CN102220286B - 杂交瘤细胞株2c9、其产生的抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了杂交瘤细胞株2C9、其分泌产生的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体及其应用。杂交瘤细胞株2C9,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCCNO.C201018。该杂交瘤细胞株2C9可以用于制备高效价抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体,采用鼠腹水抗体酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得的效价可达4.26×106。该抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体灵敏度高,对黄曲霉毒素M1的50%抑制浓度IC50为67pg/mL,与黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2交叉反应率均小于0.1%,可用于黄曲霉毒素M1的快速测定。
Description
技术领域
本发明涉及杂交瘤细胞株2C9、其产生的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体及其应用。
背景技术
黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉分泌产生的次生代谢产物,是能引起人畜各种损害的天然有毒化合物。黄曲霉毒素目前已发现20余种,其中黄曲霉毒素B1的毒性最强,它的毒性是***的10倍,砒霜的68倍。黄曲霉毒素M1(AFM1)是AFB1的羟基化代谢产物,哺乳动物摄入AFB1污染的饲料后,在体内经羟基化会分泌于乳汁当中。通常当动物摄入了AFB1污染的食物后,AFM1的排出量为AFB1摄入量的1%~3%。大量的研究者对AFM1的毒性和致癌性进行了深入的研究,研究结果也促使国际癌症研究机构将AFM1的致癌等级由二类致癌物质变为一类致癌物质。AFM1性质稳定,即使经过巴氏杀菌,也几乎完全不能被破坏。在许多乳制品中均含有AFM1。由于乳制品是婴幼儿食物的主要来源,因此AFM1污染问题引起了世界各国的广泛关注,并对AFM1进行了严格的限量。我国属于黄曲霉毒素污染较重的地区,因此加强乳及乳制品中黄曲霉毒素M1的检测、特别是速测,及时了解和掌握乳及乳制品的卫生信息,对保障我国食品消费安全具有重要意义。
现有黄曲霉毒素的检测方法包括薄层层析法、精密仪器分析法和免疫学分析法。其中薄层层析法是检测黄曲霉毒素最常用的检测方法,其不需要特殊的仪器设备,一般实验室都可进行,但试剂用量大、操作繁琐、其它组分干扰严重、准确性差,不能准确定量,且对实验人员和周围环境污染危害较大,不适于现场快速检测。精密仪器分析法包括荧光分光光度法和高效液相色谱法,其灵敏度高,准确性好,但仪器昂贵,要求黄曲霉毒素样品纯化程度高,样品前处理过程繁琐,耗时长,对实验环境要求高,难以实现快速检测。近些年发展起来的免疫分析技术克服了前两者的缺点,具有特异性强、灵敏度高、样品前处理简单、成本低、对实验人员和周围环境的污染危害小、适于现场批量检测等优点。免疫分析是利用抗原和抗体的特异性的结合反应和抗体、抗原上的标记物的生物、物理或化学放大作用来对超微量残留物进行定性、定量检测,所以要研究建立针对黄曲霉毒素M1的任何一种免疫学检测技术,都必须先制得抗黄曲霉毒素M1的抗体。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供杂交瘤细胞株2C9、其产生的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体及其应用。
本发明提供了杂交瘤细胞株2C9,该细胞株已于2010年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏地址是,中国,武汉,武汉大学,保藏编号为CCTCC NO. C201018。其具有序列表中SEQ Gene No.1所示的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体重链可变区编码基因序列和序列表中SEQ Gene No.2所示的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体轻链可变区编码基因序列。
抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体,它由保藏编号为CCTCC NO. C201018的杂交瘤细胞株2C9分泌产生。其重链可变区具有序列表中SEQ Protein No.1所示的氨基酸序列;轻链可变区具有序列表中SEQ Protein No.2所示的氨基酸序列。该抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体可以识别黄曲霉毒素M1,对黄曲霉毒素M1的50%抑制浓度IC50 为67 pg/mL。
抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体在黄曲霉毒素M1测定中的应用。
本发明提供的杂交瘤细胞株2C9是采用两步筛选法获得的,其具体步骤为:将BALB/c小鼠经黄曲霉毒素完全抗原AFM1-BSA免疫4-6次后,用2倍于前一次免疫剂量的黄曲霉毒素完全抗原AFM1-BSA作最后一次加强免疫,3天后进行细胞融合,采用ELISA方法分两步进行筛选融合细胞:第一步采用间接ELISA法筛选出抗黄曲霉毒素而不抗载体蛋白BSA的阳性孔;第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔培养液进行检测,用黄曲霉毒素M1作为竞争原,选择吸光值和灵敏度均较高的孔,采用有限稀释法进行克隆,克隆后10天左右采用同样的两步筛选法进行检测,如此重复克隆2-3次后,最终筛选获得杂交瘤细胞株2C9。
本发明提供的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的制备方法,步骤如下:将获得的杂交瘤细胞株2C9注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠,收集该小鼠的腹水,纯化即得抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体。
按上述方案,所述的纯化方法为辛酸-硫酸铵法,具体操作为:用双层滤纸过滤小鼠腹水,4℃,12000r/min离心15min以上,吸取上清,将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合,搅拌下缓慢加入正辛酸,每毫升腹水所需的正辛酸体积为30~35 μL,室温混合30~60min,4℃静置2h以上,然后4℃,12000r/min离心30min以上,弃沉淀,将得到的上清液用双层滤纸过滤后,加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L 和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液,用2 mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4,4 ℃预冷,缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL,4℃静置2h以上,然后4℃,12000r/min离心30min以上,弃上清,将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬,装入透析袋,对纯水透析,将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻,之后用冷冻干燥机冻干,收集冻干粉,即得纯化好的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体,将抗体置-20℃冰箱中备用;
所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠,0.141mL醋酸加水定容至100mL所得;所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠,0.29g十二水磷酸氢二钠,0.02g氯化钾,磷酸二氢钾0.02g,加水定容至100mL所得。
本发明的有益效果在于:
(1)本发明提供的杂交瘤细胞株2C9可以用于制备高效价抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体,抗黄曲霉毒素M1鼠腹水抗体酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得的效价可达4.26×106。
(2)本发明提供的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体灵敏度高、特异性好,对黄曲霉毒素M1的50%抑制浓度IC50 为67 pg/mL,与黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2交叉反应率均小于0.1%。
(3)本发明提供的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体可应用于测定黄曲霉毒素M1。
附图说明
图1为本发明的快速检测黄曲霉毒素M1的免疫层析试纸的正视图。图中:1 纸板、2 吸水垫;3 检测垫;4 金标垫;5 样品垫;6 质控线;7 检测线。
图2为本发明的快速检测黄曲霉毒素M1的免疫层析试纸的左视图。图中:1 纸板;2 吸水垫;3 检测垫;4 金标垫;5 样品垫。
图3为实施例4中应用本发明提供的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体制备的试纸条检测样品的结果判定图。图中:1 对照试纸条;2 检测试纸条;3 质控线;4 检测线。
具体实施方式
实施例1:杂交瘤细胞株2C9的制备
1.动物免疫
购买6周龄BALB/c小鼠6只,免疫市售的黄曲霉毒素M1完全抗原AFM1-BSA。第一次免疫将黄曲霉毒素M1完全抗原与等量福氏完全佐剂乳化后,于小鼠颈背部皮下多点注射。第二次免疫于4周后进行,采用福氏不完全佐剂与等量黄曲霉毒素M1完全抗原乳化,于小鼠腹腔注射。第三次免疫与第二次免疫间隔4周,免疫方式与其相同,第四次免疫于第三次免疫3周后进行,免疫方式与第二次免疫相同,同样为腹腔注射。4次免疫剂量相同,均为每鼠50μg。前3次每次免疫后8天,尾静脉采血,分离血清,采用间接ELISA法监测小鼠血清效价。第4次免疫后8天,尾静脉采血,分离血清,采用间接ELISA法监测小鼠血清效价,并用间接竞争ELISA法测定小鼠血清灵敏度,选择效价、灵敏度均相对较高的血清对应的小鼠进行最后一次加强免疫,免疫剂量为之前的2倍。黄曲霉毒素M1完全抗原AFM1-BSA购于Sigma-Aldrich公司。
2.细胞融合
于最后一次加强免疫3天后,采用50%(重量百分数)的聚乙二醇即PEG(分子量为1450)作融合剂,按常规方法进行细胞融合,具体步骤:无菌条件下杀死免疫小鼠,分离脾细胞,与鼠源骨髓瘤细胞SP2/0以5︰1的个数比混合,用RPMI-1640基础培养液洗混合细胞,用50%PEG融合,融合1分钟,然后加满RPMI-1640基础培养液,离心,移去上清,小鼠脾细胞和鼠源骨髓瘤细胞SP2/0形成的融合细胞用72mLRPMI-1640基础培养液重悬,将重悬起来的细胞滴加到96孔细胞培养板内,2滴/孔,置37℃二氧化碳培养箱培养,所述的RPMI-1640基础培养液为含有20%(体积百分数)胎牛血清,2%(重量百分数)生长因子和1%(重量百分数)次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT。上述SP2/0购于上海泛柯生物科技有限公司;RPMI-1640基础培养液购于Hyclone公司;1%次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT购于Sigma-Aldrich公司。
3.细胞株的筛选及克隆
待细胞融合后第12天左右,细胞集落长到占孔底1/2大小,培养液变黄,即可进行抗体检测。采用ELISA方法对有杂交瘤细胞生长的培养孔进行筛选,筛选分两步进行,第一步采用间接ELISA法筛选出抗黄曲霉毒素M1而不抗载体蛋白BSA的阳性孔;第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔进行检测,用黄曲霉毒素M1作为竞争原,选择吸光值和灵敏度均较高的孔(吸光值较高指竞争原为0的孔即阳性对照孔的最终测定值较高,灵敏度较高指抑制率为50%时的竞争原浓度亦即IC50值较小),采用有限稀释法进行克隆,克隆后10天左右采用同样的两步法进行检测,如此重复克隆2-3次后,获得杂交瘤细胞株2C9。
实施例2:抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体杂交瘤细胞株系2C9抗体可变区序列测定
(1)提取总RNA:采用天根公司的总RNA提取试剂盒并按照说明书提取可产生杂交瘤细胞株系2C9的总RNA;
(2)合成cDNA:以步骤1获得的总RNA 为模板,oligo (dT) 15为引物,按照SuperScriptTM-2 Ⅱ反转录酶说明书进行反转录,合成cDNA第一链;引物oligo (dT) 15 由Invitrogen购得;
(3)PCR法克隆可变区基因:根据GENEBANK中小鼠抗体基因序列的保守位点设计引物,以cDNA为模版扩增抗体轻、重链可变区基因。PCR程序为:94℃ 30s、55℃ 1min、72℃ 1min ,扩增 30 个循环,最后 72℃延伸 10min。PCR 产物经过1%(重量百分数)的琼脂糖凝胶电泳分离后,用试剂盒纯化回收DNA片段,连接到载体pMD18-T中,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆,送至上海桑尼生物科技有限公司进行测序。其中引物的序列分别为:重链可变区引物为5,-AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG G-3,(22mer)和5,-TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CC-3,(32mer)其中S、M、R和W为兼并碱基,M=A/C,R=A/G,S=C/G,W=A/T,轻链可变区引物为5,-GAC ATT GAG CTC ACC CAG CTT GGT GCC -3,(24mer)和5,-CCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC-3,(24mer)。
得到的基因序列结果:重链可变区编码基因序列长354bp,序列如SEQ ID NO:1所示,根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的重链可变区由117个氨基酸组成,序列如SEQ ID NO:3所示。轻链可变区编码基因序列长332bp,序列如SEQ ID NO:2所示,根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的轻链可变区由110个氨基酸组成,序列如SEQ ID NO:4所示。
实施例3:抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的制备纯化、亚型和特性鉴定
将实施例2获得的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体杂交瘤细胞株系2C9注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠,收集该小鼠的腹水,采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体,具体操作为:用双层滤纸过滤小鼠腹水,4℃,12000r/min离心15min,吸取上清,将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合,搅拌下缓慢加入正辛酸,每毫升腹水所需的正辛酸体积为33 μL,室温混合30min,4℃静置2h,然后4℃,12000r/min离心30min,弃沉淀,将得到的上清液用双层滤纸过滤后,加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L 和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液,用2 mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4,4 ℃预冷,缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL,4℃静置2h,然后4℃,12000r/min离心30min,弃上清,将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬,装入透析袋,对纯水透析,将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻,之后用冷冻干燥机冻干,收集冻干粉,即得纯化好的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体,将抗体置-20℃冰箱中备用;
所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠,0.141mL醋酸加水定容至100mL所得;所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠,0.29g十二水磷酸氢二钠,0.02g氯化钾,磷酸二氢钾0.02g,加水定容至100mL所得。
用市售亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株2C9分泌的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的亚型为IgG2a。
用常规非竞争酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得2C9的鼠腹水抗体的效价可达4.26×106,即鼠腹水抗体稀释4.26×106倍时的溶液测定结果为阳性。用常规间接竞争ELISA法鉴定其对黄曲霉毒素M1的灵敏度为67 pg/mL,与黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2交叉反应率均小于0.1%。
实施例4:抗体应用
将杂交瘤细胞株2C9分泌的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体用于制备黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条,制备方法包括以下步骤:
(1)吸水垫的制备
将吸水纸剪裁成长16mm宽3mm的规格,即得吸水垫;
(2)检测垫的制备
检测线的包被:
将黄曲霉毒素M1-牛血清白蛋白的偶联物AFM1-BSA配制成0.1mg/mL的包被液A;于距硝酸纤维素膜上沿15mm的位置,用点喷方式将包被液A横向包被于硝酸纤维素膜上,得到检测线,每厘米检测线所需黄曲霉毒素M1-牛血清白蛋白的偶联物的包被量为75ng,然后于37℃条件下干燥15分钟;
所述的包被液A为:10mg市售黄曲霉毒素M1-牛血清白蛋白偶联物AFM1-BSA,1g牛血清白蛋白,0.02g叠氮化钠,0.8g氯化钠,0.29g十二水磷酸氢二钠,0.02g氯化钾,0.02g磷酸二氢钾,加水定容至100mL所得;
质控线的包被:
将兔抗鼠多克隆抗体配成0.2mg/mL的包被液B;于距检测线5mm的位置,用点喷方式将包被液B横向包被于硝酸纤维素膜上,得质控线,每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为100ng,然后于37℃条件下干燥15分钟;
所述的包被液B为将20mg兔抗鼠多克隆抗体,0.02g叠氮化钠,0.8g氯化钠,0.29g十二水磷酸氢二钠,0.02g氯化钾,0.02g磷酸二氢钾,加水定容至100mL所得;
所述的硝酸纤维素膜长25mm,宽3mm;
(3)样品垫的制备:
将玻璃纤维膜剪裁成长13mm宽3mm的规格,放入封闭液A中浸湿,取出,于37℃条件下干燥6小时,得样品垫,然后置干燥器中室温保存;
所述的封闭液A为1g牛血清白蛋白,2g蔗糖,0.02g叠氮化钠,0.8g氯化钠,0.29g十二水磷酸氢二钠,0.02g氯化钾,0.02g磷酸二氢钾,加水定容至100mL所得;
(4)金标垫的制备:
将玻璃纤维膜剪裁成长9mm宽3mm的规格,放入封闭液B中浸湿,取出,于37℃条件下干燥16小时,于干燥好的玻璃纤维膜上,用点喷方式将纳米金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体溶液横向喷涂,每厘米喷涂长度所需纳米金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体为600ng,然后真空冷冻干燥6h,置干燥器中室温保存;
所述的封闭液B为1g牛血清白蛋白,0.1mL曲拉通X-100,0.3g聚乙烯吡咯烷酮,2g蔗糖,0.02g叠氮化钠,0.8g氯化钠,0.29g十二水磷酸氢二钠,0.02g氯化钾,0.02g磷酸二氢钾,加水定容至100mL所得;
所述的纳米金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体溶液的具体标记方法为:量取50.0mL质量浓度为0.01%的纳米金溶液,用0.1 mol/L碳酸钾水溶液调节溶液pH值为5.5;在搅拌的状态下缓慢加入2.5mL 0.1mg/mL的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体水溶液,继续搅拌30min;加入质量浓度为10%牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的终质量浓度为1%,继续搅拌30min;于4℃放置2h后,1500r/min离心15min,取上清液,弃沉淀;将上清液12000r/min离心30 min,弃去上清液,加入50.0mL标记洗涤保存液;再以12000r/min离心30 min,弃去上清液,将沉淀用标记洗涤保存液重悬,得到5.0mL浓缩物,置4℃冰箱备用,其中纳米金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体溶液的质量浓度为0.05mg/mL;
所述纳米金溶液中纳米金的粒径为15nm;
所述的0.1 mol/L碳酸钾水溶液为:13.8g碳酸钾溶于纯水定容至1000mL,0.22μm滤膜过滤所得;所述的0.1mg/mL抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体水溶液为1mg抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体溶解在10 mL纯水中制成;所述的10%牛血清白蛋白水溶液为10g牛血清白蛋白溶解在100mL纯水中,0.22μm滤膜过滤所得;所述的标记洗涤保存液为:2.0g聚乙二醇-20000,0.2g叠氮钠,0.1235克硼酸,纯水定容至1000mL,0.22μm滤膜过滤所得;
(5)试纸条的组装:在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫,相邻各垫在连接处交叠连接,交叠长度为1mm,即得黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条,见图1和图2。
上述黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条的应用:
吸取1#和2#待测牛奶样品各1mL,加入0.25mL水,混匀,得到样品溶液,取100μL稀释好的样品溶液分别做为检测液逐滴加入一黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条的样品垫,将其作为检测试纸条,同时取1mL不含有黄曲霉毒素M1的空白牛奶样品,加入0.25mL水,混匀,得到阴性对照溶液,取100μL阴性对照溶液,逐滴加入另一黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条的样品垫,将其作为对照试纸条,15分钟后读取结果;
检测结果:1#检测试纸条的质控线显示出红色线条,而检测线不显色,则判为阳性结果,表明待测样品中的黄曲霉毒素M1的含量高于0.5ng/mL,见图3-1;2#检测试纸条的质控线显示出红色线条,而检测线颜色比对照试纸条检测线颜色浅,则判为阳性结果,表明待测样品中黄曲霉毒素M1的含量高于或等于0.5ng/mL,见图3-2。
Claims (5)
1.杂交瘤细胞株2C9,其特征在于:它保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO.C201018。
2.抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体,其特征在于:它由保藏编号为CCTCC NO.C201018的杂交瘤细胞株2C9分泌产生。
3.权利要求2所述的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体在黄曲霉毒素M1含量测定中的应用。
4.根据权利要求2所述的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的制备方法,其特征在于:将获得的杂交瘤细胞株2C9注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠,收集该小鼠的腹水,纯化即得抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的制备方法,其特征在于:所述的纯化方法为辛酸-硫酸铵法,具体操作为:用双层滤纸过滤小鼠腹水,4℃,12000r/min离心15min以上,吸取上清,将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合,搅拌下缓慢加入正辛酸,每毫升腹水所需的正辛酸体积为30~35μL,室温混合30~60min,4℃静置2h以上,然后4℃,12000r/min离心30min以上,弃沉淀,将得到的上清液用双层滤纸过滤后,加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液,用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4,4℃预冷,缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL,4℃静置2h以上,然后4℃,12000r/min离心30min以上,弃上清,将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬,装入透析袋,对纯水透析,将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻,之后用冷冻干燥机冻干,收集冻干粉,即得纯化好的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体,将抗体置-20℃冰箱中备用;
所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠,0.141mL醋酸加水定容至100mL所得;所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠,0.29g十二水磷酸氢二钠,0.02g氯化钾,磷酸二氢钾0.02g,加水定容至100mL所得。
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