CN102220249B - 一种中国被毛孢的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种微生物菌种的生产方法，具体是一种中国被毛孢的生产方法。本发明使用鼠巨噬细胞培养获得细胞动态信息筛选出的中国被毛孢，经多级培养发酵后，通过固液分离技术，将菌丝加以通过300-4000分子量的膜过滤后菌液干燥处理后，制成具有增加免疫功能的保健食品与药品。该方法实现了产业化冬虫夏草菌种的不稳定性，从菌种筛选到培养发酵到固液膜处理，全程数字化标准控制，真正意义上实现标准化生产产业化冬虫夏草的工艺，其精准的筛选方法、快捷的生产速度、纯净的生产工艺、较低的生产成本，可以广泛的为大众所接受。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物菌种的生产方法，具体是指一种中国被毛孢新品系的生产方法。
技术背景
冬虫夏草是中国的一种名贵中药材，野生资源遭到极度采集，随市场需求日益增大，国内外市场货源紧缺，且价格较高，因此，利用从天然冬虫夏草中分离得到的冬虫夏草菌种——中国被毛孢，通过深层发酵培养，将发酵产物过滤干燥制成成品，因其质量稳定，价格合理，越来越受到青睐。以中国被毛孢为菌种发酵生产制品(如百令胶囊)，不但有效缓解了冬虫夏草市场供需矛盾，延缓草原环境恶化，而且使冬虫夏草变得有名但不再昂贵，能让更多的老百姓享用得起。但是也存在许多不足，人们使用人工冬虫夏草发酵制品后容易上火，少数产生胃肠道不良反应，而天然冬虫夏草性温平，几乎很少发生，所以人工冬虫夏草制品在疗效上与天然冬虫夏草存在一定的距离；另外，人工冬虫夏草发酵废液的排放对环境也造成比较大的污染。解决这些问题，一方面需要从优良菌种的筛选着手，另一方面从发酵工艺和提取工艺上进行改进。
发明内容
本发明针对现有技术中的不足，提出了一种生产工艺相对简单、操作方便的生产方法。
本发明是通过下述技术方案得以实现的：
一种中国被毛孢的生产方法，其特征在于包括下述步骤：
(1)半固体菌种斜面培养：
培养基溶于煮沸的水中，调节pH至7.2，在121℃、灭菌30分钟，制成斜面培养基；冷却后放入28℃培养箱培养3天，确认无杂菌污染后，接入中国被毛孢菌种，均匀涂布；控制温度17～19℃培养，培养时间30～45天；然后，放入0～4℃冰箱保存；
其中斜面培养基的组成按重量百分比为：脱脂蚕蛹粉2.1～3.0％，玉米粉1.5％，麸皮1～5％，葡萄糖2％，KH2PO4 0.02％， MgSO4 0.01％，琼脂1.8％，其余为水；
(2)液体菌种摇瓶培养：
把斜面培养后的菌种接种到装有液体培养基的摇瓶，在摇床震荡培养，培养温度17～19℃，摇床转速100～120rpm，培养8～13天，接入无菌接种罐内，供液体菌种增殖培养接种用；
摇瓶菌种培养基的组成按重量百分比为：脱脂蚕蛹粉2.1～3.0％，玉米粉1.5％，麸皮1～5％，葡萄糖2％，KH2PO4 0.02％，MgSO4 0.01％，其余为水；
(3)液体菌种增殖培养：
液体菌种增殖培养在培养罐中培养，培养条件为：罐压0.03～0.05Mpa，通气量1∶0.2，罐温17～19℃，搅拌速度120～140rpm，培养7～12天；当培养液中葡萄糖糖量快速下降，菌丝生长旺盛，菌丝稠密，菌丝体体积浓度不低于13％，检查无杂菌后，移入发酵罐；
液体菌种增殖培养的培养基组成按重量百分比为：脱脂蚕蛹粉2.1～3.0％，玉米粉1.5％，麸皮1～5％，葡萄糖2％，KH2PO4 0.02％，MgSO4 0.01％，其余为水；
(4)发酵培养
发酵培养在培养罐中培养，培养条件为：罐压0.03～0.05Mpa，通气量1∶0.2，罐温17～19℃，搅拌速度120～140rpm，培养9～12天，菌丝体体积浓度达25％以上，葡萄糖降至1.0％，视为发酵终点，放罐；
发酵培养基的组成按重量百分比为：脱脂蚕蛹粉2.1％，麸皮5％，玉米粉1.5％，葡萄糖2％，鱼蛋白胨0.25％，肉蛋白胨0.75％，酵母膏0.1％，KH2PO4 0.02％，MgSO4 0.01％，其余为水；调节pH至7.2；
(5)固液分离：
经发酵培养后的发酵液经固液分离器分离，分离出菌丝体和发酵清液；
(6)膜分离：
将固液分离过程中的发酵清液用300-4000分子量的膜分离器分离，得膜分离浓液；本发明中的膜分离为常规的分离方法，选择相应的膜材料、操作条件即可，且目前市场上有大量的膜材料可以选择。
(7)菌丝体与分离浓液干燥：
将膜分离浓液喷入干燥器，与菌丝体一同干燥，干燥温度在80-100℃，得产品。
作为优选，上述生产方法的步骤(1)中国被毛孢菌种的接入在18℃，接种量为10％，且为火焰保护无菌接种。
作为优选，上述生产方法的步骤(1)中所述的脱脂蚕蛹粉的含油量低于3％。
作为优选，上述生产方法中的脱脂蚕蛹粉，玉米粉，麸皮用10-20倍水提取，经过滤后，水提液加入培养基。
作为优选，上述生产方法中的中国被毛孢菌种是指经以上生产方法所得产品的水提物加入鼠肥大细胞RBL-2H3株进行无血清培养60小时，其细胞指数降低至1.5以下的中国被毛孢菌株。
本发明中国被毛孢是微生物界真菌的一个正式种名，曾用名为蝙蝠蛾被毛孢。
本发明中在半固体培养基和液体中所使用含油量＜3％脱脂蚕蛹粉，可以更好地促进中国被毛孢生长，达到更好的技术效果。另外，在半固体培养基和液体中加入2.1-3％脱脂蚕蛹粉、玉米粉、麸皮水提液有利于中国被毛孢生长，使菌丝量在上述时间内达到生产方法规定的要求。
本发明中液体菌种增殖培养是根据发酵罐的体积和接种量的要求，可以是二级(次)、三级、四级菌种放大培养。本发明中所指细胞指数(Cell Index)是一个现有技术中公开了的概念，具体在参考文献(ASSAY and Drug Development Technologies，Volume 2，Number 4，2004)中所公开。
有益效果：通过本发明结合细胞生物学的方法，将二十多个分离所得的中国被毛孢菌种的水提物加入无血清培养的鼠肥大细胞株RBL-2H3培养基，获得细胞动态信息，用天然冬虫夏草作对照，加入水提物的60小时内，细胞指数降低至1.5以下的中国被毛孢培养物，筛选为优良菌种。
通过对工艺的改进：取中国被毛孢常规发酵物，固液分离，发酵清液用300～4000分子量的膜分离器分离，得膜分离浓液，浓液与菌丝体混合或分别干燥，得中国被毛孢的发酵终产物。
经过对优良菌种的筛选，使冬虫夏草制品在功效上与天然冬虫夏草更接近，经动物药理实验证明，具有增强免疫功能和补肺强肾功能。
中国被毛孢发酵物处理工艺的改进，大大提高了产量，同时也减少了环境污染，而且可控性大大增强。
具体实施方式
下面对本发明的实施作具体说明：
实施例1
一种中国被毛孢的生产方法，通过下述步骤进行实施：
(1)半固体菌种斜面培养：
培养基溶于煮沸的水中，调节pH至7.2，在121℃、灭菌30分钟，制成斜面培养基；冷却后放入28℃培养箱培养3天，确认无杂菌污染后，接入中国被毛孢菌种，均匀涂布；控制温度17～18℃培养，培养时间40天；然后，放入3℃冰箱保存；其中斜面培养基的组成按重量百分比为：脱脂蚕蛹粉2.1％，玉米粉1.5％，麸皮1.5％，葡萄糖2％，KH2PO4 0.02％，MgSO4 0.01％，琼脂1.8％，其余为水；其中接种量为15％；
(2)液体菌种摇瓶培养：
把斜面培养后的菌种接种到装有液体培养基的摇瓶，在摇床震荡培养，培养温度17℃，摇床转速100rpm，培养9天，接入无菌接种罐内，供液体菌种增殖培养接种用；摇瓶菌种培养基的组成按重量百分比为：脱脂蚕蛹粉2.1％，玉米粉1.5％，麸皮2％，葡萄糖2％，KH2PO40.02％，MgSO4 0.01％，其余为水；
(3)液体菌种增殖培养：
液体菌种增殖培养在培养罐中培养，培养条件为：罐压0.03Mpa，通气量1∶0.2，罐温18℃，搅拌速度120rpm，培养8天；当培养液中葡萄糖糖量快速下降，菌丝生长旺盛，菌丝稠密，菌丝体体积浓度不低于13％，检查无杂菌后，移入发酵罐；液体菌种增殖培养的培养基组成按重量百分比为：脱脂蚕蛹粉2.1％，玉米粉1.5％，麸皮2％，葡萄糖2％，KH2PO40.02％，MgSO4 0.01％，其余为水；
(4)发酵培养
发酵培养在培养罐中培养，培养条件为：罐压0.04Mpa，通气量1∶0.2，罐温18℃，搅拌速度120rpm，培养9天，菌丝体体积浓度达25％以上，葡萄糖降至1.0％，视为发酵终点，放罐；
发酵培养基的组成按重量百分比为：脱脂蚕蛹粉2.1％，麸皮5％，玉米粉1.5％，葡萄糖2％，鱼蛋白胨0.25％，肉蛋白胨0.75％，酵母膏0.1％，KH2PO4 0.02％，MgSO4 0.01％，其余为水；调节pH至7.2；
(5)固液分离：
经发酵培养后的发酵液经固液分离器分离，分离出菌丝体和发酵清液；此步骤为本行业内的常规操作方法。
(6)膜分离：
将固液分离过程中的发酵清液用3000分子量的膜分离器分离，得膜分离浓液；
(7)菌丝体与分离浓液干燥：
将膜分离浓液喷入干燥器，与菌丝体一同干燥，干燥温度在80-100℃，得产品。
本产品经使用验证，具有良好的效果。
实施例2
与实施例相同的方法，通过下述步骤进行实施
(1)半固体菌种斜面培养：
培养基溶于煮沸的水中，调节pH至7.2，在121℃、灭菌30分钟，制成斜面培养基；冷却后放入28℃培养箱培养3天，确认无杂菌污染后，接入中国被毛孢菌种，均匀涂布；控制温度18～19℃培养，培养时间45天；然后，放入4℃冰箱保存；其中斜面培养基的组成按重量百分比为：脱脂蚕蛹粉2.9％，玉米粉1.5％，麸皮4.5％，葡萄糖2％，KH2PO4 0.02％，MgSO4 0.01％，琼脂1.8％，其余为水；其中接种量为15％；中国被毛孢菌种的接入在18℃，接种量为10％，且为火焰保护无菌接种；其中脱脂蚕蛹粉的含油量低于3％；
本实施例中的中国被毛孢菌种是指经以上生产方法所得产品的水提物加入鼠肥大细胞RBL-2H3株进行无血清培养60小时，其细胞指数降低至1.5时的中国被毛孢菌株；
(2)液体菌种摇瓶培养：
把斜面培养后的菌种接种到装有液体培养基的摇瓶，在摇床震荡培养，培养温度18℃，摇床转速120rpm，培养13天，接入无菌接种罐内，供液体菌种增殖培养接种用；摇瓶菌种培养基的组成按重量百分比为：脱脂蚕蛹粉2.8％，玉米粉1.5％，麸皮4％，葡萄糖2％，KH2PO40.02％，MgSO4 0.01％，其余为水；
(3)液体菌种增殖培养：
液体菌种增殖培养在培养罐中培养，培养条件为：罐压0.04Mpa，通气量1∶0.2，罐温19℃，搅拌速度140rpm，培养12天；当培养液中葡萄糖糖量快速下降，菌丝生长旺盛，菌丝稠密，菌丝体体积浓度不低于13％，检查无杂菌后，移入发酵罐；液体菌种增殖培养的培养基组成按重量百分比为：脱脂蚕蛹粉2.8％，玉米粉1.5％，麸皮4％，葡萄糖2％，KH2PO40.02％，MgSO4 0.01％，其余为水；
本实施例中脱脂蚕蛹粉，玉米粉，麸皮用10-20倍水提取，经过滤后，水提液加入培养基；
(4)发酵培养
发酵培养在培养罐中培养，培养条件为：罐压0.05Mpa，通气量1∶0.2，罐温18℃，搅拌速度140rpm，培养11天，菌丝体体积浓度达25％以上，葡萄糖降至1.0％，视为发酵终点，放罐；
发酵培养基的组成按重量百分比为：脱脂蚕蛹粉2.1％，麸皮5％，玉米粉1.5％，葡萄糖2％，鱼蛋白胨0.25％，肉蛋白胨0.75％，酵母膏0.1％，KH2PO4 0.02％，MgSO4 0.01％，其余为水；调节pH至7.2；
(5)固液分离：
经发酵培养后的发酵液经固液分离器分离，分离出菌丝体和发酵清液；此步骤为本行业内的常规操作方法。
(6)膜分离：
将固液分离过程中的发酵清液用2000分子量的膜分离器分离，得膜分离浓液；
(7)菌丝体与分离浓液干燥：
本产品经使用验证，具有良好的效果。
Claims (4)
1.一种中国被毛孢的生产方法，其特征在于包括下述步骤：
（1）半固体菌种斜面培养：
培养基溶于煮沸的水中，调节pH至7.2，在121℃、灭菌30分钟，制成斜面培养基；冷却后放入28 ℃培养箱培养3天，确认无杂菌污染后，接入中国被毛孢菌种，均匀涂布；控制温度 17～19℃培养，培养时间30～45天；然后，放入0～4 ℃冰箱保存；
其中斜面培养基的组成按重量百分比为：脱脂蚕蛹粉2.1～3.0 %，玉米粉1.5 %，麸皮1～5 %，葡萄糖2 %，KH2PO4 0.02%， MgSO4 0.01 %，琼脂1.8 %，其余为水；
（2）液体菌种摇瓶培养：
把斜面培养后的菌种接种到装有液体培养基的摇瓶，在摇床震荡培养，培养温度17～19℃，摇床转速100～120rpm，培养8～13天，接入无菌接种罐内，供液体菌种增殖培养接种用；
摇瓶菌种培养基的组成按重量百分比为：脱脂蚕蛹粉2.1～3.0 %，玉米粉1.5 %，麸皮1～5 %，葡萄糖2 %，KH2PO4 0.02%， MgSO4 0.01 %，其余为水；
（3）液体菌种增殖培养：
液体菌种增殖培养在增殖培养罐中培养，培养条件为：罐压0.03～0.05Mpa，通气量1：0.2，罐温17～19℃，搅拌速度120～140rpm，培养7～12天；当培养液中葡萄糖糖量快速下降，菌丝生长旺盛，菌丝稠密，菌丝体体积浓度不低于13 %，检查无杂菌后，移入发酵培养罐；
液体菌种增殖培养的培养基组成按重量百分比为：脱脂蚕蛹粉2.1～3.0 %，玉米粉1.5 %，麸皮1～5 %，葡萄糖2 %，KH2PO4 0.02%，MgSO4 0.01 %，其余为水；
（4）发酵培养
发酵培养在发酵培养罐中培养，培养条件为： 罐压0.03～0.05Mpa，通气量1：0.2，罐温17～19℃，搅拌速度120～140rpm，培养9～12天，菌丝体体积浓度达25％以上，葡萄糖降至1.0％，视为发酵终点，放罐；
发酵培养基的组成按重量百分比为：脱脂蚕蛹粉2.1%，麸皮 5%，玉米粉 1.5% ，葡萄糖 2% ，鱼蛋白胨0.25%，肉蛋白胨0.75%，酵母膏0.1%，KH2PO4 0.02%，MgSO4 0.01%，其余为水；调节pH至7.2；
（5）固液分离：
经发酵培养后的发酵液经固液分离器分离，分离出菌丝体和发酵清液；
（6）膜分离：
将固液分离过程中的发酵清液用300-4000分子量的膜分离器分离，得膜分离浓液；
（7）菌丝体与分离浓液干燥：
将膜分离浓液喷入干燥器，与菌丝体一同干燥，干燥温度在80-100℃，得产品。
2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于步骤（1）中国被毛孢菌种的接入在18℃，接种量为10%，且为火焰保护无菌接种。
3.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于步骤（1）中所述的脱脂蚕蛹粉的含油量低于3 %。
4.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于所述的脱脂蚕蛹粉，玉米粉，麸皮用10-20倍水提取，经过滤后，水提液加入培养基。
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