CN102203291A - 作为肿瘤标志物和癌症治疗靶标的tbc1d7 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及TBC1D7基因在癌症(特别是肺癌或食道癌)，或致癌作用中发挥的作用，并且特征在于通过施用针对一种或多种TBC1D7基因的双链分子或含有此类双链分子的组合物、载体或细胞来治疗和/或预防癌症(特别是肺癌或食道癌)的方法。本发明的特征还在于使用一种或多种过表达的选自TBC1D7的基因来诊断肺癌或评估/确定肺癌(特别是NSCLC或SCLC)，或食道癌患者的预后的方法。为此，TBC1D7可以起肺癌或食道癌的新型标志物的作用。还公开了利用化合物对一种或多种TBC1D7在肺癌或食道癌中的过表达的影响作为指标来鉴定用于治疗和预防肺癌或食道癌的化合物的方法。

Description

作为肿瘤标志物和癌症治疗靶标的TBC1D7
发明领域
优先权
本申请要求2008年8月28日提交的美国临时申请61/190,522的权益，将其全部内容援引并入本文。
发明领域
本发明涉及肺癌，更具体地涉及肺癌的诊断和治疗。
发明背景
肺癌是世界上最常见的癌症之一，而非小细胞肺癌(NSCLC)占那些病例的80％(Greenlee RT等CA Cancer J Clin 2001；51：15-36(NPL 1))。已经报告了肺致癌作用中牵涉的许多遗传变化，但是精确的分子机制仍然还不清楚(Sozzi G.Eur J Cancer 2001；37增刊7：S63-73(NPL 2))。在过去几十年中，已经出现了新开发的细胞毒剂(包括帕利他塞(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)、吉西他滨(gemcitabine)、和长春瑞滨(vinorelbine))，为晚期NSCLC患者提供多种治疗选择，然而，与基于顺铂的疗法相比，那些方案提供有限的存活益处(Schiller JH.等N Engl J Med 2002；346：92-8(NPL 3))。食道鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是最致命的消化道恶性肿瘤之一，而且5年肺癌总存活率仅为1 5％(Shimada H等，Surgery.2003年5月；133(5)：486-94(NPL 4))。在从里海东岸延伸至中国中部的称作“亚洲食道癌带(Asian esophageal cancer belt)”的区域中报告了最高的食道癌发生率(Mosavi-Jarrahi A和Mohagheghi MA.Asian Pac J Cancer Prev.2006年7月-9月；7(3)：375-80(NPL 5))。尽管已经报告了肺癌和食道癌形成和/或行进中牵涉的许多遗传学变化，但是精确的分子机制仍然还不清楚(Sozzi G.Eur J Cancer.2001年10月；37增刊7：S63-73(NPL 2))。
在这些细胞毒性药物外，已经开发出数种分子靶向性作用剂诸如针对VEGF(即贝伐单抗(bevacizumab)/抗VEGF)或EGFR(即西妥昔单抗(cetuximab)/抗EGFR)的单克隆抗体以及EGFR酪氨酸激酶抑制剂(即吉非替尼(gefitinib)和埃罗替尼(erlotinib))，而且在临床实践中应用(Thatcher N.等Lancet 2005；366：1527-37.(NPL 6)，Shepherd FA.等N Engl J Med2005；353：123-32(NPL 7))。每种新方案仅能向有限的一部分患者提供存活益处。因此，人们急切期待开发新的治疗策略，诸如开发以较小的毒性可适用于绝大多数患者的更有效的分子靶向性作用剂。
使用cDNA微阵列对数千种基因的表达水平的全基因组分析是一种用于鉴定致癌作用途径中牵涉的未知分子(它们是开发新的治疗剂和诊断剂的良好的候选靶标)的有效办法(Daigo Y和Nakamura Y Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008；56：43-53(NPL 8))。本发明人依靠对101例肺癌和19例ESCC(其肿瘤细胞群体在含有27,648种基因的cDNA微阵列上通过激光显微解剖纯化)的全基因组表达谱分析及其与31种正常人组织(27种成人和4种胎儿器官)的表达谱数据的比较，分离出了许多用于诊断和/或治疗肺癌的潜在分子靶物(Kikuchi T.等Oncogene 2003；22：2192-205.(NPL 9)，Kakiuchi S.等Mol Cancer Res 2003；1：485-99.(NPL 10)，Kakiuchi S.等Hum Mol Genet2004；13：3029-43.(NPL 11)，Kikuchi T.等Int J Oncol v2006；28：799-805.(NPL12)，Taniwaki M.等Int J Oncol 2006；29：567-75.(NPL 13)，Yamabuki T.等Int JOncol 2006；28：1375-84(NPL 14))。为了证实各种基因产物的生物学和临床病理学意义，本发明人已经通过组合对临床肺癌材料的肿瘤组织微阵列分析和RNA干扰(RNAi)技术来建立了一种筛选***(Suzuki C.等Cancer Res 2003；63：7038-41.(NPL 15)，Takahashi K.等Cancer Res 2006；66：9408-19.(NPL 16)，Mizukami Y.等Cancer Sci 2008；99：1448-54.(NPL 17)，Suzuki C.等CancerRes 2003；63：7038-41.(NPL 18)，Ishikawa N.等Clin Cancer Res2004；10：8363-70.(NPL 19)，Kato T.等Cancer Res 2005；65：5638-46.(NPL 20)，Furukawa C.等Cancer Res 2005；65：7102-10.(NPL 21)，Ishikawa N.等Cancer Res 2005；65：9176-84.(NPL 22)，Suzuki C.等Cancer Res 2005；65：11314-25.(NPL 23)，Ishikawa N.等Cancer Sci 2006；97：737-45.(NPL 24)，Takahashi K.等Cancer Res 2006；66：9408-19.(NPL 25)，Hayama S.等Cancer Res2006；66：10339-48.(NPL 26)，Kato T.等Clin Cancer Res 2007；13：434-42.(NPL27)，Suzuki C.等Mol Cancer Ther 2007；6：542-51.(NPL 28)，Yamabuki T.等Cancer Res 2007；67：2517-25.(NPL 29)，Hayama S.等Cancer Res2007；67：4113-22.(NPL 30)，Kato T.等Cancer Res 2007；67：8544-53.(NPL 31)，Taniwaki M.等Clin Cancer Res 2007；13：6624-31.(NPL 32)，Ishikawa N.等Cancer Res 2007；67：11601-11.(NPL 33)，Mano Y等Cancer Sci2007；98：1902-13.(NPL 34)，Suda T.等Cancer Sci 2007；98：1803-8.(NPL 35)，Kato T.等Clin Cancer Res Res 2008；14：2363-70.(NPL 36)，Mizukami Y等Cancer Sci 2008；99：1448-54(NPL 37))。在这些***研究的过程中，发现TBC1域家族，成员7(TBC1D7)在绝大多数肺癌和ESCC中是过表达的。
人TBC1D7由293个氨基酸组成，其中推定的TBC域由约200个氨基酸残基组成。TBC域在真核生物间是保守的，而且预测人基因组编码至少50种具有此域的蛋白质(Richardson PM和Zon LI.Oncogene 1995；11：1139-48.(NPL38)，Bernards A.Biochim Biophys Acta.2003；1603：47-82(NPL 39))。认为TBC域具有对Ypt/Rab样小G蛋白的推定的GTP酶激活作用(GAP)(Bernards A.Biochim Biophys Acta.2003；1603：47-82(NPL 39)，Neuwald AF.Trends Biochem Sci.1997；22：243-4(NPL 40))。GAP提高G蛋白的固有地缓慢的GTP酶活性，引起它们失活，藉此调控由各种G蛋白控制的细胞途径。Ypt/Rab家族的GTP酶包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的11种基因和至少60种人基因，是Ras超家族的最大分支(Bernards A.Biochim Biophys Acta.2003；1603：47-82(NPL 39))。这些蛋白质在牵涉囊泡转运的细胞过程中起至关重要的作用，在囊泡-靶膜识别、停靠(docking)、和膜融合中是特别重要的(ChavrierP和Goud B.Curr Opin Cell Biol.1999；11：466-75(NPL 41))。在高等真核生物中，TBC域存在于蛋白质(例如RN-TRE、TRE2、PRC17)中，所述蛋白质与细胞周期和肿瘤发生有关(Neuwald AF.Trends Biochem Sci.1997；22：243-4(NPL 40)，L.Pei.等Cancer Res.2002；62：5420-24(NPL 42))。TBC1D7在初级纤毛形成中作为天然关联GTP酶激活蛋白(GAP)对Rab17起作用(Yoshimura S.等J Cell Biol.2007；178：363-9(NPL 43))。先前已经报告了Rab17在细胞极化过程中被诱导，而且在极化上皮细胞中与顶端分选内体的功能有关(Lutcke A.等J Cell Biol.1993；121：553-64.(NPL 44)，Zacchi P.等J Cell Biol.1998；140：1039-53(NPL 45))。
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发明概述
在筛选用于诊断、治疗和预防人癌症的新型分子靶物的过程中，在与激光显微解剖偶联的含有27,648种基因的cDNA微阵列上对101例肺癌实施了的全基因组表达谱分析(Kikuchi T，等Oncogene.2003年4月10日；22(14)：2192-205.；Kikuchi T，等Int J Oncol.2006年4月；28(4)：799-805；Kakiuchi S，等，Mol Cancer Res.2003年5月；1(7)：485-99；Kakiuchi S，等，Hum Mol Genet.2004年10月15日；13(24)：3029-43.Epub 2004年10月20日；Taniwaki M，等，Int J Oncol.2006年9月；29(3)：567-75.)。结果表明编码TBC1域家族，成员7(TBC1D7)的基因在绝大多数原发性肺癌中常常是过表达的。
本发明涉及癌症相关基因TBC1D7，其在肿瘤中常常上调，以及用于开发使用TBC1D7进行癌症治疗的分子靶向性药物的策略。
在一个方面，本发明提供了一种利用TBC1D7的表达水平或生物学活性作为指标来诊断癌症，例如由TBC1D7介导的癌症，例如肺癌和/或食道癌，的方法。本发明还提供了一种用于预测癌症行进(例如患者中的肺癌和/或食道癌疗法)的方法，其使用TBC1D7的表达水平或生物学活性作为指标来进行。此外，本发明提供了一种使用TBC1D7的表达水平或生物学活性作为指标来预测癌症(例如肺癌和/或食道癌)患者的预后的方法。在一些实施方案中，癌症是由TBC1D7介导或促进的。在一些实施方案中，癌症是肺癌和/或食道癌。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种使用TBC1D7的表达水平或生物学活性作为指标来筛选用于治疗或预防癌症(例如由TBC1D7介导的癌症，例如肺癌和/或食道癌)的作用剂的方法。具体地，本发明提供了一种使用TBC1D7多肽与14-3-3 zeta多肽之间、TBC1D7多肽与RAB17多肽之间、或TBC1D7多肽与TSC1多肽之间的相互作用作为指标来筛选用于治疗或预防表达TBC1D7的癌症(例如肺癌和/或食道癌)的作用剂的方法。
在又一个实施方案中，本发明提供了通过本发明的方法筛选的针对TBC1D7的双链分子，例如siRNA。本发明的双链分子可用于治疗或预防癌症，例如由TBC1D7介导的或源自TBC1D7过表达的癌症，例如肺癌和/或食道癌。如此，本发明进一步涉及一种用于治疗癌症的方法，包括使癌性细胞与通过本发明的方法筛选的作用剂(例如siRNA)接触。
附图简述
在考虑以下附图简述和本发明详述及其优选实施方案后，本发明的各个方面和应用对于熟练技术人员会变得显而易见：
图1描绘了肺癌和食道癌中的TBC1D7表达。A，通过半定量RT-PCR检查的临床肺癌和食道癌组织中的TBC1D7表达。B，肺癌和食道癌细胞系中的TBC1D7表达。C，通过Western印迹检查的肺癌细胞系中的TBC1D7蛋白表达。D，肺癌LC319细胞中的内源TBC1D7蛋白表达和亚细胞定位。E，对16种正常成人人组织中的TBC1D7转录物的Northern印迹分析。在睾丸中观察到强信号。F，在5种正常组织(心脏、肺、肝、肾、和睾丸)及那些在肺癌中的TBC1D7蛋白表达的免疫组织化学分析。TBC1D7在睾丸(主要在初级***细胞的细胞核和/或胞质中)和肺癌中丰富表达，但是其表达在剩余的四种正常组织中几乎检测不到。
图2描绘了TBC1D7在正常组织中的表达和TBC1D7过表达与NSCLC患者的不良预后的联系。TBC1D7表达与不良预后的联系。顶部小图，癌组织中的TBC1D7表达的正染色和负染色的例子(初始放大率X100)。底部小图，对NSCLC患者存活的Kaplan-Meier分析(通过时序检验得到的P＝0.0124)。
图3描绘了TBC1D7的生长促进效果。A，通过针对TBC1D7的siRNA抑制肺癌细胞系LC319(左)和A549(右)的生长。顶部小图，通过两种si-TBC1D7(si-TBC1D7-#1和si-TBC1D7-#2)和两种对照siRNA (si-EGFP和si-LUC)对LC319和A549细胞中的TBC1D7蛋白表达的基因敲低效应，其通过RT-PCR来分析。中间和底部小图，用si-TBC1D7或对照siRNA转染的LC319和A549细胞的集落形成和MTT测定法。柱形，一式三份测定法的相对吸光度；工形线，SD。B，对用si-TBC1D7处理的NSCLC细胞的流式细胞计量分析。用si-TBC1D7-#1或si-EGFP转染LC319细胞，并在转染后48小时、72小时、和96小时时收集，用于流式细胞计量术。C，被TBC1D7过表达增强的哺乳动物细胞生长。显示稳定表达TBC1D7的COS-7细胞的生长性质的测定法。稳定表达TBC1D7的COS-7细胞的MTT测定法，比较它们与用模拟载体转染的对照细胞的生长。D，被TBC1D7过表达增强的哺乳动物细胞侵袭。显示稳定表达TBC1D7的COS-7细胞的侵袭性质的测定法。与对照细胞的数目相比，稳定表达TBC1D7的侵袭的COS-7细胞(invaded COS-7 cells)的数目提高。E，由TBC1D7过表达引起的COS-7细胞的体内肿瘤形成。所有4只个别地移植可COS-7-TBC1D7#A细胞的小鼠都具有通过免疫组织化学分析确认了TBC1D7蛋白的过表达的肿瘤。比较而言，在移植了COS-7-Mock-#A细胞的4只独立的小鼠中在60天观察期间没有形成可见的肿瘤。F，在细胞移植后60天时移植的肿瘤中TBC1D7表达的免疫组织化学评估(初始放大率X 40和X 200)。
图4描绘了TBC1D7与结合蛋白的相互作用。A，COS-7细胞中内源TBC1D7与内源14-3-3 zeta蛋白的相互作用。使用抗Flag M2琼脂糖和来自瞬时表达Flag-TBC1D7的COS-7细胞的提取物来实施免疫沉淀。对免疫沉淀物进行Western印迹分析以检测内源14-3-3。B，COS-7细胞中外源TBC1D7与外源RAB17蛋白的相互作用。使用抗Flag M2琼脂糖和来自瞬时表达Flag-TBC1D7和/或Myc-RAB17的COS-7细胞的提取物来实施免疫沉淀。对免疫沉淀物进行Western印迹分析以检测内源RAB17。IB，免疫印迹；IP，免疫沉淀。C，TSC1和TBC1D7在肺癌细胞中的表达。顶部小图，通过半定量RT-PCR检查的TSC1和TBC1D7在肺癌细胞系中的表达。底部小图，通过Western印迹检查的TSC1和TBC1D7在肺癌细胞系中的表达。D、E和F，一种可稳定TBC1D7蛋白的TBC1D7相互作用性蛋白-TSC1的鉴定，和被TBC1D7和TSC1的同时表达所增强的哺乳动物细胞生长活性。D，肺癌细胞中内源TBC1D7与内源TSC1蛋白的相互作用。使用抗TSC1抗体和来自表达TBC1D7和TSC1两者的LC319细胞的提取物来实施免疫沉淀。对免疫沉淀物进行Western印迹分析以检测内源TBC1D7。IB，免疫印迹；IP，免疫沉淀。E，TSC1表达对TBC1D7基因和蛋白水平的影响。左侧小图，在用si-TSC1转染的LC319细胞中通过半定量RT-PCR分析和Western印迹分析检测的TSC1和TBC1D7转录物和蛋白质的水平。右侧小图，在用TSC1表达载体转染的LC319细胞中通过半定量RT-PCR分析和Western印迹分析检测的TSC1和TBC1D7转录物和蛋白质的水平。F，最初用si-TSC1转染，随后在siRNA转染后24小时用TSC1表达载体转染的LC319中通过Western印迹分析检测的内源TSC1和TBC1D7蛋白水平。外源TSC1的额外过表达补偿了由针对TSC1的siRNA的转染所导致的TBC1D7蛋白水平降低。
图5描绘了TBC1D7中TSC1相互作用区的鉴定和TBC1D7的显性负相(dominant negative)肽对肺癌细胞生长的抑制。A：左侧小图，缺乏任一或两个末端区的六种N端加Flag标签的TBC1D7部分蛋白构建体的示意图。右侧小图，通过使用LC319细胞进行的免疫沉淀实验鉴定TBC1D7中结合TSC1的区域。指明TBC1D7112-171构建体(其对应于TBC域中的中心区)为TSC1相互作用区。B：左侧顶部小图，三种TBC1D7的细胞可通透肽的示意图，它们均涵盖TBC1D7112-171(相当于TBC1D7中的TSC1相互作用区)。B：右侧顶部小图，用11R-TBC152-171肽处理的LC319细胞中通过免疫沉淀测定法检测的内源TSC1与内源TBC1D7蛋白之间的复合物形成的减少。C：MTT测定，显示导入表达TBC1D7和TSC1蛋白两者的LC319细胞中的11R-TBC152-171肽的生长抑制效果。工形线，一式三份测定的SD。D：左侧小图：通过Western印迹分析检查的TBC1D7和TSC1蛋白在肺癌细胞系LC319和正常人肺成纤维细胞衍生的CCD19Lu细胞中的表达。右侧小图：MTT测定，显示11R-TBC152-171肽对几乎不表达TBC1D7蛋白的CCD19Lu细胞没有脱靶效应。
图6描绘了TSC1表达对肺癌LC319细胞中的mTORC1途径的影响。TSC1过表达(左侧小图)和TSC1敲低(右侧小图)对TBC1D7蛋白水平及核糖体蛋白S6(rpS6)(其是mTORC1的下游分子)磷酸化水平的影响。
发明详述
如本文中所使用的，单词“一个”、“一种”和“该/所述”，如无另外特别说明是指“至少一个”。
术语“分离的”和“纯化的”与物质(例如多肽、抗体、多核苷酸等)相关联使用时，指该物质基本上不含至少一种在天然来源中可包括的物质。例如，分离的或纯化的抗体指基本上不含细胞材料(例如来自所述蛋白质(抗体)的细胞或组织来源的碳水化合物、脂质或其它污染性蛋白质)或者在化学合成时基本上不含化学前体或其它化学品的抗体。术语“基本上不含细胞材料”包括多肽的制备物，其中所述多肽与细胞(该多肽是从该细胞分离或自该细胞重组制备的)的细胞组分是分离的。
例如，基本上不含细胞材料的多肽包括多肽制备物，其具有小于约30％、20％、10％或5％(以干重计)的异源蛋白质(在本文中也称为“污染蛋白质”)。在多肽以重组方式生成时，在一些实施方案中，它也基本上不含培养基，包括多肽的其中培养基小于蛋白质制备物体积的约20％、10％或5％的制备物。在多肽通过化学合成生成时，在一些实施方案中，它基本上不含化学前体或其它化学品，包括多肽的其中与蛋白质合成相关的化学前体或其它化学品小于蛋白质制备物体积的约30％、20％、10％、5％(以干重计)的制备物。特定蛋白质制备物含有经分离或纯化的多肽，可以例如通过在蛋白质制备物的十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳和对凝胶进行考马斯亮蓝染色等处理后出现单一条带来示明。在一个实施方案中，包括本发明抗体的蛋白质是分离的或纯化的。
“分离的”或“纯化的”核酸分子，例如cDNA分子，在通过重组技术生成时可以基本上不含其它细胞材料或培养基，或者在化学合成时可以基本上不含化学前体或其它化学品。在一个实施方案中，编码本发明蛋白质的核酸分子是分离的或纯化的。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语不但适用于天然存在的氨基酸聚合物，还适用于其中一个或多个氨基酸残基是经修饰的残基或非天然存在的残基(例如，相应的天然存在氨基酸的人工化学模拟物)的氨基酸聚合物。
术语“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及与天然存在的氨基酸相似地发挥功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是那些由遗传密码编码的氨基酸以及那些在细胞中翻译后经修饰的氨基酸(例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸)。短语“氨基酸类似物”指这样的化合物，其与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构(与氢结合的α碳、羧基、氨基和R基)，但具有经修饰的R基或经修饰的主链(例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸、亚砜、甲硫氨酸甲基硫)。短语“氨基酸模拟物”指与通用氨基酸具有不同结构但相似功能的化学化合物。
氨基酸在本文中可以通过其公知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会(Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号提及。除非另有明确指明，术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”可互换使用，并且与它们普遍接受的单字母密码所提及的氨基酸类似。与氨基酸类似，它们涵盖天然存在的和非天然存在的核酸聚合物两者。多核苷酸、寡核苷酸、核苷酸、核酸、或核酸分子可以由DNA、RNA或其组合构成。
如本文中所使用的，术语“生物学样品”指整个生物体或其组织、细胞或构成部分(例如，体液，包括但不限于血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊髓液、唾液、羊水、脐带血、尿、***液和***)的亚组。“生物学样品”还指从整个生物体或其细胞、组织或构成部分的亚组制备的匀浆、裂解物、提取物、细胞培养物或组织培养物，或其级分或部分。最后，“生物学样品”指这样的培养基，例如培养过生物体的营养肉汤或凝胶，其含有细胞组分，例如蛋白质或多核苷酸。
人TBC1D7基因的核苷酸序列在SEQ ID NO：1中显示，还可以GenBank登录号NM_016495获得。在本文中，短语“TBC1D7基因”涵盖人TBC1D7基因以及包括非人灵长类、小鼠、大鼠、犬、猫、马和牛但不限于此的其它动物的TBC1D7基因，并且包括等位突变体和与TBC1D7基因对应的在其它动物中找到的基因。由人TBC1D7基因编码的氨基酸序列以SEQ ID NO：2显示，还可以GenBank登录号057579.1获得。在本发明中，由TBC1D7基因编码的多肽称为“TBC1D7”，有时也称为“TBC1D7多肽”或“TBC1D7蛋白”。
根据本发明的一个方面，TBC1D7中还包括功能等同物。在本文中，蛋白质的“功能等同物”是与该蛋白质具有等同生物学活性的多肽。即，任何保留TBC1D7的至少一种生物学活性的多肽都可以在本发明中作为此类功能等同物使用。例如，TBC1D7的功能等同物保留细胞增殖的促进活性和/或侵袭活性。另外，TBC1D7的生物学活性含有对RAB17(GenBank登录号NM_022449.2：SEQ ID NO：12)、14-3-3zeta(GenBank登录号NM_003406，SEQ ID NO：14)或TSC1(GenBank登录号NM_001143964.1：SEQ ID NO：45)的结合活性。TBC1D7的功能等同物可以含有RAB17结合区、14-3-3zeta结合区和/或TSC1结合区(例如TBC152-171：SEQ ID NO：28)。
TBC1D7的功能等同物包括那些在TBC1D7蛋白的天然存在氨基酸序列中替换、缺失、添加或***一个或多个氨基酸(例如1-5个氨基酸，例如上至5％的氨基酸)的分子。或者，功能等同物可以是由与各自的蛋白质序列具有至少约80％同源性(又称为序列同一性)，更优选地与SEQ ID NO：2至少约90％至95％同源性，常为约96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列构成多肽。
通常，已知的是，蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能(Mark DF等，Proc Natl Acad Sci U S A.1984年9月；81(18)：5662-6；ZollerMJ和Smith M.Nucleic Acids Res.1982年10月25日；10(20)：6487-500；Wang A等，Science.1984年6月29日；224(4656)：1431-3；Dalbadie-McFarland G等，ProcNatl Acad Sci U S A.1982年11月；79(21)：6409-13)。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸的对氨基酸序列的个别添加、缺失、***或替换是“保守修饰”，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。
氨基酸侧链特性的例子是疏水性氨基酸(丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸)、亲水性氨基酸(精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸)、和具有下列功能基团或共同特征的侧链：脂肪族侧链(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸)；含有羟基基团的侧链(丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)；含有硫原子的侧链(C，M)；含有羧酸或酰胺的侧链(天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺)；含有碱基的侧链(精氨酸、赖氨酸、组氨酸)；和含有芳香族的侧链(组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)。此外，提供功能相似氨基酸的保守替换表是本领域公知的。例如，下列8组各含有对于彼此而言是保守替换的氨基酸。
(1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
(2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
(3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
(4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
(5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；
(6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
(7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和
(8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)
(参见例如Thomas E.Creighton，Proteins Publisher：New York：W.H.Freeman，c1984)。
TBC1D7蛋白中包括这些经保守修饰的多肽。然而，本发明不局限于此，而且TBC1D7蛋白包括非保守修饰，只要它们保留TBC1D7蛋白的任何一种生物学活性。要在此类经修饰的蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个氨基酸或更少，例如，6个氨基酸或更少，例如，3个氨基酸或更少。
通过添加一个或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是TBC1D7蛋白的融合蛋白。融合蛋白包括TBC1D7蛋白和其它肽或蛋白质的融合物，其也可以在本发明中使用。可以通过本领域技术人员公知的技术来生成融合蛋白，例如，通过将编码TBC1D7基因的DNA与编码其它肽或蛋白质的DNA连接，使得框架匹配，将融合DNA***表达载体中并在宿主中对其进行表达来进行。对于与TBC1D7蛋白融合的肽或蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留TBC1D7蛋白的任何一种目标生物学活性。
已知可以用作要与TBC1D7蛋白融合的肽包括例如FLAG(Hopp TP等，Biotechnology 6：1204-10(1988))、含有6×His的6His(组氨酸)残基、10×His、流感凝集素(HA)、人c-myc片段、VSP-GP片段、p18HIV片段、T7标签、HSV标签、E标签、SV40T抗原片段、lck标签、alpha微管蛋白片段、B标签、蛋白C片段等等。可以与本发明的蛋白质融合的蛋白质的例子包括GST(谷胱甘肽S-转移酶)、流感凝集素(HA)、免疫球蛋白恒定区、β-半乳糖苷酶、MBP(麦芽糖结合蛋白)等等。
此外，经修饰的蛋白质不排除多态性变体、种间同系物、和那些由这些蛋白质的等位基因编码的。
本领域已知的分离功能等同蛋白质的方法包括例如杂交技术(Sambrook和Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Lab.Press，2001)。本领域技术人员可以容易地分离与整个或部分编码人TBC1D7蛋白的人TBC1D7 DNA序列(例如SEQ ID NO：1)具有高度同源性(即序列同一性)的DNA，并从所分离的DNA分离人TBC1D7蛋白的功能等同蛋白质。如此，用于本发明的蛋白质包括那些由在严格条件下与整个或部分编码人TBC1D7蛋白的DNA序列杂交的DNA编码的且与人TBC1D7蛋白功能等同的蛋白质。这些蛋白质包括与自人或小鼠衍生的蛋白质对应的哺乳动物同系物(例如，由猴、大鼠、兔或牛基因所编码的蛋白质)。在分离与编码人TBC1D7的DNA高度同源的cDNA中，可以使用来自肺或食道癌组织或细胞系、或来自睾丸的组织的基因。
用于分离编码与人TBC1D7基因功能等同的蛋白质的DNA的杂交条件可以由本领域技术人员常规选择。短语“严格(杂交)条件”指这样的条件，在该条件下，核酸分子会与其靶序列杂交(通常在复杂的核酸混合物中)，而检测不到与其它序列杂交。严格条件是序列依赖性的，并且在不同情况下会有所不同。较长的序列在较高的温度下特异性杂交。在Tijssen的Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes，“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays”(1993)中有对核酸杂交的广泛指导。通常，严格条件选择为比在确定离子强度pH对特定序列的热解链温度(Tm)低约5-10摄氏度。Tm是这样的温度(在确定的离子强度、pH和核酸浓度下)，在该温度，与靶标互补的探针中有50％在平衡状态下与靶序列杂交(由于靶序列过量存在，在Tm，平衡状态时50％的探针被占据)。还可以通过添加去稳定剂例如甲酰胺来得到严格条件。对于选择性或特异性杂交，阳性信号是本底的至少两倍，例如背景杂交的10倍。
例如，可以如下进行杂交，使用“Rapid-hyb缓冲液”(Amersham LIFE SCIENCE)在68℃进行预杂交30分钟或更长，添加经标记的探针，并于68℃加热1小时或更长。接着的清洗步骤可以在例如低严格条件下进行。低严格条件是例如42℃、2x SSC、0.1％SDS，例如50℃、2x SSC、0.1％SDS。在一些实施方案中，采用高严格条件。高严格条件是例如于室温在2x SSC、0.01％SDS中清洗3次达20分钟，然后在37℃在1x SSC、0.1％SDS中清洗3次达20分钟，并于50℃在1x SSC、0.1％SDS中清洗两次达20分钟。然而，一些因素例如温度和盐浓度可以影响杂交的严格性，并且本领域技术人员可以适当地选择这些因素来达到所必需的严格性。
可以利用基因扩增方法例如聚合酶链式反应(PCR)方法代替杂交来分离编码与人TBC1D7基因功能等同的蛋白质的DNA，其使用根据编码人TBC1D7蛋白(SEQ ID NO：2)的DNA(SEQ ID NO：1)的序列信息所合成的引物来实现，在[实施例1]中的(b)半定量RT-PCR中列举了引物序列的例子。
由上述杂交技术或基因扩增技术所分离的DNA编码与人TBC1D7蛋白功能等同的蛋白质通常与人TBC1D7蛋白的氨基酸序列具有高度同源性(也称为序列同一性)。“高度同源性”(也称为“高度序列同一性”)通常是指两条最佳比对序列(多肽或多核苷酸序列)之间的同一性程度。通常，高度同源性或序列同一性是指40％或更高的同源性，例如，60％或更高，例如80％或更高，例如，85％、90％、95％、98％、99％或更高。可以根据算法(WilburWJ和Lipman DJ.Proc Natl Acad Sci U S A.1983 Feb；80(3)：726-30)确定两条多肽或多核苷酸序列之间的同源性或同一性程度。
适合确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的其它例子是BLAST和BLAST 2.0算法，它们有记载(Altschul SF等，J Mol Biol.1990Oct 5；215(3)：403-10；Nucleic Acids Res.1997Sep 1；25(17)：3389-402)。用于进行BLAST分析的软件可以从国家生物技术信息中心(在互联网上于ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。该算法包括首先通过鉴别查询序列中长度W的短字串来确定高分值序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字串比对时，其与某些正值的阈值得分T相匹配或满足某些正值的阈值得分T。T称为邻近字串得分阈值(Altschul等，见上文)。这些起始邻近字串命中充当启动搜索的种子来寻找含有它们的更长HSP。
然后，字串命中沿着每条序列的两个方向延伸，只要可以增加累积比对得分。对于核苷酸序列，采用参数M(对一对匹配残基的奖励得分；总是大于0)和N(对错配残基的处罚得分；总是小于0)来计算累积得分。对于氨基酸序列，采用得分矩阵来计算积累分值。当累积比对分值从其所达到的最大值下降达数值X时；当由于一个或多个负得分残基比对的积累，累积分值达到零或零以下时；或当到达任一序列的末端时，字串命中在每个方向的延伸都会停止。
BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)采用字长(W)28、期望值(E)10、M＝1、N＝-2以及两条链比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序采用字长(W)3、期望值(E)10以及BLOSUM62得分矩阵作为默认值(Henikoff S和Henikoff JG.Proc Natl Acad Sci U S A.1992 Nov 15；89(22)：10915-9)。
可用于本发明上下文的蛋白质可以在氨基酸序列、分子量、等电点、有无糖链或形式方面有变化，这取决于用来生成其的细胞或宿主或者所使用的纯化方法。然而，只要其具有TBC1D7蛋白(SEQ ID NO：2)的任何一种生物学活性，它就可用于本发明。
本发明还涵盖TBC1D7蛋白的部分肽的用途。部分肽具有TBC1D7蛋白的蛋白质特有的氨基酸序列，并且由小于约400个氨基酸组成，通常是小于约200个氨基酸并且经常是小于约100个氨基酸，且至少约7个氨基酸，例如约8个氨基酸或更多，例如约9个氨基酸或更多。
用于本发明筛选方法的部分肽合适地含有至少一种TBC1D7结合域。此外，用于本发明筛选的TBC1D7部分肽合适地含有14-3-3zeta结合区、RAB17结合区。短语TBC1D7蛋白的“功能等同物”也包括这些部分肽。
用于本方法的多肽或片段可以作为天然存在的蛋白通过常规纯化方法从自然界获得，或基于所选择的氨基酸序列通过化学合成获得。例如，可以用于合成的常规肽合成方法，包括：
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(2)The Proteins，第2卷，Academic Press，New York，1976；
(3)Peptide Synthesis(in Japanese)，Maruzen Co.，1975；
(4)Basics and Experiment of Peptide Synthesis(in Japanese)，Maruzen Co.，1985；
(5)Development of Pharmaceuticals(第二卷)(in Japanese)，第14卷(peptide synthesis)，Hirokawa，1991；
(6)WO99/67288；及
(7)Barany G.和Merrifield R.B.，Peptides第2卷，“Solid Phase Peptide Synthesis”，Academic Press，New York，1980，100-118.
或者，可以采用生成多肽的任何已知基因工程方法来获得蛋白质(例如，Morrison DA.等，J Bacteriol.1977年10月；132(1)：349-51；Clark-Curtiss JE和Curtiss R 3rd.Methods Enzymol.1983；101：347-62)。例如，制备适合的载体，其包含可表达形式的(例如在调节序列包括启动子的下游)编码目的蛋白质的多核苷酸，转化入合适的宿主细胞中，然后培养宿主细胞以生成蛋白质。更具体地，通过将基因***表达外来基因的载体，例如，pSV2neo、pcDNAI、pcDNA3.1、pCAGGS或pCD8中在宿主(例如动物)细胞等中表达编码TBC1D7多肽的基因。
启动子可以用于表达。可以采用任何常用的启动子，包括例如SV40早期启动子(Rigby in Williamson(编)，Genetic engineering，第3卷Academic Press，London，1982，83-141)、EF-alpha启动子(Kim DW等Gene.1990年7月16日；91(2)：217-23)、CAG启动子(Niwa H等，Gene.1991年12月15日；108(2)：193-9)、RSV LTR启动子(Cullen BR.Methods Enzymol.1987；152：684-704)、SR alpha启动子(Takebe Y等，Mol Cell Biol.1988年1月；8(1)：466-72)、CMV立即早期启动子(Seed B和Aruffo A.Proc Natl Acad SciUSA.1987年5月；84(10)：3365-9))、SV40晚期启动子(Gheysen D和Fiers W.JMol Appl Genet.1982；1(5)：385-94)、腺病毒晚期启动子(Kaufman RJ等，Mol Cell Biol.1989年3月；9(3)：946-58)、HSV TK启动子等等。
可以根据任何方法将载体导入宿主细胞中以表达TBClD7基因，例如，电穿孔法(Chu G等，Nucleic Acids Res.1987年2月11日；15(3)：1311-26)、磷酸钙法(Chen C和Okayama H.Mol Cell Biol.1987年8月；7(8)：2745-52)、DEAE右旋糖苷法(Lopata MA等，Nucleic Acids Res.1984年7月25日；12(14)：5707-17；Sussman DJ和Milman G.Mol Cell Biol.1984年8月；4(8)：1641-3)、Lipofectin法(Derijard B等，Cell.1994年3月25日；76(6)：1025-37；Lamb BT等，Nat Genet.1993年9月；5(1)：22-30；Rabindran SK等，Science.1993年1月8日；259(5092)：230-4)等等。
也可以采用体外翻译***在体外生成TBC1D7蛋白。在本发明的上下文中，短语“TBC1D7基因”涵盖编码人TBC1D7基因或人TBC1D7基因的任何功能等同物的多核苷酸。
TBC1D7基因可以作为天然存在的蛋白质通过常规克隆方法从自然界获得，或基于所选择的核苷酸序列通过化学合成获得。采用cDNA文库等克隆基因的方法在本领域中是公知的。
(2)抗体
如本文中所使用的，术语“抗体”意欲包括与指定的蛋白质或其肽特异性反应的免疫球蛋白及其片段。抗体可以包括人抗体、灵长源化(primatized)抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、人源化抗体、融合其它蛋白质或放射性标记物的抗体以及抗体片段。此外，本文中的抗体以最广义使用，明确涵盖完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)以及抗体片段，只要它们表现出所需的生物学活性。“抗体”表示所有类型(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。
本发明使用针对TBC1D7蛋白的抗体。这些抗体对于诊断肺癌或食道癌可以是有用的。此外，本发明使用针对TBC1D7多肽或其部分肽的抗体，特别是针对TBC1D7多肽的RAB17结合区、TBC1D7多肽的14-3-3 zeta结合区、或TBC1D7多肽的TSC1结合区(例如SEQ ID NO：28)的抗体。
这些抗体可以用于抑制和/或阻断TBC1D7多肽与RAB17多肽之间的相互作用，例如结合，或TBC1D7多肽与14-3-3 zeta之间的相互作用，例如结合，TBC1D7多肽与TSC1.多肽之间的相互作用，例如结合，并且可以用于治疗和/或预防(过)表达TBC1D7的癌症，例如肺癌或食道癌。或者，本发明还采用针对RAB17多肽、14-3-3zeta多肽、TSC1或它们的部分肽，例如它们的TBC1D7结合区诸如SEQ ID NO：28的抗体。这些抗体会通过已知方法来提供。描述了依照本发明使用的生成抗体的例示性技术。
(i)多克隆抗体
可以通过相关抗原和佐剂的多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射在动物中制备多克隆抗体。将相关抗原与在要免疫的物种中具有免疫原性的蛋白质偶联在一起是有用的，所述蛋白质例如匙孔
Figure BDA0000058047620000171
血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、或大豆胰蛋白酶抑制剂，所述偶联使用双功能或衍生化作用剂，例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(maleimidobenzoyl sulfosuccinimide ester)(通过半胱氨酸残基偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOC12或R’N＝C＝NR，其中R和R’是不同烃基基团。
以下述方式针对抗原、免疫原性偶联物或衍生物免疫动物：将例如100微克或5微克蛋白质或偶联物(分别用于兔或小鼠)与3个体积的弗氏完全佐剂混合，并在多个部位皮内注射该溶液。一个月之后，用1/5至1/10初始量的肽或偶联物(包含在弗氏完全佐剂中)通过在多个部位皮下注射来对动物进行加强免疫。7到14天后，对动物取血，测定血清抗体效价。加强免疫动物直到效价达到平台。在一些实施方案中，用相同抗原但偶联到不同蛋白质和/或通过不同交联剂偶联而成的偶联物加强免疫动物。
偶联物也可以作为蛋白质融合物在重组细胞培养中生成。此外，聚集剂例如明矾适合用来增强免疫应答。
(ii)单克隆抗体
单克隆抗体从基本均质的抗体的群获得，即构成该抗体群的各个抗体是相同的，除了存在少量可能的天然存在突变以外。因此，修饰语“单克隆”指明抗体这样的特征，即它不是离散抗体(discrete antibodies)的混合物。
单克隆抗体可以例如，采用由KohlerG和Milstein C.Nature.1975年8月7日；256(5517)：495-7首次描述的杂交瘤方法来生成，或者可以通过重组DNA方法(美国专利号4,816,567)来生成。
在杂交瘤方法中，根据上文所述对小鼠或其它合适的宿主动物，例如仓鼠进行免疫，来诱导出产生或能够产生会特异性结合用于免疫的蛋白质的抗体的淋巴细胞。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后采用适当的融合剂如聚乙二醇使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，第59页-第103页(Academic Press，1986))。
将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种并培养，所述培养基可以含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)这种酶，那么供杂交瘤用的培养基通常会包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷型细胞生长。
在一些实施方案中，骨髓瘤细胞是那些有效融合，支持选定的抗体生成细胞稳定高水平生成抗体，并且对某种培养基例如HAT培养基敏感的骨髓瘤细胞。例示性骨髓瘤细胞系包括鼠骨髓瘤系，例如从MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤和从SP-2或X63-Ag8-653细胞衍生的细胞系，上述MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤可以从Salk研究所细胞配送中心(Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego)，California USA获得，SP-2或X63-Ag8-653细胞可以从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，Manassas，Virginia，USA获得。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也有报道用于产生人单克隆抗体(Kozbor D等，J.Immunol.，1984年10月；133(6)：3001-5；Brodeur等，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51页-第63页(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。
对培养着杂交瘤细胞的培养基测定针对抗原的单克隆抗体的生成。在一些实施方案中，由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合测定法来确定，例如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)。
例如，可以通过Munson PJ和Rodbard D.Anal Biochem.1980年9月1日；107(1)：220-39的30 Scatchard分析来测定单克隆抗体的结合亲和力。在鉴定出生成具有期望特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可以通过有限稀释规程对克隆进行亚克隆，并通过标准方法来培养它们(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，第59页-第103页(Academic Press，1986))。用于此目的的合适培养基包括例如D-MEM或RPML-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可以在动物中作为腹水瘤体内培养。
通过常规的免疫球蛋白纯化规程(例如，例如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、或亲和层析)将亚克隆所分泌的单克隆抗体与培养液、腹水或血清适当分离。
容易使用常规规程，例如通过使用能够特异结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针，来将编码单克隆抗体的DNA分离并测序。杂交瘤细胞充当这样的DNA的来源。一旦分离，便可将DNA置入表达载体中，然后将所述表达载体转染入原本不生成免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞，例如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿COS细胞、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞，或骨髓瘤细胞中，从而在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述文章包括Skerra A.Curr.Opinion in Immunol.，1993年4月；5(2)：256-262和Pluckthun，Immunol.Rev.，1992年10月；130：151-188。
另一种生成与TBC1D7蛋白有反应性的特异性抗体或抗体片段的方法是用TBC1D7蛋白或肽对细菌中所表达的编码免疫球蛋白基因或其部分的表达文库进行筛选。例如，可以采用噬菌体表达文库在细菌中表达完整Fab片段、VH区和Fv区。参见例如，Ward ES等，Nature.1989年10月12日；341(6242)：544-6；Huse WD等，Science.1989年10月8日；246(4935)：1275-81；及McCafferty J等，Nature.1990年10月6日；348(6301)：552-4。用TBC1D7蛋白例如TBC1D7肽对此类文库进行筛选可以鉴定与TBC1D7蛋白有反应性的免疫球蛋白片段。或者，可以利用SCID-humouse(可从Genpharm获得)来生成抗体或其片段。
在进一步的实施方案中，可以从采用McCafferty J等，Nature.1990年10月6日；348(6301)：552-4；Clackson T等，Nature.1991年8月15日；352(6336)：624-8中所描述的技术产生的抗体噬菌体文库中分离抗体或抗体片段；并且Marks JD等，J MoL BioL，222：581-597(1991)J Mol Biol.1991年10月5日；222(3)：581-97分别描述了使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。随后的出版物描述了通过链改组(Marks JD等，Biotechnology(N Y).1992年7月；10(7)：779-83)以及组合感染(combinatorial infection)和体内重组作为构建极大型噬菌体文库的策略来产生高亲和力(nM范围)的人抗体(Waterhouse P等，Nucleic Acids Res.1993年5月11日；21(9)：2265-6)。如此，这些技术是分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方案。
也可以通过例如用人重链和轻链恒定域编码序列替换同源鼠序列(美国专利号4,816,567；Morrison SL等，Proc Natl Acad Sci USA.1984年11月；81(21)：6851-5)，或者通过将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列共价连接来修饰DNA。
通常，用此类非免疫球蛋白多肽替换抗体恒定域，或者用它们替换抗体的一个抗原结合位点的可变域以创建包括一个具有某种抗原特异性的抗原结合位点和另一个具有不同抗原特异性的抗原结合位点的嵌合双价抗体。
(iii)人源化抗体
用于将非人抗体人源化的方法在本领域中已有记载。在一些实施方案中，人源化抗体具有一个或多个从非人来源导入其中的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基经常称为“输入(import)”残基，其通常取自某个“输入”可变域。人源化可以基本上按照Winter及其合作者的方法(Jones PT等，Nature.1986年5月29日-6月4日；321(6069)：522-5；Riechmann L等，Nature.1988年3月24日；332(6162)：323-7；Verhoeyen M等，Science.1988年3月25日；239(4847)：1534-6)来进行，用高变区序列替换人抗体的相应序列。因而，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中完整人可变域的一小部分(substantially less than intact)被来自非人物种的相应序列替换。在实践中，人源化抗体典型的是人抗体中一些高变区残基(可能还有一些FR残基)被来自啮齿类抗体中类似位置的残基替代而得到的抗体。
要用于生成人源化抗体的人可变域(轻链和重链两者)的选择对于降低抗原性是非常重要的。根据所谓的“最佳匹配(best-fit)”方法，用啮齿类抗体的可变域的序列来筛选整个已知人可变域序列的文库。然后，接受与啮齿类序列最接近的人序列作为人源化抗体的人框架区(FR)(Sims MJ等，JImmunol.1993年8月15日；151(4)：2296-308；Chothia C和Lesk AM.J Mol Biol.1987年8月20日；196(4)：901-17)。另一种方法使用衍生自轻链或重链的特定亚类中的所有人抗体的共有序列的特定框架区。同一框架可用于数种不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1992年5月15日；89(10)：4285-9；Presta等，J.Immunol.，1993年9月1日；151(5)：2623-32)。
此外，在保留对抗原的高亲和力和其它有利的生物学性质的条件下进行抗体人源化是重要的。为了实现这一目标，在一些实施方案中，人源化抗体的制备借助下述过程：使用亲本和人源化序列的三维模型来分析亲本序列和各种理论上的人源化产物。三维免疫球蛋白模型是常用的，而且是本领域技术人员熟悉的。有可用的计算机程序来图解和显示选定的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构。通过检查这些展示，可以分析残基在候选免疫球蛋白序列功能发挥中的作用，即分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。这样，可以从受体序列和输入序列选择FR残基并加以组合，从而获得期望的抗体特性，例如增加对靶抗原的亲和力。一般地，高变区残基直接而且最实质性地参与影响抗原的结合。
(iv)人抗体
作为人源化的替代方式，可以制备人抗体。例如，目前有可能生成这样的转基因动物(例如小鼠)，它们在经免疫后能够在没有内源免疫球蛋白生成的同时生成完全的人抗体全集。例如，已经描述了在嵌合和种系突变型小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致对内源抗体生成的完全抑制。在所述种系突变型小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因群(array)会导致抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits A等，Proc Natl Acad Sci U S A.1993年3月15日；90(6)：2551-5；Nature.1993年3月18日；362(6417)：255-8；Brüggemann M等，Year Immunol.1993；7：33-40和美国专利号5,591,669；5,589,369以及5,545,807。
或者，噬菌体展示技术(McCafferty J等，Nature.1990年12月6日；348(6301)：552-4)可用于在体外从来自未被免疫的供体的免疫球蛋白可变(V)域全集(repertoire)生成人抗体和抗体片段。根据这种技术，将抗体V域基因以符合读码框方式克隆入丝状噬菌体(例如M13或fd)的主要或次要外壳蛋白基因中，并作为功能性抗体片段展示在噬菌体颗粒的表面上。因为丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以根据抗体的功能特性进行选择也导致编码显现那些特性的抗体的基因被选择。如此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以以多种形式进行，关于它们的综述，参见例如Johnson KS和Chiswell DJ.Curr Opin Struct Biol.1993；3：564-71。可以使用V基因区段的数种来源来进行噬菌体展示。
Clackson T等，Nature.1991年8月15日；352(6336)：624-8从经免疫小鼠的脾衍生的小型随机组合V基因文库分离出多种系列的抗
Figure BDA0000058047620000221
唑酮(oxazolone)抗体。可以构建来自未免疫的人供体的V基因全集，并基本上按照由Marks JD等，J Mol Biol.1991年12月5日；222(3)：581-97，或Griffiths AD等，EMBO J.1993年2月；12(2)：725-34所描述的技术分离针对多种抗原(包括自身抗原)的抗体。还可参见美国专利号5,565,332和5,573,905。
也可以通过体外活化的B细胞来生成人抗体(参见美国专利号205,567,610和5,229,275)。
(v)非抗体结合蛋白
本发明还预期针对CX蛋白的非抗体结合蛋白，包括针对EPHA7N末端部分的非抗体结合蛋白。术语“非抗体结合蛋白”或“非抗体配体”或“抗原结合蛋白”可互换，指采用非免疫球蛋白支架的抗体模拟物，包括Adnectin、Avimer、单链多肽结合分子以及抗体样结合肽模拟物，如下文更为详细地讨论的。
已经开发出其它按照与抗体相似的方式靶定和结合靶标的化合物。这些“抗体模拟物”中的一些使用非免疫球蛋白支架作为抗体可变区的备选蛋白质框架。
例如，Ladner等(美国专利号5,260,203)描述了具有结合特异性的单多肽链结合分子，所述结合特异性类似于聚合的，但分子上分离的抗体轻链和重链可变区。单链结合分子含有通过肽接头连接的抗体重链和轻链可变区二者的抗原结合位点，并且会折叠成类似于双肽抗体的结构。单链结合分子显示出优于常规抗体的数种优点，包括尺寸更小、稳定性更大而且更易于修饰。
Ku等(Proc Natl Acad Sci USA 92(14)：6552-6556(1995))公开了一种基于细胞色素b562的抗体替代物。Ku等(1995)制成了一个文库，其中细胞色素b562的两个环被随机化，并以对牛血清清蛋白的结合为指标加以选择。发现个别突变体以与抗BSA抗体相似的方式选择性结合BSA。
Lipovsek等(美国专利号6,818,418和7,115,396)公开了一种抗体模拟物，其以纤连蛋白或纤连蛋白样支架和至少一个可变环为特征。称作Adnectin的这些基于纤连蛋白的抗体模拟物显现出许多与天然或工程化抗体相同的特征，包括对任何靶配体的高亲和力和特异性。任何用于开发新的或改良的结合蛋白的技术均可以与这些抗体模拟物一起使用。
这些基于纤连蛋白的抗体模拟物的结构与IgG重链可变区的结构相似。因此，这些模拟物与天然抗体在性质和亲和力上展现出相似的抗原结合特性。此外，这些基于纤连蛋白的抗体模拟物与抗体和抗体片段相比还表现出某些益处。例如，这些抗体模拟物在天然折叠稳定性方面不依赖于二硫键，因此它们在通常会破坏抗体的条件下是稳定的。另外，因为这些基于纤连蛋白的抗体模拟物的结构与IgG重链的结构相似，所以可以在体外采用环随机化和改组方法，其类似于抗体的体内亲和力成熟过程。Beste等(Proc Natl Acad Sci USA 96(5)：1898-1903(1999))公开了一种基于脂笼蛋白支架的抗体模拟物(Anticalin(注册商标))。脂笼蛋白由在蛋白质末端具有4个超变环的β-桶构成。Beste(1999)将所述环进行随机诱变，并对其选择与例如荧光素的结合。三种变体展现出与荧光素的特异性结合，其中一个变体显示与抗荧光素抗体相似的结合。进一步的分析揭示了，所有随机化位置均是可变的，这表明Anticalin(注册商标)适合于用作抗体的替代品。
Anticalin(注册商标)是小的单链肽，通常在160-180个残基之间，其提供了数项优于抗体的优点，包括生产成本降低、在贮存中稳定性提高和免疫反应降低。
Hamilton等(美国专利号5,770,380)公开了一种合成的抗体模拟物，其使用杯芳烃(calixarene)刚性非肽有机支架，其上附着有多个可变肽环，用作结合位点。肽环相对于彼此均从杯芳烃的几何学上的同一侧突出。由于这种几何学构型，所有的环均可供结合，从而增加了与配体的结合亲和力。然而，与其它抗体模拟物相比，基于杯芳烃的抗体模拟物不是纯粹由肽构成的，并且因此它不易受蛋白酶攻击。支架也不是纯粹由肽、DNA或RNA构成的，这意味着此抗体模拟物在极端环境条件中相对稳定，而且寿命较长。此外，因为基于杯芳烃的抗体模拟物相对较小，它不太可能产生免疫原性应答。
Murali等(Cell Mol Biol.49(2)：209-216(2003))讨论了一种用于将抗体减小为更小的模拟肽的方法，他们称之为“抗体样结合模拟肽(antibody like binding peptidomemetics)”(ABiP)，其作为抗体的备选也可以是有用的。
Silverman等(Nat Biotechnol.(2005)，23：1556-1561)公开了若干融合蛋白，它们是单链多肽，包含多个称作“Avimer”的域。Avimer是从人胞外受体域通过体外外显子改组和噬菌体展示开发的，是一类在亲和力和对各种靶分子的特异性方面与抗体有些相似的结合蛋白。所得的多域蛋白可以包括多个独立的结合域，它们与单表位结合蛋白相比显示改善的亲和力(在某些情况下是亚纳摩尔级)和特异性。关于Avimer构建和使用的更多细节参见例如美国专利申请公开文本号20040175756、20050048512、20050053973、20050089932和20050221384。
在非免疫球蛋白蛋白质框架外，还在包含RNA分子和非天然寡聚物(例如蛋白酶抑制剂、苯并二氮卓类(benzodiazepines)、嘌呤衍生物和β转角模拟物)的化合物中模拟了抗体特性，所有这些均适合本发明使用。
正如本领域公知的，适体是由与特定分子靶标紧密结合的核酸组成的大分子。Tuerk和Gold(Science.249：505-510(1990))披露了选择适体的SELEX方法(配体指标级富集的***进化(Systematic Evolution of Ligand by Exponential Enrichment))。在SELEX方法中，生成核酸分子的大型文库(例如1015种不同分子)和/或用靶分子进行筛选。然后，分离的适体可以进一步精制以消除任何对靶向结合和/或适体结构没有帮助的核苷酸(即截短到其核心结合域的适体)。关于适体技术的综述参见例如Jayasena，1999，Clin.Chem.45：1628-1650。
尽管测试剂/化合物文库的构建是本领域中公知的，但是在下文中提供了鉴定测试剂或化合物和此类作用剂或化合物的构建文库以用于本筛选方法的其它指导。
(vi)抗体片段
已经开发了多种用于生产抗体片段的技术。通常，经由对完整抗体的蛋白水解消化来衍生这些片段(参见例如Morimoto K和Inouye K.J Biochem Biophys Methods.1992年3月；24(1-2)：107-17；Brennan M等，Science.1985年7月5日；229(4708)：81-3)。然而，这些片段现在可以直接通过重组宿主细胞制备。例如，抗体片段可以从上文所讨论的抗体噬菌体文库分离。或者，Fab’-SH片段可以直接从大肠杆菌回收并化学偶联来形成F(ab’)2片段(Carter P等，Biotechnology(N Y).1992年2月；10(2)：163-7)。根据另一个方法，F(ab’)2片段可以直接从重组宿主细胞培养物分离。用于制备抗体片段的其它技术对于熟练从业人员会是显而易见的。在其它实施方案中，所选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利号5,571,894和5,587,458。抗体片段也可以是“线性抗体”，例如，如美国专利号5,641,870中所描述的。所述线性抗体片段可以是单特异性或双特异性的。
(vii)选择抗体或抗体片段
通过检测CX基因表达细胞，如癌细胞的亲和力来选择通过上述方法制备的抗体或抗体片段。通过用含3％BSA的PBS在室温下处理30分钟来封闭对这些细胞的非特异结合。将细胞与候选抗体或抗体片段在室温下一起温育60分钟。用PBS清洗后，用FITC偶联的二抗在室温下对细胞染色60分钟，并通过使用荧光计来检测。或者，使用表面等离子共振现象的生物传感器可以用作检测或定量本发明抗体或抗体片段的手段。在本发明中选择能够检测细胞表面上的CX肽的抗体或抗体片段。
(3)双链分子
除非另有明确指明，术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”在本文中可互换使用，通过其通常所接受的单字母密码来指称。该术语适用于这样的核酸(核苷酸)聚合物，其中一个或多个核酸通过酯键合连接。多核苷酸或寡核苷酸可以由DNA、RNA或其组合构成。
如本文中所使用的，术语“分离的双链分子”指抑制靶基因表达的核酸分子，包括例如，短干扰RNA(siRNA；例如双链核糖核酸(dsRNA)或小发夹RNA(shRNA))和短干扰DNA/RNA(siD/R-NA；例如DNA和RNA的双链嵌合体(dsD/R-NA)或DNA和RNA的小发夹嵌合体(shD/R-NA))。
如本文中所使用的，术语“siRNA”指阻止靶mRNA翻译的双链RNA分子。使用将siRNA导入细胞中的标准技术，包括用DNA作为RNA转录模板的那些技术。siRNA包括与TBC1D7基因有义核酸序列对应的核糖核苷酸(也称为“有义链”)、与TBC1D7基因反义核酸序列对应的核糖核苷酸(也称为“反义链”)或这两者。siRNA可以这样构建，使单个转录物同时具有靶基因的有义核酸序列和互补的反义核酸序列，例如发夹。siRNA可以是dsRNA或shRNA。如本文中所使用的，术语“dsRNA”是指两个RNA分子的构建体，这两个RNA分子含有彼此互补的序列，并且通过所述互补序列退火在一起形成双链RNA分子。两条链的序列不仅可以包括选自靶基因序列的蛋白质编码序列的“有义”或“反义”RNA，还包括具有选自靶基因非编码区的核苷酸序列的RNA分子。
如本文中所使用的，术语“shRNA”是指具有茎-环结构的siRNA，其包含彼此互补的第一区和第二区，即有义链和反义链。区的互补程度和方向足以使该区之间发生碱基配对，所述第一区和第二区通过环区连接，所述环是由于环区内的核苷酸(或核苷酸类似物)之间缺乏碱基配对而形成的。shRNA的环区是介于有义和反义链之间的单链区，并且也可以称为“居间单链”。
如本文中所使用的，术语“siD/R-NA”是指由RNA和DNA两者组成的双链分子，并且包括RNA和DNA的杂合体和嵌合体，而且阻止靶mRNA的翻译。在本文中，杂合体指明这样的分子，其中由DNA组成的寡核苷酸和由RNA组成的寡核苷酸相互杂交以形成双链分子；而嵌合体指明组成双链分子的一条或两条链可以同时含有RNA和DNA。使用将siD/R-NA导入细胞中的标准技术。siD/R-NA包括TBC1D7基因的有义核酸序列(也称为“有义链”)、TBC1D7基因的反义核酸序列(也称为“反义链”)或这两者。siD/R-NA可以这样构建，使单个转录物同时具有来自靶基因的有义和互补的反义核酸序列，例如发夹。siD/R-NA可以是dsD/R-NA或shD/R-NA。
如本文中所使用的，术语“dsD/R-NA”是指这样两个分子的构建体，两个分子包含彼此互补的序列，并且通过所述互补序列退火在一起以形成双链多核苷酸分子。两条链的核苷酸序列可以不仅包括选自靶基因序列的蛋白编码序列的“有义”或“反义”多核苷酸序列，还可以包括具有选自靶基因非编码区核苷酸序列的多核苷酸。组成dsD/R-NA的两个分子中的一个或两个是由RNA和DNA组成(嵌合分子)，或者其中一个分子由RNA组成而另一个分子由DNA组成(杂合双链)。
如本文中所使用的，术语“shD/R-NA”是指具有茎-环结构的siD/R-NA，其包含彼此互补的第一区和第二区，即有义链和反义链。所述区的互补程度和方向足以使该区之间发生碱基配对，第一区和第二区通过环区连接，所述环是由于环区内的核苷酸(或核苷酸类似物)之间缺乏碱基配对而形成的。shD/R-NA的环区是介于有义和反义链之间的单链区，并且也可以称为“居间单链”。
(i)靶序列
针对TBC1D7基因的双链分子，该分子与靶mRNA杂交，通过与该基因正常情况下为单链的mRNA转录物联合，由此干扰翻译，藉此抑制靶基因所编码的蛋白质表达，从而抑制或减少TBC1D7基因所编码的TBC1D7蛋白的生成。癌细胞系中的TBC1D7表达受本发明的两种双链分子抑制(图3A和图3B)。
因此，本发明提供了在导入细胞中具有抑制或减少癌细胞中的TBC1D7基因表达的能力的分离的双链分子。通过下文所提及的siRNA设计算法来设计双链分子的靶序列。
TBC1D7靶序列包括，例如，核苷酸
5’-GAACAGTGCAGAGAAGATA-3’(SEQ ID NO：18)或
5’-GATAAAGTTGTGAGTGGAT-3’(SEQ ID NO：19)
具体地，本发明提供了下列双链分子[1]至[19]：
[1]一种分离的双链分子，其在导入细胞中时抑制TBC1D7基因的体内表达和细胞增殖，其中所述双链分子作用于与选自SEQ ID NO：18和SEQ IDNO：19的靶序列匹配的mRNA；
[2][1]的双链分子，其包含彼此杂交以形成双链的有义链和与之互补的反义链，其中所述有义链包含与选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：18和SEQ ID NO：19的序列对应的寡核苷酸；
[3][1]的双链分子，其中所述靶序列包含来自选自SEQ ID NO：1的核苷酸序列的至少约10个连续的核苷酸。
[4][3]的双链分子，其中所述靶序列包含来自选自SEQ ID NO：1的核苷酸序列的约19到约25个连续的核苷酸。
[5][2]的双链分子，其中所述有义链与靶序列上的反义链杂交以形成具有小于约100个核苷酸长度的双链分子。
[6][5]的双链分子，其中所述有义链与靶序列上的反义链杂交以形成具有小于约75个核苷酸长度的双链分子。
[7][6]的双链分子，其中所述有义链与靶序列上的反义链杂交以形成具有小于约50个核苷酸长度的双链分子。
[8][7]的双链分子，其中所述有义链与靶序列上的反义链杂交以形成具有小于约25个核苷酸长度的双链分子。
[9][8]的双链分子，其中所述有义链与靶序列上的反义链杂交以形成具有约19个和约25个核苷酸之间的长度的双链分子。
[10][1]的双链分子，其由包含由居间单链连接的有义和反义链两者的单一寡核苷酸组成。
[11][10]的双链分子，其具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中
[A]是有义链，其包含与选自TBC1D7的SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19的序列对应的寡核苷酸；
[B]是居间单链；以及
[A’]是包含与[A]中所选序列的互补序列相对应的寡核苷酸的反义链。
[12][1]的双链分子，其包含RNA。
[13][1]的双链分子，其包含DNA和RNA两者。
[14][13]的双链分子，其是DNA多核苷酸和RNA多核苷酸的杂合体。
[15][14]的双链分子，其中有义链和反义链分别由DNA和RNA构成。
[16][13]的双链分子，其是DNA和RNA的嵌合体。
[17][16]的双链分子，其中有义链中靶序列的5’端区域，和/或反义链中靶序列互补序列的3’端区域由RNA组成。
[18][17]的双链分子，其中所述RNA区由9至13个核苷酸组成；以及
[19][2]的双链分子，其含有3’突出端。
下文中将更为详细地描述本发明的双链分子。
用于设计具有抑制细胞中的靶基因表达的能力的双链分子的方法是已知的。(参见，例如美国专利号6,506,559，以提述的方式将其全部内容并入本文中)。例如，可以从Ambion网站(在万维网上于ambion.com/techlib/misc/siRNA finder.html)获得用于设计siRNA的计算机程序。计算机程序根据下列方案选择双链分子的靶核苷酸序列。
靶位点的设计
1、以转录物的AUG起始密码子开始，向下游扫描AA双核苷酸序列。记录每个AA的出现及3’邻近的19个核苷酸作为潜在siRNA靶位点。Tuschl等建议避免针对5’和3’非翻译区(UTR)以及起始密码子邻近区域(75个碱基内)设计siRNA，因为这些区域可能更富含调节蛋白结合位点，而UTR结合蛋白和/或翻译起始复合物可干扰siRNA核酸内切酶复合物的结合。
2、将潜在靶位点与合适的基因组数据库(人、小鼠、大鼠等)进行比较，并且将任何与其它编码序列显著同源的靶序列排除在考虑之外。主要使用BLAST，其可以在互联网ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/的NCBI服务器上找到(Altschul SF等，Nucleic Acids Res.1997年9月1日；25(17)：3389-402)。
3、选择合格的靶序列用于合成。通常沿着待评估的基因的长度选择几个靶序列。
根据该方案，对本发明分离的双链分子的靶序列设计如下
TBC1D7靶序列包括，例如，核苷酸
5’-GAACAGTGCAGAGAAGATA-3’(SEQ ID NO：18)或
5’-GATAAAGTTGTGAGTGGAT-3’(SEQ ID NO：19)
具体地，本发明提供了分别对靶向上述靶序列的下列双链分子检查其抑制或减少表达靶序列的细胞的生长的能力。表达TBC1D7的癌细胞(例如肺癌细胞系A549和LC319)的生长受本发明的两种双链分子抑制(图3A和图3B)。例如，本发明提供了靶向选自下组的任何序列的双链分子。
TBC1D7靶序列包括例如核苷酸
5’-GAACAGTGCAGAGAAGATA-3’(SEQ ID NO：18)或
5’-GATAAAGTTGTGAGTGGAT-3’(SEQ ID NO：19)。
本发明的双链分子针对单个靶TBC1D7基因序列，或可以针对多个靶TBC1D7基因序列。
本发明靶向上述TBC1D7基因靶序列的双链分子包括这样的分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含靶序列的任何核酸序列和/或与靶序列互补的序列。靶向TBC1D7基因的双链分子的例子包括包含与SEQ ID NO：18或SEQ IDNO：19对应的序列的寡核苷酸及其互补序列。然而，本发明不局限于这些例子，而且上述核酸序列中的细微修饰是可以接受的，只要经过修饰的分子保留抑制TBC1D7基因表达的能力。在本文中，核酸序列的“细微修饰”表示对该序列进行一个、两个或几个核酸的替换、缺失、添加或***。
根据本发明，可以使用实施例中所采用的方法(参见[实施例1]中的(i)RNA干扰测定法)来对本发明的双链分子测试其能力。在实施例中，根据标准方法，对包含TBC1D7基因mRNA不同部分的有义链及与之互补的反义链的双链分子进行体外测试，测试它们减少癌细胞系(例如使用LC319和A549)中TBC1D7基因产物生成的能力。此外，例如，与在不存在候选分子的条件下所培养的细胞相比与候选双链分子接触的细胞中TBC1D7基因产物的减少可以通过例如用所述TBC1D7基因mRNA的引物进行RT-PCR来加以检测(参见[实施例1]中的(b)半定量RT-PCR)。然后，可以对在体外基于细胞的测定法中减少TBC1D7基因产物生成的序列检测对细胞生长的抑制效果。对在体外基于细胞的测定法中抑制细胞生长的序列，使用患有癌症的动物，例如裸鼠异种移植模型来测试它们的体内能力，以确认TBC1D7基因产物的生成减少和癌细胞生长的降低。
当分离的多核苷酸是RNA或其衍生物时，在核苷酸序列中应将碱基“t”替换为“u”。如本文中所使用的，术语“互补的”是指多核苷酸的核苷酸单元之间形成Watson-Crick或Hoogsteen碱基配对，而术语“结合”表示两个多核苷酸之间的物理或化学相互作用。当所述多核苷酸包含经修饰的核苷酸和/或非磷酸二酯键时，这些多核苷酸也可以以相同方式相互结合。通常，互补的多核苷酸序列在适宜条件下杂交，形成含有少许或完全不含错配的稳定双螺旋。此外，本发明经分离的多核苷酸的有义链和反义链可以通过杂交形成双链分子或发夹环结构。在一个实施方案中，所述双螺旋中每10个配对中含有的错配不超过1个。在一些实施方案中，双链体的链完全互补，此类双链体不含错配。
对于所有的基因，多核苷酸长度小于500、200、100、75、50或25个核苷酸。本发明的分离的多核苷酸可用于形成针对TBC1D7基因的双链分子或制备编码双链分子的模板DNA。当所述多核苷酸用于形成双链分子时，多核苷酸的有义链可以长于19个核苷酸，例如长于21个核苷酸，例如约19-25个核苷酸之间。因而，本发明提供了包含有义链和反义链的双链分子，其中所述有义链包含与靶序列对应的核苷酸序列。在优选的实施方案中，有义链与靶序列上的反义链杂交以形成具有19-25个核苷酸对长度的双链分子。
本发明的双链分子可以含有一个或多个经修饰的核苷酸和/或非磷酸二酯联结。本领域公知的化学修饰能够提高双链分子的稳定性、可用性和/或细胞摄取。技术人员会了解这里所说的分子中可以引入的其它类型的化学修饰(WO03/070744；WO2005/045037)。在一个实施方案中，可以使用修饰来提供改善的降解抗性或改善的摄取。此类修饰的例子包括硫代磷酸酯联结、2’-O-甲基核糖核苷酸(尤其是在双链分子有义链上)、2’-脱氧-氟代核糖核苷酸、2’-脱氧核糖核苷酸、“通用碱基”核苷酸、5’-C-甲基核苷酸以及倒位脱氧脱碱基(inverted deoxyabasic)残基掺入(美国专利申请号20060122137)。
在另一个实施方案中，修饰可以用来增强双链分子稳定性或提高双链分子的靶向效率。修饰包括双链分子的两个互补链之间的化学交联、双链分子一条链3’或5’末端的化学修饰、糖修饰、核碱基修饰和/或主链修饰、2-氟代修饰核糖核苷酸以及2’-脱氧核糖核酸(WO2004/029212)。
在另一个实施方案中，修饰可以用来增加或减少针对靶mRNA中和/或互补双链分子链中互补核苷酸的亲和力(WO2005/044976)。例如，未修饰的嘧啶核苷酸可以用2-硫代、5-炔基、5-甲基或5-丙炔基嘧啶替代。另外，未修饰的嘌呤可以用7-脱氮、7-烷基或7-烯基嘌呤替代。在另一个实施方案中，当所述双链分子是带有3’突出端的双链分子时，可以将3’末端核苷酸的突出端核苷酸替换成脱氧核糖核苷酸(Elbashir SM等，Genes Dev 2001年1月15日，15(2)：188-200)。进一步的细节可以从公开文献，例如美国专利申请20060234970获知。本发明不局限于这些例子，任何已知的化学修饰都可以应用于本发明的双链分子，只要所得的分子保留抑制靶基因表达的能力。
此外，本发明的双链分子可以包含DNA和RNA两者，例如dsD/R-NA或shD/R-NA。具体地，DNA链和RNA链的杂合体多核苷酸或DNA-RNA嵌合体多核苷酸显示出增强的稳定性。可以形成DNA和RNA的混合，即由DNA链(多核苷酸)和RNA链(多核苷酸)形成的杂合型双链分子、在任一单链(多核苷酸)或两条单链上都包含DNA和RNA两者的嵌合型双链分子等等以增强双链分子的稳定性。DNA链和RNA链的杂合体可以是这样的杂合体，其中有义链是DNA而反义链是RNA，或者相反，只要其在导入表达该基因的细胞中时具有抑制靶基因表达的活性。
在一些实施方案中，有义链多核苷酸是DNA，而反义链多核苷酸是RNA。此外，嵌合体型双链分子可以是有义链和反义链两者都由DNA和RNA组成，或者其中有义链和反义链任何一个是由DNA和RNA组成，只要其在导入表达该基因的细胞中时具有抑制靶基因表达的活性。为了增强双链分子的稳定性，在一些实施方案中，所述分子含有尽可能多的DNA，然而为了诱导对靶基因表达的抑制，要求所述分子在一定范围内是RNA，从而诱导对表达的充分抑制。在嵌合体型双链分子的一个例子中，所述双链分子上游部分区域(即，位于有义或反义链内靶序列或其互补序列侧翼的区域)是RNA。
在一些实施方案中，上游部分区域指明有义链的5’端(5’侧)和反义链的3’端(3’侧)。即，在一些实施方案中，反义链3’端的侧翼区域，或有义链5’端的侧翼区域和反义链3’端的侧翼区域两者都由RNA组成。例如，本发明嵌合体或杂合体型双链分子包含下列组合。
有义链：
5’-[-----DNA-----]-3’
3’-(RNA)-[DNA]-5’
：反义链，
有义链：
5’-(RNA)-[DNA]-3’
3’-(RNA)-[DNA]-5’
：反义链，和
有义链：
5’-(RNA)-[DNA]-3’
3’-(-----RNA-----)-5’
有义链。
所述上游部分区域可以是从双链分子有义或反义链内从靶序列或其互补序列的末端算起约9-13个核苷酸的域。此外，此类嵌合体型双链分子的例子包括那些具有19-21个核苷酸的链长度，其中至少多核苷酸的上游半区(对于有义链为5’侧区域，而对于反义链为3’侧区域)是RNA，而另一半是DNA。在此类嵌合体型双链分子中，抑制靶基因表达的效果比整个反义链均为RNA时高得多(美国专利申请号20050004064)。
在本发明中，双链分子可以形成发夹，例如，短发夹RNA(shRNA)和由DNA和RNA形成的短发夹(shD/R-NA)。shRNA或shD/R-NA是RNA序列或者RNA和DNA的混合物，产生紧密的发夹转角，其可以用来通过RNA干扰来沉默基因表达。shRNA或shD/R-NA在单一链上包含有义靶序列和反义靶序列，其中所述序列被环序列隔开。通常，发夹结构被细胞机器(machinery)切割成dsRNA或dsD/R-NA，然后被结合到RNA诱导的沉默复合物(RISC)。此复合物结合并切割与dsRNA或dsD/R-NA靶序列匹配的mRNA。
为了形成发夹环结构，可以在有义和反义序列之间设置由任意核苷酸序列形成的环序列。如此，本发明还提供了具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’的双链分子，其中[A]是包含靶序列的有义链，[B]是居间单链，而[A’]是包含与[A]互补的序列的反义链。所述靶序列可以选自例如SEQ ID NO：18或SEQ IDNO：19核苷酸。
本发明不局限于这些例子，并且[A]中靶序列可以是来自这些例子的经修饰的序列，只要所述双链分子保留抑制靶定的TBC1D7基因表达，并导致抑制或减少表达这些基因的细胞的能力。区域[A]与[A’]杂交以形成包含区域[B]的环。居间单链部分[B]，即环序列，长度可为3-23个核苷酸。例如，环序列可以选自下列序列(互联网ambion.com/techlib/tb/tb_506.html)。此外，由23个核苷酸组成的环序列也提供活性siRNA(Jacque JM等，Nature 2002年7月25日，418(6896)：435-8，Epub 2002年6月26日)：
CCC、CCACC、或CCACACC：Jacque JM等，Nature 2002年7月25日，418(6896)：435-8，Epub 2002年6月26日；
UUCG：Lee NS等，Nat Biotechnol 2002年5月，20(5)：500-5；Fruscoloni P等，Proc Natl Acad Sci USA 2003年2月18日，100(4)：1639-44，Epub 2003年2月10日；和
UUCAAGAGA：Dykxhoorn DM等，Nat Rev Mol Cell Biol 2003年6月，4(6)：457-67。
具有本发明发夹环结构的例示性双链分子如下所示。在下列结构中，环序列可以选自：AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC、和UUCAAGAGA；然而，本发明不限于它们：
GAACAGUGCAGAGAAGAUAUU-[B]-UAUCUUCUCUGCACUGUUC(对于靶序列SEQ ID NO：18)；和
GAUAAAGUUGUGAGUGGAUUU-[B]-AUCCACUCACAACUUUAUC(对于靶序列SEQ ID NO：19)。
此外，为了增强双链分子的抑制活性，可以将核苷酸“u”添加至靶序列反义链的3’末端，作为3’突出端。要添加的“u”的数量至少是2个，通常是2-10个，例如2-5个。添加的“u”在双链分子反义链的3’末端形成单链。
制备双链分子的方法可以采用本领域已知的任何化学合成方法。根据化学合成方法，分别合成有义和反义单链多核苷酸，然后通过适当方法退火在一起来获得双链分子。在一个退火的实施方案中，将合成后的单链多核苷酸以优选至少约3∶7，例如约4∶6，例如基本上等摩尔量(即约5∶5的摩尔比)的摩尔比混合。接着，将混合物加热到双链分子解链的温度，然后逐渐冷却。退火的双链多核苷酸可以通过本领域已知的通常使用的方法来纯化。纯化方法的例子包括利用琼脂糖凝胶电泳的方法，或其中任选地通过例如用适当的酶降解来除去其中剩余的单链多核苷酸的方法。
位于靶序列侧翼的调控序列可以是相同的或不同的，使它们的表达可以被独立地调节，或以时间性或空间性的方式调节。通过将TBC1D7基因模板克隆到含有例如来自小核RNA(snRNA)U6或人H1RNA启动子的RNA polIII转录单位的载体中，可以在细胞内转录双链分子。
(ii)载体
本发明还包括含有一种或多种本文所述双链分子的载体和包含该载体的细胞。本发明的载体编码处于可表达形式本发明的双链分子。在本文中，短语“处于可表达形式”表示载体在导入细胞中时会表达该分子。在一个实施方案中，载体包括双链分子表达所必需的调控元件。本发明的此类载体可以用于生成本发明的双链分子，或直接作为用于治疗癌症的活性成分。
本发明的载体可以通过例如将含有靶序列的序列克隆到表达载体中，使得该序列以容许两条链都表达(通过DNA分子转录)的方式可操作连接于调节序列来生成(Lee NS等，Nat Biotechnol 2002年5月，20(5)：500-5)。例如，与mRNA反义的RNA分子由第一启动子(例如位于克隆序列3’末端侧翼的启动子序列)来转录，mRNA有义链的RNA分子由第二启动子(例如位于克隆序列5’末端侧翼的启动子序列)来转录。有义和反义链在体内杂交，产生用于基因沉默的双链分子构建体。或者，利用分别编码双链分子有义和反义链的两个载体构建体分别表达有义和反义链，接着形成双链分子构建体。此外，克隆的序列可以编码具有二级结构(例如发夹)的构建体；即，载体的单个转录物同时含有靶基因的有义和互补反义序列。
还可以对本发明的载体进行配置以实现在靶细胞基因组中的稳定***(参见，例如Thomas KR和Capecchi MR，Cell 1987，51：503-12，关于同源重组盒载体的描述)。参见，例如Wolff等，Science 1990，247：1465-8；美国专利号5,580,859；5,589,466；5,804,566；5,739,118；5,736,524；5,679,647和WO98/04720。基于DNA的递送技术的例子包括“裸DNA”、辅助(布比卡因(bupivicaine)、聚合物、肽介导的)递送、阳离子脂质复合物以及颗粒介导(“基因枪”)或压力介导的递送(参见，例如美国专利号5,922,687)。
本发明的载体可以是例如病毒或细菌载体。表达载体的例子包括减毒病毒宿主，例如牛痘或禽痘(参见，例如美国专利号4,722,848)。此方法涉及使用痘苗病毒，例如作为表达编码双链分子的核苷酸序列的载体。在导入表达靶基因的细胞中后，重组痘苗病毒表达所述分子，并且由此抑制该细胞的增殖。可使用的载体的另一个例子包括卡介苗(BCG)。BCG载体在Stover等，Nature 1991，351：456-60中有描述。极其多种其它载体可用于双链分子的治疗性施用和生产；例子包括腺病毒载体和腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)载体、脱毒的炭疽毒素载体等。参见，例如Shata等，Mol Med Today 2000，6：66-71；Shedlock等，J Leukoc Biol 2000，68：793-806和Hipp等，In Vivo 2000，14：571-85。
(iii)采用双链分子抑制或减少癌细胞生长以及治疗或预防癌症的方法
在本发明中，对靶向上述靶序列的双链分子检查它们抑制或减少(过)表达靶基因的细胞生长的能力。本发明双链分子抑制或减少了(过)表达TBC1D7基因的癌细胞的生长；本发明双链分子抑制或减少了(过)表达TBC1D7基因的细胞的生长；两种双链分子抑制TBC1D7(过)表达细胞例如肺癌细胞系A549和LC319的生长(图3A和图3B)。
因此，本发明提供了通过抑制TBC1D7基因的表达来抑制细胞生长，即来自如下所述的癌症的细胞的癌性细胞生长：所述癌症由TBC1D7基因过表达引起或由TBC1D7基因介导。TBC1D7基因表达可以由：特异靶向互补TBC1D7基因之表达的任何如上所述的本发明双链分子，或可表达任何所述双链分子的本发明载体，来加以抑制。本双链分子和载体的这种抑制癌性细胞的细胞生长的能力表明它们可以用于治疗由TBC1D7基因过表达引起或由TBC1D7基因介导的癌症的方法。如此，本发明提供了治疗由TBC1D7基因过表达引起的或由TBC1D7基因介导的癌症患者的方法，其通过施用针对TBC1D7基因的双链分子，即抑制性核酸，或表达该分子的载体来进行，而没有不良效应，因为那些基因在正常器官中几乎检测不到。
具体地，本发明提供了下列方法[1]-[22]：
[1]用于抑制或减少(过)表达TBC1D7基因的细胞生长的方法或用于治疗或预防(过)表达TBC1D7基因的癌症的方法，其中所述方法包括给予至少一种双链分子的步骤，其中所述双链分子被导入细胞中，并抑制或减少所述TBC1D7基因的体内表达。
[2][1]的方法，其中所述双链分子对与选自SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19的靶序列具有序列同一性或与之互补的mRNA起作用。
[3][2]的方法，其中所述双链分子包含彼此杂交以形成双链的有义链和与其互补的反义链，其中所述有义链包含与选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19的序列相对应的寡核苷酸。
[4][1]的方法，其中施用多种双链分子；在一些实施方案中，所述双链分子包含不同的核酸序列。
[5][4]的方法，其中所述多种双链分子靶向相同的基因；
[6][1]的方法，其中双链分子长度小于约100个核苷酸；
[7][6]的方法，其中双链分子，其中双链分子的有义链与靶序列上的反义链杂交以形成具有小于约75个核苷酸的长度的双链分子；
[8][7]的方法，其中双链分子，其中双链分子的有义链与靶序列上的反义链杂交以形成具有小于约50个核苷酸的长度的双链分子；
[9][8]的方法，其中双链分子，其中双链分子的有义链与靶序列上的反义链杂交以形成具有小于约25个核苷酸的长度的双链分子；
[10][9]的方法，其中双链分子，其中双链分子的有义链与靶序列上的反义链杂交以形成具有约19个-约25个核苷酸的长度的双链分子；
[11][1]的方法，其中所述双链分子由单个寡核苷酸组成，所述单个寡核苷酸包含通过居间单链连接的有义和反义链两者。
[12][11]的方法，其中所述双链分子具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中
[A]是包括与选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：18和SEQID NO：19的序列对应的寡核苷酸的有义链；
[B]是居间单链；及
[A’]是包含与[A]中所选序列互补的序列相对应的寡核苷酸的反义链。
[13][1]的方法，其中双链分子包含RNA。
[14][1]的方法，其中双链分子包含DNA和RNA两者。
[15][14]的方法，其中双链分子是DNA多核苷酸和RNA多核苷酸的杂合体。
[16][15]的方法，其中有义链和反义链多核苷酸分别由DNA和RNA形成。
[17][14]的方法，其中双链分子是DNA和RNA的嵌合体。
[18][17]的方法，其中有义和反义多核苷酸中的一个或两者的5’-末端侧翼区由RNA形成。
[19][18]的方法，其中侧翼区由9-13个核苷酸组成。
[20][1]的方法，其中双链分子含有3’突出端。
[21][1]的方法，其中双链分子由载体编码。
[22][21]的方法，其中所述双链分子具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中
[A]是包含与选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：18和SEQID NO：19的序列对应的寡核苷酸的有义链；
[B]是居间单链；及
[A’]是包含与[A]中所选序列互补的序列相对应的寡核苷酸的反义链。
[23][1]的方法，其中双链分子包含在组合物中，所述组合物除了该分子外还含有转染增强剂和细胞通透剂。
本发明方法会在下文更详细地描述。
通过使细胞与针对TBC1D7基因的双链分子、表达该分子的载体或含有其的组合物相接触来抑制(过)表达TBC1D7基因的细胞的生长。进一步使所述细胞与转染剂接触。合适的转染剂在本领域是公知的。短语“抑制细胞生长”表示与未暴露于该分子的细胞相比，细胞以较低的速率增殖，或细胞生存力降低。细胞生长可以通过本领域公知的方法来测定，例如采用MTT细胞增殖测定法。
根据本方法可以抑制任何类型细胞的生长，只要该细胞表达或过表达本发明双链分子的靶基因。例示性的细胞包括癌细胞。如此，可以通过施用至少一种本双链分子、至少一种表达至少一种所述分子的载体或至少一种含有至少一种所述分子的组合物，对患有或有风险患上TBC1D7基因相关疾病的患者进行治疗。例如，根据本方法可以治疗癌症患者。癌症类型可以根据要诊断的肿瘤的特定类型，采用标准方法来鉴别。在一些实施方案中，通过RT-PCR、杂交或免疫测定法来检测TBC1D7基因在患者来源的活组织检查物中的(过)表达，从而选择依照本发明方法治疗的患者。在一些实施方案中，在本发明处理前，通过本领域公知的方法来确认受试者来源的活检标本中TBC1D7基因过表达，所述本领域公知的方法例如，免疫组织化学分析、杂交或RT-PCR(参见，[实施例1]中的(b)半定量RT-PCR，(c)Northern印迹分析，(e)Western印迹或(f)免疫组织化学)。
根据本发明的抑制或减少细胞生长并由此治疗癌症的方法，当施用多种本发明的双链分子(或表达所述分子的载体、或含有所述分子的组合物)时，每个分子都可以针对相同基因的不同靶序列，或不同基因的不同靶序列。例如，该方法可以利用针对相同TBC1D7基因转录物的不同双链分子。或者，例如，该方法可以利用针对选自相同TBC1D7基因的一个、两个或多个靶序列的双链分子。
为了抑制细胞生长，可以将本发明的双链分子以实现该分子与对应的mRNA转录物的结合的形式直接导入细胞中。或者，如上文所述，可以将编码双链分子的DNA作为载体导入细胞中。为了将双链分子和载体导入细胞中，可以采用转染增强剂，例如FuGENE(Roche diagnostics)、Lipofectamine2000(Invitrogen)、Oligofectamine(Invitrogen)以及Nucleofector(Wako pure Chemical)。
如果治疗产生临床效益，例如，受试者中TBC1D7基因的表达减少、或癌症尺寸减少、普遍性(prevalence)或转移潜力减小，则认为该治疗有效。当预防性地适用治疗时，“有效”表示其延缓或阻止癌症形成、或阻止或减轻癌症的临床症状。结合特定肿瘤类型的任何已知的诊断或治疗方法来确定有效性。
应当理解的是，本发明双链分子以亚化学计量的量来降解靶mRNA(TBC1D7基因转录物)。不希望受任何理论的约束，相信本发明双链分子以催化的方式导致靶mRNA降解。如此，与常规癌症治疗方法相比，为发挥治疗效果而需要投递到癌症部位或其邻近的双链分子要少的多。
本领域技术人员在考虑一些因素，例如体重、年龄、性别、疾病类型、受试者的症状和其它条件；给药途径、以及是局部还是全身给药的基础上，能够容易地确定要向给定受试者施用的本发明双链分子的有效量。通常，本发明双链分子的有效量包括在癌症部位或其邻近约1纳摩尔(nM)至约100nM的胞内浓度，例如约2nM-约50nM，例如约2.5nM-约10nM。预想可以施用更多或更少量的双链分子。
本方法可以用于抑制癌症的生长或转移；例如，由TBC1D7基因过表达引起的癌症或由TBC1D7基因介导的癌症，例如，肺癌或食道癌。特别地，针对选自TBC1D7的SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19的靶序列的双链分子可用于治疗癌症。
为了治疗癌症，例如由TBC1D7基因促进的癌症，还可以将本发明双链分子与不同于双链分子的作用剂联合施用给受试者。或者，可以将本发明双链分子与为治疗癌症所设计的另一治疗方法联合施用给受试者。例如，本发明双链分子可以与目前用于治疗癌症或阻止癌症转移的治疗方法(例如，放射疗法、外科手术和采用化疗剂的治疗，例如顺铂、卡铂、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、阿霉素、柔红霉素(daunorubicin)或他莫昔芬(tamoxifen))联合施用。
在本方法中，可以将双链分子作为裸双链分子与投递试剂结合，或作为表达双链分子的重组质粒或病毒载体施用给受试者。
适合于与本发明双链分子联合施用的投递试剂包括Mirus Transit TKO亲脂试剂；Lipofectin；Lipofectamine；Cellfectin或多聚阳离子(例如，多聚赖氨酸)或脂质体。在一个实施方案中，投递试剂是脂质体。脂质体可以有助于将双链分子递送到特定组织，例如视网膜或肿瘤组织，而且还可以增加双链分子的血液半衰期。本发明适用的脂质体是由标准的囊泡形成脂质(vesile-forming lipid)形成的，其通常包括中性或带负电荷的磷脂和固醇，例如胆固醇。对一些因素的考虑通常可以为脂质的选择提供指导，例如所需的脂质体大小和脂质体在血流中的半衰期。多种用于制备脂质体的方法是公知的，例如在Szoka等，Ann Rev Biophys Bioeng 1980，9：467和美国专利号4,235,871；4,501,728；4,837,028以及5,019,369中所描述的，以提述的方式将它们的全部内容并入本文中。
在一些实施方案中，包埋本双链分子的脂质体包含配体分子，所述配体分子可以将脂质体递送到癌症部位。与肿瘤或血管内皮细胞中普遍存在的受体相结合的配体，例如结合肿瘤抗原或内皮细胞表面抗原的单克隆抗体是有用的。在一些实施方案中，对包埋本双链分子的脂质体进行修饰，以避免被单核巨噬细胞和网状内皮***清除，例如通过具有与结构表面结合的调理作用抑制性模块来实现。在一个实施方案中，本发明的脂质体可以包含调理作用抑制性模块和配体两者。
用于制备本发明的脂质体的调理作用抑制性模块通常是与脂质体膜结合的大型亲水性聚合物。如本文中所使用的，当调理作用抑制性模块化学地或物理地附着至膜时，例如通过脂溶性锚(anchor)***膜本身中，或者通过与膜脂质的活性基团直接结合，则调理作用抑制性模块与脂质体膜“结合”。这些调理作用抑制性亲水性聚合物形成保护性表层，显著地减少单核巨噬细胞***(“MMS”)和网状内皮***(“RES”)对脂质体的摄入；如记载于例如美国专利号4,920,016的，其全部公开内容援引并入本文。因此，用调理作用抑制性模块修饰的脂质体在循环中保留的时间比未修饰的脂质体长得多。出于此理由，此类脂质体有时称作“隐形”(stealth)脂质体。
已知隐形脂质体累积在依靠多孔性或“渗漏性”微血管***供给的组织中。如此，在以此类微血管***缺损为特征的靶组织，例如实体瘤中会高效率地累积这些脂质体。参见Gabizon等，Proc Natl Acad Sci USA 1988，18：6949-53。另外，RES的摄入减少通过阻止在肝和脾中显著积累而降低隐形脂质体的毒性。如此，用调理作用抑制性模块修饰的本发明的脂质体能将本双链核酸分子投递至肿瘤细胞。
适用于修饰脂质体的调理作用抑制性模块可以是分子量约500至约40,000道尔顿，例如约2,000至约20,000道尔顿的水溶性聚合物。此类聚合物包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物；例如，甲氧基PEG或PPG、和PEG或PPG硬脂酸酯；合成聚合物例如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；线性、分枝的或者树状聚酰胺胺(polyamidoamine)；聚丙烯酸；多元醇，诸如化学结合有羧基或氨基的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神经节苷脂，诸如神经节苷脂GM1。PEG、甲氧基PEG、或甲氧基PPG或其衍生物的共聚体也是适合的。另外，调理作用抑制性聚合物可以是PEG与聚氨基酸、多糖、聚酰胺胺、聚亚乙基胺或者多核苷酸中的任何一种的嵌段共聚物。抑制调理作用的聚合物还可以是含有氨基酸或羧酸的天然多糖，例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明质酸、果胶酸、神经氨酸、海藻酸、角叉胶；氨基化多糖类或寡糖(线性或者分枝的)；或者羧基化的多糖或寡糖，例如，与碳酸的衍生物起反应而生成了羧基联接的羧基化多糖类或寡糖。
在一些实施方案中，调理作用抑制性模块是PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG衍生物修饰的脂质体有时称作“PEG化脂质体”。
调理作用抑制性模块可以通过许多公知技术中的任何一种结合至脂质体膜。例如，PEG的N-羟基琥珀酰亚胺酯能与磷脂酰乙醇胺脂溶性锚(lipid-soluble anchor)结合，然后结合至膜。相似地，可以通过还原性氨基化，用硬脂酰胺脂溶性锚来将右旋糖苷聚合物衍生化，所述还原性氨基化使用Na(CN)BH3和混合溶剂例如于60℃以30∶12比率的四氢呋喃和水进行。
上文讨论了表达本发明的双链分子的载体。此类表达至少一种本发明的双链分子的载体也可以直接施用或者与合适的投递试剂，包括Mirus TransitLT1亲脂性试剂、Lipofectin、Lipofectamine、Cellfectin、聚阳离子(例如聚赖氨酸)或脂质体组合施用。将表达本发明的双链分子的重组病毒载体投递到患者的癌症区域的方法在本技术领域的技术范围内。
本发明双链分子可以通过任何适合于将双链分子递送到癌症部位的方式来施用给受试者。例如，双链分子可以通过基因枪、电穿孔或通过其它适合胃肠外或肠内施用路径来施用。
合适的肠内施用路径包括口服、直肠或鼻内递送。
合适的胃肠外施用路径包括血管内施用(例如静脉内推注、静脉内输注、动脉内推注、动脉内输注和向血管网络中的导管滴注)；组织周围和组织内注射(例如肿瘤周围和肿瘤内注射)；皮下注射或沉积，包括皮下输注(例如利用浸透压泵)；直接施加到癌症部位或其附近的区域，例如借助导管或其它放置装置(例如，包含多孔性、非多孔性或明胶状材料的栓剂或植入物)；和吸入。在一些实施方案中，通过注射或输注将双链核酸分子或载体施用到癌症部位或其附近。
本发明的双链分子可以以单剂或多剂施用。当经输注施用本发明的双链分子时，输注可以是单一的持续剂量或可以经多次输注递送。可以直接将作用剂注射到癌症组织或邻近癌症部位。可以将作用剂多次注射到癌症组织或邻近癌症部位。
本领域技术人员也可以容易地确定适合于向给定受试者施用本发明的双链分子的给药方案。例如，可以将双链分子一次性施用给受试者，例如作为单次注射或者沉积的形式施用到癌症部位或邻近癌症部位。或者，双链分子可以在约3至约28天、例如约7至约10天的期间内每天一次或两次施用给受试者。在一个例示性的给药方案中，双链分子可以在7天内每天一次地注射到癌症部位或邻近癌症部位。当给药方案包括多次给药时，应当理解的是，给受试者施用的双链分子的有效量可以包括在整个给药方案里施用的双链分子的总量。
(iv)组合物
此外，本发明提供包含至少一种本双链分子或编码该分子的载体的药物组合物。具体地，本发明提供下列组合物[1]-[24]：
[1]用于抑制或降低表达TBC1D7基因的细胞生长的组合物，或用于治疗或预防表达TBC1D7基因的癌症的组合物，其包含至少一种双链分子，其中将所述双链分子导入细胞中，抑制或减少所述基因的体内表达。
[2][1]的组合物，其中所述双链分子对mRNA起作用，所述mRNA与选自TBC1D7的SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19的靶序列匹配。
[3][2]的组合物，其中所述双链分子包含彼此杂交以形成双链的有义链和与其互补的反义链，其中所述有义链包含与选自SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19的序列相对应的寡核苷酸。
[1]的组合物，其中要治疗的癌症是由TBC1D7基因过表达引起的癌症，或由TBC1D7基因介导的癌症。
[4][1]的组合物，其中要治疗的癌症是肺癌或食道癌；
[5][4]的组合物，其中所述肺癌是小细胞肺癌或非小细胞肺癌；
[6][1]的组合物，其中所述组合物含有多种所述的双链分子；
[7][6]的组合物，其中所述多种双链分子靶向相同的基因；
[8][1]的组合物，其中所述双链分子的有义链具有小于约100个核苷酸的长度；
[9][8]的组合物，其中所述双链分子的有义链具有小于约75个核苷酸的长度；
[10][9]的组合物，其中所述双链分子的有义链具有小于约50个核苷酸的长度；
[11][10]的组合物，其中所述双链分子的有义链具有小于约25个核苷酸的长度；
[12][11]的组合物，其中所述双链分子的有义链具有约19个-约25个核苷酸的长度；
[13][1]的组合物，其中所述双链分子由单个寡核苷酸组成，所述单个寡核苷酸包含通过居间单链连接的有义和反义链。
[14][13]的组合物，其中所述双链分子具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中
[A]是包括与选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：18和SEQID NO：19的序列对应的寡核苷酸的有义链；
[B]是居间单链；及
[A’]是包含与[A]中所选序列互补的序列相对应的寡核苷酸的反义链。
[15][1]的组合物，其中所述双链分子包含RNA；
[16][1]的组合物，其中所述双链分子包含DNA和RNA；
[17][16]的组合物，其中双链分子是DNA多核苷酸和RNA多核苷酸的杂合体；
[18][17]的组合物，其中有义链和反义链多核苷酸分别由DNA和RNA形成；
[19][18]的组合物，其中所述双链分子是DNA和RNA的嵌合体；
[20][19]的组合物，其中有义和反义多核苷酸中一个或两者的5’-末端的至少一个侧翼区由RNA组成。
[21][20]的组合物，其中侧翼区由9-13个核苷酸组成；
[22][1]的组合物，其中双链分子含有3’突出端；
[23][1]的组合物，其中双链分子由载体编码并且包含在组合物中；
[24][1]的组合物，其进一步含有转染增强剂、细胞通透剂和药学上可接受的载体。
将在下文中更详细地描述本发明方法。
根据本领域已知的技术，向受试者施用之前，可以将本发明双链分子配制为药物组合物。本发明的药物组合物具有至少灭菌和无热原的特征。正如本说明书中所使用的，“药物配制剂”包括用于人用和兽医用的配制剂。用于制备本发明药物组合物的方法在本领域的技术范围之内，例如，在Remington’s Pharmaceutical Science，第17版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.(1985)中所描述的，以提述的方式将其全部内容并入本文中。
本发明药物配制剂含有至少一种本发明双链分子或编码所述双链分子的载体(例如，以重量计0.1-90％)或所述分子的生理学可接受盐，其与生理学可接受载体培养液混合。例示性的生理学可接受载体培养液包括，例如水、缓冲水、生理盐水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。
根据本发明，组合物可以含有多种类型的双链分子，每种分子都可以针对TBC1D7基因的相同靶序列，或不同靶序列。例如，所述组合物可以含有针对TBC1D7基因的双链分子。或者，例如，所述组合物可以含有针对选自TBC1D7基因的一个、两个或更多个靶序列的双链分子。
此外，本发明组合物可以含有编码一个或多个双链分子的载体。例如，所述载体可以编码一种、两种或多种本发明双链分子。或者，本组合物可以含有多种载体，每种载体均编码不同的双链分子。此外，本双链分子可以作为脂质体包含在本组合物中。关于脂质体的细节，参见“治疗癌症的方法”项。
本发明药物组合物还可以包含常规的药用赋形剂和/或添加剂。合适的药用赋形剂包括稳定剂、抗氧化剂、渗透压调节剂、缓冲液和pH调节剂。适合的添加剂包括生理学生物相容性缓冲液(例如氨基丁三醇盐酸盐)、补加螯合剂(例如DTPA或DTPA-双酰胺)或钙螯合剂配合物(例如DTPA钙、CaNaDTPA-双酰胺)、或者，任选地，添加钙或钠盐(例如氯化钙、抗坏血酸酸钙、葡糖酸钙或乳酸钙)。本发明药物组合物可以进行包装以作为液体使用，或者也可以加以冷冻干燥。
对于固体组合物，可以采用常规的无毒性固体载体；例如，药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。
例如，用于口服施用的固体药物组合物可以含有上面所列的任何载体和赋形剂，以及10-95％的本发明的一种或多种双链分子，例如25-75％。用于气雾剂(吸入)施用的药物组合物可以含有以重量计0.01-20％，例如以重量计1-10％的包埋于上述脂质体中的一种或多种本发明双链分子以及推进剂(propellant)。还可以视需要包含载体；例如，用于鼻内递送的卵磷脂。
除了上述内容外，本组合物还可以包含其它药物活性成分，只要它们不抑制本双链分子的体内功能。例如，所述组合物可以包含通常用于治疗癌症的化疗剂。
本发明还提供了本发明双链核酸分子在制造用于治疗(过)表达TBC1D7基因的癌症的药物组合物中的用途。例如，本发明涉及下述双链核酸分子在制造用于治疗(过)表达TBC1D7基因的癌症(包括肺癌和食道癌)的药物组合物方面的用途，所述双链核酸分子抑制细胞中TBC1D7基因的(过)表达，所述细胞过表达该基因，所述分子包含彼此杂交以形成双链核酸分子的有义链和与其互补的反义链，并靶向选自SEQ ID NO：3和/或4的序列。
本发明还提供了在治疗(过)表达TBC1D7基因的癌症中使用的本发明的双链核酸分子。
本发明进一步提供了制造用于治疗(过)表达TBC1D7基因的癌症的药物组合物的方法或工艺，其中所述方法或工艺包括将药学或生理学可接受载体与作为活性成分的、抑制细胞中TBC1D7基因(过)表达的双链核酸分子配制在一起的步骤，所述细胞过表达该基因，所述分子包含相互杂交以形成双链核酸分子有义链和与其互补的反义链，并靶向选自SEQ ID NO：3和/或4的序列。
本发明还提供了制造用于治疗(过)表达TBC1D7基因的癌症的药物组合物的方法或工艺，其中该方法或工艺包括混合活性成分与药学或生理学可接受载体的步骤，其中该活性成分是抑制TBC1D7基因在细胞中表达的双链核酸分子，所述细胞过表达该基因，所述分子包含相互杂交以形成双链核酸分子有义链和与其互补的反义链，并靶向选自SEQ ID NO：3和/或4的序列。
(5)用于诊断TBC1D7介导的癌症的方法
发现与相应的正常组织相比，TBC1D7基因的表达在肺癌和食道癌组织中特异性升高(图1)。因此，在本说明书中鉴定的基因及其转录和翻译产物具有作为由TBC1D7基因介导的癌症的标志物，并通过测量从怀疑患有癌症的患者来源的样品中TBC1D7基因的表达实现的诊断效用。可以通过比较来源于受试者的样品与正常样品之间的TBC1D7表达水平来诊断或检测这些癌症。具体地，本发明提供了一种通过测定受试者中TBC1D7的表达水平来诊断或检测由TBC1D7介导的癌症的方法。可通过本方法诊断或检测的由TBC1D7促进的癌症包括肺癌和食道癌。肺癌包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌。
或者，本发明提供了用于检测或鉴定来源于受试者的组织样品中的癌细胞的方法，所述方法包括测定TBC1D7基因在来源于受试者的组织样品中的表达水平的步骤，其中与所述基因的正常对照水平相比，所述表达水平的升高指明组织中癌细胞的存在或怀疑。优选地，组织是肺或食道组织。
根据本发明，可以提供用于检查受试者状况的中间结果。这些中间结果可以与其它信息组合来帮助医生、护士或其它从业者来诊断受试者患有该疾病。或者，本发明可以用于检测来源于受试者的组织中的癌性细胞，并且给医生提供有用信息来诊断受试者患有该疾病。
例如，根据本发明，在关于自受试者获得的组织中存在癌细胞有疑问时，可以通过考虑TBC1D7基因的表达水平，加上疾病的不同方面，包括组织的病理学、血液中的已知肿瘤标志物的水平、和受试者的临床过程等来做出临床决定。例如，血液中的一些公知的诊断性肺癌和食道癌标志物包括ACT、CA19-9、CA50、CA72-4、CA130、CA602、CEA、DUPAN-2、IAP、KMO-1、NSE、SCC、SLX、Span-1、STN、TPA、细胞角蛋白19片段、和CYFRA 21-1。也就是说，在本发明的此具体的实施方案中，基因表达分析的结果起中间结果的作用，用于进一步诊断受试者的疾病状态。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于检测癌症的诊断标志的方法，所述方法包括检测TBC1D7基因在来源于受试者的生物学样品中的表达作为癌症(例如肺癌或食道癌)的诊断标志的步骤。
具体地，本发明提供了下列方法[1]-[10]：
[1]一种诊断癌症，例如由TBC1D7基因介导或促进的癌症的方法，其中所述方法包括下列步骤：
(a)检测TBC1D7在生物学样品中的表达水平；并
(b)将该基因与其正常对照水平相比表达水平的升高与该疾病相关联。
[2][1]的方法，其中所述表达水平比正常对照水平高至少10％。
[3][2]的方法，其中表达水平通过下列任一种方法来检测：
(a)检测编码TBC1D7多肽的mRNA；
(b)检测TBC1D7多肽；和
(c)检测TBC1D7多肽的生物学活性。
[1]的方法，其中所述癌症由TBC1D7过表达引起，或由TBC1D7介导或促进。
[4][1]的方法，其中所述癌症是肺癌或食道癌。
[5][4]的方法，其中所述肺癌是非小细胞肺癌或小细胞肺癌。
[6][3]的方法，其中通过检测探针与编码TBC1D7多肽的基因转录物的杂交来确定表达水平。
[7][3]的方法，其中通过检测抗体对TBC1D7多肽的结合来确定表达水平。
[8][1]的方法，其中所述生物学样品包括活组织检查物、痰或血液。
[9][1]的方法，其中来源于受试者的生物样品包括上皮细胞、血清、胸腔积液或食道粘液。
[10][1]的方法，其中来源于受试者的生物学样品包括癌细胞。
[11][1]的方法，其中来源于受试者的生物学样品包括癌性上皮细胞。
在下文中将对诊断癌症的方法进行更详细的描述。
通过本方法诊断的受试者可以是哺乳动物。例示性的哺乳动物包括但不限于例如人、非人灵长类、小鼠、大鼠、犬、猫、马和牛。
在进行本方法的过程中，自要诊断的受试者收集生物学样品来进行诊断。任何生物学材料都可以用作供测定的生物学样品，只要它包含TBC1D7基因的目标转录或翻译产物。所述生物学样品包括但不限于身体组织和体液，例如血液，诸如血清、痰、尿液和胸腔积液。在一些实施方案中，所述生物学样品含有包含上皮细胞(例如癌性上皮细胞或来源于怀疑为癌性的组织的上皮细胞)的细胞群。此外，若必要的话，可以从所获得的身体组织和体液纯化出所述细胞，然后用作生物学样品。
根据本发明，测定TBC1D7基因在来源于受试者的生物学样品中的表达水平。可以采用本领域已知的方法在转录(核酸)产物水平上确定表达水平。例如，可以通过杂交方法(例如Northern印迹分析)使用探针对TBC1D7基因的mRNA进行定量。所述检测可以在芯片或阵列上进行。阵列可以用于检测包括TBC1D7基因在内的多个基因(例如各种癌特异性基因)的表达水平。本领域技术人员可以利用TBC1D7的序列信息(SEQ ID NO：1；GenBank登录号NM_016495)来制备所述探针。例如，TBC1D7基因的cDNA可以用作探针。如果有必要的话，可以用合适的标记物，例如染料、荧光和同位素，对探针进行标记，并且基因表达水平可以作为发生了杂交的标记物的强度来加以检测(参见[实施例1]中(c)Northern印迹分析)。
此外，可以通过基于扩增的检测方法(例如RT-PCR)采用引物对TBC1D7基因的转录产物进行定量。所述引物也可以根据该基因可获得的序列信息来制备。例如，实施例中所使用的引物(SEQ ID NO：5和6)可以用于通过RT-PCR或Northern印迹的检测，但是本发明不局限于此(参见，[实施例1](b)半定量RT-PCR和(c)Northern印迹分析)。
具体地，用于本方法的探针或引物在严格的、中等严格的或低严格的条件下与TBC1D7基因的mRNA杂交。
或者，可以检测翻译产物以用于本发明的诊断。例如，可以测定TBC1D7蛋白的量。用于测定作为翻译产物的蛋白质量的方法包括采用特异性识别蛋白质的抗体的免疫测定方法。所述抗体可以是单克隆或多克隆的。此外，抗体的任何片段或修饰(例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等)可以用于检测，只要所述片段保留与TBC1D7蛋白的结合能力。这些用于检测蛋白质的抗体的制备方法是本领域公知的，并且本发明可以采用任何方法来制备所述抗体和其等同物(参见(2)“抗体定义”)。
作为基于TBC1D7的翻译产物来检测其表达水平的另一种方法，可以采用针对TBC1D7蛋白的抗体通过免疫组织化学分析来观察染色强度。即，观察到强染色指明存在的蛋白质增加并且同时TBC1D7表达水平高(参见，[实施例1]中(g)免疫组织化学和组织微阵列分析)。
此外，除了TBC1D7表达水平之外，也可以测定其它癌症相关基因(例如已知在癌症中差异表达的基因)的表达水平来改善诊断的准确性。
如果生物学样品中包括TBC1D7在内的癌症标记基因的表达水平比相应癌症标志基因(例如，在正常或非癌性细胞中)的对照水平增加，例如，10％、25％或50％；或增加到大于1.1倍、大于1.5倍、大于2.0倍、大于5.0倍、大于10.0倍或更多，则可以认为其表达水平增加。
对照水平可以与测试生物学样品同时确定，使用先前从已知疾病状态(癌性或非癌性)的受试者收集并保存的样品。或者，可以用基于对先前确定的已知疾病状态的受试者来源的样品中TBC1D7基因表达水平分析所获结果的统计方法确定对照水平。此外，所述对照水平可以是来自先前测试的细胞的表达模式数据库。此外，根据本发明的一个方面，可以将TBC1D7在生物学样品中的表达水平与多个对照水平进行比较，所述多个对照水平是从多个参比样品确定的。在一些实施方案中，对照水平采用参比样品来确定，所述参比样品来自与来源于受试者的生物学样品类似的组织类型。在一些实施方案中，采用已知疾病状态的群体中TBC1D7表达水平的标准值。标准值可以通过本领域公知的任何方法获得。例如，可以使用平均值+/-2S.D.或平均值+/-3S.D.的范围作为标准值。
在本发明语境下，从已知非癌性的生物学样品测定的对照水平称作“正常对照水平”。另一方面，如果从癌性生物学样品测定对照水平，则它会被称作“癌性对照水平”。
当TBC1D7表达水平与正常对照水平相比发生增加或类似于癌性对照水平时，可以将受试者诊断为患有或有风险发生癌症，例如由TBC1D7介导的癌症或由TBC1D7过表达引起的癌症。此外，在对TBC1D7基因表达水平进行比较的情况下，样品和癌性参比之间基因表达模式的相似性表明受试者患有或有风险发生癌症，例如由TBC1D7介导的癌症或由TBC1D7过表达引起的癌症。
可以依据对照核酸的表达水平对测试生物学样品表达水平和对照水平之间的差异进行标准化，所述对照核酸已知其表达水平不取决于细胞的癌或非癌状态而发生变化，例如持家基因。例示性的对照基因包括但不限于β肌动蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶和核糖体蛋白P1。
(6)用于评估TBC1D7介导的癌症的预后的方法
本发明部分上根据这一发现，即TBC1D7(过)表达与患有TBC1D7介导的癌症(例如肺癌或食道癌)的患者的更差预后显著相关。如此，本发明提供了测定或评价癌症(例如由TBC1D7介导的癌症或由TBC1D7过表达引起的癌症，例如肺癌和/或食道癌)患者预后的方法，其通过下述方式进行：检测TBC1D7基因在患者的生物学样品中的表达水平；将检测到的表达水平与对照水平比较；并将与对照水平相比增加的表达水平确定作为预后不良(不良存活)的指标。
在本文中，术语“预后”是指由病例性质和症状所提示的、对疾病可能的结果以及疾病恢复前景的预测。因而，较不利的(less favorable)、负面的或不良的预后被定义为治疗后存活期或存活率较低。相反，正面的、有利的、或良好的预后以提高的治疗后存活期或存活率定义。术语“评估预后”指预测、预报患者癌症的未来结果(例如恶性、治愈癌症的可能性、估计的存活时间等)、或者将给定的检测或测量与患者癌症的未来结果相联系的能力。例如，通过测定TBC1D7随时间的表达水平，能够预测患者的结果(例如，恶性的增加或减少、癌症等级的增加或减少、治愈癌症的可能性、存活等)。在本发明的语境下，短语“评估(或确定)预后”试图包括对癌症、行进，特别是癌症复发、转移性扩散以及病情复发的预测和可能性分析。本发明的用于评价预后的方法意图在临床上用于做出关于治疗方式的决定，所述治疗方式包括治疗性干预、诊断标准，例如疾病分期、和疾病监测以及对肿瘤性疾病转移或反复的监控。
所述方法所使用的来源于来源于患者的生物学样品可以是来源于要评价的受试者的任何样品，只要可以在该样品中检测到TBC1D7基因。在一些实施方案中，所述生物样品包含肺细胞(自肺或食道获得的细胞)。此外，所述生物学样品包括体液，例如痰、血液、血清、血浆、胸腔积液、食道粘液等。此外，所述样品可以是从组织纯化的细胞。所述生物样品可以在不同时间点从患者获得，包括治疗前、治疗中和/或治疗后。
根据本发明，显示了在来源于患者的生物学样品中测量到的TBC1D7基因的表达水平越高，治疗后缓解、恢复和/或存活的预后就越差，而且不良临床结果的可能性越高。如此，根据本方法，用于比较的“对照水平”可以是，例如，在接受任何种类的治疗后显示良好的或正面的癌症预后的个体或个体群体在接受该治疗前检出的TBC1D7基因表达水平，在本文中将其称为“良好预后对照水平”。或者，“对照水平”可以是在接受任何种类的治疗后显示不良的或负面的癌症预后的个体或个体群体在接受该治疗前检出的TBC1D7基因表达水平，在本文中将其称为“不良预后对照水平”。所述“对照水平”是单一表达模式，其衍生自单个参比群体，或者衍生自多种表达模式。如此，对照水平可以在下述基础上确定：在对癌症患者或已知疾病状态(预后良好或预后不良)的患者群体进行任何种类的治疗前，所检测到的TBC1D7基因表达水平。在一些实施方案中，所述癌症是肺癌。在一些实施方案中，采用TBC1D7基因在已知疾病状态的患者组中的表达水平的标准值。标准值可以通过本领域公知的任何方法获得。例如，平均值+/-2S.D.或平均值+/-3 S.D.的范围可以用作标准值。
对照水平可以与测试生物学样品同时测定，其通过使用在进行任何种类的治疗前预先从已知疾病状态(预后良好或预后不良)的癌症患者(对照或对照组)收集和保存的样品来进行。
或者，可以基于对先前从对照组收集和保存的样品中TBC1D7基因表达水平的分析所获的结果，用统计方法确定对照水平。此外，所述对照水平可以是来自先前测试的细胞或患者的表达模式数据库。此外，根据本发明的一个方面，可以将TBC1D7基因在生物学样品中的表达水平与多个对照水平进行比较，所述对照水平由多个参比样品测定。在一些实施方案中，所用的对照水平是用这样的参比样品来测定的，所述参比样品来自与来源于患者的生物学样品类似的组织类型。
根据本发明，TBC1D7基因的表达水平与良好预后对照水平的相似性表明患者的预后更有利，而与良好预后对照水平相比表达水平升高表明在治疗后缓解、恢复、存活和/或临床结果方面的更不利的、更差的预后。另一方面，与不良预后对照水平相比TBC1D7基因表达水平的降低表明患者的预后更有利，而表达水平与不良预后对照水平的相似性表明在治疗后缓解、恢复、存活和/或临床结果方面的更不利的、更差的预后。
当表达水平与对照水平相差大于1.0、1.5、2.0、5.0、10.0或更多倍时，TBC1D7基因在生物学样品中的表达水平可以被认为是有改变的(即升高的或降低的)。
可以将测试生物学样品的表达水平与对照水平之间的差异相对于对照例如持家基因标准化。例如，已知其表达水平在癌性和非癌性细胞之间没有差别的多核苷酸，包括编码β肌动蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶和核糖体蛋白P1的多核苷酸，可以用于将TBC1D7基因的表达水平标准化。
表达水平的确定可以通过采用本领域公知技术检测来源于患者的生物学样品中的基因转录物。通过本方法检测的基因转录物包括转录和翻译产物，例如mRNA和蛋白。例如，可以通过杂交，例如Northern印迹杂交分析，来检测TBC1D7基因的转录产物，所述杂交使用针对基因转录物的TBC1D7基因探针。所述检测可以在芯片或阵列上进行。阵列可以用于检测包括TBC1D7基因在内的多个基因的表达水平。作为另一个例子，该检测可以使用基于扩增的检测方法，例如基于逆转录的聚合酶链式反应(RT-PCR)，其采用TBC1D7基因的特异引物(参见，[实施例1](b)中半定量RT-PCR)。TBC1D7基因的特异探针或引物可以通过参考TBC1D7(SEQ ID NO：1)的全序列采用常规技术来设计和制备。例如，实施例中所使用的引物(SEQ ID NO：5和6)可以用于通过RT-PCR的检测，但是本发明不局限于此。
具体地，用于本方法的探针或引物在严格条件、中等严格或低严格条件下与TBC1D7基因的mRNA杂交。如这里使用的，短语“严格(杂交)条件”是指这样的条件，在该条件下，探针或引物将与其靶序列杂交，而不与其它序列杂交。严格条件是序列依赖性的，并且在不同情况下会有所不同。与较短序列相比，较长序列在更高的温度下观察到特异杂交。通常，在确定的离子强度和pH，所选择的严格条件的温度比特异序列的热解链温度(Tm)低约5摄氏度。Tm是这样的温度(在确定的离子强度、pH和核酸浓度下)，在该温度下，在平衡状态下与靶序列互补的探针中的50％与靶序列杂交。由于靶序列通常过量存在，因此在Tm下，平衡状态时50％的探针被占据。通常，严格条件会是那些条件，其中盐浓度小于约1.0M钠离子，通常是约0.01-1.0M钠离子(或其它盐)，pH在7.0-8.3，温度对于短探针或引物(例如10-50个核苷酸)为至少约30摄氏度，对于较长探针或引物为至少约60摄氏度。还可以采用添加去稳定剂例如甲酰胺来得到严格条件。
或者，可以检测翻译产物用于本发明的评估。例如，可以测定TBC1D7蛋白的量。用于测定作为翻译产物的蛋白质的量的方法包括采用特异识别TBC1D7蛋白的抗体的免疫测定方法。所述抗体可以是单克隆的或多克隆的。此外，抗体的任何片段或修饰(例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等)均可用于检测，只要所述片段保留与TBC1D7蛋白的结合能力。这些用于检测蛋白质的抗体的制备方法是本领域公知的，并且本发明可以采用任何方法来制备所述抗体和其等同物。作为另一种基于TBC1D7基因翻译产物检测其表达水平的方法，可以采用针对TBC1D7蛋白的抗体通过免疫组织化学分析观察染色强度。即，观察到强染色表示TBC1D7蛋白的存在增加并且同时TBC1D7基因的表达水平高。
此外，已知TBC1D7蛋白具有细胞增殖活性。因此，可以采用这些细胞增殖活性作为指标确定TBC1D7基因的表达水平。例如，在生物学样品存在条件下，对表达TBC1D7的细胞进行制备和培养，然后可以通过检测增殖速度或通过测量细胞周期或集落形成能力来确定生物学样品的细胞增殖活性。
此外，除了TBC1D7基因的表达水平之外，也可以测定其它肺细胞相关基因(例如已知在肺癌或食道癌中差异表达的基因)的表达水平来改善评估的准确性。这样的其它肺癌相关基因包括在WO 2004/031413和WO2005/090603中所描述的那些基因；这样的其它食道癌相关基因包括在WO2007/013671中所描述的那些基因。
根据本方法，要评估癌症预后的患者可以是哺乳动物，包括人、非人灵长类、小鼠、大鼠、犬、猫、马和牛。
或者，根据本发明，除了评估受试者预后的其它测试结果以外，还可以提供中间结果。这些中间结果可以帮助医生、护士或其他从业者评价、确定或估计受试者的预后。可以考虑将其它信息与通过本发明获得的中间结果组合来评价预后，包括受试者临床症状和身体状况。
(7)用于诊断癌症或评价癌症预后的试剂盒
本发明提供了用于诊断癌症或评估癌症预后的试剂盒。在一些实施方案中，所述癌症是由TBC1D7基因介导或由TBC1D7基因过表达引起，例如，肺癌和/或食道癌。具体地，所述试剂盒包含至少一种用于检测TBC1D7基因在来源于患者的生物学样品中的表达的试剂，所述试剂可以选自下组：
(a)用于检测TBC1D7基因的mRNA的试剂；
(b)用于检测TBC1D7蛋白的试剂；和
(c)用于检测TBC1D7蛋白的生物学活性的试剂。
用于检测TBC1D7基因的mRNA的合适的试剂包括特异性结合或鉴定TBC1D7 mRNA的核酸，例如，具有与TBC1D7 mRNA的一部分互补的序列的寡核苷酸。这些种类的寡核苷酸以TBC1D7 mRNA的特异性引物和探针为例。这些种类的寡核苷酸可以根据本领域公知的方法制备。如果有需要，可以将检测TBC1D7mRNA的试剂固定到固相基质上。此外，在试剂盒中可以包括超过一种用于检测TBC1D7mRNA的试剂。
另一方面，用于检测TBC1D7蛋白的适合的试剂包括针对TBC1D7蛋白的抗体。所述抗体可以是单克隆或多克隆的。此外，抗体的任何片段或修饰(例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等)都可以用作所述试剂，只要所述片段保留与TBC1D7蛋白的结合能力。制备这些种类的用于检测蛋白质的抗体的方法是本领域公知的，本发明可以采用任何方法来制备所述抗体和其等同物。此外，可以通过直接联接或间接标记技术用信号产生分子对抗体进行标记。用于标记抗体和检测抗体与其靶标结合的标记物和方法是本领域公知的，任何标记物和方法都可以用于本发明。此外，在试剂盒中可以包括超过一种用于检测TBC1D7蛋白的试剂。
此外，生物学活性的测定可以例如通过测量由生物学样品中表达的TBC1D7蛋白所引起的细胞增殖活性来进行。例如，在来源于患者的生物学样品的存在下培养细胞，然后通过检测增殖速度或通过测量细胞周期或集落形成能力来确定生物学样品的细胞增殖活性。如果有需要，可以将检测TBC1D7mRNA的试剂固定到固相基质上。此外，在试剂盒中可以包括超过一种用于检测TBC1D7蛋白的生物学活性的试剂。
所述试剂盒可以包含超过一种上述试剂。此外，所述试剂盒可以包含固相基质和用于结合针对TBC1D7基因的探针或针对TBC1D7蛋白的抗体的试剂、培养基以及培养细胞的容器、阳性和阴性对照试剂、以及用于检测针对TBC1D7蛋白的抗体的第二抗体。例如，获自良好预后或不良预后患者的组织样品可以充当有用的对照试剂。本发明的试剂盒可以进一步包括从商业和用户角度看想要的其它材料，包括缓冲液、稀释液、滤器、针头、注射器以及带有使用说明的包装插页(例如书面、磁带、CD-ROM等)。这些试剂等可以包含在带有标签的容器中。适合的容器包括瓶(bottle)、小瓶(vial)和试管。所述容器可以由各种材料形成，例如玻璃或塑料。
作为本发明的一个实施方案，当所述试剂是针对TBC1D7mRNA的探针时，可以将该试剂固定到固相基质(例如，多孔条)上以形成至少一个检测位点。多孔条的测量或检测区可以包括多个位点，每个位点均含有核酸(探针)。测试条还可以含有阴性和/或阳性对照的位点。或者，对照位点可以位于与测试条不同的条上。任选地，不同检测位点可以含有不同量的固定化核酸，即，在第一检测位点上的量较高，在随后的位点上量较低。在加入检验样品时，显示可检测信号的位点的数目可提供样品中存在的TBC1D7 mRNA的量的定量指示。所述检测位点可以配置成任何适合检测的形状，并且通常采用跨越测试条宽度的条状或点状。
本发明试剂盒可以进一步含有阳性对照样品或TBC1D7标准样品。可以通过收集TBC1D7阳性血液样品来制备本发明的阳性对照样品，然后测定那些TBC1D7水平。或者，可以将纯化的TBC1D7蛋白或多核苷酸添加到不含TBC1D7的血清中以形成阳性样品或TBC1D7标准品。在本发明中，纯化的TBC1D7可以是重组蛋白。阳性对照样品的TBC1D7水平例如大于截断值。
在下文中，将参考实施例对本发明进行更详细的描述。然而，下列材料、方法和实施方案仅说明本发明的一些方面，而绝不试图限制本发明的范围。这样，与本文中所描述的那些类似或等价的方法和材料可以用于本发明的实践或测试。
筛选方法
(1)用于筛选的测试化合物
在本发明的上下文中，要通过本筛选方法鉴定的试剂可为任一种化合物或者组合物。此外，根据本发明的筛选方法，暴露于细胞或蛋白质的测试剂或化合物可为单个化合物或者化合物的组合。当化合物的组合用在本方法中时，所述化合物可被相继接触或同时接触。
任何测试剂或化合物都可用在本发明的筛选方法中，所述测试剂或化合物例如细胞提取物、细胞培养上清液、发酵微生物的产物、海洋生物提取物、植物提取物、纯化蛋白或粗蛋白、肽、非肽化合物、合成的小分子化合物(包括核酸构建体，例如反义RNA、siRNA、核酶等)以及天然化合物。本发明的测试剂或化合物还可利用本领域公知的组合文库法的众多方法中任一种来获得，所述组合文库法包括
(1)生物学文库，
(2)空间可寻址的平行固相或液相文库，
(3)需要解卷积(deconvolution)的合成文库法，
(4)“一珠一化合物”(“one-bead one-compound”)文库法，和
(5)利用亲和层析选择的合成文库法。
利用亲和层析选择的生物学文库法限于肽文库，而其它4种方法适用于肽、非肽寡聚体或化合物的小分子文库(Lam，Anticancer Drug Des 1997，12：145-67)。用于分子文库合成的方法的例子可在本领域找到(DeWitt等，ProcNatl Acad Sci USA 1993，90：6909-13；Erb等，Proc Natl Acad Sci USA 1994，91：11422-6；Zuckermann等，J Med Chem 37：2678-85，1994；Cho等，Science 1993，261：1303-5；Carell等，Angew Chem Int Ed Engl 1994，33：2059；Carell等，Angew Chem Int Ed Engl 1994，33：2061；Gallop等，J Med Chem 1994，37：1233-51)。化合物的文库可存在于溶液中(参见Houghten，Bio/Techniques 1992，13：412-21)或珠子(Lam，Nature 1991，354：82-4)、芯片(Fodor，Nature 1993，364：555-6)、细菌(美国专利5,223,409)、孢子(美国专利5,571,698；5,403,484和5,223,409)、质粒(Cull等，Proc Natl Acad Sci USA 1992，89：1865-9)或噬菌体(Scott和Smith，Science 1990，249：386-90；Devlin，Science 1990，249：404-6；Cwirla等，Proc Natl Acad Sci USA 1990，87：6378-82；Felici，J Mol Biol 1991，222：301-10；美国专利申请2002-103360)上。
通过本发明任何筛选方法筛选到的化合物的一部分结构通过添加、删除、和/或置换方式被转换而得到的化合物，包括在通过本发明筛选方法鉴定的作用剂之内。
此外，当所筛选的测试剂或化合物是蛋白质时，为了获得编码该蛋白质的DNA，可以确定蛋白质的全部氨基酸序列，以此推定编码蛋白质的核酸序列，或者可以分析所得蛋白质的部分氨基酸序列，根据该序列制备寡DNA作为探针，并用该探针筛选cDNA文库，以获得编码该蛋白质的DNA。所得的DNA在制备作为用于治疗或预防癌症的候选物的测试剂或化合物方面得到应用。
可用于本说明书所述的筛选中的测试剂或化合物还可以是抗体或非抗体结合蛋白，其与TBC1D7蛋白或TBC1D7部分肽特异性结合，所述TBC1D7部分肽没有与配偶物结合的活性。所述部分蛋白或抗体可利用本说明书中所述的方法制备(参见“定义”中(1)癌症相关基因和癌症相关蛋白，及其功能等同物或者参见“抗体”)，可测试它们阻断所述蛋白质与其结合配偶结合的能力。
(i)分子建模
通过对已知具有所寻求特性的化合物的分子结构，和/或要抑制的靶分子的分子结构的了解，很容易构建测试剂/化合物文库。初筛适合于进一步评定的测试剂或化合物的一种方法是测试剂/化合物与其靶标之间相互作用的计算机建模。
计算机建模技术容许针对选定分子的三维原子结构的可视化以及会与该分子相互作用的新化合物的合理设计。三维构建典型地依赖于从选定分子的x-射线晶体分析或NMR成像而来的数据。分子动力学需要力场数据。计算机图形***容许预测新化合物如何会连接靶分子，以及实验操作化合物和靶分子的结构以优化结合特异性。为了预测当分子和化合物之一或二者发生细小改变时分子-化合物相互作用是什么样的，需要分子力学软件和计算密集型计算机，它们通常耦联于分子设计程序与用户之间的用户友好的、菜单驱动的界面。
通常以上描述的分子建模***的例子包括CHARMm和QUANTA程序，Polygen公司，沃尔瑟姆(Waltham)，马萨诸塞州(Mass.)。CHARMm实施能量最低化和分子动力学功能。QUANTA实施构建、图形建模和分子结构分析。QUANTA容许交互式构建、修饰、可视化和分析分子彼此间的行为。
有许多文章综述了与特定蛋白质相互作用的药物的计算机建模，例如Rotivinen等Acta Pharmaceutica Fennica 1988，97：159-66；Ripka，NewScientist 1988，54-8；McKinlay和Rossmann，Annu Rev Pharmacol Toxiciol 1989，29：111-22；Perry和Davies，Prog Clin Biol Res 1989，291：189-93；Lewis和Dean，Proc R Soc Lond 1989，236：125-40，141-62；以及关于核酸组分的模型受体，Askew等，JAm Chem Soc 1989，111：1082-90。
其它可筛选并图形描述化学物质的计算机程序可以从例如Mississauga，Ontario，Canada的BioDesign，Inc.，Pasadena，Calif.，Allelix，Inc公司和Cambridge，Ontario的Hypercube，Inc.等公司获取。参见例如DesJarlais等，JMed Chem 1988，31：722-9；Meng等，J Computer Chem 1992，13：505-24；Meng等，Proteins 1993，17：266-78；Shoichet等，Science 1993，259：1445-50。
一旦TBC1D7活性的抑制剂得以鉴定，则可根据所鉴定抑制剂的化学结构，应用组合化学技术来构建任何数目的变体，如下所述。利用本发明的方法，可筛选产生的候选抑制剂，或“测试剂或化合物”的文库，以鉴定文库中破坏TBC1D7活性的测试剂或化合物。
(ii)组合化学合成
测试剂或化合物的组合文库可以作为合理药物设计程序(其涉及有关TBC1D7活性的已知抑制剂中存在的核心结构的知识)的一部分来制备。这种方法使得文库保持合理的规模，有助于高通量筛选。或者，可通过简单地合成构成文库的分子家族的所有排列，构建简单的、特别是短的聚合物型分子文库。后面一种方法的例子是所有长度为6个氨基酸的肽的文库。所述肽文库可包括每一种6氨基酸序列的排列。这种类型的文库称作线性组合化学文库。
组合化学文库的制备是本领域技术人员公知的，可以通过化学或生物合成来产生。组合化学文库包括但不仅限于肽文库(参见例如美国专利5,010,175；Furka，Int J Pept Prot Res 1991，37：487-93；Houghten等，Nature1991，354：84-6)。也可以使用其它用于产生化学多样性文库的化学。这些化学包括，但不仅限于肽(例如PCT公布文本WO 91/19735)、编码的肽(例如WO 93/20242)、随机生物寡聚体(例如WO 92/00091)、苯并二氮卓(benzodiazepines)(例如美国专利5,288,514)，Diversomer例如乙内酰脲、苯并二氮卓和二肽(DeWitt等，Proc Natl Acad Sci USA 1993，90：6909-13)、插烯型(vinylogous)多肽(Hagihara等，J Amer Chem Soc 1992，114：6568)、具有葡萄糖骨架(scaffolding)的非肽类肽模拟物(Hirschmann等，J Amer Chem Soc 1992，114：9217-8)、小化合物文库的类似物有机合成(analogous organic synthese)(Chen等，J.Amer Chem Soc 1994，116：2661)、寡聚氨基甲酸盐(Cho等，Science1993，261：1303)、和/或肽酰膦酸酯(peptidylphosphonates)(Campbell等，J OrgChem 1994，59：658)、核酸文库(参见Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology 1990-2008John Wiley Intersciences；Sambrook和Russel，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd Ed.2001，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，USA)、肽核酸文库(参见例如美国专利5,539,083)、抗体文库(参见例如Vaughan等，Nature Biotechnology 1996，14(3)：309-14和PCT/US96/10287)、碳水化合物文库(参见例如Liang等，Science 1996，274：1520-22；美国专利5,593,853)、和有机小分子文库(参见例如苯并二氮卓，Gordon EM.Curr Opin Biotechnol.1995年12月1日；6(6)：624-31；类异戊二烯(isoprenoids)，美国专利5,569,588；噻唑烷酮(thiazolidinones)和偏硫杂氮杂环己烷(metathiazanone)，美国专利5,549,974；吡咯烷(pyrrolidines)，美国专利5,525,735和5,519,134；吗啉代化合物，美国专利5,506,337；苯并二氮卓，5,288,514；等)。
(iii)其它候选物
另一种方法利用重组细菌噬菌体来制备文库。利用“噬菌体方法”(Scott和Smith，Science 1990，249：386-90；Cwirla等，Proc Natl Acad Sci USA 1990，87：6378-82；Devlin等，Science 1990，249：404-6)，可构建很大的文库(例如106-108个化学实体)。第二种方法主要利用化学法，其中例子有Geysen法(Geysen等，Molecular Immunology 1986，23：709-15；Geysen等，J Immunologic Method 1987，102：259-74)；和Fodor等(Science 1991，251：767-73)的方法。Furka等(14th International Congress of Biochemistry 1988，第5卷，摘要FR：013；Furka，Int J Peptide Protein Res 1991，37：487-93)，Houghten(美国专利4,631,211)以及Rutter等(美国专利5,010,175)描述了制备可作为激动剂或拮抗剂被测试的肽混合物的方法。
适体是由紧密结合特定分子靶标的核酸构成的大分子。Tuerk和Gold(Science.249：505-510(1990))披露了用于选择适体的SELEX(配体指数级富集的***进化)方法。在SELEX方法中，可以使用大的核酸分子文库(例如1015种不同分子)来进行筛选。
2)筛选方法
(i)通用筛选方法
可以通过例如免疫沉淀来筛选结合TBC1D7蛋白的化合物。在免疫沉淀中，通过将抗体或非抗体结合蛋白添加至利用适当去污剂制备的细胞裂解物来形成免疫复合物。免疫复合物由多肽、具有对多肽亲合力的多肽，以及抗体或非抗体结合蛋白组成。除了利用针对上述表位的抗体，免疫沉淀还可以利用针对多肽的抗体来进行，所述抗体可如上所述制备(参见抗体)。
当抗体是小鼠IgG抗体时，可例如利用蛋白A Sepharose或蛋白GSepharose沉淀免疫复合物。如果将本发明的多肽制备成与表位例如GST的融合蛋白，则可利用与这些表位特异性结合的物质(例如谷胱甘肽-Sepharose4B)，通过与利用针对多肽的抗体相同的方式形成免疫复合物。免疫沉淀可通过例如采用或根据文献中的方法来进行(Harlow和Lane，Antibodies，511-52，Cold Spring Harbor Laboratory publications，New York(1988))。
SDS-PAGE通常用于分析免疫沉淀的蛋白质，而结合的蛋白质可利用适当浓度的凝胶通过蛋白质的分子量来分析。由于与多肽结合的蛋白质难以用通常的染色法(例如考马斯染色法或银染色法)检测，所以可通过在含有放射性同位素(35S-甲硫氨酸或35S-半胱氨酸)的培养基中培养细胞、标记细胞中的蛋白质，并检测所述蛋白质，来改善蛋白质的检测灵敏度。靶蛋白可直接从SDS聚丙烯酰胺凝胶中纯化，当已经揭示蛋白质的分子量时，可确定其序列。
作为利用多肽筛选与TBC1D7多肽结合的蛋白质的方法，可以使用例如West-Western印迹分析(Skolnik等，Cell 65：83-90(1991))。具体地，可通过以下步骤获得与TBC1D7多肽结合的蛋白质：利用噬菌体载体(例如ZAP)从预期表达与TBC1D7多肽结合的蛋白质的细胞、组织、器官(参见定义中(1)癌症相关基因和癌症相关蛋白，及其功能等同物)或培养细胞中制备cDNA文库，在LB-琼脂糖上表达蛋白质，使表达的蛋白质固定在滤膜上，使纯化并标记的TBC1D7多肽与以上滤膜起反应，以及依据标志物来检测表达与TBC1D7多肽结合的蛋白质的噬斑。TBC1D7多肽可利用生物素与亲合素之间的结合来标记，或者利用与TBC1D7多肽特异性结合的抗体，或与TBC1D7多肽融合的肽或多肽(例如GST)来标记。也可使用利用放射性同位素或荧光等的方法。
本说明书中使用术语“标记物”和“可检测标记物”来指可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电、光学或化学方法检测的任意组合物。所述标志物包括以标记的链霉亲合素偶联物染色的生物素、磁珠(例如DYNABEADSTM)、荧光染料(例如荧光素、德克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白、异硫氰酸荧光素(FITC)等)，放射性标记物(例如3H、125I、35S、14C32P或33P)、酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、和其它通常用在ELISA中的酶)、以及量热标志物，例如胶体金或有色玻璃或者塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、胶乳等)珠子。教导所述标记物的应用的专利包括美国专利号3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,275,149；和4,366,241。检测所述标记物的方法是本领域技术人员众所周知的。因此，例如，放射性标记物可利用胶片或闪烁计数器检测，荧光标记可利用光检测器测定发光来检测。酶标记物通常通过为酶提供底物并检测酶作用于底物产生的反应产物来检测，量热标记物通过简单地使有色标志物显现来加以检测。
或者，在本发明筛选方法的另一个实施方案中，可使用利用细胞的双杂交***(“MATCHMAKER双杂交***”，“哺乳动物MATCHMAKER双杂交测定试剂盒”、“MATCHMAKER单杂交***”(Clontech)；“HybriZAP双杂交载体***”(Stratagene)；参考文献“Dalton和Treisman，Cell 68：597-612(1992)”，“Fields和Sternglanz，Trends Genet 10：286-92(1994)”)。
在双杂交***中，本发明的多肽与SRF-结合区或GAL4-结合区融合，并在酵母细胞中表达。从预期表达与本发明多肽结合的蛋白的细胞制备cDNA文库，从而使该文库在被表达时与VP16或GAL4转录激活区融合。然后将所述cDNA文库导入上述酵母细胞，从检测到的阳性克隆分离源自文库的cDNA(当与本发明多肽结合的蛋白质在酵母细胞中表达时，两者的结合激活报告基因，使得阳性克隆可检测到)。由cDNA编码的蛋白质可通过将上述分离的cDNA导入大肠杆菌并表达所述蛋白从而制备。
除HIS3基因外，例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、萤光素酶基因等也可用作报告基因。
还可以利用亲和层析筛选与TBC1D7多肽结合的化合物。例如，可将TBC1D7多肽固定在亲和柱的载体上，将含有能够与TBC1D7多肽结合的蛋白质的测试化合物施加到所述柱上。本说明书中测试化合物可例如为细胞提取物、细胞裂解物等。测试化合物上样后，洗柱，可制得结合于TBC1D7多肽的化合物。
当所述测试化合物为蛋白质时，分析获得的蛋白质的氨基酸序列，根据所述序列合成寡DNA，利用所述寡DNA作为探针筛选cDNA文库从而得到编码蛋白质的DNA。
利用表面等离子体共振现象的生物传感器可以在本发明中用作检测或定量结合化合物的手段。当使用这种生物传感器时，可以仅使用微量并且没有标记的多肽(例如BIAcore，Pharmacia)，以表面等离子体共振信号的形式对本发明多肽与测试化合物间的相互作用进行实时的观察。因此，使用生物传感器，例如BIAcore，有可能对TBC1D7多肽与测试化合物间的结合进行评估。
对于抑制TBC1D7蛋白与其结合配偶(例如RAB17、14-3-3zeta、TSC1)之间结合的化合物的筛选方法，可以使用本领域技术人员众所周知的许多方法。例如，筛选可以作为体外测定***(例如细胞***)进行。更具体地，首先，使TBC1D7蛋白或其结合配偶结合到载体上，再把另一蛋白与测试化合物一起加入。例如使RAB17多肽、14-3-3zeta多肽或TSC1多肽结合到载体上，将结合配偶多肽与测试化合物一起加入。接着，温育、洗涤混合物，检测和/或测量与载体结合的另一蛋白。有希望的候选化合物能抑制TBC1D7多肽与上文所提及的结合配偶之间的结合。在这里，TBC1D7、RAB17、14-3-3zeta、和TSC1不仅可以以天然蛋白质形式制备，而且还可以通过基因重组技术以重组蛋白形式制备。可以例如通过亲和层析来制备天然蛋白质。另一方面，可以通过培养用编码TBC1D7、RAB17、14-3-3zeta、或TSC1的DNA转化的细胞以在其中表达蛋白质，然后将其回收来制备重组蛋白。
可以使用针对TBC1D7或结合配偶的抗体来检测或测量TBC1D7多肽与上文所提及的结合配偶之间的结合。例如，在使支持物上固定化的结合配偶与测试化合物接触后，添加TBC1D7，温育并清洗，并可以使用针对TBC1D7多肽的抗体来进行检测或测量。或者，可以将TBC1D7多肽固定化于支持物上，并可以使用针对结合配偶的抗体来进行检测或测量。在本筛选中使用抗体的情况下，优选用本说明书中所提及的标记物质之一标记抗体，并基于标记物质来检测或测量所述抗体。或者，可以使用针对TBC1D7或结合配偶的抗体作为第一抗体，以用标记物质标记的第二抗体检测它。此外，可以使用蛋白G或蛋白A柱来检测或测量本发明筛选中与蛋白质结合的抗体。
在本发明的上下文中，对两种蛋白质之间“结合的抑制”指至少降低蛋白质间的结合。如此，在某些情况中，与适当的(例如，未用测试化合物处理或者来自非癌症样品或来自癌症样品的)对照相比较，在测试剂或化合物存在下样品中结合对的百分比会降低。与对照样品中结合对相比较，所述结合的蛋白质降低的量可例如为小于90％、80％、70％、60％、50％、40％、25％、10％、5％、1％或更小(例如0％)。
可用于结合蛋白质的支持物的例子包括例如不溶性多糖，例如琼脂糖、纤维素和右旋糖苷；及合成树脂，例如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯和硅橡胶；例如，可使用由以上材料制备的商业上可得到的珠子和平板(例如多孔板、生物传感器芯片等)。当使用珠子时，可将它们填充至柱子中。或者，磁珠的使用也是本领域公知的，它使得人们能够通过磁性容易地分离结合在珠子上的蛋白质。
蛋白质与支持物的结合可以例如根据常规方法进行，例如化学键合和物理吸附。或者，可通过特异性识别蛋白质的抗体使蛋白质与支持物结合。此外，蛋白质与支持物的结合还可依赖亲合素与生物素来进行。蛋白质之间的结合在缓冲液(例如但不限于磷酸盐缓冲液和Tris缓冲液，只要缓冲液不抑制蛋白质之间的结合)实施。
筛选当固定的多肽暴露时与合成化学化合物，或天然物质库，或随机噬菌体肽展示文库结合的分子的方法，以及根据组合化学技术利用高通量筛选不仅分离蛋白质还有与蛋白质结合的化合物(包括激动剂和拮抗剂)的方法(Wrighton等，Science 273：458-63(1996)；Verdine，Nature 384：11-3(1996))，是本领域技术人员众所周知的。
此外，多肽或其功能等同物的磷酸化水平可根据本领域公知的任何方法检测。例如，使测试化合物与多肽表达细胞接触，将所述细胞温育足够长时间使得多肽磷酸化，然后可检测磷酸化多肽的量。或者，使测试化合物与多肽在体外接触，在容许多肽磷酸化的条件下温育所述多肽，然后可检测磷酸化多肽的量(参见(14)体外和体内激酶测定法)。
在本发明中，可以在磷酸盐供体(例如ATP)存在下温育底物和酶蛋白来提供适合于磷酸化的条件。适合于磷酸化的条件还包括培养表达多肽的细胞的条件。例如，所述细胞是包含表达载体的转化子细胞，所述表达载体包括编码TBC1D7多肽的多核苷酸(参见定义中(1)癌症相关基因和癌症相关蛋白，及其功能等同物)。温育后，可例如用识别磷酸化底物的抗体或通过检测由ATP磷酸盐供体传递的标记的γ-磷酸盐来检测底物的磷酸化水平。在检测磷酸化底物之前，可将底物与其它成分或转化子细胞的细胞裂解物分离。例如，可利用凝胶电泳分离底物。或者，底物可通过与含针对底物的抗体的载体接触而被捕获。
为检测磷酸化的蛋白质，可使用SDS-PAGE或免疫沉淀。此外，可使用识别磷酸化残基的抗体或传递的标记的磷酸盐来检测磷酸化蛋白水平。任何利用识别磷酸化多肽的抗体的免疫学技术都可用于检测。ELISA或用识别磷酸化多肽的抗体的免疫印迹法可用于本发明。当使用标记的磷酸供体时，可通过追踪所述标记物来检测底物的磷酸化水平。例如，经放射性标记的ATP(例如32P-ATP)可用作磷酸供体，其中分离的底物的放射性与底物的磷酸化水平相关。或者，可使用特异性识别磷酸化底物与非磷酸化底物的抗体来检测磷酸化底物。
如果检测到的与测试化合物接触的磷酸化TBC1D7多肽的量相对于未与测试化合物接触检测到的量降低，则认为测试化合物抑制TBC1D7蛋白的多肽磷酸化，从而具有肺癌和/或食道癌抑制能力。在这里，当与未与测试剂或化合物接触的细胞的检测到的磷酸化水平相比较，磷酸化水平降低例如10％、25％或50％，或至少0.1倍、至少0.2倍、至少1倍、至少2倍、至少5倍或至少12倍或更多时，可认为是磷酸化水平是“降低的”。例如，Student氏t测验(Student’s t-test)、Mann-Whitney U检验或ANOVA可用于统计分析。
此外，多肽或其功能等同物的表达水平可根据本领域公知的任意方法来检测。例如，可使用报告基因测定法。合适的报告基因和宿主细胞是本领域众所周知的。可利用TBC1D7基因或其下游基因的转录调节区来制备筛选所需的报告构建体。当所述基因的转录调节区已为本领域技术人员公知时，可通过利用以前的序列信息制备报告构建体。当所述转录调节区还未经鉴定时，可根据基因的核苷酸序列信息从基因组文库分离包含转录调节区的核苷酸区段。具体地，可通过使报告基因序列连接到感兴趣的TBC1D7基因的转录调节区来制备筛选所需的报告构建体。TBC1D7基因的转录调节区是从起始密码子起到上游至少500bp(例如1000bp，例如上游5000bp或10000bp)的区域。包含转录调节区的核苷酸区段可从基因组文库分离或者可通过PCR扩增。鉴定转录调节区的方法以及测定法规程是众所周知的(Sambrook和Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，第17章，2001，ColdSprings Harbor Laboratory Press)。
多种低通量和高通量酶测定形式是本领域公知的，可容易地加以调适以用于检测或测量TBC1D7多肽的磷酸化水平。对于高通量测定法，可方便地使底物固定在固体支持物上。反应后，可利用上文所述的方法检测固体支持物上的磷酸化底物。或者，可在溶液中进行接触步骤，然后可使底物固定在固体支持物上，并检测磷酸化底物。为利于所述测定，可用链霉亲合素包被固体支持物，用生物素标记底物，或者可用针对底物的抗体包被固体载体。技术人员可根据筛选所需的通量容量确定合适的测定形式。
本发明的测定法还适合于有利于高通量筛选的自动化程序。已开发了许多众所周知的机器人***用于液相化学。这些***包括自动化工作站如由Takeda Chemical Industries，Ltd.(大阪，日本)开发的自动化合成装置，和许多利用机器臂的机器人***(Zymate II，Zymark Corporation，Hopkinton，Mass.；Orca，Hewlett Packard，Palo Alto，Calif.)，它们模拟由化学家进行的手工合成操作。相关领域技术人员容易想到对这些装置进行什么性质的改变(若有的话)及如何实现，以使它们如本文所讨论的那样运行。另外，很多组合文库本身是商业上可得到的(参见例如ComGenex，Princeton，N.J.，Asinex，Moscow，Ru，Tripos，Inc.，St.Louis，MO，ChemStar，Ltd，Moscow，RU，3DPharmaceuticals，Exton，PA，Martek Biosciences，Columbia，MD等)。
(ii)筛选结合TBC1D7蛋白的化合物
在本发明中，检测到了TBC1D7在肺癌和食道癌中过表达，尽管它们在正常器官(除睾丸外)中无表达(图1)。因此，可以利用TBC1D7基因、由该基因编码的蛋白质、或该基因的转录调节区，筛选能改变该基因的表达或由该基因编码的多肽的生物活性的化合物。这样的化合物用作药物治疗或预防肺癌和食道癌，或者用作检测试剂用于诊断肺癌和食道癌以及评估肺癌和/或食道癌患者的预后。
具体地，本发明提供利用TBC1D7多肽来筛选可用于诊断、治疗或预防癌症的作用剂或化合物的方法。该筛选方法的一个实施方案包括以下步骤：
(a)使测试剂或化合物与选自TBC1D7蛋白的多肽或其片段接触；
(b)检测多肽与所述测试剂或化合物之间的结合；
(c)选择与步骤(a)中所述多肽结合的测试剂或化合物。
依照本发明，可以评估候选作用剂或化合物对抑制结合TBC1D7蛋白，或候选作用剂或化合物用于治疗或预防与TBC1D7有关的癌症(例如肺癌和食道癌)的治疗效果。因此，本发明还提供了一种使用TBC1D7多肽或其片段来筛选用于抑制细胞增殖的候选作用剂或化合物，或用于治疗或预防癌症(例如肺癌和食道癌)的候选作用剂或化合物的方法，包括下列步骤：
a)使测试剂或化合物与TBC1D7多肽或其功能片段接触；并
b)检测多肽与测试剂或化合物之间的结合，并
c)将b)的结合与测试剂或化合物的治疗效果关联起来。
在本发明中，可以将治疗效果与测试剂或化合物针对TBC1D7多肽(或其片段)的结合特性关联起来。例如，当测试剂或化合物结合TBC1D7多肽(或其片段)时，可以将测试剂或化合物鉴定或选择为具有治疗效果的测试剂或化合物。或者，当测试剂或化合物不结合TBC1D7多肽(或其片段)时，可以将测试剂或化合物鉴定为没有显著治疗效果的作用剂或化合物。
本发明的方法将在下文更详细地描述。
要用于筛选的TBC1D7多肽可为重组多肽或者源自天然的蛋白质或其部分肽。与测试化合物接触的多肽可例如为纯化多肽、可溶性蛋白质、与载体结合的形式，或与其它多肽融合的融合蛋白。
作为利用TBC1D7多肽筛选蛋白质，例如与TBC1D7多肽结合的蛋白质的方法，可使用本领域技术人员众所周知的许多方法。所述筛选可例如用免疫沉淀方法进行。通过将所述基因***用于外来基因的表达载体，例如pSV2neo、pcDNA I、pcDNA3.1、pCAGGS和pCD8，使编码TBC1D7多肽的基因在宿主(例如动物)细胞等中表达。
要用于表达的启动子可为任何通常可使用的启动子，包括例如SV40早期启动子(Rigby于Williamson(编)，Genetic Engineering，第3卷Academic Press，London，83-141(1982))、EF-α启动子(Kim等，Gene 91：217-23(1990))、CAG启动子(Niwa等，Gene 108：193(1991))、RSV LTR启动子(Cullen，Methods in Enzymology 152：684-704(1987))、SRα启动子(Takebe等，Mol Cell Biol 8：466(1988))、CMV立即早期启动子(Seed和Aruffo，Proc Natl Acad Sci USA 84：3365-9(1987))、SV40晚期启动子(Gheysen和Fiers，J Mol Appl Genet 1：385-94(1982))、腺病毒晚期启动子(Kaufman等，Mol Cell Biol 9：946(1989))、HSV TK启动子等。
基因导入宿主细胞以表达外来基因可根据任意方法进行，例如电穿孔法(Chu等，Nucleic Acids Res 15：1311-26(1987))、磷酸钙法(Chen和Okayama，Mol Cell Biol 7：2745-52(1987))、DEAE右旋糖苷法(Lopata等，Nucleic Acids Res 12：5707-17(1984)；Sussman和Milman，Mol Cell Biol 4：1641-3(1984))、Lipofectin法(Derijard B.，Cell 76：1025-37(1994)；Lamb等，Nature Genetics 5：22-30(1993)：Rabindran等，Science 259：230-4(1993))等。
通过引入特异性已经被揭示的单克隆抗体的表位至多肽的N-末端或C-末端，可使由TBC1D7基因编码的多肽表达为包括单克隆抗体的识别位点(表位)的融合蛋白。可使用商业上可得到的表位-抗体***(Experimental Medicine 13：85-90(1995))。可表达例如与β-半乳糖苷酶、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽S-转移酶、绿色荧光蛋白(GFP)等的融合蛋白的载体(通过使用其多克隆位点)是商业上可得到的。而且，还报道了通过这样的方式而制备的融合蛋白：仅引入由数个至十二个(a dozen)氨基酸组成的小型表位，以便不会通过融合改变TBC1D7多肽的性质。表位例如多组氨酸(His标签)、流感凝集素HA、人c-myc、FLAG、水疱性口炎病毒糖蛋白(VSV-GP)、T7基因10蛋白(T7标签)、人单纯疱疹病毒糖蛋白(HSV标签)、E-标签(单克隆噬菌体上的表位)等，以及识别它们的单克隆抗体，可用作表位-抗体***，用于筛选与TBC1D7多肽结合的蛋白质(Experimental Medicine 13：85-90(1995))。
在免疫沉淀中，将这些抗体添加到利用适当去污剂制备的细胞裂解物中，以形成免疫复合物。所述免疫复合物由TBC1D7多肽、包括与多肽结合能力的多肽、及抗体组成。除了利用针对上述表位的抗体之外，还可利用针对TBC1D7多肽的抗体进行免疫沉淀，这样的抗体可如上所述制备。当抗体是小鼠IgG抗体时，可例如利用蛋白A Sepharose或蛋白G Sepharose来沉淀免疫复合物。如果将由TBC1D7基因编码的多肽制备成与表位(例如GST)融合的融合蛋白，则可利用与这些表位特异性结合的物质(例如谷胱甘肽-Sepharose 4B)，以与利用针对TBC1D7多肽的抗体相同的方式形成免疫复合物。
免疫沉淀可通过例如采用或根据文献中的方法来进行(Harlow和Lane，Antibodies，511-52，Cold Spring Harbor Laboratory publications，New York(1988))。
SDS-PAGE通常用于分析免疫沉淀的蛋白质，可利用适当浓度的凝胶依据蛋白质的分子量来分析结合蛋白。由于与TBC1D7多肽结合的蛋白质难以用通常的染色法(例如考马斯染色法或银染色法)检测，可通过在含有放射性同位素(35S-甲硫氨酸或35S-半胱氨酸)的培养基中培养细胞，标记细胞中的蛋白质及检测所述蛋白质，来提高对该蛋白质的检测灵敏度。可直接从SDS聚丙烯酰胺凝胶中纯化靶蛋白，当蛋白质的分子量已被揭示时，可确定其序列。
作为利用多肽筛选与TBC1D7多肽结合的蛋白质的方法，可以使用例如West-Western印迹分析(Skolnik等，Cell 65：83-90(1991))。具体地，可通过以下方式获得与TBC1D7多肽结合的蛋白质：利用噬菌体载体(例如ZAP)从预期表达与TBC1D7多肽结合的蛋白质的培养细胞(例如肺癌细胞系或食道癌细胞系)中制备cDNA文库，在LB-琼脂糖上表达所述蛋白质，使表达的蛋白质固定在滤膜上，使纯化并标记的TBC1D7多肽与以上滤膜反应，以及根据标志物检测表达与TBC1D7多肽结合的蛋白质的噬斑。本发明的多肽可利用生物素与亲合素之间的结合来标记，或者利用与TBC1D7多肽或与TBC1D7多肽融合的肽或多肽(例如GST)特异性结合的抗体来标记。也可使用利用放射性同位素或荧光等的方法。
或者，在本发明筛选方法的另一个实施方案中，可使用利用细胞的双杂交***(“MATCHMAKER双杂交***”、“哺乳动物MATCHMAKER双杂交测定试剂盒”、“MATCHMAKER单杂交***”(Clontech)；“HybriZAP双杂交载体***”(Stratagene)；参考文献“Dalton和Treisman，Cell 68：597-612(1992)”、“Fields和Sternglanz，Trends Genet 10：286-92(1994)”)。
在所述双杂交***中，本发明的多肽与SRF-结合区或GAL4-结合区融合，并在酵母细胞中表达。从预期表达与本发明多肽结合的蛋白质的细胞制备cDNA文库，以便所述文库当被表达时与VP16或GAL4转录激活区融合。然后将所述cDNA文库导入上述酵母细胞，从检测到的阳性克隆分离源自文库的cDNA(当与本发明多肽结合的蛋白质在酵母细胞中表达时，两者的结合激活报告基因，使得阳性克隆可检测到)。由cDNA编码的蛋白质可通过将上述分离的cDNA导入大肠杆菌并表达所述蛋白从而制备。除HIS3基因外，例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、萤光素酶基因等也可用作报告基因。
还可以利用亲和层析筛选与由TBC1D7基因编码的多肽结合的化合物。例如，可将本发明的多肽固定在亲和柱的载体上，将含有能够与本发明的多肽结合的蛋白质的测试化合物施加于所述柱。本文中的测试化合物可为例如细胞提取物、细胞裂解物等。测试化合物上样后，洗柱，并可制备与本发明的多肽结合的化合物。当所述测试化合物为蛋白质时，分析获得的蛋白质的氨基酸序列，根据所述序列合成寡DNA，利用所述寡DNA作为探针筛选cDNA文库从而得到编码蛋白质的DNA。
利用表面等离子体共振现象的生物传感器可以在本发明中用作检测或定量结合化合物的手段。当使用这种生物传感器时，可以仅使用微量并且没有标记的多肽，以表面等离子体共振信号的形式对本发明多肽与测试化合物间的相互作用进行实时的观察(例如BIAcore，Pharmacia)。因此，使用生物传感器，例如BIAcore，有可能对本发明多肽与测试化合物间的结合进行评估。
筛选当固定的多肽暴露时与合成化学化合物，或天然物质库，或随机噬菌体肽展示文库结合的分子的方法，以及根据组合化学技术利用高通量筛选不仅分离蛋白质还有与TBC1D7蛋白结合的化合物(包括激动剂和拮抗剂)的方法(Wrighton等，Science 273：458-63(1996)；Verdine，Nature 384：11-3(1996))是本领域技术人员众所周知的。
(iii)筛选抑制TBC1D7基因的生物学活性的化合物
在本发明中，TBC1D7蛋白具有促进癌细胞的细胞增殖(图3C)和侵袭活性(图3D)的活性。利用这种生物学活性，可筛选抑制该蛋白的这种活性的化合物。因此，本发明提供一种方法，利用由TBC1D7基因编码的多肽筛选用于治疗或预防表达TBC1D7基因的癌症例如肺癌(非小细胞肺癌或小细胞肺癌)或食道癌的化合物。
具体地，本发明提供以下[1]至[19]的方法：
[1]一种筛选可用于治疗或预防表达TBC1D7的癌症的作用剂或化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使测试剂或化合物与表达多核苷酸的细胞接触，所述多核苷酸编码由癌症中表达的基因编码的多肽，或其功能等同物；
(b)检测步骤(a)的所述多核苷酸或多肽的水平；
(c)将步骤(b)中检测到的所述水平与在无测试剂或化合物存在下检测到的水平相比较；和
(d)选择降低或抑制(c)中所述水平的测试剂或化合物。
[2][1]中的方法，其中所述水平通过选自下组的任一种方法检测：
(a)检测编码TBC1D7多肽或其功能等同物的mRNA的量；
(b)检测TBC1D7多肽或其功能等同物的量；并
(c)检测TBC1D7多肽或其功能等同物的生物学活性。
[3][2]中的方法，其中所述生物活性是选自下组的任一种活性：
(a)表达选自TBC1D7多肽的多肽或其功能等同物的细胞的增殖活性；
(b)表达TBC1D7多肽或其功能等同物的细胞的侵袭活性。
依照本发明，可以评估候选作用剂或化合物对抑制TBC1D7的水平或生物学活性(例如细胞增殖促进活性)的治疗效果，或候选作用剂或化合物用于治疗或预防与TBC1D7有关的癌症(例如肺癌和食道癌)的治疗效果。因此，本发明还提供了一种使用TBC1D7来筛选用于抑制细胞增殖的候选作用剂或化合物，或用于治疗或预防癌症(例如肺癌和食道癌)的候选作用剂或化合物的方法，包括下列步骤：
(a)使测试作用剂或化合物与表达编码由癌症中表达的基因所编码的多肽或其功能等同物的多核苷酸的细胞接触；
(b)检测步骤(a)的所述多核苷酸或多肽的水平或生物学活性；并
(c)将(b)的水平或生物学活性与测试作用剂或化合物的治疗效果关联起来。
在本发明中，可以将治疗效果与TBC1D7多肽或多核苷酸(或其功能性片段)的水平或生物学活性关联起来。例如，当与没有测试剂或化合物的情况下检测出的水平或生物学活性相比，测试剂或化合物阻抑或抑制TBC1D7的水平或生物学活性时，可以将测试剂或化合物鉴定或选择为具有治疗效果的候选作用剂或化合物。或者，当与没有测试剂或化合物的情况下检测出的水平或生物学活性相比，测试剂或化合物没有阻抑或抑制TBC1D7的水平或生物学活性时，可以将测试剂或化合物鉴定为没有显著治疗效果的候选作用剂或化合物。
本发明的方法会在下文更为详细地描述。
任何多肽都可用于筛选，只要它们包含TBC1D7蛋白的生物学活性。所述生物学活性包括：细胞增殖活性；促进细胞侵袭的活性或RAB17、14-3-3zeta或TSC1结合活性。例如，可使用TBC1D7蛋白，还可使用与这些蛋白质功能等同的多肽。所述多肽可由细胞内源或外源表达。
通过这种筛选分离的化合物是由TBC1D7基因编码的多肽的拮抗剂的候选物。术语“拮抗剂”指的是通过与多肽结合，从而抑制多肽功能的分子。所述术语还指降低或抑制编码TBC1D7的基因表达的分子。此外，通过这种筛选分离的化合物是抑制TBC1D7多肽与分子(包括DNA和蛋白质)在体内相互作用的化合物的候选物。
当本方法中要检测的生物学活性为细胞增殖时，可例如通过下述方法来检测：制备表达选自TBC1D7的多肽的细胞，在测试化合物存在下培养所述细胞，并测定细胞增殖的速度，测定细胞周期等，以及通过测定集落形成活性，如[实施例1-j]中所示的MTT测定、集落形成测定或FACS。
如本文中所定义的，术语“阻抑生物学活性”指的是与无化合物存在下相比较，TBC1D7的生物学活性阻抑至少10％，例如至少抑制25％、50％或75％，例如至少抑制90％。
(iv)筛选改变TRC1D7表达的化合物
在本发明中，特异性针对TBC1D7的双链分子降低TBC1D7的表达，导致癌细胞增殖的抑制(图3)。因此，利用TBC1D7基因表达水平作为指标进行筛选，可以鉴定出能用于治疗或预防癌症的化合物。在本发明的上下文中，所述筛选可例如包括以下步骤：
(a)使候选化合物与表达TBC1D7的细胞接触；
(b)检测TBC1D7的表达水平；并
(c)选择与对照相比降低TBC1D7表达水平的候选化合物。
依照本发明，可以评估候选化合物对改变TBC1D7表达，或候选化合物用于治疗或预防与TBC1D7有关的癌症(例如肺癌和食道癌)的治疗效果。因此，本发明还提供了一种用于筛选改变TBC1D7表达的候选化合物，或用于治疗或预防癌症(例如肺癌和食道癌)的候选化合物的方法，包括下列步骤：
a)使候选化合物与表达TBC1D7的细胞接触；
b)检测TBC1D7的表达水平；并
c)将b)的表达水平与测试化合物的治疗效果关联起来。
在本发明中，可以将治疗效果与TBC1D7表达水平关联起来。例如，当与没有测试化合物的存在下检测出的水平相比，测试化合物阻抑TBC1D7的表达水平时，可以将测试化合物鉴定或选择为具有治疗效果的候选化合物。或者，当与没有测试化合物的存在下检测出的水平相比，测试化合物没有阻抑TBC1D7的表达水平时，可以将测试化合物鉴定为没有显著治疗效果的作用剂或化合物。
本发明的方法会在下文更为详细地描述。
表达TBC1D7的细胞例如包括从肺癌或食道癌建立的细胞系；所述细胞可用于上述的本发明的筛选(例如A549和LC319)。表达水平可用本领域技术人员众所周知的方法评估，例如RT-PCR、Northern印迹试验、Western印迹试验、免疫染色、ELISA或流式细胞术分析。如本文中所定义的，术语“降低表达水平”指与在无化合物存在下的表达水平相比较，TBC1D7的表达水平降低至少10％，例如降低至少25％、50％或75％的水平，例如降低至少95％的水平。本文中的化合物包括化学化合物、双链核苷酸等。双链核苷酸的制备在上文描述。在筛选方法中，可选择降低TBC1D7表达水平的化合物作为用于治疗或预防癌症(例如肺癌和/或食道癌)的候选作用剂或化合物。
或者，本发明的筛选方法可包括以下步骤：
(a)使候选化合物与细胞接触，所述细胞中已导入了包含TBC1D7的转录调节区和在该转录调节区控制下表达的报告基因的载体；
(b)测量所述报告基因的表达或活性，和
(c)选择降低所述报告基因表达或活性的候选化合物。
合适的报告基因和宿主细胞是本领域众所周知的。例如，报告基因为萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、香菇珊瑚(Discosoma.sp)红色荧光蛋白(DsRed)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、lacZ和β葡萄糖苷酸酶(GUS)，而宿主细胞为COS7、HEK293、HeLa等。可通过使报告基因序列连接到CX的转录调节区来制备筛选所需的报告构建体。本文中CX的转录调节区是从起始密码子起到上游至少500bp(例如1000bp，例如上游5000bp或10000bp，但并不限于此)的区域。包含转录调节区的核苷酸区段可从基因组文库分离或者可通过PCR扩增。用于鉴定转录调节区的方法以及测定方案是众所周知的(Molecular Cloning第三版第17章，2001，Cold Springs Harbor Laboratory Press)。
使包含所述报告构建体的载体感染宿主细胞，并用本领域众所周知的方法(例如利用光度计、吸收分光光度计、流式细胞仪等)检测所述报告基因的表达或活性。如本文中所定义的，“降低表达或活性”指的是与无化合物存在下相比较，报告基因的表达或活性降低至少10％，例如至少降低25％、50％或75％，例如至少降低95％。
以下实施例中描述本发明的各个方面，其并非意欲限制权利要求书中所述的本发明的范围。
除非另外限定，本说明书中使用的全部技术术语和科学术语均与本发明所属技术领域的普通技术人员一般理解的含义相同。尽管与本说明书中的所述类似或等同的方法和材料均可用于实施或检验本发明，但以下描述了合适的方法和材料。以下实施例中将进一步描述本发明，其并不限制权利要求书中所述的本发明的范围。
(v)使用TBC1D7与RAB17、14-3-3zeta或SC1的结合作为指标的筛选
在本发明中，证实了TBC1D7蛋白与RAB17、14-3-3zeta或TSC1蛋白相互作用(图4)。如此，可以使用TBC1D7蛋白与RAB17、14-3-3zeta或TSC1蛋白的这样的结合作为指标来筛选抑制TBC1D7蛋白与RAB17、14-3-3zeta或TSC1蛋白之间的结合的化合物。因此，本发明提供了一种用于筛选用于抑制TBC1D7蛋白与RAB17、14-3-3zeta或TSC1蛋白之间的结合的化合物的方法，所述化合物可以使用TBC1D7蛋白与RAB17、14-3-3zeta或TSC1蛋白的这样的结合作为指标来筛选。此外，本发明还提供了一种用于筛选用于抑制或降低表达TBC1D7的癌细胞(例如肺癌细胞和/或食道癌细胞)的生长的化合物，和用于治疗或预防癌症(例如肺癌和/或食道癌)的化合物的方法。
具体地，本发明提供了下列[1]至[5]的方法：
[1]一种筛选阻断TBC1D7多肽与RAB17、14-3-3zeta或TSC1多肽之间的结合的作用剂或化合物的方法，所述方法包括下列步骤：
(a)使TBC1D7多肽或其功能等同物与RAB17、14-3-3zeta或TSC1多肽或其功能等同物在测试剂或化合物的存在下接触；
(b)检测多肽间的结合；
(c)比较步骤(b)中检测出的结合水平与那些在没有测试剂或化合物的存在下检测出的结合水平；并
(d)选择降低或抑制结合水平的测试剂或化合物。
[2]一种筛选可用于治疗或预防癌症的作用剂或化合物的方法，所述方法包括下列步骤：
(a)使TBC1D7多肽或其功能等同物与RAB17、14-3-3 zeta或TSC1多肽或其功能等同物在测试剂或化合物的存在下接触；
(b)检测多肽间的结合；
(c)比较步骤(b)中检测出的结合水平与那些在没有测试剂或化合物的存在下检测出的结合水平；并
(d)选择降低或抑制结合水平的测试剂或化合物。
[3][1]或[2]的方法，其中TBC1D7的功能等同物包括RAB17、14-3-3 zeta或TSC1结合域。
[4][1]或[2]的方法，其中RAB17、14-3-3 zeta或TSC1的功能等同物包括TBC1D7结合域。
[5][1]的方法，其中所述癌症选自下组：肺癌和食道癌。
在本发明的上下文中，TBC1D7、RAB17、14-3-3zeta或TSC1多肽的功能等同物是分别与TBC1D7多肽(SEQ ID NO：2)、RAB17(SEQ ID NO：12)、14-3-3zeta(SEQ ID NO：14)或TSC1(SEQ ID NO：45)多肽具有等同生物学活性的多肽(参见“定义”中(1)癌症相关基因和癌症相关蛋白，及其功能等同物)。具体地，TBC1D7的功能等同物是含有对RAB17、14-3-3 zeta或TSC1的结合域诸如氨基酸序列SEQ ID NO：28的多肽片段。更具体地，RAB17的功能等同物是SEQ ID NO：12的多肽片段，而14-3-3 zeta的功能等同物是SEQID NO：14的多肽片段，TSC1的功能等同物是SEQ ID NO：45的片段，其包含TBC1D7结合域。
作为筛选调制(例如抑制)TBC1D7对RAB17、14-3-3 zeta或TSC1结合的化合物的方法，可以使用本领域技术人员公知的许多方法。
要用于筛选的多肽可为重组多肽或源自天然来源的蛋白质，或者其部分肽。上述任一种测试化合物都可用于筛选。
作为使用TBC1D7、RAB17、14-3-3 zeta或TSC1多肽或其功能等同物来筛选蛋白质，例如结合多肽的蛋白质的方法(参见“定义”中(1)癌症相关基因和癌症相关蛋白，及其功能等同物)，可以使用本领域技术人员公知的许多方法。所述筛选可例如利用免疫沉淀、West-Western印迹分析(Skolnik等，Cell 65：83-90(1991))、利用细胞的双杂交***(“MATCHMAKER双杂交***”、“哺乳动物MATCHMAKER双杂交测定试剂盒”、“MATCHMAKER单杂交***”(Clontech)；“HybriZAP双杂交载体***”(Stratagene)；参考文献“Dalton和Treisman，Cell 68：597-612(1992)”、“Fields和Sternglanz，Trends Genet 10：286-92(1994)”)、亲和层析以及利用表面等离子共振现象的生物传感器进行(参见(i)通用筛选方法)。可使用上述任一种测试化合物(参见(1)筛选的测试化合物)。
在一些实施方案中，此方法进一步包括检测候选化合物与TBC1D7蛋白、RAB17蛋白、14-3-3 zeta蛋白或TSC1蛋白的结合，或者检测TBC1D7蛋白对RAB17蛋白、14-3-3 zeta蛋白或TSC1蛋白的结合水平的步骤。表达TBC1D7蛋白、RAB17和TSC1蛋白和/或14-3-3zeta蛋白的细胞包括例如由癌症(例如肺癌和/或食道癌)建立的细胞系，所述细胞可用于本发明的上述筛选，只要所述细胞表达这两种基因。或者，可用TBC1D7和RAB17、14-3-3 zeta和/或TSC1蛋白的表达载体之两者或任一转染细胞，以表达这两种基因。TBC1D7蛋白对RAB17、14-3-3 zeta蛋白和/或TSC1蛋白的结合可利用抗TBC1D7抗体、抗RAB17抗体、抗14-3-3 zeta抗体和TSC1抗体通过免疫沉淀测定法来检测(图4)。
依照本发明，可以评估候选作用剂或化合物对阻断TBC1D7多肽与RAB17、14-3-3 zeta、或TSC1多肽之间的结合，或候选作用剂或化合物用于治疗或预防与TBC1D7相关的癌症(例如肺癌和食道癌)的治疗效果。因此，本发明还提供了一种使用TBC1D7多肽或其功能等同物来筛选用于阻断TBC1D7多肽与RAB17、14-3-3 zeta、或TSC1多肽之间的结合的候选作用剂或化合物，或用于治疗或预防癌症(例如肺癌和食道癌)的候选作用剂或化合物的方法，包括下列步骤：
(a)使TBC1D7多肽或其功能等同物与RAB17、14-3-3 zeta或TSC1多肽或其功能等同物在测试剂或化合物的存在下接触；
(b)检测多肽间的结合；
(c)比较步骤(b)中检测出的结合水平与那些在没有测试剂或化合物的存在下检测出的结合水平；并
(d)将(c)的结合水平与测试剂或化合物的治疗效果关联起来；
在本发明中，可以将治疗效果与TBC1D7多肽与RAB17、14-3-3 zeta、或TSC1多肽之间的结合关联起来。例如，当与没有测试剂或化合物的存在下检测出的水平相比，测试剂或化合物阻抑或抑制多肽之间的结合水平时，可以将测试剂或化合物鉴定或选择为具有治疗效果的候选作用剂或化合物。或者，当与没有测试剂或化合物的存在下检测出的水平相比，测试剂或化合物没有阻抑或抑制多肽间的结合水平时，可以将测试剂或化合物鉴定为没有显著治疗效果的候选作用剂或化合物。
抑制TBC1D7相互作用的显性负相蛋白质
本发明涉及抑制性多肽，其含有YWITRRFVNQLNTKYRDSLP(SEQ IDNO.：28)。在一些优选的实施方案中，抑制性多肽包含YWITRRFVNQLNTKYRDSLP(SEQ ID NO.：28)；与该多肽功能等同的多肽；或编码那些多肽的多核苷酸，其中所述多肽缺乏EGFR的TTK激酶活性。EGFR片段抑制肺癌细胞增殖正是本发明证明的一个新发现。
包含本发明的选定氨基酸序列的多肽可以是任何长度的，只要多肽含有氨基酸序列YWITRRFVNQLNTKYRDSLP(SEQ ID NO.：28)，而且抑制癌细胞增殖。在一些实施方案中，多肽是TBC1D7的截短形式，由来自SEQ ID NO2的小于约250个氨基酸组成。在一些实施方案中，多肽可以由小于约100个氨基酸组成。在一些实施方案中，氨基酸序列的长度可以从20至60个残基不等。
本发明的多肽可以含有两个或更多个“选定的氨基酸序列”。两个或更多个“选定的氨基酸序列”可以是相同或不同的氨基酸序列。此外，各个“选定的氨基酸序列”可以直接连接。或者，它们之间可以布置有任何居间序列。
此外，本发明涉及与本文具体公开的YWITRRFVNQLNTKYRDSLP(SEQ ID NO.：28)多肽同源(即共享序列同一性)的多肽。在本发明中，与YWITRRFVNQLNTKYRDSLP(SEQ ID NO.：28)多肽同源的多肽是那些含有选自添加、删除、替代和***一个或几个氨基酸残基的任何突变且功能等同的多肽。短语“功能等同的”指具有抑制TBC1D7与其它蛋白质诸如TSC1之间的相互作用并抑制细胞增殖的功能。因此，优选地，与本发明中的YWITRRFVNQLNTKYRDSLP(SEQ ID NO.：28)多肽功能等同的多肽在与YWITRRFVNQLNTKYRDSLP(SEQ ID NO.：28)序列不同的位点中具有氨基酸突变。与本发明中的YWITRRFVNQLNTKYRDSLP(SEQ ID NO.：28)肽功能等同的多肽的氨基酸序列保留YWITRRFVNQLNTKYRDSLP(SEQ IDNO.：28)序列，而且与“选定的氨基酸序列”具有60％或更高，通常70％或更高，优选地80％或更高，更优选地90％或更高，或95％或更高，且进一步更优选地98％或更高的同源性。可以使用本领域中公知的算法，例如设置成其缺省设置的BLAST或ALIGN来测定氨基酸序列同源性。
可以基于选定的氨基酸序列从任何位置起化学合成本发明的多肽。通常的肽化学方法可以用于合成多肽的方法。具体地，方法包括那些记载于下列文件和日本专利公开文本中的：
Peptide Synthesis，Interscience，New York，1966；The Proteins，第2卷，Academic Press Inc.，New York，1976；
Peputido gousei(Peptide Synthesis)，Maruzen(Inc.)，1975；
Peputido gousei no kiso to jikken(Fundamental and Experimental Peptide Synthesis)，Maruzen(Inc.)，1985；
Iyakuhin no kaihatsu(Development of Pharmaceuticals)，Sequel，第14卷：Peputido gousei(Peptide Synthesis)，Hirokawa Shoten，1991；
国际专利申请公布WO99/67288。
还可以通过已知的遗传工程技术来合成本发明的多肽。遗传工程技术的例子如下。具体地，将编码期望的肽的DNA导入合适的宿主细胞中以制备转化细胞。可以通过回收由此转化细胞生成的多肽来获得本发明的多肽。或者，可以用体外翻译***(其中在体外重建蛋白质合成的必需元件)来合成期望的多肽。
在使用遗传工程技术时，可以将本发明的多肽表达为与具有不同氨基酸序列的肽融合的融合蛋白。可以通过如下方式获得表达期望的融合蛋白的载体：连接编码本发明的多肽的多核苷酸与编码不同肽的多核苷酸，使得它们在同一阅读框中，然后将所得的核苷酸导入表达载体中。通过用所得的载体转化合适的宿主来表达融合蛋白。在形成融合蛋白中使用的不同肽包括下列肽：
FLAG(Hopp等，(1988)BioTechnology 6，1204-10)，
由六个His(组氨酸)残基组成的6xHis、10xHis，
流感血凝素(HA)，
人c-myc片段，
VSV-GP片段，
p18HIV片段，
T7标签，
HSV标签，
E标签，
SV40T抗原片段，
lck标签，
α-微管蛋白片段，
B标签，
蛋白C片段，
GST(谷胱甘肽-S-转移酶)，
HA(流感血凝素)，
免疫球蛋白恒定区，
β-半乳糖苷酶，和
MBP(麦芽糖结合蛋白)。
可以通过如下方式获得本发明的多肽：用合适的蛋白酶处理如此生成的融合蛋白，然后回收期望的多肽。为了纯化多肽，预先用可与融合蛋白结合的亲和层析捕获融合蛋白，然后可以用蛋白酶处理被捕获的融合蛋白。凭借蛋白酶处理，自亲和层析分离期望的多肽，并回收具有高纯度的期望多肽。
本发明的多肽包括经修饰的多肽。在本发明中，术语“经修饰的”指例如与其它物质结合。因而，在本发明中，本发明的多肽可以进一步包含其它物质诸如细胞膜通透性物质。其它物质包括有机化合物诸如肽、脂质、糖类、和多种天然存在的或合成的聚合物。本发明的多肽可以具有任何修饰，只要所述多肽保留抑制TBC1D7相互作用的期望活性。在一些实施方案中，抑制性多肽可以直接与TSC1与TBC1D7的结合竞争。修饰还可以对本发明的多肽赋予附加的功能。附加功能的例子包括可靶向性(targetability)、可投递性(deliverability)、和稳定化。
本发明中的修饰的优选例子包括例如导入细胞膜通透性物质。通常，细胞膜将胞内结构与外部隔离。因此，胞外物质难以有效导入细胞中。可以通过用细胞膜通透性物质修饰多肽来赋予本发明的多肽以细胞膜通透性。因此，通过使本发明的多肽与细胞接触，可以将多肽投递入细胞中以对其起作用。
“细胞膜通透性物质”指能够穿透哺乳动物细胞膜以进入胞质的物质。例如，某些脂质体与细胞膜融合而将内容物释放入细胞中。同时，某些类型的多肽穿透哺乳动物细胞的细胞质膜以进入细胞的内部。对于具有这样的细胞进入活性的多肽，本发明中的细胞质膜等优选地作为所述物质。具体地，本发明包括具有以下通式的多肽。
[R]-[D]；
其中，
[R]代表细胞膜通透性物质；[D]代表含有YWITRRFVNQLNTKYRDSLP(SEQ ID NO.：28)的片段序列。在上文所描述的通式中，[R]和[D]可以直接连接或者经由接头间接连接。可以使用肽、具有多种功能团的化合物等作为接头。具体地，可以使用含有-GGG-的氨基酸序列作为接头。或者，可以将细胞膜通透性物质和含有选定序列的多肽结合至微小颗粒的表面。[R]可以连接至[D]的任何位置。具体地，[R]可以连接至[D]的N端或C端，或者连接至构成[D]的氨基酸的侧链。此外，多于一个[R]分子可以连接至[D]的一个分子。各个[R]分子可以导入[D]分子上的不同位置。或者，可以用许多连接在一起的[R]修饰[D]。
例如，已经报告了具有细胞膜通透性的多种天然存在的或人工合成的多肽(Joliot A.和Prochiantz A.，Nat Cell Biol.2004；6：189-96)。可以使用所有这些已知的细胞膜通透性物质来修饰本发明中的多肽。例如，在本发明中，选自下组的任何物质可以作为上文所描述的细胞通透性物质使用：
多聚精氨酸；Matsushita等，(2003)J.Neurosci.；21，6000-7.
[Tat/RKKRRQRRR](SEQ ID NO：29)Frankel等，(1988)Cell 55，1189-93.
Green和Loewenstein(1988)Cell 55，1179-88.
[Penetratin/RQIKIWFQNRRMKWKK](SEQ ID NO：30)
Derossi等，(1994)J.Biol.Chem.269，10444-50.
[Buforin II/TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK](SEQ ID NO：31)
Park等，(2000)Proc.Natl Acad.Sci.USA 97，8245-50.
[Transportan/GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL](SEQ ID NO：32)
Pooga等，(1998)FASEB J.12，67-77.
[MAP(模式两亲性肽)/KLALKLALKALKAALKLA](SEQ ID NO：33)
Oehlke等，(1998)Biochim.Biophys.Acta.1414，127-39.
[K-FGF/AAVALLPAVLLALLAP](SEQ ID NO：34)
Lin等，(1995)J.Biol.Chem.270，14255-8.
[Ku70/VPMLK](SEQ ID NO：35)
Sawada等，(2003)Nature Cell Biol.5，352-7.
[Ku70/PMLKE](SEQ ID NO：36)
Sawada等，(2003)Nature Cell Biol.5，352-7.
[朊病毒/MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP](SEQ ID NO：37)
Lundberg等，(2002)Biochem.Biophys.Res.Commun.299，85-90.
[pVEC/LLIILRRRIRKQAHAHSK](SEQ ID NO：38)
Elmquist等，(2001)Exp.Cell Res.269，237-44.
[Pep-1/KETWWETWWTEWSQPKKKRKV](SEQ ID NO：39)
Morris等，(2001)Nature Biotechnol.19，1173-6.
[SynB1/RGGRLSYSRRRFSTSTGR](SEQ ID NO：40)
Rousselle等，(2000)Mol.Pharmacol.57，679-86.
[Pep-7/SDLWEMMMVSLACQY](SEQ ID NO：41)
Gao等，(2002)Bioorg.Med.Chem.10，4057-65.
[HN-1/TSPLNIHNGQKL](SEQ ID NO：42)
Hong和Clayman(2000)Cancer Res.60，6551-6.
在本发明中，上文作为细胞膜通透性物质的例子列出的多聚精氨酸是由任何数目的精氨酸残基构成的。具体地，例如，它是由连续的5-20个精氨酸残基构成的。精氨酸残基的优选数目是11(SEQ ID NO：43)。
包含YWITRRFVNOLNTKYRDSLP(SEO ID NO.：28)的药物组合物
本发明的多肽抑制肺癌细胞的增殖。因此，本发明提供了用于癌症的治疗剂和/或预防剂，其包含作为活性成分的包含YWITRRFVNQLNTKYRDSLP(SEQ ID NO.：28)的多肽；或编码它的多核苷酸。或者，本发明涉及用于治疗和/或预防肺癌的方法，包括施用本发明的多肽的步骤。此外，本发明涉及本发明的多肽在制造用于治疗和/或预防肺癌的药物组合物中的用途。此外，本发明还涉及用于治疗和/或预防肺癌的多肽，其选自包含YWITRRFVNQLNTKYRDSLP(SEQ ID NO.：28)的肽。
或者，可以使用本发明的抑制性多肽来诱导癌细胞的凋亡。因此，本发明提供了用于细胞的凋亡诱导剂，其包含作为活性成分的包含YWITRRFVNQLNTKYRDSLP(SEQ ID NO.：28)的多肽；或编码其的多核苷酸。可以使用本发明的凋亡诱导剂来治疗细胞增殖性疾病诸如癌症。或者，本发明涉及用于诱导细胞凋亡的方法，其包括施用本发明的多肽的步骤。此外，本发明涉及本发明的多肽在制造用于诱导细胞中的凋亡的药物组合物中的用途。本发明的抑制性多肽诱导TTK表达细胞诸如肺癌中的凋亡。同时，尚未在大多数正常器官中观察到TTK表达。在一些正常的器官中，与肺癌组织相比，TTK的表达水平相对较低。因而，本发明的多肽可以在肺癌细胞中特异性诱导凋亡。
当将本发明的多肽以制备好的药物的形式施用给人和其它哺乳动物诸如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫、犬、绵羊、猪、牛、猴、狒狒和黑猩猩以治疗肺癌或诱导细胞中的凋亡时，可以直接施用分离的化合物，或者使用已知的药物制备方法将其配制成合适的剂量形式。例如，必要的话，药物可以以糖衣片剂、胶囊、酏剂、和微胶囊形式口服施用，或者备选地以含水或任何其它药学可接受液体的灭菌溶液或悬浮液的注射形式胃肠外施用。例如，化合物可以以产生通常接受的药物所必需的单位剂量形式，与药学可接受载体或介质混合，具体有灭菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、助悬剂、表面活性剂、稳定剂、调味剂、赋形剂、溶媒、防腐剂、粘合剂等。根据活性成分在这些配制剂中的量，可以确定规定范围内的合适剂量。
可混合到片剂和胶囊中的添加物的例子有粘合剂诸如明胶、玉米淀粉、黄蓍胶和***胶；介质例如微晶纤维素；溶胀剂诸如玉米淀粉、明胶和海藻酸；润滑剂例如硬脂酸镁；甜味剂例如蔗糖、乳糖或糖精；和调味剂诸如薄荷油、冬青油和樱桃。当单位剂型为胶囊时，上述成分中还可进一步包括液体载体诸如油。注射用无菌混合物可利用介质诸如注射用蒸馏水依照常见药物的实现来配制。
生理学盐水、葡萄糖和其它含有佐剂(诸如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化钠)的等渗溶液可用作注射用水溶液。它们可与合适的增溶剂，例如醇(具体有乙醇、多元醇诸如丙二醇和聚乙二醇)、非离子型表面活性剂诸如聚山梨醇80TM和HCO-50联合使用。
芝麻油或大豆油可用作油质液体，而且还可以与苯甲酸苄酯(benzyl benzoate)或苯甲醇(benzyl alcohol)一起用作增溶剂。此外，它们可以进一步与缓冲液诸如磷酸盐缓冲液和醋酸钠缓冲液；镇痛药诸如盐酸普鲁卡因(procaine hydrochloride)；稳定剂例如苯甲醇和苯酚；以及抗氧化剂一起配制。如此制备的注射剂可装入合适的安瓿中。
可以使用本领域技术人员公知的方法来对患者施用本发明的药用化合物，例如通过动脉内、静脉内、或皮下注射，并且类似地，通过鼻内、经气管、肌内、或口服施用来进行。剂量和施用方法随患者的体重和年龄以及施用方法而有所变化。然而，本领域技术人员可以常规地选择它们。可以将编码本发明多肽的DNA***供基因疗法中的载体中，并可以施用载体来进行治疗。虽然剂量和施用方法随患者的体重、年龄、和症状而有所变化，但是本领域技术人员可以适当地选择它们。例如结合本发明的多肽以调节其活性的化合物的剂量在对正常成人(体重60kg)口服施用时是约0.1mg至约100mg/天，优选地约1.0mg至约50mg/天，更优选地约1.0mg至约20mg/天，尽管它随症状而略有变化。
在以注射形式对正常成人(体重60kg)胃肠外施用化合物时，静脉内注射约0.01mg至约30mg/天，优选地约0.1mg至约20mg/天，更优选地约0.1mg至约10mg/天的剂量是方便的，尽管它随患者、靶器官、症状、和施用方法而略有变化。类似地，可以自用于60kg体重的剂量换算的量对其它动物施用化合物。
通过筛选如下的候选化合物，可以鉴定具有治疗或预防癌症(例如肺癌和食道癌)的潜力的候选化合物，所述候选化合物(i)结合TBC1D7；(ii)阻抑TBC1D7的生物学活性；(iii)改变TBC1D7的表达水平；(iv)抑制TBC1D7与RAB17、14-3-3zeta或TSC1之间的结合。可以通过第二次和/或进一步筛选来评估这些候选化合物用于治疗或预防癌症的潜力以鉴定用于癌症的治疗剂。例如，当具有上述(i)至(iv)中任一项的活性的化合物(例如结合TBC1D7的化合物)抑制上文所描述的癌症活性时，可以推断此类化合物具有TBC1D7特异性治疗效果。
除非另有定义，本文中所使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中的普通技术人员的通常理解具有相同意义。虽然可以在本发明的实践或测试中使用与本文中所描述的方法和材料相似或等同的方法和材料，下文描述了合适的方法和材料。
本发明会在以下实施例中进一步描述，所述实施例并不限制权利要求书中所描述的本发明的范围。
实施例
材料和方法
细胞系和临床组织样品
本研究中使用的人肺癌细胞系如下：肺腺癌(ADC)NCI-H1781、NCI-H1373、LC319、A549、和PC14；肺鳞状细胞癌(SCC)SK-MES-1、NCI-H2170、NCI-H520、NCI-H1703、和LU61；肺大细胞癌(LCC)LX1；和小细胞肺癌(SCLC)SBC-3、SBC-5、DMS273、和DMS114。本研究中使用的人食道癌细胞系如下：9种SCC细胞系(TE1、TE2、TE3、TE4、TE5、TE6、TE8、TE9、和TE10)和1种ADC细胞系(TE7)(Nishihira T.等J Cancer Res Clin Oncol 1993；119：441-449.)。将所有细胞在补充有10％胎牛血清(FCS)的合适培养基中在单层中培养，并于37℃在包含5％CO2的增湿空气的气氛中维持。将人小气道上皮细胞(SAEC)在购自Cambrex Bio Science Inc.的优化培养基(SAGM)中培养。在征得知情同意的条件下，从患者获得原发性肺癌和食道癌以及邻近的正常肺组织样品，如先前所描述的。另从北海道大学(Hokkaido University)及其附属医院(札幌，日本)进行过手术的患者获得总共270例NSCLC或261例NSCLC(153例ADC、89例SCC、3例腺鳞癌(adenosquamous carcinoma)、16例LCC；88名女性和173名男性患者；中值年龄为65.0岁，其中范围为26至84岁；112例pT1、121例pT2、28例pT3肿瘤大小；203例pN0、23例pN1、35例pN2***状态)和邻近的正常肺组织样品，用于在组织微阵列上进行免疫染色。本研究和所有临床材料的使用得到了各个机构伦理委员会的批准。
半定量RT-PCR分析
使用Trizol试剂(Life Technologies，Inc.)依照制造商的方案自培养的细胞和临床组织提取总RNA。用DNA酶I(Nippon Gene)来处理提取的RNA，并使用寡(dT)引物和SuperScript II逆转录酶(Invitrogen)来对其逆转录。用下列合成的TBC1D7特异性引物或用β-肌动蛋白(ACTB)特异性引物作为内部对照来实施半定量RT-PCR实验：TBC1D7，5’-CCCTAGTTTTTGTAGCTGTCGAA-3’(SEQ ID NO.：5)或5’-CCTAGTTTTTGTAGCTGTCGAA-3’(SEQ ID NO.：15)和5’-GATCACATGCCAAGAACACAAT-3’(SEQ ID NO.：6)；TSC1，5’-CTCCACAGCCAGATCAGACA-3’(SEQ ID NO.：16)和5’-GCTGCCTGTTCAAGAACTCC-3’(SEQ ID NO.：17)；ACTB，5’-GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3’(SEQ ID NO.：7)和5’-CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3’(SEQ ID NO.：8)。在上对PCR反应的循环数目进行优化以确保在产物强度的扩增对数期内。
Nortbern印迹分析
将人多组织印迹(BD Biosciences Clontech)与TBC1D7的经32P标记的PCR产物杂交。通过使用上文所描述的引物的RT-PCR来制备TBC1D7的cDNA探针。依照提供商的推荐来实施预杂交、杂交、和清洗。用增感屏(intensifying screen)于-80℃对印迹进行放射自显影1周。
抗TBC1D7抗体
使用pET28载体(Novagen，Madison，WI)来制备表达在其NH2末端含有His标签附加表位的TBC1D7的全长片段的质粒。将重组肽在大肠杆菌BL21Codon-Plus菌株(Stratagene，LaJolla，CA)中表达，并使用TALON树脂(BDBioscience)依照提供商的方案来纯化。将蛋白质接种入兔中；依照标准的方法在亲和柱上纯化免疫血清。使用亲和纯化的抗TBC1D7抗体来进行Western印迹及免疫细胞化学和免疫组织化学研究。根据使用来自已经用TBC1D7表达载体转染的细胞系的溶胞物和那些来自肺癌细胞系的溶胞物(都内源表达或不内源表达TBC1D7)进行的Western印迹及根据对细胞系进行免疫细胞化学染色，确认抗体对TBC1D7是特异性的。
Western印迹
在裂解缓冲液中裂解细胞；50mM Tris-HCl(pH 8.0)、150mM NaCl、0.5％NP-40、0.5％脱氧胆酸钠、0.1％SDS、及蛋白酶抑制剂(蛋白酶抑制剂混合物组III；Calbiochem)。使用ECL Western印迹分析***(GE Healthcare Bio-sciences)，如先前所描述的(Takahashi K.等Cancer Res2006；66：9408-19.)。
免疫细胞化学分析
将培养的细胞用PBS(-)清洗两次，在4％低聚甲醛溶液中于37℃固定30分钟，然后用含有0.1％Triton X-100的PBS(-)通透化3分钟。一抗反应前，用封闭溶液[PBS(-)中的3％牛血清白蛋白]将细胞覆盖7或10分钟以封闭非特异性抗体结合。将细胞与针对人TBC1D7的抗体(针对重组TBC1D7生成；请参见上文)一起温育后，添加Alexa Fluor 488山羊抗兔二抗(Molecular Probes)以揭示内源TBC1D7。用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚对细胞核染色。用激光共聚焦显微镜(TSC SP2 AOBS：Leica Microsystems)来观察经抗体染色的细胞。
免疫组织化学和组织微阵列分析
为了调查临床材料中TBC1D7蛋白的存在，本发明人使用ENVISION+试剂盒/HRP(DakoCytomation，Glostrup，Denmark)来对组织切片染色。对于抗原修复，将载玻片浸没于靶标修复溶液高pH(Target Retrieval Solution HighpH)(DakoCytomation)中，并于108℃在高压灭菌器中煮沸15分钟。在封闭内源过氧化物酶和蛋白质后添加7或12微克/ml亲和纯化的兔多克隆抗TBC1D7抗体(针对重组TBC1D7生成；请参见上文)，并将每个切片与作为二抗的经HRP标记的抗兔IgG一起温育。添加底物色原，并用苏木精对样本复染色。如别处发表的(Chin SF.等Molecular Pathology：MP 2003；56：275-279.，Callagy G.等Diagnostic Molecular Pathology 2003；12：27-34.，Callagy G.等JPathol 2005；205：388-396.)使用***固定的存档的NSCLC构建肿瘤组织微阵列，这些NSCLC是由单一机构组依照相同方案切除后收集并固定组织而获得的(Suzuki C.等Cancer Res 2003；63：7038-41.，Takahashi K.等CancerRes 2006；66：9408-19.，Mizukami Y等Cancer Sci 2008；99：1448-54.Suzuki C.等Cancer Res 2003；63：7038-41.，Ishikawa N.等Clin Cancer Res2004；10：8363-70.，Kato T.等Cancer Res 2005；65：5638-46.，Furukawa C.等Cancer Res 2005；65：7102-10.，Ishikawa N.等Cancer Res 2005；65：9176-84.，Suzuki C.等Cancer Res 2005；65：11314-25.，Ishikawa N.等Cancer Sci2006；97：737-45.，Takahashi K.等Cancer Res 2006；66：9408-19.，Hayama S.等Cancer Res 2006；66：10339-48.，Kato T.等Clin Cancer Res 2007；13：434-42.，Suzuki C.等Mol Cancer Ther 2007；6：542-51.，Yamabuki T.等Cancer Res2007；67：2517-25.，Hayama S.等Cancer Res 2007；67：4113-22.，Kato T.等Cancer Res 2007；67：8544-53.，Taniwaki M.等Clin Cancer Res2007；13：6624-31.，Ishikawa N.等Cancer Res 2007；67：11601-11.，Mano Y.等Cancer Sci 2007；98：1902-13.，Suda T.等Cancer Sci 2007；98：1803-8.，Kato T.等Clin Cancer Res Res 2008；14：2363-70.，Mizukami Y.等Cancer Sci2008；99：1448-54.)。考虑个体肺肿瘤的组织学异质性，基于与载玻片上相应的经HE-染色切片的目视比对选择取样的组织区域。利用组织微阵列制备仪(Beecher Instruments，Sun Prairie，WI)，将取自供体肿瘤块的3个、4个或5个组织核心(直径0.6mm；高3-4mm)放入接受石蜡块中。从每个病例穿取正常组织的核心。用产生的微阵列块的5-μm切片进行免疫组织化学分析。由3名独立的研究人员在事先不知道临床病理学数据的条件下半定量评估TBC1D7阳性情况(positivity)。利用以下标准评估TBC1D7染色强度：强阳性(2+)，在超过50％的肿瘤细胞中的暗褐色染色，完全掩盖细胞核和细胞质；弱阳性(1+)，在细胞核和细胞质中可看到的任何更小程度的褐色染色；无(得分为0)，肿瘤细胞中看不到染色。各病例仅当三名评定者独立地评判为强阳性时方被接受为强阳性。
统计学分析
利用StatView统计学程序(SaS)进行统计学分析。使用列联表来将临床病理学变量(年龄、性别、组织学类型、和病理学TNM期)与通过组织微阵列分析测定的TBC1D7表达水平关联起来。计算从手术日期至NSCLC相关死亡的时间或者至最近一次随访观察的存活曲线。对各相关变量和TBC1D7表达计算Kaplan-Meier曲线；利用时序检验来分析患者亚群中的存活时间差别。利用Cox比例危险回归模型来进行单变量分析和多变量分析，以确定临床病理学变量与癌症相关死亡率之间的关联。首先，本发明人分析了死亡与可能的预后因素(包括年龄、性别、组织学类型、pT-分级和pN-分级)之间的关联，每次考虑一个因素。其次，按照步降(backward)(逐步)法应用多变量Cox分析，所述步降(逐步)法总是将TBC1D7表达以及任何满足P值小于0.05准入水平的变量一起强制引入该模型中。随着所述模型继续增加因素，独立的因素没有超过P＜0.05的退出水平。
RNA干扰测定法
(实验1)
利用24Lipofectamine 2000(Invitrogen)遵循制造商的方案将小干扰RNA(siRNA)双链体(Dharmacon，Inc)(100nM)转染入NSCLC细胞系A549和食道癌细胞系TE9中。将经转染的细胞培养7天，并在转染后第7天，通过吉姆萨染色(Giemsa staining)对集落数目进行计数，并通过3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑(3-(4，5-dimethylthiazol-2-y1)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)测定法(细胞计数试剂盒-8溶液；Doiindo Laboratories)评估细胞的存活力。为证实对TBC1D7表达的抑制，用上文所描述的对TBC1D7特异性的合成引物进行半定量RT-PCR。针对人TBC1D7的siRNA双链体si-TBC1D7-#1：siGenome双链体1[D-021140-01：GAACAGUGCAGAGAAGAUAUU](SEQ ID NO：3，针对靶序列SEQ ID NO.：18)和si-TBC1D7-#2：siGenome双链体4[D-021140-4：GAUAAAGUUGUGAGUGGAUUU](SEQ ID NO.：4，针对靶序列SEQ IDNO.：19)购自Dharmacon。还设计了针对对照1(EGFP：增强型绿色荧光蛋白(GFP)基因，即维多利亚多管发光水母(Aequorea Victoria)GFP的一种突变体)的siRNA寡核苷酸，5’-NNGAAGCAGCACGACUUCUUC-3’(针对靶序列SEQ ID NO.：9)和针对对照2(乱序(SCR)：编码5S和16S rRNA的叶绿体纤细裸藻(Euglena gracilis)基因)的siRNA寡核苷酸5’-NNGCGCGCUUUGUAGGAUUCG(对于靶序列SEQ ID NO.：10)。
(实验2)
使用24μl Lipofectamine 2000(Invitrogen)遵循制造商的方案将小干扰RNA(siRNA)双链体(100nM)转染入NSCLC细胞系A549和LC319中。将经转染的细胞培养7天，并在转染后第7天，通过吉姆萨染色对集落的数目进行计数，并通过3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)测定法(细胞计数试剂盒-8溶液；Dojindo Laboratories)评估细胞的存活力。为确认对TBC1D7和TSC1表达的抑制，如上文所描述的那样使用针对TBC1D7和TSC1的抗体进行Western印迹并用对TBC1D7和TSC1特异性的合成引物进行半定量RT-PCR。针对人TBC1D7和TSC1的siRNA序列如下：si-TBC1D7#3：GAACAGUGCAGAGAAGAUA(SEQ ID NO.：18)、si-TBC1D7#4：GAUAAAGUUGUGAGUGGAU(SEQ ID NO.：19)、和si-TSC1：CGACACGGCUGAUAACUGA(SEQ ID NO.：20)。本发明人还设计了针对对照-1(LUC：来自北美萤火虫(Photinus pyralis)的萤光素酶基因)的siRNA寡核苷酸5’-CGUACGCGGAAUACUUCGA-3’(SEQ ID NO.：21)和针对对照-2(EGFP：增强型绿色荧光蛋白(GFP)基因，即维多利亚多管发光水母GFP的一种突变体)的siRNA寡核苷酸5’-GAAGCAGCACGACUUCUUC-3’(SEQ IDNO.：22)。
流式细胞术
在PBS中收集细胞，并将其在70％冷乙醇中固定30分钟。用100μg/mLRNA酶(Sigma/Aldrich，St.Louis，MO)处理后，用含50μg/mL碘化丙啶(Sigma/Aldrich，St.Louis，MO)的PBS将细胞染色。在Becton Dickinson FACScan上进行流式细胞术，并通过ModFit软件(Verity Software House，Inc.，Topsham，ME)来分析。从至少10,000个未设门细胞选择细胞分析DNA含量。
表达TBC1D7的COS-7转化体的建立及其体外生长
(实验1)
依照标准的规程来建立表达TBC1D7的稳定转化体。通过RT-PCR来扩增整个TBC1D7编码区。用EcoRI和XhoI来消化产物，并将其克隆入pCAGGSn3FC载体的合适位点中，所述pCAGGSn3FC载体含有位于TBC1D7蛋白C端的3X Flag表位序列。使用FuGENE 6转染试剂(Roche Diagnostics)依照制造商的说明，用表达TBC1D7(pCAGGS-TBC1D7-Flag)的质粒或模拟质粒(pCAGGSn3FC)转染COS-7细胞。将经转染的细胞在含有10％FCS和遗传霉素(0.8mg/ml)的培养基中培养14天；然后将50个单独的集落进行胰蛋白酶处理，并通过有限稀释测定法来筛选稳定的转化体。通过Western印迹和免疫细胞化学在每个克隆中测定TBC1D7的表达。在24、72、120、和168小时中用MTT测定法来定量两个稳定克隆(COS-7-TBC1D7-#1和-#2)和两个对照克隆(COS-7-模拟-#1和-#2)的细胞存活力。
(实验2)
依照标准的方案来建立表达TBC1D7的稳定转化体。通过RT-PCR来扩增整个TBC1D7编码区。用EcoRI和XhoI来消化产物，并将其克隆入pCAGGSn3FC载体的合适位点中，所述pCAGGSn3FC载体含有位于TBC1D7蛋白C端的3X Flag表位序列。使用FuGENE 6转染试剂(Roche Diagnostics)依照制造商的说明，用表达TBC1D7(pCAGGS-TBC1D7-Flag)的质粒或模拟质粒(pCAGGSn3FC)转染COS-7细胞。将经转染的细胞在含有10％FCS和遗传霉素(0.6mg/ml)的培养基中培养14天；然后将50个单独的集落进行胰蛋白酶处理，并通过有限稀释测定法来筛选稳定的转化体。通过Western印迹和免疫细胞化学在每个克隆中测定TBC1D7的表达。在24、72、120、和168小时中用MTT测定法来定量两个稳定克隆(COS-7-TBC1D7-#A和-#B)和两个对照克隆(COS-7-模拟-#A和-#B)的细胞存活力。
基质胶(Matrigel)侵袭测定法
将COS-7-TBC1D7-#1或COS-7-模拟-#1在含有10％FCS的DMEM中培养至接近汇合。通过胰蛋白酶处理来收获细胞，并将其在不添加血清或蛋白酶抑制剂的条件下在DMEM中清洗，并以2x105个细胞/mL的浓度在DMEM中悬浮。制备细胞悬浮液前，用DMEM于室温将基质胶基质(Becton Dickinson Labware)的干燥层复水2小时。将含有10％FCS的DMEM(0.75mL)添加至24孔基质胶侵袭室中的每个下部室，并将0.5mL(1x105个细胞)的细胞悬浮液添加至上部室的每个插片中。将插片的板于37℃温育22小时，并对室进行处理(process)；将侵袭通过基质胶的细胞固定，并进行姬姆萨染色，如由提供商(Becton Dickinson Labware)所指导的。
小鼠模型
动物实验依照机构和国家实验动物照看和使用准则进行，并得到机构动物使用委员会的批准。为了检查由TBC1D7过表达所致的体内肿瘤形成，将上述建立的稳定表达TBC1D7的COS-7细胞或那些用模拟质粒转染的细胞(1X107)皮下注射入8只BALB/cAJcl-nu/nu小鼠(雄性，7周龄)的后中背。随后，在细胞移植后第60天时对小鼠实施安乐死，并解剖肿瘤。
TRC1D7结合蛋白的鉴定
通过在蛋白酶抑制剂的存在下于4℃与在终体积1mL免疫沉淀缓冲液(0.5％NP-40、50mM Tris-HCl、150mM NaCl)中的100μl蛋白G-琼脂糖珠一起温育1小时来使来自COS-7-TBC1D7-#A或COS-7-模拟-#A的细胞提取物预澄清。于4℃以1000rpm离心1分钟后，于4℃将上清液与抗Flag M2琼脂糖珠一起温育2小时。然后，通过以5000rpm离心1分钟来收集珠，并用1mL每次免疫沉淀缓冲液清洗六次。将清洗过的珠在20μl Laemmli样品缓冲液中重悬，并煮沸5分钟，并将蛋白质在5-10％SDS聚丙烯胺凝胶电泳(PAGE)凝胶(BIORAD)中分开。电泳后，对凝胶银染色。将用抗Flag M2琼脂糖珠免疫沉淀的COS-7-TBC1D7-#A提取物中特异性出现的蛋白质条带切出，并用于基质辅助激光解吸/离子化-飞行时间质谱术(MALDI-TOF-MS)分析(AXIMA-CFRplus，SHIMADZU BIOTECH)。
显性负相肽测定法
将来源于TBC1D7中的最小化TSC1结合域的20个氨基酸的序列(密码子112-171；参见图5B)在其N端共价连接至膜转导性11个多聚精氨酸序列(11R)，如别处所描述的(Hayama S，Daigo Y，Kato T，等Cancer Res2006；66：10339-48，Hayama S，Daigo Y，Yamabuki T，等Cancer Res 2007；67：4113-22)。合成涵盖密码子112-171区的三种显性负相肽：11R-TBC112-131，RRRRRRRRRRR-GGG-YQLESGKLPRSPSFPLEPDD(SEQ ID NO.：23)；11R-TBC132-151，RRRRRRRRRRR-GGG-EVFLAIAKAMEEMVEDSVDC(SEQ ID NO.：24)；11R-TBC152-171RRRRRRRRRRR-GGG-YWITRRFVNQLNTKYRDSLP(SEQ ID NO.：25)。利用制备型反相高效液相层析来纯化肽以产生大于95％的纯度。将表达TBC1D7和TSC1两者的肺癌LC319细胞及不表达TBC1D7的正常人肺成纤维细胞衍生的CCD19Lu与浓度为10、15或20μM的所述11R肽一起温育3天。在处理后第3天通过MTT测定法来评估细胞存活力。
结果
肺癌和正常组织中的TB C1D7表达
使用代表27，648种基因的cDNA微阵列将TBC1D7鉴定为在大多数肺癌中是高度反式激活的，而它仅在睾丸和胎儿肝中检出。随后，本发明人通过半定量RT-PCR实验在15例肺癌组织中的14例(5例ADC之5例；5例SCC之5例；5例SCLS之4例)中确认了其反式激活(图1A)。还在所检查的15种肺癌细胞系之13种中观察到高水平的TBC1D7表达，而在从正常气道上皮衍生的SAEC细胞中几乎检测不到转录物(图1B)。随后，使用抗TBC1D7抗体进行Western印迹分析确认了30-kDa TBC1D7蛋白在肺癌细胞系中的过表达(图1C)。为了检查内源TBC1D7在肺癌LC319细胞中的亚细胞定位，使用抗TBC1D7抗体和LC319细胞实施免疫荧光分析。TBC1D7位于细胞核和细胞质中(图1D)。使用TBC1D7 cDNA作为探针的Northern印迹分析，在16种正常人成人组织中专有地且丰富地在睾丸中鉴定出一个1.35-kb转录物(图1E)。此外，通过使用抗TBC1D7多克隆抗体的免疫组织化学来比较5种正常组织(心脏、肺、肝、肾、和睾丸)中的TBC1D7蛋白表达与那些在肺癌中的TBC1D7蛋白表达。TBC1D7在睾丸(在***细胞的细胞核和细胞质中)和肺癌中丰富表达，但其表达在剩余的四种正常组织中几乎检测不到(图1F)。
TBC1D7表达与NSCLC患者不良预后的关联
(实验1)
使用自经石蜡包埋的NSCLC制备的组织微阵列，用亲和纯化的抗TBC1D7多克隆抗体来实施免疫组织化学分析。本发明人将TBC1D7表达样式分类为阴性或阳性。在所检查的270例NSCLC病例中，142例(52.6％)在NSCLC细胞中的细胞核和胞质中显示阳性TBC1D7染色，而128例(47.4％)显示阴性TBC1D7染色，但是在其任何相邻的正常肺细胞或基质细胞中没有观察到染色(图2，顶部小图)。然后，检查TBC1D7表达与已经接受根治手术的NSCLC患者的各项临床病理学参数的关联，而且发现其与性别(在男性中更高，P＝0.0051)、组织病理学类型(在非ADC中更高，P＜0.0001)、肿瘤大小(在T2+T3+T4中更高，P＜0.0001)、和***状态(在N1+N2中更高；表1A)的显著关联。Kaplan-Meier分析指明NSCLC中的TBC1D7阳性与较差的肿瘤特异性存活之间的显著关联(通过时序检验得到的P＝0.0124；图2，顶部小图)。我们还应用单变量分析来评估患者预后与数项因素，包括年龄、性别、组织学类型(ADC对非ADC)、pT期(肿瘤大小；T1对T2+T3+T4)、pN期(***状态；N0对N1+N2)、和TBC1D7状态(没有或弱的表达对强的表达)之间的关联。所有那些参数均与不良预后显著相关(表1B)。在多变量分析中，TBC1D7状态未达到作为针对入选本研究的手术治疗的肺癌患者的独立预后因素所需的统计学显著水平(P＝0.7586)，提示TBC1D7表达与肺癌中的这些临床病理学因素的相关性(表1B)。
(表1A)
NSCLC组织中的TBC1D7阳性与患者的特征(n＝270)之间的关联
Figure BDA0000058047620000891
ADC，腺癌
非ADC，鳞状细胞癌加上大细胞癌和腺鳞状细胞癌
P＜0.05(卡方检验)
(表1B)
对NSCLC患者中的预后因素的Cox氏比例危险模型分析
Figure BDA0000058047620000902
ADC，腺癌
非ADC，鳞状细胞癌加上大细胞癌和腺鳞状细胞癌
P＜0.05(卡方检验)
由针对TBC1D7的siRNA导致的肿瘤细胞生长抑制
使用对TBC1D7序列特异性的数种siRNA表达寡核苷酸，并将它们转染入内源表达高水平TBC1D7的LC319和A549细胞系中。当本发明人使用si-TBC1D7-#1和si-TBC1D7-#2构建体时通过RT-PCR确认了敲低效应(图3A，顶部小图)。MTT测定法和集落形成测定法揭示了用si-TBC1D7-#1、#2转染的细胞的数目急剧减少(图3A，中部和底部小图)。流式细胞测量分析揭示了si-TBC1D7对肺癌LC319细胞转染后48至96小时，S期的细胞数目持续减少，而G2/M期的细胞比例在转染后48至96小时期间增加(图3B)。
TBC1D7激活细胞生长和侵袭活性
由于对组织微阵列的免疫组织化学分析指明具有TBC1D7强阳性肿瘤的肺癌患者比那些具有TBC1D7弱阳性和/或阴性肿瘤的患者显示更短的癌症特异性存活期，所以检查了TBC1D7在细胞生长和侵袭中可能的作用。本发明人将设计用于表达TBC1D7的质粒(pCAGGS-TBC1D7-Flag)转染入COS-7细胞中，并建立了两种独立的过表达外源TBC1D7的COS-7细胞系(COS-7-TBC1D7-#1和-#2)。将它们的生长与用模拟载体转染的对照细胞(COS-7-模拟-#1和-#2)进行比较。两种COS-7-TBC1D7细胞的生长以与TBC1D7表达水平一致的显著程度得到了促进，如通过Western印迹分析所检测的(图3C)。为了进一步探索TBC1D7激活对细胞侵袭的潜在致癌效应，使用基质胶侵袭测定法来比较其侵袭活性。如图3D中所显示的，与COS-7-模拟-#1相比，COS-7-TBC1D7-#1穿过基质胶的侵袭活性得到显著增强。
为了调查TBC1D7体内肿瘤发生的潜在作用，将COS-7-TBC1D7-#1细胞或COS-7-模拟-#1细胞皮下移植入BALB/cAJcl-nu/nu小鼠中。在60天观察期间，用COS-7-TBC1D7-#1细胞个别移植的所有4只小鼠都具有含活细胞的肿瘤，而在用COS-7-模拟-#1细胞移植的4只独立的小鼠中没有形成可见的肿瘤(图3E和图3F)。这些发现暗示TBC1D7的体内和体外致癌效果。
与TBC1D7相互作用的分子的鉴定
(实验1)
为了阐明TBC1D7在肺和食道致癌作用中的生物学机制，本发明人尝试鉴定可与TBC1D7相互作用的蛋白质。因为TBC1D7具有共有的模式-1 14-3-3结合基序，在用抗14-3-3 zeta抗体(Cell signaling technology，USA)免疫印迹后，对于来自用Flag-TBC1D7表达载体或模拟载体(阴性对照)瞬时转染的COS-7细胞的细胞提取物，用Flag M2琼脂糖免疫沉淀。随后确认了外源TBC1D7与内源14-3-3 zeta的关联相互作用(图4A)。另一方面，最近已经报告了TBC1D7在初级纤毛形成中作为关联GTP酶激活蛋白(GAP)作用于Rab17，如此构建RAB17表达载体(pcDNA3.1 Myc-His RAB17)，并确认了TBC1D7与RAB17间的相互作用(图4B)。
(实验2)
TBC1D7与TSC1的相互作用。
为了阐明TBC1D7在肺致癌作用中的生物学机制，尝试鉴定可与TBC1D7相互作用的蛋白质。用抗Flag M2琼脂糖珠免疫沉淀用于检查TBC1D7的体外生长和体内致瘤效果的COS-7-TBC1D7-#A或COS-7-模拟-#A(阴性对照)的细胞提取物。通过SDS-PAGE分离后，对蛋白质复合物进行银染色。将在COS-7-TBC1D7-#A中由抗Flag M2琼脂糖得到的免疫沉淀物中观察到，但在阴性对照细胞中观察不到的蛋白质条带切出，用胰蛋白酶消化，并进行质谱术分析。来自130kDa的提取条带的肽与在人和猴之间保守的TSC1部分匹配。接着，通过半定量RT-PCR实验和Western印迹来检查人肺癌细胞系中的TSC1表达，在大多数所检查的肺癌细胞中发现了TBC1D7和TSC1的共表达(图4C)，提示这两种蛋白质在肺癌细胞中形成复合物的可能性。随后，我们通过使用针对TBC1D7和TSC1的兔多克隆抗体的免疫沉淀确认了肺癌LC319细胞中内源TBC1D7和内源TSC1之间的相互作用(图4D)。
为了进一步评估TSC1表达是否可以影响肺癌细胞中的TBC1D7功能，在LC319细胞中抑制或过表达TSC1后检查TBC1D7水平。与对照siRNA(si-EGFP)相比，用针对TSC1的siRNA寡核苷酸(si-TSC1)处理LC319细胞抑制内源TSC1的表达。令人感兴趣的是，TBC1D7蛋白水平在用si-TSC1处理的细胞中是降低的，而TBC1D7的转录水平未改变(图4E，左侧小图)。另一方面，TSC1的过表达导致TBC1D7蛋白增加，而TBC1D7转录物的表达水平未改变(图4E，右侧小图)。用si-TSC1处理的细胞中的TBC1D7蛋白减少被诱导表达TSC1的质粒所补偿(图4F)，这暗示TBC1D7蛋白可能经由其与TSC1的相互作用来得到稳定化及其促成细胞生长增强。
TBC1D7的显性负相肽对肺癌细胞的生长抑制
为了进一步调查这两种蛋白质的相互作用的生物学意义，将TBC1D7的三种部分构建体之任一种与在其N端的Flag序列(TBC1-231、TBC51-293、和TBC51-231；图5A，左侧小图)一起转染入COS-7细胞中。用单克隆抗Flag抗体进行的免疫沉淀表明所有构建体都能够与内源TSC1相互作用(图5A，右侧顶部小图)。为了进一步限定TBC51-231中最小的且亲和力高的TSC1结合域，将另外三种TBC1D7构建体(TBC51-111、TBC112-171、和TBC172-231；图5A，左侧小图)之任一种转染入COS-7细胞中，并发现TBC112-171能够与TSC1相互作用，但TBC51-111和TBC172-231不然(图5A，右侧底部小图)。这些实验提示了TBC1D7中的60个氨基酸的多肽(密码子112-171)应当在与TSC1相互作用中发挥重要的作用。
为了开发能抑制TBC1D7与TSC1的功能性结合的生物活性细胞通透性肽，合成三种不同的20个氨基酸的多肽(11R-TBC1D7112-131、11R-TBC1D7132-151、和11R-TBC1D7152-171)，它们涵盖TBC112-171的TSC1结合域并在其N端具有膜通透性11个精氨酸残基(11R)。为了测试这些连接有多聚精氨酸的肽对肺癌细胞生长/存活的影响，用三种肽分别处理LC319。向培养基中添加11R-TBC1D7152-171抑制了TBC1D7与TSC1间的复合物形成(图5B)，而且导致细胞存活力的显著降低，如通过MTT测定法所测量的(图5C；对于15μM为P＜0.0001，而对于20μM肽处理为＜0.0001，其通过不成对t检验得到)。另一方面，在用其余两种肽(11R-TBC1D7112-131和11R-TBC1D7132-151)处理细胞时没有观察到对细胞生长的影响。11R-TBC1D7152-171对由正常人肺成纤维细胞衍生的CCD19Lu细胞(其中TBC1D7表达几乎检测不到)的细胞存活力没有显示出影响(图5D)。这些数据提示了11R-TBC1D7152-171肽可以抑制TBC1D7和TSC1的功能性复合物形成，而且对不表达TBC1D7蛋白的正常人细胞没有脱靶毒性效应。
讨论
尽管开发了新型分子靶向性抗癌药物，但是具有存活益处的患者的比例仍然非常有限，而且他们中的一些人可能遭受严重的不良作用。因此，本发明已经建立了可有效鉴定治疗靶标的***，用来开发具有比现有疗法更有效的抗癌作用且不良反应最小的小分子化合物(Kikuchi T.等Oncogene2003；22：2192-205.，Kakiuchi S.等Mol Cancer Res 2003；1：485-99.，Kakiuchi S.等Hum Mol Genet 2004；13：3029-43.，Kikuchi T.等Int J Oncol2006；28：799-805.，Taniwaki M.等Int J Oncol 2006；29：567-75.，Yamabuki T.等Int J Oncol 2006；28：1375-84.)。策略如下：1)通过使用cDNA微阵列***进行的全基因组扫描来鉴定肺癌和食道癌中上调的基因，2)通过cDNA微阵列和Northern印迹分析来验证候选基因在正常组织中没有表达水平或表达水平低，3)通过组织微阵列确认其在数百份存档的肺癌样品中的过表达，并检查其与临床病理学因素的关联，4)通过RNAi测定法来验证靶基因对于癌细胞的细胞生长或存活是否是必需的，并5)从癌症特异性癌蛋白筛选增强细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的表位。通过此***性办法，发现TBC1D7是在绝大多数临床肺癌和食道癌样品中过表达的癌蛋白，而且对于致癌作用是必需的。
将对TBC1D7特异性的siRNA转染入NSCLC细胞中可降低其表达，而且导致生长抑制。与此一致的是，哺乳动物COS-7细胞中的TBC1D7诱导促进体外细胞生长和小鼠中体内肿瘤形成。此外，通过我们的组织微阵列实验得到的临床病理学证据表明具有强烈表达TBC1D7的肿瘤的NSCLC患者比那些具有阴性或弱TBC1D7表达的患者显示更短的癌症特异性存活期。通过体外和体内测定获得的结果表明过表达的TBC1D7是肺肿瘤发生中的一种重要的分子。据我们所知，这是第一项显示TBC1D7的致癌功能和预后价值的研究。
已经显示了含有TBC域的蛋白质充当GTP酶激活蛋白(GAP)，并经由与Rab样小G蛋白相互作用来发挥功能。许多Rab蛋白与基本的生物学过程诸如囊泡融合、受体再循环、膜转运和胞质***有关(Zerial M和McBride H.NatRev Mol Cell Biol.2001；2：107-17.)。每个Rab成员在GDP结合的失活状态和GTP结合的活性状态间循环，而且GTP结合的激活形式经由与效应器分子的特异性相互作用而介导膜转运，如此控制其功能(Zerial M和McBride H.NatRev Mol Cell Biol.2001；2：107-17.，Pfeffer ST.Trends Cell Biol.2001；11：487-91.，Stenmark H和Olkkonen VM.Genome Biol.2001；2REVIEWS3007)。通常认为两种关键的酶家族，鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEFs)和GTP酶激活蛋白(GAPs)，控制Rab的GDP/GTP循环(Zerial M和McBride H.Nat Rev Mol Cell Biol.2001；2：107-17.，Segev N.Sci STKE.2001；100：RE11.)。最近，已经报告通过生物化学GAP测定发现，TBC1D7在初级纤毛形成中对Rab17起作用(Yoshimura S.等J Cell Biol.2007；178：363-9)。先前已经报告了Rab17在细胞极化过程中被诱导，而且参与极化上皮细胞中的顶端分选内体的功能(Lutcke A.等J Cell Biol.1993；121：553-64.，Zacchi P.等J Cell Biol.1998；140：1039-53.)，但是尚未描述RAB17在癌细胞中的功能。使用免疫沉淀测定法，确认了TBC1D7和RAB17之间的相互作用。GAP增强G蛋白原本缓慢的GTP酶活性，引起它们的失活，藉此调制由各种G蛋白控制的细胞途径(Bernards A.Biochim Biophys Acta 2003；1603：47-82，Chavrier P，Goud B.Curr Opin Cell Biol 1999；11：466-75)。已经报告了一些含有TBC域的蛋白质参与致癌作用(Pei L，Peng Y，Yang Y，等Cancer Res 2002；62：5420-24)。例如，TRE17癌基因在尤因肉瘤(Ewing sarcoma)中表达，而且作为Rho GTP酶Cdc42和Rac1的效应物途径的组分参与肌动蛋白重塑(Masuda-Robens JM，Kutney SN，Qi H，等Mol Cell Biol 2003；23：2151-61)。
另一方面，TBC1D7具有共有模式-114-3-3结合基序(RSxpSxP)，而且使用免疫沉淀测定证明了TBC1D7与14-3-3zeta之间的相互作用。14-3-3蛋白是在调节中枢生理学途径中发挥关键作用的高度保守的细胞蛋白质家族。已经鉴定出超过200种14-3-3靶蛋白，包括牵涉促有丝***和细胞存活信号传导、细胞周期控制和凋亡性细胞死亡的蛋白质。重要的是，14-3-3蛋白牵涉调节多种癌基因和肿瘤阻抑物基因指向人癌症中的潜在作用(Tzivion G.等Semin Cancer Biol.2006；16：203-13.)。最佳的结合基序对应于模式-1(RSXpSXP)和模式-2(RXF/YXpSXP，其中pS表示磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸)序列，其被所有14-3-3同等型识别(Gardino AK等Semin Cancer Biol.2006；16：173-82.)。在我们的磷酸酶测定法中没有检测出TBC1D7的磷酸化(数据未显示)，这提示了此相互作用可能是间接的。未来对TBC1D7中的14-3-3结合基序的研究可以有助于理解这些蛋白质与TBC1D7致癌功能的联系。
本文中的数据揭示了TSC1可以与TBC1D7相互作用，并使TBC1D7稳定。用TBC1D7的显性负相细胞通透性肽抑制这些分子的相互作用导致了癌细胞生长的阻遏，表明此相互作用在癌细胞的生长中具有至关重要的作用。重要的是，此通透性肽对不表达TBC1D7的正常的人细胞没有毒性效应。虽然TBC1D7-TSC1复合物在癌细胞中的详细功能仍有待阐明，对TBC1D7-TSC1复合物及TBC1D7功能的特异性抑制有可能是用于治疗肺癌的有效办法。
TSC1编码130-kDa的蛋白质，并且结节性硬化症复合物(TSC)中的TSC1丧失是造成良性肿瘤综合征诸如具有低恶性风险的错构瘤(hamartoma)的原因(Consortium TEC1T.Cell 1993；75：1305-15，Crino PB，Nathanson KL，HenskeEP.N Engl J Med 2006；355：1345-56，Huang J，Dibble CC，Matsuzaki M，等Mol Cell Biol 2008；28：4104-15)。TSC1-TSC2复合物在细胞内的信号整合结中发挥中心作用(Huang J，Dibble CC，Matsuzaki M，等Mol Cell Biol2008；28：4104-15)。有趣的是，最近的研究提示了高水平的TSC2表达与乳腺癌患者的肿瘤侵袭性升高和不良预后相联系(Liu H，Radisky DC，Nelson CM，等Proc Natl Acad Sci USA 2006；103：4134-9)。虽然已经清楚TSC1-TSC2复合物是mTORC1的一种至关重要的上游抑制剂，但是此复合物在调节其它下游靶物中的作用仍不清楚(Huang J，Dibble CC，Matsuzaki M，等Mol Cell Biol2008；28：4104-15)。实际上，TSC1-TSC2复合物的丧失导致普遍的AKT磷酸化降低(Huang J，Dibble CC，Matsuzaki M，等Mol Cell Biol 2008；28：4104-15)，这表明TSC1表达在细胞存活中发挥重要的作用。为了进一步评估TSC1的表达是否可以影响肺癌细胞中的mTORC1途径，检查了p-rpS6(Ser235/236)(其是mTORC1的下游靶物)在LC319细胞中抑制或过表达TSC1后的水平。针对TSC1的siRNA处理LC319细胞抑制了内源TSC1的表达，而且降低了TBC1D7蛋白的水平，而p-rpS6(Ser235/236)蛋白的水平没有改变(图6，左侧小图)。另一方面，TSC1的过表达导致TBC1D7蛋白的升高，而p-rpS6(Ser235/236)蛋白的水平不受影响(图6，右侧小图)。这些结果可能提示TSC1-TBC1D7复合物功能不依赖于肺癌细胞中的mTORC1途径。
总之，人TBC1D7在肺癌和食道癌的生长/存活和恶性性质中具有重要的功能作用。我们的数据提供了用于设计特异性靶向TBC1D7的酶活性的新型小分子化合物的手段。TBC1D7在切除的肿瘤样本中的过表达是一项可用作预后性生物标志的指标，以便对有可能具有不良预后的患者应用辅助疗法。
工业实用性
使用激光捕获解剖和全基因组cDNA微阵列的组合对本文中所描述的癌症进行的基因表达分析已经鉴定出特定的基因作为供癌症预防和疗法用的靶物。基于这些差异表达的基因中的一部分的表达，本发明提供了用于鉴定和检测癌症及评估预后的分子诊断性标志物。
本文中所描述的方法还可用于鉴定别的用于预防、诊断、和治疗癌症的分子靶物。本文中提供的数据增加了对癌症的全面了解，促进了新的诊断策略的开发，并为鉴定用于治疗性药物和预防剂的分子靶物提供了线索。这样的信息有助于对肿瘤发生的更深刻的了解，而且为开发用于诊断、治疗、和最终预防癌症的新策略提供了指标。
通过提及而完整收录本文中所引用的所有专利、专利申请、和出版物。
此外，虽然本发明已经详细地并参考其具体的实施方案进行了描述，但是要理解的是，上述说明书本质上是例示性的和说明性的，而且意图例示本发明及其优选的实施方案。通过常规的实验，本领域技术人员会容易地认可，可以在不背离本发明的精神和范围的前提下在其中进行各种改变和修饰。如此，本发明并不意图限于上述说明书，而限于所述权利要求书及其等同方案。
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Claims (39)

1.一种在受试者中检测或诊断癌症的方法，包括测定来源于患者的生物学样品中TBC1D7的表达水平，其中所述水平与所述基因的正常对照水平相比的升高指示所述受试者患有或者有风险患上癌症，其中通过选自下组的任一种方法来测定所述表达水平：
(a)检测TBC1D7的mRNA，
(b)检测由TBC1D7编码的蛋白质，和
(c)检测由TBC1D7编码的蛋白质的生物学活性。
2.权利要求1的方法，其中所述升高是比所述正常的对照水平高至少10％。
3.权利要求1的方法，其中所述来源于患者的生物学样品是活检。
4.权利要求1的方法，其中所述癌症选自肺癌和食道癌。
5.一种用于检测或诊断癌症的试剂盒，其包含结合TBC1D7的转录或翻译产物的检测试剂。
6.一种用于评估肺癌和/或食道癌患者的预后的方法，该方法包括下列步骤：
(a)检测生物学样品中的TBC1D7表达水平；和
(b)比较检出的表达水平与对照水平；和
(c)基于(b)的比较来确定所述患者的预后。
7.权利要求6的方法，其中所述对照水平是良好的预后对照水平，而与所述对照水平相比，所述表达水平的升高确定为不良预后。
8.权利要求7的方法，其中所述升高比所述对照水平高至少10％。
9.权利要求6的方法，其中通过选自下组的任何一种方法来测定所述表达水平：
(a)检测TBC1D7的mRNA，
(b)检测由TBC1D7编码的蛋白质，和
(c)检测由TBC1D7编码的蛋白质的生物学活性。
10.一种筛选用于治疗或预防癌症或抑制癌细胞生长的候选化合物的方法，所述方法包括下列步骤：
a)使测试化合物与由TBC1D7编码的多肽接触；
b)检测所述多肽与所述测试化合物之间的结合活性；和
c)选择结合所述多肽的化合物。
11.一种筛选用于治疗或预防癌症或抑制癌细胞生长的候选化合物的方法，所述方法包括下列步骤：
a)使测试化合物与表达TBC1D7的细胞接触；和
b)选择降低TBC1D7表达水平的化合物。
12.一种筛选用于治疗或预防癌症或抑制癌细胞生长的候选化合物的方法，所述方法包括下列步骤：
a)使测试化合物与由TBC1D7编码的多肽接触；
b)检测步骤(a)的多肽的生物学活性；和
c)选择与没有所述测试化合物存在下检测的生物学活性相比抑制所述多肽的生物学活性的化合物。
13.权利要求12的方法，其中所述生物学活性是细胞增殖活性或侵袭活性。
14.一种筛选用于治疗或预防癌症或抑制癌细胞生长的候选化合物的方法，所述方法包括下列步骤：
a)使测试化合物与已经导入包含TBC1D7基因的转录调节区和在转录调节区控制下表达的报告基因的载体的细胞接触；
b)测量所述报告基因的表达或活性；和
c)选择与没有所述测试化合物存在下的水平相比降低所述报告基因的表达或活性水平的化合物。
15.一种筛选抑制TBC1D7多肽与14-3-3zeta多肽、RAB17多肽、或TSC1多肽之间的结合的候选化合物的方法，所述方法包括下列步骤：
(a)在测试剂的存在下使TBC1D7多肽或其功能等同物与14-3-3 zeta、RAB17、或TSC1多肽或其功能等同物接触；
(b)检测所述多肽间的结合；
(c)比较步骤(b)中检测的结合水平与没有所述测试剂的存在下检测的结合水平；和
(d)选择步骤(c)中与没有所述测试剂的存在下检测的结合水平相比降低或抑制所述结合水平的测试剂。
16.权利要求15的方法，其中所述TBC1D7的功能等同物包含14-3-3zeta、RAB17、或TSC1结合域。
17.权利要求10、11、12和14的方法，其中所述癌症是肺癌或食道癌。
18.一种双链分子，其包含有义链和反义链，其中所述有义链包含与由SEQ ID NO：18或19组成的靶序列对应的核苷酸序列，且其中所述反义链包含与所述有义链互补的核苷酸序列，其中所述有义链和反义链彼此杂交以形成所述双链分子，且其中所述双链分子当被导入表达所述TBC1D7基因的细胞中时抑制该基因的表达。
19.权利要求18的双链分子，其中所述双链分子是长度为约19至约25个核苷酸的寡核苷酸。
20.权利要求18的双链分子，其中所述双链分子是包含经由单链核苷酸序列连接的所述有义链和所述反义链的单一核苷酸转录物。
21.权利要求20的双链分子，其中所述多核苷酸具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]是包含SEQ ID NO：18或19的核苷酸序列；[B]是由约3至约23个核苷酸组成的核苷酸序列；且[A’]是与[A]互补的核苷酸序列。
22.权利要求18的双链分子，其中表达TBC1D7基因的细胞选自下组：膀胱癌细胞、胃癌细胞、结肠和直肠癌细胞、乳腺癌细胞、食道癌细胞、肺癌细胞、淋巴瘤细胞、胰腺癌细胞和睾丸癌细胞。
23.一种载体，其包含下述多核苷酸的组合中的每一个或两者，所述多核苷酸包含有义链核酸和反义链核酸，其中所述有义链核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO：18或19，且其中所述反义链包含与所述有义链互补的核苷酸序列，其中所述有义链和所述反义链的转录物彼此杂交以形成所述双链分子，且其中所述载体当被导入表达所述TBC1D7基因的细胞中时抑制该基因的表达。
24.权利要求23的载体，其中所述多核苷酸是长度为约19至约25个核苷酸的寡核苷酸。
25.权利要求23的载体，其中所述双链分子是包含经由单链核苷酸序列连接的所述有义链和所述反义链的单一核苷酸转录物。
26.权利要求25的载体，其中所述多核苷酸具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]是包含SEQ ID NO：18或19的核苷酸序列；[B]是由约3至约23个核苷酸组成的核苷酸序列；而[A’]是与[A]互补的核苷酸序列。
27.一种在受试者中治疗或预防癌症的方法，包括对所述受试者施用药学有效量的与表达TBC1D7基因的细胞接触可抑制细胞增殖的针对TBC1D7的双链分子或包含所述双链分子的载体，以及药学上可接受的载体。
28.权利要求27的方法，其中所述双链分子是权利要求18的双链分子，其中所述载体是权利要求23的载体。
29.权利要求27的方法，其中所述癌症选自肺癌和食道癌。
30.一种用于治疗或预防癌症的组合物，其包含药学有效量的与表达TBC1D7基因的细胞接触可抑制细胞增殖的针对TBC1D7的双链分子或包含所述双链分子的载体，以及药学上可接受的载体。
31.权利要求30的组合物，其中所述双链分子是权利要求18的双链分子，其中所述载体是权利要求23的载体。
32.权利要求30的组合物，其中所述癌症选自肺癌和食道癌。
33.一种多肽，其选自下组：
(a)包含YWITRRFVNQLNTKYRDSLP(SEQ ID NO：28)的多肽，和
(b)具有与由YWITRRFVNQLNTKYRDSLP(SEQ ID NO：28)组成的多肽在功能上等同的多肽的氨基酸序列的多肽，
其中所述多肽缺乏由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的多肽的生物学功能。
34.一种多核苷酸，其编码权利要求33的多肽。
35.权利要求33的多肽，其中所述生物学功能是细胞增殖活性或侵袭活性。
36.权利要求33的多肽，其中所述多肽由20至60个残基组成。
37.权利要求33的多肽，其中所述多肽是经细胞膜通透性物质修饰的。
38.权利要求37的多肽，其具有以下通式：[R]-[D]；其中[R]代表所述细胞膜通透性物质；而[D]代表包含YWITRRFVNQLNTKYRDSLP(SEQ ID NO：28)的片段序列的氨基酸序列；或与包含所述片段序列的多肽在功能上等同的多肽的氨基酸序列，其中所述多肽缺乏由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的多肽的生物学功能，其中[R]和[D]可以直接连接或者经由接头间接连接。
39.权利要求38的多肽，其中所述细胞膜可通透物质是选自下组的任何物质：
聚精氨酸/RRRRRRRRRRR/SEQ ID NO：43；
Tat/RKKRRQRRR/SEQ ID NO：29；
Penetratin/RQIKIWFQNRRMKWKK/SEQ ID NO：30；
Buforin II/TRS SRAGLQFPVGRVHRLLRK/SEQ ID NO：31；
Transportan/GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL/SEQ ID NO：32；
MAP(模式两亲性肽)/KLALKLALKALKAALKLA/SEQ ID NO：33；
K-FGF/AAVALLPAVLLALLAP/SEQ ID NO：34；
Ku70/VPMLK/SEQ ID NO：35；
Ku70/PMLKE/SEQ ID NO：36；
朊病毒/MANLGYWLLALF VTMWTDVGLCKKRPKP/SEQ ID NO：37；
pVEC/LLIILRRRIRKQAHAH SK/SEQ ID NO：38；
Pep-1/KETWWETWWTEWSQPKKKRKV/SEQ ID NO：39；
SynB1/RGGRLSYSRRRFSTSTGR/SEQ ID NO：40；
Pep-7/SDLWEMMMVSLACQY/SEQ ID NO：41；和
HN-1/TSPLNIHNGQKL/SEQ ID NO：42。
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