CN102219687B

CN102219687B - 地胆草提取物及其制备方法和在制备抗病毒药物中的用途

Info

Publication number: CN102219687B
Application number: CN2011101016501A
Authority: CN
Inventors: 李药兰; 叶文才; 吴霞; 王国才; 王英; 张晓琦; 张冬梅
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2011-04-22
Filing date: 2011-04-22
Publication date: 2013-09-04
Anticipated expiration: 2031-04-22
Also published as: CN102219687A

Abstract

本发明公开了一种地胆草提取物及其制备方法和用途。该地胆草提取物的制备方法是将地胆草的干燥全草或根用乙醇或水提取，再经过大孔吸附树脂柱纯化得到，其活性成分为咖啡酰奎宁酸类物质。本发明首次从广东民间应用广泛的草药地胆草中，提取并富集了具有抗呼吸道病毒作用的地胆草提取物，该提取物可用于制备抗呼吸道合胞病毒、抗副流感3型病毒或抗甲型流感病毒的药物或保健品。本发明不但为地胆草的民间应用提供了一定的科学依据，而且为开发安全、高效的新型抗呼吸道病毒药物提供了新资源。

Description

地胆草提取物及其制备方法和在制备抗病毒药物中的用途

技术领域

本发明属于中药领域，特别涉及一种从中药地胆草(Elephantopus scaber)中得到的提取物及其制备方法和在制备抗病毒药物中的用途。

背景技术

地胆草(Elephantopus scaber)为菊科(Compositae)地胆草属(Elephantopus)植物，也叫地胆头、苦地胆、土公英，主要分布在我国的华南和西南地区，具清热、凉血、利湿的功效，该草药在我国广东民间应用广泛，用于治疗感冒、百日咳、黄疽、咽炎、结膜炎、肾炎、湿疹和虫蛇咬伤等，并收录于1977年版《中国药典》。地胆草中主要的化学成分有倍半萜类、黄酮类和咖啡酰基奎宁酸类化合物。现代药理研究表明，地胆草具有抗病毒、抑菌、抗肿瘤和解热等作用，其中，有研究报道地胆草的粗提物具有较好的抗呼吸道合胞病毒(RSV)活性，但是，对地胆草的抗病毒活性部位及和活性成分没有研究报道。在国家知识产权局相关检索和中国期刊网、Scifinder Scholar的检索结果显示，未发现以咖啡酰奎宁酸类物质作为有效成分的地胆草提取物及其制备方法和在抗呼吸道病毒方面的用途的专利和文献。

众所周知，呼吸道病毒感染是严重危害人类健康的传染性疾病之一，其中流感病毒、副流感病毒和呼吸道合胞病毒是呼吸道病毒感染的主要病原体。由于病毒是细胞内寄生的微生物，它的复制与宿主细胞的许多生化过程密切相关，因此，寻找能选择性地抑制病毒又不影响宿主细胞功能的抗病毒药物有一定困难；此外，病毒抗原的易变异性和抗病毒药物的耐药性等因素也给抗病毒药物的研究和开发造成困难。因此，目前FDA批准用于临床的抗病毒药比抗菌药少得多，而且还存在毒副作用和耐药性等问题。因此，亟需寻找和开发安全、高效的新型抗病毒药物。

发明内容

为了解决上述现有技术存在的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种地胆草提取物。

本发明的另一目的在于提供上述地胆草提取物的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述地胆草提取物在制备抗病毒药物中的用途。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种地胆草提取物的制备方法，包括以下操作步骤：

(1)将地胆草全草或根部干燥和粉碎后，用质量百分比浓度为0～100％的乙醇溶液提取，合并提取液，过滤，减压浓缩至无醇味，得到粗提物浸膏；或将地胆草全草或根部干燥和粉碎后，采用水提醇沉法提取，提取液过滤，浓缩，得到粗提物浸膏；

(2)将粗提物浸膏用蒸馏水溶解成粗提液，经大孔吸附树脂纯化得到地胆草提取物。

步骤(1)所述用质量百分比浓度为0～100％的乙醇溶液提取的次数为1～3次，每次提取1～3小时。

步骤(2)所述经大孔吸附树脂纯化得到地胆草提取物是先将粗提液流经大孔吸附树脂柱，用蒸馏水洗脱柱子，用薄层色谱(TLC)分析跟踪，直至流出液在硅胶薄层板上展开后喷洒质量百分比浓度5％的FeCl₃乙醇溶液显蓝色或蓝黑色斑点；再用质量百分比浓度50～60％的乙醇溶液洗脱柱子，用薄层色谱(TLC)分析跟踪，直至流出液在硅胶薄层板上展开后喷洒质量百分比浓度5％的FeCl₃乙醇溶液不显色；收集乙醇溶液洗脱柱子的流出液，回收溶剂，浓缩，干燥，得到地胆草提取物。

步骤(1)所述地胆草是菊科地胆草属植物。

步骤(1)所述水提醇沉法是按制药工业常规的方法进行提取。

一种根据上述方法制备得到的地胆草提取物，包括以下活性成分：3，5-O-二咖啡酰奎宁酸、3，4-O-二咖啡酰奎宁酸、4，5-O-二咖啡酰奎宁酸、3，5-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯、3，4-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯、4，5-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯和5-O-咖啡酰奎宁酸。

以地胆草提取物的干品重量计算，地胆草提取物中总酚的质量百分含量＞50％。

上述的地胆草提取物在制备抗病毒药物或保健品中的用途。

所述病毒为呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感3型病毒(PIV 3)或甲型流感病毒(FluA，H1N1)。

所述抗病毒药物含有治疗有效量的地胆草提取物和药学上可接受的载体。

本发明相对现有技术具有如下的优点及有益效果：

(1)首次从广东民间应用广泛的草药地胆草中，提取并富集了具有抗呼吸道病毒作用的地胆草提取物，抗病毒实验表明：该提取物具有很强的抗呼吸道合胞病毒(RSV)和副流感3型病毒(PIV 3)的活性，而且细胞毒性小，因此其抗RSV和PIV 3的选择性指数(SI值，SI＝CC₅₀/IC₅₀)高于阳性对照药病毒唑；另外，该提取物还具有一定的抗甲型流感病毒的活性，其抗甲型流感病毒的SI值与病毒唑的相当。

(2)明确了该地胆草提取物主要由活性很好的咖啡酰奎宁酸类物质组成。

(3)本发明不但为地胆草的民间应用提供了一定的科学依据，而且为开发安全、高效的新型抗呼吸道病毒药物提供了新资源。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：

取菊科地胆草属草药地胆草(采自广东，由广州市药材公司高级工程师麦振球鉴定)的干燥根200g，粉碎，分别用2000mL质量百分比浓度为95％的乙醇水溶液回流提取2次，每次1小时，过滤，合并滤液，减压浓缩至无醇味，得到粗提物浸膏；

称取大孔吸附树脂(D101)500g，加蒸馏水800mL，搅拌均匀，用水浮选法除去树脂单体或碎片，然后在室温下放置24h，待树脂充分溶胀后，将树脂抽干，再用乙醇湿法装柱，用乙醇流动清洗柱子至流出液与水的体积比为1∶5混合时不呈白色浑浊，然后用蒸馏水充分淋洗柱子至流出液无乙醇的味道，放置过夜平衡柱子，得到大孔树脂柱。

将上述粗提物浸膏用500mL蒸馏水溶解，过滤，滤液缓缓流过上述处理和平衡过的大孔树脂柱中，用蒸馏水继续洗柱子，洗脱过程用TLC分析跟踪，水洗脱过程直至流出液在硅胶薄层板上展开后、喷洒质量百分比浓度5％的FeCl₃乙醇溶液显蓝色或蓝黑色斑点即停止。接着再用质量百分比浓度50～60％的乙醇溶液洗脱柱子，流出液同上用TLC分析跟踪，直至流出液在硅胶薄层板上展开后、喷洒质量百分比浓度5％的FeCl₃乙醇溶液不显色，收集流出液，回收溶剂，浓缩、冷冻干燥得到地胆草提取物1。以提取物干品重量计算，该地胆草提取物中总酚的质量百分含量＞50％。

实施例2：

将200g地胆草的干燥根粉碎，用2000mL的蒸馏水回流提取3小时，过滤，滤液用旋转蒸发仪浓缩，在搅拌下加入质量百分比浓度95％的乙醇溶液至乙醇含量为质量百分比浓度80％，静置24小时，滤取上清液，减压回收乙醇至无醇味，得得到粗提物浸膏。粗提物浸膏经大孔吸附树脂柱纯化得地胆草提取物2，纯化方法与实施例1一致。以提取物干品重量计算，地胆草提取物中总酚的质量百分含量＞50％。

实施例3：

将200g地胆草的干燥根粉碎，分别用2000mL的蒸馏水回流3次，每次1～3小时，过滤，合并滤液得粗提物浸膏。粗提物浸膏经大孔吸附树脂柱纯化得地胆草提取物3，纯化方法与实施例1一致。以提取物干品重量计算，地胆草提取物中总酚的质量百分含量＞50％。

实施例4：地胆草提取物的总酚含量测定(比色法)：

在10mL容量瓶中，加入待测物(本发明地胆草提取物)的丙酮-水溶液8ml，然后加入Folin-Ciocalteau试剂0.5mL，摇匀，放置1分钟。再加入质量百分比浓度为20％硫酸钠溶液1.5mL，摇匀，放置1小时。在750nm下测定吸收度。同时在另一容量瓶中加入丙酮-水，按同上步骤显色作为空白。

另外，用3，5-O-二咖啡酰奎宁酸(自制，HPLC分析结果显示其纯度＞95％)做标准样品测定标准曲线。将在干燥器中干燥至恒重的标准品配成系列浓度，按同上方法，在750nm测定吸收度，作标准曲线。

测定结果显示，地胆草提取物中，以3，5-O-二咖啡酰奎宁酸计，地胆草提取物中总酚的质量百分含量＞50％。

实施例5：地胆草提取物1中咖啡酰奎宁酸衍生物的提取、分离和结构测鉴定

将实施例1所得的地胆草提取物1经过反复硅胶柱层析、氯仿-甲醇溶剂体系洗脱，再经过反复Sephadex LH-20凝胶柱层析分离、氯仿-甲醇和甲醇-水溶剂体系洗脱，然后再经过制备HPLC纯化、甲醇-三氟醋酸溶剂洗脱，得到7个咖啡酰奎宁酸类化合物，它们的化学结构采用光谱分析的方法鉴定，数据如下：

化合物1：黄色粉末，薄层层析碘熏显土黄色，三氯化铁显蓝黑色，示有酚羟基存在；ESI-MSm/z：515[M-H]^-，1031[2M-H]^-；¹H-NMR(500MHz，CD₃OD)δppm：7.56(1H，d，J＝16.0Hz，H-7’)，7.52(1H，d，J＝16.0Hz，H-7”)，7.01(2H，d，J＝2.0Hz，H-2’，H-2”)，6.91(2H，dd，J＝7.0，2.0Hz，H-6’，H-6”)，6.73(2H，d，J＝7.0Hz，H-5’，H-5”)，6.30(1H，d，J＝16.0Hz，H-8’)，6.21(1H，d，J＝16.0Hz，H-8”)，5.38(1H，m，H-5)，5.32(1H，m，H-3)，3.91(1H，dd，J＝7.5，3.0Hz，H-4)，2.09-2.27(4H，m，H-2，H-6).¹³C-NMR(125MHz，CD₃OD)δppm：74.8(C-1)，37.6(C-2)，72.6(C-3)，70.9(C-4)，72.1(C-5)，36.0(C-6)，177.5(C-7)，123.1(C-1’，C-1”)，116.5(C-2’，C-2”)，147.2(C-3’，C-3”)，149.6(C-4’，C-4”)，115.6(C-5’，C-5”)，116.5(C-6’，C-6”)，146.8(C-7’，C-7”)，115.2(C-8’，C-8”)，168.4(C-9’)，168.9(C-9”)。

化合物2：淡黄色粉末，薄层层析碘熏显土黄色，三氯化铁显蓝黑色，示有酚羟基存在；ESI-MSm/z：515[M-H]^-，1031[2M-H]^-；¹H-NMR(500MHz，CD₃OD)δppm：7.53(1H，d，J＝16.5Hz，H-7’)，7.46(1H，d，J＝16.0Hz，H-7”)，6.96(H，d，J＝2.0Hz，H-2’)，6.94(1H，d，J＝1.5Hz，H-2”)，6.87(2H，dd，J＝6.5，2.0Hz，H-6’，H-6”)，6.70(1H，d，J＝8.5Hz，H-5’)，6.68(1H，d，J＝8.0Hz，H-5”)，6.23(1H，d，J＝16.5Hz，H-8’)，6.13(1H，d，J＝16.0Hz，H-8”)，5.57(1H，m，H-3)，5.06(1H，dd，J＝9.0，2.5Hz，H-4)，4.32(1H，dt，J＝3.0，2.5Hz，H-5)，2.05-2.23(4H，m，H-2，H-6).¹³C-NMR(125MHz，CD₃OD)δppm：75.9(C-1)，39.4(C-2)，69.0(C-3)，75.8(C-4)，69.4(C-5)，38.3(C-6)，177.0(C-7)，127.7(C-1’，C-1”)，115.2(C-2’，C-2”)，146.8(C-3’，C-3”)，149.7(C-4’，C-4”)，116.5(C-5’，C-5”)，123.1(C-6’，C-6”)，147.7(C-7’，C-7”)，114.8(C-8’，C-8”)，168.3(C-9’)，168.6(C-9”)。

化合物3：淡黄色粉末，薄层层析碘熏显土黄色，三氯化铁显蓝黑色，示有酚羟基存在；ESI-MSm/z：515[M-H]^-，1031[2M-H]^-；¹H-NMR(500MHz，CD₃OD)δppm：7.64(1H，d，J＝16.0Hz，H-7’)，7.53(1H，d，J＝16.0Hz，H-7”)，7.10(H，d，J＝2.0Hz，H-2’)，7.08(1H，d，J＝2.0Hz，H-2”)，6.97(2H，dd，J＝6.5，2.0Hz，H-6’，H-6”)，6.76(1H，d，J＝8.5Hz，H-5’)，6.72(1H，d，J＝8.0Hz，H-5”)，6.30(1H，d，J＝16.0Hz，H-8’)，6.23(1H，d，J＝16.0Hz，H-8”)，5.72(1H，m，H-5)，5.15(1H，dd，J＝9.0，3.0Hz，H-4)，4.36(1H，dt，J＝3.0，2.5Hz，H-3)，2.04-2.31(4H，m，H-2，H-6).¹³C-NMR(125MHz，CD₃OD)δppm：77.5(C-1)，40.7(C-2)，69.5(C-3)，77.1(C-4)，70.7(C-5)，38.8(C-6)，177.0(C-7)，127.7(C-1’，C-1”)，115.1(C-2’，C-2”)，146.7(C-3’，C-3”)，149.6(C-4’，C-4”)，116.5(C-5’，C-5”)，123.1(C-6’，C-6”)，147.5(C-7’，C-7”)，114.9(C-8’，C-8”)，168.5(C-9’，C-9”)。

化合物4：黄色粉末，薄层层析碘熏显土黄色，三氯化铁显蓝黑色，示有酚羟基存在；ESI-MSm/z：529[M-H]^-，1059[2M-H]^-；UVλ_max(MeOH)：251(sh)，300(sh)，331；¹H-NMR(500MHz，CD₃OD)δppm：5.25(1H，m，H-3)，3.92(1H，dd，J＝6.5，3.0Hz，H-4)，5.35(1H，m，H-5)，2.10-2.29(4H，m，H-2，H-6)，7.01(1H，d，J＝2.5Hz，H-2”)，7.02(1H，d，J＝2.5Hz，H-2’)，6.73(2H，d，J＝8.0Hz，H-5’，H-5”)，6.91(2H，dd，J＝8.0，2.5Hz，H-6’，H-6”)，7.50(1H，d，J＝16.0Hz，H-7’)，7.57(1H，d，J＝16.0Hz，H-7”)，6.17(1H，d，J＝16.0Hz，H-8’)，6.29(1H，d，J＝16.0Hz，H-8”)，3.64(3H，s，OCH₃).¹³C-NMR(125MHz，CD₃OD)δppm：74.6(C-1)，36.7(C-2)，69.7(C-3)，72.0(C-4)，72.2(C-5)，35.7(C-6)，175.6(C-7)，127.6(C-1’)，127.9(C-1”)，115.2(C-2’)，115.2(C-2”)，146.9(C-3’)，146.9(C-3”)，149.6(C-4’)，149.8(C-4”)，116.5(C-5’)，116.5(C-5”)，123.0(C-6’)，123.1(C-6”)，147.1(C-7’)，147.4(C-7”)114.9(C-8’)，115.5(C-8”)，167.9(C-9’)，168.8(C-9”)，53.0(OCH3)。

化合物5：黄色粉末，薄层层析碘熏显土黄色，三氯化铁显蓝黑色，示有酚羟基存在；ESI-MS m/z：529[M-H]^-，1059[2M-H]^-；UVλ_max(MeOH)：251(sh)，300(sh)，332；¹H-NMR(500MHz，CD₃OD)δppm：5.37(1H，m，H-3)，4.98(1H，dd，J＝7.5，3.0Hz，H-4)，4.35(1H，m，H-5)，2.09-2.19(4H，m，H-2，H-6)，6.88(1H，d，J＝2.5Hz，H-2’)，6.89(1H，d，J＝2.5Hz，H-2”)，6.63(2H，d，J＝8.0Hz，H-5’，H-5”)，6.78(2H，dd，J＝8.0，2.5Hz，H-6’，H-6”)，7.51(1H，d，J＝16.0Hz，H-7”)，7.37(1H，d，J＝16.0Hz，H-7’)，6.17(1H，d，J＝16.0Hz，H-8’)，6.09(1H，d，J＝16.0Hz，H-8”)，3.63(3H，s，OCH₃)。

化合物6：黄色粉末，薄层层析碘熏显土黄色，三氯化铁显蓝黑色，示有酚羟基存在；ESI-MSm/z：529[M-H]^-，1059[2M-H]^-；UVλ_max(MeOH)：250(sh)，300(sh)，332；¹H-NMR(500MHz，CD₃OD)δppm：4.37(1H，m，H-3)，5.10(1H，dd，J＝8.0，3.1Hz，H-4)，5.49(1H，m，H-5)，2.07-2.21(4H，m，H-2，H-6)，6.86(1H，d，J＝2.5Hz，H-2’)，6.89(1H，d，J＝2.5Hz，H-2”)，6.73(2H，d，J＝8.0Hz，H-5’，H-5”)，6.79(2H，dd，J＝8.0，2.5Hz，H-6’and H-6”)，7.61(1H，d，J＝16.0Hz，H-7’)，7.52(1H，d，J＝16.0Hz，H-7”)，6.25(1H，d，J＝16.0Hz，H-8’)，6.16(1H，d，J＝16.0Hz，H-8”)，3.70(3H，s，OCH₃)。

化合物7：淡黄色粉末，薄层层析碘熏显土黄色，三氯化铁显蓝黑色，示有酚羟基存在；ESI-MS m/z：354；¹H-NMR(500MHz，CD₃OD)δppm：7.56(1H，d，J＝16.0Hz，H-β)，7.00(1H，d，J＝2.0Hz，H-2’)，6.92(1H，dd，J＝8.5，2.0Hz，H-6’)，6.73(1H，d，J＝8.5Hz，H-5’)，6.31(1H，d，J＝16.0Hz，H-α)，5.32(1H，m，H-5)，4.29(1H，m，H-4)，3.67(1H，m，H-3).¹³C-NMR(125MHz，CD₃OD)：75.6(C-1)，38.1(C-2)，74.9(C-3)，73.0(C-4)，69.0(C-5)，41.7(C-6)，147.0(C-α)，115.1(C-β)，128.1(C-1；)，116.5(C-2’)，146.9(C-3’)，149.7(C-4’)，115.8(C-5’)，123.0(C-6’)，177.8(C-7)，169.0(C-8)。

化合物1-7的结构分别为3，5-O-二咖啡酰奎宁酸(1)、3，4-O-二咖啡酰奎宁酸(2)、4，5-O-二咖啡酰奎宁酸(3)、3，5-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯(4)、3，4-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯(5)、4，5-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯(6)和5-O-咖啡酰奎宁酸(7)，除化合物1和3外，其它四个咖啡酰奎宁酸衍生物首次从地胆草中分离得到。它们的结构如下图所示：

化合物1：R₁＝R₃＝Caffeoyl group，R₂＝R₄＝H

化合物2：R₁＝R₂＝Caffeoyl group，R₃＝R₄＝H

化合物3：R₂＝R₃＝Caffeoyl group，R₁＝R₄＝H

化合物4：R₁＝R₃＝Caffeoyl group，R₂＝H，R₄＝CH₃

化合物5：R₁＝R₂＝Caffeoyl group，R₃＝H，R₄＝CH₃

化合物6：R₂＝R₃＝Caffeoyl group，R₁＝H，R₄＝CH₃

化合物7：R₃＝Caffeoyl group，R₁＝R₂＝R₄＝H

实施例6：地胆草提取物2中咖啡酰奎宁酸衍生物的提取、分离和结构测鉴定

将实施例2所得的地胆草提取物经过反复硅胶柱层析、氯仿-甲醇溶剂体系洗脱，再经过反复Sephadex LH-20凝胶柱层析分离、甲醇-水溶剂体系洗脱，然后再经过制备HPLC纯化、甲醇-三氟醋酸溶剂洗脱，得到7个咖啡酰奎宁酸类化合物，它们的化学结构采用光谱分析的方法鉴定，结果与实施例5所得化合物1-7一致。

实施例7：地胆草提取物3中咖啡酰奎宁酸衍生物的提取、分离和结构测鉴定

将实施例3所得的地胆草提取物3经过反复硅胶柱层析、氯仿-甲醇溶剂体系洗脱，再经过反复Sephadex LH-20凝胶柱层析分离、甲醇-水溶剂体系洗脱，然后再经过制备HPLC纯化、甲醇-三氟醋酸溶剂洗脱，得到7个咖啡酰奎宁酸类化合物，它们的化学结构采用光谱分析的方法鉴定，结果与实施例5所得化合物1-7一致。

实施例8：地胆草及其中的咖啡酸衍生物的抗呼吸道病毒活性测定

细胞、病毒和实验材料：选用呼吸道合胞病毒(RSV)，宿主细胞为喉癌细胞(Hep-2)；选用副流感3型病毒(PIV 3)、宿主细胞为Hep-2和甲型流感病毒(FluA，H1N1)，宿主细胞为狗肾传代细胞(MDCK)。

阳性对照药为病毒唑；细胞生长在质量百分比浓度为10％的小牛血清(FBS)的MEM培养基中；维持液为1％FBS的MEM培养基。

样品溶液的配制：将实施例1所得地胆草提取物1、实施例2所得地胆草提取物2、实施例3所得地胆草提取物3、咖啡酰奎宁酸衍生物和病毒唑用维持液配分别配成200μg/mL和100μg/mL的样品溶液。

用四唑盐(MTT)比色法测定化合物的细胞毒性：将Hep-2细胞或MDCK细胞培养在96孔培养板中，等单层细胞长好后，加入用维持液稀释好的样品(浓度为200.0～3.1μg/mL)，在37℃，5％CO2培养箱中培养3天。加入10μlMTT溶液(5mg/mL，用缓冲溶液配置)，继续培养4小时。吸出样品溶液，加入二甲亚砜，室温下，将96孔板置于微空孔板振荡器中振荡10分钟。用酶标仪测定各孔的OD值，测量波长为570nm，参比波长为630nm，计算样品对细胞的半数致死毒性浓度(CC₅₀)。每组设4个平衡孔，每组实验重复3次。计算结果，画出曲线，求出半数毒性浓度(CC₅₀)。

通过观察样品对细胞病变效应的抑制程度(cytopathic effect reductionassay)测定抗病毒活性：将Hep-2细胞或MDCK细胞培养在96孔培养板中，等单层细胞长好后，加入用维持液稀释好的100倍半数感染量(100TCID₅₀)的病毒液，再加入用维持液稀释好的系列浓度样品溶液(浓度为100～0.4μg/mL)。在37℃，5％CO2培养箱中培养3～4天。每天于倒置显微镜下观察细胞病变效应(CPE)的程度，并记录：-表示无CPE；+表示0～25％细胞有CPE；2+表示25～50％细胞有CPE；3+表示50～70％细胞有CPE；4+表示75～100％细胞有CPE。最后估计出半数抑制浓度(IC₅₀)。选择性指数(SI)＝CC₅₀/IC₅₀。实验结果见表1-3：

表1地胆草提取物和咖啡酸衍生物的抗呼吸道合胞病毒活性

*呼吸道合胞病毒(RSV)的宿主细胞为Hep-2，CC₅₀为半数毒性浓度，IC₅₀为半数抑制浓度，SI值为选择性指数，由CC₅₀/IC₅₀计算出得到。

表2地胆草提取物和咖啡酸衍生物的抗副流感病毒活性

*副流感3型病毒(PIV 3)的宿主细胞为Hep-2，CC₅₀为半数毒性浓度，IC₅₀为半数抑制浓度，SI值为选择性指数，由CC₅₀/IC₅₀计算出得到。

表3地胆草提取物和咖啡酸衍生物抗流感病毒活性

*甲型流感H1N1病毒(Flu A H1N1)的宿主细胞为MDCK，CC₅₀为半数毒性浓度，IC₅₀为半数抑制浓度，SI值为选择性指数，由CC₅₀/IC₅₀计算出得到，“-”表示在测定浓度范围内没活性。

从表1-3中的数据可见：(1)地胆草提取物对Hep-2和MDCK细胞的半数毒性浓度均大于200μg/mL，其细胞毒性比西药病毒唑低得多。(2)地胆草提取物对本实验所采用的三种呼吸道病毒均有不同程度的体外抑制活性。地胆草提取物对呼吸道合胞病毒(RSV)的抑制活性最好，IC₅₀值与阳性对照药相当，它们的SI值大过病毒唑的SI值；地胆草提取物对副流感3型病毒(PIV3)也有较好的抑制活性，它们的SI值也大于病毒唑的SI值；地胆草提取物对甲型流感病毒(Flu AH1N1)有一定的抑制作用，因毒性较小，它们的SI值与病毒唑的SI值相当。(3)从地胆草提取物中分离出来的7个咖啡酰奎宁酸衍生物对RSV有很好的体外抑制活性、对PIV3的体外抑制活性也较强；3个二咖啡酰奎宁酸甲酯对Flu A H1N1有一定的抑制活性，其中3，5-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯体外抑制Flu A H1N1的活性强于病毒唑。

上述试验结果表明，从广东民间应用广泛的草药地胆草中提取、纯化得到的地胆草提取物，具有较好的抗呼吸道病毒活性，且毒性比西药较低；地胆草提取物中含有活性很强的系列咖啡酰奎宁酸衍生物。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种地胆草提取物的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤：

（1）将地胆草全草或根部干燥和粉碎后，用质量百分比浓度为0～100%的乙醇溶液提取，合并提取液，过滤，减压浓缩至无醇味，得到粗提物浸膏；或将地胆草全草或根部干燥和粉碎后，采用水提醇沉法提取，提取液过滤，浓缩，得到粗提物浸膏；

（2）将粗提物浸膏用蒸馏水溶解成粗提液，先将粗提液流经大孔吸附树脂柱，用蒸馏水洗脱柱子，直至流出液在硅胶薄层板上展开后喷洒质量百分比浓度5%的FeCl₃乙醇溶液显蓝色或蓝黑色斑点；再用质量百分比浓度50～60％的乙醇溶液洗脱柱子，直至流出液在硅胶薄层板上展开后喷洒质量百分比浓度5%的FeCl₃乙醇溶液不显色；收集乙醇溶液洗脱柱子的流出液，回收溶剂，浓缩，干燥，得到地胆草提取物。

2.根据权利要求1所述的一种地胆草提取物的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述用质量百分比浓度为0～100%的乙醇溶液提取的次数为1～3次，每次提取1～3小时。

3.根据权利要求1所述的一种地胆草提取物的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述水提醇沉法是按制药工业常规的方法进行提取。

4.根据权利要求1所述的一种地胆草提取物的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述地胆草是菊科地胆草属植物。

5.一种根据权利要求1所述的方法制备得到的地胆草提取物，其特征在于：该提取物包括以下活性成分：3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯和5-O-咖啡酰奎宁酸。

6.根据权利要求5所述的地胆草提取物，其特征在于：以地胆草提取物的干品重量计算，地胆草提取物中总酚的质量百分含量>50%。

7.根据权利要求5所述的地胆草提取物在制备抗病毒药物或保健品中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述病毒为呼吸道合胞病毒、副流感3型病毒或甲型流感病毒。

9.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述抗病毒药物含有治疗有效量的地胆草提取物和药学上可接受的载体。