CN102256625B - 单和双peg il10的生产和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了生产单和双聚乙二醇化的IL-10的混合物的方法。

Description

单和双PEG IL10的生产和用途
发明领域
本发明包括单聚乙二醇化（PEG）和双PEG IL-10组合物及其使用方法。
发明背景
细胞因子白介素-10(IL-10)是二聚体，在连接其2个单体亚基的非共价相互作用破坏后成为生物学上失活的。IL-10最初作为2型辅助T细胞的产物被鉴定，后来显示其可由其它细胞类型包括B细胞和巨噬细胞产生。其也抑制1型辅助T细胞产生的几种细胞因子例如γ-干扰素、IL-2和肿瘤坏死因子-α (TNF-α)的合成。IL-10抑制细胞介导的免疫应答调节剂和抑制抗原呈递细胞依赖性T细胞应答的能力证明IL-10具有免疫抑制特性。此细胞因子也抑制其它细胞因子例如IL-1, IL-6, IL-8, 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF), 粒细胞集落刺激因子(G- CSF)和TNF-α的单核细胞/巨噬细胞产生。由于其多效活性，已对IL-10进行研究用于多种临床应用，例如治疗炎性病症、细菌脓毒症、肠毒素引起的致死休克和自身免疫疾病，例如类风湿关节炎、同种异体移植排斥和糖尿病。
可通过免疫***控制或根除癌症和肿瘤。免疫***包括几类淋巴样和骨髓样细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、树突细胞（DC）、嗜酸性粒细胞、T细胞、B细胞和嗜碱性粒细胞。这些淋巴样和骨髓样细胞产生称为细胞因子的分泌信号蛋白。细胞因子包括例如白介素-10(IL-10)、干扰素-γ(IFNγ)、IL-12和IL-23。免疫应答包括炎症，即全身性或在体内特定位置的免疫细胞聚集。响应感染剂或外源物质后，免疫细胞分泌细胞因子，其进而调节免疫细胞的增殖、发育、分化或迁移。过度的免疫应答可产生病理学后果，例如自身免疫疾病，而损伤的免疫应答可导致癌症。免疫***的抗肿瘤应答包括先天免疫性例如通过巨噬细胞、NK细胞和嗜碱性粒细胞介导的，和适应性免疫性，例如通过抗原呈递细胞（APC）、T细胞和B细胞介导的（见例如Abbas等人 (编) (2000) Cellular and Molecular Immunology, W.B. Saunders Co., Philadelphia, PA; Oppenheim and Feldmann (编) (2001) Cytokine Reference, Academic Press, San Diego, CA; von Andrian and Mackay (2000) New Engl. J. Med. 343:1020-1034; Davidson and Diamond (2001) New Engl. J. Med. 345:340-350）。
调节免疫应答的方法已在癌症例如黑色素瘤的治疗中使用。这些方法包括使用细胞因子例如IL- 2, IL-10, IL- 12, 肿瘤坏死因子-α (TNF α), IFNγ, 粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)和转化生长因子(TGF)或使用细胞因子拮抗剂（例如抗体）的治疗。白介素-10最初被表征为细胞因子合成抑制因子（CSIF；见例如Fiorentino等人 (1989) J. Exp. Med. 170:2081-2095）。IL-10是由T细胞、B细胞、单核细胞产生的多效细胞因子，其可作为免疫抑制剂和免疫刺激剂二者发挥功能（见例如Groux等人 (1998) J. Immunol. 160:3188-3193和Hagenbaugh等人 (1997) J. Exp. Med. 185:2101-2110）。
动物模型提示IL-10可以剂量依赖的方式引起NK-细胞活化和促进靶细胞的破坏（见例如Zheng等人 (1996) J. Exp. Med. 184:579-584; Kundu等人 (1996) J. Natl. Cancer Inst. 88:536-541）。进一步研究表明IL-10在肿瘤微环境中的存在与更好的患者存活有关（见例如Lu等人 (2004) J. Clin. Oncol. 22:4575-4583）。
因为其相对短的半衰期，IL-10已与多种伴侣（partner）包括聚乙二醇缀合。其他细胞因子也已被聚乙二醇化，通常通过单聚乙二醇化，例如PEG分子与细胞因子蛋白上的单个残基连接。不幸的是，由于亚基改组（shuffling），在一个IL-10亚基上的单聚乙二醇化导致双聚乙二醇化、单聚乙二醇化和非聚乙二醇化IL-10分子的非均一混合。允许聚乙二醇化反应进行完全将也允许非特异性和多聚乙二醇化靶蛋白的存在，因此降低这些蛋白质的生物活性。因此存在更高效地产生更高产量的正确聚乙二醇化IL-10的需要。本发明通过提供产生单和双聚乙二醇化IL-10的混合物的方法来满足此需求。
附图简述
图1显示了产生单和双PEG-IL-10的反应动力学。
图2显示了多种单和双PEG-IL-10（鼠）样品（prototype）对移植的PDV6鳞状上皮细胞癌的效力。
发明概述
本发明基于以下发现，即受控的反应可产生选择性聚乙二醇化单和双PEG-IL-10(mono- and di-PEG-IL-10)的混合，其进而改进最终的聚乙二醇化产物的产量并与其他PEG-IL-10种类具有相当的效力。
本发明提供了生产单和双聚乙二醇化的IL-10的混合物的方法，其中至少一个PEG分子与IL-10的至少一个亚基的至少一个氨基酸残基共价连接，所述方法包括：a）将1mg/ml至12mg/ml的IL-10蛋白与活化的PEG接头反应以使IL-10与PEG接头的比例为1:1至1:7.7，反应在0.75 mM至35 mM的还原剂的存在下，在约5.0至7.4的pH下和5℃至30℃的温度下进行12-15小时；和b）纯化单和双聚乙二醇化IL-10的混合物。在某些实施方案中，PEG接头选自琥珀酰亚胺碳酸酯-PEG、PEG-丁醛、PEG-戊醛、PEG-酰胺基-丙醛、PEG-氨酯基-丙醛和PEG-丙醛，PEG接头为从5,000道尔顿至12,000道尔顿，或还原剂选自硼氢化物、氰基硼氢化钠、胺合硼烷络合物和甲基吡啶硼烷。在另一个实施方案中，单和双PEG的混合物通过选自阳离子交换、阴离子交换、大小排阻和疏水相互作用的层析纯化。还包括的是药物组合物，其包含通过此反应方法生产的单和双PEG- IL-10和药学上可接受的载体。
本发明包括生产单和双聚乙二醇化的IL-10的混合物的方法，其中至少一个PEG分子与IL-10的至少一个亚基的至少一个氨基酸残基共价连接，所述方法包括：a）将7.5mg/ml的IL-10蛋白与活化的PEG接头反应以使IL-10与PEG接头的比例为1:3.5，反应在25mM的还原剂的存在下，在6.3的pH下和15℃的温度下进行15小时；和b）纯化单和双聚乙二醇化IL-10的混合物。在某些实施方案中，PEG接头选自琥珀酰亚胺碳酸酯-PEG、PEG-丁醛、PEG-戊醛、PEG-酰胺基-丙醛、PEG-氨酯基-丙醛和PEG-丙醛。包含PEG接头的PEG的分子量为从5,000道尔顿至12,000道尔顿，还原剂选自硼氢化物、氰基硼氢化钠、胺合硼烷络合物和甲基吡啶硼烷，或单和双PEG混合物通过选自阳离子交换、阴离子交换、大小排阻和疏水相互作用的层析纯化。还包括的是药物组合物，其包含通过此反应方法生产的单和双PEG-IL-10和药学上可接受的载体。
发明详述
如本文使用的，包括所附权利要求书，单词的单数形式例如“一”和“其”（“a”、“an”和“the”）包括其对应的复数形式，除非上下文另外明确指出。将本文中引用的所有参考引入作为参考，就如同每一单个出版物、专利申请或专利被明确和单独地说明被引用作为参考一样。
I. 定义
“活化”、“刺激”和“处理”当用于细胞或受体时可具有相同的含义，例如用配体活化、刺激或处理细胞或受体，除非上下文另外或明确指出。“配体”包含天然和合成配体，例如细胞因子、细胞因子变体、类似物、突变蛋白和来源于抗体的结合组合物。“配体”也包含小分子，例如细胞因子的肽模拟物或抗体的肽模拟物。“活化”可指如通过内部机制以及通过外部或环境因素调节的细胞活化。“应答”，例如细胞、组织、器官或生物的应答包含生化或生理行为的改变，例如浓度、密度、粘附或在生物区室内的迁移、基因表达速率或分化状态，其中改变与活化、刺激或处理相关，或与内部机制例如遗传编程相关。
分子的“活性”可描述或指分子与配体或与受体的结合，催化活性；刺激基因表达或细胞信号转导的能力，分化或成熟；抗原活性，其他分子的调节活性等等。分子的“活性”也可指调节或维持细胞与细胞的相互作用例如粘附的活性，或维持细胞结构例如细胞膜或细胞骨架的活性。“活性”还可指比活性，例如[催化活性]/[mg蛋白质]，或[免疫学活性]/[mg蛋白质]，在生物区室中的浓度等等。“增殖活性”包括促进例如正常细胞***以及癌症、肿瘤、发育异常、细胞转化、转移和血管生成的活性，其对上述是必需的或与上述特异性相关。
“施用”和“处理”当用于动物、人、试验对象、细胞、组织、器官或生物流体时，指外源药物剂、治疗剂、诊断剂、化合物或组合物与动物、人、对象、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“施用”和“处理”可指例如治疗、安慰剂、药物动力学、诊断、研究和实验方法。“细胞的处理”包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中流体与细胞接触。“施用”和“处理”也指例如用试剂、诊断剂、结合组合物或另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当用于人、兽医学或研究对象时，指治疗性处理、对研究和诊断应用的预防或预防性措施。“处理”当用于人、兽医学或研究对象，或细胞、组织或器官时，包括PEG-IL-10与人或动物对象、细胞、组织、生理区室或生理流体的接触。“细胞的处理”还包括PEG-IL-10接触IL-10受体（IL-10R1和IL-10R2的异源二聚体）的情况，例如在流相或胶体相，以及IL-10激动剂或拮抗剂接触流体的情况，例如其中流体与细胞或受体接触，但其中未证实激动剂或拮抗剂直接接触细胞或受体。
“恶病质”是一种与肌肉（肌肉萎缩）和脂肪减少相关的消耗综合症，由代谢紊乱导致。恶病质在多种癌症（“癌症恶病质”）、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、晚期器官衰竭和AIDS中出现。癌症恶病质的特征是例如显著的体重减少、厌食、无力和贫血。厌食是一种由缺乏进食动机产生的疾病，例如厌恶食物（见例如MacDonald等人 (2003) J. Am. Coll. Surg. 197:143-161; Rubin (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:5384-5389; Tisdale (2002) Nature Reviews Cancer 2:862-871; Argiles等人 (2003) Drug Discovery Today 8:838-844; Lelli等人 (2003) J. Chemother. 15:220-225; Argiles等人 (2003) Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care 6:401-406）。
“PEG-IL-10的保守修饰变体”同时应用于氨基酸和核酸序列。对特定核酸序列来说，保守修饰变体指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸或当核酸不编码氨基酸序列时指基本上相同的核酸序列。因为遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸可编码任意特定蛋白质。
对氨基酸序列来说，技术人员将认识到将编码序列中的氨基酸或小百分比的氨基酸取代为保守氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白质序列的单个置换为“保守修饰变体”。提供功能类似的氨基酸的保守置换表是本领域熟知的。保守置换的实例是将下组之一的氨基酸替换为相同组的另一个氨基酸（Lee等人公开的美国专利号5,767,063；Kyte和Doolittle (1982) J. MOL. Biol. 157: 105-132）：
(1) 疏水: 正亮氨酸, Ile, Val, Leu, Phe, Cys或Met;
(2) 中性疏水: Cys, Ser, Thr;
(3) 酸性: Asp, Glu;
(4) 碱性: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
(5) 影响链定向的残基: Gly, Pro;
(6) 芳香族: Trp, Tyr, Phe;
(7) 小氨基酸: Gly, Ala, Ser。
“有效量”包括足够改善或预防医学状况的症状或征兆的量。有效量也指足够允许或便于诊断的量。对特定患者或兽医学对象的有效量可取决于因素的变化，如待治疗的病症、患者的总体健康、施用的方法途径和剂量以及副作用的严重程度（见例如授权给Netti等人的美国专利号5,888,530）。有效量可为避免明显副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。结果将导致诊断测量或参数的至少5%，通常至少10%，更通常至少20%，最通常至少30%，优选至少40%，更优选至少50%，最优选至少60%，理想地至少70%，更理想地至少80%和最理想地至少90%的改善，其中将100%定义为正常对象显示的诊断参数（见例如Maynard等人 (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, FL; Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., London, UK）。PEG-IL-10的有效量可为足够减少肿瘤体积、抑制肿瘤生长、预防转移或提高CD8+ T细胞渗入肿瘤位点的量。
“外源的”指在生物、细胞或人体以外产生的物质，取决于上下文。“内源的”指在细胞、生物或人体内产生的物质，取决于上下文。
“免疫状况”（“immune condition”）或“免疫病症”（“immune disorder”）包括例如病理学炎症、炎性病症和自身免疫病症或疾病。“免疫状况”也指感染、持续感染和增生性状况，例如癌症、肿瘤和血管生成，包括通过免疫***抵抗放射的感染、肿瘤和癌症。“癌性状况”包括例如癌症、癌细胞、肿瘤、血管生成和癌症前期的状况例如发育异常。
“抑制剂”和“拮抗剂”或“激活剂”和“激动剂”分别指抑制性或活化性分子，例如用于活化例如配体、受体、辅助因子、基因、细胞、组织或器官。调节剂，例如基因、受体、配体或细胞的调节剂是改变基因、受体、配体或细胞的活性的分子，其中可在其调节性能内活化、抑制或改变活性。调节剂可单独起作用，或其可使用辅助因子，例如蛋白质、金属离子或小分子。抑制剂是减少、阻止、避免、延迟活化，失活、脱敏或下调例如基因、蛋白质、配体、受体或细胞的化合物。活化剂是增加、活化、促进、增强活化，致敏或上调例如基因、蛋白质、配体、受体或细胞的化合物。抑制剂也可被定义为减少、阻止或失活组成型活性的组合物。“激动剂”是与靶相互作用以引起或促进靶活化的增加的化合物。“拮抗剂”是与激动剂作用相反的化合物。拮抗剂避免、减少、抑制或中和激动剂的活性。拮抗剂也可避免、抑制或减少靶例如靶受体的组成型活性，甚至在没有确定的激动剂的情况下。
例如为了检查抑制的程度，例如，用潜在的激活剂或抑制剂处理包含给定的例如蛋白质、基因、细胞或生物的样品或试样（assays）并与没有抑制剂的对照样品比较。指定对照样品，即没有用拮抗剂处理的样品的相对活性值为100%。当相对对照的活性值为约90%或更低，通常85%或更低，更通常80%或更低，最通常75%或更低，一般70%或更低，更一般65%或更低，最一般60%或更低，通常55%或更低，经常50%或更低，更经常45%或更低，最经常40%或更低，优选35%或更低，更优选30%或更低，还更优选25%或更低和最优选低于25%时获得抑制。当相对对照的活性值为约110%，一般至少120%，更一般至少140%，更一般至少160%，通常至少180%，更通常至少2倍，最通常至少2.5倍，经常至少5倍，更经常至少10倍，优选至少20倍，更优选至少40倍和最优选大于40倍时获得活化。
可通过下述监视活化或抑制的终点。可通过终点监视例如细胞、生理流体、组织、器官和动物或人对象的活化、抑制和对处理的反应。终点可包含例如炎症、致瘤性或细胞脱粒或分泌，例如细胞因子、毒性氧或蛋白酶的释放的标记（indicia）的预定量或百分比。终点可包含例如离子流或运输，细胞迁移，细胞粘附，细胞增殖，转移潜力，细胞分化和表型变化例如炎症、凋亡、转化、细胞周期或转移相关基因表达的变化的预定量（见例如Knight (2000) Ann. Clin. Lab. Sci. 30:145- 158; Hood和Cheresh (2002) Nature Rev. Cancer 2:91-100; Timme等人 (2003) Curr. Drug Targets 4:251-261; Robbins和Itzkowitz (2002) Med. Clin. North Am. 86:1467-1495; Grady和Markowitz (2002) Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3:101-128; Bauer等人 (2001) Glia 36:235-243; Stanimirovic和Satoh (2000) Brain Pathol. 10:113-126）。
抑制终点通常为对照的75%或更少，优选对照的50%或更少，更优选对照的25%或更少和最优选对照的10%或更少。通常，活化终点为对照的至少150%，优选对照的至少2倍，更优选对照的至少4倍和最优选对照的至少10倍。
“标记的”组合物是可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、同位素或化学方法直接或间接检测的。例如，有用的标记物包括32P, 33P, 35S, 14C, 3H, 125I, 稳定的同位素，荧光染料，电子致密试剂，底物，表位标签或酶，例如在酶联免疫测定或fluorettes中使用（见例如Rozinov和Nolan (1998) Chem. Biol. 5:713-728）。
“配体”指可作为受体的激动剂或拮抗剂的例如小分子、肽、多肽和膜连接的或膜结合的分子，或其复合物。“配体”也包含非激动剂或拮抗剂但可与受体结合并不显著影响其生物性能例如信号转导或粘附的试剂。此外，“配体”包括膜结合配体，其已通过例如化学或重组方法被改变为膜结合配体的可溶形式。根据常规，当配体在第一种细胞上膜结合时，受体通常在第二种细胞上存在。第二种细胞可能与第一种细胞具有相同或不同的特性。配体或受体可完全地为细胞内的，即其可驻留在细胞溶质（cytosol）、核或一些其他细胞内区室中。配体或受体可改变其定位，例如从细胞内区室至质膜的外侧。配体和受体的复合物被称为“配体受体复合物”。当配体和受体涉及信号转导途径中时，配体在上游位置存在，受体在信号转导途径的下游位置存在。
为***和癌症的生理机能和病症提供“小分子”。“小分子”被定义为具有低于10 kD，通常低于2 kD和优选低于1 kD分子量的分子。小分子包括但不限于无机分子、有机分子、含有无机成分的有机分子、包含放射性原子的分子、合成的分子、肽模拟和抗体模拟。作为治疗剂，与大分子相比，小分子可能对细胞更具渗透性、更不易于降解和更不易于引起免疫应答。描述了小分子例如抗体和细胞因子的肽模拟，以及小分子毒素（见例如Casset等人 (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 307:198-205; Muyldermans (200I) J. Biotechnol. 74:277-302; Li (2000) Nat. Biotechnol. 18:1251-1256; Apostolopoulos等人 (2002) Curr. Med. Chem. 9:411-420; Monfardini等人 (2002) Curr. Pharm. Des. 8:2185- 2199; Domingues等人 (1999) Nat. Struct. Biol. 6:652-656; Sato和Sone (2003) Biochem. J. 371 :603-608; 授权给Stewart等人的美国专利号6,326,482）。
“化学治疗剂”是用于治疗癌症的化学化合物。化学治疗剂的实例包括烷基化试剂例如塞替派和环磷酰胺(CYTOXANTM)；烷基磺酸酯例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；环乙亚胺例如benzodopa、卡波醌、meturedopa和uredopa；乙烯亚胺和methylamelamine包括六甲蜜胺、三胺嗪、三乙烯磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲蜜胺氮芥例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、胆磷酰胺、雌氮芥、 异环磷酰胺、氮芥、盐酸氮芥氧化物、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、松龙苯芥、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝脲例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素例如阿克拉霉素、放线菌素、蒽霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、加利车霉素、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌素、东洋霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星、去甲柔红霉素、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、紫菜霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、新制癌菌素、佐柔比星；抗代谢物例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物例如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物例如安西他滨, 阿扎胞苷、6-氮尿甙、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷, 5-FU；雄激素例如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺类物质例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充物例如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；安吖啶；百垂布西；比生群；依达曲沙；defofamine；地美可辛；地吖醌；艾佛鸟氨酸；醋酸羟哔咔唑；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸乙肼；甲基苄肼；PSK?.；雷佐生；西索菲兰；锗螺胺；细格孢氮杂酸；三乙撑亚胺苯醌；2,2',2"-三氯乙胺；氨基甲酸乙酯；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷("Ara-C")；环磷酰胺；塞替派；紫杉类药物, 例如紫杉醇 (TAXOL? Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)和多烯紫衫醇 (Taxotere?, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物例如顺铂和卡波铂；长春碱；铂；依托泊苷 (VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺肖林；替尼泊苷；道诺霉素；氨基蝶呤；Xeloda? Roche, Switzerland；伊班膦酸盐；CPT1l；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸 (DMFO)；视黄酸；埃斯培拉霉素；卡培他滨；和药学上可接受的上述任一种的盐、酸或衍生物。在此定义中也包括对肿瘤发挥调节或抑制激素作用的抗激素剂，例如抗***，包括例如它莫西芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制性4(5)-咪唑, 4-羟基它莫西芬, 曲沃昔芬, 雷洛昔芬, LYl17018, 奥那司酮和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素例如氟他胺，尼鲁米特，比卡鲁胺，丙瑞林和戈舍瑞林；和药学上可接受的上述任一种的盐、酸或衍生物。
当提及配体/受体，抗体/抗原或其他结合对时，“特异性”或“选择性”结合表示由蛋白质和其他生物性的异质群体中的蛋白质的存在决定的结合反应。因此，在指定的条件下，特定配体结合特定受体并不以显著量结合样品中存在的其他蛋白。在设想的方法中抗体或来源于抗体的抗原结合位点的结合组合物以与任意其他抗体或来源于其的结合组合物的亲和力相比至少2倍、优选至少10倍、更优选至少20倍和最优选至少100倍的亲和力与它的抗原或其变体或突变蛋白结合。在优选的实施方案中，抗体将具有例如通过Scatchard分析(Munsen等人 (1980) Analyt. Biochem. 107:220-239)测定的大于约109升/mol的亲和力。
如本文使用的“白介素-10”或“IL-10”，无论是与聚乙二醇缀合或以非缀合的形式，为包含2个非共价连接的亚基以形成同源二聚体的蛋白质。如本文使用的，除非另外指出，“白介素-10”或“IL-10”可指人或小鼠IL-10（Genbank登记号NP 000563; M37897;或US 6,217,857），其又被称为"hIL-10"或 "mIL-10"。
“聚乙二醇化的IL-10”或“PEG-IL-10”是具有一个或多个聚乙二醇分子的IL-10分子，所述聚乙二醇分子经接头与IL-10的一个或一个以上的氨基酸残基共价连接，以使连接稳定。术语“单聚乙二醇化IL-10”和“单PEG-IL-10”指至少一个聚乙二醇分子与IL-10二聚体的一个亚基上的单个氨基酸残基通过接头共价连接。术语“双聚乙二醇化的IL-10”和“双PEG-IL-10”指至少一个PEG分子与IL-10二聚体的每个亚基上的单个残基经接头连接。PEG部分的平均分子量优选地在约5,000至约50,000道尔顿之间。PEG与IL-10的连接方法和位点不是关键的，但优选聚乙二醇化不改变或仅轻微改变生物学活性分子的活性。优选地，半衰期的增加超过生物学活性的任意降低。通常通过评估用细菌抗原（脂多糖，LPS）攻击的和用PEG-IL-10处理的对象血清中的炎症细胞因子（例如TNFα, IFNγ）水平来测量PEG-IL-10的生物学活性，如在US 7,052,686中描述的。
如本文使用的，“血清半衰期”，简称“t1/2”指消除半衰期，即试剂的血清浓度已达到其初始或最大值的一半时的时间。本文使用的提及合成试剂的术语“增加的血清半衰期”指合成试剂以比非合成的内源试剂或其重组产生的形式更慢的速度被清除。
II. 概述
本发明提供了生产单和双PEG混合物的方法。聚乙二醇化的IL-10已显示在肿瘤环境中更有效，见例如US20080081031。本发明提供了通过纯化单聚乙二醇化的（在IL-10同源二聚体的一个亚基上至少一个PEG分子）和双聚乙二醇化的（在IL-10同源二聚体的每个亚基上至少一个PEG分子）IL-10二者来增加聚乙二醇化的IL-10的产量的方法。
III. 聚乙二醇（“PEG”）
聚乙二醇（“PEG”）是在制备治疗性蛋白质产品中已使用的化学部分。动词“聚乙二醇化”指将至少一个PEG分子与另一个分子例如治疗性蛋白质连接。例如已批准腺苷脱氨酶的聚乙二醇化的制剂Adagen用于治疗重症联合免疫缺陷病；聚乙二醇化的超氧化物歧化酶已经处于治疗头部损伤的临床试验中；聚乙二醇化的α干扰素已在治疗肝炎的I期临床试验中检测；聚乙二醇化的葡糖脑苷脂酶和聚乙二醇化的血红素据报导已处于临床前检测中。聚乙二醇的连接已显示可预防蛋白质水解（见例如Sada等人, (1991) J. Fermentation Bioengineering 71 :137-139）。
在其最普遍的形式中，PEG是末端为羟基的线性或分支的聚醚，并具有通用结构：
HO-(CH2CH2O) n CH2CH2-OH。
为了将PEG偶联至分子（多肽、多糖、多核苷酸和有机小分子），需要通过制备在一端或两端具有功能性基团的PEG衍生物来活化PEG。用于蛋白质的PEG缀合的最常用途径是用适于与赖氨酸和N-端氨基酸基团反应的官能团活化PEG。特别地，涉及将PEG偶联至多肽的最常用反应基团是赖氨酸的α或ε氨基。
聚乙二醇化接头与蛋白质的反应导致主要在以下位点的PEG部分的连接：蛋白质的N-端的α氨基，赖氨酸残基侧链上的ε氨基和组氨酸残基侧链上的咪唑基。因为大多数重组蛋白质具有单个α氨基和多个ε氨基和咪唑基，根据接头的化学性质可产生多个位置异构体。
第一代被广泛使用的2个活化的单甲氧基PEG（mPEG）为琥珀酰亚胺碳酸酯PEG（SC-PEG; 见例如Zalipsky等人 (1992) Biotehnol. Appl. Biochem 15:100-114以及Miron和Wilcheck (1993) Bioconjug. Chem. 4:568-569）和苯并***碳酸酯（BTC-PEG; 见例如Dolence等人美国专利号5,650,234），其优先与赖氨酸残基反应以形成氨基甲酸酯连接，但已知其也与组氨酸和酪氨酸残基反应。与IFNα上的组氨酸残基的连接已显示是水解不稳定的咪唑氨基甲酸酯连接（见例如Lee和McNemar, 美国专利号5,985,263）。
第二代PEG化技术已被设计为避免这些不稳定的连接以及在残基反应性中的选择性的缺乏。使用PEG-醛接头通过还原胺化靶向多肽和/或蛋白质亚基的N-端上的单个位点。可使用不同类型的接头和pH聚乙二醇化IL-10以得到多种形式的聚乙二醇化的分子（见例如US 5,252,714、US 5,643,575、US 5,919,455、US 5,932,462、US 5,985,263、US 7,052,686）。
IV. PEG-IL-10的生物学活性
当对具有免疫能力的小鼠施用人IL-10时，其引起中和抗体的快速产生。为避免此类型的中和，对B细胞有缺陷的小鼠（即不能发动抗体应答的小鼠）给予PEG-hIL-10的皮下施用。PEG-hIL-10显著延迟了在这些免疫缺陷小鼠中完全形成的同基因肿瘤的生长或完全排斥了这些肿瘤。肿瘤生长限制或抑制依赖于CD4和CD8 T细胞二者。在缺失了CD8细胞后，PEG-hIL-10的抑制作用完全消失了。因此，PEG-hIL-10引起了CD8介导的细胞毒性应答。
进一步的肿瘤组织分析显示PEG-IL-10以高于非聚乙二醇化的IL-10的水平增加了CD8+ T细胞渗入肿瘤的水平。与非聚乙二醇化的IL-10处理相比，用PEG-IL-10处理的侵入的CD8细胞的炎性细胞因子表达水平也较高，用PEG-IL-10处理肿瘤患者应该引起了显著的抗肿瘤应答并赋予显著的治疗益处（见例如）。
在本发明中使用的IL-10蛋白质含有与成熟IL-10蛋白质的序列（即缺乏任何前导序列）共享至少75%，更优选至少85%，最优选至少90%或更高，例如至少95%的观测同源性的氨基酸序列。见例如美国专利号6,217,857。通过最优化残基匹配和如果需要通过引入必要的缺口测定氨基酸序列同源性或序列同一性。同源氨基酸序列通常旨在各自序列中包括天然等位基因、多态和种间变化。一般的同源蛋白质或肽将与IL-10多肽的氨基酸序列具有从25-100%的同源性（如果可引入缺口）至50-100%的同源性（如果包括保守置换）。见Needleham 等人, J. MoI. Biol. 48:443-453 (1970); Sankoff 等人 in Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison, 1983, Addison- Wesley, Reading, Mass.和来自IntelliGenetics, Mountain View, Calif, and the University of Wisconsin Genetics Computer Group, Madison, Wis的软件包。
PEG-IL-10缀合物的IL-10部分可被糖基化或可被非糖基化突变蛋白或其他类似物，包括BCRFl (EB病毒的病毒IL-10)蛋白修饰。可使用多种技术产生编码IL-10的序列的修饰，例如定点突变[Gillman 等人, Gene 8:81-97 (1979); Roberts 等人, Nature 328:731-734 (1987)]，并可通过在合适的测定中常规筛选IL-10活性评估所述修饰。修饰的IL-10蛋白，例如变体，可在一级结构水平与天然存在序列不同。可通过氨基酸***、置换、缺失和融合产生这些修饰。可为了多种预想的目的制备IL-10变体，包括增加血清半衰期，降低针对IL-10的免疫应答，便于纯化或制备，减少IL-10至其单体亚基的转化，改进治疗效力和减轻在治疗使用中的副作用的严重程度或发生。氨基酸序列变体通常是在自然界不存在的预定变体，尽管其他变体可为翻译后修饰变体，例如糖基化变体。在此发明中可使用任意IL-10变体，只要其保留合适的IL-10活性水平。在肿瘤的情况下，合适的IL-10活性可为例如CD8+ T细胞侵入肿瘤位点，这些侵入细胞中的炎症细胞因子例如IFNγ、IL-4、IL-6、IL-10和RANK-L的表达，在生物样品中的TNF α或IFNγ的提高的水平。
在此发明中使用的IL-10可来源于哺乳动物，例如人或小鼠。优选人 IL-10 (hIL-10)用于需要IL-10治疗的人的治疗。在此发明中使用的IL-10优选地为重组IL-10。在美国专利号5,231,012中可找到描述制备人和小鼠IL-10的方法。也包括人和小鼠IL-10的天然存在的或保守置换的变体。在本发明的另一个实施方案中，IL-10可为病毒来源。在Moore 等人, Science 248:1230 (1990)中公开了来自EB病毒的病毒IL-10（BCRFl蛋白）的克隆和表达。
可使用本领域已知的标准技术用多种方法得到IL-10，例如从能够分泌所述蛋白质的活化细胞（例如T细胞）的培养基中分离和纯化，化学合成或重组技术（见例如Merrif?eld, Science 233:341-47 (1986); Atherton 等人, Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach, 1989, 1.R.L. Press, Oxford;美国专利号5,231,012教导了产生具有IL-10活性的蛋白质的方法，包括重组和其他合成技术）。优选地，使用重组技术从编码IL-10多肽的核酸中得到IL-10蛋白。重组人IL-10也可例如从PeproTech, Inc., Rocky Hill, N.J购得。
可使用本领域熟知的技术制备PEG-IL-10。可如例如在Lundblad, RX. 等人 (1988) Chemical Reagents for Protein Modification CRC Press, Inc., vol. 1, pp. 105-125中描述的合成聚乙二醇（PEG）。如上所述可通过使用接头将PEG缀合至IL-10。在某些实施方案中，在本发明中使用的PEG-IL-10为单PEG-IL-10，其中1至9个PEG分子通过接头与IL-10二聚体的一个亚基的N端氨基酸残基的α氨基共价连接。
V. 治疗组合物，方法
可将PEG-IL-10配制在包含治疗有效量的IL-10和药物载体的药物组合物中。“治疗有效量”是足够提供预期治疗效果的量。优选地，这样的量具有最小的不良副作用。为治疗可用IL-10治疗的病症而施用的PEG-IL-10的量基于缀合蛋白的IL-10活性，其可通过本领域已知的IL-10活性测定确定。对需要这些治疗的特定患者的治疗有效量可通过考虑多种因素例如治疗的病症、患者的总体健康、施用的方法、副作用的严重程度等等确定。在肿瘤的情况下，合适的IL-10活性可为例如CD8 T细胞侵入肿瘤位点，这些侵入细胞中的炎性细胞因子例如IFNγ、IL-4、IL-6、IL-10和RANK-L的表达，在生物样品中的TNF α或IFNγ的提高的水平。
聚乙二醇化的IL-10的治疗有效量范围可从约0.01至约100μg蛋白质/kg体重/天。优选地，聚乙二醇化的IL-10的量的范围可从约0.1至约20μg蛋白质/kg体重/天，更优选从约0.5至10μg蛋白质/kg体重/天，和最优选从约1至4μg蛋白质/kg体重/天。使用本发明的PEG-IL-10可应用较少频率的施用时间表，因为此缀合形式比IL-10作用更长。以纯化的形式配制聚乙二醇化IL-10并基本上不含聚集体和其他蛋白质。优选地，通过连续输注施用PEG-IL-10从而每天递送约50至800μg蛋白质的范围的量（即约1至16μg蛋白质/kg体重/天的PEG-IL-10）。基于副作用和血细胞计数监控可改变每日的输注速度。
为制备含有单PEG-IL-10的药物组合物，将治疗有效量的PEG-IL-10与药学上可接受的载体或赋形剂混合。载体或赋形剂优选为惰性的。药物载体可为适于递送本发明的IL-10组合物至患者的任意相容的非毒性物质。合适载体的实例包括普通盐溶液， 林格溶液，葡萄糖溶液和汉克氏溶液。也可使用非水性载体例如不挥发性油和油酸乙酯。优选的载体是5%葡萄糖/盐溶液。载体可含有微量添加剂例如增强等渗性和化学稳定性的物质，例如缓冲液和防腐剂，见例如Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984)。可通过混合以例如冻干的粉末、浆液、水溶液或悬乳液形式的生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂制备治疗和诊断剂制剂（见例如Hardman等人 (2001) Goodman and Gilman 's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, NY; Avis等人 (编) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman等人 (编) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman等人 (编) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner和Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY）。
本发明的组合物可口服施用或注射至体内。用于口服用途的制剂也可包括在胃肠道中进一步保护IL 10免受蛋白酶破坏的化合物。注射通常为肌肉内、皮下、皮内或静脉内。可选地，在合适情况下可使用关节内注射或其他途径。
当在胃肠外施用时，将聚乙二醇化的IL-10以单位剂量可注射形式（溶液、悬乳液、乳液）与药物载体一起配制。见例如Avis 等人编, Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Dekker, N.Y. (1993); Lieberman 等人编, Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Dekker, N.Y. (1990)和Lieberman 等人编, Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Dekker, N.Y. (1990)。可选地，本发明的组合物可通过可植入的或可注射的药物递送***例如Urquhart 等人 Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24:199-236, (1984); Lewis编, Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals Plenum Press, New York (1981); 美国专利号3,773,919; 3,270,960等等引入患者体内。可在具有或不具有各种添加剂和/或稀释剂的水性载体例如水、盐溶液或缓冲的载体中施用聚乙二醇化的IL-10。
对特定患者的有效量可取决于例如治疗的病症、患者的总体健康、施用的方法、途径和剂量和副作用的严重程度而变化（见例如Maynard等人 (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, FL; Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch PubL, London, UK)）。
通常兽医学、实验或研究对象包括猴子、狗、猫、大鼠、小鼠、兔、豚鼠、马和人。
合适剂量的测定由临床医师决定，例如使用本领域已知或疑为影响治疗或预计影响治疗的参数或因素。通常，用略低于最佳剂量的量开始剂量，然后以小增量增加剂量直到得到相对于任意不良副作用的预期或最佳效果。重要的诊断测量包括这些症状：例如炎症或产生的炎性细胞因子的水平。优选地，将要使用的生物来源于与治疗靶向的动物相同的物种，由此最小化对试剂的体液应答。与第二种治疗剂例如细胞因子、类固醇、化学治疗剂、抗生素或放射物共同施用或治疗的方法是本领域熟知的（见例如Hardman等人 (编) (2001) Goodman and Gilman 's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill, New York, NY; Poole和Peterson (编) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice: A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA; Chabner和Longo (编) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA）。治疗有效量将减轻通常至少10%；一般至少20%；优选至少约30%；更优选至少40%和最优选至少50%的症状，例如肿瘤大小或肿瘤生长的抑制。
VI. 用途
本发明提供了治疗增生性状况或病症的方法，例如子宫、子宫颈、乳腺、***、睾丸、***、胃肠道例如食道、口咽、胃、小肠或大肠、结肠或直肠，肾、肾细胞、膀胱、骨、骨髓、皮肤、头或颈、皮肤、肝、胆囊、心、肺、胰腺、唾液腺、肾上腺、甲状腺、脑例如胶质瘤、神经中枢、中枢神经***(CNS)和外周神经***(PNS)，和免疫***例如脾或胸腺的癌症。本发明提供了治疗例如免疫原性肿瘤、非免疫原性肿瘤、潜伏肿瘤、病毒诱导的癌症例如上皮细胞癌、内皮细胞癌、鳞状上皮细胞癌、***瘤病毒、腺癌、淋巴瘤、癌、黑色素瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤、畸胎瘤、化学诱导的癌症、转移和血管发生的方法。本发明还考虑降低对肿瘤细胞或癌细胞抗原的耐受性，例如通过调节调节性T细胞(Treg)和或CD8 T细胞的活性（见例如Ramirez-Montagut等人 (2003) Oncogene 22:3180-3187; Sawaya等人 (2003) New Engl. J. Med. 349:1501-1509; Farrar等人 (1999) J. Immunol. 162:2842-2849; Le等人 (2001) J. Immunol. 167:6765-6772; Cannistra和Niloff (1996) New Engl. J. Med. 334:1030-1038; Osborne (1998) New Engl. J. Med. 339:1609-1618; Lynch和Chapelle (2003) New Engl. J. Med. 348:919-932; Enzinger和Mayer (2003) New Engl. J. Med. 349:2241-2252; Forastiere等人 (2001) New Engl. J. Med. 345:1890-1900; Izbicki等人 (1997) New Engl. J. Med. 337:1188-1194; Holland等人 (编) (1996) Cancer Medicine Encyclopedia of Cancer, 4th ed., Academic Press, San Diego, CA）。
在某些实施方案中，本发明提供了使用PEG-IL-10和至少一种另外的治疗或诊断剂治疗增生性状况、癌症、肿瘤或癌症前期状况例如发育异常的方法。另外的治疗剂可为例如细胞因子或细胞因子拮抗剂，例如IL-12、干扰素-α或抗表皮生长因子受体、阿霉素、表柔比星、抗叶酸例如甲氨蝶呤或氟尿嘧啶、依立替康、环磷酰胺、放射疗法、激素或抗激素疗法例如雄激素、***、抗***、氟他胺或己烯雌酚、外科手术、它莫西芬、异环磷酰胺、二溴卫矛醇、烷基化剂例如美法仑或顺铂、依托泊苷，长春瑞滨，长春碱，长春地辛、糖皮质激素、组胺受体拮抗剂、血管生成抑制剂、放射、放射致敏剂、蒽环类抗生素、长春花生物碱、紫杉类药物例如紫杉醇和多烯紫杉醇、细胞周期抑制剂例如周期蛋白依赖性激酶抑制剂，针对另一种肿瘤抗原的单克隆抗体、单克隆抗体和毒素的复合物、T细胞佐剂、骨髓移植或抗原呈递细胞例如树突细胞疗法。可提供疫苗，例如以可溶性蛋白或以编码蛋白质的核酸的形式（见例如Le等人, 如上; Greco和Zellefsky (编) (2000) Radiotherapy of Prostate Cancer, Harwood Academic, Amsterdam; Shapiro和Recht (2001) New Engl. J. Med. 344:1997-2008; Hortobagyi (1998) New Engl. J. Med. 339:974-984; Catalona (1994) New Engl. J. Med. 331 :996-1004; Naylor和Hadden (2003) Int. Immunopharmacol. 3:1205-1215; The Int. Adjuvant Lung Cancer Trial Collaborative Group (2004) New Engl. J. Med. 350:351-360; Slamon等人 (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792; Kudelka等人 (1998) New Engl. J. Med. 338:991-992; van Netten等人 (1996) New Engl. J. Med. 334:920-921）。
也提供了治疗癌症的骨髓外造血（EMH）的方法。描述了EMH（见例如Rao等人 (2003) Leuk. Lymphoma 44:715-718; Lane等人 (2002) J. Cutan. Pathol. 29:608-612）。
参考以下实施例可最好地理解此发明的广泛范围，无意将本发明限制为特定实施方式。
本文的所有引用在本文中引入作为参考，就如同每一单个出版物或专利申请被明确和单独地说明被引入作为参考一样。
对本领域技术人员显而易见的，可以对此发明进行多种修改和变化而不背离其精神和范围。仅以示例的方式提供本文描述的特定实施方案，本发明由附加的权利要求书的条款以及这些权利要求赋予的等同物的全部范围限制；本发明不受通过示例方式在本文展示的特定实施方案的限制。
实施例
I. 通用方法
描述了在分子生物学中的标准方法(Maniatis等人 (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA)。在Ausubel等人 (2001) Current Protocols in Molecular Biology, VoIs. 1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, NY中也显示了标准方法，其描述了在细菌细胞中的克隆和DNA突变发生（卷1），在哺乳动物细胞和酵母中的克隆（卷2），复合糖和蛋白质表达（卷3）和生物信息学（卷4）。
描述了用于蛋白质纯化的方法包括免疫沉淀、层析、电泳、离心和结晶(Coligan等人 (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. I, John Wiley and Sons, Inc., New York)。描述了化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的产生、蛋白质的糖基化(见例如Coligan等人 (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., New York; Ausubel等人 (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, pp. 16.0.5-16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; pp. 45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp. 384-391)。描述了多克隆和单克隆抗体的产生、纯化和片段化(Coligan等人 (2001) Current Protcols in Immunology, Vol. I, John Wiley and Sons, Inc., New York; Harlow和Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow和Lane, 见上)。用于表征配体/受体相互作用的标准技术是可利用的（见例如Coligan等人 (2001) Current Protcols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., New York）。在例如美国专利号7,052,686中描述了产生PEG-IL-10的方法。
用于流式细胞术包括荧光激活细胞分选术（FACS）的方法是可利用的（见例如Owens等人 (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; Givan (2001) Flow Cytometry, 2nd ed.; Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ）。用作例如诊断试剂的适于修饰核酸包括核酸引物和探针、多肽和抗体的荧光试剂是可利用的(Molecular Probes (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, MO)。
描述了免疫***组织学的标准方法（见例如Muller-Harmelink (编) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, New York, NY; Hiatt等人 (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams, and Wilkins, Phila, PA; Louis等人 (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, New York, NY）。
描述了用于治疗和诊断癌症的方法（见例如Alison (编) (2001) The Cancer Handbook, Grove's Dictionaries, Inc., St. Louis, MO; Oldham (编) (1998) Principles of Cancer Biotherapy, 3rd. ed., Kluwer Academic PubL, Hingham, MA; Thompson等人 (编) (2001) Textbook of Melanoma, Martin Dunitz, Ltd., London, UK; Devita等人 (编) (2001) Cancer: Principles and Practice of Oncology, 6th ed., Lippincott, Phila, PA; Holland等人 (编) (2000) Holland-Frei Cancer Medicine, BC Decker, Phila., PA; Garrett和Sell (编) (1995) Cellular Cancer Markers, Humana Press, Totowa, NJ; MacKie (1996) Skin Cancer, 2nd ed., Mosby, St. Louis; Moertel (1994) New Engl. J. Med. 330:1136-1142; Engleman (2003) Semin. Oncol. 30(3 Suppl. 8):23-29; Mohr等人 (2003) Onkologie 26:227-233）。
用于测定例如抗原片段、前导序列、蛋白质折叠、功能结构域、糖基化位点和序列比对的软件包和数据库是可利用的（见例如GenBank, Vector NTI? Suite (Informax, Inc, Bethesda, MD); GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, CA); DeCypher? (TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nevada); Menne等人 (2000) Bioinformatics 16: 741-742; Menne等人 (2000) Bioinformatics Applications Note 16:741-742; Wren等人 (2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181; von Heijne (1983) Eur. J. Biochem. 133:17-21; von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683-4690）。
II. 聚乙二醇化的IL-10
用pH范围在5-7.4的50mM磷酸钠，100mM氯化钠透析IL-10（例如啮齿类或灵长类）。1:1-1:7摩尔比的5K PEG-丙醛与1 - 12 mg/ml浓度的IL-10在0.75 - 30 mM氰基硼氢化钠存在下反应。可选地，可用甲基吡啶硼烷用类似的方法激活反应。反应在5 - 30℃下孵育3 - 24小时。
特别地，将聚乙二醇化反应的pH调节至6.3，7.5 mg/ml的hIL-10与PEG反应以使IL-10与PEG接头的比例为1:3.5。氰基硼氢化盐的终浓度为25mM，反应在15℃下进行12-15小时。图1显示了单和双PEG-IL-10的反应动力学。单和双PEG-IL-10是反应的最主要产物，在终止时各自具有50%的浓度。
使用氨基酸例如甘氨酸和赖氨酸或可选地用Tris缓冲液猝灭反应。已应用多种纯化方法例如凝胶过滤、阴离子和阳离子交换层析和大小排阻以分离预期的PEG化的样品（prototype）。
可选地，用10mM磷酸钠pH 7.0, 100mM NaCl透析IL-10。使用透析缓冲液将透析的IL-10稀释3.2倍至约0.5至12 mg/ml的浓度。在加入SC-PEG- 12K (Delmar Scientific Laboratories, Maywood, IL)接头以前，将1倍体积的pH9.1的100mM四硼酸钠加入9倍体积的稀释的IL-10中以将IL-10溶液的pH升高至8.6。将SC-PEG-12K接头溶解在透析缓冲液中并将合适体积的接头溶液（1.8至3.6摩尔接头每摩尔IL-10）加入稀释的IL-10溶液中以起始聚乙二醇化反应。反应在5℃下进行以控制反应速度。在聚乙二醇化反应中温和搅拌反应溶液。当经大小排阻HPLC(SE- HPLC)测定的单PEG-IL-10产量接近40%时，通过加入1M甘氨酸溶液至终浓度30mM停止反应。使用HCl溶液将反应溶液的pH缓慢调节至7.0，将反应溶液经0.2微米过滤并贮存于-80℃。
III. 效力比较
为比较不同PEG-IL-10样品，对每处理组10只小鼠在右侧腹皮下植入100 μL体积的在基质胶中的106个PDV6鳞状细胞癌细胞。一旦平均肿瘤大小达到100 mm3（约在植入后2-3周），开始用以下鼠PEG-IL- 10样品或对照处理，每天1次（除非明确指出，接头为PPA）：
对照           HEPES缓冲液
0.2 mpk        2 x 5K双PEG-IL-10   
0.02 mpk       2 x 5K 双PEG-IL-10
0.2 mpk        1 x 5K 单PEG-IL-10
0.02 mpk      1 x 5K 单PEG-IL-10
0.2 mpk        1 x 5K 单PEG-IL-10 + 2 x 5K 双PEG-IL-10
0.02 mpk       1 x 5K 单PEG-IL-10 + 2 x 5K 双PEG-IL-10
0.2 mpk        1 x 12K 单PEG-IL-10 (SC接头)
0.02 mpk       1 x 12K 单PEG-IL-10 (SC接头)
测量的终点包括肿瘤大小（每周测量2次），体重（每周测量1次）和血清浓度（在处理开始、中点和结束时测量）。图2显示了上述各种样品的效力。
本文的所有引用在本文中引入作为参考，就如同每一单个出版物或专利申请被明确和单独地说明被引入作为参考一样。
对本领域技术人员显而易见的，可以对此发明进行多种修改和变化而不背离其精神和范围。仅以示例的方式提供本文描述的特定实施方案，本发明由附加的权利要求书的条款以及这些权利要求赋予的等同物的全部范围限制；本发明不受通过示例方式在本文展示的特定实施方案的限制。

Claims (10)

1.一种生产单和双聚乙二醇化的IL-10的混合物的方法，其中至少一个PEG分子与IL-10的至少一个亚基的至少一个氨基酸残基共价连接，所述方法包括：
a）将7.5mg/ml的IL-10与活化的PEG接头反应以使IL-10与PEG接头的比例为1:3.5，反应在25mM的还原剂的存在下，在6.3的pH下和15℃的温度下进行；和
b）纯化单和双聚乙二醇化的IL-10的混合物。
2.权利要求1的方法，其中所述PEG接头选自琥珀酰亚胺碳酸酯-PEG、PEG-丁醛、PEG-戊醛、PEG-酰胺基-丙醛、PEG-氨酯基-丙醛和PEG-丙醛。
3.权利要求2的方法，其中所述PEG接头为PEG-丙醛。
4.权利要求1的方法，其中包含所述PEG接头的PEG分子量为从5,000道尔顿至20,000道尔顿。
5.权利要求4的方法，其中包含所述PEG接头的PEG分子量为5,000道尔顿。
6.权利要求1的方法，其中所述还原剂选自硼氢化物、氰基硼氢化钠、胺合硼烷络合物和甲基吡啶硼烷。
7.权利要求6的方法，其中所述还原剂选自氰基硼氢化钠和甲基吡啶硼烷。
8.权利要求1的方法，其中所述单和双PEG的混合物通过选自阳离子交换、阴离子交换、大小排阻和疏水相互作用的层析纯化。
9.权利要求8的方法，其中所述单和双PEG的混合物通过大小排阻层析纯化。
10.一种包含由权利要求1的方法生产的单和双PEG-IL-10和药学上可接受的载体的药物组合物。
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Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT2379115T (pt) * 2008-12-17 2018-01-03 Merck Sharp & Dohme Produção de mono- e di-peg-il-10; e utilizações
MX2015014438A (es) 2013-04-18 2016-05-18 Armo Biosciences Inc Metodos de uso de interleucina-10 para tratar enfermedades y trastornos.
EP3434277A1 (en) 2013-06-17 2019-01-30 Armo Biosciences, Inc. Method for assessing protein identity and stability
CA2920679A1 (en) 2013-08-30 2015-03-05 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
AU2014346537A1 (en) 2013-11-11 2016-05-19 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
CN106573072A (zh) 2014-06-02 2017-04-19 阿尔莫生物科技股份有限公司 降低血清胆固醇的方法
CA2963989A1 (en) 2014-10-14 2016-04-21 Armo Biosciences, Inc. Interleukin-15 compositions and uses thereof
MX2017004983A (es) 2014-10-22 2017-11-13 Armo Biosciences Inc Metodos para usar interleucina 10 para tratar enfermedades y trastornos.
CN105777892A (zh) * 2014-12-17 2016-07-20 深圳翰宇药业股份有限公司 普兰林肽聚乙二醇衍生物、其制备方法及其应用
US10618970B2 (en) 2015-02-03 2020-04-14 Armo Biosciences, Inc. Method of treating cancer with IL-10 and antibodies that induce ADCC
CN107847583A (zh) 2015-05-28 2018-03-27 阿尔莫生物科技股份有限公司 用于治疗癌症的聚乙二醇化白细胞介素‑10
EP3302528A1 (en) 2015-05-29 2018-04-11 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
MX2018002298A (es) 2015-08-25 2018-07-06 Armo Biosciences Inc Metodos de uso de interleucina 10 para el tratamiento de enfermedades y trastornos.
KR20180101417A (ko) 2016-01-11 2018-09-12 아르모 바이오사이언시스 인코포레이티드 항원-특이적 cd8+ t 세포의 제조에서 인터루킨-10 및 이의 사용 방법
EP3551034A1 (en) 2016-12-07 2019-10-16 Progenity, Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
WO2018183931A1 (en) 2017-03-30 2018-10-04 Progenity Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with il-10 or an il-10 agonist
CN111094356B (zh) * 2017-09-25 2022-11-01 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 一种蛋白质异二聚体及其用途
CN111315398A (zh) 2017-11-10 2020-06-19 阿尔莫生物科技股份有限公司 白介素-10与免疫检查点途径抑制剂的组合的组合物和使用方法
EP3810189A1 (en) 2018-06-19 2021-04-28 Armo Biosciences, Inc. Compositions and methods of use of il-10 agents in conjunction with chimeric antigen receptor cell therapy
CN113348011B (zh) 2018-11-19 2023-04-18 比奥拉治疗股份有限公司 用生物治疗剂治疗疾病的方法和装置
CN112955546B (zh) * 2018-11-26 2024-04-16 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种人白细胞介素10变体及其衍生物
CN115666704A (zh) 2019-12-13 2023-01-31 比奥拉治疗股份有限公司 用于将治疗剂递送至胃肠道的可摄取装置

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020044921A1 (en) * 2000-09-29 2002-04-18 Seoju Lee Pegylated interleukin-10

Family Cites Families (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3270960A (en) 1964-09-11 1966-09-06 Sperry Rand Corp Fluid sensor
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
JPS63152393A (ja) 1986-07-03 1988-06-24 Takeda Chem Ind Ltd グリコシル誘導体
US5231012A (en) 1989-06-28 1993-07-27 Schering Corporation Nucleic acids encoding cytokine synthesis inhibitory factor (interleukin-10)
US6217857B1 (en) 1989-06-28 2001-04-17 Schering Corporation Cytokine synthesis inhibitory factor (IL-10) and pharmaceutical compositions thereof
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
CZ282523B6 (cs) 1991-01-16 1997-07-16 Schering Corporation Iterleukin - 10 pro léčení nádorů, farmaceutický prostředek jej obsahující, jeho použití a způsob výroby
MY108267A (en) 1991-01-16 1996-09-30 Schering Corp Use of interleukin-10 in adoptive immunotherapy of cancer
US5767063A (en) 1991-03-29 1998-06-16 Genentech, Inc. Human IL-8 receptor and antibodies thereto
US5624823A (en) 1991-11-22 1997-04-29 The General Hospital Corporation DNA encoding procine interleukin-10
US5665345A (en) 1993-05-24 1997-09-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Methods of inhibiting viral replication using IL-10
PL312718A1 (en) 1993-07-26 1996-05-13 Schering Corp Competitors and opponents of human interleukine-10
GB9317618D0 (en) 1993-08-24 1993-10-06 Royal Free Hosp School Med Polymer modifications
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5951974A (en) 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
JPH09508116A (ja) 1994-01-20 1997-08-19 シェーリング コーポレイション 末梢血単核細胞溶解活性を刺激するためのｉｌ−１０の使用
US5650234A (en) 1994-09-09 1997-07-22 Surface Engineering Technologies, Division Of Innerdyne, Inc. Electrophilic polyethylene oxides for the modification of polysaccharides, polypeptides (proteins) and surfaces
US5650232A (en) 1994-10-07 1997-07-22 Warner-Lambert Company Method for making seamless capsules
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US6410008B1 (en) 1994-12-12 2002-06-25 Beth Israel Hospital Association Chimeric IL-10 proteins and uses thereof
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5866134A (en) 1995-03-24 1999-02-02 Schering Corporation Method for enhancing the antibody response to specific antigens with Interleukin-10
US5770190A (en) 1995-07-14 1998-06-23 Schering Corporation Method of treatment of acute leukemia with inteleukin-10
US5888530A (en) 1995-07-21 1999-03-30 The General Hospital Corporation Method of enhancing delivery of a pharmaceutical formulation
GB2304047A (en) 1995-08-09 1997-03-12 Univ Manchester Pharmaceutical compositions containing cytokines
US5908621A (en) 1995-11-02 1999-06-01 Schering Corporation Polyethylene glycol modified interferon therapy
US5989867A (en) 1996-09-23 1999-11-23 Knappe; Andrea DNA encoding IL-10-like homologue; related reagents
US6660258B1 (en) 1997-05-09 2003-12-09 Pharma Pacific Pty Ltd Oromucosal cytokine compositions and uses thereof
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US6326482B1 (en) 1999-04-23 2001-12-04 Genentech, Inc. SH2 domain-containing peptides
US7666400B2 (en) 2005-04-06 2010-02-23 Ibc Pharmaceuticals, Inc. PEGylation by the dock and lock (DNL) technique
WO2001005821A2 (en) 1999-07-16 2001-01-25 Maria Teresa Bejarano Viral il-10 for the inhibition of angiogenesis, tumorigenesis and metastasis
US6989377B2 (en) 1999-12-21 2006-01-24 Wisconsin Alumni Research Foundation Treating vitamin D responsive diseases
US20030186386A1 (en) 2000-02-11 2003-10-02 Hansen Christian Karsten Interleukin 10
EP1257574A1 (en) 2000-02-11 2002-11-20 Maxygen Aps Improved interleukin 10
JP3894118B2 (ja) 2000-09-20 2007-03-14 株式会社日立製作所 イオントラップ質量分析計を用いた探知方法及び探知装置
GB0212648D0 (en) 2002-05-31 2002-07-10 Immunoclin Lab Ltd Treatment with cytokines
AU2003263552A1 (en) 2002-09-09 2004-03-29 Nautilus Biotech Rational evolution of cytokines for higher stability, the cytokines and encoding nucleic acid molecules
WO2004044006A1 (en) 2002-11-14 2004-05-27 Maxygen, Inc. Conjugates of interleukin-10 and polymers
AU2003292137A1 (en) 2002-11-29 2004-06-23 Maria Grazia Roncarolo Rapamycin and il-10 for the treatment of immune diseases
PL380269A1 (pl) 2002-12-26 2007-01-08 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Koniugaty polimerowe cytokin, czynników wzrostu, hormonów polipeptydowych i ich antagonistów o zachowanej zdolności do wiązania receptora
US7261882B2 (en) 2003-06-23 2007-08-28 Reagents Of The University Of Colorado Methods for treating neuropathic pain by administering IL-10 polypeptides
AU2004293499B2 (en) 2003-11-28 2009-11-26 The University Of Sydney Latent phase viral interleukin-10-(VII-10) and uses thereof
US20060046961A1 (en) 2004-09-02 2006-03-02 Mckay William F Controlled and directed local delivery of anti-inflammatory compositions
WO2006094530A1 (en) * 2005-03-11 2006-09-14 Siegfried Ltd. Di-polymer protein conjugates and processes for their preparation
US20100028296A1 (en) 2005-05-02 2010-02-04 Chavez Raymond A Use of cytokine-derived peptides in treatment of pain and neurodegenerative disease
ATE452908T1 (de) 2005-05-31 2010-01-15 Univ Colorado Il-10 mutante
US20080096252A1 (en) * 2005-10-04 2008-04-24 Zamost Bruce L Production and purification of il-29
US7939056B2 (en) 2005-11-14 2011-05-10 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Interleukin-10 compositions for the treatment of adenocarcinomas
EP2468293B1 (en) 2006-09-28 2014-10-22 Merck Sharp & Dohme Corp. Use of pegylated il-10 to prevent metastasis of a cancer or tumor to the lung
JP2010506166A (ja) 2006-10-05 2010-02-25 エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ デング熱の診断及び治療
CA2708004C (en) 2006-12-04 2015-12-01 Promedior, Inc. Conjoint therapy for treating fibrotic diseases
EP2200649A4 (en) 2007-10-19 2012-09-26 Univ California COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING CNS INFUSION, PSYCHOSIS, DELIRE, PTSD OR PTSS
PT2379115T (pt) * 2008-12-17 2018-01-03 Merck Sharp & Dohme Produção de mono- e di-peg-il-10; e utilizações
MX2015014438A (es) * 2013-04-18 2016-05-18 Armo Biosciences Inc Metodos de uso de interleucina-10 para tratar enfermedades y trastornos.

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020044921A1 (en) * 2000-09-29 2002-04-18 Seoju Lee Pegylated interleukin-10

Also Published As

Publication number Publication date
JP2012512250A (ja) 2012-05-31
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WO2010077853A3 (en) 2010-09-02
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JP2018168160A (ja) 2018-11-01
WO2010077853A2 (en) 2010-07-08

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