CN102227443B - 治疗性核糖核酸酶 - Google Patents

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Abstract

公开了用于治疗或预防疾病的核糖核酸酶(RNA酶)。所述核糖核酸酶包括具有带下述氨基酸修饰的人RNA酶1序列的核糖核酸酶：R4C、G38R、R39G、N67R、G89R、S90R和V118C。所述核糖核酸酶可重组制备，以用作治疗性制备物。所述核糖核酸酶可以是宿主细胞中所含表达载体中的核酸序列。

Description

治疗性核糖核酸酶
相关申请的交叉引用
本申请要求享有于2008年10月1日提交的美国临时专利申请序列号61/101,905的优先权，其全部公开内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及核糖核酸酶(RNA酶)在疾病的治疗或预防中的应用。
背景技术
在美国人口中，估计仅与15种最常见癌症类型相关的死亡率每年就为每100,000人中有接近170人死亡(Martin L Brown，JosephLipscomb和Claire Snyder，2001，THE BURDEN OF ILLNESS OFCANCER：Economic Cost and Quality of Life，Ann.Rev.Public Health，22：91-113)。目前，估计每年有1,437,180例新发癌症和565,650例死亡(American Cancer Society Cancer Facts and Figures 2008)。癌症的经济负担在1990年估计超过$960亿美元(Brown等人，2001)。
术语“化学疗法”仅指以化学物质治疗疾病。化学疗法之父PaulEhrlich将完美的化学治疗剂设想为“魔术子弹”；这种化合物将杀死侵入的生物体或细胞而不伤害宿主。虽然在确认杀死或抑制癌细胞的化合物方面和确认将这种化合物指向所指定的靶标细胞的方法方面已经取得了显著进展，但本领域中还需要改善的治疗性化合物。
有多种不同类型的化学治疗剂可以使用，包括小分子和生物制剂，如核酸化合物、多肽化合物或其衍生物。通常，需要考虑的化学治疗剂的性质包括效能、药代动力学性质和制造的容易性。作为对小分子的替代性方案，蛋白治疗剂通常可提供特殊优点；不过，有效的蛋白药物必须具有包括以下的最佳性质的平衡：特异性、细胞毒性、对其靶标的亲和性、安全性、溶解性、有效递送的顺从性、稳定性和体内寿命(清除时间)。这些性质中任何一种性质优异的候选药物可能不具有作为有效药物的全部特征的最佳平衡。
本领域中需要具有用于治疗情况的有效补充特征的另外的抗癌化学治疗剂。
发明内容
本发明涉及RNA酶在疾病的治疗或预防中的应用。在一些实施方式中，RNA酶用于治疗或预防人类疾病，如癌症。在一些实施方式中，重组人RNA酶1的变体具有用于治疗或预防人癌症的所期望性质的最佳平衡。这些性质包括但不限于稳定性、对病原细胞的细胞毒性、降解包括病毒RNA在内的任何来源的病原RNA的效能、逃避被RNA酶抑制剂结合、对蛋白酶降解的抵抗性、向靶标细胞的递送、向细胞中输入的效率、剂量响应性、药代动力学性质和在人体内的寿命。在一些实施方式中，本发明的治疗性组合物和方法利用了人RNA酶1的变体，所述变体与野生型酶相比具有如下氨基酸变化：R4C、G38R、R39G、N67R、G89R、S90R和V118C。在一些实施方式中，核糖核酸酶包含SEQ ID NO：1或由SEQ ID NO：1组成，所述SEQ ID NO：1为：
KESCAKKFQRQHMDSDSSPSSSSTYCNQMMRRRNMTQRGCKPVNTFVHEPLVD
VQNVCFQEKVTCKRGQGNCYKSNSSMHITDCRLTNRRRYPNCAYRTSPKERHII
VACEGSPYVPCHFDASVEDST.
在一些实施方式中，所述氨基酸序列包含具有N-末端甲硫氨酸的SEQ ID NO：1(SEQ ID NO：4)或由具有N-末端甲硫氨酸的SEQ ID NO：1(SEQ ID NO：4)组成，所述具有N-末端甲硫氨酸的SEQ ID NO：1(SEQID NO：4)为：
MKESCAKKFQRQHMDSDSSPSSSSTYCNQMMRRRNMTQRGCKPVNTFVHEPLV
DVQNVCFQEKVTCKRGQGNCYKSNSSMHITDCRLTNRRRYPNCAYRTSPKERHI
IVACEGSPYVPCHFDASVEDST.
在一些实施方式中，核糖核酸酶重组生成。在一些实施方式中，核糖核酸酶由包含SEQ ID NO：2的核酸分子编码，所述SEQ ID NO：2为：
AAA GAA TCT TGC GCT AAA AAA TTC CAG CGT CAG CAC ATG GAC TCT GAC
TCT TCT CCG TCT TCT TCT TCT ACT TAC TGC AAC CAG ATG ATG CGT CGC
CGT AAC ATG ACT CAG CGT GGT TGC AAA CCG GTT AAC ACT TTC GTT CAT
GAA CCG CTG GTT GAC GTT CAG AAC GTT TGC TTC CAG GAA AAA GTT ACT
TGC AAA CGC GGT CAG GGT AACTGC TAC AAA TCT AAC TCT TCT ATG CAT
ATC ACT GAC TGC CGT CTG ACG AAT CGT CGC CGT TAC CCG AAC TGC GCT
TAC CGT ACT TCT CCG AAA GAA CGT CAT ATC ATC GTT GCT TGC GAA GGT
TCT CCG TAC GTT CCG TGT CAT TTC GAC GCT TCT GTT GAA GAC TCT ACC
在一些实施方式中，编码核糖核酸酶的表达载体还包含前导序列，例如SEQ ID NO：3：
TT GNT TAA CTT TAA GAA GGA GAT ATA CATATG
在一些实施方式中，编码核糖核酸酶的表达载体还包含一个或多个终止密码子(例如，TAA和/或TGA)。
在一些实施方式中，RNA酶与作为提供改善的物理性质的要素的水溶性部分缀合。在一些实施方式中，水溶性部分是聚乙二醇(PEG)分子。在一些实施方式中，RNA酶与将RNA酶靶向特殊细胞类型(如病态细胞或癌细胞)的部分缀合或融合或缔合。
因此，在一些实施方式中，本发明提供了包含核糖核酸酶(例如，纯化的核糖核酸酶)的组合物(例如，治疗性制备物)，所述核糖核酸酶具有带有如下氨基酸修饰的人RNA酶1序列(例如，包含SEQ ID NO：1或由SEQ ID NO：1组成)：R4C、G38R、R39G、N67R、G89R、S90R和V118C。在一些实施方式中，本发明提供了包含编码所述核糖核酸酶的核酸序列(例如，包含SEQ ID NO：2)的表达载体。在一些实施方式中，本发明提供了包含所述表达载体的宿主细胞。在一些实施方式中，本发明还提供了通过将核糖核酸酶单独施用或与其它试剂组合施用于受试者(例如，患有癌症或疑似患有癌症的人受试者)而治疗所述受试者的方法。施用可以以治疗有效剂量在一个或多个时点进行(例如，以每周0.01～100mg/kg受试者体重施用一周或多周；以每天0.01～100mg/kg受试者体重施用一天或多天；或者以每次治疗0.01～100mg/kg受试者体重施用一次或多次治疗)。
如本文所用，术语“核糖核酸酶的变体”是指经修饰的核糖核酸酶，其保留了与其所衍生自的未-经修饰的核糖核酸酶相似的酶活性(例如，保留了至少60％、至少75％、至少85％、至少95％或至少99％的活性)。测定酶活性的试验在本文中进行了描述并且是本领域已知的。所述变体可以是天然酶的变体或者可以是非-天然酶的变体。例如，可以将具有SEQ ID NO：1的特定非-天然合成核糖核酸酶修饰为包含可导致SEQ ID NO：1的变体的一个或多个氨基酸变化。在一些优选实施方式中，该变体与未-经修饰的核糖核酸酶相比具有一个或有限数量的氨基酸取代(例如，保守或非-保守取代)、添加或缺失(例如，截短)。
如本文所用，术语“保留RNA降解活性的核糖核酸酶变体”是指具有其所衍生自的未-经修饰的核糖核酸酶的至少50％、至少60％、至少75％、至少85％、至少95％或至少99％的RNA降解活性的核糖核酸酶变体(例如，SEQ ID NO：1)。RNA降解活性可以利用任何适当的测试法进行测定，所述测试法包括但不限于利用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳对经降解的RNA样品进行可视化和定量。在一些优选实施方式中，所述变体与未-经修饰的核糖核酸酶相比具有一个或有限数量的氨基酸取代(例如，保守或非-保守取代)、添加或缺失(例如，截短)。
如本文所用，术语“具有基本相同的细胞杀死活性、细胞毒活性、细胞抑制活性或细胞损伤活性的核糖核酸酶变体”是指具有其所衍生自的未-经修饰的核糖核酸酶的至少50％、至少60％、至少75％、至少85％、至少95％或至少99％的细胞杀死活性、细胞毒活性、细胞抑制活性或细胞损伤活性的核糖核酸酶变体(例如，SEQ ID NO：1)。例如，在一些实施方式中，所述活性是杀死或影响癌细胞的能力。在另一些实施方式中，所述活性是减小动物的肿瘤尺寸的能力。在又一些实施方式中，所述活性是减少以异常细胞生长为特征的疾病(例如，癌症)的症状的能力。可以使用任何适当的方法测定活性，所述方法包括但不限于商售细胞成活性测试法、肿瘤尺寸的测定和商售细胞增殖测试法。在一些优选实施方式中，与野生型酶相比所述变体具有一个或有限数量的氨基酸取代(例如，保守或非-保守取代)、添加或缺失(例如，截短)。
如本文所用，术语“保留蛋白质折叠性质的核糖核酸酶变体”是指显示了与其所衍生自的未-经修饰的核糖核酸酶相似的蛋白质折叠性质的核糖核酸酶变体(例如，SEQ ID NO：1)。蛋白质折叠性质包括蛋白质折叠速度和正确结构的折叠(基本保留其所衍生自的未-经修饰的核糖核酸酶的活性的折叠)。在优选的实施方式中，变体以其所衍生自的未-经修饰的核糖核酸酶的速度的至少50％、至少60％、至少75％、至少85％、至少95％或至少99％或更多的速度折叠。蛋白折叠的测试是本领域公知的，包括但不限于光谱测试和酶学(例如RNA降解)测试以及HPLC。在一些优选实施方式中，与野生型酶相比，所述变体具有一个或有限数量的氨基酸取代(例如，保守或非-保守取代)、添加或缺失(例如，截短)。
如本文所用，术语“具有相似免疫原性的核糖核酸酶变体”是指这样的核糖核酸酶变体(例如，SEQ ID NO：1)：在一些实施方式中，其展示出与其所衍生自的未-经修饰的核糖核酸酶基本相同或更好的免疫原性。免疫原性包括毒性和动物体内不利的免疫应答(例如，细胞毒性免疫应答)。在优选实施方式中，变体展示出小于100％、优选小于90％、更优选小于80％、进而更优选小于70％的其所衍生自的未-经修饰的核糖核酸酶的毒性或不利的免疫应答。可以使用任何适当方法确定毒性或免疫原性的水平，所述方法包括但不限于毒性和免疫应答的商售测试法(例如，细胞因子或T-细胞响应的测定)。在一些优选实施方式中，与野生型酶相比，所述变体具有一个或有限数量的氨基酸取代(例如，保守或非-保守取代)、添加或缺失(例如，截短)。
术语“异源核酸序列”或“异源基因”可互换使用，指和天然状态中不与其连接、或天然状态中与其在不同位置连接的核酸序列相连接的核苷酸序列。异源DNA对其所引入的细胞不是内源的，而是从另一细胞中获得。通常，但非必须的是，所述异源DNA编码RNA和蛋白，而所述RNA和蛋白通常不由表达其的细胞产生。异源DNA的实例包括报告基因、转录和翻译调控序列、可选择的标记物蛋白(例如，赋予抗药性或治疗益处的蛋白)等。
如本文所用，术语“免疫球蛋白”或“抗体”是指结合特异性抗原的蛋白。免疫球蛋白包括但不限于，多克隆、单克隆、嵌合和人源化抗体、Fab片段、F(ab′)2片段，并且包括以下类别的免疫球蛋白：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE和分泌型免疫球蛋白(sIg)。免疫球蛋白通常包含2个相同的重链和2个轻链。不过，术语“抗体”和“免疫球蛋白”还包括单链抗体和双链抗体。
如本文所用，术语“抗原结合蛋白”是指结合特异性抗原的蛋白。“抗原结合蛋白”包括但不限于：包括多克隆、单克隆、嵌合和人源化抗体的免疫球蛋白；Fab片段、F(ab′)2片段和Fab表达文库；和单链抗体。
术语“表位”在本文用于指抗原的与特定免疫球蛋白接触的部分。
当使用蛋白或蛋白片段免疫宿主动物时，所述蛋白的多个区域可以引起抗体生成，所述抗体特异性结合给定区域或蛋白的三维结构；这些区域或结构称为“抗原决定簇”。抗原决定簇可以与完整抗原(即，用于引发免疫应答的“免疫原”)竞争结合抗体。
述及抗体和蛋白或肽的相互作用而使用的术语“特异结合”或“特异性结合”表示该相互作用取决于蛋白上存在的特定结构(即，抗原决定簇或表位)；即，抗体所识别和结合的是特异蛋白结构，而不是一般性蛋白。例如，如果抗体对表位“A”是特异性的，在含有标记的“A”和抗体的反应中存在含有表位A(或游离的非标记的A)的蛋白将减少与抗体结合的标记的A的量。
如本文所用，述及抗体和蛋白或肽的相互作用而使用的术语“非-特异结合”和“背景结合”是指不依赖于特定结构存在的相互作用(即，抗体与一般性蛋白结合，而不是与如表位等特定结构结合)。
如本文所用，术语“受试者”是指任何动物(例如哺乳动物)，所述动物包括但不限于人、非-人灵长类动物和啮齿类动物等，其是特定治疗的接受者。通常，术语“受试者”和“患者”在本文中述及人受试者时可互换使用。
如本文所用，术语“疑似患有癌症的受试者”是指存在一种或多种指示癌症的症状(例如，明显的肿块或包块)或进行癌症筛查(例如，在常规体检过程中)的受试者。疑似患有癌症的受试者还可以具有一种或多种风险因素。疑似患有癌症的受试者一般未接受过癌症检测。然而，“疑似患有癌症的受试者”包括已接受初步诊断(例如，显示包块的CT扫描)但未进行确诊检测(例如，活组织检查和/或组织学检查)或癌症阶段未知的个体。该术语还包括曾经患癌的受试者(例如，复原中的个体)。“疑似患有癌症的受试者”有时诊断患有癌症，有时发现不患有癌症。
如本文所用，术语“诊断患有癌症的受试者”是指已进行检测并发现具有癌细胞的受试者。可以利用任何适当方法诊断癌症，所述方法包括但不限于，活组织检查、x-射线、血液检测和本发明的诊断方法。“初步诊断”是仅基于视觉(例如，CT扫描或存在肿块)和抗原检测的诊断。
如本文所用，术语“有癌症风险的受试者”是指具有一种或多种患特定癌症的风险因素的受试者。风险因素包括但不限于性别、年龄、遗传倾向、环境接触和此前的癌症事件、已存在的非-癌症疾病和生活方式。
如本文所用，术语“非-人动物”是指所有非-人动物，包括但不限于脊椎动物，例如啮齿类动物、非-人灵长类动物、绵羊、牛、反刍动物、兔、猪、公山羊、马、犬、猫、鸟等。
“氨基酸序列”和如“多肽”或“蛋白”等术语不意图将氨基酸序列限制为与所述蛋白分子相关的完整天然的氨基酸序列。
术语“测试化合物”和“候选化合物”是指作为用于治疗或预防疾病、病患、不适或身体功能紊乱(例如，癌症)的候选物的任何化学或生物学实体、药物和药剂等。测试化合物包括已知的和潜在的治疗化合物。利用本发明的筛选方法通过筛选，可将测试化合物确定为治疗剂。
如本文所用，术语“样品”取其最广泛的含义。在一个含义中，其表示包括从任何来源获得的样本或培养物，以及生物和环境样品。生物样品可以获得自动物(包括人)并包括液体、固体、组织和气体。生物样品包括血液品，例如血浆、血清等。环境样品包括环境材料，如表面物、土壤、水和工业样品。不过，这些实例不应被理解为对适用于本发明的样品种类的限制。
术语“基因”是指包含产生多肽或前体(例如，本发明的核糖核酸酶或核糖核酸酶的缀合物)所必需的编码序列的核酸(例如，DNA)序列。多肽可以由全长编码序列或所述编码序列的任何部分编码，只要保留了全长或片段的所需活性或功能性质(例如，酶活性等)即可。该术语还包含结构基因的编码区，并且包括在5′和3′端以距任一端约1kb距离的邻近编码区的序列，因此该基因对应于全长mRNA的长度。位于编码区5′并存在于mRNA中的序列称为5′非翻译序列。位于编码区3′或下游并存在于mRNA中的序列称为3′非翻译序列。术语“基因”包含cDNA和基因的基因组形式。基因的基因组形式或克隆含有由称为“内含子”或“间插区”或“间插序列”的非-编码序列中断的编码区。内含子是基因的转录为核RNA(hnRNA)的区段；内含子可以含有调控元件，例如增强子。内含子从核或初级转录体中去除或“剪接掉”；因此内含子不存在于信使RNA(mRNA)转录体中。翻译过程中mRNA担当指导新生多肽中氨基酸序列或顺序的功能。
术语“片段”在本文中用于指与天然蛋白相比具有氨基-末端和/或羧基-末端缺失、但剩余氨基酸序列与由全长cDNA序列推导出的氨基酸序列相应位置相同的多肽。片段长度通常至少4个氨基酸、优选至少20个氨基酸、通常为至少50个氨基酸或更长，并且覆盖了该成分与其各种配体和/或底物分子间结合所需的多肽部分。在一些实施方式中，片段具有天然蛋白的活性。
如本文所用，术语“纯化的”或“纯化”是指去除样品中的杂质和污染物。例如，通过去除非-免疫球蛋白的蛋白而纯化抗体；还可以通过去除不结合指定靶标分子的免疫球蛋白而纯化抗体。非-免疫球蛋白的蛋白的去除和/或不结合指定靶标分子的免疫球蛋白的去除使得样品中靶标反应性免疫球蛋白的百分比增加。在另一实例中，重组多肽在宿主细胞中表达，并通过去除宿主细胞蛋白而纯化所述多肽；因此样品中重组多肽的百分比增加。
术语“表达载体”在本文中用于指含有所需编码序列和适当核酸序列的重组DNA分子，所述适当核酸序列是在特定宿主生物体中表达所操纵性连接的编码序列所必需的。在原核生物中表达所必需的核酸序列通常包括启动子、操纵子(可选)和核糖体结合位点，通常还有其他序列。已知真核细胞可利用启动子、增强子以及终止和多聚腺苷酸化信号。
如本文所用，术语“宿主细胞”是指任何真核或原核细胞(例如，细菌细胞如大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞、禽类细胞、两栖动物细胞、植物细胞、鱼类细胞和昆虫细胞)，而无论这些细胞位于体外还是体内均可。例如，宿主细胞可以位于转基因动物中。
具体实施方式
本发明提供了核糖核酸酶组合物和方法。发现所述核糖核酸酶可用作药剂和研究试剂(例如，用于研究或表征细胞、组织或生物体中的生物过程)。例如，在一些实施方式中，提供了包含SEQ ID NO：1的核糖核酸酶。SEQ ID NO：1是具有下述氨基酸修饰的天然人RNA酶1：R4C、G38R、R39G、N67R、G89R、S90R和V118C(X#Y，其中X是天然氨基酸，#是基于人RNA酶1的所认识的编号体系的氨基酸位置，Y是替代X的经修饰的氨基酸)。本发明还提供了SEQ ID NO：1的变体，所述变体保持了4C、38R、39G、67R、90R和118C序列，但包括一个或多个额外的氨基酸改变。下面将更详细描述各种变体。
根据产生有效治疗分子的多种性质的平衡来确认本发明的核糖核酸酶。所考虑的性质包括稳定性、对病原细胞的细胞毒性、降解包括病毒RNA在内的任何来源的病原RNA的效能、逃避被RNA酶抑制剂结合、对蛋白酶降解的抵抗性、向靶标细胞的递送、向细胞中输入的效率、剂量响应性、药代动力学性质和在人体内的寿命。例如，SEQ IDNO：1的核糖核酸酶提供了有用的治疗分子，所述治疗分子具有的性质平衡使其优于此前描述的治疗性核糖核酸酶，如美国专利公报序列号20050261232(通过引用将其整体并入本文)描述的QBI-119。在选择最佳化合物时可能被认为重要的某些特征(例如，酶活性、逃避核糖核酸酶抑制剂等)方面，SEQ ID NO：1的核糖核酸酶劣于QBI-119和天然人RNA酶1，不过却提供了整体优异的治疗剂。例如，SEQ ID NO：1只具有天然人RNA酶1的核糖核酸酶活性的一部分(小于1％)，不过具有治疗有效性。
发现本发明的核糖核酸酶可用于治疗多种疾病状态，包括多种癌症类型。例如，对SEQ ID NO：1测试了抗非-小细胞肺癌细胞(A549细胞系)、胰腺癌细胞(BxPC3细胞系)和***癌细胞(DU145细胞系)的性质，并发现以15mg/kg-100mg/kg的剂量范围，每天或每周给药1～5次，抑制超过65％(并且高达94％)的肿瘤生长。在抑制百分比(等于或好于QBI-119)和其可高度有效的癌细胞类型多样性方面，SEQ ID NO：1均优于QBI-119。
可以将本发明的核糖核酸酶配制为含有或不含有其他治疗剂、载体、赋形剂或其他组分(例如，靶向部分、水溶性分子等)的任何所需形式。可以将核糖核酸酶作为治疗剂或研究试剂包装在试剂盒中，所述试剂盒含有用于运输和/或储存的包装和适当容器，包括成为用于一个或多个患者的单剂量或多剂量形式的制备物。
本发明还提供了包含不显著改变核糖核酸酶的一个或多个或任何治疗相关性质的氨基酸变化的SEQ ID NO：1变体。本文更详细描述了这些变体的实例。例如，据认为单独以异亮氨酸或缬氨酸替代亮氨酸、以谷氨酸替代天冬氨酸、以丝氨酸替代苏氨酸或以一种氨基酸替代结构相关氨基酸的相似替代(即，保守突变)将不对所得分子的生物活性有大的影响。因此，本发明的一些实施方式提供了含有保守替代的本文公开的核糖核酸酶变体。保守替代是在侧链相关的氨基酸家族内发生的替代。遗传编码的氨基酸可分为四个家族：(1)酸性(天冬氨酸、谷氨酸)；(2)碱性(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；(3)非极性(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)；和(4)不带电极性(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时统称芳香族氨基酸。按照相似方式，氨基酸集可分为(1)酸性(天冬氨酸、谷氨酸)；(2)碱性(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；(3)脂肪族(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸)，其中可选将丝氨酸和苏氨酸单独分为脂肪族-羟基氨基酸；(4)芳香族(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)；(5)酰胺类(天冬酰胺、谷氨酰胺)；和(6)含硫氨基酸(半胱氨酸和甲硫氨酸)(例如，Stryered.，Biochemistry，17页-21页，2nd ed，WH Freeman and Co.，1981)。通过评价变体肽以与野生型蛋白相似的方式发挥功能的能力，可以容易确定肽的氨基酸序列的改变是否得到功能性多肽。具有多于一个替换的肽可容易地通过相同方式检测。
更罕见的是，变体包含“非保守”改变(例如，以色氨酸替代甘氨酸)。相似性最小的变化还可包括氨基酸缺失和/或***。确定何种氨基酸残基可以被取代、***或缺失而不丧失生物活性的指导可以利用计算机程序找到(所述计算机程序包括但不限于，FADE(Mitchell等人，(2004).Molec.Simul.30，97-106)；MAPS(Ban等人，Proceedings of the 8thAnnual International Conference on Research in Computational MolecularBiology，2004，205-212)、SYBYL(Tripos，Inc，St.Louis，MO)；和PyMOL(可在sourceforge的互联网站点获得))。
RNA酶1的晶体结构由例如Pous等人(Acta Crystallogr D BiolCrystallogr.2001；57，498-505)和Pous等人(J Mol Biol.2000；303，49-60)有所描述，并且作为选择变化的基础。此外，还可获得其他人胰腺核糖核酸酶的晶体结构，包括嗜酸的衍生的神经毒素(EDN，RNA酶2；Swaminathan等人，Biochemistry，2002，41，3341-3352，Mosimann等人J.Mol.Biol.，1996，260，540-552.；Iyer等人J Mol Biol，2005，347，637-655)、嗜酸阳离子蛋白(ECP，RNA酶3；Mohan等人Biochemistry2002；41，12100-12106；Boix等人Biochemistry，1999，38，16794-16801.；Mallorqui-Fernandez等人J.Mol.Biol，2000，300，1297-1307)、RNA酶4(Terzyan等人，1999，285，205-214.)和血管生成素(RNA酶5；Leonidas等人J.Mol.Biol.1999，285，1209-1233；Leonidas等人Protein Sci.，2001，10，1669-1676；Papageorgiou等人EMBO J.，1997，16，5162-5177；Shapiro等人J.Mol.Biol.，2000，302，497-519.)。
可以诸如通过定向进化或其他产生变体组合文库的技术等方法来产生变体，下文有更详细描述。在本发明的又一些实施方式中，可以对本发明的核苷酸序列进行工程化从而改变人RNA酶编码序列，包括但不限于改变基因产物的克隆、加工、定位、分泌和/或表达的变化。例如，可利用本领域公知技术引入突变(例如，***新限制位点、改变糖基化模式或改变密码子偏好的定点突变等)。在一些实施方式中，在编码本发明多肽的核酸序列中进行改变，从而根据基因在其中进行表达的生物体进行密码子优化。
下面描述示例性变体，包括但不限于取代、截短、嵌合等。本发明不限于这些具体变体。活性位点和底物结合区域中的变体以及离开活性位点的变体均设想在本发明的范围内。例如，与正常人RNA酶1相比，SEQ ID NO：1的变体包括R4C、G38R、R39G、N67R、G89R、S90R和V118C改变，而且还含有影响或不影响所述酶的一个或多个活性或性质的一个或多个额外的改变。可以根据例如实验数据、计算机建模和合理设计通过与其他核糖核酸酶进行比较，从而选择变体。可以利用选择具有所需性质的变体的测试来检测活性(例如见，Raines等人，J.Biol.Chem，273，34134(1998)；Fisher等人，Biochemistry 37：12121(1998)；Guar等人，J.Biol.Chem.，276：24978(2001)；Bosch，等人，Biochemistry，43：2167(2004，)；Lin，J.Biol.Chem.，245：6726(1970)；Bal等人，Eur.J.Biochem.，245：465(1997)；Guar等人，Mol.Cell.Biochem.，275：95(2005)；Benito等人，Protein Eng.，15：887(2002)；Ribo等人，Biol.Chem.Hoppe-seyler，375：357(1994)；DiGaetano等人，Biochem.J.，358：241(2001)；Trautwein等人，FEBS Lett.，281：277(1991)；Curran等人，Biochemistry 32：2307(1993)；Sorrentino等人，Biochemistry 42：10182(2003)；将各篇文献以引用方式整体并入本文)。
下文提供了在变体生成中进行修饰的示例性氨基酸位置。根据需要，可以对一个或多个位点进行修饰。以下的示例性列表提供了基于野生型人RNA酶1的氨基酸编号的各氨基酸位置修饰的效用的评级(例如，表示为修饰的益处(例如，从而得到功能性核糖核酸酶(例如，具有所需性质(例如，癌细胞杀死和/或核糖核酸裂解(ribonucleolytic)活性)的功能性核糖核酸酶)))。根据需要在核糖核酸酶修饰(例如，缺失、取代或产生核糖核酸酶变体和/或与水溶性聚合物缀合的其他种类突变)后还保留在核糖核酸酶中的本文所述核糖核酸酶的特性(例如，生物活性(例如，核糖核酸裂解活性、癌细胞杀死活性、寡聚反应能力等))，可将“益处位点”表征为“高益处位点”、“中益处位点”或“低益处位点”。例如，高益处位点是那些可被修饰而不显著干扰核糖核酸酶的一个或多个所需活性或性质的位点：高益处(1-3、13-24、31-39、48-50、60、66-71、75-78、87-94、105、112-115和127-128)；中益处(4-11、25、27-30、42-47、51-57、59、61-64、73-74、79-83、85-86、96-104、106-109、111、116-118和120-126)；和低益处(12、26、40-41、58、65、72、84、95、110和119)。
应当意识到，可以使用一个或多个修饰位点。优选的是，所选位点是高益处位点或中益处位点。不过，一个或多个额外的位点可以根据需要进行改变，并适合于预计的应用。应当注意的是，在一些实施方式中，(例如，通过用于产生蛋白(例如，重组人核糖核酸酶(例如，大肠杆菌中产生))的方法)引入甲硫氨酸(例如，甲硫氨酸不是野生型人RNA酶的一部分)作为蛋白的第一个氨基酸的方式制备RNA酶。因此，在一些实施方式中，本文所示的氨基酸残基的编号可以为1个数值的偏离(例如，如果将甲硫氨酸引入蛋白中，则本文所述人RNA酶的氨基酸残基的编号偏离1(即，由于在位置1引入甲硫氨酸，所以所述氨基酸编号少1，例如，10号残基由于位置1处引入甲硫氨酸而实际上成为11号残基))。类似的是，所述位置还可以适用于其他相关核糖核酸酶的对应数值位置。
在一些实施方式中，对本发明中进行修饰(例如，缺失、突变等)的所需残基进行选择以避免破坏核糖核酸酶的三级结构和/或稳定性。在一些实施方式中，这些残基位于蛋白表面(例如，通常接触溶剂(例如，水或缓冲液)的残基)。例如，在一些实施方式中，经修饰的残基类型包括但不限于，在晶体结构中表现混乱的氨基酸、接触核糖核酸酶抑制剂蛋白的残基和三级结构(例如，α螺旋和β片层)不涉及的氨基酸、结构(例如，α螺旋和β片层)之间的环区域中的氨基酸以及蛋白末端(N-末端和C-末端)的氨基酸。在一些实施方式中，在N-末端或C-末端添加额外的氨基酸残基(例如，用于产生RNA酶类似物和/或用于缀合水溶性聚合物)。
在一些实施方式中，本发明提供了核糖核酸酶的聚合物缀合，从而增加其体内循环半衰期，并保留核糖核酸裂解活性或其他所需功能(例如，癌细胞杀死功能)。在一些实施方式中，在核糖核酸酶蛋白的避免核糖核酸酶抑制剂(RI)所涉及的区域中将核糖核酸酶与水溶性聚合物缀合。在一些优选实施方式中，在核糖核酸酶蛋白的避免RI所不涉及的区域(例如，不影响核糖核酸酶与RI结合的区域)中将核糖核酸酶与水溶性聚合物缀合。不涉及避免RI的区域的实例包括但不限于，包含1、49、75或113位氨基酸残基的区域。因此，虽然对机理的理解不是实施本发明所必需的，并且本发明不限于任何具体的作用机理，但在一些实施方式中，即使水溶性聚合物与核糖核酸酶的缀合无助于核糖核酸酶逃避RI，但该缀合还具有生物活性(例如，癌细胞杀死活性)。
在一些实施方式中，本发明在RNA酶中引入了独特的功能性基团，以便缀合水溶性聚合物。例如，在一些实施方式中，将半胱氨酸分子工程化到RNA酶中(例如，不丧失核糖核酸裂解活性或其他所需功能(例如，癌细胞杀死功能))，从而提供用于缀合水溶性聚合物的游离巯基。在RNA酶中别处没有发现游离巯基，从而提供了产生均一缀合的能力。在其它实施方式中，利用重组DNA技术来提供经修饰的或新型的密码子，从而在所研究的RNA酶中引入具有正交功能的非-天然氨基酸(而例如，不丧失核糖核酸裂解活性)。
在一些实施方式中，核糖核酸酶经修饰而包含一个或多个氨基酸残基，例如赖氨酸、半胱氨酸和/或精氨酸，从而提供水溶性聚合物的结合位置(例如，与氨基酸侧链中的原子结合)。本领域普通技术人员公知添加氨基酸残基的技术(例如见，March，Advanced Organic Chemistry：Reactions Mechanisms and Structure，4th Ed.(New York：Wiley-Interscience，1992))。
本发明不限于本文所述的对所述核糖核酸酶进行的修饰的种类。在一些实施方式中，通过结合选自葡聚糖、糖类、白蛋白、载体蛋白和抗体(例如，用于延长核糖核酸酶半衰期的非靶向性抗体)的一个或多个部分而改变本发明。
本发明不限于本文所述的用于与人核糖核酸酶缀合所用的水溶性聚合物种类。实际上，可以使用任何生物相容性水溶性聚合物。在一些实施方式中，水溶性聚合物是非肽类、无毒性、非-天然存在的和/或生物相容的。如果通过临床医师(例如，内科医生)评估，将聚合物单独使用或与其他物质(例如，与核糖核酸酶缀合)组合使用(例如，施用于患者)的与活组织有关的有益效果超过任何不利效果，则认为该水溶性聚合物具有生物相容性。对于非-免疫原性，如果聚合物在体内的预定使用并未产生不利的免疫应答(例如，形成抗体)，或者即使产生免疫应答，这种应答也不被临床医师评估为临床显著的或重要的，则该聚合物被认为是非免疫原性的。因此，在一些优选实施方式中，所述水溶性聚合物是生物相容的和非免疫原性的。
选择本发明的水溶性聚合物，从而使该聚合物在与人核糖核酸酶结合时在水性环境(例如生理环境)中不沉淀。在一些实施方式中，根据与人核糖核酸酶蛋白的缀合方法选择聚合物。例如，对于利用还原性烷基化的方法，所选聚合物应具有单一反应性醛从而可以控制聚合度。聚合物可以是枝化的或非枝化的。优选的是，对于终产物制备物的治疗应用，聚合物为药学可接受的。根据对聚合物/蛋白缀合物是否用于治疗，以及如果用于治疗时的所需剂量、循环时间、对蛋白水解作用的抗性的考虑和其他考虑，本领域技术人员能够选择所需聚合物。例如，利用本领域公知方法测试缀合物的体外核糖核酸裂解活性，可以查明这些考虑因素。
水溶性聚合物可以选自下组：该组包括但不限于聚(烷撑二醇)，如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(“PPG”)、乙二醇和丙二醇的共聚物等，聚(氧乙基化的多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)、聚(羟烷基甲基丙烯酸酯)、聚(糖)、聚(α-羟基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚
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唑啉、聚(N-丙烯酰吗啉)及上述任何物质的组合。
所述聚合物可以为直链(例如，烷氧基PEG或双功能PEG)或支链。另外，所述聚合物可以是多臂的(例如，分叉PEG或与多醇核结合的PEG)、树枝的和/或包含可降解的键。还设想，聚合物的内部结构可以组织为多种不同模式中的任何模式(例如，包括但不限于均聚物、交替共聚物、随机共聚物、嵌段共聚物、交替三聚体、随机三聚体和嵌段三聚体的模式)。
此外，聚合物可以由适合于与核糖核酸酶中的所需残基偶联的适当的活化基团来“活化”。“活化”聚合物是指具有与核糖核酸酶反应的反应性基团的聚合物。本发明中活化聚合物及其与设想有用的蛋白缀合的方法(例如，用于将水溶性聚合物与人核糖核酸酶缀合)的实例是本领域已知的，并在Zalipsky，Bioconjugate Chem 6，150-165(1995)；Kinstler等人，Advanced Drug Delivery Reviews 54，477-485(2002)；和Roberts等人，Advanced Drug Delivery Reviews 54，459-476(2002)中有详细描述；出于所有目的将上述各篇文献以参考方式整体并入本文。
聚合物可以具有任何分子量。例如，对于聚乙二醇，优选分子量为约2kDa至约150kDa(术语“约”表示在聚乙二醇制备物中，与标称分子量相比，一些分子更重，一些分子更轻)。根据所需治疗情况(例如，本发明组合物(例如，含有RNA酶蛋白或类似物的组合物)的所需缓释时间、效果、生物学活性(如果有)、处理的容易性、抗原性的程度或抗原性缺失和聚乙二醇的其它已知效果)，可以使用其他规格。
当将聚乙二醇(PEG)用作水溶性聚合物，则PEG的一端可以以惰性基团封端。例如，PEG分子可以为甲氧基-PEG，也称为mPEG，是其中聚合物的一端为甲氧基(例如，-OCH3)、而另一端为功能性基团(例如，羟基)的PEG形式，上述功能性基团可化学修饰并用于将反应性基团与靶蛋白(例如，人核糖核酸酶)缀合。在一些实施方式中，使用美国专利申请公开号20040235734中所述的PEG聚合物，通过参考将其整体并入本文。
在一些实施方式中，PEG聚合物可以包含一个或多个弱的或可降解的键。例如，PEG聚合物可以包含酯键(例如，可以随时间而水解的酯键(例如，当存在于患者体内时))。在一些实施方式中，包含可降解键的PEG聚合物的水解产生2个或更多个片段(例如，分子量低于母体分子的片段)。
本发明不受可降解键类型的限制。实际上，PEG聚合物可以包含各种可降解键中的一种或多种，所述可降解键包括但不限于碳酸酯键；亚胺键；磷酸酯键；腙键；缩醛键；原酸酯键；酰胺键、氨基甲酸乙酯键；肽键；和寡核苷酸键。
设想到，在聚合物本身中包含一个或多个可降解键提供了控制本发明的缀合物的药代动力学特性的又一机制。例如，在一些实施方式中，本发明的RNA酶-PEG缀合物可施用于患者，其中所述缀合物在施用时几乎没有至根本没有酶活性，但当暴露于所述键降解(例如，水解)的条件时，所述酶的核糖核酸裂解活性被激活。因此，在一些实施方式中，PEG分子内的可降解键可用于增加缀合物的特异性和效能。
设想到，本发明的缀合物可以含有聚合物(例如，PEG)和人核糖核酸酶蛋白之间的键。在一些实施方式中，所述键为稳定的键(例如，酰胺键、氨基甲酯键、胺键、硫醚/硫化物键或碳酰胺键。在一些实施方式中，所述键可水解(例如，从而释放RNA酶(例如，在RNA酶上不剩余聚合物(例如，PEG)部分))。本发明不受所用可降解键的类型的限制。实际上，本文设想了多种键，包括但不限于，羧酸酯、磷酸酯、硫羟酸酯(thiolester)、酐、缩醛、缩酮、酰氧基烷基醚、亚胺、原酸酯、肽和寡核苷酸。这些键可通过(例如，利用本领域已知方法)修饰RNA酶蛋白(例如，位于C-末端羧基或氨基酸侧链的羟基)和/或聚合物而制得。
水溶性聚合物(例如，PEG)与核糖核酸酶蛋白分子的比例可以变化，只要其在反应混合物中的浓度允许。通常，可以(例如，利用所选聚合物(例如，PEG)的分子量、所用缀合化学、所靶向的感兴趣位点的数量等)确定最适比例(例如，就反应效率而言(例如，将聚合物缀合至1、2、3、4或更多个位点)其中几乎没有至没有过量的未反应蛋白或聚合物)。例如，在一些实施方式中，可以进行非-特异性缀合反应(例如，PEG化反应)，然后进行后续纯化(例如，从而根据缀合至各RNA酶的聚合物(例如，PEG)的数量来分离RNA酶)。
在一些实施方式中，缀合物存在于组合物中。例如，在一些实施方式中，组合物包含多个缀合物，其中每个蛋白包含1-3个与蛋白共价连接的水溶性聚合物。在一些实施方式中，组合物包含多个缀合物，其中每个蛋白包含1、2、3、4、5、6或更多个与蛋白连接的聚合物。在一些实施方式中，组合物包含缀合物的群，其中大多数缀合物(例如，大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于97％、大于98％、大于99％)共价连接相同数量(例如，1、2、3或更多个)的聚合物(例如，PEG分子)。在一些实施方式中，1、2、3或更多个聚合物与寡聚的核糖核酸酶缀合。本发明的寡聚物中存在的核糖核酸酶分子的数量不受限制。实际上，多个寡聚物可以与一个或多个水溶性聚合物缀合，包括但不限于，2、3、4、5、6或甚至更多个核糖核酸酶的寡聚物。在一些实施方式中，本发明提供了包含含有单个水溶性聚合物(例如，单PEG化)的多个RNA酶的组合物。在一些实施方式中，所述多个RNA酶包含RNA酶的单体、二聚体、三聚体和/或更高级别的复合物(即，寡聚物)。
在优选实施方式中，本发明的经修饰的人核糖核酸酶蛋白(例如，水溶性聚合物-RNA酶缀合物)保留了大部分的酶(例如，核糖核酸裂解)活性。在一些实施方式中，缀合物具有未经修饰的(例如，未-缀合)核糖核酸酶的约1％至约95％的酶活性。在一些实施方式中，缀合物具有未经修饰的核糖核酸酶的更大的活性。在一些实施方式中，相对于具有核糖核酸裂解活性的未经修饰的母体核糖核酸酶，经修饰的人核糖核酸酶具有约1％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％或更大的活性(例如，以本领域技术人员公知的体外测试法测定)。
在其它优选实施方式中，本发明的经修饰的人核糖核酸酶蛋白(例如，水溶性聚合物-RNA酶缀合物)保留了大部分的另一种所需性质(例如，核糖核酸裂解活性之外的性质(例如，癌细胞杀死能力))。虽然机理的理解对于实施本发明不是必需的，并且本发明不受任何特定作用机理限制，在一些实施方式中，在没有(例如，小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％的未经修饰的核糖核酸酶的)核糖核酸裂解活性的情况下，经修饰的人核糖核酸酶蛋白(例如，水溶性聚合物-RNA酶缀合物)(例如，由于人核糖核酸酶蛋白的其他特性)能够杀死靶标细胞(例如，癌细胞或微生物(例如，病毒)感染的细胞)。
本发明不限制用于将水溶性聚合物与本发明的人核糖核酸酶缀合的方法。多种化学知识是本领域已知的，并可用于制备本发明的组合物。这些方法已被详细描述(例如见，Zalipsky，Bioconjugate Chem 6，150-165(1995)；Kinstler等人，Advanced Drug Delivery Reviews 54，477-485(2002)；和Roberts等人，Advanced Drug Delivery Reviews 54，459-476(2002))。在一些实施方式中，本发明使用了可用于将本发明的活化聚合物与人核糖核酸酶缀合的缀合化学知识。
例如，为了获得N-末端缀合的RNA酶(例如，N-末端PEG化的RNA酶)，可以使用还原性烷基化。不经聚合物(例如，PEG)和蛋白部分之间的连接基团而进行连接的方法由Francis等人在：Stability ofprotein pharmaceuticals：in vivo pathways of degradation and strategies forprotein stabilization(Eds.Ahern.，T.和Manning，M.C.)Plenum，N.Y.，1991)中进行了描述。在一些实施方式中，采用了涉及利用羧甲基mPEG的N-羟基琥珀酰亚胺酯的方法(例如见，1998年10月20日授予的美国专利第5,824,784号，通过参考将其整体并入本文)。
在一些实施方式中，在缀合之后纯化PEG-核糖核酸酶缀合物。本发明所用的纯化方法类型不受限制。实际上，可以利用多种方法，包括但不限于，凝胶过滤色谱、离子交换色谱、疏水相互作用色谱、体积排阻色谱和本领域公知的其他方法。
例如，在一些实施方式中，可以纯化水溶性聚合物-RNA酶缀合物从而获得一种或多种不同种类的缀合物(例如，与单个聚合物共价结合的缀合物)。在一些实施方式中，对缀合反应的产物进行纯化以获得(例如，平均为)每个人核糖核酸酶有1、2、3、4或更多个聚合物(例如，PEG)。在一些实施方式中，使用凝胶过滤色谱来分离/分级与不同数量的聚合物共价结合的核糖核酸酶或将缀合物与未-缀合蛋白或与未-缀合聚合物分离。凝胶过滤柱是本领域公知的，并且可从多个来源获得(例如，Amersham Biosciences，Piscataway，NJ的SUPERDEX和SEPHADEX柱)。
在一些实施方式中，本发明提供了包含水溶性聚合物-人核糖核酸酶缀合物的组合物。在一些实施方式中，将组合物施用于患者以治疗癌症。因此，在一些实施方式中，本发明提供了治疗癌症的方法，所述方法包括施用包含水溶性聚合物-人核糖核酸酶缀合物的组合物。在一些实施方式中，本发明的治疗组合物包含抗体和核糖核酸酶。抗体可以提供细胞或组织特异性靶向和/或额外的治疗益处。下表列出了一些癌症治疗抗体的机理，包括携带用于淋巴瘤和白血病的毒性载量的3种抗体缀合物。(Drug Discovery Today，Vol.8，No.11 June 2003)。所述缀合物中的2种，即ZEVALIN和BEXXAR，携带放射性碘作为毒素，而第三种，即MYLOTARG，携带细胞毒性的抗肿瘤抗生素calicheaminin，其分离自细菌发酵物。抗体Mylotarg特异性结合CD33抗原，所述抗原在超过80％的急性骨髓性白血病(AML)患者中可见的白血病母细胞表面上表达。所述缀合物中的抗体的约98.3％氨基酸序列源自人源。
表1
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Figure BPA00001375112000201
这些产品中所用的任何靶向抗体或试剂都可用于本发明的组合物和方法。
通常，用来靶向毒素的最特异性方法是使用设计用来识别对肿瘤细胞特异的表面抗原的单克隆抗体或抗体片段。由于正常细胞缺少表面抗原，它们不会被毒素缀合物所靶向和杀死。完整抗体具有2个域：赋予抗体亲和性和结合特异性的可变域，和与免疫***的其它部分相互作用从而刺激宿主生物体的免疫应答的恒定域。可变域由结合抗体的靶标的互补决定区(CDR)和将CDR锚定至抗体其余部分并帮助维持CDR形状的框架区组成。各抗体中的6个CDR在不同抗体之间具有不同的长度和序列，并且是抗体与其靶标标志物的特异性(识别)和亲和性(结合)的主要原因。
除了抗体递送载体，还可以利用数种其它特异性和非特异性载体来递送毒性分子至癌细胞，所述载体包括肽、聚合物、树枝状高分子(dendrimer)、脂质体、聚合性纳米颗粒和嵌段共聚物胶束。例如，已使用与促黄体生成激素-释放激素结合的肽将小分子毒素喜树碱靶向卵巢癌细胞(Journal of Controlled Release，2003，91，61-73.)。
核糖核酸酶是人细胞中、特别是对抗癌细胞的有效毒素。以下文献描述了核糖核酸酶与靶向蛋白(包括蛋白和抗体)的一些化学缀合物：Newton等人(2001)，Blood 97(2)：528-35，Hursey等人(2002)LeukLymphoma 43(5)：953-9，Rybak等人，(1991)Journal of BiologicalChemistry 266(31)：21202-7，Newton等人(1992)Journal of BiologicalChemistry 267(27)：19572-8，Jinno和Ueda(1996)Cancer ChemotherPharmacol 38：303-308，Yamamura等人(2002)Eur J Surg 168：49-54，Jinno等人(1996)Life Sci 58：1901-1908，Suzuki等人(1999)NatureBiotechnology 17(3)：265-70，Rybak等人(1992)，Cell Biophys 21(1-3)：121-38，Jinno等人(2002)Anticancer Res.22：4141-4146，通过引用将各篇文献整体并入本文。
在一些实施方式中，本发明提供了包含核酸序列的重组构建体，所述核酸序列编码本文所述的一个或多个氨基酸序列。在本发明的一些实施方式中，所述构建体包括载体，例如质粒或病毒载体，其中已将序列SEQ ID：NO 2或相关序列以正向或反向***。在又一些实施方式中，将异源结构序列在适当阶段与翻译起始和终止序列组装。
在本发明的一些实施方式中，利用多种程序中的任何程序将适当的DNA序列***载体。通常，通过本领域已知的程序，将DNA序列***适当的限制性核酸内切酶位点。大量适合的载体是本领域技术人员已知的，并且可商购获得。所述载体包括但不限于下述载体：1)细菌载体-pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pET 22b、pET26b、pET 30b(Novagen brand、EMD Chemicals)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pBSKS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)；和2)真核载体-pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、PXT1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。可以使用任何其他质粒或载体，只要其可在宿主中复制和存活。在本发明的一些实施方式中，哺乳动物表达载体包含复制起点、合适的启动子和增强子，并且还包含任何必需的核糖体结合位点、多聚腺苷酸化位点、剪接供体和受***点、转录终止序列和5′侧翼非转录序列。在其它实施方式中，可以使用源自SV40剪接的DNA序列和多聚腺苷酸化位点来提供所需的非转录遗传元件。
在本发明的某些实施方式中，表达载体中的DNA序列可操纵地连接于指导mRNA合成的适当表达控制序列(启动子)。本发明可用的启动子包括但不限于LTR或SV40启动子、大肠杆菌lac或trp启动子、λ噬菌体PL和PR启动子、T3和T7启动子，和巨细胞病毒(CMV)即早期启动子、单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶启动子、和小鼠金属硫蛋白-I启动子，以及其它已知控制原核或真核细胞或其病毒的基因表达的启动子。在本发明的其他实施方式中，重组表达载体包括复制起点和使宿主细胞转化的选择性标记物(例如，二氢叶酸还原酶或用于真核细胞培养的新霉素抗性或大肠杆菌中的四环素、卡那霉素或氨苄青霉素抗性)。
在本发明的一些实施方式中，在载体中***增强子序列，可增强高等真核生物对编码本发明多肽的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常约10至300bp，可作用于启动子以增强其转录。本发明可用的增强子包括但不限于，在复制起点后侧100至270bp的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧的多瘤病毒增强子和腺病毒增强子。
在其它实施方式中，表达载体还含有用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。在本发明的又其他实施方式中，载体还可以包括用于扩大表达的适当序列。
在进一步的实施方式中，本发明提供了包含上述构建体的宿主细胞。在本发明的一些实施方式中，宿主细胞是高等真核细胞(例如，哺乳动物细胞或昆虫细胞)。在本发明的其他实施方式中，宿主细胞是低等真核细胞(例如，酵母细胞)。在本发明的又其他实施方式中，宿主细胞可以是原核细胞(例如，细菌细胞)。宿主细胞的具体实例包括但不限于，大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、枯草芽孢杆菌和假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属中的各种种，以及酿酒酵母、栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomycees pombe)、果蝇S2细胞、甜菜夜蛾Sf9细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS-7系的猴肾成纤维细胞(Gluzman，Cell23：175[1981])、C127、3T3、293、293T、HeLa和BHK细胞系。
宿主细胞中的构建体可以以常规方式使用，以产生由重组序列编码的基因产物。在一些实施方式中，可通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、转化或电穿孔来完成构建体向宿主细胞中的导入。作为选择，在本发明的一些实施方式中，本发明的多肽可通过常规肽合成仪合成制备。
蛋白可在适当启动子的控制下在哺乳动物细胞、酵母、细菌或其他细胞中表达。利用源自本发明DNA构建体的RNA，还可以采用无细胞翻译体系制备所述蛋白。Sambrook等人在Molecular Cloning：ALaboratory Manual(Second Edition，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989))中描述了与原核和真核宿主一同使用的适当克隆和表达载体。
在本发明的一些实施方式中，在转化适当的宿主株和使宿主株生长至适当的细胞密度之后，通过适当方式(例如，温度跃迁或化学诱导)诱导所选的启动子并再培养细胞一段时间。在本发明的其他实施方式中，通常将细胞离心收获，以物理或化学方式破坏，并将所得粗提取物保留用于进一步纯化。在本发明的又其他实施方式中，可以将蛋白表达所用的微生物细胞以任何常规方法破坏，包括冻融循环、超声、机械破坏或使用细胞裂解剂。
适合的重组产物方法的实例涉及使用赋予抗药性(例如氨苄青霉素(例如，pET22b)或卡那霉素(例如，pET-26b、pET-30b))并含有核糖核酸酶蛋白编码基因的质粒。将携带基因的质粒转化到大肠杆菌细胞系。可用的细胞包括但不限于，大肠杆菌B或K株和相关突变株，例如HB101、JM109、DHa5、BL-21AI和BL21DE3。在发酵过程中通过添加诸如***糖或乳糖或其类似物(包括异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG))等糖可诱导核糖核酸酶蛋白的表达。核糖核酸酶蛋白可制备为可溶性产物或包涵体。对于可溶性制备，将蛋白分离并利用柱层析进行如下纯化。对于包涵体制备，将细胞机械、酶学或/和化学裂解。通过包括渗滤或离心在内的多种方法将含有包涵体的细胞沉淀物与可溶性物质分离。将包涵体以变性剂，如尿素或盐酸胍溶解。可以加入还原剂，例如低分子量硫醇(例如，二硫苏糖醇)或三(2-羧乙基)膦。加入酸引起沉淀的形成，可通过过滤和/或离心将沉淀从溶液中去除。
通过交换为可含有多种辅助蛋白折叠的试剂的缓冲液使蛋白折叠。这种试剂的实例包括：精氨酸、聚乙二醇、硫代甜菜碱、去污剂、有机盐和/或离液剂。再次交换缓冲液，以便与第一柱层析步骤相容，并通过过滤或离心去除沉淀。柱步骤包括：阴离子交换、阳离子交换和疏水相互作用。阴离子交换树脂的实例包括但不限于：Q SepharoseXL、UNO Q-1、Poros 50 HQ、Toyopearl QAE 550c、Separon HemaBio1000Q、Q-Cellthru Bigbeads Plus、Q Sepharose HP、Toyopearl SuperQ650s、Macro-Prep 25Q、TSK-Gel Q-5PW-HR、Poros QE/M、Q SepharoseFF、Q HyperD 20、Q Zirconia、Source 30Q、Fractogel EMD TMAE 650s和Express-Ion Q。阳离子交换树脂的实例包括但不限于：SP SepharoseXL、Poros 50 HS、Toyopearl SP 550c、SP Sepharose BB、Source 30S、TSKGel SP-5PW-HR20、Toyopearl SP 650c、Heparin Sepharose FF、SPSepharose FF、CM Sepharose FF、Heparin Toyopearl 650m、SP Toyopearl650m、CM Toyopearl 650m、Ceramic Heparin HyperD M、Ceramic SHyperD 20和Ceramic CM HyperD F。疏水相互作用树脂的实例包括但不限于：TSK-凝胶苯基-5PW、TSK-凝胶醚-5PW、TSK-凝胶丁基-NPR、Toyopearl丁基-650S、Toyopearl醚-650S、Toyopearl苯基-650S、Toyopearl丁基-650M、Toyopearl醚-650M、Toyopearl苯基-650M、丁基-Sepharose4 FF、辛基-Sepharose 4 FF、辛基-Sepharose CL-4B和苯基-Sepharose 6FF(高度或低度取代)。将终产物交换进入中性缓冲液以便于长期储存。
在一些实施方式中，本发明的组合物和方法用于治疗受试生物体(例如，哺乳动物受试者，包括但不限于人和脊椎动物)的患病细胞、组织、器官或病理状况和/或疾病状态，或体内和/或离体细胞、组织和器官。对此，各种疾病和病理接受利用本方法和组合物的治疗或预防。这些疾病和病况的非限制性示例性列表包括但不限于乳癌、***癌、淋巴癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠癌、黑色素瘤、恶性黑色素瘤、卵巢癌、脑癌、原发性脑瘤、头颈癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、肝癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、头或颈瘤、乳腺瘤、卵巢瘤、肺瘤、小细胞肺瘤、维尔姆斯瘤、宫颈瘤、睾丸瘤、膀胱瘤、胰腺瘤、胃瘤、结肠瘤、***瘤、泌尿生殖瘤、甲状腺瘤、食管瘤、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、肾上腺瘤、肾细胞瘤、子宫内膜瘤、肾上腺皮质瘤、恶性胰腺胰岛瘤、恶性类癌瘤、绒毛膜瘤、蕈样肉芽肿病、恶性血钙过多、宫颈增生、白血病、急性淋巴性白血病、慢性淋巴性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性粒细胞白血病、急性粒细胞白血病、多毛细胞白血病、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、卡波氏肉瘤、真性多血症、特发性血小板增多症、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、软组织肉瘤、骨原性肉瘤、原发巨球蛋白血症和视网膜母细胞瘤等，T细胞和B细胞介导的自身免疫疾病；炎症；感染；过多增生性疾病；AIDS；退行性病况和血管性疾病等。在一些实施方式中，接受治疗的癌细胞是转移癌细胞。在其它实施方式中，本发明的RNA酶靶向癌干细胞。
在被确定具有患癌风险的受试者中，即使癌细胞还在发展，优选在有效减少癌细胞的血管生成、增殖和/或诱导杀死(例如，凋亡)的条件下对受试者施用本发明组合物。
本发明还提供了药物组合物(例如，包括上述细胞杀死性组合物)。根据是否需要局部性治疗或全身性治疗和根据治疗区域，本发明的药物组合物可以以多种方式施用。施用可以是局部施用(包括眼部，和包括***和直肠递送的粘膜施用)、肺部施用(例如，通过吸入或吹入粉末或气溶胶，包括使用雾化器；气管内、鼻内、表皮和透皮)、口服或胃肠外施用。胃肠外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射或注输；或颅内，例如，鞘内或脑室内施用。
用于局部施用的药物组合物和制剂可以包括透皮贴剂、软膏、洗液、霜、凝胶、滴剂、栓剂、喷剂、液体和粉末。常规药物载体(水性的、粉末或油基)、增稠剂等可能是必须的或需要的。
口服施用的组合物和制剂包括粉剂或颗粒剂、在水或非水性介质中的悬浮液或溶液、胶囊剂、囊包剂或片剂。还可以有增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂。
胃肠外、鞘内或脑室内施用的组合物和制剂可包括无菌水溶液，所述无菌水溶液还可以含有缓冲剂、稀释剂和其他适合的添加剂，例如但不限于渗透增强剂、载体化合物和其他药学可接受的载体或赋形剂。
本发明的药物组合物包括但不限于溶液、乳液和含有脂质体的制剂。这些组合物可以由各种成分制成，所述成分包括但不限于预先形成的液体、自乳化固体和自乳化半固体。
本发明的药物制剂可以以单位剂型方便地提供，并可按照制药业公知的常规技术制备。这些技术包括使活性成分与药用载体或赋形剂结合的步骤。通常，将活性成分与液体载体和/或精细分割的固体载体均匀和紧密地结合，随后需要时使产品成形，从而制备制剂。
可以将本发明的组合物配制为多种可能剂型中的任何一种，例如但不限于片剂、胶囊剂、液体糖浆、软凝胶、栓剂和灌肠剂。本发明的组合物还可以配制为水性、非水性或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液还可以包含增加悬浮液粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。悬浮液还可以含有稳定剂。
在本发明的一个实施方式中，可以将药物组合物作为泡沫剂配制和使用。药物泡沫剂包括的制剂例如有但不限于乳液、微乳液、霜、胶冻剂和脂质体。这些制剂虽然性质基本相似，但最终产品的成分和稠度有所不同。
施用的优选方法是通过静脉内或IP注射。作为选择，可以利用向需治疗的肿瘤中注射。在一些实施方式中，在额外时间(例如，数天至数月)内作为辅助治疗继续进行所述施用。
本发明的组合物可以额外含有常见于药物组合物中的其他附加成分。因此，例如，所述组合物可含有额外的、相容的药物活性物质，例如止痒剂、收敛剂、局麻剂或抗炎剂，或者可以含有可用于物理配制本发明组合物的各种剂型的额外的物质，例如染料、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。不过，在添加所述材料时，其不应过度干扰本发明组合物的成分的生物活性。可以将该制剂灭菌，并且需要时与辅助剂混合，辅助剂例如有润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、芳香剂和/或芳香物质，以及不会与制剂的活性药剂不利地相互作用的其他物质。
在一些优选实施方式中，将核糖核酸酶与其他医药干预同时或依次共同施用。例如，对于癌症治疗，可以将任何常用于癌症治疗的溶瘤剂(oncolytic agent)与本发明的组合物和方法共同施用。例如，美国食品药品管理局保留了批准在美国使用的溶瘤剂的处方集。与U.S.F.D.A.等同的国际机构保留了类似的处方集。表2提供了批准在美国使用的示例性抗肿瘤剂的名单。本领域技术人员应理解，对于所述示例性试剂，所有美国批准的化学治疗剂需要的“产品标签”记载了批准的适应症、给药信息和毒性数据等。所设想的是，在一些情况下，与本发明组合物的共同施用可降低这些化合物的剂量，从而减少毒性。
表2
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Figure BPA00001375112000291
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在一些实施方式中，利用互补法将本发明的RNA酶或其变体递送至靶细胞。例如，在一些实施方式中，将RNA酶的两个或更多个片段分别递送至细胞中。所述片段重新结合以形成功能性酶。在一些实施方式中，递送2个蛋白片段。在其它实施方式中，将含有编码RNA酶片段的核酸的载体分别导入细胞或生物体。
通过筛选片段(例如，在细胞培养物测试中)的活性，可以确定适合互补递送的片段。优选的片段是那些快速重新结合以形成功能性酶的片段。酶活性可利用任何适当方法确定，所述方法包括但不限于本文公开的那些方法。
在一些实施方式中，本发明利用对RNA酶消化以产生S-肽和S-蛋白(例如见，Hamachi等人，Bioorg Med Chem Lett 9，1215-1218(1999)；Goldberg和Baldwin，Proc Natl Acad Sci，96，2019-2024(1999)；Asai等人，J Immun Meth，299，63-76(2005)；Backer等人，J Cont Release，89，499-511(2003)；Backer等人，Bioconj Chem，15，1021-1029(2004))。例如，枯草杆菌蛋白酶对牛RNA酶A的消化因Ala20和Ser21之间断裂而主要产生2个片段。较短片段(氨基酸1-20)称为S-肽，而较长片段(氨基酸20-124)称为S-蛋白。2个片段在中性pH紧密结合，有时称为RNA酶S或RNA酶S′。RNA酶S是活性核糖核酸酶。S-肽-S-蛋白相互作用已用于亲和纯化，以及在三元对接体系中靶向成像剂或药物。因此，在一些实施方式中，本发明提供了人核糖核酸酶的S-肽-S-蛋白。
在一些实施方式中，将本发明的RNA酶或其变体作为编码RNA酶的核酸提供。可通过多种方法中的任何一种将携带遗传信息的分子导入细胞，所述方法包括但不限于，裸DNA构建体的直接注入、以载有所述构建体的金颗粒进行轰击和利用例如脂质体、生物聚合物等进行的大分子介导的基因转移。优选方法利用源自病毒的基因递送载体，所述病毒包括但不限于，腺病毒、逆转录病毒、牛痘病毒和腺相关病毒。由于与逆转录病毒相比效率较高，源自腺病毒的载体是优选的将核酸分子体内转入宿主细胞的基因递送载体。腺病毒载体已显示出提供向动物模型的各种实体瘤和免疫缺陷小鼠中人实体瘤异种移植物中的非常有效的体内基因转移。腺病毒载体和基因转移方法的实例在PCT公开WO 00/12738和WO 00/09675，以及美国专利申请号6,033,908、6,019,978、6,001,557、5,994,132、5,994,128、5,994,106、5,981,225、5,885,808、5,872,154、5,830,730和5,824,544中有所描述，将上述各篇文献以参考方式整体并入本文。
可以将载体以各种方式施用于受试者。例如，在本发明的一些实施方式中，利用直接注射将载体施用至肿瘤或肿瘤相关组织中。在其它实施方式中，施用经血或淋巴循环进行(例如见，PCT公开99/02685，将该文献以参考方式整体并入本文)。腺病毒载体的示例性剂量水平优选在注输液中加入108至1011个载体颗粒。
给药取决于需治疗疾病的严重性和响应性，治疗过程持续数天至数月，或直至实现治愈或取得疾病状态的减轻。通过对患者体内的药物积累的测量可以计算最佳给药方案。进行施用的内科医生可容易确定最适剂量、给药方法和重复率。最适剂量可以根据各药物组合物的相对效力而变化，通常可根据体外和体内动物模型中有效的EC50，或根据本文所述实例来估计。通常，剂量为0.01μg至100g/kg体重，例如0.1至1000mg/kg体重，优选0.1至500mg/kg体重，还更优选0.1至200mg/kg体重(例如，1至100mg/kg)，时间为1至240分钟(例如，2至60分钟，优选15至45分钟)。可以根据获得所需效果(例如，肿瘤尺寸减小或癌细胞数量减少)而需要的频率来施用剂量，例如每日一次或多次至每周或每月一次或多次。在一些实施方式中，组合物每周以5至60分钟(例如，30分钟)的时间施用0.1至10mg的量(例如，1mg)。根据测定的体液或组织中药物的停留时间和浓度，治疗内科医生可估计给药的重复率。成功治疗后，理想的是使受试者每日接受一次或多次(直至每20年接受一次)防止疾病复发的维持治疗。在一些优选实施方式中，剂量为每日、每周或每月0.25-1000mg/kg，以实现所需疗效。在一些优选实施方式中，剂量为每日、每周或每月50mcg/m2至400mcg/m2，以实现所需疗效。有时还以与药量(重量)相对的每剂量的活性单位方式将药物给药。
上述说明书中提及的所有公开出版物、专利、专利申请和以登录号确认的序列以参考方式整体并入本文。虽然本发明已结合具体实施方式进行了描述，但应理解所要求保护的发明不应不当地限于所述具体实施方式。不显著改变本文所述组合物和方法的功能特征的对所述本发明组合物和方法进行的修饰和变化也包含在所附权利要求的范围中。

Claims (8)

1.一种包含核糖核酸酶的组合物，所述核糖核酸酶由带下述氨基酸修饰的人RNA酶1序列组成：R4C、G38R、R39G、N67R、G89R、S90R和V118C。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述核糖核酸酶由SEQIDNO:1组成。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述核糖核酸酶重组产生。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述核糖核酸酶由SEQIDNO:2组成的核酸分子编码。
5.一种包含如权利要求1所述的核糖核酸酶的治疗性制备物。
6.一种包含核酸序列的表达载体，所述核酸序列编码如权利要求1所述的核糖核酸酶。
7.一种宿主细胞，其包含如权利要求6所述的表达载体。
8.如权利要求1所述的组合物在制备用于治疗受试者的药物中的用途。
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