPA、GYPC、GYS1、GYS2、H0KPP2、H0MG2、HADHA、HADHB、HAGE、HAGH、HAL、HAST-2、HB1、HBA2、HBA1、HBB、HBBP1、HBD、HBE1、HBG2、HBG1、HBHR、HBP1、HBQ1、HBZ、HBZP、HCA、HCC-1、HCC-4、HCF2、HCG、HCL2、HCL1、HCR、HCVS、HD、HPN、HER2、HER2/NEU、HER3、HERV-K-MEL、HESX1、HEXA、HEXB、HF1、HFE、HF1、HGD、HHC2、HHC3、HHG、HK1HLA-A、HLA-A*0201-R170I、HLA-A11/m、HLA-A2/m、HLA-DPB1HLA-DRA、HLCS、HLXB9、HMBS、HMGA2、HMGCL、HMI、HMN2、HMOX1、HMS1 HMW-MAA、HND、HNE、HNF4A、HOAC、HOMEOBOX NKX 3.1、HOM-TES-14/SCP-1、HOM-TES-85、HOXA1 HOXD13、HP、HPC1、HPD、HPE2、HPE1、HPFH、HPFH2、HPRT1、HPS1、HPT、HPV-E6、HPV-E7、HR、HRAS、HRD、HRG、HRPT2、HRPT1、HRX、HSD11B2、HSD17B3、HSD17B4、HSD3B2、HSD3B3、HSN1、HSP70-2M、HSPG2、HST-2、HTC2、HTC1、hTERT、HTN3、HTR2C、HVBS6、HVBS1、HVEC、HV1S、HYAL1、HYR、I-309、IAB、IBGC1、IBM2、ICAM1、ICAM3、iCE、ICHQ、ICR5、ICR1、ICS 1、IDDM2、IDDM1、IDS、IDUA、IF、IFNa/b、IFNGR1、IGAD1、IGER、IGF-1R、IGF2R、IGF1、IGH、IGHC、IGHG2、IGHG1、IGHM、IGHR、IGKC、IHG1、IHH、IKBKG、IL1、IL-1RA、IL10、IL-11、IL12、IL12RB1、IL13、IL-13Rα2、IL-15、IL-16、IL-17、IL18、IL-1a、IL-1α、IL-1b、IL-1β、IL1RAPL1、IL2、IL24、IL-2R、IL2RA、IL2RG、IL3、IL3RA，IL4、IL4R、IL4R、IL-5、IL6、IL-7、IL7R、IL-8、IL-9、不成熟的层粘连蛋白受体、IMMP2L、INDX、INFGR1、INFGR2、INFα、IFN..INFγ、INS、INSR、INVS、IP-10、IP2、IPF1、IP1、IRF6、IRS1、ISCW、ITGA2、ITGA2B、ITGA6、ITGA7、ITGB2、ITGB3、ITGB4、ITIH1、ITM2B、IV、IVD、JAG1、JAK3、JBS、JBTS1、JMS、JPD、KAL1、KAL2、KALI、KLK2、KLK4、KCNA1、KCNE2、KCNE1、KCNH2、KCNJ1、KCNJ2、KCNJ1、KCNQ2、KCNQ3、KCNQ4、KCNQ1、KCS、KERA、KFM、KFS、KFSD、KHK、ki-67、KIAA0020、KIAA0205、KIAA0205/m、KIF1B、KIT、KK-LC-1、KLK3、KLKB1、KM-HN-1、KMS、KNG、KNO、K-RAS/m、KRAS2、KREV1、KRT1、KRT10、KRT12、KRT13、KRT14、KRT14L1、KRT14L2、KRT14L3，KRT16、KRT16L1、KRT16L2、KRT17、KRT18、KRT2A、KRT3、KRT4、KRT5、KRT6A、KRT6B、KRT9、KRTHB1、KRTHB6、KRT1、KSA、KSS、KWE、KYNU、L0H19CR1、L1CAM、LAGE、LAGE-1、LALL、LAMA2、LAMA3、LAMB3、LAMB1、LAMC2、LAMP2、LAP、LCA5、LCAT、LCCS、LCCS 1、LCFS2、LCS1、LCT、LDHA、LDHB、LDHC、LDLR、LDLR/FUT、LEP、LEWISY、LGCR、LGGF-PBP、LGI1、LGMD2H、LGMD1A、LGMD1B、LHB、LHCGR、LHON、LHRH、LHX3、LIF、LIG1、LIMM、LIMP2、LIPA、LIPA、LIPB、LIPC、LIVIN、L1CAM、LMAN1、LMNA、LMX1B、LOLR、LOR、LOX、LPA、LPL、LPP、LQT4、LRP5、LRS 1、LSFC、LT-β、LTBP2、LTC4S、LYL1、XCL1、LYZ、M344、MA50、MAA、MADH4、MAFD2、MAFD1、MAGE、MAGE-A1、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGEB1、MAGE-B10、MAGE-B16、MAGE-B17、MAGE-B2、MAGE-B3、MAGE-B4、MAGE-B5、MAGE-B6、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-D1、MAGE-D2、MAGE-D4、MAGE-E1、MAGE-E2、MAGE-F1，MAGE-H1、MAGEL2、MGB1、MGB2、MAN2A1、MAN2B1、MANBA、MANBB、MAOA、MAOB、MAPK8IP1、MAPT、MART-1、MART-2、MART2/m、MAT1A、MBL2、MBP、MBS1、MC1R、MC2R、MC4R、MCC、MCCC2、MCCC1、MCDR1、MCF2、MCKD、MCL1、MC1R、MCOLN1、MCOP、MCOR、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCPH2、MCPH1、MCS、M-CSF、MDB、MDCR、MDM2、MDRV、MDS 1、ME1、ME1/m、ME2、ME20、ME3、MEAX、MEB、MEC CCL-28、MECP2、MEFV、MELANA、MELAS、MEN1 MSLN、MET、MF4、MG50、MG50/PXDN、MGAT2、MGAT5、MGC1 MGCR、MGCT、MGI、MGP、MHC2TA、MHS2、MHS4、MIC2、MIC5、MIDI、MIF、MIP、MIP-5/HCC-2、MITF、MJD、MKI67、MKKS、MKS1、MLH1、MLL、MLLT2、MLLT3、MLLT7、MLLT1、MLS、MLYCD、MMA1a、MMP 11、MMVP1、MN/CAIX-抗原、MNG1、MN1、MOC31、MOCS2、MOCS1、MOG、MORC、MOS、MOV18、MPD1、MPE、MPFD、MPI、MPIF-1、MPL、MPO、MPS3C、MPZ、MRE11A、MROS、MRP1、MRP2、MRP3、MRSD、MRX14、MRX2、MRX20、MRX3、MRX40、MRXA、MRX1、MS、MS4A2、MSD、MSH2、MSH3、MSH6、MSS、MSSE、MSX2、MSX1、MTATP6、MTC03、MTCO1、MTCYB、MTHFR、MTM1、MTMR2、MTND2、MTND4、MTND5、MTND6、MTND1、MTP、MTR、MTRNR2、MTRNR1、MTRR，MTTE、MTTG、MTTI、MTTK、MTTL2、MTTL1、MTTN、MTTP、MTTS1、MUC1，MUC2、MUC4、MUC5AC、MUM-1、MUM-1/m、MUM-2、MUM-2/m、MUM-3、MUM-3/m、MUT、突变体p21 ras、MUTYH、MVK、MX2、MXI1、MY05A、MYB、MYBPC3、MYC、MYCL2、MYH6、MYH7、MYL2、MYL3、MYMY、MYO15A、MYO1G、MYO5A、MYO7A、MYOC、肌球蛋白/m、MYP2、MYP1、NA88-A、N-乙酰葡糖氨基转移酶-V、NAGA、NAGLU、NAMSD、NAPB、NAT2、NAT、NBIA1、NBS1、NCAM、NCF2、NCF1、NDN、NDP、NDUFS4、NDUFS7、NDUFS8、NDUFV1、NDUFV2、NEB、NEFH、NEM1、Neo-PAP、neo-PAP/m、NEU1、NEUROD1、NF2、NF1、NFYC/m、NGEP、NHS、NKS1、NKX2E、NM、NME1、NMP22、NMTC、NODAL、NOG、NOS3、NOTCH3、NOTCH1、NP、NPC2、NPC1、NPHL2、NPHP1、NPHS2、NPHS1、NPM/ALK、NPPA、NQO1、NR2E3、NR3C1、NR3C2、NRAS、NRAS/m、NRL、NROB1、NRTN、NSE、NSX、NTRK1、NUMA1、NXF2、NY-CO1、NY-ESO1、NY-ESO-B、NY-LU-12、ALDOA、NYS2、NYS4、NY-SAR-35、NYS1、NYX、OA3、OA1、OAP、OASD、OAT、OCA1、OCA2、OCD1、OCRL、OCRL1、OCT、ODDD、ODT1、OFC1、OFD1、OGDH、OGT、OGT/m、OPA2、OPA1、OPD1、OPEM、OPG、OPN、OPN1LW、OPN1MW、OPN1SW、OPPG、OPTB1、TTD、ORM1、ORP1、OS-9、OS-9/m、OSM LIF、OTC、OTOF、OTSC1、OXCT1、OYTES1、P15、P190 MINOR BCR-ABL、P2RY12、P3、P16、P40、P4HB、P-501、P53、P53/m、P97、PABPN1、PAFAH1B1、PAFAH1P1、PAGE-4、PAGE-5、PAH、PAI-1、PAI-2、PAK3、PAP、PAPPA、PARK2、PART-1、PATE、PAX2、PAX3、PAX6、PAX7、PAX8、PAX9、PBCA、PBCRA1、PBT、PBX1、PBXP1、PC、PCBD、PCCA、PCCB、PCK2、PCK1、PCLD、PCOS1、PCSK1、PDB1、PDCN、PDE6A、PDE6B、PDEF、PDGFB、PDGFR、PDGFRL、PDHA1、PDR、PDX1、PECAM1、PEE1、PEO1、PEPD、PEX10、PEX12、PEX13、PEX3、PEX5、PEX6、PEX7、PEX1、PF4、PFBI、PFC、PFKFB1、PFKM、PGAM2、PGD、PGK1、PGK1P1、PGL2、PGR、PGS、PHA2A、PHB、PHEX、PHGDH、PHKA2、PHKA1、PHKB、PHKG2、PHP、PHYH、PI、PI3、PIGA、PIM1-KINASE、PIN1、PIP5K1B、PITX2、PITX3、PKD2、PKD3、PKD1、PKDTS、PKHD1、PKLR、PKP1、PKU1、PLA2G2A、PLA2G7、PLAT、PLEC1、PLG、PLI、PLOD、PLP1、PMEL17、PML、PML/RARα、PMM2、PMP22、PMS2、PMS1、PNKD、PNLIP、POF1、POLA、POLH、POMC、PON2、PON1、PORC、POTE、POU1F1、POU3F4、POU4F3、POU1F1、PPAC、PPARG、PPCD、PPGB、PPH1、PPKB、PPMX、PPOX、PPP1R3A、PPP2R2B、PPT1、PRAME、PRB、PRB3、PRCA1、PRCC、PRD、PRDX5/m、PRF1、PRG4、PRKAR1A、PRKCA、PRKDC、PRKWNK4、PRNP、PROC、PRODH、PROM1、PROP1、PROS1、PRST、PRP8、PRPF31、PRPF8、PRPH2、PRPS2、PRPS1、PRS、PRSS7、PRSS1、PRTN3、PRX、PSA、PSAP、PSCA、PSEN2、PSEN1、PSG1、PSGR、PSM、PSMA、PSORS1、PTC、PTCH、PTCH1、PTCH2、PTEN、PTGS1、PTH、PTHR1、PTLAH、PTOS1、PTPN12、PTPNI 1、PTPRK、PTPRK/m、PTS、PUJO、PVR、PVRL1、PWCR、PXE、PXMP3、PXR1、PYGL、PYGM、QDPR、RAB27A、RAD54B、RAD54L、RAG2、RAGE、RAGE-1、RAG1、RAP1、RARA、RASA1、RBAF600/m、RB1、RBP4、RBP4、RBS、RCA1、RCAS1、RCCP2、RCD1、RCV1、RDH5、RDPA、RDS、RECQL2、RECQL3、RECQL4、REG1A、REHOBE、REN、RENBP、RENS1、RET、RFX5、RFXANK、RFXAP、RGR、RHAG、RHAMM/CD168、RHD、RHO、Rip-1、RLBP1、RLN2、RLN1、RLS、RMD1、RMRP、ROM1、ROR2、RP、RP1、RP14、RP17、RP2、RP6、RP9、RPD1、RPE65、RPGR、RPGRIP1、RP1、RP10、RPS19、RPS2、RPS4X、RPS4Y、RPS6KA3、RRAS2、RS1、RSN、RSS、RU1、RU2、RUNX2，RUNX1、RWS、RYR1、S-100、SAA1、SACS、SAG、SAGE、SALL1、SARDH、SART1、SART2、SART3、SAS、SAX1、SCA2、SCA4、SCA5、SCA7、SCA8、SCA1、SCC、SCCD、SCF、SCLC1、SCN1A、SCN1B、SCN4A、SCN5A、SCNN1A、SCNN1B、SCNN1G、SCO2、SCP1、SCZD2、SCZD3、SCZD4、SCZD6、SCZD1、SDF-1/SDHA、SDHD、SDYS、SEDL、SERPENA7、SERPINA3、SERPINA6、SERPINA1、SERPINC1、SERPIND1、SERPINE1、SERPINF2、SERPING1、SERPINI1、SFTPA1、SFTPB、SFTPC、SFTPD、SGCA、SGCB、SGCD、SGCE、SGM1、SGSH、SGY-1、SH2D1A、SHBG、SHFM2、SHFM3、SHFM1、SHH、SHOX、SI、SIAL、SIALYL LEWISX、SIASD、S11、SIM1、SIRT2/m、SIX3、SJS1、SKP2、SLC10A2、SLC12A1、SLC12A3、SLC17A5、SLC19A2、SLC22A1L、SLC22A5、SLC25A13、SLC25A15、SLC25A20、SLC25A4、SLC25A5、SLC25A6、SLC26A2、SLC26A3、SLC26A4、SLC2A1、SLC2A2、SLC2A4、SLC3A1、SLC4A1、SLC4A4、SLC5A1、SLC5A5、SLC6A2、SLC6A3、SLC6A4、SLC7A7、SLC7A9、SLC11A1、SLOS、SMA、SMAD1、SMAL、SMARCB1、SMAX2、SMCR、SMCY、SM1、SMN2、SMN1、SMPD1、SNCA、SNRPN、SOD2、SOD3、SOD1、SOS1、SOST、SOX9、SOX10、Sp17、SPANXC、SPG23、SPG3A、SPG4、SPG5A、SPG5B、SPG6、SPG7、SPINK1、SPINK5、SPPK、SPPM、SPSMA、SPTA1、SPTB、SPTLC1、SRC、SRD5A2、SRPX、SRS、SRY、βhCG、SSTR2、SSX1、SSX2(HOM-MEL-40/SSX2)、SSX4、ST8、STAMP-1、STAR、STARP1、STATH、STEAP、STK2、STK11、STn/KLH、STO、STOM、STS、SUOX、SURF1、SURVIVIN-2B、SYCP1、SYM1、SYN1、SYNS1、SYP、SYT/SSX、SYT-SSX-1、SYT-SSX-2、TA-90、TAAL6、TACSTD1、TACSTD2、TAG72、TAF7L、TAF1、TAGE、TAG-72、TALI、TAM、TAP2、TAP1、TAPVR1、TARC、TARP、TAT、TAZ、TBP、TBX22、TBX3、TBX5、TBXA2R、TBXAS1、TCAP、TCF2、TCF1、TCIRG1、TCL2、TCL4、TCL1A、TCN2、TCOF1、TCR、TCRA、TDD、TDFA、TDRD1、TECK、TECTA、TEK、TEL/AML1、TELAB1、TEX15、TF、TFAP2B、TFE3、TFR2、TG、TGFA、TGF-β、TGFBI、TGFB1、TGFBR2、TGFBRE、TGFβ、TGFβRII、TGIF、TGM-4、TGM1、TH、THAS、THBD、THC、THC2、THM、THPO、THRA、THRB、TIMM8A、TIMP2、TIMP3、TIMP1、TITF1、TKCR、TKT、TLP、TLR1、TLR10、TLR2、TLR3、TLR4、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLX1、TM4SF1、TM4SF2、TMC1、TMD、TMIP、TNDM、TNF、TNFRSF11A、TNFRSF1A、TNFRSF6、TNFSF5、TNFSF6、TNFα、TNFβ、TNNI3、TNNT2、TOC、TOP2A、TOP1、TP53、TP63、TPA、TPBG、TPI、TPI/m、TPI1、TPM3、TPM1、TPMT、TPO、TPS、TPTA、TRA、TRAG3、TRAPPC2、TRC8、TREH、TRG、TRH、TRIM32、TRIM37、TRP1、TRP2、TRP-2/6b、TRP-2/INT2、Trp-p8、TRPS1、TS、TSC2、TSC3、TSC1、TSG101、TSHB、TSHR、TSP-180、TST、TTGA2B、TTN、TTPA、TTR、TU M2-PK、TULP1、TWIST、TYH、TYR、TYROBP、TYROBP、TYRP1、TYS、UBE2A、UBE3A、UBE1、UCHL1、UFS、UGT1A、ULR、UMPK、UMPS、UOX、UPA、UQCRC1、URO5、UROD、UPK1B、UROS、USH2A、USH3A、USH1A、USH1C、USP9Y、UV24、VBCH、VCF、VDI、VDR、VEGF、VEGFR-2、VEGFR-1、VEGFR-2/FLK-1、VHL、VIM、VMD2、VMD1、VMGLOM、VNEZ、VNF、VP、VRNI、VWF、VWS、WAS、WBS2、WFS2、WFS1、WHCR、WHN、WISP3、WMS、WRN、WS2A、WS2B、WSN、WSS、WT2、WT3、WT1、WTS、WWS、XAGE、XDH、XIC、XIST、XK、XM、XPA、XPC、XRCC9、XS、ZAP70、ZFHX1B、ZFX、ZFY、ZIC2、ZIC3、ZNF145、ZNF261、ZNF35、ZNF41、ZNF6、ZNF198、ZWS1，或选自其片段或变体。优选地，这样的片段以及变体显示与上面所显示或描述的蛋白或肽或蛋白或肽序列之一约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％的序列同源性或同一性。在该上下文中，片段和变体的定义如上面所定义的相似地用于本发明的转运蛋白货物结合分子的组分(A)。
适合作为本发明的转运蛋白货物结合分子组分(B)的效应分子也可选自蛋白激酶抑制剂，特别地是蛋白激酶c-Jun氨基端激酶的抑制剂，即JNK抑制剂。典型地，适合作为本发明的转运蛋白货物结合分子组分(B)的JNK抑制剂可衍生自人或大鼠IB1序列，优选地衍生自如根据SEQ ID NO：137(描述来自大鼠的IB1 cDNA序列及其预测的氨基酸序列)、SEQ ID NO：138(描述来自大鼠的IB1蛋白序列，其由rIb1基因-剪接供体的外显子-内含子边界编码)、SEQ ID NO：139(描绘来自人类的IB1蛋白序列)或SEQ ID NO：140(描绘来自人类(homo sapiens)的IB1cDNA序列)的任何序列所限定或编码的氨基酸序列，更优选地衍生自如根据SEQ ID NO：139(描绘来自人类的IB1蛋白序列)或SEQ ID NO：140(描绘来自人类的IB1 cDNA序列)的任何序列所限定或编码的氨基酸序列，或衍生自其任何片段或变体。在该上下文中，片段和变体的定义相似地如上面所定义的适用于本发明的转运蛋白货物结合分子的组分(A)。
优选地，适合作为本发明的转运蛋白货物结合分子组分(B)的JNK抑制剂序列包括少于150个氨基酸残基的总长度，优选的范围在5到150个氨基酸残基，更优选的，10到100个氨基酸残基，特别更优选的，10到75个氨基酸残基，最优选的15到50个氨基酸残基，例如10至30、10至20或10至15个氨基酸残基。更优选地，这样的JNK抑制剂序列和上面的范围可选自任何本文提到的JNK抑制剂序列，特别更优选地选自如根据SEQ ID NO：139所限定的或如SEQ ID NO：140所编码的氨基酸序列，特别更优选地处于SEQ ID NO：140的核苷酸420和980之间或SEQ ID NO：139的氨基酸105和291之间的区域，最优选地处于SEQ ID NO：140的核苷酸561和647之间或SEQ ID NO：139的氨基酸152和180之间的区域。
根据特别的实施方式，适合作为本发明的转运蛋白货物结合分子组分(B)的JNK抑制剂序列典型地结合JNK和/或抑制至少一个JNK激活的转录因子，例如c-Jun或ATF2(参见例如SEQ ID NOs：147和148)或Elk1的激活。
同样，适合作为本发明的转运蛋白货物结合分子组分(B)的JNK抑制剂序列优选地包括根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的至少一个氨基酸序列，或其片段、衍生物或变体，或由之组成。更优选地，如本文所用的JNK抑制剂序列可含有根据SEQID NOs：137至220的氨基酸序列或其变体、片段或衍生物的1、2、3、4或更多个拷贝。如果以超过一个拷贝存在，如本文所用的根据SEQ ID NOs：137至220的这些氨基酸序列或其变体、片段或衍生物可直接相互连接，而不需要任何连接体序列或通过连接体序列连接，该连接体序列包括1到10，优选1到5个氨基酸。形成连接体序列的氨基酸优选地选自甘氨酸或脯氨酸作为氨基酸残基。更优选的，如本文所用，根据SEQ ID NOs：137至220的这些氨基酸序列或其片段、变体或其衍生物可通过2、3或更多的脯氨酸残基的铰合部相互隔开。
适合作为本发明的转运蛋白货物结合分子组分(B)的JNK抑制剂序列可由L-氨基酸、D-氨基酸或其组合组成。优选地，如本文所用的JNK抑制剂序列包括至少1个或甚至两个，优选至少3、4或5个，更优选至少6、7、8或9个和特别更优选至少10个或更多个D-和/或L-氨基酸，其中，在如本文所用的JNK抑制剂序列中，D-和/或L-氨基酸可以区组(blockwise)、非区组或可替换的方式排列。
根据一个优选的实施方式，适合作为本发明的转运蛋白货物结合分子组分(B)的JNK抑制剂序列可专有地由L-氨基酸组成。如本文所用的JNK抑制剂序列可然后包括根据SEQ ID NO：141至143的至少一个“天然的JNK抑制剂序列”或由之组成。在该上下文中，术语“天然的”或“天然的JNK抑制剂序列”是指根据SEQ ID NO：141至143任何的非改变的JNK抑制剂序列，如本文所用的，其完全由L-氨基酸组成。
因此，适合作为本发明的转运蛋白货物结合分子组分(B)的JNK抑制剂序列可包括至少一个(天然的)氨基酸序列NH2-Xn b-Xn a-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xn b-COOH(L-IB类(s))[SEQ ID NO：143]和/或IB1 XRPTTLXLXXXXXXXQDS/TX(L-IB(类))[SEQ ID NO：151]的JNK结合结构域(JBDs)或由之组成。在该上下文中，每个X典型地代表氨基酸残基，优选地选自任何(天然的)氨基酸残基。Xn a典型地代表一个氨基酸残基，优选地选自除丝氨酸或苏氨酸之外的任何氨基酸残基，其中n(X的重复数)是0或1。此外，每个Xn b可选自任何氨基酸残基，其中n(X的重复数)是0-5、5-10、10-15、15-20、20-30或更多，如果对于Xn a，n(X的重复数)是0，那么Xn b优选地在其C端不包括丝氨酸或苏氨酸，以避免丝氨酸或苏氨酸在该位置。优选地，Xn b代表来自SEQ ID NOs：141至143的一段连续的肽残基。Xn a和Xn b可代表任何D或L氨基酸。另外，如本文所用的JNK抑制剂序列可包括至少一个选自IB1DTYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT(L-IB1)[SEQ ID NO：149]的JNK结合结构域的(天然的)氨基酸序列或由之组成。更优选地，如本文所用的JNK抑制剂序列另外可包括至少一个(天然的)氨基酸序列NH2-RPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH(L-IB1(s))[SEQ ID NO：141]或由之组成。此外，如本文所用的JNK抑制剂序列可包括至少一个(天然的)氨基酸序列或由之组成，该序列选自包括如下的组：IB1 L-IB1(s1)(NH2-TLNLFPQVPRSQD-COOH，SEQ ID NO：153)；L-IB1(s2)(NH2-TTLNLFPQVPRSQ-COOH，SEQ ID NO：154)；L-IB1(s3)(NH2-PTTLNLFPQVPRS-COOH，SEQ ID NO：155)；L-IB1(s4)(NH2-RPTTLNLFPQVPR-COOH，SEQ ID NO：156)；L-IB1(s5)(NH2-KRPTTLNLFPQVP-COOH，SEQ ID NO：157)；L-IB1(s6)(NH2-PKRPTTLNLFPQV-COOH，SEQ ID NO：158)；L-IB1(s7)(NH2-RPKRPTTLNLFPQ-COOH，SEQ ID NO：159)；L-IB1(s8)(NH2-LNLFPQVPRSQD-COOH，SEQ ID NO：160)；L-IB1(s9)(NH2-TLNLFPQVPRSQ-COOH，SEQ ID NO：161)；L-IB1(s10)(NH2-TTLNLFPQVPRS-COOH，SEQ ID NO：162)；L-IB1(s11)(NH2-PTTLNLFPQVPR-COOH，SEQ ID NO：163)；L-IB1(s12)(NH2-RPTTLNLFPQVP-COOH，SEQ ID NO：164)；L-IB1(s13)(NH2-KRPTTLNLFPQV-COOH，SEQ ID NO：165)；L-IB1(s14)(NH2-PKRPTTLNLFPQ-COOH，SEQ ID NO：166)；L-IB1(s15)(NH2-RPKRPTTLNLFP-COOH，SEQ ID NO：167)；L-IB1(s16)(NH2-NLFPQVPRSQD-COOH，SEQ ID NO：168)；L-IB1(s17)(NH2-LNLFPQVPRSQ-COOH，SEQ ID NO：169)；L-IB1(s18)(NH2-TLNLFPQVPRS-COOH，SEQ ID NO：170)；L-IB1(s19)(NH2-TTLNLFPQVPR-COOH，SEQ ID NO：171)；L-IB1(s20)(NH2-PTTLNLFPQVP-COOH，SEQ ID NO：172)；L-IB1(s21)(NH2-RPTTLNLFPQV-COOH，SEQ ID NO：173)；L-IB1(s22)(NH2-KRPTTLNLFPQ-COOH，SEQ ID NO：174)；L-IB1(s23)(NH2-PKRPTTLNLFP-COOH，SEQ ID NO：175)；L-IB1(s24)(NH2-RPKRPTTLNLF-COOH，SEQ ID NO：176)；L-IB1(s25)(NH2-LFPQVPRSQD-COOH，SEQ ID NO：177)；L-IB1(s26)(NH2-NLFPQVPRSQ-COOH，SEQ ID NO：178)；L-IB1(s27)(NH2-LNLFPQVPRS-COOH，SEQ ID NO：179)；L-IB1(s28)(NH2-TLNLFPQVPR-COOH，SEQ ID NO：180)；L-IB1(s29)(NH2-TTLNLFPQVP-COOH，SEQ ID NO：181)；L-IB1(s30)(NH2-PTTLNLFPQV-COOH，SEQ ID NO：182)；L-IB1(s31)(NH2-RPTTLNLFPQ-COOH，SEQ ID NO：183)；L-IB1(s32)(NH2-KRPTTLNLFP-COOH，SEQ ID NO：184)；L-IB1(s33)(NH2-PKRPTTLNLF-COOH，SEQ ID NO：185)和L-IB1(s34)(NH2-RPKRPTTLNL-COOH，SEQ ID NO：186)的JNK结合结构域。
另外，适合作为本发明的转运蛋白货物结合分子组分(B)的JNK抑制剂序列可包括至少一个(天然的)氨基酸序列或由之组成，该序列选自包括IB1的(长的)JNK结合结构域(JBDs)PGTGCGDTYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT(IB1-长的)[SEQ IDNO：145]、IB2的(长的)JNK结合结构域IPSPSVEEPHKHRPTTLRLTTLGAQDS(IB2-长的)[SEQ ID NO：146]、c-Jun  的JNK  结合结构域GAYGYSNPKILKQSMTLNLADPVGNLKPH(c-Jun)[SEQ ID NO：147]、ATF2的JNK结合结构域TNEDHLAVHKHKHEMTLKFGPARNDSVIV(ATF2)[SEQ ID NO：148]的集合。在该上下文中，比对揭示了部分保守的8个氨基酸序列，IB1和IB2的JBDs的进一步比对揭示了在两个序列之间高度保守的七个和三个氨基酸的两个区段。
根据另一个优选的实施方式，适合作为本发明的转运蛋白货物结合分子组分(B)的JNK抑制剂序列可部分或专有地由如上面所定义的D-氨基酸组成。更优选地，这些由D-氨基酸组成的JNK抑制剂序列是上面(天然的)JNK抑制剂序列的非天然的D逆反序列。术语“逆反序列”是指线状肽序列的异构体，其中，序列的方向是相反的，并且每一个氨基酸残基的手性是相反的(参见例如Jameson et al.，Nature，368，744-746(1994)；Brady et al.，Nature，368，692-693(1994))。结合D-对映体和相反合成的优点是交换了每个酰胺键中的羰基和氨基的位置，而保持侧链基团在每个α碳的位置。除非有特别的陈述，假定如根据本发明所使用的任何给定的L-氨基酸序列或肽，通过合成对相应的天然L-氨基酸序列或肽的相反序列或肽，可被转换成D逆反序列或肽。
因此，适合作为本发明的转运蛋白货物结合分子组分(B)的JNK抑制剂序列可包括至少一个根据氨基酸序列NH2-Xn b-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xn a-Xn b-COOH(D-IB1类(s))[SEQ ID NO：144]和/或XS/TDQXXXXXXXLXLTTPRX(D-IB(类))[SEQ IDNO：152]的D逆反序列或由之组成。如该上下文中所用，X、Xn a和Xn b如上面所定义的(优选地，代表D氨基酸)，其中Xn b优选地代表来自SEQ ID NO：142或144的一段连续的残基。另外，如本文所用的JNK抑制剂序列可包括至少一个根据氨基酸序列的D逆反序列或由之组成，该氨基酸序列包括IB1TDQSRPVQPFLNLTTPRKPRYTD(D-IB1)[SEQ ID NO：150]的JNK结合结构域(JBDs)。更优选地，如本文所用的JNK抑制剂序列可包括至少一个根据氨基酸序列NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPR-COOH(D-IB1(s))[SEQ ID NO：142]的D逆反序列或由之组成。此外，如本文所用的JNK抑制剂序列可包括至少一个根据氨基酸序列的D逆反序列或由之组成，该氨基酸序列包括IB1D-IB1(s1)(NH2-QPFLNLTTPRKPR-COOH，SEQ ID NO：187)；D-IB1(s2)(NH2-VQPFLNLTTPRKP-COOH，SEQ ID NO：188)；D-IB1(s3)(NH2-PVQPFLNLTTPRK-COOH，SEQ ID NO：189)；D-IB1(s4)(NH2-RPVQPFLNLTTPR-COOH，SEQ ID NO：190)；D-IB1(s5)(NH2-SRPVQPFLNLTTP-COOH，SEQ ID NO：191)；D-IB1(s6)(NH2-QSRPVQPFLNLTT-COOH，SEQ ID NO：192)；D-IB1(s7)(NH2-DQSRPVQPFLNLT-COOH，SEQ ID NO：193)；D-IB1(s8)(NH2-PFLNLTTPRKPR-COOH，SEQ ID NO：194)；D-IB1(s9)(NH2-QPFLNLTTPRKP-COOH，SEQ ID NO：195)；D-IB1(s10)(NH2-VQPFLNLTTPRK-COOH，SEQ ID NO：196)；D-IB1(s11)(NH2-PVQPFLNLTTPR-COOH，SEQ ID NO：197)；D-IB1(s12)(NH2-RPVQPFLNLTTP-COOH，SEQ ID NO：198)；D-IB1(s13)(NH2-SRPVQPFLNLTT-COOH，SEQ ID NO：199)；D-IB1(s14)(NH2-QSRPVQPFLNLT-COOH，SEQ ID NO：200)；D-IB1(s15)(NH2-DQSRPVQPFLNL-COOH，SEQ ID NO：201)；D-IB1(s16)(NH2-FLNLTTPRKPR-COOH，SEQ ID NO：202)；D-IB1(s17)(NH2-PFLNLTTPRKP-COOH，SEQ ID NO：203)；D-IB1(s18)(NH2-QPFLNLTTPRK-COOH，SEQ ID NO：204)；D-IB1(s19)(NH2-VQPFLNLTTPR-COOH，SEQ ID NO：205)；D-IB1(s20)(NH2-PVQPFLNLTTP-COOH，SEQ ID NO：206)；D-IB1(s21)(NH2-RPVQPFLNLTT-COOH，SEQ ID NO：207)；D-IB1(s22)(NH2-SRPVQPFLNLT-COOH，SEQ ID NO：208)；D-IB1(s23)(NH2-QSRPVQPFLNL-COOH，SEQ ID NO：209)；D-IB1(s24)(NH2-DQSRPVQPFLN-COOH，SEQ ID NO：210)；D-IB1(s25)(NH2-DQSRPVQPFL-COOH，SEQ ID NO：211)；D-IB1(s26)(NH2-QSRPVQPFLN-COOH，SEQ ID NO：212)；D-IB1(s27)(NH2-SRPVQPFLNL-COOH，SEQ ID NO：213)；D-IB1(s28)(NH2-RPVQPFLNLT-COOH，SEQ ID NO：214)；D-IB1(s29)(NH2-PVQPFLNLTT-COOH，SEQ ID NO：215)；D-IB1(s30)(NH2-VQPFLNLTTP-COOH，SEQ ID NO：216)；D-IB1(s31)(NH2-QPFLNLTTPR-COOH，SEQ ID NO：217)；D-IB1(s32)(NH2-PFLNLTTPRK-COOH，SEQ ID NO：218)；D-IB1(s33)(NH2-FLNLTTPRKP-COOH，SEQ ID NO：219)和d D-IB1(s34)(NH2-LNLTTPRKPR-COOH，SEQ ID NO：220)的JNK结合结构域(JBDs)。
适合作为本发明的转运蛋白货物结合分子组分(B)的示例性的JNK抑制剂序列呈现在表4(SEQ ID NO：s 141至220)中。该表呈现如本文所用的JNK抑制剂序列的名称以及它们的序列识别号、它们的长度和氨基酸序列。此外，表4显示IB1衍生的序列以及它们的通式，例如分别针对SEQ ID NO’s：141和142和SEQ ID NO’s：143和144。表4此外公开了根据SEQ ID NOs：153至186的L-IB1序列和根据SEQ ID NOs：187至220的D-IB1序列。
表4
Figure BPA00001390404200361
Figure BPA00001390404200371
Figure BPA00001390404200381
Figure BPA00001390404200391
适合作为本发明的转运蛋白货物结合分子组分(B)的JNK抑制剂序列此外可包括上面定义的根据SEQ ID NOs：141至220的天然或非天然氨基酸序列的至少一个变体、片段和/或衍生物或由之组成。优选地，这些变体、片段和/或衍生物保留上面公开的如本文所用的天然或非天然的JNK抑制剂序列的生物活性，特别是根据SEQ IDNOs：141至220的天然或非天然的氨基酸序列的生物活性，即结合JNK和/或抑制至少一个JNK激活的转录因子，例如c-Jun、ATF2或Elk1的激活。功能性可通过各种试验检测，例如肽对其靶分子的结合试验或通过生物物理学方法，例如光谱学、计算机模拟、结构分析等。特别地，如上面所定义的JNK抑制剂序列或其变体、片段和/或衍生物可通过亲水性分析而被分析(参见例如Hopp and Woods，1981.Proc NatlAcad Sci USA 78：3824-3828)，该亲水性分析能被用于识别肽的疏水区和亲水区，因此在用于实验操作，诸如在结合实验中，或用于抗体合成的底物设计中提供帮助。也可进行二级结构分析以识别如本文所用的JNK抑制剂序列或其变体、片段和/或衍生物的区域，该区域呈现特定的结构基序(参见例如Chou and Fasman，1974，Biochem 13：222-223)。
使用本领域可利用的计算机软件程序能实现操作、翻译、二级结构预测、亲水性和疏水性分布、开放阅读框架预测和绘图、以及序列同源性的测定。结构分析的其它方法包括，例如X射线结晶学(参见，例如Engstrom，1974.Biochem Exp Biol 11：7-13)、质谱法和气相色谱法(参见，例如METHODS IN PROTEIN SCIENCE，1997，J.Wileyand Sons，New York，NY)，也可以应用计算机模拟(参见，例如Fletterick and Zoller，eds.，1986.Computer Graphics and Molecular Modeling，In：CURRENT COMMUNICATIONSIN MOLECULAR BIOLOGY，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。
因此，适合作为本发明的转运蛋白货物结合分子组分(B)的JNK抑制剂序列可包括根据SEQ ID NOs：141至220的(天然或非天然的)氨基酸序列的至少一个变体或由之组成。在本发明的上下文中，“根据SEQ ID NOs：141至220的(天然或非天然的)氨基酸序列的变体”优选地是衍生自任何根据SEQ ID NOs：141至220的序列的序列，其中该变体包括根据SEQ ID NOs：141至220的氨基酸序列的氨基酸改变。这样的改变典型地包括根据SEQ ID NOs：141至220的氨基酸的1至20，优选地1至10，更优选地1至5个置换、***和/或缺失，其中该变体显示与根据SEQ ID NOs：141至220的任何序列至少约30％、50％、70％、80％、90％、95％、98％或甚至99％的序列同一性。如果如上面所定义和本文所用的根据SEQ ID NOs：141至220的(天然或非天然的)氨基酸序列的变体通过特定氨基酸的置换获得，这样的置换优选地包括如上面已经定义的保守氨基酸置换。
适合作为本发明的转运蛋白货物结合分子组分(B)的效应分子另外可以选自抗原或抗原片段，优选为蛋白质和(多)肽抗原，例如肿瘤抗原或其抗原片段、过敏抗原或其抗原片段、自身免疫自身抗原或其抗原片段、病原性抗原或其抗原片段、和来自病毒的抗原或其抗原片段，优选为来自以下病毒的抗原或其抗原片段：巨细胞病毒(CMV)、正痘(orthopox)天花病毒、正痘类天花病毒、绵羊副痘病毒、触染性软疣病毒、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、疱疹B病毒、水痘带疹病毒、伪狂犬病病毒、人巨细胞病毒、人疱疹病毒6型、人疱疹病毒7型、爱泼斯坦-巴尔病毒、人疱疹病毒8型、乙型肝炎病毒、切昆贡亚(chikungunya)病毒、奥尼翁-尼翁病毒、风疹病毒(rubivirus)、丙型肝炎病毒、GB病毒C型、西尼罗病毒、登革病毒、黄热病病毒、羊跳跃病病毒、圣路易士脑炎病毒、日本乙型脑炎病毒、波瓦散病毒、FSME病毒、SARS、SARS相关冠状病毒、人冠状病毒229E、人冠状病毒Oc43、曲状病毒(Torovirus)、人类嗜T淋巴细胞病毒I型、人类嗜T淋巴细胞病毒II型、HIV(AIDS)——即人免疫缺陷病毒1型或人免疫缺陷病毒2型、流感病毒、拉沙病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、塔卡里伯病毒、胡宁病毒、马休波病毒、博尔纳病病毒、本扬委那病毒、加利福尼亚脑炎病毒、裂谷热病毒、白蛉热病毒、托斯卡纳(Toscana)病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、Hazara病毒、Khasan病毒、汗坦病毒、首尔病毒(Seoulvirus)、希望山病毒、普马拉病毒、德贝病毒、图拉(Tula)病毒、sin nombre病毒、维多利亚湖马尔堡病毒、扎伊尔(Zaire)埃博拉病毒、苏丹埃博拉病毒、象牙海岸埃博拉病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、副流感病毒、疟疾病毒、马尔堡病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒、人类偏肺病毒、水疱性口炎印第安纳病毒、狂犬病病毒、莫科拉病毒、杜温哈格病毒、欧洲蝙蝠狂犬病病毒(Europeanbat lyssavirus)1+2、澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒(Australian bat lyssavirus)、腺病毒A-F、人***瘤病毒、湿疣病毒6型、湿疣病毒11型、多瘤病毒、腺伴随病毒2、轮状病毒、环状病毒、水痘——包括水痘带状疱疹(Varizella zoster)等；或来自利什曼原虫、typanosomes、amibes、细菌等的抗原或抗原片段；或可以选自表位；或选自以上抗原或抗原片段的变体。优选地，如上定义的抗原的片段以及变体显示与如上所示或所述的抗原或抗原序列之一约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％的序列同源性或同一性。在该上下文中，如以上已经定义的片段和变体的定义相似地应用于本发明的转运蛋白货物结合分子的组分(A)。此外，如上定义的抗原或抗原片段的表位(也称作“抗原决定簇”)也被包含。本发明的上下文中的表位典型地是位于如本文所定义的(天然)蛋白或肽抗原外表面上的片段，优选地具有5至15个氨基酸，更优选地具有5至12个氨基酸，特别更优选地具有6至9个氨基酸，其可被抗体识别，即以它们的天然形式。
此外，适合作为本发明转运蛋白货物结合分子的组分(B)的效应分子可以选自抗体。根据本发明，这样的抗体可选自任何抗体，例如本领域已知的任何重组产生的或天然存在的抗体，尤其是适于治疗、诊断或科学目的的抗体，或已被识别的与特定癌症疾病有关的抗体。在本文，术语“抗体”以其最广的意义被使用，并具体地覆盖单克隆和多克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂和阻断或中和抗体)和具有多表位特异性的抗体种类。根据本发明，“抗体”通常包括本领域已知的任何抗体(例如IgM、IgD、IgG、IgA和IgE抗体)，如天然存在的抗体、由在宿主生物体中免疫产生的抗体、从天然存在的抗体或通过在宿主生物体中免疫产生和通过本领域已知的分子生物学方法重组产生的抗体分离或鉴别的抗体，以及嵌合抗体、人抗体、人源化抗体、双特异性抗体、胞内抗体——即在细胞中表达并任选地位于特定的细胞区室的抗体、前面提到的抗体的片段和变体。一般而言，抗体由轻链和重链组成，轻链和重链都具有可变结构域和恒定结构域。轻链由N末端可变结构域——VL和C端恒定结构域——CL组成。相反，IgG抗体的重链，例如，由N末端可变结构域——VH和三个恒定结构域——CH1、CH2和CH3组成。在该上下文中，抗体也包括如上所述的抗体的片段和变体，例如Fab片段、Fc片段等。优选地，这样的片段以及变体显示与如上所述的抗体之一约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％的序列同源性或同一性。在本文中，片段和变体的定义相似地用于如上面所描述的本发明的转运蛋白货物结合分子的组分(A)。
另外，适合作为本发明的转运蛋白货物结合分子组分(B)的效应分子可以选自凋亡因子或凋亡相关蛋白，其包括AIF、Apaf——例如Apaf-1、Apaf-2、Apaf-3、oderAPO-2(L)、APO-3(L)、凋亡酶、Bad、Bak、Bax、Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-xS、bik、Bok、CAD、钙激活中性蛋白酶、胱天蛋白酶——例如胱天蛋白酶-1、胱天蛋白酶-2、胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-4、胱天蛋白酶-5、胱天蛋白酶-6、胱天蛋白酶-7、胱天蛋白酶-8、胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-10、胱天蛋白酶-11、ced-3、ced-9、c-Jun、c-Myc、crm A、细胞色素C(cytochrom C)、CdR1、DcR1、DD、DED、DISC、DNA-PKCS、DR3、DR4、DR5、FADD/MORT-1、FAK、Fas(Fas-配体CD95/fas(受体))、FLICE/MACH、FLIP、胞衬蛋白、fos、G-A肌动蛋白、Gas-2、凝溶胶蛋白、粒酶A/B、ICAD、ICE、JNK、核纤层蛋白A/B、MAP、Max、MCL-1、Mdm-2、MEKK-1、MORT-1、Myd88、NEDD、NF-κB、NuMa、p38、p53、PAK-2、PARP、穿孔蛋白、PITSLRE、PKCδ、pRb、早老蛋白、prICE、RAIDD、Ras、RIP、鞘磷脂酶、来自单纯疱疹的胸苷激酶(thymidinkinase)、TRADD、TRAF2、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3、转谷氨酰胺酶等；或选自其片段或变体；或选自wnt-信号传导途径的组分，如-联蛋白或ICF-家族、polo样激酶、CiP2A、PP2A、等；或选自其片段或变体。优选地，这样的片段以及变体显示与以上所示或所述的序列之一约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％的序列同源性或同一性。在该上下文中，片段和变体的定义相似地用于如上面所描述的本发明的转运蛋白货物结合分子的组分(A)。
适合作为本发明转运蛋白货物结合分子的组分(B)的效应分子另外可以选自至少一个或更多个部分或全长BH3-结构域和/或至少一个部分或全长唯BH3蛋白。在该上下文中，唯BH3蛋白优选地被定义为通过与Bcl-2家族的其它成员相互作用而代表细胞凋亡调节剂的Bcl-2家族成员。因此，在本发明的上下文中，本发明转运蛋白货物结合分子的组分(B)可以选自氨基酸序列，其包括唯BH3蛋白的至少一个或更多个部分或全长BH3-结构域序列(一个或多个)或部分或全长唯BH3蛋白(被定义为Bcl-2家族蛋白质的亚类)，其能通过与至少一个Bcl-2家族蛋白相互作用或通过激活或致敏Bcl-2家族的至少一个促凋亡成员而诱导凋亡。它们的功能活性能通过合适的分析方法，例如通过结合分析或通过凋亡分析分析其促凋亡活性而测试。优选地，用作本发明转运蛋白货物结合分子的组分(B)的氨基酸序列可包括选自Bid、Bad、Noxa、Puma、Bim、Bik、Bmf、DP5/Hrk和Bok的至少一个部分或全长BH3-结构域序列和/或至少一个部分或全长唯BH3蛋白序列或由之组成。可选地，用作本发明转运蛋白货物结合分子的组分(B)的氨基酸序列可以包括至少一个部分或全长BH3-结构域序列和/或至少一个部分或全长唯BH3蛋白序列的组合或由之组成，该组合优选地选自：例如Bid和Bad、Bim和Bad、Bik和Bad、Puma和Bad、Noxa和Bad、Bmf和Bad、DP5/Hrk和Bad、Bok和Bad、Bik和Bim、Bik和Bid、Bik和Puma、Bik和Noxa、Bik和Bmf、Bik和DP5/Hrk、Bik和Bok、Bid和Puma、Bid和Noxa、Bid和Bim、Bid和Bmf、Bid和DP5/Hrk、Bid和Bok、Bim和Noxa、Bim和Puma、Bim和Bmf、Bim和DP5/Hrk、Bim和Bok、Puma和Noxa、Puma和Bmf、Puma和DP5/Hrk、Puma和Bok、Noxa和Bmf、Noxa和DP5/Hrk和Noxa和Bok。以上定义的(全长或部分)BH3-序列或唯BH3蛋白序列可以选自例如任意哺乳动物唯BH3蛋白，尤其是选自人同种型。因此，本发明转运蛋白货物结合分子的组分(B)可以包括如由SEQ ID NOs：221至237任意一个所定义的至少一个部分或全长BH3-结构域序列和/或至少一个唯BH3蛋白序列(参见表5)或由之组成。优选地，用作本发明转运蛋白货物结合分子的组分(B)的氨基酸序列可以进一步包括如由SEQ ID NOs：221至237任意一个所定义的至少一个部分或全长BH3-结构域序列和/或至少一个唯BH3蛋白序列的至少一个片段或变体或由之组成。这样的片段以及变体优选地具有小于50、优选具有小于40，而甚至更优选具有小于30个氨基酸的序列长度，或显示与以上所描述的或显示于任意SEQ ID NOs：221至237的序列之一约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％的序列同源性或同一性。在该上下文中，如上定义的片段和变体的定义相似地应用于本发明转运蛋白货物结合分子的组分(A)。此外，天然序列的片段或变体通常包括BH3-结构域序列或至少部分地包括BH3-结构域序列(BH3-结构域序列的至少7个氨基酸)。
表5
Figure BPA00001390404200431
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如上所述的，例如治疗活性蛋白、抗原、抗体、凋亡因子、病理状态中牵涉的蛋白酶——优选为肽蛋白酶抑制剂、BH3结构域等的蛋白质或肽序列——其被用作本发明的转运蛋白货物结合分子组分(B)的效应分子，可以作为处于由L-氨基酸组成的天然形式或处于由D氨基酸组成的逆反D-形式(完全地)的蛋白质或(多)肽序列被提供，这意味着这些序列必须通过回复末端而被倒转：天然C端是反向形式的N端，而天然N端是反向形式的C端)。可选地，如上所述的这些蛋白质或肽序列可以提供作为L-氨基酸和D-氨基酸的混合物的其蛋白或肽序列。
适合作为本发明的转运蛋白货物结合分子组分(B)的效应分子另外可以选自核酸，优选地选自编码以上定义的蛋白质或肽，如治疗活性蛋白和肽、抗原、抗体、凋亡因子、病理状态中牵涉的蛋白酶——优选为肽蛋白酶抑制剂、BH3-结构域或部分或全长唯BH3蛋白或其片段的变体的核酸。在该上下文中，核酸优选地包括单链、双链或部分双链核酸，优选地选自基因组DNA、cDNA、RNA、siRNA、反义DNA、反义RNA、核酶、具有或没有表达元件的互补RNA/DNA序列、小基因、基因片段、调控元件、启动子和其组合。
作为另外的具体的例子，适合作为本发明的转运蛋白货物结合分子组分(B)的效应分子可以选自siRNAs。在该上下文中，siRNAs被关注尤其是与RNA干扰现象有关。在免疫学研究过程中集中关注RNA干扰现象。近年来，已发现了基于RNA的防御机制，其同时存在于真菌界及植物和动物界中并充当“基因组的免疫***”。在可能鉴定该过程的潜在机制是相同的：在植物中RNA介导的病毒抗性、植物中的PTGS(转录后基因沉默)和真核生物中的RNA干扰因此基于共同的程序之前，该体系最初在相互独立的各个物种中——首先在线虫(C.elegans)中描述。RNA干扰(RNAi)的体外技术是基于双链RNA分子(dsRNA)，其触发基因表达的序列特异性抑制(Zamore(2001)Nat.Struct.Biol.9：746-750；Sharp(2001)Genes Dev.5：485-490：Hannon (2002)Nature 41：244-251)。在用长dsRNA转染哺乳动物细胞的过程中，蛋白激酶R和核糖核酸酶L的活化产生非特异效果，如例如，干扰素反应(Stark et al.(1998)Annu.Rev.Biochem.67：227-264；He and Katze(2002)Viral Immunol.15：95-119)。当使用较短的，例如21-至23-mer，所谓的siRNA(小干扰RNA)时，这些非特异的效果被避免，因为非特异的效果不被短于30bp的siRNA触发(Elbashir et al.(2001)Nature 411：494-498)。最近，dsRNA分子也已在体内使用(McCaffrey et al.(2002)，Nature 418：38-39；Xia et al.(2002)，Nature Biotech.20：1006-1010；Brummelkamp et al.(2002)，Cancer Cell2：243-247)。因此，用作适合作为本发明转运蛋白货物结合分子的组分(B)的效应分子的siRNA通常包括(单链或)双链，优选为双链RNA序列，具有约8至30个核苷酸，优选为17至25个核苷酸，甚至更优选为20至25个核苷酸，而最优选为21至23个核苷酸。原则上，具有长度为17至29、优选为19至25、最优选为21至23个碱基对的所有区段可以作为siRNA的靶序列，所述区段出现在如上所提到的蛋白(序列)的编码区。同样，siRNAs也能直接针对本文之前所述的蛋白质(序列)的核苷酸序列，所述序列不位于编码区——例如尤其在RNA的5′非编码区内，因而，针对具有调控功能的RNA的非编码区。因而，siRNA的靶序列可以位于RNA的翻译和/或非翻译区和/或位于控制元件区。siRNA的靶序列还可以位于非翻译和翻译序列的重叠区；尤其地，靶序列能包括编码区起始三联体上游的至少一个核苷酸。
作为另外的具体的例子，适合作为本发明的转运蛋白货物结合分子组分(B)的效应分子可以选自反义RNA。在该上下文中，反义RNA优选地是在(基因组)DNA的编码链而不是模板链的基础上转录的(单链)RNA分子，为此，它与正义(信使)RNA互补。适合作为本发明转运蛋白货物结合分子的组分(B)的反义RNA通常在正义和反义RNA分子之间形成双链体，并因此能阻断相应mRNA的翻译。如果由此减低/抑制编码的蛋白质或肽的翻译，本文所用的反义RNA能直接针对mRNA序列的任何部分，该mRNA序列例如衍生自基因组DNA和/或其可以编码任何蛋白质，例如本文所定义的蛋白质肽，如本文之前所述的治疗活性蛋白和肽、抗原、抗体、凋亡因子、病理状态中牵涉的蛋白酶——优选为肽蛋白酶抑制剂、BH3-结构域或部分或全长唯BH3蛋白或其片段的变体。因此，反义RNA在靶mRNA(或靶向(基因组)DNA)上的靶序列可以位于mRNA(或靶向(基因组)DNA)的翻译和/或非翻译区，例如位于控制元件区，尤其是位于发挥调控功能的mRNA(或靶向(基因组)DNA)的5′非编码区。反义RNA在靶mRNA(或靶向(基因组)DNA)上的靶序列还可被构建，这样反义RNA通过用其序列覆盖与靶mRNA(或靶向(基因组)DNA)的非翻译和翻译(编码)序列部分互补的区域而结合mRNA(或靶向(基因组)DNA)；尤其地，反义RNA可通过靶mRNA编码区的起始三联体上游的至少一个核苷酸与靶mRNA(或靶向(基因组)DNA)序列互补。优选地，本文所用的反义RNA包括约5至约5000、约500至约5000，而且，更优选地，约1000至约5000或可选地约5至约1000、约5至约500、约5至约250、约5至约100、约5至约50或约5至约30个核苷酸长度，或者可选地，以及甚至更优选地约20至约100、约20至约80或约20至约60个核苷酸长度。
作为另外的具体的例子，适合作为本发明的转运蛋白货物结合分子组分(B)的效应分子另外可以选自适于作为化学疗法药物的细胞毒性药物或抗肿瘤药物。一般而言，基于其作用机制，适于本发明的转运蛋白货物结合分子组分(B)的化学疗法药物可以被分成三个主要类型。它们可以(a)阻止前DNA分子构件的合成：这些药剂以许多不同的方式起作用。DNA构件是叶酸、杂环碱和核苷酸，它们是细胞内天然产生的。所有这些药剂起作用，以阻断核苷酸或脱氧核糖核苷酸(对制备DNA是必需的)制备中的一些步骤。当这些步骤被阻断时，DNA和RNA的构件——核苷酸不能被合成。因此，由于不能在没有核苷酸的情况下制备DNA，细胞不能复制。该类药物的例子包括甲氨蝶呤(Abitrexate
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)、氟尿嘧啶(Adrucil
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)、羟基脲(Hydrea
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)和巯基嘌呤(Purinethol
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)、硫鸟嘌呤、tocoferol，或更通常地，还有任意核苷酸类似物，例如2’-脱氧胞苷类似物。可选地，化学疗法药物可以(b)直接损伤细胞核中的DNA。这些药剂以化学方法损伤DNA和RNA。它们使DNA的复制中断，并使复制完全终止或引起无义DNA或RNA(即新的DNA或RNA不能编码任何有用物)的制造。该类药物的例子包括属于蒽环类抗生素抗肿瘤药剂(其成员可用作本发明转运蛋白货物结合分子的组分(B))的顺铂(Platinol
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)和抗生素-柔红霉素(Cerubidine
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)、多柔比星(Adriamycin)，和表鬼臼毒吡喃葡糖苷(VePesid
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)或任何嵌入剂。最后，化学疗法药物可以(c)导致有丝***纺锤体的合成或崩解。当细胞开始将其***成两个新细胞时，有丝***纺锤体充当细胞中具有“北极和南极”的分子铁路。这些纺锤体非常重要，因为它们有助于***新拷贝的DNA，这样在细胞***期间一个拷贝到达两个新细胞中的每一个。这些药剂使这些纺锤体的形成中断，并因此中断细胞***。有丝***破坏剂的该类的药物的例子包括：长春碱(Velban
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)、长春新碱(Oncovin)和紫杉醇(Taxol
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)。本发明转运蛋白货物结合分子的组分(B)可以根据以上作用方式之一起作用。换言之，每类抗肿瘤药物，即烷化剂、亚硝基脲、抗代谢药、植物生物碱、抗肿瘤抗生素和类固醇激素可以被用作本发明转运蛋白货物结合分子的组分(B)。为了更详细地描述这些药物种类，强调的是每个抗癌药物还可根据如上所公开的其对细胞周期和细胞化学的影响而分类。烷化剂通过直接侵袭DNA而杀死细胞。烷化剂可以被用于治疗慢性白血病、霍奇金病、淋巴瘤以及肺、***、***和卵巢的某些癌症。环磷酰胺是通常使用的烷化剂的一个例子。亚硝基尿与烷化剂相似地作用，并也抑制对DNA修复必需的改变。这些药剂跨过血脑屏障，并因此被用于治疗脑瘤、淋巴瘤、多发性骨髓瘤和恶性黑色素瘤。卡莫司汀和洛莫司汀是该类中的主要药物。抗代谢药物是通过干扰某些活动，通常是DNA合成而阻断细胞生长的药物。一旦被细胞摄取，它们使正常的发育和繁殖停止。该类中的所有药物在细胞周期的“S”期影响细胞。抗代谢药可以被用于治疗急性和慢性白血病、绒毛膜癌以及胃肠道、***和卵巢的一些肿瘤。通常使用的抗代谢药的例子是6-巯基嘌呤和5-氟尿嘧啶(5FU)。抗肿瘤抗生素是不同组的化合物。一般而言，它们通过与DNA结合并阻止RNA合成而起作用。这些药剂被广泛地用于治疗各种癌症。该组中最常使用的药物是多柔比星(Adriamycin)、丝裂霉素-C和博来霉素。植物(长春花)生物碱是来自植物的抗肿瘤剂。这些药物通过有丝***期间阻断细胞***而特异地起作用。它们通常被用于治疗急性成淋巴细胞白血病、霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、成神经细胞瘤、维尔姆斯氏肿瘤以及肺、***和睾丸的癌症。长春新碱和长春碱是该类中通常使用的药剂。类固醇激素在治疗一些类型的肿瘤中有用。该类包括肾上腺皮质类固醇、***、***对抗剂、***和雄激素。尽管它们的特定作用机制不清楚，但是类固醇激素改变某些激素依赖癌症的发展。他莫昔芬是一个例子，其被用于雌激雌依赖性乳癌。以上提到的所有肿瘤种类可以通过本发明的转运蛋白货物结合分子治疗，所述分子包括作为组分(B)的任何上述的抗肿瘤剂。
可以被用作本发明转运蛋白货物结合分子的组分(B)的效应分子的一组细胞毒性药物或抗肿瘤药物优选地选自：烷化药物、抗代谢药(antimetabolica)、细胞抑制剂或与激素治疗有关的药物。在该上下文中，优选选择金属——尤其是铂(衍生物)和紫杉醇类作为细胞毒性药物或抗肿瘤药物化合物。尤其地，药物部分选自例如顺式铂氨、反式铂、沙铂、奥沙利铂(oxaliplatin)、卡铂、奈达铂(nedaplatin)、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、苯丙氨酸氮芥(mephalan)、硫唑嘌呤(azathioprin)、氟尿嘧啶、(6)-巯基嘌呤、methrexate、南诺龙、aminogluthemide、甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、甲基苄肼、多西紫杉醇、紫杉醇、伊立替康、表鬼臼毒素、鬼臼毒素、长春新碱、长春碱、多西紫杉醇、道诺霉素、柔红霉素、多柔比星、米托蒽醌、托泊替坎(topotecan)、博来霉素、吉西他滨、氟达拉滨、诺维本(navelbine)和5-FUDR。尤其优选的是含有金属的抗癌药类，例如铂化合物类。
可以被用作本发明转运蛋白货物结合分子的组分(B)的效应分子的另外的细胞毒性药物或抗肿瘤药物是(通过其通用名称识别)：阿利维A酸(Alitretinoin)、六甲蜜胺、硫唑嘌呤、比卡鲁胺(Bicalutamide)、白消安、卡培他滨、环磷酰胺、依西美坦(Exemestane)、来曲唑(Letrozole)、非那雄胺(Finasteride)、醋酸甲地孕酮、曲普瑞林(Triptorelin)、替莫唑胺(Temozolomide)、米非司酮、维甲酸、欧乐(Oral)、他莫昔芬、替尼泊苷(Teniposide)、伊马替尼(Imatinib)(Gleevec
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)、吉非替尼(Gefitinib)(IRESSA)、硫酸培洛霉素或喜树碱类。
可用作本发明的转运蛋白货物结合分子组分(B)的效应分子的另一组细胞毒或抗肿瘤药是吲哚并咔唑化合物，例如十字孢碱(及其类似物)和雷别卡霉素(rebeccamycin)。即将提到的是，属于苯胺奎哪唑啉(anilinoquinazolines)(例如吉非替尼(gefitinib))类的化合物也是特别优选地作为组分(B)。
可以被用作本发明转运蛋白货物结合分子的组分(B)的效应分子的另外的一组细胞毒性药物或抗肿瘤药物可另外选自：拓扑异构酶抑制剂，如伊立替康或有丝***驱动蛋白或DHFR。
另外，可以用作本发明转运蛋白货物结合分子的组分(B)的效应分子的细胞毒性药物或抗肿瘤药物可以选自抑制或刺激细胞增殖(PDGF)、细胞内途径，例如RAS/RAF信号转导途径的因子，如RAF/MEK/ERK信号转导途径(例如RAF-1)或促***原活化蛋白激酶途径的成员，CMGC激酶家族(含有CDK(细胞周期蛋白依赖激酶)、MAPK、GSK3、CLK)，属于AGC激酶家族的Ser/Thr激酶，其包含PKA、PKG、PKC激酶家族、例如新血管形成和肿瘤进展中涉及的受体酪氨酸激酶，包括血管内皮生长因子受体(VEGFR)-2、VEGFR-3、血小板衍生的生长因子受体β、Flt-3，包括ET-1、ET-2、ET-3和ETA受体(ETAR)以及ETBR的内皮素(ET)***，和通过例如抑制其功能而被靶向的c-KIT，以及IGF家族的成员，如IGF-1、IGF-2、IGF-1R、IGF2R等。
可以用作本发明转运蛋白货物结合分子的组分(B)的效应分子的另一组细胞毒性药物或抗肿瘤药物可以选自靶向肿瘤细胞增殖和肿瘤血管发生的抑制剂。在该上下文中尤其优选的是小分子抗肿瘤激酶抑制剂，其针对恶性细胞和/或具有抗血管生成活性的血管细胞上的靶标。激酶抑制剂如那些针对EGFR、Her2/neu、BCR-ABL、c-KIT、PKC、Raf和PI3的激酶抑制剂是抗血管的生成，这是由于通过受累的恶性细胞阻断血管生成因子的分泌。通过对血管细胞的作用，激酶抑制剂如那些针对VEGFR2、VEGFR1、PDGFR、PKC、Raf和PI3的激酶抑制剂是抗血管生成的。细胞周期蛋白依赖激酶(CDKIs)的合成抑制剂的例子是例如奥罗莫星(olomoucine)、夫拉平度(flavopiridol)、丁内酯及其衍生物，并因而抑制肿瘤细胞增殖。另一方面，适合作为本发明转运蛋白货物结合分子的组分(B)的抗肿瘤化合物可以选自癌细胞中凋亡程序的活化剂(例如十字孢碱)或通过下调抗凋亡蛋白例如Bcl-2而选择。
对于以上所有化合物共同的是，为了充当抗癌药物，它们必须跨过细胞膜。通过将作为组分(B)的属于这些类中每一个的化合物(化合物，其直接损伤细胞核中的DNA、影响有丝***纺锤体的合成或裂解或使前DNA分子构件的合成停止)与组分(A)偶联，以形成本发明的转运蛋白货物结合物分子，抗癌化合物向细胞的进入被增强和/或它们的溶解度被增强，由此增强这些治疗化合物的功效。反过来，增加的细胞摄取，以及优选地，这些化合物在含水环境(例如细胞溶胶)中较好的溶解度，允许降低治疗性抗癌化合物的剂量。
另外，本发明的转运蛋白货物结合物分子组分(B)还可以包括小的有机化合物或药物分子，如蛋白酶抑制剂，其抑制蛋白酶，尤其是感染原的感染周期中涉及的蛋白酶，例如病毒、细菌或原生动物蛋白酶。在优选的实施方式中，作为发明的结合物分子一部分的这些蛋白酶抑制剂(有机化合物或药物分子)可用于治疗病毒、细菌感染或原生动物感染，例如疟疾。尤其地，病毒感染可由蛋白酶抑制剂治疗，例如反转录病毒病。包括蛋白酶抑制剂的结合物分子的用途强烈优选地用于HIV感染的治疗。即将被用于与本文所公开的载体序列偶联的蛋白酶抑制剂可以选自包含以下集合：640385、硫酸阿巴卡韦(abacavir sulfate)、AG1776、氨普那韦(amprenavir)(141W94或VX-478)、阿扎那韦(atazanavir)(BMS-232632)、组织蛋白酶S蛋白酶抑制剂、D1927、D9120、依法韦仑(efavirenz)、恩曲他滨(emtricitabine)、恩夫韦肽(enfuvirtide)(T-20)、fosamprenavir(GW-433908或VX-175)、GS 9005、GW640385(VX-385)、HCV蛋白酶抑制剂、呋山那韦(indinavir)(MK-639)、L-756、423、levoprin-ZG、洛匹那韦(lopinavir)(ABT-378)、洛匹那韦/利托那韦(ritonavir)(LPV ABT-378/r)、MK-944A、莫折那韦(mozenavir)(DMP450)、奈非那韦(nelfinavir)(AG-1343)、奈韦拉平(nevirapine)、P-1946、PL-100、普啉司他(prinomastat)、利托那韦(ritonavir)(ABT-538)、RO033-4649、TMC114、沙奎那韦(saquinavir)(Ro-31-8959)、富马酸替诺福韦酯(tenofovir disoproxilfumarate)、替拉那韦(tipranavir)(PNU-140690)、TLK 19781、TMC-114、Vertex 385、VX-950。
最后，适合作为本发明转运蛋白货物结合物分子组分(B)的效应分子可以作为单独的组分另外选自如上定义的针对本发明的转运蛋白货物结合物分子的标记。这样的发明的转运蛋白货物结合物分子尤其适于体外或体内分析。在该上下文中，标记可以包括放射性标记，即放射性磷酸化或带有硫、氢、碳、氮等的放射性标记；有色染料(例如地高辛配基等)；荧光基团(例如荧光素、罗丹明、如以下所定义的荧光染料蛋白等)；化学发光基团；或这些标记的组合。优选地，荧光染料蛋白包括任意荧光染料蛋白，其能被激活，以发出荧光信号。更优选地，荧光染料蛋白选自任意荧光染料蛋白，例如选自包含以下的集合：绿色荧光蛋白(GFP)、绿色荧光蛋白(GFP)的衍生物，例如EGFP、AcGFP、TurboGFP、祖母绿、Azami Green、光激活GFP(PA-GFP)，或包括EBFP、蓝宝石、T-蓝宝石在内的蓝色荧光蛋白(BFP)，或包括增强的青色荧光蛋白(ECFP)、mCFP、Cerulan、CyPet在内的青色荧光蛋白(CFP)，或黄色荧光蛋白(YFP)——包括Topaz、Venus、mCitrine、Ypet、PhiYFP、mBanana，黄移型荧光蛋白(yellowshifted green fluorescent protein)(黄色GFP)、增强的黄色荧光蛋白(EYFP)，或橙色和红色荧光蛋白(RFP)——包括Kusibara Orange、mOrange、dTomato-Tandem、DsRed-单体、mTangerine、mStrawberry、单体红色荧光蛋白(mRFP1)(本文也指定为mRFP)、mCherry、mRaspberry、HcRed-Tandem、mPlum、以及选自PA-GFP、CoralHue Dronpa(G)、PS-CFP(C)、PS-CFP(G)、mEosFP(G)、mEosFP(G)的光学荧光笔(opticalhighlighters)，或其他单体荧光蛋白如或引火荧光蛋白(KFP1)、水母素、自体荧光蛋白(autofluorescent proteins)(AFPs)、或荧光蛋白JRed、TurboGFP、PhiYFP和PhiYFP-m、tHc-Red(HcRed-Tandem)、PS-CFP2和KFP-Red(可从EVRΩGEN获得，也参见www.evrogen.com)，或其他合适的荧光蛋白。
包括组分(A)和(B)的本发明的转运蛋白货物结合分子此外可包括至少一个任选的另外的组分(C)、(D)和/或(E)等，优选地不同于组分(B)。该至少一个任选的另外的部分可赋予本发明的融合蛋白另外的功能并可独立地选自组分(B)、(C)、(D)和/或(E)。
例如，本发明的转运蛋白货物结合分子的至少一个任选的另外的组分(C)、(D)和/或(E)等可以是如上面针对组分(B)所描述的任何效应分子。优选地，本发明的转运蛋白货物结合分子的至少一个任选的另外的组分(C)、(D)和/或(E)等与特别选择的本发明的转运蛋白货物结合分子组分(B)不同，即至少一个任选的另外的组分(C)、(D)和/或(E)等，优选地可独立地相互选自如上面所描述的不同的效应分子或它们的片段或变体。本发明的转运蛋白货物结合分子的至少一个任选的另外的组分(C)、(D)和/或(E)等此外可以是氨基酸、寡肽或多肽或(小的)有机化学化合物(organo-chemicalcompound)并能在合适的位置，例如，本发明的转运蛋白货物结合分子的N端、C端，连接到本发明的转运蛋白货物结合分子，或可在内偶联到氨基酸，例如氨基酸侧链，或偶联到核酸或组分(B)(或(A))的任何合适的位置。本发明的转运蛋白货物结合分子的至少一个任选的另外的组分(C)、(D)和/或(E)等还可以是这样的部分(例如HA、HSV-Tag、His6-Tag、FLAG-Tag)，其可使本发明的转运蛋白货物结合分子易于纯化和/或分离。必要时，针对纯化而需要的组分然后能在生产过程结束时从本发明的转运蛋白货物结合分子的其他组分中被除去(例如，通过蛋白酶剪切或本领域已知的其他方法)。
此外，本发明的转运蛋白货物结合分子的至少一个任选的另外的组分(C)、(D)和/或(E)等可以是信号序列或定位序列，其有效地引导本发明的转运蛋白货物结合分子到特定的细胞内靶定位，优选地没有丧失本发明的转运蛋白货物结合分子的增强的细胞透性性质。典型地，这样的信号序列或定位序列引导本发明的转运蛋白货物结合分子到特定的细胞区室，例如，内质网、线粒体、高尔基体、溶酶体囊泡等。示例性的信号序列或定位序列包括，但不限于，针对内质网的定位序列，诸如KDEL(SEQ IDNO：238)、DDEL(SEQ ID NO：239)、DEEL(SEQ ID NO：240)、QEDL(SEQ ID NO：241)、RDEL(SEQ ID NO：242)，针对定位进细胞核的序列，诸如PKKKRKV(SEQ IDNO：243)、PQKKIKS(SEQ ID NO：244)、QPKKP(SEQ ID NO：245)、RKKR(SEQ IDNO：246)，针对对核区域定位的序列，诸如RKKRRQRRRAHQ(SEQ ID NO：247)、RQARRNRRRRWRERQR(SEQ ID NO：248)、MPLTRRRPAASQALAPPTP(SEQ IDNO：249)，针对定位进内体区室(endodomal compartiment)的序列，诸如MDDQRDLISNNEQLP(SEQ ID NO：250)等。
相似地，本发明的转运蛋白货物结合分子的至少一个任选的另外的组分(C)、(D)和/或(E)等可以是信号序列或定位序列，其有效地引导发明的转运蛋白货物结合分子到特定的细胞类型，优选地没有丧失本发明的转运蛋白货物结合分子的增强的细胞透性性质。
本发明的转运蛋白货物结合分子此外可包括至少一个修饰，优选地在其末端，在C端或N端，或者两端。C端可以优选地由酰胺改性而修饰，其中N端可以由任意合适的NH2-保护基团修饰，诸如例如酰化，或者如以上针对L-氨基酸已经表明的任意另外的修饰。这样的修饰还包括如上面针对根据上面通式(I)的转运蛋白分子所定义的标记的引入。
最后，如上面所描述的本发明的转运蛋白货物结合分子的组分(B)、(C)、(D)和/或(E)以及可随意地用作互连这些组分的连接体，可包括蛋白或肽序列或由蛋白或肽序列组成。这样的蛋白或肽序列可由L-氨基酸、D-氨基酸或它们的组合组成，优选地如上面针对根据上面通式(I)或根据任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的本发明新型转运蛋白构建物所描述的。这样的D-和/或L-氨基酸可以区组(blockwise)、非区组或可选的方式被排列在组分(B)，(C)、(D)和/或(E)中。可选地，如上面针对根据上面通式(I)或根据任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的本发明新型转运蛋白构建物所描述的模式对于这些组分可重复。换言之，如上面所定义的通式(I)(SEQ ID NO：1)DILLLxDm(LLLyDn)a可被应用，其中如a所定义的重复数不限于0-3，但可被应用到整个分子，即a将是1至500、1至250、1至100、1至50、1至20、1至10、1至5或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等，优选地由将被覆盖的蛋白或肽序列的长度决定。
本发明的转运蛋白货物结合分子的组分(A)、(B)和，如果存在的话，另外的任选组分(C)、(D)和/或(E)等典型地通过共价键或通过静电结合(例如，聚-赖氨酸)，优选通过共价键而彼此偶联。在该上下文中，术语“共价键”涉及通过共享一对或更多对电子而产生的两个原子之间的稳定的化学连接。优选地，本发明的转运蛋白货物结合分子的所有的组分(A)和(B)和，如果存在的话，另外的任选组分(C)、(D)和/或(E)等可以被偶联，以形成线性分子或非线性(分支的)分子，优选地是线性分子。在线性分子中，所有以上组分(A)和(B)和，如果存在的话，任选的组分(C)、(D)和/或(E)等以线性形式通过其末端彼此连接，不产生分支的转运蛋白货物结合分子。在非线性(分支的)分子中，所有以上组分(A)和(B)和，如果存在的话，任选的组分(C)、(D)和/或(E)等以产生分支的转运蛋白货物结合分子——例如具有Y型形式等——的形式通过其末端彼此连接。
因为本发明的转运蛋白货物结合分子的组分(A)经定义为由D-和L-氨基酸组成肽序列，另外的组分(B)的(共价)结合，以及如果存在，任选组分(C)、(D)和/或(E)的(共价)结合当然会依赖于即将被结合的组分的类型和性质，即对于单一组分是否是蛋白质或肽、核酸、(小的)有机化合物等。
本发明转运蛋白货物结合分子的组分(B)，以及如果存在，另外的任选组分(C)、(D)和/或(E)与组分(A)连接并彼此连接以形成优选的线性分子的顺序，通常可以包括任意顺序。因此，任意组分(A)、(B)，以及如果存在，(C)、(D)和/或(E)可以彼此结合。然而，组分(A)优选地连接在本发明的转运蛋白货物结合分子的末端。如果任意组分(B)，以及如果存在，组分(C)、(D)和/或(E)是蛋白质或(多)肽序列，当作为肽或蛋白质出现时，组分(A)优选为包含于本发明的转运蛋白货物结合分子的C末端，例如，在如上定义的组分(B)，或者如果存在，组分(C)、(D)和/或(E)的C末端。组分(A)在本发明的转运蛋白货物结合分子中的这样的位置防止组分(B)、(C)、(D)和/或(E)的货物肽或蛋白质序列在它/它们转运至期望的靶部位例如细胞、核等之前被肽酶，尤其是羧肽酶如羧基末端肽酶N降解。可选地，如果使用的细胞***中存在氨基末端肽酶，组分(A)可以被定位于本发明的转运蛋白货物结合分子的氨基末端。
如果另外的组分(B)和/或，如果存在，任意任选的组分(C)、(D)和/或(E)是肽或蛋白质序列，本发明的转运蛋白货物结合分子的这些蛋白质或肽组分之间的连接典型地为肽键。利用涉及两种即将被连接的组分(一种组分的N末端和其它组分的C末端)的化学合成，可以形成这样的肽键，或者通过两种组分的整个肽序列的蛋白质合成，可以直接形成这样的肽键，其中两种(蛋白质或肽)组分优选为在一个步骤中合成。这样的蛋白质合成方法包括、但不限于：例如液相肽合成方法或固体肽合成方法，例如根据Merrifield的固体肽合成方法、t-Boc固相肽合成、Fmoc固相肽合成、基于BOP(苯并***-1-基-氧-三-(二甲氨基)-磷六氟磷酸盐)的固相肽合成等。
此外，本发明转运蛋白货物结合分子的组分(A)和组分(B)可以通过连接体被偶联，或者，如果即将被连接的组分具有反应性氨基或羧基，直接地通过，例如酰胺桥(没有连接体)偶联。可选地，酯或酯键合是优选的。
如果存在，如上提到的另外的组分(C)、(D)和/或(E)等可以以类似的方式与组分(A)和/或组分(B)偶联，或者任选的彼此偶联至然后作为单个部分与组分(A)或组分(B)连接。连接序列也可以被用于将发明的转运蛋白货物结合分子的组分与至少一种其它组分(参见以下)融合。将另外的组分(一种或多种)与本发明转运蛋白货物结合分子的组分(A)或组分(B)偶联的方式将依赖于其化学特性。如果另外的组分(C)、(D)和/或(E)等属于肽序列类，它们将优选通过组分(A)的任一末端与本发明的转运蛋白货物结合分子连接，或者可选地，通过组分(A)的L或D氨基酸侧链，例如通过二硫桥连接。具有其它化学性质的另外的组分可以同样地被连接至组分(A)(末端基团或化学活性侧链基团)或组分(B)。通过侧链的键合将优选的基于侧链氨基、硫羟或羟基例如，通过酰胺或酯或酯键。必须注意，根据本发明，所有氨基酸(组分(A)的任意的，并且，如果由氨基酸形成，组分(C)、(D)、(E)等)优选为D-对映体氨基酸，其通过以逆反顺序被连接而反映其最终的天然存在类似物。然而，如果由氨基酸组成，组分(C)、(D)、(E)等也可以由L-氨基酸(以其天然存在序列顺序)组成，或者由D和L氨基酸的组合形成。
如果使用肽连接序列融合组分(A)和(B)或将另一个组分，例如(C)与组分(A)和/或(B)融合，连接序列优选的形成2至10个残基，更优选1至5个残基的柔性序列(flexiblesequence)。在优选的实施方式中，连接序列包含至少20％，更优选至少40％，甚至更优选至少50％Gly或β-丙氨酸残基，例如GlyGlyGlyGlyGly(SEQ ID NO：255)、GlyGlyGlyGly(SEQ ID NO：256)、GlyGlyGly、CysGlyGly或GlyGlyCys等。适当的连接序列能易于被本领域的技术人员选择并制备。它们可以由D和/或L氨基酸组成。
肽连接序列也可以在本发明的转运蛋白货物结合分子的组分(A)和组分(B)，和/或另外的组分(C)、(D)和/或(E)之间引入，其中，氨基末端甲硫氨酸被加入到组分(A)和/或在蛋白质或肽序列组分(B)、(C)、(D)和/或(E)之前。
优选地，组分(A)和组分(B)通过化学偶联以本领域已知的任意合适的方式如交联方法而被连接。然而，应该注意这样的事实，即许多已知的化学交联方法是非特异的，即它们并不将偶联点指引到载体部分或货物部分上的任意特殊的部位。因此，非特异***联剂的使用可能侵袭功能位点或空间上阻断活性部位，使本发明的转运蛋白货物结合分子的融合的组分无生物学活性。通过使用适当的保护基团而阻断潜在的活性(reactice)基团，这涉及技术人员的知识。可选地，可以利用强大的和通用的肟和腙连接技术的使用——其是可以应用于组分(A)与组分(B)的交联的化学选择性实体。该连接技术由例如Rose等(1994)，JACS 116，30描述。如果存在，如上提到的另外的组分(C)、(D)、(E)等可以以类似的方式彼此化学偶联，或者与组分(A)和/或(B)化学偶联。
通过与在组分(A)中只发现一次或几次的管能团直接化学偶联能增加偶联特异性，组分(A)的管能团将与组分(B)的有机分子交联。举例来说，如果仅一个半胱氨酸残基存在于本发明的转运蛋白货物结合分子的组分(A)上，半胱氨酸硫羟基可以被使用。同样，例如如果结合分子组分(A)不含赖氨酸残基，对伯胺特异的交联剂对于组分(A)的氨基末端将是选择性的。可选地，也可以通过放置于肽N端的谷氨酸残基侧链实施交联，以便酰胺键可以通过其侧链产生。因此，将谷氨酸残基与本发明的转运蛋白货物结合分子的组分(A)的N端连接可以是有利的。然而，如果半胱氨酸残基将被引入组分(A)，在其N或C端或附近的引入是优选的。基于通过将一个或更多个额外的氨基酸例如尤其是半胱氨酸残基加入到易位序列，或通过置换包含于组分(A)中的易位序列(一个或多个)的至少一个残基而进行的组分(A)的修饰，针对这样的氨基酸序列改变的常规方法是可以获得的。如果半胱氨酸侧链被用于偶联目的，本发明的转运蛋白货物结合分子的组分(A)优选具有一个半胱氨酸残基。任意第二个半胱氨酸残基应该优选地被避免，并且，当它们出现在本发明的转运蛋白货物结合分子的组分(A)中时，最终能被替换。当半胱氨酸残基在将被用作组分(A)或组分(A)的一部分的原始易位序列中被替换时，通常要求最小化组分(A)肽折叠中产生的变化。当替换物与半胱氨酸在化学上和空间上相似时，组分(A)折叠中的变化被最小化。因此，丝氨酸优选为半胱氨酸的替换物。
通过包括标准肽合成偶联剂，如HOBt、HBTU、DICI、TBTU在内的偶联剂或结合试剂，可以完成本发明的转运蛋白货物结合分子的两种成分的偶联。有几种可以使用的分子间交联剂，例如参见Means and Feeney，Chemical Modification of Proteins，Holden-Day，1974，pp.39-43。其中这些试剂是，例如，N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫)丙酸酯(SPDP)或N，N′-(1，3-亚苯基)双马来酰亚胺；N，N′-乙烯-双(碘代乙酰胺)或别的具有6到11个碳亚甲基桥的这样的试剂；和1，5-二氟-2，4-二硝基苯。对此目的有用的其它交联剂包括：p，p′-二氟-m，m′-二硝基二苯砜；二甲基己二亚酰胺；苯酚-1，4二磺酰氯；六亚甲基二异氰酸，或二异硫氰酸盐，或苯偶氮基-对-二异氰酸盐；戊二醛和去重氮联苯胺。交联剂可以是双同官能团，即具有两个功能基团，它们经历相同的反应。优选的双同官能团交联剂是二马来酰亚胺基己烷(BMH)。BMH包括两个马来酰亚胺管能团，其在中性条件下(pH 6.5-7.7)特异地与含硫氢基的化合物起反应。该两个马来酰亚胺基团通过烃链连接在一起。因此，BMH对于含有半胱氨酸残基的蛋白质(或多肽)的不可逆交联是有用的。交联剂也可以是异双功能的。异双功能交联剂具有两个不同的管能团，例如胺反应基团和硫醇反应基团，其将各自交联具有自由胺和硫羟的两种蛋白质。异双功能交联剂的例子是琥珀酰亚胺基4-(N-甲基异马来酰亚胺)-环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、间马来酰亚胺苯甲酰N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、以及琥珀酰亚胺4-(对马来酰亚胺苯基)丁酸酯(SMPB)——MBS的延伸的链类似物。这些交联剂的琥珀酰亚胺基团与伯胺反应，并且硫醇反应性马来酰亚胺与半胱胺酸残基的硫醇形成共价键。因为交联剂在水中常常具有低溶解性，亲水的部分，如磺化基可以被加入到交联剂中，以提高其水溶解性。硫代-MBS和硫代-SMCC是水溶性被修改的交联剂的例子。许多交联剂产生结合物，其在细胞条件下本质上是不可***的。因此，一些交联剂包含共价键例如二硫化物，其在细胞条件下是可***的。例如，Traut′s试剂、二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP)、以及N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)都是熟知的可***的交联剂。可***交联剂的使用允许货物部分组分(B)、(C)、(D)和/或(E)在输送至靶细胞后与新型转运蛋白构建物组分(A)分开。为此，直接的二硫键也可以是有用的。化学交联也可以包括间隔臂(spacer arm)的使用。间隔臂提供分子内的柔性或调节结合部分之间的分子内距离，并因而可以帮助保持生物活性。间隔臂可以处于包括间隔氨基酸例如脯氨酸的蛋白质(或多肽)部分的形式。可选地，间隔臂可以是交联剂的一部分，如在“长链SPDP”中(Pierce Chem.Co.，Rockford，Ill.，cat.No.21651 H)。许多交联剂——包括以上讨论的交联剂是商业上可以获得的。对它们的用途的详细说明容易从其供应商获得。对于蛋白交联和结合物制备的一般参考文献是：Wong，Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking，CRCPress(1991)。
根据另一个优选的实施方式，如上面所定义的发明的转运蛋白货物结合分子可包括上面定义的发明的转运蛋白货物结合分子的至少一个变体和/或片段或由之组成。优选地，上面定义的发明的转运蛋白货物结合分子的变体和/或片段保持如上面所公开的本发明的转运蛋白货物结合分子的生物活性。这样的片段或变体的功能性可通过各种试验，例如转染效率、货物核酸编码的蛋白的正确表达，或通过生物物理学方法，例如光谱学、计算机模拟、结构分析等与上面针对根据通式(I)的本发明新型转运蛋白构建物所描述的相似的而检测。
更优选地，上面定义的发明的转运蛋白货物结合分子包括至少一个变体(和/或片段)或由之组成，特别地如果单一组分是蛋白或肽序列。在本发明的上下文中，上面定义的发明的转运蛋白货物结合分子的这样的变体(和/或片段)可与它们的天然序列，例如上面定义的发明的转运蛋白货物结合分子的片段或变体与其天然的转运蛋白货物结合分子序列，在天然的发明转运蛋白货物结合分子的全长上，具有至少70％、80％或85％，优选地至少90％，更优选地至少95％，最优选地至少99％的序列同源性。
上面定义的发明的转运蛋白货物结合分子的“片段”，特别是如果单一组分是蛋白或肽序列，优选地将被理解为其截短的序列，即上面定义的发明的转运蛋白货物结合分子的氨基酸序列，其与如上面所定义的天然的发明转运蛋白货物结合分子的氨基酸序列相比，N-端、C-端和/或序列内被截短。
上面定义的发明转运蛋白货物结合分子的“变体”优选地包括这样的序列，其中本发明的转运蛋白货物结合分子变体的氨基酸序列与上面定义的发明的转运蛋白货物结合分子的天然序列差异一个或更多个突变，诸如一个或更多个取代的(或者，必要时，***的和/或缺失的)氨基酸(或多个)。优选地，与如上面所定义的全长的天然转运蛋白货物结合分子相比，上面定义的发明的转运蛋白货物结合分子的变体具有相同的生物学功能或比活性。优选地，在上述含义中，变体可包括约1至100、1至50、1至20，优选地1至10，更优选地1至5、4、3、2或1个氨基酸改变。这样的改变可包括尤其是如上面所定义的氨基酸的修饰、如上面所定义的将标记引入到氨基酸、用任何本文提到的任何(修饰的或标记的)氨基酸置换氨基酸、氨基酸的缺失或***。如本文所定义的变体此外优选地包括保守的氨基酸置换，优选地诸如上面已经定义的。
根据第三个方面，本发明另外提供药物组合物，该药物组合物优选包括如上定义的本发明的转运蛋白货物结合分子，和任选的药学上可接受的载体和/或媒介物(赋形剂，vehicle)，或任何赋形剂(excipient)、缓冲液、稳定剂或本领域技术人员熟知的其它物质。
作为第一个成分，本发明的药物组合物包括如上面所定义的发明的转运蛋白货物结合分子，即发明的转运蛋白货物结合分子，包括作为组分(A)的根据上面的通式(I)或根据任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的本发明新型转运蛋白构建物，和作为组分(B)的效应分子，该效应分子选自蛋白或肽，诸如在治疗上有活性的蛋白和肽、蛋白激酶抑制剂——尤其是蛋白激酶c-Jun氨基末端激酶的抑制剂、抗原、抗体、凋亡因子、病理状态中牵涉的蛋白酶——优选为肽蛋白酶抑制剂、BH3-结构域唯BH3蛋白，或选自核酸、siRNAs，或选自细胞毒性剂、小的有机化合物等。任选地，如上面所定义的本发明的转运蛋白货物结合分子此外可含有另外的组分(C)、(D)和/或(E)等。
作为第二个成分，本发明的药物组合物可以包括或不包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。在本发明的上下文中，药学上可接受的载体通常包括本发明的药物组合物的液体或非液体基础成分(basis)。如果本发明的药物组合物以液体的形式被提供，载体通常会是不含致热源的水、等渗盐溶液或缓冲(水性)溶液，例如磷酸盐、柠檬酸盐等缓冲液。尤其对于本发明的药物组合物的注射剂，可以使用水，或者优选为缓冲液，更优选为水性缓冲液，其含有钠盐——优选为至少50mM的钠盐、钙盐——优选为至少0.01mM的钙盐和任选的钾盐——优选为至少3mM的钾盐。根据优选的实施方式，钠、钙和任选的钾盐可以以其卤化物，例如氯化物、碘化物或溴化物；以其氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐或硫酸盐等的形式出现。不受此限制，钠盐的例子包括，例如NaCl、NaI、NaBr、Na2CO3、NaHCO3、Na2SO4；任选的钾盐的例子包括，例如KCl、KI、KBr、K2CO3、KHCO3、K2SO4；以及钙盐的例子包括，例如CaCl2、CaI2、CaBr2、CaCO3、CaSO4、Ca(OH)2。此外，前述阳离子的有机阴离子可以被包含于缓冲液中。根据更优选的实施方式，适合用于如上定义的注射目的的缓冲液可以含有盐，其选自氯化钠(NaCl)、氯化钙(CaCl2)和任选的氯化钾(KCl)，其中，除了氯化物可以存在另外的阴离子。CaCl2也可以由另外的盐，像KCl，替代。通常，注射缓冲液中的盐以至少50mM氯化钠(NaCl)、至少3mM氯化钾(KCl)和至少0,01mM氯化钙(CaCl2)的浓度存在。通过参考特定的参考介质，注射缓冲液可以是高渗的、等渗的或低渗的，即通过参考特定的参考介质，缓冲液可以具有较高的、相同的或较低的盐浓度，其中优选地，前述盐的这样的浓度可以被使用，所述浓度由于其渗透性或其它浓度效应不会导致细胞损伤。参考介质是，例如以“体内”方式出现的液体，如血液、淋巴、细胞溶质液体或其它体液；或者例如液体，其可以以“体外”方式被用作参考介质，如普通缓冲液或液体。这样的普通缓冲液或液体为技术人员所熟知。尤其优选林格乳酸溶液作为液体基础成分。
然而，适于对即将被治疗的患者给药的一种或更多种相容固体或液态填料或稀释剂或封装化合物(encapsulating compound)也可以被用于本发明的药物组合物。此处使用的术语“相容的”意为本发明的药物组合物的这些成分能够以不发生相互作用的方式与如上定义的本发明的转运蛋白货物结合分子混合，所述相互作用在典型的使用条件下会充分降低本发明的药物组合物的药效。当然，药学上可接受的载体、填料和稀释剂必须具有足够高的纯度和足够低的毒性，以使其适于对即将被治疗的人给药。可以用作药学上可接受的载体、填料或其组分的一些化合物的例子是糖，如例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如例如玉米淀粉或马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、醋酸纤维素；粉末状西黄蓍胶；麦芽；明胶；动物脂；固体助流剂(glidant)，如例如，硬脂酸、硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如例如，花生油、棉籽油、麻油、橄榄油、玉米油和来自可可属(theobroma)的油；多元醇，如例如，聚丙二醇、甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；藻酸。
本发明的药物组合物可以口服给药、肠胃外给药、通过吸入喷雾给药、局部给药、直肠给药、鼻腔给药、口腔给药、***给药或通过植入型药盒(reservoir)给药。本文所用的术语“肠胃外”包括皮下的、静脉内的、肌肉的、关节内的、滑膜内的、胸骨内的、鞘内的、肝内的、损伤区的、颅内的、经皮的、真皮内的、肺内的(intrapulmonal)、腹腔内的、心内的、动脉内的和舌下的注射或输注技术。
优选地，本发明的药物组合物可以通过肠胃外注射被给予，更优选通过皮下的、静脉内的、肌肉的、关节内的、滑膜内的、胸骨内的、鞘内的、肝内的、损伤区内的、颅内的、经皮的、真皮内的、肺内的、腹腔内的、心内的、动脉内的和舌下的注射或输注技术被给予。本发明的药物组合物的无菌可注射形式可以是水性或油性悬浮液。利用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂，可以根据本领域已知的技术配制这些悬浮液。无菌可注射制备物也可以是无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如像1.3-丁二醇中的溶液一样。在可接受的赋形剂和溶剂中可以应用的是水、林格氏(Ringer′s)溶液和等渗的氯化钠溶液。此外，按照常规应用无菌、不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。为此，可以被应用的任意温和不挥发性油包括合成的单或双甘油酯。脂肪酸，如油酸和其甘油酯衍生物在制备注射剂中是有用的，天然药学可接受的油，如橄榄油或蓖麻油——尤其以其聚氧乙烯形式(version)一样有用。这些油溶液或悬浮液也可以包含长链醇稀释剂或分散剂，如羧甲基纤维素或相似的分散剂，其通常用于制备药学上可接受的剂型——包括乳剂和悬浮液。其它通常使用的表面活性剂，如吐温、斯盘类(Spans)和其它乳化剂或通常用于制备药学上可接受的固体、液体或其它剂型的生物利用度增强剂也可以被用于配制本发明的药物组合物的目的。
对于静脉内的、皮肤的或皮下注射，或者在痛苦部位的注射，活性成分将优选为肠胃外可接受的水性溶液的形式，所述溶液不含致热源并具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域的有关技术人员应该能够利用，例如等张赋形剂如氯化钠注射剂、林格氏注射剂、乳酸林格氏注射剂制备合适的溶液。如果需要，可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲液、抗氧化剂和/或其它添加剂。无论即将给予个体的是根据本发明的多肽、肽、或核酸分子、其它药学上有用的化合物，优选以“预防上有效量”或“治疗上有效量”给药(视情况)，这足以显示对个体的益处。实际的给药量、以及给药速率和时程将取决于正在治疗的性质和严重程度。
如上定义的本发明的药物组合物可以以任意口服可接受的剂型被口服给予，所述口服可接受的剂型包括、但不限于胶囊、片剂、水性悬浮液或溶液。在片剂用于口服用途的情况下，通常使用的载体包括乳糖和玉米淀粉。润滑剂，如硬脂酸镁通常也被加入。针对以胶囊形式的口服，有用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。在要求水性悬浮液用于口服用途时，活性成分，即如上定义的本发明的转运蛋白货物结合分子与乳化剂和悬浮剂结合。如果期望，某些甜味剂、调味剂或着色剂也可以被加入。
本发明的药物组合物也可以被局部给予，尤其在治疗目标包括通过局部施用易于到达的区域或器官，例如，包括皮肤疾病或任意其它可到达的上皮组织疾病。针对这些区域或器官易于制备合适的局部制剂。对于局部施用，本发明的药物组合物可以被配制成合适的膏剂，其含有本发明的免疫刺激组合物，尤其是如上定义的其组分悬浮或溶于一种或更多种载体中。用于局部给药的载体包括、但不限于矿物油、液状石蜡、白蜡、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。可选地，本发明的药物组合物可以被配制成合适的洗剂或乳剂。在本发明的上下文中，合适的的载体包括、但不限于矿物油、山梨糖醇酐单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蜡、十六-十八醇、2-辛基十二醇、苯甲醇和水。
在该上下文中，在使用以上药物组合物时，治疗的处方例如对剂量的决定等通常在一般从业者和其它医生的职责之内的，并通常考虑即将被治疗的病症、个体患者的病状、施用的部位、给药方法和从业者已知的其它因素。以上所提到的技术和方案的例子可以在REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，16th edition，Osol，A.(ed)，1980中找到。因此，本发明的药物组合物通常包括“安全和有效量”的如上定义的本发明的药物组合物的组分，尤其是本发明的转运蛋白货物结合分子物的组分。本文所用的，“安全和有效量”意为如上定义的本发明的转运蛋白货物结合分子的量，其足以显著地诱导本文所定义的疾病或病症的积极修正。然而同时，“安全和有效量”足够少，以避免严重的副作用，也就是说，以允许优势和风险之间的合理关系。这些界限的确定通常位于合理的医学判断范围内。在随医医生的知识和经验内，如上定义的本发明的药物组合物的组分、尤其是本发明的转运蛋白货物结合分子的组分的“安全和有效量”将进一步针对即将被治疗的特殊病状，并也针对即将被治疗的患者的年龄和生理状况、体重、总体健康、性别、饮食、给药时间、***速率、药物组合、如上定义的本发明的转运蛋白货物结合分子的特殊组分(A)、(B)、(C)、(D)和/或(E)的活性、病状的严重性、治疗持续时间、伴随疗法的性质、使用的药学上可接受的载体的性质和相似的因素而变化。本发明的药物组合物作为一般的药物组合物或作为疫苗可以被用于人，并且同样用于兽医学目的，优选用于人类医学目的。
根据特定的实施方式，例如如果本发明转运蛋白货物结合分子的组分(B)是适于引起免疫反应的治疗活性蛋白质如(蛋白质或肽)抗原或抗原片段或如上所述的任意分子，本发明的药物组合物可以被提供作为疫苗。这样的发明的疫苗通常由像本发明的药物组合物组成，并优选地支持即将被治疗的患者的免疫***的先天性和/或适应性免疫应答，这取决于于如上定义的本发明的转运蛋白货物结合分子的组分(B)、(C)、(D)和/或(E)的性质。举例来说，如果任意这些组分提供或编码(蛋白质或肽)抗原或抗原片段，疫苗通常会在即将被治疗的患者中导致适应性免疫应答。同样地，任意上面所定义的本发明的转运蛋白货物结合分子的另外的组分(B)、(C)、(D)和/或(E)等可以导致先天性和/或适应性免疫应答。
本发明的疫苗也可以包括药学上可接受的载体、佐剂和/或如上针对本发明的药物组合物定义的赋形剂。在本发明的疫苗的特定上下文中，药学上可接受的载体的选择原则上通过本发明的疫苗被给予的方式而确定。本发明的疫苗可以通过，例如全身或局部给予。一般全身给药的途径包括，例如经皮途径、口服途径、肠胃外途径——包括皮下注射、静脉内注射、肌肉注射、动脉内注射、真皮内注射和腹腔内注射和/或鼻腔给药途径。一般局部(local)给药的途径包括，例如局部(topical)给药途径但也有真皮内注射、经皮注射、皮下注射或肌肉注射或者损伤区内注射、颅内注射、肺内注射、心内注射和舌下注射。更优选地，疫苗可以通过真皮内、皮下或肌肉内途径被给予。因而优选发明的疫苗制成液体(或有时候以固体)形式。可以通过用动物模型进行的常规试验确定即将被给予的本发明疫苗的合适的量。这样的模型包括兔、羊、小鼠、大鼠、狗和非人类灵长类动物模型而不包含任何限制。注射剂的优选单位剂型包括水、生理盐水或其混合物的无菌溶液。这样的溶液的pH应该被调至约7.4。注射的合适的载体包括水凝胶、控制或延迟释放的设备、聚乳酸和胶原基质。用于局部施用的合适的药学上可接受的载体包括那些适合用于洗剂、乳剂、凝胶和类似物的载体。如果本发明的疫苗即将通过口服给予，则片剂、胶囊及类似物是优选的单位剂型。用于制备可以用于口服给药的单位剂型的药学上可接受的载体是现有技术中所熟知的。其选择将依赖于次要考虑，如味道、成本和耐储性，这些对本发明的目的不是关键的，并可以由本领域的技术人员不费力的进行选择。
为了进一步增加其免疫原性，本发明的疫苗可以另外包含一种或更多种辅助物质。因而优选实现如上定义的本发明的转运蛋白货物结合分子和可以任选地包含于如上所述的本发明的疫苗中的辅助物质的增效作用。根据各种类型的辅助物质，在这方面可以考虑各种机制。例如，允许树突细胞(DCs)成熟的化合物，例如脂多糖、TNF-α或CD40配体，形成第一类合适的辅助物质。一般，有可能使用以“危险信号”(LPS、GP96等)方式影响免疫***的任意药剂，或者允许根据本发明由免疫刺激佐剂产生的免疫应答以靶向方式被增强和/或影响的细胞因子如GM-CFS，作为辅助物质。尤其优选的辅助物质是细胞因子，如单核因子、淋巴因子、白细胞介素或趋化因子，其进一步促进先天性免疫应答，如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、INF-α、IFN-β、INF-γ、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、LT-β或TNF-α，生长因子，如hGH。
可以包含于发明的疫苗中的另外的添加剂是乳化剂如例如吐温(Tween
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)、润湿剂如例如十二烷基硫酸钠；着色剂；给味剂(taste-imparting agent)；药物载体；片剂形成剂；稳定剂；抗氧化剂；防腐剂。
本发明的疫苗还可以另外包含另外的化合物，已知所述化合物是免疫刺激的，这是由于其对人Toll样受体TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10的亲合力(作为配体)，或者由于其对鼠科动物Toll样受体TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12或TLR13的亲合力(作为配体)。
在该上下文中，可以被加入到发明的疫苗中的另一类化合物可以是CpG核酸，尤其是CpG-RNA或CpG-DNA。CpG-RNA或CpG-DNA可以是单链CpG-DNA(ssCpG-DNA)、双链CpG-DNA(dsDNA)、单链CpG-RNA(ss CpG-RNA)或双链CpG-RNA(ds CpG-RNA)。CpG核酸优选以CpG-RNA的形式，更优选以单链CpG-RNA(ssCpG-RNA)的形式。CpG核酸优选地包含一条或更多条(促有丝***的)胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸序列(一条或多条)(CpG基序(一个或多个))。根据第一个优选的选项，至少一个CpG基序包含于这些序列中，也就是说CpG基序的C(胞嘧啶)和G(鸟嘌呤)未甲基化。所有任选地包含于这些序列中的另外的胞嘧啶或鸟嘌呤可以被甲基化或未甲基化。然而，根据进一步优选的选项，CpG基序的C(胞嘧啶)和G(鸟嘌呤)也可以以甲基化形式存在。
根据本发明的第四个的方面，如上定义的本发明的转运蛋白货物结合分子可以(用于制备本文所定义的药物组合物或疫苗，优选为两者)用于任何本文所定义的疾病和病症的预防、治疗和/或改善，优选地用于癌症或肿瘤疾病——包括由缺陷型凋亡引起的疾病、炎性疾病、感染疾病、病毒(感染)疾病、与JNK信号传导密切相关的疾病、自身免疫性病症或疾病、心血管疾病、神经元或神经变性疾病、肝病、脊柱疾病、子宫疾病、重度抑郁症、非慢性或慢性炎性消化病和听力丧失或内耳疾病的预防、治疗和/或改善。通过治疗即将被移植的器官/组织/细胞或通过治疗器官/组织/细胞的接受者，例如以防止白细胞免于初始移植排斥为目的，本发明的转运蛋白货物结合分子也可(用于制备药物组合物)用于在组织移植中使用。
本文所述的预防、治疗和/或改善疾病通常包括给予如上所定义的药物组合物。术语“预防”通常涉及防止患者中本文所定义的疾病，优选地在疾病在患者中表现之前。术语“治疗”一般指在患者中本文所定义的疾病的任何治疗，其中该疾病可能已经被诊断或将被预防，即在疾病在患者中表现之前、之时和之后。使用的术语“治疗”，例如在术语“治疗病状”中，还优选地表示至少给予治疗有效量的治疗化合物，以引起治疗效果。它不一定意味着“治愈”，而是对具有这样病状的活体给药时，对病状优选地至少具有一些最小的生理效应。例如，治疗可以包括给予药剂，而该药剂的存在导致接受动物中生理的变化。最后，术语“改善”优选地包括对本文所定义的疾病的任意修正，优选为对本文所定义的疾病的积极修正。特定的修正依赖于即将被治疗的疾病。
根据一个方法，利用如上定义的药物组合物的给药途径，如上定义的发明的药物组合物、疫苗或发明的转运蛋白货物结合分子可以被直接给予患者。可选地，利用离体方法，例如通过将如上定义的药物组合物、疫苗或本发明的转运蛋白货物结合分子引入细胞，优选为自体同源细胞，即起源于即将被治疗的患者的细胞，并将这些细胞移植到即将被治疗的患者的部位，任选地在储存些细胞和/或在治疗前培养这些细胞之后，如上定义的药物组合物、疫苗或发明的转运蛋白货物结合分子可以被给予患者。
根据一个优选实施方式，如上定义的本发明的转运蛋白货物结合分子、本发明的药物组合物或本发明的疫苗可以被用于(制备药物用于)预防、治疗和/或改善例如癌或肿瘤疾病——包括由缺陷型凋亡引起的疾病，优选地选自听神经细胞瘤、***癌、星细胞瘤、基底细胞癌(basalioma)、贝切特氏综合征、膀胱癌、胚细胞瘤、骨癌、脑转移瘤、脑瘤、脑癌(胶质母细胞瘤)、乳癌(***癌)、伯基特淋巴瘤、类癌瘤、***、结肠癌、结直肠癌、子宫体癌、颅咽管瘤(craniopharyngeoma)、CUP综合征、子宫内膜癌、胆囊癌、生殖器肿瘤——包括生殖泌尿道癌、恶性胶质瘤、神经胶质瘤、头/颈瘤、肝癌、组织细胞性淋巴瘤、霍奇金综合征或淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、垂体瘤、肠癌——包括小肠瘤和胃肠道瘤、卡波西氏肉瘤、肾癌(kidney cancer，kidneycarcinomas)、咽喉癌(laryngeal cancer)或喉癌、白血病——包括急性髓细胞性白血病(AML)、红白血病、急性淋巴样白血病(ALL)、慢性髓细胞性白血病(CML)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、眼睑瘤、肝癌、肝转移、肺癌(lung carcinoma)(＝lung cancer＝支气管癌)、肺小细胞癌和非肺小细胞癌，和肺腺癌、淋巴瘤、淋巴癌、恶性黑色素瘤、乳腺癌(＝乳癌)、成神经管细胞瘤、黑素瘤、脑膜瘤、蕈样霉菌病、肿瘤性疾病神经细胞瘤、食管癌、食管癌(oesophageal carcinoma(＝oesophageal cancer))、少突胶质细胞瘤、卵巢癌(ovarian cancer(＝ovarian carcinoma))、卵巢癌、胰腺癌(pancreaticcarcinoma)(＝pancreatic cancer)、***癌(penile cancer)、***癌(penis cancer)、鼻咽癌、垂体瘤、浆细胞瘤、***癌(＝***瘤)、直肠癌、直肠瘤、肾癌(renal cancer)、肾癌(renal carcinomas)、视网膜母细胞瘤、肉瘤、Schneeberger′s疾病、皮肤癌例如黑素瘤或非黑素瘤皮肤癌——包括基底细胞癌和鳞状细胞癌以及牛皮癣、寻常天庖疮、软组织瘤、鳞状细胞癌(spinalioma)、胃癌、睪丸癌、咽喉癌(throat cancer)、胸腺瘤、甲状腺癌、舌癌、尿道癌、子宫癌、***癌、各种病毒诱发的肿瘤如，例如***瘤病毒诱发的癌(例如***(cervical carcinoma＝cervical cancer))、腺癌、疱疹病毒诱发的肿瘤(例如，伯基特淋巴瘤、EBV诱发的B细胞淋巴瘤、***)、B型肝炎诱发的肿瘤(肝细胞癌)、HTLV-1和HTLV-2诱发的淋巴瘤、外阴癌、疣突病状或受累(involvement)等。在本上下文中，术语“疗法”和“治疗的”优选地表示在被给予活体时具有至少一些最小生理效应。例如，在给予“治疗的”抗肿瘤化合物时，生理效应可以是抑制肿瘤生长、或减小肿瘤大小、或预防肿瘤复发。优选地，在癌或瘤性疾病的治疗中，抑制肿瘤生长、或减小肿瘤大小、或预防肿瘤复发的化合物会被认为是治疗上有效的。术语“抗肿瘤药物”因此优选地表示具有抗肿瘤、瘤性疾病或癌的治疗效果的任何治疗剂。
根据可选的优选实施方式，如上定义的本发明的转运蛋白货物结合分子、本发明的药物组合物或本发明的疫苗可以被用于(制备药物，所述药物用于)预防、治疗和/或改善炎性疾病，如肺炎性疾病或肺疾病——包括急性呼吸窘迫综合症(ARDS)或肺纤维化、组织炎症——包括、但不限于：包括囊性纤维化在内的纤维组织形成、脑膜炎和移植排斥或移植排斥反应、涉及呼吸***的慢性病——包括哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺炎和肺纤维化。
根据可选的优选实施方式，如上定义的本发明的转运蛋白货物结合分子、本发明的药物组合物或本发明的疫苗可以被用于(制备药物，所述药物用于)预防、治疗和/或改善例如感染疾病，优选为病毒、逆转录病毒、细菌或原生动物感染疾病。这样的感染疾病通常选自：AIDS、炭疽病、日本脑炎、细菌感染疾病如流产(***炎症)、炭疽病、阑尾炎、疏螺旋体病、肉毒中毒、弯曲菌属(Camphylobacter)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)(尿道炎症、结膜炎)、霍乱、白喉、杜诺几病(donavanosis)、会厌炎(epiglottitis)、斑疹伤寒、气菌坏疽、淋病、兔热病、幽门螺旋杆菌(Heliobacterpylori)、百日咳、气候***炎、骨髓炎、军团病、水痘、***、巨细胞病毒(CMV)、登革热、初夏脑膜脑炎(early summer meningoencephalitis)(ESME)、埃博拉病毒、感冒、第五病、手足口病、单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型、带状疱疹、HSV、由寄生虫、原生动物或真菌引起的感染疾病如阿米巴病、裂体吸虫病、恰加斯病、棘球绦虫、鱼绦虫、鱼肉中毒(拉美鱼肉毒)、狐狸绦虫(fox tapeworm)、脚癣、犬绦虫、念珠菌病、酵母菌斑、疥疮、皮肤利什曼病(Leishmaniosis)、贾第虫病(lambliasis(giardiasis))、虱子、疟疾、显微镜方法、盘尾丝虫病(河盲)、真菌疾病、牛绦虫、血吸虫病、猪绦虫、弓形体病、毛滴虫病、锥虫病(昏睡病)、内脏利什曼病(visceral Leishmaniosis)、尿布(nappy/diaper)皮炎或小型绦虫、感染性红斑、流行性感冒、卡波西氏肉瘤、拉沙热、利什曼病、麻风病、利斯特氏菌病、莱姆疏螺旋体病、疟疾、马尔堡病毒感染、麻疹、脑膜炎包括细菌脑膜炎、触染性软疣、单核细胞增多症、腮腺炎、人支原体(Mycoplasma hominis)、新生儿败血症(绒毛膜羊膜炎)、坏疽性口炎、诺瓦克病毒感染、中耳炎、副伤寒、发否氏腺热、瘟疫、肺炎、脊髓灰质炎(小儿麻痹症，儿童时期残疾)、假格鲁布、狂犬病、赖特氏综合征、落基山斑疹热、沙门氏菌属(Salmonella)副伤寒、沙门氏菌属斑疹伤寒、SARS、猩红热、带状疱疹、肝炎、天花、软性下疳、梅毒、破伤风、三日热、断路装置、***、结核病、斑疹伤寒、***炎、由巨细胞病毒(CMV)引起的病毒病、正痘天花病毒、正痘类天花病毒、绵羊副痘病毒、触染性软疣病毒、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、疱疹B病毒、水痘带疹病毒、伪狂犬病病毒、人巨细胞病毒、人疱疹病毒6型、人疱疹病毒7型、爱泼斯坦-巴尔病毒、人疱疹病毒8型、乙型肝炎病毒、切昆贡亚病毒、奥尼翁-尼翁病毒、风疹病毒属、丙型肝炎病毒、GB病毒C型、西尼罗病毒、登革病毒、黄热病病毒、羊跳跃病病毒、圣路易士脑炎病毒、日本乙型脑炎病毒、波瓦散病毒、FSME病毒、SARS、SARS相关冠状病毒、人冠状病毒229E、人冠状病毒Oc43、曲状病毒属、人类嗜T淋巴细胞病毒I型、人类嗜T淋巴细胞病毒II型、HIV(AIDS)，即人免疫缺陷病毒1型或人免疫缺陷病毒2型、流感病毒、拉沙病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、塔卡里伯病毒、胡宁病毒、马休波病毒、博尔纳病病毒、本扬委那(Bunyamwera)病毒、加利福尼亚脑炎病毒、裂谷热病毒、白蛉热病毒、托斯卡纳病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、Hazara病毒、Khasan病毒、汗坦病毒、首尔病毒(Seoul virus)、希望山病毒、普马拉病毒、德贝病毒、图拉病毒、sin nombre病毒、维多利亚湖马尔堡病毒、扎伊尔埃博拉病毒、苏丹埃博拉病毒、象牙海岸埃博拉病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒、人类偏肺病毒、水疱性口炎印第安纳病毒、狂犬病病毒、莫科拉病毒、杜温哈格病毒、欧洲蝙蝠狂犬病病毒1+2、澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒、腺病毒A-F、人***瘤病毒、湿疣病毒6型、湿疣病毒11型、多瘤病毒、腺伴随病毒2、轮状病毒或环状病毒、水痘——包括水痘带状疱疹、和疟疾病毒、病毒感染疾病如AIDS、由***引起的感染疾病、凹疣突(hollow wart)、登革热、三日热、埃博拉病毒、感冒、初夏脑膜脑炎(early summer meningoencephalitis)(FSME)、流感、带状疱疹、肝炎、单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型、带状疱疹、流行性感冒、日本脑炎、拉沙热、马尔堡病毒、疣突、西尼罗热、黄热病等。
根据另一个优选实施方式，本发明的转运蛋白货物结合分子、本发明的药物组合物或本发明的疫苗，可以被用于(制备药物，所述药物用于)预防、治疗和/或改善对象中与JNK信号传导密切相关的疾病。这样的与对象中JNK信号传导密切相关的疾病或病症优选地选自(但不限于此)：自身免疫性疾病、心血管疾病、如上定义的癌或肿瘤疾病、糖尿病——包括一型或二型糖尿病、如上定义的炎性疾病、脱发——包括斑秃、肺疾病、神经元或神经变性疾病、肝病、脊柱疾病、子宫疾病、(病毒)感染疾病和抑郁症。在与JNK信号传导密切相关的疾病或病症的情况下，术语“改善”可以包括在JNK过表达时，抑制其表达和/或抑制任何以上疾病中c-jun、ATF2或NFAT4的磷酸化，例如通过利用如本文所定义的至少一种JNK抑制剂序列——偶联到以上定义内的本发明的新转运分子，作为细胞内天然c-jun、ATF2和NFAT4结合位点的竞争性抑制剂。在这种特定上下文中，术语“调控”也包括抑制转录因子的杂络物和同络物(homomeric complex)，其由、但不限于此，c-jun、ATF2或NFAT4及其相关的配体组成，如例如由c-jun、AFT2和c-fos组成的络合物。当如上定义的与JNK信号传导密切相关的疾病或病症与JNK的过度表达相关时，这样的抑制性JNK抑制剂序列可以被引入到细胞。在一些例子中，在与JNK信号传导密切相关的疾病或病症的上下文中，“调控”也可以包括JNK表达的增加，例如通过使用阻碍IB-肽与JNK结合的IB-肽特异抗体，因此通过IB-相关肽，防止JNK抑制。用以上公开的药物组合物对对象的预防和/或治疗通常可以通过(体内)给予对象(“治疗有效的”)量的所述药物组合物来完成，其中所述对象可以是，例如任何哺乳动物，例如人类、灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、牛、马或猪。术语“治疗有效的”表示药物组合物的活性组分具有足够的量，以改善如上定义的与JNK信号传导密切相关的疾病或病症。可以发现本文提及的其它疾病另外的例子。
因此，本发明的转运蛋白货物结合分子、本发明的药物组合物或本发明的疫苗可以被用于(制备药物，所述药物用于)预防、治疗和/或改善自身免疫性病症或疾病。根据每种疾病的主要临床病理学特征，自身免疫性疾病广义上可以被分为***和器官特异或局部自身免疫性疾病。自身免疫性疾病可以被分类为***综合征，其包括***性红斑狼疮(SLE)、斯耶格伦氏综合征、硬皮病、类风湿性关节炎和多发性肌炎；或局部综合征，其可以是内分泌学的(一型糖尿病(type I diabetes)(Diabetes mellitus Type1)、桥本氏甲状腺炎、阿狄森氏病等)、皮肤病学的(寻常天庖疮)、血液学的(自身免疫性溶血性贫血)、神经的(多发性硬化症)或者事实上可以涉及任意身体组织边界清楚的肿块。即将被治疗的自身免疫性疾病可以选自：自身免疫性疾病I型或自身免疫性疾病II型或自身免疫性疾病III型或自身免疫性疾病IV型，如例如，多发性硬化症(MS)、类风湿性关节炎、糖尿病、一型糖尿病(type I diabetes)(Diabetes mellitus Type 1)、慢性多关节炎、巴塞多氏病、自身免疫型慢性肝炎、溃疡性结肠炎、过敏疾病I型、过敏疾病II型、过敏疾病III型、过敏疾病IV型、纤维肌痛、脱发、别赫捷列夫氏病、克罗恩病、重症肌无力、神经性皮炎、风湿性多肌痛、进行性全身性硬化症(PSS)、赖特氏综合征、风湿性关节炎、牛皮癣、血管炎等或二型糖尿病。而对于为什么免疫***引起针对自身抗原的免疫反应的确切模式迄今还没有阐明，关于病因有几个发现。因此，自身反应可能是由于T细胞旁路。正常的免疫***要求B细胞被T细胞活化，之后，前者能大量产生抗体。T细胞的该要求在极少数情况下可被忽视，如被产生超抗原的生物体感染，所述超抗原通过以非特异性方式直接结合到T细胞受体的β-亚基能发起B细胞的多克隆活化、甚至T细胞的多克隆活化。另外的解释推论自身免疫性疾病来自分子拟态。外源性抗原与某些宿主抗原可以共有结构相似性；因此，任意针对该抗原(其模拟自身抗原)产生的抗体理论上也能与宿主抗原结合，并增强免疫应答。在A组β-溶血性链球菌中观察到分子拟态的最显著的形式，所述A组β-溶血性链球菌与人心肌共有抗原并是造成风湿热的心脏表现的原因。
本发明的转运蛋白货物结合分子、本发明的药物组合物或本发明的疫苗也可以被用于(制备药物，所述药物用于)预防、治疗和/或改善心血管疾病，其优选地选自：心脏病和冠心病、动脉硬化、中风、腹主动脉扩张，如肾下动脉瘤高血压和心肌梗塞。
另外，本发明的转运蛋白货物结合分子、本发明的药物组合物或本发明的疫苗可以被用于(制备药物，所述药物用于)预防、治疗和/或改善神经元或神经变性疾病，其选自、但不限于：阿耳茨海默病、帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、张力障碍、癫痫、视神经疾病——包括青光眼、眼部感染、多发性硬化症、脑膜炎、由或者病症或者疾病引起的神经元疾病或神经***病症——包括轴突“切割”或破坏，如轴突横切，疼痛、尤其是神经病痛、发作——包括缺血性发作和病毒性脑病。
本发明的转运蛋白货物结合分子、本发明的药物组合物或本发明的疫苗也可以被用于(制备药物，所述药物用于)预防、治疗和/或改善肝病，其选自、但不限于：肝炎和肝毒性。
另外，本发明的转运蛋白货物结合分子、本发明的药物组合物或本发明的疫苗可以被用于(制备药物，所述药物用于)预防、治疗和/或改善脊柱疾病，其选自、但不限于盘疝形成。
根据一个优选实施方式，本发明的转运蛋白货物结合分子、本发明的药物组合物或本发明的疫苗可以被用于(制备药物，所述药物用于)预防、治疗和/或改善子宫疾病，其选自、但不限于子宫内膜异位症。
根据另一个优选实施方式，本发明的转运蛋白货物结合分子、本发明的药物组合物或本发明的疫苗可以被用于(制备药物，所述药物用于)预防、治疗和/或改善抑郁症，其选自、但不限于严重抑郁症——也称为严重抑郁症、单相性抑郁症、临床抑郁症或单纯性抑郁症、双相性抑郁症、躁病抑郁症和躁狂抑郁症。
根据更进一步的优选实施方式，本发明的转运蛋白货物结合分子、本发明的药物组合物或本发明的疫苗可以被用于(制备药物，所述药物用于)预防、治疗和/或改善对象中非慢性或慢性炎性消化疾病。本文所用的术语“非慢性或慢性炎性消化疾病”通常表示属于胃肠道的非慢性或慢性炎性疾病。这包括食道、胃、十二指肠的第一、第二、第三和第四部分、空肠、回肠、回盲肠复合体、大肠、(升、横和降结肠)乙状结肠和直肠疾病。优选地包含于该方面的是慢性炎性消化疾病，其以结肠炎症为特征，如结肠炎——包括，例如溃疡性结肠炎(Colitis ulcerosa)(ulcerativecolitis)、Morbus Crohn(克罗恩病)、改道性结肠炎、缺血性结肠炎、感染性结肠炎、暴发性溃疡性结肠炎、化学性结肠炎、微小性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、胶原性结肠炎、未定型结肠炎和非典型结肠炎等。
在以上的上下文中，本发明也涉及本发明的转运蛋白货物结合分子、本发明的药物组合物或本发明的疫苗用于预防、治疗和/或改善本文所提的疾病或病症的应用。尤其地，它也包括本发明的转运蛋白货物结合分子、本发明的药物组合物或本发明的疫苗用于接种的应用，或者这些组分作为接种剂的应用。根据本发明的一个尤其优选的实施方式，用于预防、治疗和/或改善上述疾病或病症的这样的方法，或者用于预防上述疾病的接种方法通常包括将所述的发明的转运蛋白货物结合分子、药物组合物或疫苗给予需要其的患者(例如，遭受任何以上疾病，或表现其症状)、尤其是给予人类，优选地以“安全和有效的量”并以上述制剂中的一种。给药方式也可以为针对发明的药物组合物或疫苗的如上所述的给药方式。
根据本发明的第五个方面，如上定义的本发明的药物组合物、本发明的疫苗、本发明的转运蛋白货物结合分子、根据通式(I)或根据上面的任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的本发明新型转运蛋白构建物，或以上定义内的其变体或片段可以被用作药物。这样的药物可以是如上所示的药物组合物或疫苗。它通常可用于医学应用，优选地用于任何预防、治疗和/或改善如本文所提到的疾病或病症。
根据本发明的第六个方面，本发明的转运蛋白货物结合分子和优选地根据通式(I)或根据上面的任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的本发明新型转运蛋白构建物可用于将任何货物分子(优选地如本文所定义的)转运到即将被治疗的患者的细胞或组织中。在该上下文中，货物分子可以优选地适于本文所提到的治疗，尤其适于预防、治疗和/或改善本文所提到的疾病或病症，并可以选自因此适合的任何货物分子，更优选选自针对本发明的转运蛋白货物结合分子的任何组分(B)、(C)、(D)和/或(E)如上所述的任何货物分子。由此，使用针对上面的组分(B)、(C)、(D)和/或(E)描述的任何偶联方法，根据通式(I)或根据上面的任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的本发明新型转运蛋白构建物可与这样的货物分子偶联。
根据该方面的一个特别优选的实施方式，本发明的转运蛋白货物结合分子，更优选地根据通式(I)或根据上面的任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的本发明新型转运蛋白构建物可用于将如本文所提到的，例如上面针对任何组分(B)、(C)、(D)和/或(E)所描述的任何货物分子转运到细胞，优选地转运到血细胞，更优选地转运到白细胞或优选地转运到神经细胞。这种转运可在体外、体内和/或先体外后体内实现。优选地，该转运可被实现进入到即将被治疗的患者的各个细胞。对本发明的转运蛋白货物结合分子，更优选地对上面所提到的结合到货物的根据通式(I)或根据上面的任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的本发明新型转运蛋白构建物的这样的指导在治疗如上面所提到的炎性疾病中是特别适合的。为了该目的，本发明的转运蛋白货物结合分子，更优选地根据通式(I)或根据上面的任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的本发明新型转运蛋白构建物可针对发明的药物组合物或发明的疫苗，如上面所描述的被给予。此外，本发明的转运蛋白货物结合分子，更优选地根据通式(I)或根据上面的任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的本发明新型转运蛋白构建物针对给药的目的，可被配制为如上面所描述的发明的药物组合物或发明的疫苗。给药途径如上面所定义的针对发明的药物组合物或发明的疫苗。可选地，本发明的转运蛋白货物结合分子，更优选地根据通式(I)或根据上面的任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的本发明新型转运蛋白构建物可直接给药，不需要任何另外制剂，即“裸的”。同样，给药途径优选地如上面所定义的针对这样的制剂。
根据本发明的第七个方面，根据通式(I)或根据上面的任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的本发明新型转运蛋白构建物、如上定义本发明的转运蛋白货物结合分子或以上定义内的其变体或片段、本发明的药物组合物或本发明的疫苗可以在诊断中被用作诊断工具，例如用在(体内或体外)测定中，例如用在免疫测定中，以检测、预测、诊断或监测所提到的病症或疾病的各种病状和疾病状态。
举例来说，免疫测定可以通过这样的方法来进行，该方法包括使来源于患者的样品与如上定义的发明的转运蛋白货物结合分子接触，其中本发明的转运蛋白货物结合分子的组分(B)和/或任何组分(C)、(D)和/或(E)可以指向样品中所包含的组分或化合物，例如(细胞)特异性组分或化合物。这样的本发明转运蛋白货物结合分子的组分(B)和/或任意组分(C)、(D)和/或(E)可以是，例如针对样品(细胞)特异性组分或化合物的抗体，其中这样的样品(细胞)特异性组分或化合物可以是，例如本文所定义的任意组分(B)、(C)、(D)和/或(E的如上所述的化合物或组分。通常在可以发生免疫专一结合的条件下实施样品的接触，并随后通过抗体检测或测量任意免疫专一结合的量。在特定的实施方式中，对样品(细胞)特异性组分或化合物，例如上面所定义的组分(B)、(C)、(D)和/或(E)特异的抗体，可以被用于分析来自患者的组织或血清样品是否存在如上定义的这样的组分(B)、(C)、(D)和/或(E)或与之有关的疾病。这样的疾病可以包括本文所述的疾病或病症。可使用的免疫测定包括、但不限于：竞争和非竞争分析***，其所使用的技术例如蛋白质印迹、放射性免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、“夹层”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集反应分析、荧光免疫测定、补体结合测定、免疫放射测定、以及蛋白质-A免疫测定等。
可选地，可以通过输送如上定义的本发明的药物组合物、疫苗或本发明的转运蛋白货物结合分子或以上定义内的其变体或片段至靶细胞，进行(体外)分析，并通过本领域技术人员熟知的生物物理方法，监测细胞反应，所述靶细胞一般选自，例如培养的动物细胞、人细胞或微生物。在此一般使用的靶细胞可以是培养的细胞(体外)或体内细胞，即构成活的动物或人的器官或组织的细胞，或在活的动物或人中发现的微生物。在该上下文中尤其优选的是所谓的标签(markes)或标记(label)，其可以作为本发明的转运蛋白货物结合分子的组分(B)或任意组分(C)、(D)和/或(E)被包含，其中，这样的标记可以是例如以上针对本发明的转运蛋白货物结合分子的所一般定义的。
根据本发明的最后的方面，本发明也提供试剂盒，尤其是成套试剂盒(kits ofparts)，其包括根据通式(I)或根据上面的任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的本发明新型转运蛋白构建物、本发明的转运蛋白货物结合分子、本发明的药物组合物和/或本发明的疫苗单独作为组分或组合，以及任选地具有涉及这些组分的给药和剂量信息的技术说明。这样的试剂盒，优选为部分的试剂盒，可以被例如用于或用在，任意以上所提到的用途或应用中。本发明另外特别提供试剂盒用于诊断和治疗目的的应用，特别是用于治疗、预防或监测所公开的疾病或病症。
本发明并不被限制在根据本文所述的特殊实施方式的范围内。实际上，根据前述说明书和附图，对于除本文描述的以外的发明的各种修改，对本领域技术人员来说是显然的。这样的修改落入所附权利要求书的范围。
本文引用了各种出版物，其公开内容通过参考以其整体并入本文。
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员一般理解的含义一样的含义。尽管与本文所公开的相似或相当的方法和材料可以被用于实施或测试本发明，但以下描述了合适的方法和材料。通过参考以其整体，将本文所提到的所有出版物、专利申请、专利以及其它参考文献并入本文。在有冲突的情况下，以本发明说明书——包括定义为准。此外，材料、方法和例子仅是说明性的，而并不意图为限制性的。根据以下详细的描述和权利要求书，本发明的其它特征和优势将会很明显。
附图说明
以下附图旨在进一步说明本发明。它们不意欲限制本发明的主题。
图1：描绘涉及几种转运蛋白构建物的用蛋白酶K进行的定量降解测定的结果，该转运蛋白构建物具有聚Arg序列，每种显示不同的D-和L-氨基酸模式(D-/L-模式)。该测定中使用的转运蛋白构建物称作1-至6-。使用大写字母和小写字母描述序列的不同D-/L-模式。在这些序列(“R”-氨基酸)中大写字母指L-对映体精氨酸(L-Arg)，在这些序列(“r”-氨基酸)中小写字母指D-对映体精氨酸(L-Arg)。以t＝0、10和40分钟的时间间隔测量对蛋白酶K的敏感性。然后在这些特定的时间间隔取得的样品的基础上，测定用蛋白酶K进行的定量降解测定的结果。使用起始物质的离子强度作为参考值，利用质谱分析来分析这些样品。结果，当一段3个或更多个L-Arg存在于序列中时，该肽显示对蛋白酶K的敏感性并被降解。具有相互紧靠的2个或更少个L-Arg的肽不被降解，结果与完全-D序列或D-TAT(SEQ ID NO：251)——各自的D-JNKi——相当。
图2：在表中显示四种不同的D-/L-TAT衍生物的转运蛋白构建物(称为L-TAT(SEQ ID NO：18)、r3-TAT(也称为r3-L-Tat；SEQ ID NO：20)、r3-TATi(也称为r3-L-TATi：SEQ ID NO：21)和D-TAT；SEQ ID NO：251)的比较，每种均具有9个氨基酸的长度，但具有不同的D-/L-模式。使用大写字母和小写字母描述序列的不同D-/L-模式序列。序列(“R”-氨基酸)中大写字母指L-对映体精氨酸(L-Arg)，在这些序列(“r”-氨基酸)中小写字母指D-对映体精氨酸(L-Arg)。图2中显示的表显示了这些TAT衍生的转运蛋白构建物的氨基酸序列，以及它们的分子量(MW)和pI值。
图3：显示TAT衍生的转运蛋白构建物在10％和50％人血清中在37℃消化直到这些TAT衍生的转运蛋白完全降解的结果。TAT衍生的转运蛋白构建物如图2中所描述的，其中转运蛋白构建物r3-TAT(也称为r3-L-Tat；SEQ ID NO：20)、r3-TATi(也称为r3-L-TATi：SEQ ID NO：21)以β-丙氨酸被在N末端另外地保护。如在图3中所能看出的，D-TAT转运蛋白构建物是抗蛋白酶的，而L-TAT转运蛋白构建物在体内被降解的非常早，为了实现有效地转运进细胞。只有转运蛋白构建物r3-TAT(也称为r3-L-Tat；SEQ ID NO：20)、r3-TATi(也称为r3-L-TATi，SEQ ID NO：21)显示在合适的期限内降解，这允许限制治疗应用的体内稳定性。
图4：显示TAT衍生的转运蛋白构建物在10％和50％人血清中在37℃消化直到这些TAT衍生的转运蛋白在β-丙氨酸(b-Ala)参与保护肽下完全降解的结果。因此，将β-Ala加入到TAT衍生的转运蛋白构建物L-TAT的N端作为如已在图3中描述的L-TATi。如在图4中所能看出的，具有β-丙氨酸的转运蛋白肽的N-端保护不导致显著的作用，即改善的稳定性。
图5：描述FITC标记的TAT衍生的转运蛋白构建物时间依赖性内在化(摄取)至HL-60细胞系的细胞中的结果。将HL-60细胞与10M的TAT衍生物转运蛋白温育30min、1、6或24小时。然后将细胞用酸性缓冲液(0.2M甘氨酸，0.15M NaCl，pH 3.0)洗涤两次，以及用PBS洗涤两次。通过加入RIPA裂解缓冲液破碎细胞。然后，通过读取每种提取物的荧光强度(Fusion A plate reader；PerkinElmer)，随后减去背景和蛋白质含量标准化，确定内在化肽的相对量。r3-L-TAT转运蛋白构建物(SEQ ID NO：20)显示与D-TAT转运蛋白构建物一样有效的内在化能力。象前两个转运蛋白一样以时间依赖方式内在化的r3-L-TATi转运蛋白构建物(SEQ ID NO：21)似乎不太有效但仍然是适合的，而L-TAT(SEQ ID NO：18)在超过24小时后不积累。
图6：显示用荧光标记的TAT衍生的转运蛋白构建物处理的细胞的共聚焦显微镜检查结果。将从P2斯普拉-道来(Sprague Dawley)大鼠解离的皮质初级神经元在神经基质(neurobasal)培养基中被培养12天，之后暴露于500nM FITC标记的TAT衍生的转运蛋白24小时。将细胞在冰上用PBS洗涤5次，然后，在没有先前固定的情况下装入fluorsave封固介质。在LSM510 meta共聚焦显微镜(Zeiss)上进行收集。将图像用LSM510软件处理，并用Adobe photoshop制作。通过用500nM FITC-转运蛋白标记的共聚焦显微镜检查进行可视化(A：绿色)。核经Hoechst染色(B：蓝色)。r3-L-TAT(SEQ ID NO：20)以及D-TAT(SEQ ID NO：251)和r3-L-TATi(SEQ ID NO：21)转运蛋白构建物被内在化至非应激的神经元的细胞质(C：合并的图)。然而，在24小时温育之后，L-TAT转运蛋白(SEQ ID NO：18)便不再存在。
图7：显示FITC标记的TAT衍生的转运蛋白构建物的体外摄取(内在化)(10μM，HepG2肝癌细胞，HCT-116肿瘤结肠，24h)。使用的构建物为被称为D-TAT(SEQ IDNO：251)和r3-TATi(也称为r3-L-TATi，SEQ ID NO：21)的不同的TAT衍生的转运蛋白构建物，每种均具有9个氨基酸的长度但具有不同的D-/L-模式，以及测试构建物r6R3(SEQ ID NO：260)和DAK，其中该构建物另外已被β-丙氨酸在其N端标记。如所能看到的，对构建物D-TAT(SEQ IDNO：251)和r6R3(SEQ IDNO：260)的摄取是最有效的，其次是r3-L-TATi(SEQ ID NO：21)。
图8：显示FITC标记的TAT衍生的转运蛋白构建物的体外摄取(内在化)(10μM，U937，淋巴瘤，24h)。使用的构建物为四个不同的TAT衍生转运蛋白构建物(称为L-TAT，SEQ ID NO：18)、r3-TAT(也称为r3-L-Tat，SEQ ID NO：20)、r3-TATi(也称为r3-L-TATi，SEQ ID NO：21)和D-TAT，SEQ ID NO：251)，每种具有9个氨基酸的长度，但具有不同的D-/L-模式。另外，构建物DAK用于比较和对照样品，只含有氨基酸D、A和K。如所能看到的，r3-TAT(SEQ ID NO：20)、r3-TATi(SEQ ID NO：21)和D-TAT(SEQ ID NO：251)转运蛋白构建物摄取进细胞是最有效的，其中L-TAT(SEQ ID NO：18)显示显著较低地摄取进细胞。
图9：显示D-TAT转运蛋白构建物的摄取(内在化)在U937细胞，淋巴瘤中超过24小时在500nM浓度下是HSPG依赖性的。用于实验的构建物是D-TAT(SEQ ID NO：251)，具有9个氨基酸的长度，并被FITC标记，在其N端具有β-丙氨酸。
图10：显示在U937细胞中在500nM FITC-D-TAT时未观察到FITC标记的TAT衍生的转运蛋白构建物的退出。用于实验的构建物是D-TAT(SEQ ID NO：251)，具有9个氨基酸的长度，并被FITC标记。
图11：显示在10μM FITC-D-TAT下观察到FITC标记的TAT衍生的转运蛋白构建物的退出，其是HSPG依赖性的(U937，淋巴瘤)。用于实验的构建物是D-TAT(SEQID NO：251)，具有9个氨基酸的长度，并用FITC标记，在其N端具有β-丙氨酸。
图12：显示在非WBC-细胞系(白细胞系)中在10μM FITC-D-TAT下观察到FITC标记的TAT衍生的转运蛋白构建物的摄取(内在化)和退出。用于实验的构建物是D-TAT(SEQ ID NO：251)，其具有9个氨基酸的长度，并用FITC标记。
图13：显示使用TAT衍生的通式(I)的转运蛋白构建物的内在化实验。如图13中所能看出的，24小时温育之后，具有共有序列rXXXrXXXr(SEQ ID NO：252；参见上面针对潜在序列的选择)的所有转运蛋白显示出较L-TAT转运蛋白(SEQ ID NO：18)高的内在化能力。将Hela细胞与10mM r3-L-TAT-衍生的转运蛋白在96孔板中温育24小时。然后将细胞用酸性缓冲液(0.2M甘氨酸，0.15M NaCl，pH 3.0)洗涤两次，以及用PBS洗涤两次。通过加入RIPA裂解缓冲液破碎细胞。然后通过读取每种提取物的荧光强度(Fusion A plate reader；PerkinElmer)，随后减去背景，确定内在化肽的相对量。
图14：显示使用TAT衍生的通式(I)的转运蛋白构建物的内在化实验。如图14中所能看出的，一个位置表现出对最高的转运蛋白活性和对改善的转运蛋白活性动力学是关键的：位置2中的Y(肽N°91对应于SEQ ID NO：116)。简言之，将Hela细胞在24孔板中与渐增剂量的r3-L-TAT衍生的转运蛋白(0、500nM、1mM或10mM)温育2、6或24小时。然后将细胞用酸性缓冲液(0.2M甘氨酸，0.15M NaCl，pH 3.0)洗涤两次，以及用PBS洗涤两次。通过加入RIPA裂解缓冲液破碎细胞。然后通过读取每种提取物的荧光强度(Fusion A plate reader；PerkinElmer)，随后减去背景，确定内在化肽的相对量。
图15：荧光TAT衍生物转运蛋白D-TAT(SEQ ID NO：251)-FITC或r3-L-TAT(SEQID NO：20)-FITC靶向不同的人白细胞群。
A：D-TAT(SEQ ID NO：251)-FITC。在各个四分体中的细胞百分比如下(假设顺时针以左上四分体开始)：
单核细胞(CD14)     9,24；  19,37； 31,71； 39,68；
嗜中性粒细胞(CD15) 17,03； 13,87； 21,53； 47,57；
淋巴细胞T(CD3)     22,7；  11,82； 18,01； 47,46；
淋巴细胞B(CD19)    32,40； 2,12；  8,26；  57,22。
B：r3-L-TAT(SEQ ID NO：20)-FITC。在各个四分体中的细胞百分比如下(假设顺时针以左上四分体开始)：
单核细胞(CD14)     6,34；  16,65； 36,24； 40,77；
嗜中性粒细胞(CD15) 11,74； 13,75； 24,76； 49,75；
淋巴细胞T(CD3)     20,64； 8,96；  20,04； 50,36；
淋巴细胞B(CD19)    27,83； 1,76；  8,48；  61,92。
图16：该表表示在如图15(FITC通道)所显示的每个细胞类型中，荧光TAT衍生的转运蛋白D-TAT(SEQ ID NO：251)-FITC或r3-L-TAT(SEQ ID NO：20)-FITC的平均荧光值。
图17：不同细胞类型对选择的根据本发明的转运蛋白构建物的摄取。摄取对D-TAT(SEQ ID NO：251)被标准化。HepG2：肝癌细胞(人，非白细胞细胞系)；A549：肺上皮细胞(人，非白细胞细胞系)；原状的：巨噬细胞细胞(小鼠；白细胞细胞系)；J77：巨噬细胞细胞(小鼠；白细胞细胞系)；BMDM：骨髓衍生的巨噬细胞(小鼠；纯化的原代白细胞)。*n＝2次独立试验(重复2次)(除了肽#64n＝1重复2次以外)；**n＝2次试验(重复2次)(除了肽#64n＝2重复2次以外)；***n＝1次试验(重复2次)。
图18：不同细胞类型对选择的根据本发明的转运蛋白构建物的摄取。摄取对r3-L-TAT(SEQ ID NO：20)被标准化。HepG2：肝癌细胞(人，非白细胞细胞系)；A549：肺上皮细胞(人，非白细胞细胞系)；原状的：巨噬细胞细胞(小鼠；白细胞细胞系)；J77：巨噬细胞细胞(小鼠；白细胞细胞系)；BMDM：骨髓衍生的巨噬细胞(小鼠；纯化的初级白细胞)。*n＝2次独立试验(重复2次)(除了肽#64n＝1重复2次以外)；**n＝2次试验(重复2次)(除了肽#64n＝2重复2次以外)；***n＝1次试验(重复2次)。
实施例
以下实施例旨在进一步说明本发明。它们不意欲限制本发明的主题。
1.(肽)转运蛋白构建物的制备
使用如上面所描述的固相合成方法制备这些实施例中使用的(肽)转运蛋白构建物。用于识别对蛋白酶敏感的转运蛋白构建物的最小D-/L-模式的构建物如下：
  SEQ ID No.   D-/L-模式(pattern)   序列(N-末端至C-末端)
  123   所有的L   RRRRRRRRR(参考序列)
  257   所有的D   rrrrrrrrr
  258   D/L   rRrRrRrRr
  259   DD/LL   rrRRrrRRr
  260   DDD/LLL(r6R3)   rrrRRRrrr
  261   DDDD/LLLL   rrrRRRRrr
用于进入各种细胞和细胞系的摄取(内在化)实验的构建物如下：
Figure BPA00001390404200751
合成之后将构建物纯化，在无菌水中贮存为10mM溶液，并作为纯化的使用，无需任何另外的处理。
2.赋予对蛋白酶(蛋白酶K)敏感性的最小D-/L-模式的识别
为了识别对蛋白酶敏感但在体内提供足够长的半衰期的转运蛋白构建物的最小D-/L-模式，用蛋白酶K对几种转运蛋白构建物进行定量降解测定，这些转运蛋白构建物具有聚Arg序列，每个序列显示不同的D-和L-氨基酸模式。如上面实施例1下所描述地制备该测定中使用的转运蛋白构建物，并称为1至6。
  SEQ ID No.   模式   序列(N-末端至C-末端)   蛋白酶
  敏感性
  123   所有L   RRRRRRRRR(参考序列)   +
  257   所有D   rrrrrrrrr   -
  258   D/L   rRrRrRrRr   -
  259   DD/LL   rrRRrrRRr   -
  260   DDD/LLL(r6R3)   rrrRRRrrr   +
  261   DDDD/LLLL   rrrRRRRrr   +
使用大写字母和小写字母描述不同的序列模式。在这些序列1至6(“R”-氨基酸)中大写字母指L-对映体精氨酸(L-Arg)，在这些序列(“r”-氨基酸)中小写字母指D-对映体精氨酸(L-Arg)。以t＝0、10和40分钟的时间间隔测量对蛋白酶K的敏感性。然后在这些特定的时间间隔取得的样品的基础上，测定用蛋白酶K进行的定量降解测定的结果。使用起始物质的离子强度作为参考值，利用质谱分析来分析这些样品。结果，当一段3个或更多个L-Arg存在于序列中时，该肽显示对蛋白酶K的敏感性并被降解。具有相互紧靠的2个或更少个L-Arg的肽不被降解。这些结果与完全由D-对映体氨基酸组成的序列，例如分别为D-TAT(rrrqrrkkr；SEQ ID NO：251)或D-JNKi相当(也参见图1)。
进一步的比较通过使用称为L-TAT(SEQ ID NO：18)、r3-TAT(也称为r3-L-Tat；SEQ ID NO：20)、r3-TATi(也称为r3-L-TATi：SEQ ID NO：21)和D-TAT；SEQ ID NO：251)的四个D-/L-TAT衍生物的转运蛋白构建物进行，每种均具有9个氨基酸的长度，但具有不同的D-/L-模式。使用大写字母和小写字母描述不同的序列模式。序列(“R”-氨基酸)中大写字母指L-对映体精氨酸(L-Arg)，在这些序列(“r”-氨基酸)中小写字母指D-对映体精氨酸(L-Arg)。图2中显示的表显示了这些TAT衍生的转运蛋白构建物的氨基酸序列，关于它们的分子量(MW)和pI值(参见图2)。
消化是在10％和50％人血清中在37℃进行的，直到这些TAT衍生的转运蛋白构建物完全降解。如在图3——其显示TAT衍生的转运蛋白构建物消化结果——中所能看出的，D-TAT(SEQ IDNO：251)转运蛋白构建物是抗蛋白酶的，而L-TAT转运蛋白构建物(SEQ ID NO：18)在体内被降解的非常早，以便实现向细胞的有效转运。只有转运蛋白构建物r3-TAT(也称为r3-L-Tat；SEQ ID NO：20)、r3-TATi(也称为r3-L-TATi，SEQ ID NO：21)显示在合适的期限内降解，允许限制针对治疗应用的体内稳定性。
对转运蛋白构建物r3-L-TAT在人血清中的降解进行质谱分析。结果，r3-L-TAT(SEO ID NO：20)在人血清中被从C末端降解直到单个氨基酸。
此外，TAT衍生的转运蛋白构建物的消化在10％和50％人血清中在37℃进行，直到在β-丙氨酸(b-Ala)参与保护肽下这些TAT衍生的转运蛋白完全降解。因此，将β-Ala加入到TAT衍生的转运蛋白构建物L-TAT的N端作为如已在图3中描述的L-TATi。结果显示在图4中。如在图4中所能看出的，具有β-丙氨酸的转运蛋白肽的N-端保护不导致显著的作用，即改善的稳定性。
总结以上关于它们的体内稳定性和功能半衰期的结果，在10和50％HS中测试的4种TAT衍生的肽的稳定性如下：D-TAT(SEQ ID NO：251)＞r3-L-TATi(SEQ ID NO：21)＞r3-L-TAT(SEQ ID NO：20)＞L-TAT(SEQ ID NO：18)。因此r3-L-TAT(SEQ ID NO：20)和r3-L-TATi(SEQ ID NO：21)的生存期与L-TAT(SEQ ID NO：18)相比增加了，与D-TAT(SEQ ID NO：251)相比降低了。由于血清占血量的～50％，从含有50％HS的样品中获得的值是最相关的。UPLC-MS结果此外提示降解涉及在TAT的C端切割的外蛋白酶。推定羧肽酶N参与降解，因为它是组成型活性的并以高浓度(30μg/mL)存在于血液中。而且，CPN特异性地切割来自肽和蛋白质C末端的Lys或Arg。
3.肽内在化(摄取)进细胞和肽内在化进细胞的测量
在该实验中，在细胞系HL-60(白血病)中用荧光板读数仪(荧光分析仪，fluorescence plate reader)评价FITC标记的TAT衍生的转运蛋白构建物的体外内在化(摄取)能力。
3.1.实验中使用的测试样品
该试验中使用的构建物为四种不同的TAT衍生的转运蛋白构建物(称为L-TAT(SEQ ID NO：18)、r3-TAT(也称为r3-L-Tat；SEQ ID NO：20)、r3-TATi(也称为r3-L-TATi：SEQ ID NO：21)和D-TAT；SEQ ID NO：251)，每种均如上所述地被制备。这些构建物具有9个氨基酸的长度，但具有不同的D-/L-模式。此外，构建物DAK用作对照，其不包含转运蛋白序列。构建物以β-丙氨酸(βA)被N末端保护并用FITC标记。
Figure BPA00001390404200771
如上所述地制备构建物，将其纯化，作为10mM溶液储存于无菌水中，并作为纯化的使用而无需任何进一步的处理。
3.2.另外的转运蛋白构建物TAT(s2-1)-TAT(s2-96)
如上面一般针对发明的转运蛋白构建物所描述地制备另外的转运蛋白构建物TAT(s2-1)-TAT(s2-96)。因此，在合成(与树脂结合)期间使用以下序列和保护基团：
TATs2-1：
D-Arg(Pmc)-Ala-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-2：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Ala-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-3：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ala-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-4：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Ala-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-5：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Ala-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-6：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Ala-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-7：
D-Arg(Pmc)-Asp(OBut)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-8：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Asp(OBut)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-9：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Asp(OBut)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-10：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Asp(OBut)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-11：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Asp(OBut)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-TATs2-树脂
TATs2-12：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Asp(OBut)-D-Arg(Pmc)-TATs2-树脂
TATs2-13：
D-Arg(Pmc)-Glu(OBut)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-14：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Glu(OBut)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-15：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OBut)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-16：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Glu(OBut)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-17：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Glu(OBut)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-18：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Glu(OBut)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-19：
D-Arg(Pmc)-Phe-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-20：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Phe-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-21：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Phe-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-22：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Phe-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-23：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Phe-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-24：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Phe-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-25：
D-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-26：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-27：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-28：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-29：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-30：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-31：
D-Arg(Pmc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-32：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-His(Trt)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-33：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-His(Trt)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-34：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)His(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-35：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-His(Trt)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-36：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-His(Trt)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-37：
D-Arg(Pmc)-Ile-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-38：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Ile-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-39：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ile-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-40：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Ile-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-41：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Ile-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-42：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Ile-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-43：
D-Arg(Pmc)-Leu-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-44：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Leu-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-45：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-46：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Leu-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-47：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Leu-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-48：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Leu-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-49：
D-Arg(Pmc)-Met-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-50：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Met-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-51：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Met-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-52：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Met-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-53：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Met-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-54：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Met-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-55：
D-Arg(Pmc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-56：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-57：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-58：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Asn(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-59：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-60：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Asn(Trt)-D-Arg，(Pmc)-树脂
TATs2-61：
D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-62：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-63：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-64：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)Lys(Boc)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-65：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-66：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-67：
D-Arg(Pmc)-Ser(But)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-68：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Ser(But)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-69：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(But)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-70：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Prmc)-D-Arg(Pmc)Ser(But)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-71：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Ser(But)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-72：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Ser(But)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-73：
D-Arg(Pmc)-Thr(But)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-74：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-75：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-76：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)Thr(But)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-77：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Thr(But)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-78：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Thr(But)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-79：
D-Arg(Pmc)-Val-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-80：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Val-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-81：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Val-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-82：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Val-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-83：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Val-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-84：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Val-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-85：
D-Arg(Pmc)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-86：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-87：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-88：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)Trp(Boc)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-89：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-90：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Trp(Boc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-91：
D-Arg(Pmc)-Tyr(But)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-92：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Tyr(But)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-93：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(But)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-94：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)Tyr(But)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-95：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Tyr(But)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-树脂
TATs2-96：
D-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Tyr(But)-D-Arg(Pmc)-树脂
3.3 用于摄取实验的材料和方法
a)细胞系：
用于该实验的细胞系为HL-60(Ref CCL-240，ATCC，Lot 116523)。
b)培养基和平板
RPMI(Ref 21875-091，Invitrogen，Lot 8296)或DMEM(Ref 41965，Invitrogen，Lot 13481)于2008年5月5日补给：
10％FBS(Ref A64906-0098，PAA，LotA15-151)：于2008年4月4日在56℃去补给30min。
1mM丙酮酸钠(Ref S8636，Sigma，Lot 56K2386)
青霉素(100unit/ml)/链霉素(100μg/ml)(Ref P4333，Sigma，Lot106K2321)
PBS 10×(Ref 70011，Invitrogen，Lot 8277)：用无菌H2O稀释成1×
胰蛋白酶(Trypsine)-0.05％EDTA(Ref L-11660，PAA，Lot L66007-1194)
6孔培养板(Ref 140675，Nunc，Lot 102613)
24孔培养板(Ref 142475，Nunc，Lot 095849)
96孔培养板(Ref 167008，Nunc，Lot 083310)
用于蛋白质剂量给药的96孔板(Ref 82.1581，Sarstedt)
用于荧光测量的96孔板(Ref 6005279，Perkin Elmer)
c)溶液
聚-D-赖氨酸包被溶液(Sigma P9011 Lot 095K5104)：在PBS 1×中最终稀释的25μg/ml
酸性洗涤液：0.2M甘氨酸，0.15M NaCl，pH 3.0
Ripa裂解缓冲液：10mM NaH2PO4 pH 7.2，150mM NaCl，1％TritonX-100，1mM EDTA pH 8.0，200μM Na3VO2，0.1％SDS，1×蛋白酶抑制剂混合物(Ref 11873580001，Roche，Lot 13732700)
d)显微镜检查和荧光板读数仪
利用倒置显微镜(Axiovert 40CFL；Zeiss；20×)观察和计数细胞。
用Fusion A Plate读取仪(Perkin Elmer)读取荧光。
e)方法
在悬浮细胞上研究FITC标记的肽内在化。细胞以1×106细胞/ml的浓度铺到聚-DL-赖氨酸包被的器皿中。然后，在加入已知浓度的肽之前，在37℃，5％CO2和100％相对湿度下温育平板24小时。加入肽之后，将细胞在37℃，5％CO2和100％相对湿度下温育30min、1、6或24小时。然后，为了去除细胞表面吸附的肽，用酸性缓冲液(甘氨酸0.2M，NaCl 0.15M，pH 3.0)洗涤细胞两次(参见Kameyama et al.，(2007)，Biopolymers，88，98-107)。在富含碱性氨基酸的肽有力地吸附在细胞表面上——常常导致过高估计内在化肽——时，使用酸性缓冲液。因此，应用酸性缓冲液进行细胞洗涤以去除细胞表面吸附的肽。酸洗涤在测定Fab/细胞-渗入肽结合物的细胞摄入中进行，接下来是两次PBS洗涤。通过加入RIPA裂解缓冲液破碎细胞。然后，在减去背景和蛋白质含量标准化之后，通过荧光测定内在化肽的相对量。
这些步骤因此是：1.细胞培养
                2.酸性洗涤和细胞提取物
                3.用荧光板读数仪分析肽内在化
f)细胞培养和肽处理
(1)用3ml的聚-D-Lys(Sigma P9011；在PBS中25μg/ml)包被6孔细胞培养板，用600μl包被24孔板，以及用125μl包被96孔板，并在37℃，CO2 5％和100％相对湿度下温育4小时。
(2)在4小时之后，对6、24或96孔板，分别用3.5ml PBS、700μl或150μl PBS洗涤器皿2次。
(3)针对悬浮细胞以1'000'000个细胞/ml的铺板密度将细胞铺到器皿2.4ml培养基(RPMI)中。接种之后，在加入肽之前，将平板在37℃，5％CO2和100％相对湿度下温育24小时。在处理日，贴壁细胞应该在90-95％的密度，并被铺入在DMEM中：
Figure BPA00001390404200871
Figure BPA00001390404200881
(4)用期望浓度的FITC标记的肽(储备液，在H2O中的浓度为10mM)处理细胞。
(5)在肽加入之后，将细胞在37℃，CO25％和100％相对湿度下温育0至24小时(例如30min、1、6或24小时)。
酸性洗涤和细胞提取物：
(6)将提取物在冰上冷却。
悬浮细胞(或者细胞，其不是很好(don)地附着于器皿)：
●将细胞转移到《Falcon 15ml》中。为了回收最多的细胞，用1ml PBS洗涤器皿。
●以最大2400rpm收获细胞2分钟。
●将细胞悬浮于1ml冷的PBS中。
●将细胞转移到包被的“Eppendorf管”(用1ml聚D-Lys包被4小时，并用1ml PBS洗涤两次)。
●用1ml冷的酸性洗涤缓冲液洗涤三次，并以最大2400rpm离心2分钟。小心“eppendorf”中的细胞撒出。
●用1ml冷的PBS洗涤两次，以中和。
●加入50μl裂解RIPA缓冲液。
●在冰上冰育30min至1小时，同时搅动。
贴壁细胞：
●用3ml、1ml或200μl(分别针对6、24或96孔板)冷的酸性洗涤缓冲液洗涤三次。小心细胞从器皿中分离。
●用1ml冷的PBS(分别针对6、24或96孔板)洗涤两次，以中和。
●加入50μl裂解RIPA缓冲液。
●在冰上冰育30min至1小时，同时搅动。
●用冷的刮器刮细胞。于4℃，将24和96孔板直接以4000rpm离心15min，以去掉细胞残渣。然后，将上清液(100或50ml，分别针对24或96孔板)直接转移到深96孔板。通过荧光板读数仪(Fusion A，Perkin Elmer)读取平板。
●将裂解产物转移到包被的“eppendorf”(以1ml聚D-Lys包被4小时，并用1ml PBS洗涤两次)中。
●然后将裂解的细胞在4℃，以10000g离心30分钟，以去掉细胞残渣。
●移去上清液并将其在包被的“Eppendorf管”(以1ml聚D-赖氨酸包被4小时，并用1ml PBS洗涤两次)中于-80℃储存。
用荧光板读数仪分析肽内在化：
(7)通过标准的BCA测定(Kit N°23225，Pierce)根据生产商的说明书测定每种蛋白提取物的含量。
(8)在荧光板读数仪(Fusion A，Perkin Elmer)中读取10μl每种样品之后，通过减去背景和蛋白质浓度标准化，测定每个样品的相对荧光。
3.4 内在化试验和分析
用如上所述的材料和方法完成FITC标记的TAT衍生的转运蛋白构建物时间依赖性内在化(摄取)至HL-60细胞系的细胞。
简言之，将HL-60细胞与10μM TAT衍生物转运蛋白一起温育30min、1、6或24小时。然后，将细胞用酸性缓冲液(0.2M甘氨酸，0.15M NaCl，pH 3.0)洗涤两次，并用PBS洗涤两次。通过加入RIPA裂解缓冲液破碎细胞。然后，通过读取每种提取物的荧光强度(Fusion A plate reader；PerkinElmer)，随后通过减去背景和蛋白质含量标准化，测定内在化肽的相对量。r3-L-TAT转运蛋白构建物显示与D-TAT转运蛋白构建物一样有效的内在化能力。以如之前的两种转运蛋白的时间依赖方式内在化的r3-L-TATi转运蛋白构建物似乎效率较低，但仍是合适的，然而L-TAT不会在超过24小时的时期内累积(参见图5)。
此外，用以如上所述的荧光标记的TAT衍生的转运蛋白构建物处理的细胞进行共聚焦显微镜检查。将从P2斯普拉-道来(Sprague Dawley)大鼠解离的皮质初级神经元在神经基质培养基中培养12天，之后暴露于500nM FITC标记的TAT衍生的转运蛋白24小时。将细胞用PBS在冰上洗涤5次，然后在没有提前固定的情况下装入fluorsave封固介质。在LSM510 meta共聚焦显微镜(Zeiss)上进行收集。图像用LSM510软件处理，并用Adobe photoshop制作。通过用500nMFITC-转运蛋白标记的共聚焦显微镜检查而可视化(A：绿色)。核经Hoechst染色(B：蓝色)。r3-L-TAT以及D-TAT和r3-L-TATi转运蛋白构建物被内在化至非应激的神经元的细胞质(C：合并的图)。然而，在24小时温育之后，L-TAT转运蛋白便不再存在(参见图6)。
3.5 另外的内在化试验和分析
使用96-FITC标记的D-TAT衍生物转运蛋白的序列，以如上所述的材料和方法，进一步实施FITC标记的TAT衍生的转运蛋白构建物时间依赖性内在化(摄取)至HL-60细胞系的细胞。这些序列列在下面的表6中。
表6
Figure BPA00001390404200901
Figure BPA00001390404200921
在以上表中，D氨基酸以在各自氨基酸残基前的小“d”表示(dR＝D-Arg)。
由于技术原因，少数序列合成在第一种方法中不幸失败。这些序列在图13中缩写为1、2、3、4、5、6、7、8、43、52、53、54、55、56、57、85、86、87、88、89和90。然而，剩下的序列在内在化试验中使用。
结果显示在图13和14中。
如图13中所能看出的，24小时温育之后，具有共有序列rXXXrXXXr(SEQID NO：252)的所有转运蛋白(参见以上，以选择可能的序列)显示较L-TAT转运蛋白高的内在化能力。将海拉细胞与10mM的r3-L-TAT衍生的转运蛋白在96孔板中一起温育24小时。然后，将细胞用酸性缓冲液(0.2M甘氨酸，0.15M NaCl，pH 3.0)洗涤两次，并用PBS洗涤两次。通过加入RIPA裂解缓冲液破碎细胞。然后，通过读取每种提取物的荧光强度(Fusion A plate reader；PerkinElmer)，随后减去背景，确定内在化肽的相对量。
如图14中所能看出的，一个位置似乎对最高的转运蛋白活性和对提高的转运活性动力学很关键：位置2中的Y(肽N°91，其对应于SEQ ID NO：116)。简言之，将海拉细胞与渐增剂量的r3-L-TAT衍生物转运蛋白(0、500nM、1mM或10mM)在24孔板中一起温育的2、6或24小时。然后，将细胞用酸性缓冲液(0.2M甘氨酸，0.15M NaCl，pH 3.0)洗涤两次，并用PBS洗涤两次。通过加入RIPA裂解缓冲液破碎细胞。然后，通过读取每种提取物的荧光强度(Fusion A platereader；PerkinElmer)，随后通过背景消减，确定内在化肽的相对量。
该试验的结论如下：
·在24小时温育后，具有共有序列rXXXrXXXr(SEQ ID NO：252)的所有转运蛋白(参见表1，以选择可能的序列)显示较L-TAT转运蛋白高的内在化能力(图13)。这些结果充分验证了共有序列rXXXrXXXr(SEQ ID NO：252)。
·一个位置对最高的转运蛋白活性很关键(图13)：位置2中的Y(序列91，其对应于SEQ ID NO：116)。
·一个位置对改善的转运活性动力学很关键(图14)：位置2中的Y(序列91，对应于SEQ ID NO：116)。
因此，如表1所示的这样的TAT衍生的序列是优选的，其在位置2显示Y，特别是当根据通式(I)的序列显示9aa并具有共有序列rXXXrXXXr(SEQ ID NO：252)时。
4.这些肽摄取(内在化)至U937细胞之后特异的转运蛋白构建物细胞内浓度的测 定
根据另外的试验，这些肽摄取(内在化)至U937细胞之后，测定特异的转运蛋白构建物的浓度。每个以10μM的浓度使用序列RKKRRQRRR(L-TAT)、rrrqrrkkr(D-TAT)、rKKRrQRRr(r3-L-TAT)和rYKRrQRRr(XG-91)进行试验。
令人惊奇地，rYKRrQRRr(XG-91，序列91，对应于SEQ ID NO：116)的积累在细胞中显示极大积累，其甚至显著高于转运蛋白构建物在介质中的浓度或者D-TAT构建物所期望的约20μM的平均浓度。这突出了根据通式(I)的转运蛋白构建物，尤其是包含如表1所示的TAT衍生的序列的转运蛋白构建物的重要性，其在位置2显示Y并优选的具有9aa和共有序列rXXXrXXXr(SEQ ID NO：252)。
摄取(内在化)肽至细胞和测量在细胞系HepG2(肝癌)、HCT-116(肿瘤结肠)、U937(淋 巴瘤)，在WBC细胞系(白细胞系)和非WBC细胞系中的肽内在化
在这些实验中，用荧光板读数仪在另外的细胞系HepG2(肝癌)、HCT-116(肿瘤结肠)、U937(淋巴瘤)，在WBC细胞系(白细胞系)和非WBC细胞系中评估FITC标记的TAT衍生的转运蛋白构建物的体外内在化(摄取)能力。
实验中使用的测试样品和条件
该实验中使用的构建物和条件如以上针对实验3所述的，同时具有以下修改和细胞系：
a)FITC标记的TAT衍生的转运蛋白构建物的体外摄取(内在化)(10μM， HepG2肝癌、HCT-116肿瘤结肠，24小时)
使用的构建物为称为D-TAT和r3-TATi(也称为r3-L-TATi)、D-TAT的不同的TAT衍生的转运蛋白构建物，每种均具有9个氨基酸的长度，但是不同的D-/L-模式，以及构建物r6R3(rrrRRRrrr)和DAK，其中构建物已经用β-丙氨酸在其N端另外标记。结果显示在图7中。如图7所能看出的，对构建物D-TAT和r6R3的摄取最有效，其次为r3-L-TATi。
b)FITC标记的TAT衍生的转运蛋白构建物的体外摄取(内在化)(10μM， U937，淋巴瘤，24小时)
使用的构建物为四种不同的TAT衍生的转运蛋白构建物(称为L-TAT、r3-TAT(也称为r3-L-Tat)、r3-TATi(也称为r3-L-TATi)和D-TAT)，每种均具有9个氨基酸的长度，但是不同的D-/L-模式。另外，构建物DAK用于比较和对照样品，其不含肽。结果显示在图8中。如图8所能看出的，r3-TAT、r3-TATi和D-TAT转运蛋白构建物的细胞摄取最有效，其中L-TAT显示显著较低的细胞摄取。
c)D-TAT转运蛋白构建物摄取(内在化)的HSPG依赖性
进行一项实验以察看D-TAT转运蛋白构建物的摄取(内在化)是否是HSPG依赖性的。如所发现的，D-TAT转运蛋白构建物的摄取(内在化)在U937细胞、淋巴瘤中，在500nm的浓度，在24小时内是HSPG依赖性的(也参见图9)。用于实验的构建物为D-TAT，其具有9个氨基酸的长度并被FITC标记，而且在其N端被β-丙氨酸标记。
d)FITC标记的TAT衍生的转运蛋白构建物在U937细胞(淋巴瘤)中的退出(exit)
进行另外的实验以察看FITC标记的TAT衍生的转运蛋白构建物是否退出U937细胞。结果，在U937细胞中，以500nM FITC-D-TAT，没有观察到退出(参见表10)。用于实验的构建物为D-TAT(SEQ ID NO：251)，其具有9个氨基酸的长度并被FITC标记，而且在其N端被β-丙氨酸标记。
此外，可见在10μM FITC-D-TAT，观察到FITC标记的TAT衍生的转运蛋白构建物的退出，并且，其在U937细胞(淋巴瘤)中是HSPG依赖性的(参见图11)。用于实验的构建物再次为如上的D-TAT(SEQ ID NO：251)。
e)FITC标记的TAT衍生的转运蛋白构建物以10μM FITC-D-TAT在非 WBC细胞系(白细胞系)中的摄取(内在化)和退出
在另外的实验中，在非WBC细胞系(白细胞系)中，在10μMFITC-D-TAT时观察到FITC标记的TAT衍生的转运蛋白构建物的摄取(内在化)和退出(参见图12)。用于实验的构建物为D-TAT(SEQ ID NO：251)，其具有9个氨基酸的长度并用FITC标记，而且在其N端用β-丙氨酸标记。
f)结论
作为以上摄取(内在化)实验的结论并如上面的图所能看出的，含有D-氨基酸或排他地由D-氨基酸组成的FITC标记的TAT衍生的转运蛋白构建物的摄取(内在化)在体外几小时内是线性的。此外，在24小时时，这些FITC标记的TAT衍生的转运蛋白构建物的体外摄取(内在化)达到比L-TAT高50-100倍的细胞内浓度。另外，含有D-氨基酸或排他地由D-氨基酸组成的FITC标记的TAT衍生的转运蛋白构建物被WBC细胞系(白细胞系)体外摄取(内在化)的效率比被非WBC细胞系体外摄取(内在化)高10-50倍。对于所有这些实验，退出显示在高细胞内浓度时是有效的，但在WBCs中在低细胞内浓度下没有观察到。
6.细胞毒性转运蛋白货物结合分子D-Tat-顺铂、r3-L-TAT-顺铂和r3-L-TATi-顺铂的 合成
6.1 肽合成
通过应用Fmoc化学术，在0.4mmol Fmoc-Amide-AM树脂上人工合成包括另外的甲硫氨酸的D-TAT(rrrqrrkkr；SEQ ID NO：251)、r3-L-TAT(rKKRrQRRr；SEQ ID NO：20)和r3-L-TATi(rRRQrRKKr；SEQ ID NO：21)的肽序列。然后，用TFA将肽从树脂中切割、在减压下过滤、用冷的醚沉淀，并干燥。粗制的肽经半制备型HPLC纯化，并经ESI-MS表征。
6.2 将肽烷化成顺铂
将5.0μmol顺铂(1.5mg，3.0ml氯化钠缓冲液(pH 5.0)中)溶于2.0ml的10mM Na2HPO4缓冲液(pH 7.4)中，而且，溶液的pH值为7.0。在10mM Na2HPO4缓冲液(pH 7.4)中制备5.0μmol D-TAT-甲硫氨酸肽(或r3-L-TAT-甲硫氨酸肽或r3-L-TATi-甲硫氨酸肽)，溶液的pH值为6.0。然后，通过将两种溶液在黑暗中于室温下混合而开始烷化(混合物的pH值为7.0)。在0小时、1小时、3小时和24小时之后，产物通过分析型RP-HPLC分析，并经ESI-MS表征。期望的峰值溶液最终经半制备型RP-HPLC纯化并被冻干。
7.细胞毒性转运蛋白货物结合分子D-Tat-奥沙利铂、r3-L-TAT-奥沙利铂和 r3-L-TATi-奥沙利铂的合成
Figure BPA00001390404200961
7.1.肽(D-Tat-甲硫氨酸、r3-L-TAT-甲硫氨酸和r3-L-TATi-甲硫氨酸)合成
通过应用Fmoc化学术，在0.23mmol Fmoc-Rink Amide树脂上人工合成D-TAT(rrrqrrkkr；SEQ ID NO：251)、r3-L-TAT(rKKRrQRRr；SEQ ID NO：20)和r3-L-TATi(rRRQrRKKr；SEQ ID NO：21)的肽序列。因而，用Fmoc去保护(DMF中20％哌啶)和氨基酸偶联(DMF活化中的HBTU/HOBt/DIEA)的循环，从C末端Gly到N末端1-Met(L型)的每个氨基酸均被顺序地连接到树脂上。用TFA(在2.5％dH2O、0.5％EDT和2.0％TIS存在的情况下2小时)将肽从树脂中切割，在大气压下过滤，经N2鼓泡缩小体积，用冷的醚沉淀并风干。粗制的肽经半制备型RP-HPLC纯化，并经ESI-MS表征。
7.2.将肽烷化成奥沙利铂
10μmol奥沙利铂在5.0ml 10mM Na2HPO4缓冲液(pH 7.4)中被配制为Eloxatin
Figure BPA00001390404200962
(奥沙利铂4.0mg，一水乳糖36.0mg)。在dH2O 5.0ml中制备10μmolD-Tat-甲硫氨酸肽(或r3-L-TAT-甲硫氨酸肽或r3-L-TATi-甲硫氨酸肽)。通过在室温下混合两种溶液而开始烷化。然后，置于37℃反应，并通过分析型RP-HPLC在214和280nm监测24小时，靶峰经ESI-MS表征，并经半制备型RP-HPLC纯化，接下来冻干。
7.3.测试条件
测定了用渐增浓度的本发明结合分子(D-Tat-奥沙利铂，r3-L-TAT-奥沙利铂或r3-L-TATi-奥沙利铂)的处理对MCF-7(人乳腺腺癌细胞系)和SiHa(人宫颈鳞状细胞癌细胞系)存活的影响。将D-Tat-奥沙利铂、r3-L-TAT-奥沙利铂或r3-L-TATi-奥沙利铂的影响与结合物L-Tat-奥沙利铂相比较，并与两种非结合抗癌药物(奥沙利铂和顺铂)相比较。将每个细胞系的细胞(每孔10'000个细胞)铺到96孔板中(针对MCF-7，200μl总体积的MEM，补充有10％FBS、1％L-谷氨酰胺、1％丙酮酸钠、1％非必需氨基酸，针对SiHa细胞，200μl总体积的MEM/Earle’s，补充有10％FBS、1％丙酮酸钠、1％非必需氨基酸)中。针对每种测试物质检验了6至10种不同的浓度。不处理对照细胞。在用测试物质处理前，将细胞于37℃温育24小时。每项实验重复进行三次。处理后，于37℃进行细胞温育96小时。通过MTT分析测量测试分子对这些细胞系存活(体外细胞毒活性)的影响。将溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS，CHUV)中的20μl 5mg/ml的0.22μm过滤的Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide溶液(MTT，Sigma，编号88415)加入到每个孔，将平板于37℃温育4小时。去掉上清液，用DMSO(每孔200μl)溶解甲簪晶体。在酶标仪中于595nm(Expert Plus Reader，Asys Hitech)测量吸光度(OD)。利用Prism软件计算测试物质的IC50(抑制50％细胞生长的药物浓度)。
8.细胞毒性转运蛋白货物结合分子D-Tat-苯丁酸氮芥、r3-L-TAT-苯丁酸氮芥和 r3-L-TATi-苯丁酸氮芥的合成
Figure BPA00001390404200971
8.1 结合分子(D-Tat-苯丁酸氮芥、r3-L-TAT-苯丁酸氮芥和r3-L-TATi-苯丁酸氮芥)合成
通过应用Fmoc化学术，在0.23mmol Fmoc-Rink Amide树脂上人工合成D-TAT(rrrqrrkkr；SEQ ID NO：251)、r3-L-TAT(rKKRrQRRr；SEQ ID NO：20)和r3-L-TATi(rRRQrRKKr；SEQ ID NO：21)肽序列。因而，用Fmoc去保护(DMF中20％哌啶)和氨基酸偶联(DMF活化中的HBTU/HOBt/DIEA)的循环，将从C末端甘氨酸到N末端1-βA(L型)的每个氨基酸顺序地连接到树脂上。
在N末端I-A的Fmoc去保护(DMF中20％哌啶)之后，利用标准的氨基酸偶联条件(DMF活化中的HBTU/HOBt/DIEA)实现苯丁酸氮芥的偶联。用TFA(在3％dH2O和3％TIS存在的情况下70分钟)将结合分子从树脂中切割，在大气压下过滤，经N2鼓泡缩小体积，用冷的醚沉淀并风干。粗制的结合分子经半制备型RP-HPLC纯化，经ESI-MS表征，接下来冻干。
8.2 比较研究
测定用渐增浓度的D-Tat-苯丁酸氮芥、r3-L-TAT-苯丁酸氮芥或r3-L-TATi-苯丁酸氮芥的处理对MCF-7(人乳腺腺癌细胞系)和SiHa(人宫颈鳞状细胞癌细胞系)存活的影响。将D-Tat-苯丁酸氮芥、r3-L-TAT-苯丁酸氮芥或r3-L-TATi-苯丁酸氮芥的影响进一步与结合物L-Tat-苯丁酸氮芥比较，以及与两种苯丁酸氮芥非结合(nconjugated)抗癌药物(苯丁酸氮芥和顺铂)相比较。将每个细胞系的细胞(每孔10'000个细胞)铺到96孔板中(针对MCF-7，200μl总体积的MEM，补充有1O％FBS、1％L-谷氨酰胺、1％丙酮酸钠、1％非必需氨基酸；针对SiHa细胞，200μl总体积的MEM/Earle’s，补充有10％FBS、1％丙酮酸钠、1％非必需氨基酸)。针对每种测试物质检验了6至10种不同的浓度。不处理对照细胞。在用测试物质处理前，将细胞于37℃温育24小时。处理后，于37℃进行细胞温育96小时。每项实验重复进行三次。在处理后于37℃进行细胞温育96小时。通过MTT分析测量测试分子对这些细胞系存活(体外细胞毒活性)的影响。将溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS，CHUV)中20μl的5mg/ml的0.22μm过滤的Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide溶液(MTT，Sigma，编号88415)加入到每个孔，而且将平板于37℃温育4小时。去掉上清液，并且用DMSO(每孔200μl)溶解甲簪晶体。在酶标仪中于595nm(Expert Plus Reader，Asys Hitech)测量吸光度(OD)。利用Prism软件计算测试物质的IC50(抑制50％细胞生长的药物浓度)。
9.细胞毒性转运蛋白货物结合分子D-Tat-阿霉素、r3-L-TAT-阿霉素和 r3-L-TATi-阿霉素的合成
9.1.结合分子(D-Tat-阿霉素、r3-L-TAT-阿霉素和r3-L-TATi-阿霉素)合成
通过应用Fmoc化学术，在0.23mmol Fmoc-Rink Amide树脂上人工合成D-TAT(rrrqrrkkr；SEQ ID NO：251)、r3-L-TAT(rKKRrQRRr；SEQ ID NO：20)和r3-L-TATi(rRRQrRKKr；SEQ ID NO：21)肽序列。因而，用Fmoc去保护(DMF中20％哌啶)和氨基酸偶联(DMF活化中的HBTU/HOBt/DIEA)的循环，将从C末端Gly到N末端I-E(L型)的每个氨基酸顺序地连接到树脂上。
在N末端I-E的Fmoc去保护(DMF中20％哌啶)之后，完成乙酰化作用(乙酸酐，DMF活化中的DIEA)。用溶于DMF的2％一水合肼进行Odmab侧链保护基团的去除。通过OBt酯(DCM/DMF活化中的DIPCDI/HOBt/DIEA)达到被配制为Adriblastin(盐酸阿霉素18％，NaCl 82％冻干)的苯丁酸氮芥的偶联。
用TFA(在1.7％dH2O和1.7％TIS存在的情况下2小时)将结合分子从树脂中切割，在大气压下过滤，经N2鼓泡缩小体积，用冷的醚沉淀并风干。粗制的结合分子经半制备型RP-HPLC纯化，经ESI-MS表征，接下来被冻干。
10.细胞毒性转运蛋白货物结合分子D-Tat-沙奎那韦、r3-L-TAT-沙奎那韦和 r3-L-TATi-沙奎那韦的合成
Figure BPA00001390404201001
10.1.肽(D-TAT-D-半胱氨酸、r3-L-TAT-D-半胱氨酸和r3-L-TATi-D-半胱氨酸)合成
通过应用Fmoc化学术，在0.40mmol Fmoc-Rink Amide树脂上人工合成D-TAT(rrrqrrkkr；SEQ ID NO：251)、r3-L-TAT(rKKRrQRRr；SEQ ID NO：20)和r3-L-TATi(rRRQrRKKr；SEQ ID NO：21)肽序列。因而，用Fmoc去保护(DMF中20％哌啶)和氨基酸偶联(DMF活化中的TBTU/HOBt/DIEA)的循环，将从C末端D-Arg到N末端D-Cys的每个氨基酸顺序地连接到树脂上。用TFA将肽从树脂中切割，在冰上预冷(在2.5％dH2O、2.5％EDT和1.0％TIS存在的情况下5小时)，在减压下过滤，用冷的醚沉淀并真空干燥。粗制的肽经半制备型RP-HPLC纯化，并经ESI-MS表征。
10.2.沙奎那韦活性酯的制备
将375μmol Boc-Gly-OH于室温下溶于无水DCM，并于0℃向其中加入265μmol DMAP、375μmol DIPCI和110μmol沙奎那韦，配制为Invirase
Figure BPA00001390404201002
(用乳糖和赋形剂压成obducto)。反应混合物可以被加热至室温并搅拌过夜。产物用0.1N HCl洗涤，用MgSO4干燥并在减压下蒸发以产生固体产物SQV-Gly(Boc)。通过在CH2Cl2和TFA(50∶50)混合物中温育SQV-Gly(Boc)酯3小时去除Boc保护基团。产物从冷的醚中重结晶并真空干燥过夜。将47μmol SQV-甘氨酸酯于室温下溶于3ml无水DMSO，并向其中加入94μmol SPDP。在室温不断搅拌下将反应混合物的pH调至8.0。在不断搅拌下，将反应维持3小时。粗制产物SQV-Gly-COCH2CH2-SS-吡啶经半制备型RP-HPLC纯化，并经ESI-MS表征。
10.3.肽D-TAT(rrrqrrkkr；SEQ ID NO：251)、r3-L-TAT(rKKRrQRRr；SEQ ID NO：20)或r3-L-TATi(rRRQrRKKr；SEQ ID NO：21)-D-半胱氨酸与沙奎那韦的结合
将27μmol SQV-Gly-COCH2CH2-SS-吡啶于室温下溶于0.5ml pH 7.5的PBS缓冲液中，并向其中加入0.5ml pH 7.5的PBS缓冲液中的54μmol D-TAT(rrrqrrkkr；SEQ ID NO：251)、r3-L-TAT(rKKRrQRRr；SEQ ID NO：20)或r3-L-TATi(rRRQrRKKr；SEQ ID NO：21)-D-半胱氨酸。将反应在不断搅拌下置于室温3小时。粗制的结合物D-TAT(rrrqrrkkr；SEQ ID NO：251)-沙奎那韦、r3-L-TAT(rKKRrQRRr；SEQ ID NO：20)-沙奎那韦和r3-L-TATi(rRRQrRKKr；SEQ ID NO：21)-沙奎那韦经半制备型RP-HPLC纯化，并经ESI-MS表征。
11.包括JNK抑制剂序列作为货物部分的转运蛋白货物结合分子的制备
11.1.JNK抑制剂序列的识别
通过已知的JBD之间，例如IB1、IB2、c-Jun和ATF2的JBD之间的序列比对识别对与JNK的有效相互作用重要的氨基酸序列，JBD被定义为弱保守的8个氨基酸序列。使用该比对，JNK抑制剂序列能被识别，导致许多合适的JNK抑制剂序列，本文将它们定义为SEQ ID NOs：137至220。
11.2.包括JNK抑制剂序列的转运蛋白货物结合分子的制备
包括以上JNK抑制剂序列的转运蛋白货物结合分子通过共价连接如本文所定义的JNK抑制剂序列的C末端至如上面所定义的根据通式(I)的转运蛋白构建物的N末端而合成。使用经典的Fmock合成方法制备如上面所定义的根据通式(I)的转运蛋白构建物，并进一步通过质谱法对其进行分析。组分最终经HPLC纯化。连接可通过使用由两个脯氨酸残基组成的连接体进行。该连接体能用于允许最大的柔性和防止不需要的二级结构改变。
11.3 细胞死亡的抑制
研究了对JNK生物活性的影响。将构建物以N端连接到绿色荧光蛋白，并评价该构建物对由IL1引起的胰腺β细胞凋亡的影响。先前已显示该凋亡模式被用JBD1-280的转染而阻断，而ERK1/2或p38的特异抑制剂不保护。
将胰岛素产生TC-3细胞在RPMI 1640培养基中培养，该培养基补充有10％胎牛血清、100μg/mL链霉素、100units/mL青霉素和2mM谷氨酰胺。用本发明的转运蛋白货物结合分子转染胰岛素产生TC-3细胞，并向细胞培养基中加入IL-1(10ng/mL)。在加入IL-1之后48小时使用倒置荧光显微镜计数凋亡细胞的数量。通过细胞质的特征性“出泡(blebbing out)”区分凋亡细胞和正常细胞，两天之后计数凋亡细胞。
12.发明的转运蛋白货物结合分子的细胞输入，所述结合分子包括根据SEQ ID  NOs：8至136的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一 个的JNK1或IB1衍生的货物肽
评估了转运蛋白货物结合分子进入细胞的能力，所述结合分子包含根据SEQ IDNOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽。发明的转运蛋白构建物和发明的转运蛋白货物结合分子通过与荧光素连接的甘氨酸残基的N-末端添加而被标记。将这些标记的肽(1μM)加入到TC-3细胞培养物中，其如实施例11所描述的被保持。在预定的时间将细胞用PBS捕获，并在冰冷的甲醇-丙酮(1∶1)中固定5分钟，之后在荧光显微镜下对其进行检测。荧光素标记的BSA(1μM，12摩尔/摩尔BSA)用作对照。
测定来自这些转运蛋白构建物和发明的转运蛋白货物结合分子的荧光信号。
13.发明的转运蛋白货物结合分子对c-JUN、ATF2和Elk1磷酸化的体外抑制， 所述结合分子包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物 和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽
体外研究了本发明的转运蛋白货物结合分子对它们的靶转录因子的JNK介导的磷酸化的影响，所述结合分子包含根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽。重组和非活化的JNK1、JNK2和JNK3通过使用TRANSCRIPTION ANDTRANSLATION兔网织红细胞裂解物试剂盒(Promega)产生并用于利用c-Jun、ATF2和Elk1的固相激酶测定，单独或融合至谷胱甘肽S-转移酶(GST)，作为底物。进行剂量反应研究，其中将发明的转运蛋白货物结合分子与重组JNK1、JNK2或JNK3激酶在反应缓冲液(20mM Tris乙酸盐、1mM EGTA、10mM磷酸对硝基苯酯(p-nitrophenyl-phosphate)(pNPP)、5mM焦磷酸钠、10mM对甘油磷酸盐、1mM二硫苏糖醇)中混合20分钟，所述结合分子包含根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽。然后通过加入10mM MgCl2和5pCi 33P--dATP和1μg GST-Jun(aa1-89)、GST-AFT2(aa 1-96)或GST-ELK1(aa 307-428)启动激酶反应。GST融合蛋白购自Stratagene(La Jolla，CA)。
将10μL谷胱苷肽-琼脂糖小珠也加入到混合物中。反应产物然后在变性10％聚丙烯酰胺凝胶上经SDS-PAGE分离。将凝胶干燥并随后暴露于X射线胶片(Kodak)，并且测定这些发明的转运蛋白货物结合分子对c-JUN、ATF2和Elk1磷酸化的抑制，所述结合分子包含根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽。
14.发明的转运蛋白货物结合分子对IL-1诱导的胰腺β细胞死亡的抑制，所述结 合分子包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据 SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽
测定了本发明的转运蛋白货物结合分子对IL-1引起的细胞凋亡促进的影响，所述结合分子包含根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽。将TC-3细胞培养物与1μM发明的L-TAT-IB1(或多个)肽温育30分钟，之后与10ng/mL IL-1温育。24小时之后进行肽(1μM)的第二次加入。在与IL-1β温育两天之后，通过使用碘化丙锭(染红细胞是死细胞)和Hoechst 33342(染蓝细胞是质膜未受损的细胞)核染色计数凋亡细胞。发明的TAT-IB(或多个)肽的加入抑制在IL-1β存在的情况下培养两天的TC-3细胞的IL-1诱导的凋亡。
通过如上所述——除了细胞与本发明的转运蛋白货物结合分子的温育持续12天外——处理TC-3细胞来检测IL-1诱导的细胞死亡的长期抑制，所述转运蛋白货物结合分子包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽。每天加入另外的肽(1μM)，每两天加入另外的IL-1(10ng/mL)。
15.发明的转运蛋白货物结合分子对辐射诱导的胰腺β细胞死亡的抑制，所述结 合分子包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据 SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽
JNK也通过电离辐射激活。为了确定是否发明的转运蛋白货物结合分子能提供保护避免辐射诱导的JNK损伤，所述结合分子包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽，在D-TAT(SEQ ID NO：251)、L-TAT(SEQ ID NO：18)和发明的转运蛋白货物结合分子存在或不存在的情况下对“WiDr”细胞进行辐射(30Gy)，所述结合分子包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽(辐射前30分钟加入1μM)。不辐射对照细胞(CTRL)。48小时后，如上所述，通过PI和Hoechst 3342染色方法分析细胞。N＝3，SEM被显示。
16.发明的转运蛋白货物结合分子对电离辐射的辐射防护，所述结合分子包括根 据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs： 137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽
为了确定本发明的转运蛋白货物结合分子的辐射防护效果，使用Phillips RT 250R-射线，以0.74Gy/min的剂量率(17mA，0.5mm Cu过滤器)，对C57Bl/6小鼠(2到3月龄)进行辐射，所述结合分子包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽。辐射前30分钟，动物经腹腔注射发明的转运蛋白货物结合分子，所述结合分子包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽。简言之，小鼠被如下辐射：将小鼠置于小塑料盒子中，头部置于该盒子外。将动物的背部放置于辐射体下，并将其颈固定在小的塑料管道中以将其头维持在正确的位置。以铅保护其身体。在辐射前，以标准的团块小鼠饲料(pellet mouose chow)喂养小鼠，但在辐射后，以每天更新的半流体食物喂养小鼠。然后根据Parkins等(Parkins et al，Radiotherapy &Oncology，1：165-173，1983)开发的评分***，由两个独立的观察者对唇粘膜反应进行评分，其中引用红斑状态，以及水肿、脱皮和渗出物的出现。另外，在每次记录它们的红斑/水肿状态之前，对动物进行称重。
17.发明的转运蛋白货物结合分子对JNK转录因子的抑制，货物结合分子所述包 括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID  NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽
用AP-1双重标记的探针(5′-CGC TTG ATG AGT CAG CCG GAA-3′(SEQ ID NO：262)进行凝胶阻滞试验。如所指示的，HeLa细胞核提取物用5ng/ml TNF-α处理一个小时或不处理。TNF-α处理之前30分钟加入TAT和发明的转运蛋白货物结合分子，该结合分子包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽。
18.在永久性MCAO模型中神经保护免遭局灶性脑缺血的评价-测定在不同剂量 的保护功效。
在12天龄的大鼠中诱导局灶性大脑缺血。在诱导室中使用2％异氟烷麻醉大鼠，在操作过程中，在2％异氟烷下使用面具维持麻醉。通过电凝中动脉(MCA)的主干，诱导MCAO。右侧放置小鼠，并在耳和眼之间作斜皮切割。在切除颞肌后，从额缝中去除颅骨，直至颧弓之下的水平。在MCA分叉进入额支和顶支之前，将其显现在鼻腔裂缝上之后正好暴露的左MCA在大脑下静脉处永久地电凝。然后闭合头盖皮肤切口。然后，将大鼠置于培养箱中，保持温度为37℃，直到其苏醒，然后将其转移到其母亲处。
6小时后，腹膜内注射发明的转运蛋白货物结合分子，其包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽。凝固后24小时，使用水合氯醛麻醉大鼠，并通过升主动脉用在PBS中的4％多聚甲醛灌注。然后将脑移出并在相同的固定液中保持2小时，并放置在30％蔗糖梯度的PBS中，于4℃持续约15小时。将脑在异戊烷中(-40℃)冷冻并存储在-20℃。将50μm冷冻切片收集在载玻片上。使用甲酚紫染色该切片。分析每个第十个切片，并使用Neuroleucida程序计算损害的总体积。
19.在短暂MCAO模型中，静脉给药后，本发明的嵌合肽防御局灶性大脑缺血的 神经保护的评估
成年小鼠中短暂的局部缺血。使用雄性ICR-CD1小鼠(6周龄；18-37g；Harlan)；通过将丝从颈外动脉引入到颈内动脉，并进一步向前引入到动脉环，引起局部性缺血，因此闭塞中大脑动脉。通过激光多普勒血流计测量局部的脑血流量，一个探针被固定在头骨上，遍及整个局部缺血直到再灌注10分钟后。测量直肠温度并保持在37℃。再灌注后48小时处死小鼠。使用配备有Neurolucida程序(MicroBrightField)的计算机显微镜***追踪20μm厚的连续的冷冻切片，并使用Neurolucida程序计算(看不见的)局部缺血区域的体积以及整个大脑的体积。在成年小鼠模型中，测定再灌注(30分钟夹紧(clamp))后，安慰剂和发明的转运蛋白货物结合分子推注静脉给药1,3rmg/kg6小时后梗塞的体积大小(mm3)，该结合分子包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽。
20.通过测量NMDA刺激后LDH释放，测定神经元培养物
在姊妹培养基中评估本发明的转运蛋白货物结合分子的神经保护效果，该结合分子包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽，该培养物在连续的暴露于100μM NMDA之前，用指示浓度的肽或MK-801预处理30分钟。NMDA处理12小时后，在用5μM发明的转运蛋白货物结合分子预处理的培养物中，测定由于NMDA暴露导致的变性改变、形态学外观、神经元的数目和分布，该结合分子包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ IDNOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽。
皮质神经元培养。从两天龄大鼠的大脑切下许多小片皮质，将其与200单位的木瓜蛋白酶在34℃温育30分钟，然后将神经元以大约1×106个细胞/板的密度铺到用100μg/ml聚-D-赖氨酸预包被器皿上。铺板培养基由B27/神经基质(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)组成，并补充有0.5mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素。
乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性测定。使用Cytotox96非放射性细胞毒性测定试剂盒(Promega，WI)，测量在NMDA给予之后12、24和48小时释放到浸浴培养基中的LDH。
21.使用一体化方法(all-in one well approach)抑制HepG2细胞中内源JNK活性
实验前一天将HepG2细胞以3'000个细胞/孔接种。然后将渐增浓度的白细胞介素-1[IL-1β]或肿瘤坏死因子α[TNFα]加到激活的JNK中30分钟。使细胞在20mMHepes、0.5％Tween pH 7.4中裂解并处理用于AlphaScreen JNK。(b)通过10ng/mlIL-1β诱导针对JNK活性的Z’，并在384孔/板(n＝96)中对其进行测量。(c)使用化学JNK抑制剂，抑制内源性IL-1β诱导的JNK活性[星形孢菌素和SP600125]。(d)发明的包括根据SEQ ID NOs：8至136的TAT衍生的转运蛋白构建物的转运蛋白货物结合分子和肽抑制剂L-TAT-IB1(或多个)对IL-1α依赖的JNK活性的影响。
方法：AlphaScreen激酶测定
原理：AlphaScreen是一种非放射的基于小珠的技术，其用于在微孔板格式中研究生物分子的相互作用。缩写词ALPHA代表扩大的发光邻近同源测定(AmplifiedLuminescence Proximity Homogenous Assay)。它包括生物相互作用，该相互作用使得“供体”和“受体”珠非常接近，然后级联化学反应起作用以产生放大的信号。在680nm激光激发之后，“供体”小珠中的光敏剂(酞菁染料)将周围的氧转换成激发的单线态。在其4μsec的半衰期内，单线态氧分子能在溶液中扩散直到大约200nm，并且如果受体小珠在其邻近内，单线态氧与“受体”小珠中的二甲基噻吩衍生物反应，在370nm产生化学发光，其进一步激活包含在同一“受体”小珠中的荧光团。随后，该激发的荧光团在520-620nm发出光。在缺少受体小珠时，单线态氧回到基态，没有信号产生。
首先将激酶试剂(B-GST-cJun、抗P-cJun抗体和活性JNK3)在激酶缓冲液(20mMTris-HCl pH 7.6，10mM MgCl2，1mM DTT，100μM Na3VO4，0.01％Tween-20)中稀释，并将其添加到孔中(15μl)。然后，将反应在10μM ATP存在的情况下在23℃温育1小时。通过添加10μl小珠混合物(蛋白A受体20μg/ml和链霉抗生物素受体20μg/ml)进行检测，该混合物是在检测缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.4，20mM NaCl，80mM EDTA，0.3％BSA)中被稀释；之后在黑暗中在23℃再次进行1小时温育。为了测量JNK内源活性，如上所述的进行激酶测定，除了用细胞裂解物取代有活性的JNK3；在细胞裂解后，添加反应激酶组分。以相同的浓度使用B-GST-cjun和P-cJun抗体，而以50μM而不是10μM使用ATP。在Fusion或En Vision仪器上直接分析AlphaScreen信号。
22.噪声损伤的治疗
要么在噪声损伤(120dB，6kHz，持续30分钟)前30分钟，要么在噪声损伤后30分钟或4小时，以100μM的浓度将2微升2.6％缓冲透明质酸的凝胶制剂(Hylumed，Genzyme Corp.)中将发明的转运蛋白货物结合分子——包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽——施用于3组豚鼠(每组6只豚鼠)的耳蜗圆窗膜。未治疗的耳朵作为对照。在噪声损伤后20分钟(暂时性阈值移位，TTS)以及损伤后15天(永久性阈值移位，PTS)，通过听性脑干反应测量来评估听觉域值移位。与未治疗的耳朵相比，即使在暴露于过度噪声后，给予D-TAT-IB1(或多个)也会保护避免永久性的听力丧失。
23.发明的转运蛋白货物结合分子在治疗结肠炎中的治疗活性的评估，所述结合 分子包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据 SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽
a)试验***：
i)物种/品系：小鼠/BALB/c
ii)来源：Harlan Israel，Ltd.
iii)性别：雌性
iv)动物总数：n＝150
v)年龄：年轻的成年动物，在开始研究时7周龄
vi)体重：在开始治疗时动物的体重变化不超过平均体重的±20％。
vii)动物健康：在到达时检查该研究中使用的动物的健康状况，仅使健康状况良好的动物适应实验室条件(至少七天)并用于研究中。
viii)随机选择：根据随机数字表，将动物随机分到实验组。
ix)结束：在研究结束时，存活的动物通过颈脱位法被实施安乐死。
b)试验程序
通过给予溶于50％乙醇的TNBS诱发结肠炎。
然后，用0.1至1000μg/kg剂量的发明的转运蛋白货物结合分子作为单剂量或重复的每日剂量(参见以上)经腹腔内或者经皮下处理所有动物，所述结合分子包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID Nos：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽。
c)观察与检查
i)临床征象
在以上试验的整个期间，进行了仔细的临床检查并对其进行了记录。观察包括外观变化例如皮肤、皮毛、眼睛、粘膜的变化，分泌物和***物(例如，腹泻)的发生，和自主性活动。同样注意步态、体态和对处理的反应的变化，以及奇特行为、震颤、抽搐、睡眠和昏迷的存在。
ii)体重
每日进行动物个体体重的测定。
iii)结肠炎的临床评估
每日都记录体重、粪便稠度和经直肠的出血并将其作为疾病严重性评分的参数：
Figure BPA00001390404201081
Figure BPA00001390404201091
iv)结肠的总病理学
在实验的最后一天，动物被实施安乐死，并且移取结肠用于根据以下评分进行总病理学评估：
Figure BPA00001390404201092
24.测定发明的转运蛋白货物结合分子在治疗病毒感染-水痘带状疱疹病毒(VZV)中的活性，该结合分子包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽
测定培养的宿主细胞(人***成纤维细胞(HFFs))中发明的转运蛋白货物结合分子的活性，该结合分子包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽。病毒是专性的细胞内寄生物，其需要有功能的细胞环境以完成它们的生命周期；濒死的细胞不支持病毒复制。另外，细胞功能的抑制剂可对细胞有毒，这能非特异地阻止病毒生长。因此，有病的或濒死的宿主细胞能显示非特异地降低病毒滴度。由于这可曲解结果，所以首先进行细胞毒性试验，测定培养的细胞对测试化合物的耐受。随后，进行菌斑减少试验，然后在感染的细胞中就水痘带状疱疹病毒(VZV)检测发明的转运蛋白货物结合分子的活性，该结合分子包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽。
A)测定发明的转运蛋白货物结合分子的细胞毒性，该结合分子包括根据SEQ IDNOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽：
为了测定细胞毒性，将培养的细胞(人***成纤维细胞(HFFs))接种到96孔组织培养板中。将含有DMSO(与5μM发明的转运蛋白货物结合分子相同的水平，该结合分子包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽)的培养基以几个浓度(1、2和5μM)加入，持续24h。随后，进行中性红试验。针对细胞毒性试验的中性红比色测定(6次重复)用于设置针对随后的效能试验的最大剂量(如Taylor et al，2004，J.Virology，78：2853-2862中所进行的)。活细胞吸收中性红，因此，吸收的水平是细胞生存和数目的定量测量。中性红摄取与细胞数目直接成比例，还反映正常的胞吞作用。因此，在0或24小时将简短脉冲的中性红加入到培养基中。固定和提取之后，加入染料并在ELISA酶标仪上在540nm测量每个样品中染料的量。
B)菌斑减少试验，以评价发明的转运蛋白货物结合分子对水痘带状疱疹病毒(VZV)的抗病毒作用，该结合分子包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽：
为了测定是否发明的转运蛋白货物结合分子显示剂量依赖的抗病毒作用，测试标准的1μM剂量周围的浓度范围，所述结合分子包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽。在该菌斑减少试验中，将24孔板中汇合的人***成纤维细胞(HFFs)用VZV感染的HFFs以1∶100的比率(多重感染MOI＝0.01)接种并吸附到细胞上持续2小时。将过量的病毒洗掉，加入含有0(只有DMSO)、0.5、1或2发明的转运蛋白货物结合分子的培养基，该结合分子包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽。这时取一个样品以测量感染的起始水平；其中每孔含有～150pfu。24小时之后，将复孔接受胰蛋白酶作用，然后将细胞悬液滴定在MeWo细胞单层上重复三次以测定每个样品中VZV感染细胞的数量。在无限制的生长期间，VZV通常1天增加10倍，因为它通过细胞-细胞传播增殖。这是对单独用DMSO处理的培养物所观察到的，其产生1200±430pfu。测定细胞毒性和效能数据。根据这些数据，计算初步的选择指数(Tox/EC50)5.0μM/0.3μM。
C)测量具有发明的转运蛋白货物结合分子的人***成纤维细胞(HFFs)中水痘带状疱疹病毒(VZV)复制，该结合分子包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽：
为了测定阻止人***成纤维细胞(HFFs)中水痘带状疱疹病毒(VZV)复制的发明的转运蛋白货物结合分子的最小有效剂量——该结合分子包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽，将汇合的单层HFFs用VZV-BAC-Luc株接种2h，然后用发明的转运蛋白货物结合分子以0.25、0.5或1.0μM的浓度，或用阴性对照(DAK，1.0μM)处理24h，该结合分子包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽。用萤光素酶分析来测量病毒产量。样品重复三次(一式三份)，显示平均的发光；误差棒代表平均值的标准偏差。
25.测定发明的转运蛋白货物结合分子在治疗慢性阻塞性肺疾病(COPD)中的活性，该结合分子包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽
为了测定示范性发明的转运蛋白货物结合分子在治疗慢性阻塞性肺疾病(COPD)中的活性，在博来霉素诱发的急性肺部炎症和纤维化的动物模型中使用这些发明的转运蛋白货物结合分子，所述结合分子包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽。博来霉素诱发的炎症和纤维化的方案之前已经在文献中被描述。该试验的目的是通过皮下(s.c.)途径研究这些发明的转运蛋白货物结合分子对在博来霉素诱发的炎症和纤维化中支气管肺泡灌洗(BAL)和肺中的嗜中性粒细胞募集的作用：
-在第一天单次给予博来霉素(10mg/kg)之后
-和在第十天伴随纤维化的发展
1)方法和实验步骤
皮下给予选自发明的转运蛋白货物结合分子的测试化合物两次剂量以及赋形剂对照，同时单次鼻腔内给予博来霉素，并在第一天和第十天后对小鼠进行分析，所述结合分子包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽。模型中使用的动物为每组10只C57BL/6小鼠(8周龄)。实验组包括赋形剂、0.001mg/kg发明的转运蛋白货物结合分子和0.1mg/kg这些发明的转运蛋白货物结合分子，并且治疗由在每三天给予博来霉素之前重复皮下给予这些发明的转运蛋白货物结合分子组成，所述结合分子包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽。通过BAL灌洗、细胞学、细胞计数和肺髓过氧化物酶活性监测24小时的急性肺部炎症。将化合物的作用与赋形剂对照作比较。在第十天单剂量的博来霉素之后，利用苏木精和曙红染色从组织学上评估肺纤维化。
1.1)博来霉素给予
在轻微***-甲苯噻嗪(ketamine-xylasine)麻醉下，通过鼻内滴注将40μL体积的来自Bellon Laboratories(Montrouge，France)的盐水中的硫酸博来霉素(10mg/kg体重)或盐水经过导气管给予。针对博来霉素诱发的炎症和纤维化的用于博来霉素给予的组包括：赋形剂、0.001mg/kg本发明的转运蛋白货物结合分子和0.1mg/kg这些发明的转运蛋白货物结合分子，所述结合分子包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽。针对博来霉素诱发的炎症的途径为皮下(s.c.)途径，而给药作为单剂量出现。针对博来霉素诱发的纤维化的途径为皮下的(s.c.)途径，而在10天中出现3次给药。
1.2)支气管肺泡灌洗液(BALF)
在气管切开后，将塑料插管***，并用0.3ml的PBS溶液洗涤空域，加热至37℃。将收集的样品分成2部分：第一部分(1ml，相当于两个第一次灌洗)用于介质测量，并且第二部分用于细胞测定(4ml)。将第一部分离心(600g，10min)，而且分馏上清液并保存于-80℃直到介质测定。然后，将细胞团块(cell pellet)重新悬浮于0.4ml无菌NaCl——0,9％中，而且与第二部分汇集并用于细胞计数。
1.3)肺均质化
在BAL之后，将整个肺移取并与1ml的PBS一起置于微管(microtube)(Lysingmatrix D，Q Bio Gene，Illkrich，France)中，利用Fastprep
Figure BPA00001390404201121
***(FP120，Q Bio Gene，Illkrich，France)制备全部肺组织提取物，然后，在介质测量以及用Sircol CollagenAssay(France Biochem Division，France)进行胶原分析前将提取物离心，并将上清液储存于-80℃。
1.4)细胞计数和测定
利用Malassez血球计数器测定BAL液中的总细胞计数。在用MGGDiff-quick(Dade Behring AG)染色后，在细胞离心涂片机(cytospin)制备物(Cytospin 3，Thermo Shandon)上进行分化细胞计数。利用标准形态学标准对200个细胞进行分化细胞计数。
1.5)TNF测量
利用ELISA分析试剂盒(Mouse DuoSet，R&D system，Minneapolis，USA)，根据生产商指示测定TNF在BALF中的水平。结果报告为pg/ml。
1.6)MPO-测量
在给予发明的转运蛋白货物结合分子之后测量MPO-水平，所述货物结合分子包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽。
1.7)组织学
在BAL和肺灌注之后，大的叶被固定于4％缓冲甲醛，用于标准显微镜分析。3-m切片用苏木精和曙红(H&E)染色。
26.测定发明的转运蛋白货物结合分子在治疗阿耳茨海默病中的活性，该结合分子包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽
为了测定示范性发明的转运蛋白货物结合分子在阿耳茨海默病中的活性，利用Morris Water Maze行为检验以及测量菌斑载荷(plaque load)的免疫组织学检验和测量小鼠脑中β-淀粉状蛋白1-40和β-淀粉状蛋白1-42水平的ELISA检验，在hAPP-转基因小鼠模型中评估这些肽，所述小鼠模型过量表达APP751，具有London和Swedish突变，所述结合分子包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽。
a)方法
i)介绍
该研究旨在利用5月(±2周)龄的雌性hAPP Tg小鼠评估本发明的转运蛋白货物结合分子对行为标签、生物化学标签和组织学标签的功效，所述结合分子包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽。因此，每两或三周对小鼠进行治疗，直到4个月，并在治疗阶段结束时，在Morris WaterMaze中评估行为。在处死的脑中收集CSF和血液。在四个不同的脑均浆部分以及Tg小鼠的CSF中测定Aβ40和Aβ42水平。在每治疗组8只Tg动物的皮质和海马中量化菌斑载荷。
ii)动物
具有C57BL/6×DBA背景和5月(±2周)龄的雌性Tg小鼠被随机分配到治疗组1至3(n＝12)。在5月龄时，动物开始进行两种不同浓度的赋形剂或发明的转运蛋白货物结合分子的给予，每隔一周或两周皮下(s.c.)施用，一直持续4个月，所述结合分子包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽。用于该研究的所有动物都具有黑色的眼睛，并有可能察觉到MWM池外面的地标。然而，在针对所有动物包括研究中圈起的储备动物进行治疗之前，必须排除动物的视觉能力差，这是在可见平台训练——所谓的预试验中控制的。一旦已经确认特殊动物的视觉障碍，该小鼠会被从研究中排除。
iii)动物识别和存养
通过耳标逐个识别小鼠。它们被存养在由Rettenmaier
Figure BPA00001390404201141
提供的标准啮齿动物垫料上的单个通风笼(IVCs)中。每个笼最多装5只小鼠。根据基于国际标准写成的JSW Standard Operating Procedures(SOP GEN011)饲养小鼠。通过指示动物的研究号、性别、个体登记号(IRN)、出生日期以及筛选日期和治疗组分配的彩色卡片识别每个笼。研究期间的温度被维持在大约24℃，而相对湿度被维持在大约40-70％。动物在恒定光周期(12小时光照/黑暗)中存养。动物可随意用正常的自来水。
iv)治疗
以两种不同剂量(n＝12/组)，每两周用0.1mg/kg b.w.或每三周用10mg/kgb.w.本发明转运蛋白货物结合分子，或者每三周1次用赋形剂(n＝12)s.c.治疗四十只雌性hAPP转基因小鼠，超过四个月，所述结合分子包括根据SEQ IDNOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽。
v)Morris水迷宫(MWM)
Morris Water Maze(MWM)任务在直径为100cm的黑色圆形池中进行。以自来水注满，温度为22±1℃，并且，池事实上被分为四部分。在水表面下约0.5cm处放置透明的平台(8cm直径)。除了预试验，在整个测试期间，平台被位于池的西南象限。在4天的持续训练期间之前的某天，必须对动物进行所谓的“预试验”(两个60秒的持续试验)，以确保每只动物的视觉能力均正常。只有完成该任务的动物才能圈养进行MWM测试。在MWM任务中，每只小鼠必须连续四天进行3项试验。单项试验最多持续最多1分钟。在该时间期间，小鼠有机会寻找隐藏的、透明的目标。如果动物不能找到从水中出来的“路”，研究者将小鼠引导到或放到平台上。在每项试验之后，允许小鼠在平台上休息10-15秒。在该时间期间，小鼠有可能在环境中定位。在暗淡的光条件下进行研究，以防止跟踪***受到负面影响(Kaminski；PCS，Biomedical Research Systems)。在环绕池的壁上，固定有具有黑色、粗体几何符号(例如，圆形或方形)的装饰画，小鼠可以利用其符号作为它们定位的路标。每次试验每个游泳组由5至6只小鼠组成，以确保试验之间的时间为约5至10分钟。对于逃避潜伏期(时间[秒]——小鼠寻找隐藏的平台并因而从水中逃脱所需要的)、路径(到达目标的道路的长度[米])以及在目标象限逗留的量化，使用了计算机化的跟踪***。计算机被连接到置于池中央上方的照相机上。照相机检测用小发夹固定在小鼠尾巴上的发光二极管(LED)的信号。在第四天最后一项试验1小时后，小鼠必须完成所谓的探索试验。这时以及在1分钟的探索试验期间，平台被从池中移走；试验者计数穿过以前的目标位置的数目。另外，计算在该象限以及其它三个其他象限中的留守。在该试验中，小鼠不能从平台得到任何、无论何种性质的线索。
vi)组织取样
在治疗阶段结束时，并在所有行为测试之后，所有剩下的小鼠(n＝28)均被处死。因此，通过如SOP MET030中所述的标准吸入麻醉(Isofluran，Baxter)，使所有的小鼠镇静。通过钝性分离以及暴露枕大孔(foramen magnum)获得脑脊髓液(CSF)。在暴露时，巴斯德(Pasteur)吸管被***到枕大孔中约0.3-1mm深处。通过吸入和毛细管作用收集CSF，直到溢满为止。立即冷冻每个样品的两等份并保存于-80℃直到准备用ELISA技术进行进一步分析。在CSF取样后，每只小鼠被屈膝背卧放置，胸腔被打开，并且，连接到1cc注射器的26号针被***到右心脏心室腔。小的吸力被应用到针上，并且血液被收集到EDTA中，并从而用于获得血浆。为了得到血浆，利用具有转斗的转子(GH-3.8Beckman)将来自每只小鼠的血样在离心机(GS-6R Beckman)中以1,750rpm(700g)旋转10分钟。将血浆冰冻并于-20℃储存直到进行进一步分析。在血液取样后，转基因小鼠被心脏内灌注0.9％的氯化钠。脑被迅速去掉，小脑被切掉。所有小鼠的右脑半球均于室温下被浸固在新制作的4％的多聚甲醛/PBS(pH 7.4)中1小时。此后，脑被转移到15％的蔗糖PBS溶液中24小时，以确保低温保护。在次日，脑被冰冻于异戊烷中并于-80℃储存直到用于进行组织学研究(SOP MET042)。左脑半球被称重并冰冻于液氮中以及储存于-80℃，以进行生物化学分析。
vii)Aβ1-40和Aβ1-42的测定
在每只Tg小鼠的四个不同的脑均浆部分中，以及在CSF样品中，用ELISA技术评估Aβ1-40和Aβ1-42水平。高敏感性Aβ1-40和Aβ1-42 ELISA测试试剂盒购买自The Genetics CompanyTM，Switzerland(SOP MET058)。如上所述地制备CSF。对于脑均浆，冰冻脑半球在含有蛋白酶抑制剂混合物的TRIS缓冲盐水(TBS)-缓冲液(5ml)中被搅匀。1.25ml的这种初始脑TBS均浆被储存于-80℃，1.25ml已经被用于进一步研究。剩余的脑均浆(2.5ml)被离心，而且产生的上清液(＝TBS部分)被等分并保存于-20℃直到进行ELISA测定。团块被悬浮于Triton X-100(2.5ml)中，离心并等分上清液(＝Triton X-100部分)以及保存于-20℃。用SDS(2.5ml)重复这些步骤。在随后的离心之前，SDS部分中的团块被悬浮于70％甲酸(0.5ml)。获得的上清液用1M TRIS(9.5ml)中和，等分并保存于-20℃(＝FA部分)。四个脑均浆部分(TBS、Triton X-100、SDS和FA)的样品被用于以ELISA技术测定Aβ1-40和Aβ1-42。ELISA测试试剂盒购买自The Genetics CompanyTM，Switzerland(SOP MET062)。可以假定，TBS和Triton X-100使单体结构溶于寡聚结构中。聚合物如前原纤维和水不溶性原纤维可以溶于SDS和FA中。在这一方面，所有四个部分的研究还提供对Aβ聚合状态的洞察力。
viii)脑形态学的评价
以完全相同的方式处理所有研究的Tg动物的脑组织，以避免由于该程序变化造成的偏差。来自24只Tg小鼠(每组8只)的脑的一半的每层20片冰冻切片(一共5层)——每片10μm厚(Leica CM 3050S)被矢形地切割，并且5片(每层一片)被处理并评估，以量化菌斑载荷。5层矢形层对应于根据Paxinos和Franklin的形态学图集(atlas)“小鼠脑(The Mouse Brain)”(第二版)的图104至105、107至108、111至112、115至116和118至119。第一层按照要求指定包括带有其区域CA1、CA2、CA3、GDlb和GDmb的整个海马。利用单克隆人Aβ-特异性抗体6E10(Signet)以及ThioflavinS染色，在海马和皮质中定量评估免疫反应性。剩下的未被利用的脑半球或组织被保留并储存于JSW CNS直到该项目结束。
b)评价
i)行为
针对每只Tg动物，用特殊计算机软件测量Morris Water Maze试验中游泳路径的长度，逃避潜伏期、游泳速度，以及探索试验中穿过前平台位置以及花费在池的每个象限中的时间。
ii)生物化学评价
用商业上可购买的Aβ1-40和Aβ1-42 ELISAs，分析来自所有Tg小鼠的CSF样品和来自脑标本的样品。同时进行适当标准的测量。来自脑制备物的样品被重复分析2次。由于小的样品量，仅在单次测量中分析CSF样品。
iii)组织学
i1)淀粉状蛋白沉积和菌斑载荷测量
针对6E10免疫组织化学，利用了以下评估程序：
aa)对比图像以使切片边界可视，而不对图像应用对比度。
bb)皮质轮廓的交互描绘和皮质面积(＝区域面积)的以下测量。
cc)感兴趣区域(AOI)的交互描绘，其中染色的目标被检测到超过基于一定强度的阈值水平(对每个图像都相同)并高于8μm2大小。
dd)在平滑对比(smooth contrasting)以增强信噪比(对每个图像都相同)后，测量每个目标的面积，AOI中的总染色面积，以及目标数。
ee)针对海马重复aa)-dd)。
ff)计算平均菌斑大小(＝“菌斑总面积/菌斑数”)，相对菌斑数和面积(＝“菌斑数/区域面积”和“菌斑总面积/区域面积*100”)。
gg)自动数据被输出到Excel电子表格(Excel spread sheet)中，其包括参数“图像名称、区域面积、菌斑数、总菌斑面积、相对菌斑数、相对菌斑面积和平均菌斑大小。备注区域被用于分别记录图象质量和排除标准。排除标准为：缺少部分的切片、许多褶皱、主要缺陷或染色不一致(例如，由于膨胀，其会阻碍封闭剂的充分反应)。
hh)关闭图像而不保存(以保持原始数据未处理)。
27.测定发明的转运蛋白货物结合分子在治疗二型糖尿病中的活性，该结合分子包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽
目的是测定发明的转运蛋白货物结合分子在治疗二型糖尿病中的活性，尤其是通过每三天(28天)评估空腹血糖水平，测定用这些发明的转运蛋白货物结合分子在二型糖尿病db/db小鼠模型中长期治疗的作用，所述结合分子包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽。
a)材料和方法
i)动物
从Charles River(Germany)得到共计二十(20)只雄性db/db小鼠(8周龄大)。除非另有说明，到达之后，将动物按组存养(n＝6-7/组)并提供标准的啮齿动物饲料(Altromin standard #1324 chow；C.Petersen，Ringsted，Denmark)，而且水随意。
将小鼠在12∶12 L/D周期(在4:00开启光照，而在16:00关闭光照)下并在温度和湿度受控制的室内存养。
ii)组和随机化
在第四天，根据血糖水平(禁食；在Biosen S线分析仪(Biosen S lineanalyzer)(EKF diagnostic，Germany)上测量血糖)将小鼠随机化，以参与到以下药物治疗组中的一个(n＝6)：
1)赋形剂对照，S.C.(生理盐水)
2)发明的转运蛋白货物结合分子，所述结合分子包括根据SEQ IDNOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽；1mg/kg；皮下
3)发明的转运蛋白货物结合分子，所述结合分子包括根据SEQ IDNOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽；10mg/kg；皮下
所有列出的剂量均针对游离碱计算。药物纯度：95.28％，肽含量：78.0％。所有化合物均以3ml/kg的体积皮下(s.c.)给予。赋形剂对照和发明的转运蛋白货物结合分子——包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽——的配制说明如下：
首先，将发明的转运蛋白货物结合分子溶于赋形剂，所述结合分子包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽。根据以下详述的程序制备制剂(浓度为0.33和3.3mg/ml，其分别对应于1和10mg/kg的剂量)。计算并表示浓度，其考虑检验项目纯度和肽含量(放大系数为1.346)。
■储备液制备：将冻干的发明的转运蛋白货物结合分子解冻，持续最少1小时，并将其制备为溶于赋形剂的1mM储备液，所述结合分子包括根据SEQ ID NOs：8至136任何一个的TAT衍生的转运蛋白构建物和根据SEQ ID NOs：137至220任何一个的JNK1或IB1衍生的货物肽。针对每个治疗日制备等份试样并储存于大约-80℃。在每个治疗日将该储备液稀释至需要的浓度；在每个治疗日进行将该储备液稀释成要求的浓度。
■储备液的储存：在大约-80℃；
■稀释的制备品的储存：在室温下最多24小时。
在溶解前，粉末储存于-20℃。在大约-80℃下，储备液的稳定性为3个月；在室温下，用于动物剂量给药的稀释的制剂的稳定性为24小时。如果保存于4-8℃，未使用的稀释的物质可以被储存多达7天。
c)试验过程
在环境适应8天之后，按照概述的组，小鼠每日在光于04.00PM消失之前8小时，于08.00AM经SC剂量给药接受治疗，持续21天。
i)血糖
在剂量给药后6小时，通过从尾静脉收集10μl血样于红细胞压积测定管中而从7小时禁食的动物测量血糖，随后在Biosen s线分析仪(EKF-diagnostic；Germany)上进行分析。
ii)代谢笼
组1+3：将小鼠置于代谢笼中，用于记录24小时食物和水摄入以及24小时尿和粪便产生。将小鼠分层成n＝6-7的两个亚组，随后进行代谢表征。
iii)脂肪因子(adipokine)组(panel)
组1+3：利用涂EDTA的红细胞压积测定管(100μl)三次(第57、66和108研究日)从尾静脉收集血液。在血液离心之后，收集血浆并储存于-20℃直到测量。然后，利用基于Luminex的7丛，测定脂肪因子/细胞因子的以下组：瘦蛋白、抵抗素、MCP-1、PAI-1、TNFα、胰岛素和白细胞介素-6(IL-6)。
iv)结束
组1+3(第111天)：以下器官被切离并称重：腹股沟皮下脂肪、附睾脂肪、腹膜后脂肪、脑、肝、肾、脾脏和心脏。上述所有器官均为4％PFA中的样品，用于未来可能的组织病理学检查。同样，胰(全部)被取样，用于可能的立体学和免疫组织化学分析，而且，眼睛被取样，用于稍后可能的视网膜病分析。第2组(第28天)：不采集组织或血浆。
28.TAT衍生物靶向人白细胞群
在红血细胞裂解后，从全血中获取初级人白细胞(WBC)。将WBC与1μM D-TAT(SEQ ID NO：251)-FITC或r3-L-TAT(SEQ ID NO：20)-FITC于37℃温育30分钟，在酸性缓冲液中洗涤，并用针对细胞类型特异性表面标记(CD14针对单核细胞，CD15针对多形核白细胞，CD3针对淋巴细胞T，CD19针对淋巴细胞B)的荧光抗体染色。最终通过流式细胞术分析含D-TAT-FITC和r3-L-TAT-FITC的细胞，以测量其各自的转运蛋白含量。两种TAT衍生物均靶向人白细胞群。dTAT和r3LTAT结合到单核细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞T细胞，并效率较低地结合到淋巴细胞B细胞。dTAT和r3-L-TAT特异性之间存在较小的差异，D-TAT似乎比r3-L-TAT更有效地与淋巴细胞T结合。
29.不同的细胞类型摄取选择的根据本发明的转运蛋白构建物
将细胞以亚汇合的密度(其可以依使用的细胞类型而变化)铺于聚-D-赖氨酸预包被的96孔板中。然后，将FITC偶联的转运蛋白于3μM与细胞一起温育15小时。在此之后，将细胞保存于冰上，用于其它步骤。为了去掉细胞表面结合的肽，首先用酸洗液洗涤细胞两次，以去掉质膜结合的分子。随后，将细胞用PBS洗涤两次，并在标准裂解缓冲液中裂解30分钟。然后，将含有细胞溶解产物的板于4℃，1500rpm离心5分钟。然后收集澄清的上清液，并将其转移到黑色的96孔板中，用于测量细胞内FITC荧光。以下细胞被使用：
非白细胞细胞系：HepG2：肝癌细胞(人)
                A549：肺上皮细胞(人)
白细胞细胞系：原状的：巨噬细胞(小鼠)
              J77：巨噬细胞(小鼠)
初始纯化的白细胞：BMDM：骨髓衍生的巨噬细胞(小鼠)
结果表示为D-TAT(SEQ ID NO：251)(图17)或r3-L-TAT(SEQ ID NO：20)(图18)摄取的百分比。所有的转运蛋白构建物在各自细胞中均显示摄取，虽然速率不同。
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Claims (26)

1.转运蛋白构建物，其包括通式(I)(SEQ ID NO：1)的至少一个序列：
DlLLLxDm(LLLyDn)a
其中：D是D-氨基酸；
L是L-氨基酸；
a是0-3；
l、m和n相互独立地是1或2；
x和y相互独立地是0、1或2。
2.根据权利要求1的转运蛋白构建物，其中所述转运蛋白构建物包括根据以下子式(Ia)至(Id)(SEQ ID NOs：2至5)之一的至少一个序列：
(Ia)：DlLLLxDm；
(Ib)：DlLLLxDmLLLyDn；
(Ic)：DlLLLxDmLLLyDnLLLyDn；或
(Id)：DlLLLxDmLLLyDnLLLyDnLLLyDn。
3.根据权利要求1或2的转运蛋白构建物，其中所述转运蛋白构建物包括根据以下子式(Ie)(SEQ ID NO：6)的至少一个序列：
DLLLD(LLLD)a。
4.根据权利要求1、2或3中任一项的转运蛋白构建物，其中所述转运蛋白构建物包括根据以下子式(If)(SEQ ID NO：7)的至少一个序列：
DLLLDLLLD。
5.根据权利要求1-4中任一项的转运蛋白构建物，其中将根据通式(I)或根据任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的所述序列与运输序列一起使用，或应用于运输序列，所述运输序列衍生自HIV-1 TAT蛋白(SEQ ID NO：8)；优选衍生自含有HIV-1TAT蛋白(SEQ ID NO：8)的TAT残基48-57或49至57的氨基酸序列；或衍生自HSVVP22(单纯疱疹(Herpes simplex))；或衍生自触角足载体序列(果蝇属触角足(Drosophila antennapedia))、FGF、乳铁蛋白；或衍生自碱性的肽，该肽的长度为5至15个氨基酸，优选地10至12个氨基酸，并包括至少80％，更优选地85％或甚至90％的选自精氨酸、赖氨酸和/或组氨酸的碱性氨基酸，或可选自富含精氨酸的肽序列，包括R9、R8、R7、R6、R5；衍生自VP22；衍生自PTD-4衍生的蛋白或肽；衍生自RGD-K16；衍生自PEPT1/2或PEPT1/2衍生的蛋白或肽；衍生自SynB3或SynB3衍生的蛋白或肽；衍生自PC抑制剂；衍生自P21衍生的蛋白或肽；衍生自JNKI衍生的蛋白或肽；或衍生自这些运输序列之一的变体、片段和衍生物。
6.根据权利要求1至5中任一项的转运蛋白构建物，其中将根据通式(I)或根据任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的所述序列与以下序列之一或其反向序列或这些序列的变体或片段一起使用，或应用于下序列之一或其反向序列或这些序列的变体或片段：
Figure FPA00001390404100021
Figure FPA00001390404100031
Figure FPA00001390404100041
Figure FPA00001390404100051
7.根据权利要求1至6中任一项的转运蛋白构建物，其中所述转运蛋白构建物包括根据rXXXrXXXr(SEQ ID NO：252)的至少一个序列，其中：
R代表D-对映体精氨酸；
X是任何L-氨基酸；
其中每个X可单独地并独立于SEQ ID NO：252内的任何其它X而选择。
8.根据权利要求8的转运蛋白构建物，其中所述6个X L-氨基酸的至少4个单独地选自由K或R组成的L氨基酸。
9.根据权利要求1至8中任一项的转运蛋白构建物，其中所述转运蛋白构建物包括所述子式(If)DLLLDLLLD(SEQ ID NO：7)，并且其中所述转运蛋白序列选自以下序列：
Figure FPA00001390404100061
Figure FPA00001390404100071
Figure FPA00001390404100081
Figure FPA00001390404100091
10.根据权利要求1至9中任一项的转运蛋白构建物，其中所述转运蛋白构建物包括所述子式(If)DLLLDLLLD(SEQ ID NO：7)，并且其中将所述转运蛋白序列与运输序列一起使用或应用于运输序列，所述运输序列衍生自HIV-1 TAT蛋白，在所述TAT衍生的序列的位置2具有酪氨酸(Y)，所述序列优选地选自序列TAT(s2-91)(SEQID NO：116)。
11.根据权利要求5至10中任一项的转运蛋白构建物，其中将根据通式(I)或根据任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的所述转运蛋白序列与权利要求5至10中列出的任何所述运输序列的变体或片段一起使用或应用于权利要求5至10中列出的任何所述运输序列的变体或片段，其具有权利要求5至10中列出的任何所述运输序列全长的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或85％，优选地至少90％，更优选地至少95％和最优选地至少99％。
12.转运蛋白货物结合分子，其包括
a)组分(A)，其中组分(A)包括根据权利要求1至11任一项的所述转运蛋白构建物；和
b)组分(B)，其包括效应分子。
13.根据权利要求12的转运蛋白货物结合分子，其中所述效应分子选自在治疗上有活性的蛋白或肽、蛋白激酶抑制剂、蛋白激酶c-Jum氨基末端激酶的抑制剂、抗原、抗体、凋亡因子、病理状态中牵涉的蛋白酶，优选地是肽蛋白酶抑制剂、BH3结构域或唯BH3蛋白、编码这些蛋白的核酸、siRNAs、反义RNAs、细胞毒性剂和包括蛋白酶抑制剂的小有机化合物。
14.根据权利要求12或13的转运蛋白货物结合分子，此外包括至少一个不同于组分(B)的另外的组分(C)、(D)和/或(E)，其中所述至少一个任选的另外的组分(C)、(D)和/或(E)相互独立地选自如针对组分(B)所定义的不同的效应分子或它们的片段或变体。
15.根据权利要求12至14中任一项的转运蛋白货物结合分子，其中组分(A)和(B)与任选的组分(C)、(D)和/或(E)相互共价连接。
16.根据权利要求12至15中任一项的转运蛋白货物结合分子，其中所述至少一个另外的组分(C)、(D)和/或(E)选自信号序列或定位序列，其引导所述发明的转运蛋白货物结合分子到特定的细胞内靶定位或到特定的细胞类型。
17.根据权利要求12至16中任一项的转运蛋白货物结合分子，其中组分(B)和/或所述至少一个另外的组分(C)、(D)和/或(E)是蛋白或肽序列并由L-氨基酸、D-氨基酸或二者的混合物组成。
18.根据权利要求12至17中任一项的转运蛋白货物结合分子，其中组分(A)位于所述转运蛋白货物结合分子的所述C末端，假设组分(B)是蛋白或肽序列。
19.根据权利要求12至18中任一项的转运蛋白货物结合分子，其用作药物。
20.药物组合物，其包括根据权利要求12至19中任一项的转运蛋白货物结合分子和任选地药学上可接受的载体/或赋形剂。
21.根据权利要求1至11中任一项的转运蛋白构建物用于制备转运蛋白货物结合分子的用途。
22.根据权利要求21的转运蛋白构建物的用途，其中所述转运蛋白货物结合分子是如根据权利要求12至18中任一项所定义的。
23.根据权利要求1至11中任一项的转运蛋白构建物或根据权利要求12至18中任一项所定义的转运蛋白货物结合分子用于将货物分子转运进将被治疗的患者的细胞或组织的用途。
24.根据权利要求23的用途，其中所述货物是如根据权利要求12至18中任一项所定义的。
25.根据权利要求23或24的用途，其用于将货物分子转运进白细胞和/或神经元细胞，特别是将被治疗的患者的白细胞和/或神经元细胞。
26.根据权利要求12至18中一项的转运蛋白货物结合分子用于制备药物的用途，该药物用于预防、治疗和/或改善癌症或肿瘤疾病——包括由缺陷型凋亡引起的疾病、炎性疾病、感染疾病、病毒(感染)疾病、与NJK信号传导密切相关的疾病、自身免疫性病症或疾病、心血管疾病、神经元或神经变性疾病、肝病、脊柱疾病、子宫疾病、重度抑郁症、非慢性或慢性炎性消化病、听力丧失、内耳疾病，或用在组织移植中。
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