CN102223802A - 用作植物化学剂的植物提取物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及葡萄(Vitis vinifera)籽提取物作为试剂用于治疗和预防由病原体(特别是真菌和卵菌)引起的植物疾病，以及用于感染或易感染病原体(特别是真菌或乱菌)的植物的包含葡萄提取物的杀真菌组合物。
Description
本发明涉及葡萄(Vitis vinifera)籽提取物作为试剂用于治疗和预防由病原体(特别是真菌和卵菌)引起的植物疾病。
本发明由此提供了用于感染了病原体或易受感染(特别是真菌或卵菌)的植物的包含葡萄提取物的杀真菌组合物。
发明背景
由病原体例如真菌、霉菌、卵菌、细菌和病毒引起的许多植物疾病是已知的。它们之中有许多通常与适于其攻击和扩散的气候条件有关联并具有严重的后果，导致作物产量的下降，当这可能对农业经济产生深刻的，有时为灾难性的影响，特别是当疾病呈现流行性状态时。
历史上导致灾难性后果的植物疾病实例是由晚疫病菌(Phytophthora infestans)引起的马铃薯感染(晚疫病)，其是造成19世纪40年代晚期著名的爱尔兰饥荒的原因。
另一种卵菌，霜霉病菌(Plasmopara viticola)是造成名为霜霉病的原因，霜霉病是最广泛分布的感染之一，其影响和导致酒生产者和葡萄种植者的巨大损失，负面影响生产的产量以及质量。
一种类似的名为白粉病的葡萄树疾病是由真菌Erysiphe necator又称葡萄白粉菌(Uncinula necator)引起的。
类似的感染影响其他植物例如大豆、向日葵、莴苣、番茄、马铃薯、橡树、观赏植物、结果植物、烟草、瓜类植物(cucurbits)。
在European Handbook of Plant Diseases，I.M.Smith等人编，1988，Blackwell Scientific Publications中报导了有关植物疾病的全面综述。
已经提议了一些天然和合成试剂用于治疗上述植物疾病，并且这些试剂是可以得到的。
除了硫磺和铜盐或复合物以外，用于农用化学品用途的合成的杀真菌剂属于非常广泛和不同的化学品类型(苯酰胺、苯并咪唑衍生物、二羧酰亚胺、氨基甲酸酯、苯氨基甲酸、二硫代氨基甲酸酯、二硝基苯胺等等)。所述合成试剂的使用被众所周知的抗性现象以及所述试剂在人和动物中引起的毒性作用和其环境污染潜力限制。
因此，研究工作致力于开发对环境更友好的、如有可能是天然来源的杀真菌剂，其可能取代已知的合成杀真菌剂或至少其可与合成的杀真菌剂组合使用以降低抗性现象和/或其环境影响。
已知一些油类例如肉桂精油、迷迭香油和印度楝树油是有效的杀真菌剂。
此外US 6,174,920公开了荷荷芭蜡在控制白粉病感染中的用途。
在CA 2,103,014中也报导了荷荷芭提取物作为预处理剂在葡萄植物中预防白粉病感染，而US 2007/0071831公开了用于预防和/或治疗感染的产品，所述产品通过来源于制酒过程中的沉淀物的部分或全部中和得到。
WO 2006/006878公开了杀真菌组合物，其包含无水脂肪乳，任选地与一种或多种大豆油、橄榄油和椰子油的组合。
发明详述
现在发现葡萄籽或含籽榨渣提取物在控制植物病原体，特别是真菌和卵菌中是有效的。
本发明由此提供了包含葡萄籽或含籽榨渣提取物作为有效成分的植物药物组合物。
本发明对世界范围的经济具有非常重大的利益，即通过在提取后通常可能的进一步现有物价稳定措施如油回收、蒸馏、燃烧生物质或堆肥的热产生之前通过葡萄酒酿酒厂的废料再利用提供新的物价稳定措施。
本发明的组合物在治疗和/或预防植物的病原生物感染中有用，所述植物包括可能被所述病原体感染的葡萄树和其他作物。
本发明还涉及预防或治疗真菌或卵菌引起的植物感染的方法，其包含对待治疗的植物应用有效量的葡萄籽或含籽榨渣提取物。
下面报导的实验性检验显示了葡萄籽提取物对抗2种最常见的葡萄树病原体即霜霉病菌和葡萄白粉菌的显著活性。然而，应当理解本发明不仅限于治疗这2种病原体引起的葡萄树感染，而是可应用于感染其他目的植物的多种其他真菌和卵菌。
以下是感染目的植物的示例性病原体列表。
1-粉孢子
Erysiphe necator＝葡萄白粉菌(葡萄)
禾谷类白粉菌(Erysiphe graminis)(谷类)
白叉丝单囊壳菌(Podosphaera leucotricha)(乔本作物，水果树)
蔷薇单丝壳菌(Sphaerotheca pannosa)(玫瑰植物)
2-霉病
霜霉病菌(Plasmopara viticola)(葡萄)
向日葵霜霉病菌(Plasmopara helianthi)(向日葵)
晚疫病菌(Phytophthora infestans)(马铃薯)
寄生疫霉(Phytophthora parasitica)(番茄)
3-水果树疮痂病
苹果黑星菌(Venturia inaequalis)(苹果树)
梨黑星菌(Venturia pirina)(梨树)
4-桃叶卷曲
畸形外囊菌(Taphrina deformans)
5-褐斑病(Septoriosis)
颖枯壳针孢(Septoria nodorum)和小麦壳针孢(Septoria tritici)(谷类)
壳针孢属物种(Septoria sp.)(油菜)
6-锈病
禾柄锈菌(Puccinia graminis)，隐匿柄锈菌(Puccinia recondita)和小麦条锈病菌(Puccinia striiformis)(谷类)
7-黑穗病
小麦散黑粉菌(Ustilago tritici)(小麦)
玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)(玉米)
大麦坚黑粉菌(Ustilago hordei)(大麦)
8-腥黑穗病(Bunt)
小麦腥黑粉菌(Tilletia tritici)，小麦网腥黑粉菌(Tilletia caries)和小麦光腥黑粉菌(Tilletia foetida)(谷类)
9-疫腐病(Collar rot)
黑胫病菌(Phoma lingam)(十字花科植物，油菜)
立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)(马铃薯)
菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)(番茄)
10-炭疽病
胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)(豌豆)
豆刺盘孢(Colletotrichum lindemuthianum)(豆)
11-灰霉
灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)(葡萄)
特别有趣的是本发明的提取物对抗所列的第1，2，3，4，9，10和11种病原体的作用。
可被葡萄提取物有效控制的另一种病原体的示例为例如晚疫病菌，其感染多种茄科植物，例如马铃薯、番茄和一些观赏植物。
可通过用不同溶剂例如水、丙酮、乙酸乙酯、乙醇、丁醇或其混合物在不同提取参数和技术下提取和纯化新鲜或干燥的种子或含籽榨渣制备根据本发明的葡萄籽或含籽榨渣提取物。
许多提取物是已知的并可商业获得的。例如，在WO 2007/017037中公开了通过用水-乙醇混合物的提取获得的葡萄籽提取物。
鉴于这些溶剂的低成本和低毒性，使用例如水和乙醇的溶剂当然是优选的。还发现可通过下述过程得到特别适于根据本发明的用途的提取物，所述过程包括：
-用热水提取葡萄籽；
-去除水不溶性成分；
-在吸附树脂柱上纯化；
-浓缩；
-喷雾干燥。
通过所述过程得到的提取物具有从5至30％的儿茶素和表儿茶素含量(HPLC)，范围从90至110％(Folin-Ciocalteau分光光度法)的多酚总含量。所述提取物是新颖的并且是本发明的另一个目的。
葡萄籽提取物可这样使用，即合适地溶解或悬浮在适于对植物应用的载体中，或可将它们与合适的赋形剂(例如湿润添加剂、佐剂)或其他活性成分(例如已知的杀真菌剂、铜化合物、油等等)组合配制。
组合物中的葡萄籽提取物的量的范围可从5至25克/升，但可根据所述组合物的功用、待治疗的病原体、待保护的植物和治疗技术调整此范围。
组合物可通过任意合适的技术对植物施用，例如通过用传统设备喷洒，可每周一次或根据种植者决定的时序实施治疗，所述时序取决于一些因素例如气候条件、感染程度、感染生物的毒性、其他植物化学剂的使用等等。
作为一个示例，在被霜霉病感染的情况下，一般以每株植物和每次治疗从0.1至10克范围的量将葡萄籽提取物喷洒在叶子上面和下面，每周至三周一次，从早春持续到晚夏，甚至持续到收获期。当然精确的量将取决于植物的密度，其根据地理区域和葡萄树的品种变化很大：例如在托斯卡纳为约3000株/公顷，在香槟为约7500株/公顷或在勃艮第为约10000株/公顷。此外，喷洒在植物上的总“即用”溶液体积可根据产品和技术而变化：从300至750升/公顷，相当于5克/升x300升/公顷/10000株/公顷＝0.15克/株至最多25克/升x750升/公顷相当于3000株/公顷＝6.25克/株。
在下面的实施例中更详细的说明本发明。
实施例1-葡萄籽的水提取物：VITIVAC的制备
用75℃的热水覆盖1000克干燥的葡萄籽。在带保温套的静态渗滤器或配备搅拌器的带保温套的反应器中进行4小时。
然后用75℃的热水渗滤生物质，连续排放回收的渗滤液直至总体积为7.5升。渗滤流理想地为约1升每小时。
将全部回收的渗滤液冷却至20℃并用50微米的滤器过滤以去除细颗粒。
然后将水溶液连续上样至含有1升Rhom and Haas
XAD7HP树脂或以前重生的等同物的层析柱上端并用水填充。关注通过柱底部的水的电导率。
在固定步骤的最后，理想地用4升水漂洗树脂，然后理想地用4升70％ v/v乙醇连续洗脱，并紧接着用4升水再漂洗一次。关注通过柱底部的水的电导率。
收集得到的酒精溶液，在真空下浓缩，并用水清洗以去除乙醇。
然后在真空下浓缩溶液并在低于85℃的温度下喷雾干燥。
将得到的粉末混合、检查并在密封和不透明的袋子中包装。
标准产量为93克，对应于起始物料的产量为9.30％ w/w。但是此产量可根据使用的生物质而变化。
此产物具有8.5％的儿茶素(儿茶素+表儿茶素)HPLC含量和98％的总多酚含量。
实施例2-葡萄籽提取物：VITIVAC的杀真菌活性
植物
使用霞多丽葡萄(Vitis vinifera cv.Chardonnay)研究杀真菌剂对霜霉病的作用。从种子开始培养植物(每0.1-1盆1株)并置于培养箱(23℃白天/19℃夜晚，100-120μE.m-2.s-1，每天16小时光照)。使用1升0.2g/l的N-P-K肥料(20-20-20)每周2次对幼苗施肥。使用具有至少4片完全发育的叶的8周大幼苗研究VITIVAC的生物学活性。
病原体
在“霞多丽”的分离的表面已消毒的叶上维持霜霉病菌Pv1分离株，2007年从位于法国香槟区域的葡萄园的感染植物中获得所述菌株。将叶置于培养皿中并置于培养箱中(23℃白天/19℃夜晚，100-120μE.m-2.s-1，每天16小时光照)。从接种后8-12天的新鲜地形成孢子的叶上获得接种物。在4℃的蒸馏水中悬浮孢子囊并在血球计数仪的辅助下将浓度调整为每毫升水5x105孢子囊。
杀真菌处理
在整个实验中以25g/l的比例使用如实施例1中所描述的制备的天然产物(VITIVAC)。将VITIVAC的效力与以4.0kg配制的产品/公顷的比例使用的(Mikal Flash WG，Bayer CropScience)参考杀真菌剂混合物Fosetyl-Al(500g/kg)+Folpel(250g/kg)比较。
将表面已消毒的“霞多丽”叶背轴侧向上置于14cm直径的塑料培养皿中，每个培养皿含有用8ml水湿润的滤纸。使用配备了锥形喷嘴(Teejet XR 110015 VS)的实验室喷雾器(Euro-Pulvé)以2 bar的气压喷洒叶。对Mikal Flash和VITIVAC分别以每公顷400和720升的体积应用杀真菌制品。每个试验重复3次。使用Newman-Keuls检验(XLS-Stat，Addinsoft)对数据进行统计分析。
处理后的叶在层流下放置30分钟以干燥应用在叶背轴面的杀真菌剂。干燥后，将含有处理的或未处理(对照)的叶的培养皿在培养箱中(23℃白天/19℃夜晚，100-120μE.m-2.s-1，每天16小时光照)保存24小时。
霜霉病菌的接种
用木塞穿孔器从每片处理的或未处理的(对照)叶中切割出10个叶圆片(每个直径10mm)并背轴侧向上置于9cm直径的塑料培养皿中，每个培养皿中含有用4ml无菌蒸馏水湿润的滤纸。通过加入1滴(20μl)接种物(5×105孢子囊.ml-1)接种圆片。接种后，含有10片叶圆片的培养皿在黑暗中于19℃培养24小时，然后在培养箱中(23℃白天/19℃夜晚，100-120μE.m-2.s-1，每天16小时光照)保存以用于疾病的发展。在实验的最后，将培养皿在19℃黑暗保存24小时以诱导孢子形成。
接种后10天，对每种检测的形态测定了展示霜霉病发展的叶圆片数目(感染率)。然后，将伴有发白的孢子囊的霜霉病损伤根据0-4的等级分级，如Reuveni(Relationship between leaf age，peroxidase and b 1-3 glucanase activity and resistance to downy mildew in s，1998.Journal of Phytopa thology 146，525-530)以前描述的：0，无损伤；1，1-10％的叶圆片区域受感染和形成孢子；2，11-25％；3，26-50％；和4，＞50％(感染强度)。评估了叶圆片上产生的孢子囊的数目。用已知体积的含有0.01％ Tween 80的无菌蒸馏水将孢子囊从10片叶圆片上洗下来，并在血球计数器的辅助下计数(每10片叶圆片计数6次)。计算了每平方厘米叶圆片面积产生的孢子囊的数目(形成孢子的强度)。进行了1次实验，每种处理使用3个培养皿。
霜霉病(1)
接种后10天的观察
α感染率：污染的接种圆片数/总圆片数(10)。
β感染强度：代表每片叶圆片的感染强度的主观等级。
结果在下面的表中报告。
处理被葡萄白粉菌感染的叶得到类似的肯定结果。除了通过在培养皿中摇晃污染的叶诱导葡萄白粉菌的感染外，程序基本上是相同的。在此案例中，证明本发明的治疗特别有效的降低形成孢子的强度(定义为每表面单位(cm2)的分生孢子(霜霉病菌)数)。
下面是植物药物组合物的示例。
实施例3
葡萄提取物 g 250
去离子水 l 100
实施例4
葡萄提取物 g 500
去离子水 l 100
Claims (7)
1.植物药物组合物，其包含葡萄籽或含籽榨渣的提取物作为活性成分。
2.根据权利要求1的组合物，其中所述提取物为水/乙醇或水提取物。
3.根据权利要求1或2的组合物，其进一步包含其他具有杀真菌活性的活性成分。
4.预防或治疗植物被真菌或卵菌感染的方法，其包括对待治疗的植物应用有效量的葡萄籽提取物。
5.根据权利要求4的方法，其中所述植物为葡萄。
6.根据权利要求5的方法，其中所述病原体为霜霉病菌。
7.由下述方法得到的葡萄籽提取物，方法包含：
-用热水提取葡萄籽；
-去除水不溶性成分；
-在吸附树脂柱上纯化；
-浓缩和喷雾；
-喷雾干燥。
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