CN101273132A - 用于治疗乳腺癌的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明展示了一种通过使细胞与可抑制A2254或A5623表达的siRNA组合物接触抑制癌细胞生长的方法。本发明还包括治疗癌症的方法。本发明还展示了用于所提供方法的产品，包括核酸序列、载体以及由它们构成的组合物。本发明还提供了用于抑制肿瘤细胞，例如乳腺癌细胞，生长的方法，以及用于鉴定可降低或防止A5623与A2254结合的化合物的方法。而且，本发明还涉及治疗或预防癌症，特别是乳腺癌，的方法，包括施用可抑制A2254与A5623结合的化合物，并涉及含有这些结合抑制剂的组合物。

Description

用于治疗乳腺癌的组合物和方法

本专利申请要求2005年7月25日提交的美国临时专利申请流水号No.60/702,446的权益，本文引用其全部内容作为参考。

技术领域

本发明涉及生物科学领域，更明确地，涉及癌症研究领域。特别地，本发明涉及包括能够抑制A2254或A5623编码基因表达的核酸的组合物。在一些实施方案中，该化合物是对应于来自这些基因的亚序列的小干扰RNA(siRNA)。本发明还涉及用于鉴定可用于治疗和预防癌症的化合物的方法和试剂盒。而且，本发明还涉及治疗或预防癌症特别是乳腺癌的方法，包括施用抑制A2254与A5623之间结合的化合物，本发明还涉及包含这些结合抑制剂的组合物。

背景技术

乳腺癌(BRC)是一种复杂的疾病，其特征是大量基因中遗传和表观遗传改变的积累(Nathanson KL.，et al.，Nat Med，7(5)：552-6，2001)。乳腺癌发生的多步模型，即正常细胞经由非典型导管增生、原位导管癌(DCIS)和浸润性(invasive)导管癌(IDC)等阶段的转化，与其他组织中的癌发生阶段相似，但是推进乳腺癌的确切分子机制尚未知。显然，导致原发乳腺癌发生、发展和转移的分子因子很可能成为预防和治疗这类疾病的更好工具的开发目标。

通过cDNA微阵列分析获得的基因表达模式可以为表征每种癌症的本质提供相当大量的信息；这些信息的应用前景在于其通过开发新型药物改进肿瘤病临床治疗策略的潜力(Petricoin、E.F.、3rd、et al.、Nat Genet、32 Suppl：474-479、2002；Bange J，.、et al.、Nat Med、7(5)：548-52、2001)。带着这个目的，我们分析了77例乳腺肿瘤的表达模式，包括通过激光微光束显微解剖(LMM)和代表27，648个基因的cDNA微阵列的组合方法纯化的12个DCIS和69个IDC(Nishidate T，et al.，Int J Oncol.2004 Oct；25(4)797-819)。这些实验的数据不仅可以提供有关乳腺肿瘤发生的重要信息，对于鉴定其产物可作为诊断标志和/或作为治疗乳腺癌的分子靶标的候选基因也很具有价值。

发明公开

本发明是基于如下的发现，即A2254和A5623在乳腺癌细胞中显著过高表达，并且抑制A2254或A5623的表达可有效抑制多种癌细胞，包括BRC涉及的癌细胞的细胞生长。本申请描述的发明即是部分地基于此发现。

为了分离用于治疗乳腺癌的新分子靶标，本发明人组合使用cDNA阵列和激光微光束显微解剖研究了77个绝经期前乳腺癌病例的全基因组表达模式。在上调的基因中，本发明人鉴定了被指称为驱动蛋白家族成员2C(KIF2C)的A2254以及被指称为胞质***蛋白调节因子(PRC1)1的A5623，它们的表达在本发明人能够获得表达数据的乳腺癌病例中，分别在60例中的44例和58例中的37例中有上调。随后的半定量RT-PCR和Northern印迹分析证实，与正常人类组织包括乳腺导管细胞和正常乳腺相比，A2254和A5623在临床乳腺癌样品和乳腺癌细胞系中显著过高表达。免疫细胞化学染色显示，外源A2254和A5623定位于COS7细胞的细胞质和/或细胞质器(cytoplasmic apparatus)中。特别地，外源A5623可见于COS7细胞的中间纤维网络中。

用小干扰RNA(siRNAs)处理乳腺癌细胞有效抑制了A2254和A5623的表达，并分别抑制乳腺癌细胞、T47D和HBC5的细胞/肿瘤生长。此外，本发明人发现，A2254[和A5623]在HT1080细胞中瞬时过高表达可促进划痕测定(scratch assay)中细胞的迁移，表明这些基因在细胞迁移中均发挥关键作用(数据未显示)。这些发现表明，乳腺肿瘤发生或转移中可能涉及了A2254和A5623过高表达，并可能是特异性治疗乳腺癌患者的有希望的策略。

而且，本发明人证明，A5623能够通过其N端侧的一部分与A2254结合，并且在细胞***后期和胞质***期间，A5623和A2254共定位于中间体。免疫细胞化学染色显示，在乳腺癌细胞中，外源A2254在前期定位于有丝***纺锤体极，然后在中期和后期的早期阶段定位于整个有丝***纺锤体。这些发现表明，A2254和A5623的复合物可能参与了乳腺肿瘤发生，并可能是特异治疗乳腺癌患者的有希望的策略。

A2254被指称为驱动蛋白家族成员2C，它具有两种不同的转录变体，分别由21和20个外显子构成，对应于A2254V1(GenBank登录号NO：AB264115，SEQ ID NO：35，36)和A2254V2(GenBank登录号NO：AY026505，SEQ ID NO：37，38)(图3A，上图面)。因此，在本发明中，A2254包括A2254V1和A2254V2。V1变体的外显子1和2分别是185bp和94bp，而V2变体没有V1的外显子1和2，而具有一个由346bp构成的新外显子作为外显子1。V2变体的最后一个外显子(外显子20)比V1变体的最后一个外显子(外显子21)的3’端短537bp。A2254V1和A2254V2变体的全长cDNA序列分别含有2886和2401个核苷酸。这些变体的ORF开始于每个外显子1内。最终，V1和V2转录物分别编码725和671个氨基酸。

A5623被指称为胞质***蛋白调节因子1，它也有三种不同的转录变体，分别由15、14和14个外显子构成，对应于A5623V1(Genbank登录号NO：NM_003981；SEQ ID NO：39、40)，A5623V2(Genbank登录号NO：NM_199413；SEQ ID NO：41、42)和A5623V3(Genbank登录号NO：NM_199414；SEQ ID NO：43、44)(图3B，上图面)。因此，本发明中A5623包括A5623V1、A5623V2和A5623V3。V1的外显子13和14有可选择的变化，其余外显子在所有变体中均相同。V2变体没有V1的外显子14，在最后一个外显子内产生新的早终止密码子。V3的外显子14被完全删除，并且V3的外显子13在3’端比V1的外显子13短77bp，也在最后一个外显子内产生一个新的早终止密码子。A5623V1、A5623V2和A5623V3变体的全长cDNA序列分别由3128、3091和3011个核苷酸构成。这些变体的ORF开始于每个外显子1内。最终，V1、V2和V3转录物分别编码620、606和566个氨基酸。

本发明提供了抑制细胞生长的方法。在本文提供的方法中有这样的方法，它们包括使细胞与包含抑制A2254或A5623表达的小干扰RNA(siRNA)的组合物接触。本发明还提供了用于抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法。这些方法包括向受试者施用含有与来自A2254或A5623的序列特异杂交的小干扰RNA(siRNA)的组合物。本发明的另一个方面提供了用于抑制生物样品细胞中A2254或A5623基因表达的方法。所述基因的表达可以通过向细胞内引入足以抑制A2254或A5623基因表达的量的双链核糖核苷酸(RNA)分子来加以抑制。本发明的另一个方面包括核酸序列和载体的产物，以及包含它们的组合物，它们有用于，例如，本文提供的方法。在本文提供的产物中有这样的siRNA分子，它们具有在被引入到表达A2254或A5623基因的细胞内时抑制这些基因表达的性质。这类分子中有这样的分子，它们包括有义链和反义链，其中有义链包括与A2254或A5623靶序列对应的核糖核苷酸序列，并且其中该反义链包括与所述有义链互补的核糖核苷酸序列。分子的有义和反义链彼此杂交形成双链分子。

本发明进一步的方面是筛选可用于治疗或预防癌症，特别是乳腺癌的化合物的方法，所述方法包括如下步骤：

(a)在测试化合物的存在下，使包含A5623多肽的A2254-结合域的多肽与包含A2254多肽的A5623-结合域的多肽接触；

(b)检测多肽间的结合；和

(c)选择可抑制多肽间结合的测试化合物。

技术人员可通过本领域已知的用于确定蛋白相互作用域的方法确定A5623多肽的A2254-结合域或A2254多肽的A5623-结合域。例如，相互作用域可通过相互作用域作图(interaction domain mapping)加以确定。例如，分别表达A2254或A5623多肽的不同部分并应用例如酵母双杂交***筛选相互作用。由酵母双杂交***鉴定的相互作用，可通过应用例如生物化学测定，如免疫沉淀和/或柱上相互作用，来加以确证。前面提到的用于相互作用域鉴定和/或作图的方法决没有限制意义，因为技术人员可以容易地应用其他本领域已知的用于相互作用域鉴定和作图的方法。

优选地，在A5623多肽与A2254多肽之间结合的抑制剂的筛选方法中应用的含A2254-结合域的多肽，包括A5623多肽，例如A5623V1(SEQ IDNO：40)、A5623V2(SEQ ID NO：42)或A5623V3(SEQ ID NO：44)。

在另一个优选方面中，在A5623多肽与A2254多肽之间结合抑制剂的筛选方法中应用的含A5623-结合域的多肽，包括A2254多肽，例如A2254V1(SEQ ID NO：36)或A2254V1(SEQ ID NO：38)。

本发明的另外一个方面是用于筛选治疗或预防乳腺癌的化合物的试剂盒，其中该试剂盒包括：

(a)包含A5623多肽的A2254-结合域的多肽；

(b)包含A2254多肽的A5623-结合域的多肽；和

(c)用于检测多肽间相互作用的试剂。

优选地，所述含有A2254-结合域的多肽包括A5623多肽，或者所述含有A5623-结合域的多肽包括A2254多肽。

在另一个方面中，本发明涉及用于治疗或预防受试者中乳腺癌的方法。其中该方法包括施用药物有效量的可抑制A5623多肽与A2254多肽之间结合的化合物的步骤。

而且，本发明还涉及用于治疗或预防乳腺癌的组合物，其中该组合物包括药物有效量的抑制A5623多肽与A2254多肽之间结合的化合物和药物可接受的载体。

如这里使用的，术语“生物体”是指任何由至少一个细胞构成的活体。活的生物体可以简单到例如单个真核生物细胞，或者复杂到哺乳动物，包括人类。

如这里使用的，术语“生物样品”是指整个生物体或者其的组织、细胞或组成部分的一部分(例如体液，包括但不仅限于，血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊液、唾液、羊水、羊膜脐血、尿、***液和***)。“生物样品”进一步指从整个生物体或其细胞、组织或组成部分的一部分制备的匀浆、裂解物、提取物、细胞培养物或组织培养物，或者其级分或部分。最后，“生物样品”指含有细胞组分，例如蛋白质或核酸分子的介质，例如生物体在其中繁殖的营养肉汤或凝胶。

本发明以抑制细胞生长的方法为特征。使细胞与A2254或A5623小干扰RNA(siRNA)的组合物接触抑制细胞生长。细胞进一步与转染增强剂接触。细胞在体外、体内或离体提供。受试者是哺乳动物，例如人、非人灵长动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛。细胞是乳腺导管细胞。或者细胞是肿瘤细胞(也就是癌细胞)，例如上皮细胞癌(carcinoma)细胞或腺癌细胞。例如，细胞是乳腺癌细胞。“抑制细胞生长”的意思是，被处理细胞与未处理细胞相比增殖速度较低或者生存能力下降。细胞生长通过本领域已知的增殖测定加以测量。

术语“siRNA”的意思是阻止靶mRNA翻译的双链RNA分子。使用将siRNA引入到细胞的标准技术，包括其中DNA是转录RNA的模板的技术。siRNA包括有义A2254或A5623核酸序列，反义A2254或A5623核酸序列，或者两者。siRNA可以包括两个互补的分子，或者可以被构建使得单一转录物同时具有来自靶基因的有义和互补反义序列，例如发夹，在一些实施方案中发夹导致微RNA(miRNA)的产生。

靶细胞内siRNA与A2254或A5623转录物的结合导致细胞的A2254或A5623产生减少。寡核苷酸的长度至少为大约10个核苷酸，并可以与天然存在的A2254或A5623转录物一样长。优选地，寡核苷酸的长度为大约19-大约25个核苷酸。最优选地，寡核苷酸的长度小于大约75个、大约50个、或者大约25个核苷酸。抑制哺乳动物细胞内A2254或A5623表达的A2254或A5623 siRNA寡核苷酸的实例包括分别含有靶序列的寡核苷酸，其中所述靶序列例如分别为SEQ ID NO：21或25的核苷酸，或29或33的核苷酸。

设计具有抑制靶细胞内基因表达能力的双链RNA的方法是已知的(见例如，美国专利No.6,506,559，本文引用其全部内容作为参考)。例如，可以从Ambion网点(http://www.ambion.co.jp/techlib/tb/tb_506.html)获得用于设计siRNA的计算机程序。该计算机程序可以从Ambion公司获得，根据如下的方案选择用于siRNA合成的核苷酸序列。

选择siRNA靶点

1.从转录物的AUG起始密码子开始向下游扫描AA双核苷酸序列。记录每个AA的出现及其3’侧相邻的19个核苷酸作为潜在siRNA靶点。Tuschl等在Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro.Genes Dev13(24)：3191-7(1999)中不推荐针对5’和3’非翻译区(UTR)以及邻近起始密码子的区域(75个碱基之内)设计siRNA，因为这里可能更富含调节蛋白质的结合位点。UTR结合蛋白和/或翻译起始复合物可能干扰siRNA核酸内切酶复合物的结合。

2.将潜在靶点与合适的基因组数据库(人、小鼠、大鼠等)进行比较，将任何与其他编码序列显著同源的靶序列排除在考虑之外。建议使用BLAST(Altschul SF、et al.、Nucleic Acids Res.1997；25：3389-402；J Mol Biol.1990；215：403-10.)，其可见于NCBI服务器：www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。

3.选择合格的靶序列用于合成。通常在待评估的基因的长度上选择几个靶序列。

本发明还包括含有靶序列的核酸序列的分离核酸分子，所述靶序列例如SEQ ID NO：21、25、29和33的核苷酸，或者与SEQ ID NO：21、25、29和33的核苷酸的核酸序列互补的核酸分子。如这里使用的，“分离核酸”是从其原环境(例如，如果是自然存在的，即自然环境)移出的核酸，因而人工地(synthetically)改变了其自然状态。在本发明中，分离的核酸包括DNA、RNA及其衍生物。当分离核酸是RNA或其衍生物时，应当在核苷酸序列中将碱基“t”替换为“u”。如这里使用的，术语“互补”是指核酸分子核苷酸单元之间的Watson-Crick或Hoogsteen碱基配对，而术语“结合”是指两个核酸或化合物、或者相关核酸或化合物、或它们的组合之间的物理或化学相互作用。互补核酸序列在合适的条件下杂交，形成含有极少或者没有错配的稳定双链体。为了本发明的目的，两条具有5个或者更少错配的序列被认为是互补的。而且，本发明分离核苷酸的有义链和反义链可通过杂交形成双链核苷酸或发夹环结构。在优选实施方案中，这种双链体在每10个匹配中的错配数不超过1个。在双链体链完全互补的特别优选的实施方案中，这种双链体没有错配。对于A2254或A5623而言，核酸分子的长度分别小于2886或3128个核苷酸。例如，核酸分子的长度小于大约500、大约200、或者大约75个核苷酸。本发明还包括含有一个或多个本文所述核酸的载体，以及含有该载体的细胞。本发明的分离核酸可用于抗A2254或A5623的siRNA，或者编码该siRNA的DNA。当核酸用于siRNA或其编码DNA时，有义链优选地长于大约19个核苷酸，更优选地长于21个核苷酸。

本发明部分地基于如下的发现，即编码A2254或A5623的基因在乳腺癌(BRC)中相比于在非癌性乳腺组织中过高表达。A2254V1和A2254V2的cDNA长度分别为2886和2401个核苷酸。A5623V1、A5623V2和A5623V3的cDNA长度分别为3128、3091和3011个核苷酸。A2254V1和A2254V2的核酸和多肽序列分别如SEQ ID NO：35和36、及SEQ ID NO：37和38所示。A5623V1、A5623V2和A5623V3的核酸和多肽序列分别如SEQ ID NO：39和40、SEQ ID NO：41和42以及SEQ ID NO：43和44所示。序列数据还可以从如下登录号获得。

A2254：AY026505

A5623：NM_003981、NM_199413、NM_199414

抑制细胞生长的方法

本发明涉及通过抑制A2254或A5623的表达而抑制细胞生长，即癌细胞生长。或者，本发明涉及通过抑制A5623多肽与A2254多肽的结合而抑制细胞生长，即癌细胞生长，特别是乳腺癌的生长，因为发现两种多肽可以相互作用，并且认为它们的相互作用在癌发生，特别是乳腺癌发生中发挥至关重要的作用。因此，本发明涉及通过抑制A5623多肽与A2254多肽的结合而治疗或预防受试者中乳腺癌的手段和方法。而且，本发明设想了一种A5623多肽与A2254多肽的结合抑制剂，用作治疗或预防癌症，特别是治疗或预防乳腺癌的药物。

A2254或A5623的表达被例如特异性靶向A2254或A5623基因的小干扰RNA(siRNA)所抑制。A2254或A5623靶标包括例如SEQ ID NO：21、25、29和33的核苷酸。

在非哺乳动物细胞中，双链RNA(dsRNA)显示对基因表达具有强烈而特异性的沉默效应，这称作RNA干扰(RNAi)(Sharp PA.Genes Dev.1999；13(2)：139-41.)。dsRNA被一种含有RNA酶III基序的酶加工成20-23个核苷酸的dsRNA，称作小干扰RNA(siRNA)。siRNA与多组分核酸酶复合物一起特异性靶向互补mRNA(Hammond SM et al.，Nature.2000；404(6775)：293-6；Hannon GJ.Nature.2002；418(6894)：244-51.)。在哺乳动物细胞中，由20或21聚体dsRNA构成、具有19个互补核苷酸和3’端非互补胸苷或尿苷二聚体的siRNA显示具有基因特异性敲低(knockdown)作用，而不会导致基因表达的全局改变(Elbashir SM et al.，Nature.2001；411(6836)：494-8.)。此外，含有小核RNA(snRNA)U6或聚合酶IIIH1-RNA启动子的质粒可有效产生这种短RNA募集型III族RNA聚合酶III，从而能够组成型抑制其靶mRNA(Miyagishi M.et al.，Nat Biotechnol.2002；20(5)：497-500.；Brummelkamp TR，et al.，Science.296(5567)：550-3，2002.)。

通过使细胞与含有A2254或A5623之siRNA的组合物接触抑制细胞的生长。进一步将细胞与转染试剂接触。合适的转染试剂在本领域是已知的。“抑制细胞生长”的意思是，与没有暴露于组合物的细胞相比，细胞的增殖速度较低，生存能力下降。细胞生长用本领域已知的方法加以测量，例如MTT细胞增殖测定。

A2254或A5623的siRNA指向A2254或A5623基因序列的单个靶标。或者siRNA指向A2254或A5623基因序列的多个靶标。例如，组合物含有指向A2254或A5623的2、3、4或5个或者更多个靶序列的A2254或A5623的siRNA。“A2254或A5623靶序列”是指与A2254或A5623基因的一部分相同的核苷酸序列。靶序列可包括人类A2254或A5623基因的5’非翻译(UT)区、可读框(ORF)或3’非翻译区。或者siRNA是与A2254或A5623基因表达的上游或下游调节子互补的核酸序列。上游和下游调节子的实例包括结合A2254或A5623基因启动子的转录因子、与A2254或A5623多肽相互作用的激酶或磷酸酶，A2254或A5623启动子或增强子。与靶mRNA杂交的A2254或A5623的siRNA，通过与通常为单链的mRNA转录物相结合，从而干扰翻译，进而干扰蛋白质的表达，藉此降低或抑制由A2254或A5623基因编码的A2254或A5623多肽产物的产生。因此，本发明的siRNA分子可通过其在严紧条件下与来自A2254或A5623基因的mRNA或cDNA特异性杂交的能力加以鉴定。为了本发明的目的，术语“杂交”或“特异性杂交”用于表示两个核酸分子在“严紧杂交条件下”杂交的能力。短语“严紧杂交条件”是指在该条件下，典型地在核酸的复杂混合物中，核酸分子与其靶序列杂交而不与其他序列发生可检测的杂交。严紧条件是序列依赖性的，在不同的环境下会不同。越长的序列在越高的温度发生特异性杂交。在下列文献中可获得核酸杂交的详细指导：Tijssen，Techniques in Biochemistry andMolecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes，“Overview of principlesof hybridization and the strategy of nucleic acid assays”(1993)。一般地，对于特定的序列，在限定的离子强度pH下，严紧条件选择比热解链温度(T_m)低大约5-10℃。T_m是在平衡状态下，与靶序列互补的探针中的50％与靶序列杂交的温度(在限定的离子强度，pH和核浓度)(因为靶序列过量存在，因此在T_m时，50％的探针被占据)。严紧条件还可以通过添加去稳定剂如甲酰胺实现。为了选择性或特异性杂交，阳性信号至少是背景的2倍，优选地是背景杂交的10倍。严紧杂交条件的实例可如下：50％甲酰胺、5x SSC和1％SDS，42℃温育，或者5x SSC、1％SDS，65℃温育，在50℃ 0.2x SSC、和0.1％SDS中清洗。

本发明siRNA的长度小于大约500、大约200、大约100、大约50、或者大约25个核苷酸。优选地，siRNA的长度为大约19-大约25个核苷酸。示例性的用于产生A2254或A5623siRNA的核酸序列分别包括SEQ ID NO：21或25、或者29或33的核苷酸的序列作为靶序列。而且，为了提高siRNA的抑制活性，在靶序列反义链的3’端可以添加核苷酸“u”。所添加的“u”的数目为至少大约2个，一般大约2-大约10个，优选地大约2-大约5个。添加的“u”在siRNA反义链的3’端形成单链。

细胞是任何表达或过高表达A2254或A5623的细胞。细胞是上皮细胞，例如乳腺导管细胞。或者，细胞是肿瘤细胞，例如癌、腺癌、母细胞瘤、白血病、骨髓瘤或肉瘤。细胞是乳腺癌。

A2254或A5623的siRNA以能够结合mRNA转录物的形式直接引入到细胞内。或者，编码A2254或A5623的siRNA的DNA处于载体内。

载体是通过，例如，以允许两条链均表达(通过DNA分子转录)的方式，将A2254或A5623靶序列克隆到具有位于A2254或A5623序列的侧翼的、可操作连接的调节序列的表达载体中而产生的(Lee、N.S.、et al.、(2002)Nature Biotechnology 20：500-5)。与A2254或A5623mRNA反义的RNA分子由第一启动子(例如位于克隆DNA3’侧的启动子序列)转录，对A2254或A5623mRNA而言为有义链RNA分子由第二启动子(例如位于克隆DNA的5’侧启动子序列)转录。有义和反义链在体内杂交，产生用于沉默A2254或A5623基因的siRNA构建体。或者利用两个构建体产生siRNA构建体的有义和反义链。克隆的A2254或A5623可编码具有二级结构例如发夹的构建体，其中单一转录物同时具有来自靶基因的有义和互补反义序列。

在有义和反义序列之间可以存在由任意核苷酸序列构成的环序列，以形成发夹环结构。因此，本发明还提供了具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’的siRNA，其中[A]是与来自A2254或A5623的mRNA或cDNA特异性杂交的序列的相应核糖核苷酸序列。在优选实施方案中，[A]是这样的核糖核苷酸序列，它相应于选自SEQ ID NO：21、25、29和33的核苷酸的序列。

[B]是由3-23个核苷酸构成的核糖核苷酸序列，和

[A’]是由[A]的互补序列构成的核糖核苷酸序列。

区域[A]与[A’]杂交，然后形成由区域[B]构成的环。环序列的长度优选地为大约3-大约23个核苷酸。环序列可以从例如由如下序列构成的组中选择(http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html)。而且，由23个核苷酸构成的环序列也提供活性siRNA(Jacque、J.M.et al.、(2002)Nature 418：435-8.)。

CCC、CCACC或CCACACC：Jacque，J.M.et al.，(2002)Nature，418：435-8.

UUCG：Lee、N.S.et al.，(2002)Nature Biotechnology 20：500-5；Fruscoloni，P.et al.，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100(4)：1639-44.

UUCAAGAGA：Dykxhoorn、D.M.et al.，(2003)Nature ReviewsMolecular Cell Biology 4：457-67.

例如，具有本发明发夹环结构的优选siRNA如下所示。在下列结构中，环序列可以从CCC、UUCG、CCACC、CCACACC和UUCAAGAGA中选择。优选的环序列是UUCAAGAGA(在DNA中是“ttcaagaga”)。

GAGAAGAAGGCCCAGAACU-[B]-AGUUCUGGGCCUUCUUCUC(对靶序列SEQ ID NO：21)

CUCUAGGACUUGCAUGAUU-[B]-AAUCAUGCAAGUCCUAGAG(对靶序列SEQ ID NO：25)

GGAAAGACUCAUCAAAAGC-[B]-GCUUUUGAUGAGUCUUUCC(对靶序列SEQ ID NO：29)

GCAUAUCCGUCUGUCAGAA-[B]-UUCUGACAGACGGAUAUGC(对靶序列SEQ ID NO：33)。

位于A2254或A5623序列侧翼的调节序列是相同或者不同的，从而它们的表达可以独立地被调节或者以时间或空间方式被调节。通过将A2254或A5623基因模板克隆到含有例如来自小核RNA(snRNA)U6启动子或人H1 RNA启动子的RNA聚合酶III转录单元的载体内，从而在细胞内转录siRNA。为了将载体引入到细胞内，可以使用转染增强剂。FuGENE(RocheDiagnostices)、Lipofectamine 2000(Invitrogen)、Oligofectamine(Invitrogen)和Nucleofector(Wako pure Chemical)可用作转染增强剂。

根据标准方法，在体外测试寡核苷酸和与A2254或A5623的mRNA多个部分互补的寡核苷酸降低肿瘤细胞中A2254或A5623产生的能力(例如，使用乳腺细胞系，如乳腺癌(BRC)细胞系)。使用A2254或A5623的特异性抗体或其他检测策略，检测与候选siRNA组合物接触的细胞中A2254或A5623基因产物与不存在候选组合物时培养的细胞相比的降低。对于在体外基于细胞的测定或无细胞测定中降低A2254或A5623产生的序列，随后测试其对细胞生长的抑制效应。对于在体外基于细胞的测定中抑制细胞生长的序列，将其在大鼠或小鼠体内进行测试以确认在患有恶性肿瘤的动物体内A2254或A5623的产生降低以及肿瘤细胞生长降低。

治疗恶性肿瘤的方法

通过施用A2254或A5623的siRNA治疗患有以A2254或A5623过高表达为特征的肿瘤的患者。siRNA治疗用于抑制罹患或者有危险发生例如乳腺癌的患者体内A2254或A5623的表达。这些患者通过具体肿瘤类型的标准方法加以鉴定。乳腺癌(BRC)的诊断通过例如CT、MRI、ERCP、MRCP、计算机断层摄影或超声波。如果治疗导致临床效益，例如受试者中A2254或A5623表达降低，或者肿瘤的大小、患病率(prevalence)或转移潜力降低，则治疗是有效的。在预防性地施加治疗时，“有效”是指治疗可推迟或阻止肿瘤形成，或阻止或减轻肿瘤的临床症状的症状。有效性是结合已知的用于诊断或治疗特定肿瘤类型的方法来加以确定。

siRNA治疗的执行是通过向受试者施用siRNA，其施用是利用编码本发明siRNA的标准载体和/或基因输送***，例如通过输送合成的siRNA分子。典型地，将合成siRNA分子化学稳定化以防止体内核酸酶降解。制备化学稳定化的RNA分子的方法在本领域是公知的。典型地，这类分子含有经过修饰的骨架和核苷酸以防止核糖核酸酶作用。其他修饰也是可能的，例如胆固醇偶联的siRNA显示提高的药理学性质(Song et al.Nature Med.9：347-51(2003))。合适的基因输送***可以包括脂质体、受体介导的输送***或病毒载体，例如疱疹病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒及其他。治疗性核酸组合物配制在药物可接受的载体中。治疗性组合物还可以包括如上所述的基因输送***。药物可接受的载体是适合施用于动物的生物相容性溶媒，例如生理盐水。化合物的治疗有效量是能够产生医学上理想的结果——例如受治疗动物中A2254或A5623基因产物产生降低、细胞生长如增殖降低，或者体内肿瘤生长降低——的量。

胃肠外给药例如静脉内、皮下、肌肉内和腹腔内输送途径可用于输送A2254或A5623的siRNA组合物。为了治疗乳腺肿瘤，向腹动脉、脾动脉或肝总动脉直接输注是有用的。

任何一个患者的剂量取决于多种因素，包括患者的身材、体表面积、年龄、待施用的特定核酸、性别、给药的时间和途径、一般健康状况、以及同时施用的其他药物。核酸的静脉内给药剂量为核酸分子的大约10⁶-10²²个拷贝。

多核苷酸通过标准方法给药，例如通过注射到组织如肌肉或皮肤的间质空间，引入到循环***或者体腔，或者通过吸入或吹入。多核苷酸与药物可接受的液体载体例如水性或部分水性的液体载体一起注射或者通过其他方式输送给动物。多核苷酸与脂质体(例如阳离子或阴离子脂质体)结合。多核苷酸包含被靶细胞表达所需的遗传信息，例如启动子。

或者患有肿瘤，特别是乳腺肿瘤的患者可以通过施用抑制A5623多肽与A2254多肽之间结合的化合物加以治疗。不受限于理论，我们相信A5623多肽与A2254多肽的相互作用的抑制剂可改变、相互影响、调节、干扰、破坏A5623多肽与A2254多肽的结合或者A2254多肽与A5623多肽的结合。从而，相信两种蛋白质均不再能够象它们在癌细胞内那样相互作用。因此，进一步相信，两种蛋白质在癌发生中——特别是乳腺癌发生中，如本发明人的观察结果所提示的——所发挥的关键作用可以被阻断，从而可以实现癌症特别是乳腺癌的预防或治疗。

除非另有定义，本文所用的全部技术和科学术语的意义与本发明所属领域中普通技术人员所共同理解的意义相同。尽管在实践或测试本发明时可以使用与本文所公开的方法和材料相似或等价的方法和材料，但是下文仍然描述了合适的方法和材料。本文引用本文中提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献的全部内容作为参考。如有矛盾，则以包括定义在内的本说明书为准。此外，材料、方法和实施例只是举例说明，而没有任何限制意义。

减少或抑制A5623和A2254之间结合的化合物的产生和鉴定

考虑本实施例中提供的证据，本发明的一个方面涉及减少或防止A5623与A2254之间结合的测试化合物的鉴定。

用于确定A5623/A2254结合的方法包括任何用于确定两个蛋白质间相互作用的方法。下文描述了其它方法。这些测定包括，但不限于传统的方法，例如交联、免疫共沉淀和通过梯度或色谱柱共纯化。此外，可以使用基于酵母的遗传***监视蛋白-蛋白相互作用，该***如Fields和其合作者所描述(Fields and Song，Nature 340：245-6(1989)；Chien et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，9578-82(1991))，并如Chevray和Nathans所公开(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5789-93(1992))。许多转录激活物，例如酵母GALA，由两个物理上分离的调节域构成，一个充当DNA结合域，另一个发挥转录激活域的作用。在先出版物中描述的酵母表达***(一般称作“双杂交***”)就是利用这一性质，并采用两个杂合蛋白质，在其中一个中靶蛋白与GAL4的DNA结合域融合，在另一个内，候选激活蛋白与激活域融合。GAL1-lacZ报道基因在GALA激活的启动子控制下的表达，取决于GAL4活性通过蛋白-蛋白相互作用的重建。含有相互作用多肽的菌落可以用β-半乳糖苷酶的显色底物加以检测。用双杂交技术鉴定两个特定蛋白质之间蛋白-蛋白相互作用的完整试剂盒(MATCHMAKER^TM)可以从Clontech购买。这个***还可以扩展到用于参与特定蛋白相互作用的蛋白域作图以及定位对于这些相互作用至关重要的氨基酸残基。

尽管本申请提到的是″A5623″或″A2254″，但是应当理解，在对这两者的相互作用进行分析或操作时，可以用这些蛋白质之一或二者的结合部分代替这些蛋白质的全长拷贝。通过用A5623的标准缺失分析和/或诱变以鉴定结合A2254的片段，可以容易地鉴定出结合A2254的A5623片段。可以使用类似的分析来鉴定A2254的A5623结合性片段。

如本文所公开的，任何测试化合物，包括例如蛋白质(包括抗体)、突变蛋白(mutein)、多核苷酸、核酸、核酸适体、和多肽及非肽小有机分子，均可用作本发明的测试化合物。测试化合物可以从天然来源分离，合成或重组制备，或者它们的任意组合。

例如，肽可以用E.Gross和J.Meienhoffer主编的《Peptides》第二版中由G.Barany和R.B.Merrifield撰写的“Solid Phase Peptide Synthesis(固相肽合成)”一节，Academic Press，New York，N.Y.，pp.100-118(1980)中描述的固相技术合成制备。类似地，核酸也可以用Beaucage、S.L.，& Iyer，R.P.(1992)Tetrahedron，48，2223-311；和Matthes et al.，EMBO J.，3：801-5(1984)中描述的固相技术加以合成。

在鉴定抑制肽时，用各种氨基酸模拟物或非天然氨基酸修饰本发明的肽，对于提高肽在体内的稳定性特别有用。稳定性可以用多种方法测定。例如，肽酶和各种生物介质，如人血浆和血清，已经被用于测试稳定性。见例如Verhoef et al.，Eur.J.Drug Metab Pharmacokinet.11：291-302(1986)。其他本领域已知的有用肽修饰包括糖基化和乙酰化。

重组和化学合成技术均可以用来产生本发明的测试化合物。例如，可通过***到合适的载体内产生测试化合物的核酸，其可以在转染到感受态细胞中后表达。或者，可以利用PCR技术或者在合适宿主中表达来扩增核酸(见例如Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，1989、Cold Spring Harbor Laboratory、New York、USA)。

肽和蛋白质还可以用本领域公知的重组技术进行表达，例如通过用重组DNA构建体转化合适的宿主细胞，如Morrison，J.Bact.，132：349-51(1977)；和Clark-Curtiss & Curtiss，Methods in Enzymology，101：347-362(Wu et al.，eds，1983)所述。

抗A5623和抗A2254抗体

在本发明的一些方面中，测试化合物是抗A5623或抗A2254抗体。在一些实施方案中，抗体是嵌合抗体，包括但不仅限于人源化抗体。在一些情况下，本发明的抗体实施方案在这些蛋白质与其他蛋白质结合的界面上结合A5623或A2254。在一些实施方案中，在生理条件下，这些抗体结合A5623或A2254的K_a至少为大约10⁵mol^-1、10⁶mol^-1或者更大、10⁷mol^-1或者更大、10⁸mol^-1或者更大、或者10⁹mol^-1或者更大。这些抗体可以从商业来源购得，例如Chemicon公司(Temecula Calif.)，或者可以用例如基本上纯化的A5623或A2254蛋白，例如人蛋白或其片段，作为免疫原来激发产生。由给定免疫原制备单克隆和多克隆抗体的方法在本领域是公知的。关于特定免疫原抗体的纯化技术和鉴定方法见例如PCT/US02/07144(WO/03/077838)，本文引用其内容作为参考。用例如抗体亲和基质形成亲和柱来纯化抗体的方法在本领域是公知的，并可商业上获得(AntibodyShop、Copenhagen、Denmark)。能够破坏A5623/A2254结合的抗体的鉴定，使用下文详述的一般测试化合物的测试方法进行。

转换酶(converting enzymes)

转换酶可以用作本发明的测试化合物。在本发明的上下文中，转换酶是对A5623或A2254之一或者它们两者进行共价翻译后修饰的分子催化剂。本发明的转换酶将以下面所述的方式共价修饰A5623和/或A2254的一个或多个氨基酸残基：其导致被修饰蛋白的结构发生别构变化，或者改变被修饰蛋白的A5623/A2254分子结合位点化学或结构从而干扰A5623与A2254之间的结合。干扰两个分子之间的结合，是指相对于在30℃、离子强度0.1和不存在去垢剂的条件下测得的蛋白间的K_a，使结合K_a降低至少25％、30％、40％、50％、60％、70％或者更多。本发明的转换酶实例包括激酶、磷酸酶、酰胺酶、乙酰化酶、糖苷酶等。

构建测试化合物文库

尽管测试化合物文库的构建在本领域是公知的，本部分仍然提供了在鉴定测试化合物并构建这些化合物的文库，用于筛选A5623/A2254相互作用的有效抑制剂的的额外指导。下文提供关于化合物文库的进一步指导。

分子建模

对具有目标性质的化合物的分子结构和/或对待抑制靶分子即A5623和A2254的分子结构的知识，方便了测试化合物文库的构建。预筛选适于进一步评估的测试化合物的方法之一，是对测试化合物与其靶标的相互作用进行计算机建模。在本发明中，A5623与A2254相互作用的建模提供了对相互作用本身细节的认识，并提示了干扰该相互作用的可能策略，包括相互作用的潜在分子抑制剂。

计算机建模技术为所选分子的三维原子结构的可视化以及与该分子相互作用的新化合物的合理设计提供了可能。三维构建典型地依赖于从所选分子的x-射线晶体分析或NMR成像而来的数据。分子动力学需要力场数据。计算机图形***为预测新化合物如何连接靶分子，以及实验操作化合物和靶分子的结构以优化结合特异性提供了可能。为了预测当分子之一或二者中产生细小改变对分子-化合物相互作用是什么样的，需要分子力学软件和计算密集型计算机，它们通常关联着分子设计程序和用户之间的用户友好的、菜单驱动的界面。

上文一般性描述的分子建模***的一个实例，是由CHARMm和QUANTA程序构成，Polygen Corporation，Waltham，Mass。CHARMm执行能量最小化和分子动力学功能。QUANTA执行构建、图形建模和分子结构分析。QUANTA为分子相互行为的分析、可视化、修饰和相互作用性构建提供了可能。

大量文献综述了与特定蛋白质相互作用的药物的计算机建模，例如Rotivinen，et al.Acta Pharmaceutica Fennica 97，159-166(1988)；Ripka，NewScientist 54-57(Jun.16、1988)；McKinlay and Rossmann，Annu.Rev.Pharmacol.Toxiciol.29，111-122(1989)；Perry and Davies，Prog Clin BiolRes.291：189-93(1989)；Lewis and Dean，Proc.R.Soc.Lond B Biol Sci.236，125-40和141-62(1989)；以及关于核酸组分的模型受体，有Askew、et al.，J.Am.Chem.Soc.111、1082-90(1989)。

其他筛选和图形描述化学物质的计算机程序可以例如BioDesign Inc.，Pasadena，Calif.，Allelix Inc.，Mississauga，Ontario，Canada和Hypercube Inc.，Cambridge，Ontario等公司获得。见例如DesJarlais et al.(1988)J.Med.Chem.31：722-9；Meng et al.(1992)J.Computer Chem.13：505-24；Meng et al.(1993)Proteins 17：266-78；Shoichet et al.(1993)Science 259：1445-50。

一旦鉴定了A5623/A2254相互作用的假定抑制剂，就可以根据已鉴定的假定抑制剂的化学结构使用组合化学技术构建任何数目的变体，如下文所述。对于最终的假定抑制剂或“测试化合物”文库可使用本发明的方法进行筛选，以鉴定该文库中干扰A5623/A2254结合的测试化合物。

组合化学合成

测试化合物的组合文库可作为涉及在已知A5623/A2254相互作用抑制剂中存在的核心结构的知识的合理药物设计程序的一部分而产生。这种方法使文库保持合理的大小，便于高通量筛选。或者可通过简单合成构成该库的分子家族的全部排列构建简单的，特别是短的聚合物分子文库。后一种方法的实例是由长度为6个氨基酸的全部肽构成的文库。这种肽文库可包括每一个6氨基酸序列排列。这种类型的文库称作线性组合化学文库。

组合化学文库的制备是本领域技术人员所公知的，并可通过化学或生物合成产生。组合化学库包括，但不限于肽文库(见例如美国专利5,010,175，Furka，Int.J.Pept.Prot.Res.37：487-93(1991)和Houghten et al.，Nature354：84-6(1991))。也可以采用其他用于产生化学多样性库的化学。这类化学包括，但不仅限于：肽(例如PCT公开第WO 91/19735号)，被编码的肽(例如PCR公开第WO 93/20242号)，随机生物寡聚体(例如PCT公开第WO92/00091号)，苯并二氮卓(benzodiazepine)(例如美国专利第5,288,514号)，diversomers如乙内酰脲类(hydantoins)，苯并二氮卓类(benzodiazepines)和二肽(dipeptides)(DeWitt et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6909-13(1993))，插烯(vinylogous)多肽(Hagihara et al.、J.Amer.Chem.Soc.114：6568-70(1992))，具有葡萄糖骨架的非肽性肽模拟物(Hirschmann et al.，J.Amer.Chem.Soc.114：9217-8(1992))，小化合物文库的类似有机合成(Chen et al.，J.Amer.Chem.Soc.116：2661(1994))，寡聚氨基甲酸酯(oligocarbamates)(Cho et al.，Science 261：1303(1993))，和/或肽基膦酸盐或酯(peptidylphosphonate)(Campbell et al.，J.Org.Chem.59：658(1994))，核酸文库(见Ausubel，andSambrook，全部见上文)，肽核酸文库(见例如美国专利5,539,083)，抗体文库(见例如Vaughan et al.，Nature Biotechnology，14(3)：309-14(1996)和PCT/US96/10287)，糖文库(见例如Liang et al.、Science、274：1520-2(1996)和美国专利5,593,853)，小有机分子库(见例如，苯并二氮卓，Gordon EM.CurrOpin Biotechnol.1995 Dec 1；6(6)：624-31.；类异戊二烯，美国专利5,569,588；噻唑啉酮类(thiazanones)和间噻唑啉酮类(metathiazanones，美国专利5,549,974；吡咯烷类，美国专利5,525,735和5,519,134；吗啉代化合物，美国专利5,506,337；苯并二氮卓、5,288,514等)。下文提供了关于组合化学合成进一步的指导。

噬菌体展示

另一种方法使用重组噬菌体产生文库。使用“噬菌体方法”(Scott andSmith，Science 249：386-90、1990；Cwirla，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.、87：6378-82、1990；Devlin et al.，Science，249：404-6，1990)可以构建非常大的文库(例如10⁶-10⁸个化学实体)。第二种方法主要使用化学方法，其实例是Geysen法(Geysen et al.，Molecular Immunology 23：709-15，1986；Geysen etal.J.Immunologic Method 102：259-74，1987)和Fodor等人的方法(Science251：767-73，1991)。Furka等(第14届国际生物化学会议，第5卷，摘要FR：013、1988；Furka、Int.J.Peptide Protein Res.37：487-493，1991)，Houghten(美国专利No.4,631,211，1986年12月公开)和Rutter等(美国专利No.5,010,175，1991年4月23日公开)描述了产生能够作为激动剂或拮抗剂加以测试的肽混合物的方法。

制备组合文库的设备可以商业获得(见例如357MPS、390MPS、Advanced Chem Tech，Louisville KY，Symphony，Rainin，Woburn，MA，433A Applied Biosystems，Foster City，CA，9050 Plus，Millipore，Bedford，MA)。此外，大量组合文库本身也可商业获得(见例如ComGenex，Princeton，N.J.，Tripos，Inc.，St.Louis，MO，3D Pharmaceuticals，Exton，PA，MartekBiosciences，Columbia，MD，等)。

测试化合物文库的筛选

本发明的筛选方法可针对具有干扰A5623/A2254结合的高可能性的测试化合物提供高效而快速的鉴定。一般地，任何确定测试化合物干扰A5623/A2254结合能力的方法均适用于本发明。例如，可以采用ELISA样式的竞争性和非竞争性抑制测定。应当进行对照实验以确定***的最大结合能力(例如在下文的实例中，使结合的A5623与A2254接触，并确定与A5623结合的A2254的量)。下面提供了筛选测试化合物文库的进一步指导。

竞争性测定样式

竞争性测定可用于筛选本发明的测试化合物。作为实例，竞争性ELISA样式可以包括与固体支持物结合的A5623(或A2254)。结合的A5623(或A2254)与A2254(或A5623)及测试化合物共温育。经过足够的时间使测试化合物和/或A2254(或A5623)结合A5623(或A2254)，清洗底物以除去未结合材料。然后确定与A5623结合的A2254的量。这可以用本领域已知的多种方法中的任何一种来实现，例如使用带有可检测标记作为标签的A2254(或A5623)种类，或者使已清洗的底物与标记的抗A2254(或A5623)抗体接触。与A5623(或A2254)结合的A2254(或A5623)的量将与测试化合物干扰A2254/A5623结合的能力成反比。关于蛋白质——包括但不仅限于抗体——的标记，如下面的文献所记载：Harlow & Lane，Antibodies，A LaboratoryManual(1988)。

在一种变化形式中，用亲和标签标记A5623(或A2254)。然后，将标记的A5623(或A2254)与测试化合物和A2254(或A5623)一起温育，然后进行免疫沉淀。然后用抗A2254(或A5623)抗体对免疫沉淀物进行Western印迹。与前面的竞争性测定样式一样，被发现与A5623(或A2254)结合的A2254(或A5623)的量与测试化合物干扰A2254/A5623结合的能力成反比。

非竞争测定形式

对于构建样式不适于立即利用竞争性测定加以筛选的测试化合物文库，如本文所述的那些文库而言，非竞争性结合测定作为初始筛选可能也是有用的。上述文库的实例是噬菌体展示库(见例如Barret，et al.(1992)Anal.Biochem 204，357-364)。

噬菌体文库有用之处在于能够快速产生工作量的很多种不同重组肽。噬菌体文库不适于本发明的竞争性测定，但是可以以非竞争样式高效地进行筛选，确定何种重组肽测试化合物结合A5623或A2254。然后可以制备已鉴定为结合性的测试化合物，并用竞争性测定样式加以筛选。噬菌体和细胞展示文库的产生和筛选在本领域是公知的，在例如如下文献中有讨论：Ladner et al.，WO 88/06630；Fuchs et al.(1991)Biotechnology 9：1369-72；Goward et al.(1993)TIBS 18：136-40；Charbit et al.(1986)EMBO J 5，3029-37；Cull et al.(1992)PNAS USA 89：1865-9；Cwirla，et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87，6378-82。

示例性的非竞争性测定遵循与上述竞争性测定相似的程序，只是不添加其中一种组分(A5623或A2254)。然而，由于非竞争样式确定的是测试化合物对A5623或A2254的结合，需要对于每个候选物确定测试化合物结合A5623和A2254二者的能力。因此，例如，可通过下列步骤确定测试化合物与固定A5623的结合：清洗掉未结合的测试化合物；从支持物洗脱结合的测试化合物，随后通过例如质谱，蛋白测定(Bradford或Lowry测定，或280nm吸光度的定)对洗脱物进行分析。或者可以省略洗脱步骤，通过监测支持物表面上有机层光谱学性质的变化确定测试化合物的结合。监测表面光谱学性质的方法包括，但不限于吸光度、反射率、透光度、双折射、折光率、衍射、表面等离子体共振、椭圆偏振测量、共振镜(resonant mirror)技术、光栅耦合波导技术和多极共振光谱，所有这些对于本领域技术人员而言是已知的。在测定中还可使用标记的测试化合物，从而省去洗脱步骤。在这种情况下，洗去未结合材料后与支持物结合的标记的量与测试化合物的结合成正比。

已经开发了大量公知的机器人***，用于溶液相化学。这些***包括自动工作站，如Takeda Chemical Industries公司(Osaka，Japan)开发的自动合成装置，以及许多利用机器手的机器人***(Zymate II、Zymark公司、Hopkinton，Mass.；Orca，Hewlett Packard，Palo Alto，Calif.)，它们模拟化学技术人员的手工合成操作。上面的任何一种设备均适合于利用本发明。为使其能够如本文所述地工作而对这些设备所作的修改(如果有的话)的性质和实施，对于相关领域的技术人员而言是显而易见的。此外，可以商业获得大量的组合文库(见例如ComGenex，Princeton、N.J.，Asinex，Moscow，Ru，Tripos，Inc.，St.Louis，MO、ChemStar，Ltd，Moscow，RU，3DPharmaceuticals，Exton，PA，Martek Biosciences，Columbia，MD，等)。

转换酶筛选

对于是转换酶的测试化合物，可以在非竞争样式下，用待测定转换酶特异性的辅因子和辅助底物加以测定。给定待研究的转换酶类型后，这些辅因子和辅助底物对于本领域的技术人员是已知的。

用于转换酶的一个示例性筛选程序包括首先在辅因子和辅助底物的存在下，优选在生理条件下，使A5623和/或A2254与转换酶接触，其中所述辅因子和辅助底物对于转换酶的特征性蛋白的共价修饰是必需的。然后测试被修饰的蛋白结合其结合配偶体的能力(即A5623对A2254的结合)。然后比较被修饰的蛋白与其结合配偶体的结合与未修饰对照对的结合，确定如上所述的必要K_a变化是否得以实现。

为了在执行测定时便于蛋白质的检测，可以利用本领域技术人员公知的技术将一种或多种蛋白用上述的可检测标记加以标记。

筛选方法

上述的筛选实施方案适合于高通量确定适于进一步研究的测试化合物。特别地，本发明的筛选优选地包括如下检测步骤：

(a)在测试化合物的存在下，使包含A5623多肽的A2254-结合域的多肽与包含A2254多肽的A5623-结合域的多肽接触；

(b)检测多肽间的结合；和

(c)选择可抑制多肽间结合的测试化合物。

或者向正在增殖的细胞添加所研究的测试化合物，并且相对于未提供测试化合物的对照群的增殖监测该处理细胞的增殖。根据本文所提供的教导，适于筛选测试化合物的细胞系对于本领域技术人员而言是显而易见的。

对于体内测试，可以将测试化合物施用于可接受的动物模型。将基因导入到动物细胞内以表达外来基因，可根据任何方法，例如电穿孔法(Chu，et al.，Nucleic Acids Res 15：1311-26(1987))，磷酸钙法(Chen and Okayama，Mol Cell Biol 7：2745-52(1987))，DEAE葡聚糖法(Lopata et al.，Nucleic AcidsRes 12：5707-17(1984)，脂质体转染试剂(lipofectin)法(Derijard B，et al.Cell 7：1025-37(1994)；Lamb et al.，Nature Genetics 5：22-30(1993)：Rabindran et al.，Science 259：230-4(1993))等来实施。基因可以表达与标签(例如HA或Myc)融合的蛋白质。

用免疫组织化学染色考察A5623和A2254的亚细胞定位。用标签-A5623、标签-A2254或其组合转染细胞。可以利用显微镜例如荧光显微镜获得定位图像。

在优选实施方案中，可以通过将A2254和A5623基因的表达载体转染入合适的细胞系而获得同时表达A2254和A5623的细胞。例如，可以使用HEK293、SW480或COS7细胞作为细胞系。而且，检测试剂优选地是识别A2254的抗体。或者，当A2254或A5623表达为与标签的融合蛋白时，可使用任何可识别蛋白质所融合的标签的抗体作为检测试剂。在本发明的试剂盒中，抗体可以用荧光剂(例如FITC、TAMRA或GFP)标记。

特别地，如本文所述，本发明人观察到A5623多肽与A2254多肽相互作用。因此，相信两种多肽的相互作用在癌症发生，特别是乳腺癌发生中发挥关键作用。因此，我们意图筛选可用于治疗或预防癌症，特别是乳腺癌的化合物，其抑制A5623多肽与A2254多肽的相互作用或者其相反的相互作用。即，在测试化合物的存在下，使包含A5623多肽的A2254-结合域的多肽与包含A2254多肽的A5623-结合域的多肽接触，检测两个多肽间的结合，并选择抑制两个多肽间结合的测试化合物。当然，作为选择，还可以在测试化合物的存在下，使包含A2254多肽A5623-结合域的多肽与包含A5623多肽A2254-结合域的多肽接触。

优选地，含有A2254结合域的多肽包括A5623多肽，含有A5623结合域的多肽包括A2254多肽。

术语“使......接触”包括在测试化合物的存在下，通过使用测试化合物的领域已知的技术和方法，使包含A5623多肽的A2254-结合域的多肽与包含A2254多肽的A5623-结合域的多肽接触，或者使包含A2254多肽的A5623-结合域的多肽与包含A5623的多肽A2254-结合域的多肽接触。

例如，可应用基于细胞的测定或无细胞测定来筛选A5623多肽与A2254多肽的结合抑制剂。在基于细胞测定的一个实例中，可以使用表达含A5623结合域的多肽和含A2254结合域的多肽的细胞进行筛选。在无细胞测定的一个实例中，可以使用部分或完全纯化的含A5623结合域的多肽和部分或完全纯化的含A2254结合域的多肽。当然，也可以使用表达含A5623结合域的多肽和含A2254结合域的多肽的细胞的提取物。

上文描述了试验测定和方法的进一步的实例。

术语“测试化合物”或“待测试化合物”是指作为A5623和A2254相互作用的假定抑制剂，将要通过本发明的一种或多种筛选方法加以测试的分子或物质或化合物或组合物或药剂，或其任意组合。测试化合物可以是任何化学物质，例如无机化学物质、有机化学物质、蛋白质、肽、糖、脂类、或其任意组合，或者本文所述化合物、组合物或药剂的任何一种。应当理解，术语“测试化合物”当用于本发明上下文中时，可以和术语“测试分子”、“测试物质”、“潜在候选物”、“候选物”或上文提到的术语互换使用。

因此，我们设想了将小肽或类肽分子用于相互作用抑制剂的筛选方法中。这种小肽或类肽分子结合并占据A5623结合域或A2254结合域之一的相互作用域或者它们二者的相互作用域，藉此分别使得A5623或A2254结合域不能被A2254多肽或A5623多肽触及。而且，设想任何生物或化学组合物或物质均可作为相互作用抑制剂。抑制剂的抑制功能可以用本领域已知的方法加以测量。这些方法包括相互作用测定，如免疫沉淀测定、ELISA、RIA。同样，在筛选A5623与A2254结合或者相反结合的抑制剂时优选要使用的潜在候选分子或候选分子混合物，可以是，典型地，化学或生物来源的物质、化合物或组合物，其是自然存在的和/或合成、重组和/或化学产生的。因此，候选分子可以是与A5623和/或A2254多肽结合和/或相互作用的蛋白质、蛋白质片段、肽、氨基酸和/或其衍生物，或者其他化合物，例如离子。合成化合物文库可以从Maybridge Chemical Co.(Trevillet，Cornwall，UK)、Comgenex(Princeton，N.J.)、Brandon Associates(Merrimack，N.H.)和Microsource(New Milford.Conn.)商购。稀有化学文库可以从Aldrich(Milwaukee，Wis.)获得。或者，细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文库可以从例如Pan Laboratories(Bothell.Wash.)或MycoSearch(N.C.)获得，或者可以容易地生产。此外，天然和合成产生的文库和化合物可以容易地通过常规化学、物理或生物化学方法进行修饰。

此外，化学文库的产生在本领域是公知的。例如，使用组合化学产生要在本文所述测定中加以筛选的化合物文库。组合化学文库通过组合大量的化学“构成单位”(building block)试剂通过化学合成或生物合成产生的各种化学化合物的集合。例如，线性组合化学文库如多肽文库的形成是通过组合每种可能的氨基酸组合来产生给定长度的肽。通过这种化学构成单位的组合混合，理论上可以合成数百万种化合物。例如，一位评论者认为，***、组合地混合100个可互换的化学构成单位，可以理论上合成1亿种四聚体化合物或者100亿种五聚体化合物(Gallop A、et al.Journal ofMedicinal Chemistry、37(9)1233-51(1994))。也可以使用本领域已知的其他化学文库，包括天然产物文库。一旦组合文库产生，便对其进行筛选，寻找具有期望生物学性质的化合物。

在本发明的上下文中，筛选化合物文库以鉴定发挥A5623和A2254多肽结合抑制剂作用的化合物。例如，首先，用本领域公知的组合文库形成方法产生小分子文库。美国专利NOs.5,463,564和5,574,656就是两个这样的教导。然后对文库的化合物进行筛选以鉴定具有期望结构和功能性质的化合物。美国专利No.5,684,711讨论了用于筛选文库的方法。举例说明筛选过程：将含有A2254结合域的多肽与含有A5623结合域的多肽以及文库中的化合物相混合，并使之彼此相互作用。然后进一步观察所述化合物是否抑制这两种多肽的结合。作为实例，只要两种多肽相互作用可产生荧光信号，而该信号在测试化合物抑制多肽间结合时会减少和/或消失，则可以应用FRET技术。相应地，两种多肽均可以包含适合于FRET的标签。这类标签在本领域是众所周知的。

将每个文库化合物的特征加以编码，使得在多肽结合的抑制中表现活性的化合物能够被分析，并且已鉴定的各种化合物的共同特征能够被分离并其组合到文库的进一步迭代(interation)中。一旦筛选了一个化合物文库，即用在第一轮筛选中显示具有抗相互作用活性的化学构成单位生成后继文库。使用这种方法，随后的候选化合物迭代将具有越来越多的抑制相互作用必需的结构和功能特征，直到能够发现一组对抑制两种多肽间结合具有高度特异性的抑制剂。然后可以进一步测试这些化合物用作动物例如哺乳动物中的药物时的安全性和效力。很容易意识到，这种特定的筛选方法学只是举例。其他的方法是本领域技术人员所公知的。

例如，候选药剂包括许多种类的化学物质，但典型地它们是有机分子，优选地为分子量大约50且小于大约2500道尔顿，优选地小于大约750道尔顿，更优选地小于大约350道尔顿的有机小分子。

候选药剂还可能包含与蛋白质结构的相互作用特别是氢键所必需的功能基团，典型地包含至少一个胺基、羰基、羟基或羧基，优选地至少两个功能化学基团。候选试剂经常含有碳环或杂环结构和/或被一个或多个上述功能基团取代的芳香或聚芳香结构。

候选药剂的示例性种类可包括杂环、肽、糖类、类固醇等。这些化合物可以接受修饰以提高效力、稳定性、药物相容性等。可以利用药剂的结构鉴定来鉴定、产生或筛选其它药剂。例如，当鉴定肽试剂时，为了提高其稳定性可以用各种方法对它们进行修饰，例如使用非天然氨基酸如D-氨基酸特别是D-丙氨酸，使氨基或羧基末端功能化，例如对于氨基进行酰化或烷基化，对于羧基进行酯化或酰胺化等。其他稳定化方法可以包括包封，例如包封在脂质体中等。

如上所述，候选药剂还在生物分子中，包括肽、氨基酸、糖类、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、核酸及衍生物、结构类似物或其组合中被发现。候选药剂从广泛的来源获得，包括合成或天然化合物的文库。例如，有很多方法，包括随机化的寡核苷酸和寡肽的表达，可以用来随机和定向合成多种多样的有机化合物和生物分子。或者，细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文库是现有可用的或者可以容易地产生。此外，天然或合成产生的文库和化合物可容易地通过常规化学、物理和生物化学方法进行修饰，并可用于产生组合文库。可以对已知的药理学药剂进行定向或随机化学修饰，例如酰化、烷化、酯化、酰胺化等，以产生结构类似物。其他的测试化合物可以是适体、抗体、affybody、trinectin或anticalin，或类似化合物。当然，对A5623或A2254特异性的适体、抗体、affybody、trinectin或anticalin自身可能已经是A5623与A2254之间结合的抑制剂，因此可以容易地用于治疗或预防癌症，特别是乳腺癌的方法。

通过本文所述的用于筛选A5623多肽与A2254多肽结合抑制剂的方法所鉴定的化合物可用于预防或治疗癌症，特别是乳腺癌。因此，抑制剂具有这样的性质：直接或间接与A2254结合域和/或A5623结合域相互作用，藉此，如本文所述的，影响这些域的相互作用，使它们不再能够像在癌细胞，特别是乳腺癌细胞中那样相互作用。

例如，抑制剂可以是抗A2254结合域或A5623结合域的抗体。这种抑制剂的另一种实例是affybody、适体、anticalin或trinectin。

筛选和治疗试剂盒

在一个实施方案中，本发明提供了用于筛选可用于治疗或预防乳腺癌的制品或试剂盒，其中该试剂盒包括：(a)A5623多肽的A2254-结合域；(b)A2254多肽的A5623-结合域；和(c)检测这两种多肽间相互作用的试剂。如上文讨论的，含有A2254结合域的多肽可以包括全长的A5623多肽或其A2254结合部分。类似地，含有A5623结合域的多肽可以包括全长的A2254多肽或其A5623结合部分。

在本发明进一步的实施方案中，提供了制品和试剂盒，其含有可用于治疗本文所述病理状况的材料。该制品可以包括本文所述药剂的容器和标签。合适的容器包括例如瓶、小瓶和试管。容器可以用各种材料形成，例如玻璃或塑料。在本发明的上下文中，容器容纳具有活性剂的组合物，该活性剂可有效治疗细胞增殖性疾病例如乳腺癌。在一个实施方案中，组合物中的活性剂是已鉴定为能够在体内破坏A5623/A2254结合的测试化合物(例如抗体、小分子等)。容器上的标签应当指明该组合物用于治疗一种或多种以异常细胞增殖为特征的状况。标签还可以给出施用和监测技术，例如本文所述的技术的指导。

除了上述容器之外，本发明的试剂盒还可以任选地包括容纳药物可接受稀释剂的第二容器。它可以进一步包括其他商业和用户角度看理想的材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器材、针头、注射器和带有使用指导的说明书。

如果期望的话，组合物可以存在于包装或分配装置内，包装或分配装置可以包含一个或多个含有活性成分的单位剂型。包装可以例如包括金属或塑料箔，例如泡壳包装。包装或分配设备可以和施用指导放在一起。还可以制备在相容性药物载体中配制的包含本发明化合物的组合物，放在合适的容器内，并标记用于治疗指定病症的标签。

附图简述

图1显示了在来源于乳腺癌患者(上图面)的肿瘤细胞(3T、31T、149T、175T、431T、453T、491T、554T、571T、709T、772T和781T)、乳腺癌细胞系(HBC4、HBC5、HBL100、HCC1937、MCF7、MDA-MB-231、SKBR3、T47D、YMB1)(下图面)和正常人组织中(A)A2254和(B)A5623表达的半定量RT-PCR结果。

图2显示了在各种人组织(上图面)和乳腺癌细胞系及正常人生命器官(下图面)中(A)A2254和(B)A5623转录物的Northern印迹分析照片。

图3显示了(A)A2254和(B)A5623的基因组结构。A2254具有2个不同的变体，指称为V1和V2，A5623也具有3个不同的变体(V1、V2和V3)。上图；基因组结构，下图；对每种变体特异性的半定量RT-PCR结果。

图4A是通过Western印迹分析显示的A2254蛋白的外源表达。图4B显示了A2254蛋白的亚细胞定位。图4C通过Western印迹分析显示了A5623V1、A5623V2和A5623V3蛋白的外源表达。图4D-F显示了(D)A5623V1、(E)A5623V2和(F)A5623V3蛋白的亚细胞定位。

图5显示了设计用于降低乳腺癌细胞中A2254表达的小干扰RNA(siRNAs)的生长抑制效果。图5A显示了在乳腺癌细胞系T47D(左图面)和HBC5(右图面)中A2254内源表达受抑制的半定量RT-PCR。GAPDH用作内部对照。图5B显示的是MTT测定，其表明通过敲低T47D(左图面)和HBC5(右图面)细胞中的A2254降低了集落的数目。图5C显示的是集落形成测定，其表明通过敲低T47D(左图面)和HBC5(右图面)细胞中的A2254降低了集落的数目。

图6显示了设计用于降低乳腺癌细胞中A5623表达的小干扰RNA(siRNAs)的生长抑制效果。图6A显示了在乳腺癌细胞系T47D(左图面)和HBC5(右图面)中A5623内源表达受抑制的半定量RT-PCR。GAPDH用作内部对照。图6B显示的是MTT测定，其表明通过敲低T47D(左图面)和HBC5(右图面)细胞中的A5623降低了集落的数目。图6C显示的是集落形成测定，其表明通过敲低T47D(左图面)和HBC5(右图面)细胞中的A5623降低了集落的数目。

图7。A5623和A2254在乳腺癌细胞系和组织切片中的表达。图7A，乳腺癌细胞系中的内源A5623和A2254表达与HMEC细胞系中的比较，其是用抗A5623抗体或抗A2254抗体进行Western印迹分析而考察的。图7B，在乳腺癌细胞系中，内源A5623蛋白或A2254蛋白在细胞周期中的亚细胞定位。使用亲和纯化的抗-A5623多克隆抗体或抗-A2254多克隆抗体(绿色)，对HBC4、HBC5和MCF-7细胞进行A5623的免疫组织化学染色，对HBC5细胞进行A2254的免疫组织化学染色，并用DAPI(蓝色)染色以区分细胞核(见材料和方法)。白色箭头指示末期细胞中间体中A5623的定位。图7C，乳腺癌和正常组织切片(正常乳腺组织、肺、心脏、肝脏、肾和睾丸)的免疫组织化学染色结果。内源A5623蛋白用抗-A5623抗体染色。正常乳腺组织(样品No.10441)中几乎不可检测到表达，但是在所有研究的癌组织中癌细胞均被强烈染色，包括实性管状癌(sold-tubular carcinoma)(样品No.234)、***管状癌(papillotubular carcinoma)(样品No.240)和硬癌(样品No.179)。代表性图来自于原始放大倍数x 200的显微镜观察。

图8A5623与A2254间的相互作用。图8A，通过半定量RT-PCR检测的A5623和A2254在乳腺癌细胞系(HBC4、HBC5、HBL100、HCC1937、MCF7、MDA-MB-231、SKBR3、T47D、YMB1)和正常人组织(N，正常乳腺导管细胞；MG，乳腺；LUN，肺；LIV，肝；HEA，心脏；KID，肾；以及BM，骨髓)中的表达。图8B、C，A5623与A2254的免疫共沉淀。对来自转染了HA标签A2254和Flag标签A5623蛋白的COS7细胞的细胞裂解物用抗HA或抗Flag免疫沉淀。免疫沉淀物用单克隆抗HA或抗Flag抗体进行免疫印迹。图8D，内源A5623或A2254在稳定表达细胞中的亚细胞定位。左图面显示在稳定表达A2254的细胞中，内源A5623蛋白(红色)与外源A2254蛋白(绿色)共定位，而右图面显示在稳定A5623细胞中，内源A2254(红色)与外源A5623(绿色)共定位。外源A2254蛋白(红色)与外源A5623蛋白共定位(右图)。

图9外源A2254在NIH3T3细胞中的促生长或浸润作用。图9A，表达高水平或中等水平外源A2254的细胞或者模拟载体转染的细胞的Western印迹分析。用抗HA标签单克隆抗体确认了A2254表达的外源引入。用β-肌动蛋白用作上样对照。图9B，NIH3T3-A2254细胞的体外生长。用A2254(NIH3T3-A2254-#1、-#2、-#3、和-#4)和模拟物(NIH3T3-模拟-#1、-#2、-#3)转染NIH3T3细胞，通过MTT测定加以测量。图9C，Matrigel浸润测定证实NIH3T3-A2254--#3、和-#4和NIH3T3-模拟-#1可增强浸润。计算迁移通过Matrigel包被滤膜的细胞数目。每次一式三孔进行3次测定。

实施本发明的最佳模式

在下面的实施例中将对本发明进行进一步的描述，它们并不限制由权利要求所述的本发明的范围。

[一般方法]

细胞系和临床材料

人乳腺癌细胞系HBC4、HBC5、MDA-MB-231由Yamori博士(财团法人癌研究会，东京)惠赠，BT-549、MCF-7、T47D、SKBR3、HCC1937、MDA-MB-435S、YMB1、HBL100和COS7从ATCC获得。全部细胞培养在合适的培养基中，即BT-549、HBC4、HBC5、SKBR3、T47D、YMB1、和HCC1937用RPMI-1640(Sigma、St.Louis、MO)(含2mM L-谷氨酰胺)；HBL100、COS7用Dulbecco修饰的Eagle培养基(Invitrogen、Carlsbad、CA)；MCF-7用含0.1mM必需氨基酸(Roche)，1mM丙酮酸钠(Roche)、0.01mg/ml胰岛素(Sigma)的EMEM(Sigma)，MDA-MB-231和MDA-MB-435S用L-15(Roche)。每种培养基均添加10％胎牛血清(Cansera)和1％抗生素/抗真菌剂溶液(Sigma)。MDA-MB-231和MDA-MB-435S细胞维持在37℃无CO₂的湿润气氛中。其他的细胞系维持在37℃含5％CO₂的湿润气氛中。临床样品(乳腺癌和正常乳腺导管)从外科标本获得，并获得了所有患者的相关知情同意。

我们的cDNA微阵列上A2254和A5623的斑点所代表的新人类基因的分离

为了检测在乳腺癌中通常被上调的基因，对微阵列上27,648个基因的全部表达图式进行了筛选，以选择分别在＞50％的i)全部77个绝经前乳腺癌病例，ii)69个浸润性导管癌，iii)31个高度低分化损害、iv)14个中等低分化损害或v)24个低分化损害的病例中表达比＞3.0的基因。在全部493个在肿瘤细胞中表现为上调的基因中，我们着眼于内部标识号为A2254和A5623的基因，因为它在超过50％的提供信息的乳腺癌病例中的表达比大于3.0，而通过正常人组织表达模式发现它在包括心脏、肺、肝和骨髓在内的正常组织中过低表达。

半定量RT-PCR分析

我们从激光捕获细胞的各个群体中提取总RNA，然后进行基于T7的扩增和反转录，如前文所述(Ono K、et al.、Cancer Res.、60、5007-11、2000)。我们通过监测甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为定量内部对照，制备了每种单链cDNA的合适的稀释物，用于随后的PCR扩增。PCR引物序列如下：

5′-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3′(SEQ ID NO；1)和

5′-GGTTGAGCACAGGGTACTTTATT-3′(SEQ ID NO；2)用于GAPDH；

5’-AACTTAGAGGTGGGAGCAG-3’(SEQ ID NO：45)和

5’-CACAACCATGCCTTACTTTATC-3’(SEQ ID NO：46)用于β2MG；

5′-ACTCTAGGACTTGCATGATTGCC-3′(SEQ ID NO；3)和

5′-TGGGTGTCAAACCAAACAGA-3′(SEQ ID NO；4)用于A2254V1，

5′-GTTAGAACTTGTTTCCTCCTCCG-3′(SEQ ID NO；5)和

5′-ATCCTCAATGGTATTTCAGC-3′(SEQ ID NO；6)用于A2254V2，

5′-GTGGTCCTAGGAGACTTGGTTTT-3′(SEQ ID NO；7)和

5′-TACATGCATACCCCCAACAA-3′(SEQ ID NO；8)用于A5623的共有区域，

5′-GCTTCAGCGAGAACTTTC-3′(SEQ ID NO；9)和

5′-CAACTGTAACACTCATTCACATC-3′(SEQ ID NO；10)用于A5623V1，

5′-CTATTCTGAGTTTGCGCGAGAAC-3′(SEQ ID NO；11)和

5′-CAACTGTAACACTCATTCACATC-3′(SEQ ID NO；10)用于A5623V2，

5′-CATCCTGAGTGCGAGAACTTTC-3′(SEQ ID NO；12)和

5′-CAACTGTAACACTCATTCACATC-3′(SEQ ID NO；10)用于A5623V3。

Northern-blot分析

根据制造商的说明书，用Rneasy试剂盒(QIAGEN)从所有乳腺癌细胞系中提取了总RNA。用DNase I(Nippon Gene、Osaka、Japan)处理后，用mRNA纯化试剂盒(Amersham Biosciences)根据制造商的说明书分离mRNA。将1-μg等份的每种mRNA与从正常成人乳腺(Biochain)、肺、心脏、肝、肾、骨髓(BD、Clontech，Palo Alto，CA)分离的聚A(+)RNA一起在1％变性琼脂糖凝胶上分离，并转移到尼龙膜上(乳腺癌-Northern印迹)。将乳腺癌-和人多组织Northern印迹(Clontech，Palo Alto，CA)与[α³²P]-dCTP-标记的A2254和A5623PCR产物杂交，该PCR产物通过RT-PCR制备(见下文)。根据供应商的推荐进行预杂交、杂交和清洗。印迹用增感屏在-80℃放射自显影14天。针对A2254(548bp)和A5623(454bp)的特异性探针使用如下引物组通过PCR制备：

5′-ACTCTAGGACTTGCATGATTGCC-3′(SEQ ID NO；3)和

5′-TGGGTGTCAAACCAAACAGA-3′(SEQ ID NO；4)用于A2254的共有区域，

5′-GTGGTCCTAGGAGACTTGGTTTT-3′(SEQ ID NO；7)和

5′-TACATGCATACCCCCAACAA-3′(SEQ ID NO；8)用于A5623的共有区域。

此外，A2254V1的特异性探针(350bp)用如下的特异性引物组通过PCR制备：5′-CTGGAAGAGCAGGCTAGCAG-3′(SEQ ID NO；13)和

5′-GCTGCGGAGAAAGCTCTATG-3′(SEQ ID NO；14)。

表达载体的构建

为了构建A5623和A2254表达载体，用KOD-Plus DNA聚合酶(Toyobo，Osaka，Japan)通过PCR扩增PRC1 cDNA的整个编码序列。引物组为

A5623-正向，5′-CCGGAATTCTCCGCCATGAGGAGAAGTGA-3′(SEQID NO：47)(下划线表示EcoRI位点)和

A5623-反向，5′-TTGCCGCTCGAGGGACTGGATGTTGGTTGAA-3′(SEQ ID NO：48)(下划线表示XhoI位点)，

A2254-正向，5’-CCGGAATTCATGGCCATGGACTCGTCG-3’(SEQ IDNO：49)和

A2254-反向，5′-GCTCCGCTCGAGCTGGGGCCGTTTCTT-3′(SEQ IDNO：50)。将PCR产物***到pCAGGS-nHA或pCAGGS-Flag表达载体的EocRI和XhoI位点中。

抗-A5623-特异性多克隆抗体和抗-A2254-特异性多克隆抗体

使用pET21载体(Novagen、Madison、WI)制备质粒，这些质粒被设计用于分别表达A5623两个片段(179-360和234-360位氨基酸)或A2254的两个片段(86-239和124-239位氨基酸)，其中所述片段的C端带有His标签标记的表位。分别在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21codon-plus株(Stratagene、La Jolla、CA)中表达重组肽，并用Ni-NTA树脂琼脂糖(Qiagen)根据供应商的实验方案进行纯化。将纯化的重组蛋白混合在一起，然后免疫接种到兔子体内。将免疫血清在亲和柱上根据标准方法学纯化。将亲和纯化的抗-A5623抗体或抗A2254抗体用于Western印迹、免疫沉淀和免疫细胞染色，如下文所述。我们通过Western印迹分析证实，这些抗体可以分别特异性识别MCR7乳腺癌细胞中的内源A5623蛋白或A2254蛋白。

免疫细胞化学染色

为了检查内源A5623蛋白或A2254蛋白在乳腺癌细胞系MCF7、HBC4和HBC5中的亚细胞定位，我们以每孔1×10⁵个细胞接种细胞(Lab-Tek II腔室玻片、Nalgen Nunc International、Naperville、IL)。温育24小时后，细胞用含有4％多聚甲醛的PBS(-)固定15分钟，并用含有0.1％Triton X-100的PBS(-)于4℃处理2.5分钟以使其可渗透。随后，在4℃用含3％BSA的PBS(-)覆盖细胞12小时，以封闭非特异性杂交，随后用1∶1000稀释的兔抗A5623多克隆抗体或1∶1000稀释的抗A2254多克隆抗体温育。用PBS(-)清洗后，将细胞用1∶1000稀释的Alexa488-偶联的抗兔第二抗体(MolecularProbe，Eugene，OR)染色。用4′，6’-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸(4′，6′-diamidine-2′-phenylindolendihydrochrolide)(DAPI)对细胞核复染色。在TCS SP2AOBS(Leica，Tokyo，Japan)下获得荧光图像。

Western印迹分析

我们用FuGENE 6转染试剂(Roche)根据制造商说明书分别将1μgpCAGGS-A2254-HA、pCAGGS-A5623V1-HA、pCAGGS-A5623V2-HA或pCAGGS-A5623V3-HA瞬时转染到COS7细胞内。将细胞裂解物在10％SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离，并转移到硝酸纤维素膜上，然后与1∶1000稀释的作为第一抗体的小鼠抗HA抗体(Roche)温育。与作为第二抗体的绵羊抗小鼠IgG-HRP(Amersham Biosciences)温育后，用ECL试剂盒(AmershamBiosciences)使信号可视化。

而且，为了检测乳腺癌细胞系(BT-474、BT-549、HBC4、HBC5、HBL-100、MCF-7、MDA-MB-231、SKBR3和T47D)和HMEC(人乳腺上皮细胞)中的内源A5623蛋白或A2254蛋白，将细胞在含有0.1％蛋白酶抑制剂合剂III(Calbiochem，San Diego，CA)的裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8.0/150mMNaCl/0.5％NP-40)中裂解。用蛋白测定试剂盒(Bio-Rad、Hercules、CA)估计总蛋白量，然后将蛋白与SDS-上样缓冲液混合，煮沸，然后加载到10％SDS-PAGE凝胶。电泳后，将蛋白点样到硝酸纤维素膜(GE Healthcare)上。将含有蛋白的膜用封闭液封闭，然后与抗A5623多克隆抗体或抗A2254多克隆抗体一起温育，用于检测内源A5623蛋白或A2254蛋白。最后将膜与HRP偶联的第二抗体温育，并通过ECL检测试剂(GE Healthcare)使蛋白条带可视化。对β-肌动蛋白进行实验作为上样对照。

免疫细胞化学染色

为了检查A2254或A5623V1、A5623V2和A5623V3的亚细胞定位，我们对于所有4个构建体以每孔1×10⁵个细胞接种COS7细胞。24小时后，使用FuGENE 6转染试剂(Roche)根据制造商说明书分别以1μgpCAGGS-A2254-HA、pCAGGS-A5623V1-HA、pCAGGS-A5623V2-HA或pCAGGS-A5623V3-HA瞬时转染COS7细胞。然后，用含有4％多聚甲醛的PBS固定细胞15分钟，并用含有0.1％Triton X-100的PBS 4℃处理2.5分钟以使其可渗透。随后，于4℃将细胞用含3％BSA的PBS覆盖12小时以封闭非特异性杂交。接着，将每种被构建体转染的COS7细胞与1∶1000稀释的大鼠抗HA抗体(Roche)一起温育。用PBS清洗后，用1∶1000稀释的Alexa594-偶联的抗大鼠第二抗体(Molecular Probe)对所有转染细胞进行染色。用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸(4′，6′-diamidine-2′-phenylindolendihydrochrolide)(DAPI)对细胞核复染色。在TCS SP2AOBS(Leica，Tokyo，Japan)显微镜下获得荧光图像。

用psiU6X3.0构建A2254和A5623特异性-siRNA表达载体

我们根据先前的报道(WO2004/076623)用psiU6BX siRNA表达载体建立了基于载体的RNAi***。通过将表1中的双链寡核苷酸克隆到psiU6BX3.0载体的BbsI位点中制备针对A2254(psiU6BX-A2254)和A5623(psiU6BX-A5623)的siRNA表达载体。对照质粒——psiU6BX-模拟，是通过将如下的双链寡核苷酸克隆到psiU6BX3.0载体的BbsI位点中制备的：

5’-CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’(SEQ ID NO；15)和

5’-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’(SEQ ID NO；16)。

siRNA的寡核苷酸序列

针对A2254和A5623小干扰RNA的寡核苷酸序列如下所示。

表1.针对A2254和A5623小干扰RNA的寡核苷酸序列

下划线指示特异性siRNA序列。

A2254和A5623的基因沉默效应

将人乳腺癌细胞系T47D和HBC5涂布在10-cm培养皿上(1×10⁶个细胞/皿)，并用FuGENE6试剂根据供应商的推荐(Roche)以psiU6BX-模拟(作为阴性对照)、psiU6BX-A2254或psiU6BX-A5623进行转染。每种构建体转染后7天，从细胞提取总RNA，然后用上述针对A2254和A5623共有区域的特异性引物通过半定量RT-PCR确认siRNA的敲低效应。作为内部对照的GAPDH的引物如下：

5′-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3′(SEQ ID NO；1)和

5′-GGTTGAGCACAGGGTACTTTATT-3′(SEQ ID NO；2)。另外，将使用T47D和HBC5细胞系表达siRNA的转染子在含有0.7mg/ml新霉素的选择培养基上培养28天。用4％多聚甲醛固定后，将转染细胞用Giemsa溶液染色，以评估集落形成。进行MTT测定以定量细胞生存能力。在含有新霉素的培养基中培养12天后，添加MTT溶液(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物)(Sigma)，浓度为0.5mg/ml。37℃温育2.5小时后，添加酸-SDS(0.01N HCl/10％SDS)；剧烈混合悬浮液，然后37℃温育过夜以溶解深蓝色晶体。用Microplate Reader 550(BioRad)测量570nm吸光度。

免疫沉淀和Western印迹

将细胞在裂解缓冲液(50mM Tris-HCL(pH 8.0)、150mM NaCL、0.5％NP-40和蛋白酶抑制剂合剂组III(Calbiochem、San Diego、CA))中裂解。将等量的总蛋白与1mg大鼠抗HA抗体(Roche)或小鼠抗Flag抗体(Santa Cruz)在4℃共温育1小时。将免疫复合物与蛋白G-Sepharose(Zymed Laboratories，South San Francisco，CA)共温育1小时，然后用裂解缓冲液清洗。共沉淀蛋白通过SDS-PAGE进行分离。

将SDS-PAGE分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，然后与大鼠抗HA抗体或小鼠抗Flag抗体(Santa Cruz)共温育，在与偶联HRP的第二抗体共温育之后，用ECL试剂盒(Amersham Biosciences)使信号可视化。

建立稳定表达A5623或A2254的NIH3T3细胞

如上所述，用FUGENE6将A5623或A2254表达载体或模拟载体转染进入NIH3T3细胞。将转染的细胞在含有0.9mg/ml遗传霉素(G418)(Invitrogen)的培养基中温育。将克隆NIH3T3细胞通过有限稀释进行亚克隆。用抗HA单克隆抗体通过Western印迹分析对带HA标签的A5623或A2254的表达进行评估。最后，建立了数个克隆，并命名为A5623-NIH3T3或A2254-NIH3T3。

为了研究A2254的促生长作用，我们将4种独立的A2254-NIH3T3细胞和3种独立的MOCK-NIH3T3细胞每种接种了5000个细胞，并通过MTT测定每天记录细胞数目，经过6天。这些实验按一式三份进行。

而且，我们研究了A2254-NIH3T3细胞(A2254-NIH3T3-3和-4)浸润通过matrigel的能力。简而言之，我们将2种独立的A2254-NIH3T3细胞(A2254-NIH3T3-3和-4)和一种独立的模拟-NIH3T3细胞分别接种了10000个细胞，并且将细胞在含有10％FCS的DMEM中培养到汇合。将细胞通过胰蛋白酶处理加以收集，在不加血清或蛋白酶抑制剂的DMEM中清洗，并以1×10⁵个细胞/mL的浓度悬浮在DMEM中。在制备细胞悬液前，在室温下用DMEM对Matrigel基质(Bection Dickinson Labware、Bedford、MA)干燥层再水化2小时。向24孔Matrigel浸润小室的每个下部小室添加含有10％FBS的DMEM，并向每个上部小室的***片(insert)添加0.5mL(5×10⁴个细胞)细胞悬液。将板在37℃温育22小时。温育后，对小室进行处理，将浸润通过matrigel包被的***片的细胞加以固定，并用Giemsa染色，以上步骤均按照供应商(Bection Dickinson Labware)的说明。

免疫组织化学染色

用抗A5623兔多克隆抗体研究A5623蛋白在乳腺癌和正常组织中的表达图式。简而言之，将石蜡包埋的标本用二甲苯和乙醇处理，并用蛋白封闭试剂(Dako Cytomation，Carpinteria，CA)封闭。添加抗体稀释溶液(1∶100)中的多克隆抗体，然后用底物-色原(DAKO liquid DAB chromogen、DakoCytomation)染色。最后，将组织标本用苏木精染色以区分细胞核和细胞质。

[结果]

鉴定A2254和A5623为乳腺癌细胞中的上调基因

当我们用代表27,648个人类基因的cDNA微阵列分析来自77位绝经前乳腺癌患者的癌细胞的基因表达模式时，我们鉴定了493个在乳腺癌细胞中普遍上调的基因。在它们中，我们关注了下面两种基因：一种内部编号为A2254，被指称为驱动蛋白家族成员2C(KIF2C)(SEQ ID NO；35、36)，另一种内部编号为A5623，被指称为胞质***蛋白调节子1(Genebank登录号No.NM_003981；SEQ ID NO；39、40)。在微阵列上，与正常乳腺导管细胞相比，A2254和A5623基因的表达分别在60例乳腺癌中的44例和58例乳腺癌中的37例中有所升高。为了确认这些上调基因的表达，我们进行了半定量RT-PCR分析来比较乳腺癌标本与含有正常乳腺导管细胞的正常人组织之间的表达水平。首先，我们发现，与正常乳腺导管细胞和正常人组织，包括乳腺、肺、心脏、肝、肾和骨髓相比，A2254的表达在12例临床乳腺癌标本(低分化型)中的7例中有所升高(图1A，上图面)。此外，该基因在全部9种乳腺癌细胞系中均过高表达(图1A，下图面)。接着，我们还发现，与正常人组织，特别是正常乳腺导管细胞(图1B，上图面)相比，A5623的表达在12例乳腺癌标本(低分化型)中的7例中有所升高，并且在我们检查的全部9种乳腺癌细胞系中均过高表达(图1B，下图面)。

为了进一步检查这些基因的表达图式，我们用A2254和A5623的cDNA片段作为探针对多种人组织和乳腺癌细胞系进行了Northern印迹分析(见材料和方法)。A2254在除睾丸和胸腺外的正常人组织无表达或者表达无法检测(图2A，上图面)，而与除骨髓之外的其他正常组织相比，其在乳腺癌细胞系中令人惊讶地过高表达(图2A，下图面)。A5623也仅在睾丸中表达(图2B，上图面)，而与除骨髓之外的其他正常组织相比，特别是与正常人乳腺相比，在所有乳腺癌细胞系中显著过高表达(图2B，下图面)。因此，我们关注这些乳腺癌特异性表达的转录物。

A2254和A5623的基因组结构

为了获得A2254和A5623的完整cDNA序列，我们用乳腺癌细胞系T47D作为模板进行RT-PCR。A2254由21个外显子构成，指称为驱动蛋白家族成员2C(KIF2C)，位于染色体1p34.1上。A2254的全长mRNA序列包含2886个核苷酸，编码725个氨基酸。

A2254具有两种不同的转录变体，它们分别由21和20个外显子构成，分别对应于A2254V1(GenBank登录号NO：AB264115，SEQ ID NO：35，36)和A2254V2(GenBank登录号NO：AY026505，SEQ ID NO：37，38)(图3A，上图面)。V1变体的外显子1和2分别是185bp和94bp，而V2变体没有V1的外显子1和2，而具有一个由346bp构成的新外显子作为外显子1。V2变体的最后一个外显子(外显子20)比V1变体的最后一个外显子(外显子21)的3’端短537bp。A2254V1和A2254V2变体的全长cDNA序列分别含有2886和2401个核苷酸。这些变体的ORF开始于每个外显子1内。最后，V1和V2转录物分别编码725和671个氨基酸。为了进一步确认每种变体在乳腺癌标本和正常人组织中的表达图式，我们用识别每种变体的引物组进行半定量RT-PCR。结果，我们发现，与V2变体的表达相比，A2254 V1变体主要在乳腺癌细胞中表达，而V2变体仅在睾丸中表达(图3A；下图面)。因此，我们关注A2254 V1变体。

A5623也有三种不同的转录变体，它们分别由15、14和14个外显子构成，分别对应于A5623V1(Genbank登录号NO：NM_003981；SEQ ID NO：39，40)，A5623V2(Genbank登录号NO：NM_199413；SEQ ID NO：41，42)和A5623V3(Genbank登录号NO：NM_199414；SEQ ID NO：43，44)(图3B，上图面)。V1的外显子13和14有可选择的变化形式，其余外显子在所有变体中保持相同。V2变体没有V1的外显子14，在最后一个外显子内产生新的早期终止密码子。V3的外显子14被完全缺失，并且V3的外显子13比V1的外显子13在3’端短77bp，在最后一个外显子内也产生一个新的早期终止密码子。A5623V1、A5623V2和A5623V3变体的全长cDNA序列分别由3128、3091和3011个核苷酸构成。这些变体的ORF开始于每个外显子1内。最后，V1、V2和V3转录物分别编码620、606和566个氨基酸。为了进一步确认每种变体在乳腺癌标本和正常人组织中的表达模式，我们用识别每种变体的引物组进行了半定量RT-PCR。结果，我们发现，与正常人组织相比，所有变体在乳腺癌细胞细胞中高度过高表达(图3B；下图面)。因此，我们进一步对A5623的全部变体进行了功能分析。

A2254和A5623的亚细胞定位

为了进一步考察A2254和A5623的特征，我们检查了这些基因产物在COS7细胞中的亚细胞定位。首先，当我们将表达A2254蛋白(pCAGGS-A2254-HA)的质粒瞬时转染到COS7细胞中时，我们通过Western印迹分析观察到了具有预期大小的81KD-A2254蛋白(图4A)。此外，免疫细胞化学染色显示外源A2254在转染细胞中位于质膜下(图4B)。令人惊讶的是，免疫细胞化学染色中的阳性信号在细胞-细胞附着的膜中消失，提示该基因可能在细胞-细胞相互作用或细胞极性中发挥关键作用。

接着，当我们又将表达A5623 V1、V2和V3蛋白(pCAGGS-A5623-HA)的质粒瞬时转染到COS7和T47D细胞中时，通过Western印迹分析观察到了具有各自预期大小的外源A5623 V1、V2和V3蛋白(图4C)。而且，免疫细胞化学染色显示，A5623的全部变体蛋白在转染细胞中均作为中间纤维定位于细胞质器(图4D、E、F)，提示A5623可能也在细胞-细胞相互作用中发挥关键作用。

我们开发了抗A5623或A2254的多克隆抗体，然后通过Western印迹分析，用HMEC(人乳腺上皮细胞)作为实验对照，研究了A5623蛋白或A2254蛋白在来自乳腺癌细胞系BT-474、BT-549、HBC4、HBC5、HBL-100、MCF-7、MDA-MB-231、SKBR3和T47D的细胞裂解物中的内源表达。全部乳腺癌细胞系均显示了高水平的A5623或A2254表达，而HMEC细胞显示非常微弱的表达。随后用抗A5623多克隆抗体对乳腺癌细胞系HBC4、HBC5和MCF7进行免疫细胞化学分析显示，内源A5623主要定位于中期细胞的细胞质和/或细胞核器中。特别地，观察到内源A5623位于所有乳腺癌细胞系的中间纤维网络。当细胞经历有丝***时，A5623发生显著的再分布。在前期，它与有丝***纺锤体极共定位，然后从中期到后期的早期阶段与整个有丝***纺锤体共定位。到中后期为止，A5623在细胞的后期纺锤体中间区集中成为一系列窄带(图7B)。随后用抗A2254多克隆抗体对乳腺癌细胞系、HBC5进行免疫细胞化学染色表明，内源A2254被观察到主要定位于中期细胞的细胞质器中，尽管外源A2254位于转染细胞的质膜下。当细胞经历有丝***时，A2254经历显著的再分布。尽管A2254在中期细胞中仍然定位于细胞质内，但是A2254在细胞的后期纺锤体中间区集中成为一系列窄带(图7B)。最后，该蛋白积累在末期细胞的中间体。这些发现提示，在乳腺癌细胞以及先前描述的HeLa细胞中(Mollinari C、et al.JCell Biol、2002；157；1175-86.；Mollinari C、et al.Mol Biol Cell.2005；16；1043-55.)，A5623和A2254在胞质***中发挥重要作用。

为了进一步研究A5623在乳腺癌和正常组织切片中的表达，我们用抗A5623抗体进行了免疫组织化学染色。我们确认在三种不同组织亚型的乳腺癌即管内癌、***管癌和硬癌的细胞质和细胞核中有强烈染色，但是其表达在正常乳腺组织中几乎检测不到(图7C，上图面)。而且，与Northen印迹分析结果一致，在睾丸中检测到其表达，而在心脏、肺、肝和肾中均未见表达(图7C，下图面)。

设计为降低A2254和A5623表达的小干扰RNA(siRNA)的生长抑制效应

为了评估A2254和A5623的促生长作用，我们以基于哺乳动物载体的RNA干扰(RNAi)技术(见上文)为手段，敲低了已显示A2254和A5623过高表达的乳腺癌细胞系T47D和HBC5中内源A2254和A5623的表达。通过半定量RT-PCR实验检查了A2254和A5623的表达水平。如图5和6所示，与对照siRNA构建体(psiU6BX-模拟)相比，这两个基因各自的siRNA构建体——A2254(si2和si5)和A5623(si1和si2)特异性siRNA，显著抑制了各自基因的表达(图5A，6A)。为了确认A2254和A5623特异性siRNAs的细胞生长抑制，我们分别实施了集落形成和MTT测定。A2254(si2和si5)(图5B、C)和A5623(si1和si2)(图6B、C)构建体的引入抑制了T47D和HBC5细胞的生长，与上文降低表达的结果一致。每个结果都得到了3次独立实验的验证。这些发现提示，A2254和A5623在乳腺癌细胞生长中具有重要的功能。

A2254的致癌活性

为了进一步证实A2254的促生长作用，我们建立了稳定表达外源A2254的NIH3T3-衍生细胞(NIH3T3-A2254-1、-2、-3和-4细胞)。Western印迹分析表明在三个衍生克隆(NIH3T3-A2254-1、-2和-3)中有高水平的外源A2254蛋白，在一个克隆(A2254-4)中有低水平的A2254(图9A)。随后的MTT测定显示，外源A2254的过高表达对细胞生长无显著提高(图9B)。这些发现提示，尽管单是A2254基因过高表达不具有促生长活性，但该基因产物缺乏对于乳腺癌细胞的存活具有重要影响。

而且，因为我们首次观察到外源A2254位于转染细胞的质膜下，所以我们进行matrigel浸润测定以确定A2254在细胞运动性中是否发挥某种作用。稳定表达外源A2254的NIH3T3-衍生细胞(NIH3T3-A2254-3和-4细胞)通过matrigel的浸润，相比于模拟稳定转染细胞(NIH3T3-模拟)显著提高，且根据Western印迹结果显示该提高依赖于A2254蛋白表达(图9C)，这表明A2254基因可能在肿瘤细胞浸润中也具有关键作用。

A5623与A2254的相互作用

为了进一步研究A5623在乳腺癌细胞中的生理功能，我们尝试了鉴定其相互作用蛋白。我们发现驱动蛋白家族成员2C/有丝***-着丝粒-相关驱动蛋白(KIF2c/MCAK)蛋白(A2254)是可能的候选A5623-相互作用蛋白，因为该蛋白已知在晚后期或末期细胞中定位于中间体中或收缩环附近，并且在中间区形成和胞质***中发挥作用。此外，有报道称A5623与数种驱动蛋白家族蛋白相互作用(Kurasawa Y，et al.EMBO J 2004；23；3237-48.；ZhuC，et al.Proc Natl Acad Sci USA 2005；102；343-8.；Gruneberg U，et al.2006；172；363-72.)。

我们首先通过半定量RT-PCR分析研究A2254在乳腺癌病例中的表达图式，发现A2254和A5623在乳腺癌病例中共上调(图8A)。随后，我们用共转染到COS7细胞中的Flag-标签A5623和HA-标签A2254进行免疫共沉淀实验。利用抗Flag和抗HA抗体，我们确认Flag-标签A5623与HA-标签A2254共沉淀(图8B)，并且HA-标签A2254反过来与Flag-标签A5623共沉签(图8C)，表明这两种蛋白相互作用。

随后，我们建立了稳定表达外源A5623和A2254的NIH3T3-衍生细胞(NIH3T3-A5623和NIH3T3-A2254细胞)。免疫细胞化学分析显示，内源小鼠A5623和稳定表达的外源A2254在NIH3T3细胞中在晚后期共定位于中间区形成物(图8D，左图面)，内源A2254和稳定表达的外源A5623在NIH3T3细胞中在晚后期共定位于中间区形成物(图8D)。尽管还需要进一步研究内源A5623和内源A2254在乳腺癌细胞中的共定位，但是这些结果强烈提示A5623和A2254的构像(conformation)可能在癌细胞的胞质***中发挥关键作用。

[讨论]

通过利用全基因组cDNA微阵列技术的乳腺癌的精确表达模式，我们分离了新基因A2254和A5623，与正常人组织相比，它们在乳腺癌细胞中显著过高表达。

而且，Northern印迹分析显示，A5623和A2254的表达在除睾丸和骨髓之外的所检查的任何正常人组织中几乎不能检测到。而且，利用抗A5623多克隆抗体或抗A2254多克隆抗体进行的免疫组织化学染色实验清晰地表明，A5623或A2254的表达在乳腺癌组织切片中上调。这些结果显示，该基因可能成为开发乳腺癌抗癌剂的有价值的靶标。

我们的免疫细胞化学染色实验显示，A5623在***间期的乳腺癌细胞中定位于细胞质和/或细胞核，在晚后期定位于中间区，在末期定位于收缩环。

进一步，我们证实，用siRNA处理乳腺癌细胞，有效抑制了所有三种靶基因A2254和A5623的表达，并显著抑制了乳腺癌细胞/肿瘤的生长。这些发现提示，A2254和5623可能在肿瘤细胞生长增殖中发挥关键作用，并可作为具有前景的用于开发抗癌药物的靶标。

我们证实，通过siRNA敲低内源A5623诱使乳腺癌细胞中胞质***失败，造成多核细胞的积累和随后细胞死亡。这些发现提示，A5623也在乳腺癌细胞的胞质***中发挥作用。A5623据报道还与几种驱动蛋白家族蛋白相互作用(Kurasawa Y，et al.EMBO J 2004；23；3237-48.；Zhu C，et al.ProcNatl Acad Sci USA 2005；102；343-8.；Gruneberg U，et al.2006；172；363-72.)。根据报道，A5623能够与几种分子，例如与有丝***事件，特别是胞质***相关的KIF4或KIF14相互作用(Kurasawa Y，et al.EMBO J 2004；23；3237-48.；Zhu C，et al.Proc Natl Acad Sci USA 2005；102；343-8.)。然而，在我们的整个乳腺癌表达模式中，KIF4和KIF14在乳腺癌中均不表达(数据未显示)。因此，我们进一步通过鉴定A5623的相互作用蛋白考察了其在乳腺癌细胞中的生物学作用，并且鉴定A2254(驱动蛋白家族成员2C/有丝***-着丝粒相关驱动蛋白)蛋白作为候选相互作用蛋白，因为该蛋白已知在晚后期或末期细胞中定位于中间体中或收缩环附近，并且在中间区形成和胞质***中发挥作用。如图8所示，我们证实了细胞周期中，特别是在末期细胞胞质***时的中间体中A2254和A5623的体内相互作用和共定位。它们在乳腺癌病例中的证据提示，它们的相互作用在乳腺癌发生中发挥关键作用。而且，我们确定了A5623与A2254的结合区(51-70和200-490氨基酸)(数据未显示)。尽管还需要进一步分析A5623的功能，但是所提供的数据应当有助于更加深入地理解乳腺癌的发生和开发乳腺癌的新型治疗方法。

工业适用性

本发明人已证明特异性靶向A2254或A5623基因的小干扰RNA(siRNA)抑制细胞生长。因此，这种新型的siRNA是用于开发抗癌药物的有用靶标。例如，阻断A2254或A5623表达或者阻止其活性的药剂可用作抗癌剂，特别是用于治疗乳腺癌(BRC)的抗癌剂。

尽管本发明参考其特定的实施方案进行了详细的描述，但是本领域的技术人员在不背离本发明精神和范围的前提下显然知道可以作出各种变化和修改。

序列表

<110>肿瘤疗法科学股份有限公司(ONCOTHERAPY SCIENCE，INC.)

<120>用于治疗乳腺癌的组合物和方法

<130>ONC-A0512P

<150>US 60/702,446

<151>2005-07-25

<160>50

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物

<400>1

cgaccacttt gtcaagctca               20

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物

<400>2

ggttgagcac agggtacttt att           23

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物

<400>3

actctaggac ttgcatgatt gcc        23

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物

<400>4

tgggtgtcaa accaaacaga            20

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物

<400>5

gttagaactt gtttcctcct ccg        23

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物

<400>6

atcctcaatg gtatttcagc           20

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物

<400>7

gtggtcctag gagacttggt ttt        23

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物

<400>8

tacatgcata cccccaacaa           20

<210>9

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物

<400>9

gcttcagcga gaactttc            18

<210>10

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物

<400>10

caactgtaac actcattcac atc        23

<210>11

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物

<400>11

ctattctgag tttgcgcgag aac        23

<210>12

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物

<400>12

catcctgagt gcgagaactt tc         22

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物

<400>13

ctggaagagc aggctagcag            20

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物

<400>14

gctgcggaga aagctctatg                                       20

<210>15

<211>51

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于siRNA的人工合成寡核苷酸

<400>15

caccgaagca gcacgacttc ttcttcaaga gagaagaagt cgtgctgctt c    51

<210>16

<211>51

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于siRNA的人工合成寡核苷酸

<400>16

aaaagaagca gcacgacttc ttctctcttg aagaagaagt cgtgctgctt c    51

<210>17

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>siRNA靶序列

<400>17

gaagcagcac gacttcttc                                        19

<210>18

<211>47

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>siRNA发夹结构

<400>18

gaagcagcac gacttcttct ctcttgaaga agaagtcgtg ctgcttc         47

<210>19

<211>51

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于siRNA的人工合成寡核苷酸

<400>19

caccgagaag aaggcccaga actttcaaga gaagttctgg gccttcttct c    51

<210>20

<211>51

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于siRNA的人工合成寡核苷酸

<400>20

aaaagagaag aaggcccaga acttctcttg aaagttctgg gccttcttct c    51

<210>21

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>siRNA靶序列

<400>21

gagaagaagg cccagaact                                        19

<210>22

<211>47

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>siRNA发夹结构

<400>22

gagaagaagg cccagaactt tcaagagaag ttctgggcct tcttctc         47

<210>23

<211>51

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于siRNA的人工合成寡核苷酸

<400>23

caccctctag gacttgcatg attttcaaga gaaatcatgc aagtcctaga g    51

<210>24

<211>51

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于siRNA的人工合成寡核苷酸

<400>24

aaaactctag gacttgcatg atttctcttg aaaatcatgc aagtcctaga g    51

<210>25

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>siRNA靶序列

<400>25

ctctaggact tgcatgatt                                        19

<210>26

<211>47

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>siRNA发夹结构

<400>26

ctctaggact tgcatgattt tcaagagaaa tcatgcaagt cctagag         47

<210>27

<211>51

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于siRNA的人工合成寡核苷酸

<400>27

caccggaaag actcatcaaa agcttcaaga gagcttttga tgagtctttc c    51

<210>28

<211>51

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于siRNA的人工合成寡核苷酸

<400>28

aaaaggaaag actcatcaaa agctctcttg aagcttttga tgagtctttc c    51

<210>29

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>siRNA靶序列

<400>29

ggaaagactc atcaaaagc                                       19

<210>30

<211>47

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>siRNA发夹结构

<400>30

ggaaagactc atcaaaagct tcaagagagc ttttgatgag tctttcc        47

<210>31

<211>51

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于siRNA的人工合成寡核苷酸

<400>31

caccgcatat ccgtctgtca gaattcaaga gattctgaca gacggatatg c    51

<210>32

<211>51

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于siRNA的人工合成寡核苷酸

<400>32

aaaagcatat ccgtctgtca gaatctcttg aattctgaca gacggatatg c             51

<210>33

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>siRNA靶序列

<400>33

gcatatccgt ctgtcagaat                                                 20

<210>34

<211>47

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>siRNA发夹结构

<400>34

gcatatccgt ctgtcagaat tcaagagatt ctgacagacg gatatgc                   47

<210>35

<211>2886

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(116)..(2290)

<400>35

acgcttgcgc gcgggattta aactgcggcg gtttacgcgg cgttaagact tcgtagggtt     60

agcgaaattg aggtttcttg gtattgcgcg tttctcttcc ttgctgactc tccga atg     118

                                                             Met

                                                             1

gcc atg gac tcg tcg ctt cag gcc cgc ctg ttt ccc ggt ctc gct atc    166

Ala Met Asp Ser Ser Leu Gln Ala Arg Leu Phe Pro Gly Leu Ala Ile

            5                   10                  15

aag atc caa cgc agt aat ggt tta att cac agt gcc aat gta agg act    214

Lys Ile Gln Arg Ser Asn Gly Leu Ile His Ser Ala Asn Val Arg Thr

        20                  25                  30

gtg aac ttg gag aaa tcc tgt gtt tca gtg gaa tgg gca gaa gga ggt    262

Val Asn Leu Glu Lys Ser Cys Val Ser Val Glu Trp Ala Glu Gly Gly

    35                  40                  45

gcc aca aag ggc aaa gag att gat ttt gat gat gtg gct gca ata aac    310

Ala Thr Lys Gly Lys Glu Ile Asp Phe Asp Asp Val Ala Ala Ile Asn

50                  55                  60                  65

cca gaa ctc tta cag ctt ctt ccc tta cat ccg aag gac aat ctg ccc    358

Pro Glu Leu Leu Gln Leu Leu Pro Leu His Pro Lys Asp Asn Leu Pro

                70                  75                  80

ttg cag gaa aat gta aca atc cag aaa caa aaa cgg aga tcc gtc aac    406

Leu Gln Glu Asn Val Thr Ile Gln Lys Gln Lys Arg Arg Ser Val Asn

            85                  90                  95

tcc aaa att cct gct cca aaa gaa agt ctt cga agc cgc tcc act cgc    454

Ser Lys Ile Pro Ala Pro Lys Glu Ser Leu Arg Ser Arg Ser Thr Arg

        100                 105                 110

atg tcc act gtc tca gag ctt cgc atc acg gct cag gag aat gac atg    502

Met Ser Thr Val Ser Glu Leu Arg Ile Thr Ala Gln Glu Asn Asp Met

    115                 120                 125

gag gtg gag ctg cct gca gct gca aac tcc cgc aag cag ttt tca gtt    550

Glu Val Glu Leu Pro Ala Ala Ala Asn Ser Arg Lys Gln Phe Ser Val

130                 135                 140                 145

cct cct gcc ccc act agg cct tcc tgc cct gca gtg gct gaa ata cca    598

Pro Pro Ala Pro Thr Arg Pro Ser Cys Pro Ala Val Ala Glu Ile Pro

                150                 155                 160

ttg agg atg gtc agc gag gag atg gaa gag caa gtc cat tcc atc cgt    646

Leu Arg Met Val Ser Glu Glu Met Glu Glu Gln Val His Ser Ile Arg

            165                 170                 175

ggc agc tct tct gca aac cct gtg aac tca gtt cgg agg aaa tca tgt     694

Gly Ser Ser Ser Ala Asn Pro Val Asn Ser Val Arg Arg Lys Ser Cys

        180                 185                 190

ctt gtg aag gaa gtg gaa aaa atg aag aac aag cga gaa gag aag aag     742

Leu Val Lys Glu Val Glu Lys Met Lys Asn Lys Arg Glu Glu Lys Lys

    195                 200                 205

gcc cag aac tct gaa atg aga atg aag aga gct cag gag tat gac agt     790

Ala Gln Asn Ser Glu Met Arg Met Lys Arg Ala Gln Glu Tyr Asp Ser

210                 215                 220                 225

agt ttt cca aac tgg gaa ttt gcc cga atg att aaa gaa ttt cgg gct     838

Ser Phe Pro Asn Trp Glu Phe Ala Arg Met Ile Lys Glu Phe Arg Ala

                230                 235                 240

act ttg gaa tgt cat cca ctt act atg act gat cct atc gaa gag cac     886

Thr Leu Glu Cys His Pro Leu Thr Met Thr Asp Pro Ile Glu Glu His

            245                 250                 255

aga ata tgt gtc tgt gtt agg aaa cgc cca ctg aat aag caa gaa ttg     934

Arg Ile Cys Val Cys Val Arg Lys Arg Pro Leu Asn Lys Gln Glu Leu

        260                 265                 270

gcc aag aaa gaa att gat gtg att tcc att cct agc aag tgt ctc ctc     982

Ala Lys Lys Glu Ile Asp Val Ile Ser Ile Pro Ser Lys Cys Leu Leu

    275                 280                 285

ttg gta cat gaa ccc aag ttg aaa gtg gac tta aca aag tat ctg gag    1030

Leu Val His Glu Pro Lys Leu Lys Val Asp Leu Thr Lys Tyr Leu Glu

290                 295                 300                 305

aac caa gca ttc tgc ttt gac ttt gca ttt gat gaa aca gct tcg aat    1078

Asn Gln Ala Phe Cys Phe Asp Phe Ala Phe Asp Glu Thr Ala Ser Asn

                310                 315                 320

gaa gtt gtc tac agg ttc aca gca agg cca ctg gta cag aca atc ttt    1126

Glu Val Val Tyr Arg Phe Thr Ala Arg Pro Leu Val Gln Thr Ile Phe

            325                 330                 335

gaa ggt gga aaa gca act tgt ttt gca tat ggc cag aca gga agt ggc    1174

Glu Gly Gly Lys Ala Thr Cys Phe Ala Tyr Gly Gln Thr Gly Ser Gly

        340                 345                 350

aag aca cat act atg ggc gga gac ctc tct ggg aaa gcc cag aat gca    1222

Lys Thr His Thr Met Gly Gly Asp Leu Ser Gly Lys Ala Gln Asn Ala

    355                 360                 365

tcc aaa ggg atc tat gcc atg gcc tcc cgg gac gtc ttc ctc ctg aag    1270

Ser Lys Gly Ile Tyr Ala Met Ala Ser Arg Asp Val Phe Leu Leu Lys

370                 375                 380                 385

aat caa ccc tgc tac cgg aag ttg ggc ctg gaa gtc tat gtg aca ttc    1318

Asn Gln Pro Cys Tyr Arg Lys Leu Gly Leu Glu Val Tyr Val Thr Phe

                390                 395                 400

ttc gag atc tac aat ggg aag ctg ttt gac ctg ctc aac aag aag gcc    1366

Phe Glu Ile Tyr Asn Gly Lys Leu Phe Asp Leu Leu Asn Lys Lys Ala

            405                 410                 415

aag ctg cgc gtg ctg gag gac ggc aag caa cag gtg caa gtg gtg ggg    1414

Lys Leu Arg Val Leu Glu Asp Gly Lys Gln Gln Val Gln Val Val Gly

        420                 425                 430

ctg cag gag cat ctg gtt aac tct gct gat gat gtc atc aag atg ctc    1462

Leu Gln Glu His Leu Val Asn Ser Ala Asp Asp Val Ile Lys Met Leu

    435                 440                 445

gac atg ggc agc gcc tgc aga acc tct ggg cag aca ttt gcc aac tcc    1510

Asp Met Gly Ser Ala Cys Arg Thr Ser Gly Gln Thr Phe Ala Asn Ser

450                 455                 460                 465

aat tcc tcc cgc tcc cac gcg tgc ttc caa att att ctt cga gct aaa    1558

Asn Ser Ser Arg Ser His Ala Cys Phe Gln Ile Ile Leu Arg Ala Lys

                470                 475                 480

ggg aga atg cat ggc aag ttc tct ttg gta gat ctg gca ggg aat gag    1606

Gly Arg Met His Gly Lys Phe Ser Leu Val Asp Leu Ala Gly Asn Glu

            485                 490                 495

cga ggc gca gac act tcc agt gct gac cgg cag acc cgc atg gag ggc    1654

Arg Gly Ala Asp Thr Ser Ser Ala Asp Arg Gln Thr Arg Met Glu Gly

        500                 505                 510

gca gaa atc aac aag agt ctc tta gcc ctg aag gag tgc atc agg gcc    1702

Ala Glu Ile Asn Lys Ser Leu Leu Ala Leu Lys Glu Cys Ile Arg Ala

    515                 520                 525

ctg gga cag aac aag gct cac acc ccg ttc cgt gag agc aag ctg aca    1750

Leu Gly Gln Asn Lys Ala His Thr Pro Phe Arg Glu Ser Lys Leu Thr

530                 535                 540                 545

cag gtg ctg agg gac tcc ttc att ggg gag aac tct agg act tgc atg    1798

Gln Val Leu Arg Asp Ser Phe Ile Gly Glu Asn Ser Arg Thr Cys Met

                550                 555                 560

att gcc acg atc tca cca ggc ata agc tcc tgt gaa tat act tta aac    1846

Ile Ala Thr Ile Ser Pro Gly Ile Ser Ser Cys Glu Tyr Thr Leu Asn

            565                 570                 575

acc ctg aga tat gca gac agg gtc aag gag ctg agc ccc cac agt ggg    1894

Thr Leu Arg Tyr Ala Asp Arg Val Lys Glu Leu Ser Pro His Ser Gly

        580                 585                 590

ccc agt gga gag cag ttg att caa atg gaa aca gaa gag atg gaa gcc    1942

Pro Ser Gly Glu Gln Leu Ile Gln Met Glu Thr Glu Glu Met Glu Ala

    595                 600                 605

tgc tct aac ggg gcg ctg att cca ggc aat tta tcc aag gaa gag gag    1990

Cys Ser Asn Gly Ala Leu Ile Pro Gly Asn Leu Ser Lys Glu Glu Glu

610                 615                 620                 625

gaa ctg tct tcc cag atg tcc agc ttt aac gaa gcc atg act cag atc    2038

Glu Leu Ser Ser Gln Met Ser Ser Phe Asn Glu Ala Met Thr Gln Ile

                630                 635                 640

agg gag ctg gag gag aag gct atg gaa gag ctc aag gag atc ata cag    2086

Arg Glu Leu Glu Glu Lys Ala Met Glu Glu Leu Lys Glu Ile Ile Gln

            645                 650                 655

caa gga cca gac tgg ctt gag ctc tct gag atg acc gag cag cca gac    2134

Gln Gly Pro Asp Trp Leu Glu Leu Ser Glu Met Thr Glu Gln Pro Asp

        660                 665                 670

tat gac ctg gag acc ttt gtg aac aaa gcg gaa tct gct ctg gcc cag    2182

Tyr Asp Leu Glu Thr Phe Val Asn Lys Ala Glu Ser Ala Leu Ala Gln

    675                 680                 685

caa gcc aag cat ttc tca gcc ctg cga gat gtc atc aag gcc tta cgc    2230

Gln Ala Lys His Phe Ser Ala Leu Arg Asp Val Ile Lys Ala Leu Arg

690                 695                 700                 705

ctg gcc atg cag ctg gaa gag cag gct agc aga caa ata agc agc aag      2278

Leu Ala Met Gln Leu Glu Glu Gln Ala Ser Arg Gln Ile Ser Ser Lys

                710                 715                 720

aaa cgg ccc cag tgacgactgc aaataaaaat ctgtttggtt tgacacccag          2330

Lys Arg Pro Gln

            725

cctcttccct ggccctcccc agagaacttt gggtacctgg tgggtctagg cagggtctga    2390

gctgggacag gttctggtaa atgccaagta tgggggcatc tgggcccagg gcagctgggg    2450

agggggtcag agtgacatgg gacactcctt ttctgttcct cagttgtcgc cctcacgaga    2510

ggaaggagct cttagttacc cttttgtgtt gcccttcttt ccatcaaggg gaatgttctc    2570

agcatagagc tttctccgca gcatcctgcc tgcgtggact ggctgctaat ggagagctcc    2630

ctggggttgt cctggctctg gggagagaga cggagccttt agtacagcta tctgctggct    2690

ctaaaccttc tacgcctttg ggccgagcac tgaatgtctt gtactttaaa aaaatgtttc    2750

tgagacctct ttctacttta ctgtctccct agagtcctag aggatcccta ctgttttctg    2810

ttttatgtgt ttatacattg tatgtaacaa taaagagaaa aaataaaaaa aaaaaaaaaa    2870

aaaaaaaaaa aaaaaa                                                    2886

<210>36

<211>725

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>36

Met Ala Met Asp Ser Ser Leu Gln Ala Arg Leu Phe Pro Gly Leu Ala

1               5                   10                  15

Ile Lys Ile Gln Arg Ser Asn Gly Leu Ile His Ser Ala Asn Val Arg

            20                  25                  30

Thr Val Asn Leu Glu Lys Ser Cys Val Ser Val Glu Trp Ala Glu Gly

        35                  40                  45

Gly Ala Thr Lys Gly Lys Glu Ile Asp Phe Asp Asp Val Ala Ala Ile

    50                  55                  60

Asn Pro Glu Leu Leu Gln Leu Leu Pro Leu His Pro Lys Asp Asn Leu

65                  70                  75                  80

Pro Leu Gln Glu Asn Val Thr Ile Gln Lys Gln Lys Arg Arg Ser Val

                85                  90                  95

Asn Ser Lys Ile Pro Ala Pro Lys Glu Ser Leu Arg Ser Arg Ser Thr

            100                 105                 110

Arg Met Ser Thr Val Ser Glu Leu Arg Ile Thr Ala Gln Glu Asn Asp

        115                 120                 125

Met Glu Val Glu Leu Pro Ala Ala Ala Asn Ser Arg Lys Gln Phe Ser

    130                 135                 140

Val Pro Pro Ala Pro Thr Arg Pro Ser Cys Pro Ala Val Ala Glu Ile

145                 150                 155                 160

Pro Leu Arg Met Val Ser Glu Glu Met Glu Glu Gln Val His Ser Ile

                165                 170                 175

Arg Gly Ser Ser Ser Ala Asn Pro Val Asn Ser Val Arg Arg Lys Ser

            180                 185                 190

Cys Leu Val Lys Glu Val Glu Lys Met Lys Asn Lys Arg Glu Glu Lys

        195                 200                 205

Lys Ala Gln Asn Ser Glu Met Arg Met Lys Arg Ala Gln Glu Tyr Asp

    210                 215                 220

Ser Ser Phe Pro Asn Trp Glu Phe Ala Arg Met Ile Lys Glu Phe Arg

225                 230                 235                 240

Ala Thr Leu Glu Cys His Pro Leu Thr Met Thr Asp Pro Ile Glu Glu

                245                 250                 255

His Arg Ile Cys Val Cys Val Arg Lys Arg Pro Leu Asn Lys Gln Glu

            260                 265                 270

Leu Ala Lys Lys Glu Ile Asp Val Ile Ser Ile Pro Ser Lys Cys Leu

        275                 280                 285

Leu Leu Val His Glu Pro Lys Leu Lys Val Asp Leu Thr Lys Tyr Leu

    290                 295                 300

Glu Asn Gln Ala Phe Cys Phe Asp Phe Ala Phe Asp Glu Thr Ala Ser

305                 310                 315                 320

Asn Glu Val Val Tyr Arg Phe Thr Ala Arg Pro Leu Val Gln Thr Ile

                325                 330                 335

Phe Glu Gly Gly Lys Ala Thr Cys Phe Ala Tyr Gly Gln Thr Gly Ser

            340                 345                 350

Gly Lys Thr His Thr Met Gly Gly Asp Leu Ser Gly Lys Ala Gln Asn

        355                 360                 365

Ala Ser Lys Gly Ile Tyr Ala Met Ala Ser Arg Asp Val Phe Leu Leu

    370                 375                 380

Lys Asn Gln Pro Cys Tyr Arg Lys Leu Gly Leu Glu Val Tyr Val Thr

385                 390                 395                 400

Phe Phe Glu Ile Tyr Asn Gly Lys Leu Phe Asp Leu Leu Asn Lys Lys

                405                 410                 415

Ala Lys Leu Arg Val Leu Glu Asp Gly Lys Gln Gln Val Gln Val Val

            420                 425                 430

Gly Leu Gln Glu His Leu Val Asn Ser Ala Asp Asp Val Ile Lys Met

        435                 440                 445

Leu Asp Met Gly Ser Ala Cys Arg Thr Ser Gly Gln Thr Phe Ala Asn

    450                 455                 460

Ser Asn Ser Ser Arg Ser His Ala Cys Phe Gln Ile Ile Leu Arg Ala

465                 470                 475                 480

Lys Gly Arg Met His Gly Lys Phe Ser Leu Val Asp Leu Ala Gly Asn

                485                 490                 495

Glu Arg Gly Ala Asp Thr Ser Ser Ala Asp Arg Gln Thr Arg Met Glu

            500                 505                 510

Gly Ala Glu Ile Asn Lys Ser Leu Leu Ala Leu Lys Glu Cys Ile Arg

        515                 520                 525

Ala Leu Gly Gln Asn Lys Ala His Thr Pro Phe Arg Glu Ser Lys Leu

    530                 535                 540

Thr Gln Val Leu Arg Asp Ser Phe Ile Gly Glu Asn Ser Arg Thr Cys

545                 550                 555                 560

Met Ile Ala Thr Ile Ser Pro Gly Ile Ser Ser Cys Glu Tyr Thr Leu

                565                 570                 575

Asn Thr Leu Arg Tyr Ala Asp Arg Val Lys Glu Leu Ser Pro His Ser

            580                 585                 590

Gly Pro Ser Gly Glu Gln Leu Ile Gln Met Glu Thr Glu Glu Met Glu

        595                 600                 605

Ala Cys Ser Asn Gly Ala Leu Ile Pro Gly Asn Leu Ser Lys Glu Glu

    610                 615                 620

Glu Glu Leu Ser Ser Gln Met Ser Ser Phe Asn Glu Ala Met Thr Gln

625                 630                 635                 640

Ile Arg Glu Leu Glu Glu Lys Ala Met Glu Glu Leu Lys Glu Ile Ile

                645                 650                 655

Gln Gln Gly Pro Asp Trp Leu Glu Leu Ser Glu Met Thr Glu Gln Pro

            660                 665                 670

Asp Tyr Asp Leu Glu Thr Phe Val Asn Lys Ala Glu Ser Ala Leu Ala

        675                 680                 685

Gln Gln Ala Lys His Phe Ser Ala Leu Arg Asp Val Ile Lys Ala Leu

    690                 695                 700

Arg Leu Ala Met Gln Leu Glu Glu Gln Ala Ser Arg Gln Ile Ser Ser

705                 710                 715                 720

Lys Lys Arg Pro Gln

                725

<210>37

<211>2401

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(349)..(2364)

<400>37

gggggtaact ggggaagttt ctgggcccac aagaaaatgt aggtagtctt agggttaggt     60

ctcagctgtc aggaacttgc ccctgcccat aagatcctaa agggccccca tttgactctc    120

accagacagt tagaacttgt ttcctcctcc gtgtcagcca tcaagaggtg cttggggggc    180

tgtgcccagc aggacctcac tgcccagcag atcagcaggg gagccaagtg gcctagatct    240

gctgtggagt acccgactgt ttgcctgcct gtctgccctc ctcttcacct cattctcatc    300

actgacgtct accattggct tggaaatcag aaacccatat ccatctag atg att gat     357

                                                     Met Ile Asp

                                                     1

ttt gat gat gtg gct gca ata aac cca gaa ctc tta cag ctt ctt ccc    405

Phe Asp Asp Val Ala Ala Ile Asn Pro Glu Leu Leu Gln Leu Leu Pro

    5                   10                  15

tta cat ccg aag gac aat ctg ccc ttg cag gaa aat gta aca atc cag    453

Leu His Pro Lys Asp Asn Leu Pro Leu Gln Glu Asn Val Thr Ile Gln

20                  25                  30                  35

aaa caa aaa cgg aga tcc gtc aac tcc aaa att cct gct cca aaa gaa    501

Lys Gln Lys Arg Arg Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Ala Pro Lys Glu

                40                  45                  50

agt ctt cga agc cgc tcc act cgc atg tcc act gtc tca gag ctt cgc    549

Ser Leu Arg Ser Arg Ser Thr Arg Met Ser Thr Val Ser Glu Leu Arg

            55                  60                  65

atc acg gct cag gag aat gac atg gag gtg gag ctg cct gca gct gca    597

Ile Thr Ala Gln Glu Asn Asp Met Glu Val Glu Leu Pro Ala Ala Ala

        70                  75                  80

aac tcc cgc aag cag ttt tca gtt cct cct gcc ccc act agg cct tcc     645

Asn Ser Arg Lys Gln Phe Ser Val Pro Pro Ala Pro Thr Arg Pro Ser

    85                  90                  95

tgc cct gca gtg gct gaa ata cca ttg agg atg gtc agc gag gag atg     693

Cys Pro Ala Val Ala Glu Ile Pro Leu Arg Met Val Ser Glu Glu Met

100                 105                 110                 115

gaa gag caa gtc cat tcc atc cgt ggc agc tct tct gca aac cct gtg     741

Glu Glu Gln Val His Ser Ile Arg Gly Ser Ser Ser Ala Asn Pro Val

                120                 125                 130

aac tca gtt cgg agg aaa tca tgt ctt gtg aag gaa gtg gaa aaa atg     789

Asn Ser Val Arg Arg Lys Ser Cys Leu Val Lys Glu Val Glu Lys Met

            135                 140                 145

aag aac aag cga gaa gag aag aag gcc cag aac tct gaa atg aga atg     837

Lys Asn Lys Arg Glu Glu Lys Lys Ala Gln Asn Ser Glu Met Arg Met

        150                 155                 160

aag aga gct cag gag tat gac agt agt ttt cca aac tgg gaa ttt gcc     885

Lys Arg Ala Gln Glu Tyr Asp Ser Ser Phe Pro Asn Trp Glu Phe Ala

    165                 170                 175

cga atg att aaa gaa ttt cgg gct act ttg gaa tgt cat cca ctt act     933

Arg Met Ile Lys Glu Phe Arg Ala Thr Leu Glu Cys His Pro Leu Thr

180                 185                 190                 195

atg act gat cct atc gaa gag cac aga ata tgt gtc tgt gtt agg aaa     981

Met Thr Asp Pro Ile Glu Glu His Arg Ile Cys Val Cys Val Arg Lys

                200                 205                 210

cgc cca ctg aat aag caa gaa ttg gcc aag aaa gaa att gat gtg att    1029

Arg Pro Leu Asn Lys Gln Glu Leu Ala Lys Lys Glu Ile Asp Val Ile

            215                 220                 225

tcc att cct agc aag tgt ctc ctc ttg gta cat gaa ccc aag ttg aaa    1077

Ser Ile Pro Ser Lys Cys Leu Leu Leu Val His Glu Pro Lys Leu Lys

        230                 235                 240

gtg gac tta aca aag tat ctg gag aac caa gca ttc tgc ttt gac ttt    1125

Val Asp Leu Thr Lys Tyr Leu Glu Asn Gln Ala Phe Cys Phe Asp Phe

    245                 250                 255

gca ttt gat gaa aca gct tcg aat gaa gtt gtc tac agg ttc aca gca    1173

Ala Phe Asp Glu Thr Ala Ser Asn Glu Val Val Tyr Arg Phe Thr Ala

260                 265                 270                 275

agg cca ctg gta cag aca atc ttt gaa ggt gga aaa gca act tgt ttt    1221

Arg Pro Leu Val Gln Thr Ile Phe Glu Gly Gly Lys Ala Thr Cys Phe

                280                 285                 290

gca tat ggc cag aca gga agt ggc aag aca cat act atg ggc gga gac    1269

Ala Tyr Gly Gln Thr Gly Ser Gly Lys Thr His Thr Met Gly Gly Asp

            295                 300                 305

ctc tct ggg aaa gcc cag aat gca tcc aaa ggg atc tat gcc atg gcc    1317

Leu Ser Gly Lys Ala Gln Asn Ala Ser Lys Gly Ile Tyr Ala Met Ala

        310                 315                 320

tcc cgg gac gtc ttc ctc ctg aag aat caa ccc tgc tac cgg aag ttg    1365

Ser Arg Asp Val Phe Leu Leu Lys Asn Gln Pro Cys Tyr Arg Lys Leu

    325                 330                 335

ggc ctg gaa gtc tat gtg aca ttc ttc gag atc tac aat ggg aag ctg    1413

Gly Leu Glu Val Tyr Val Thr Phe Phe Glu Ile Tyr Asn Gly Lys Leu

340                 345                 350                 355

ttt gac ctg ctc aac aag aag gcc aag ctg cgc gtg ctg gag gac ggc    1461

Phe Asp Leu Leu Asn Lys Lys Ala Lys Leu Arg Val Leu Glu Asp Gly

                360                 365                 370

aag caa cag gtg caa gtg gtg ggg ctg cag gag cat ctg gtt aac tct    1509

Lys Gln Gln Val Gln Val Val Gly Leu Gln Glu His Leu Val Asn Ser

            375                 380                 385

gct gat gat gtc atc aag atg ctc gac atg ggc agc gcc tgc aga acc    1557

Ala Asp Asp Val Ile Lys Met Leu Asp Met Gly Ser Ala Cys Arg Thr

        390                 395                 400

tct ggg cag aca ttt gcc aac tcc aat tcc tcc cgc tcc cac gcg tgc    1605

Ser Gly Gln Thr Phe Ala Asn Ser Asn Ser Ser Arg Ser His Ala Cys

    405                 410                 415

ttc caa att att ctt cga gct aaa ggg aga atg cat ggc aag ttc tct    1653

Phe Gln Ile Ile Leu Arg Ala Lys Gly Arg Met His Gly Lys Phe Ser

420                 425                 430                 435

ttg gta gat ctg gca ggg aat gag cga ggc gca gac act tcc agt gct    1701

Leu Val Asp Leu Ala Gly Asn Glu Arg Gly Ala Asp Thr Ser Ser Ala

                440                 445                 450

gac cgg cag acc cgc atg gag ggc gca gaa atc aac aag agt ctc tta    1749

Asp Arg Gln Thr Arg Met Glu Gly Ala Glu Ile Asn Lys Ser Leu Leu

            455                 460                 465

gcc ctg aag gag tgc atc agg gcc ctg gga cag aac aag gct cac acc    1797

Ala Leu Lys Glu Cys Ile Arg Ala Leu Gly Gln Asn Lys Ala His Thr

        470                 475                 480

ccg ttc cgt gag agc aag ctg aca cag gtg ctg agg gac tcc ttc att    1845

Pro Phe Arg Glu Ser Lys Leu Thr Gln Val Leu Arg Asp Ser Phe Ile

    485                 490                 495

ggg gag aac tct agg act tgc atg att gcc acg atc tca cca ggc ata    1893

Gly Glu Asn Ser Arg Thr Cys Met Ile Ala Thr Ile Ser Pro Gly Ile

500                 505                 510                 515

agc tcc tgt gaa tat act tta aac acc ctg aga tat gca gac agg gtc    1941

Ser Ser Cys Glu Tyr Thr Leu Asn Thr Leu Arg Tyr Ala Asp Arg Val

                520                 525                 530

aag gag ctg agc ccc cac agt ggg ccc agt gga gag cag ttg att caa    1989

Lys Glu Leu Ser Pro His Ser Gly Pro Ser Gly Glu Gln Leu Ile Gln

            535                 540                 545

atg gaa aca gaa gag atg gaa gcc tgc tct aac ggg gcg ctg att cca    2037

Met Glu Thr Glu Glu Met Glu Ala Cys Ser Asn Gly Ala Leu Ile Pro

        550                 555                 560

ggc aat tta tcc aag gaa gag gag gaa ctg tct tcc cag atg tcc agc    2085

Gly Asn Leu Ser Lys Glu Glu Glu Glu Leu Ser Ser Gln Met Ser Ser

    565                 570                 575

ttt aac gaa gcc atg act cag atc agg gag ctg gag gag aag gct atg    2133

Phe Asn Glu Ala Met Thr Gln Ile Arg Glu Leu Glu Glu Lys Ala Met

580                 585                 590                 595

gaa gag ctc aag gag atc ata cag caa gga cca gac tgg ctt gag ctc    2181

Glu Glu Leu Lys Glu Ile Ile Gln Gln Gly Pro Asp Trp Leu Glu Leu

                600                 605                 610

tct gag atg acc gag cag cca gac tat gac ctg gag acc ttt gtg aac    2229

Ser Glu Met Thr Glu Gln Pro Asp Tyr Asp Leu Glu Thr Phe Val Asn

            615                 620                 625

aaa gcg gaa tct gct ctg gcc cag caa gcc aag cat ttc tca gcc ctg    2277

Lys Ala Glu Ser Ala Leu Ala Gln Gln Ala Lys His Phe Ser Ala Leu

        630                 635                 640

cga gat gtc atc aag gcc tta cgc ctg gcc atg cag ctg gaa gag cag    2325

Arg Asp Val Ile Lys Ala Leu Arg Leu Ala Met Gln Leu Glu Glu Gln

    645                 650                 655

gct agc aga caa ata agc agc aag aaa cgg ccc cag tga cgactgcaaa     2374

Ala Ser Arg Gln Ile Ser Ser Lys Lys Arg Pro Gln

660                 665                 670

taaaaatctg tttggttcca aaaaaaa                                      2401

<210>38

<211>671

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>38

Met Ile Asp Phe Asp Asp Val Ala Ala Ile Asn Pro Glu Leu Leu Gln

1               5                   10                  15

Leu Leu Pro Leu His Pro Lys Asp Asn Leu Pro Leu Gln Glu Asn Val

            20                  25                  30

Thr Ile Gln Lys Gln Lys Arg Arg Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Ala

        35                  40                  45

Pro Lys Glu Ser Leu Arg Ser Arg Ser Thr Arg Met Ser Thr Val Ser

    50                  55                  60

Glu Leu Arg Ile Thr Ala Gln Glu Asn Asp Met Glu Val Glu Leu Pro

65                  70                  75                  80

Ala Ala Ala Asn Ser Arg Lys Gln Phe Ser Val Pro Pro Ala Pro Thr

                85                  90                  95

Arg Pro Ser Cys Pro Ala Val Ala Glu Ile Pro Leu Arg Met Val Ser

            100                 105                 110

Glu Glu Met Glu Glu Gln Val His Ser Ile Arg Gly Ser Ser Ser Ala

        115                 120                 125

Asn Pro Val Asn Ser Val Arg Arg Lys Ser Cys Leu Val Lys Glu Val

    130                 135                 140

Glu Lys Met Lys Asn Lys Arg Glu Glu Lys Lys Ala Gln Asn Ser Glu

145                 150                 155                 160

Met Arg Met Lys Arg Ala Gln Glu Tyr Asp Ser Ser Phe Pro Asn Trp

                165                 170                 175

Glu Phe Ala Arg Met Ile Lys Glu Phe Arg Ala Thr Leu Glu Cys His

            180                 185                 190

Pro Leu Thr Met Thr Asp Pro Ile Glu Glu His Arg Ile Cys Val Cys

        195                 200                 205

Val Arg Lys Arg Pro Leu Asn Lys Gln Glu Leu Ala Lys Lys Glu Ile

    210                 215                 220

Asp Val Ile Ser Ile Pro Ser Lys Cys Leu Leu Leu Val His Glu Pro

225                 230                 235                 240

Lys Leu Lys Val Asp Leu Thr Lys Tyr Leu Glu Asn Gln Ala Phe Cys

                245                 250                 255

Phe Asp Phe Ala Phe Asp Glu Thr Ala Ser Asn Glu Val Val Tyr Arg

            260                 265                 270

Phe Thr Ala Arg Pro Leu Val Gln Thr Ile Phe Glu Gly Gly Lys Ala

        275                 280                 285

Thr Cys Phe Ala Tyr Gly Gln Thr Gly Ser Gly Lys Thr His Thr Met

    290                 295                 300

Gly Gly Asp Leu Ser Gly Lys Ala Gln Asn Ala Ser Lys Gly Ile Tyr

305                 310                 315                 320

Ala Met Ala Ser Arg Asp Val Phe Leu Leu Lys Asn Gln Pro Cys Tyr

                325                 330                 335

Arg Lys Leu Gly Leu Glu Val Tyr Val Thr Phe Phe Glu Ile Tyr Asn

            340                 345                 350

Gly Lys Leu Phe Asp Leu Leu Asn Lys Lys Ala Lys Leu Arg Val Leu

        355                 360                 365

Glu Asp Gly Lys Gln Gln Val Gln Val Val Gly Leu Gln Glu His Leu

    370                 375                 380

Val Asn Ser Ala Asp Asp Val Ile Lys Met Leu Asp Met Gly Ser Ala

385                 390                 395                 400

Cys Arg Thr Ser Gly Gln Thr Phe Ala Asn Ser Asn Ser Ser Arg Ser

                405                 410                 415

His Ala Cys Phe Gln Ile Ile Leu Arg Ala Lys Gly Arg Met His Gly

            420                 425                 430

Lys Phe Ser Leu Val Asp Leu Ala Gly Asn Glu Arg Gly Ala Asp Thr

        435                 440                 445

Ser Ser Ala Asp Arg Gln Thr Arg Met Glu Gly Ala Glu Ile Asn Lys

    450                 455                 460

Ser Leu Leu Ala Leu Lys Glu Cys Ile Arg Ala Leu Gly Gln Asn Lys

465                 470                 475                 480

Ala His Thr Pro Phe Arg Glu Ser Lys Leu Thr Gln Val Leu Arg Asp

                485                 490                 495

Ser Phe Ile Gly Glu Asn Ser Arg Thr Cys Met Ile Ala Thr Ile Ser

            500                 505                 510

Pro Gly Ile Ser Ser Cys Glu Tyr Thr Leu Asn Thr Leu Arg Tyr Ala

        515                 520                 525

Asp Arg Val Lys Glu Leu Ser Pro His Ser Gly Pro Ser Gly Glu Gln

    530                 535                 540

Leu Ile Gln Met Glu Thr Glu Glu Met Glu Ala Cys Ser Asn Gly Ala

545                 550                 555                 560

Leu Ile Pro Gly Asn Leu Ser Lys Glu Glu Glu Glu Leu Ser Ser Gln

                565                 570                 575

Met Ser Ser Phe Asn Glu Ala Met Thr Gln Ile Arg Glu Leu Glu Glu

            580                 585                 590

Lys Ala Met Glu Glu Leu Lys Glu Ile Ile Gln Gln Gly Pro Asp Trp

        595                 600                 605

Leu Glu Leu Ser Glu Met Thr Glu Gln Pro Asp Tyr Asp Leu Glu Thr

    610                 615                 620

Phe Val Asn Lys Ala Glu Ser Ala Leu Ala Gln Gln Ala Lys His Phe

625                 630                 635                 640

Ser Ala Leu Arg Asp Val Ile Lys Ala Leu Arg Leu Ala Met Gln Leu

                645                 650                 655

Glu Glu Gln Ala Ser Arg Gln Ile Ser Ser Lys Lys Arg Pro Gln

            660                 665                 670

<210>39

<211>3128

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(158)..(2020)

<400>39

gcttcgcccc gtggcgcggt ttgaaatttt gcggggctca acggctcgcg gagcggctac     60

gcggagtgac atcgccggtg tttgcgggtg gttgttgctc tcggggccgt gtggagtagg    120

tctggacctg gactcacggc tgcttggagc gtccgcc atg agg aga agt gag gtg     175

                                         Met Arg Arg Ser Glu Val

                                         1               5

ctg gcg gag gag tcc ata gta tgt ctg cag aaa gcc cta aat cac ctt    223

Leu Ala Glu Glu Ser Ile Val Cys Leu Gln Lys Ala Leu Asn His Leu

            10                  15                  20

cgg gaa ata tgg gag cta att ggg att cca gag gac cag cgg tta caa    271

Arg Glu Ile Trp Glu Leu Ile Gly Ile Pro Glu Asp Gln Arg Leu Gln

        25                  30                  35

aga act gag gtg gta aag aag cat atc aag gaa ctc ctg gat atg atg    319

Arg Thr Glu Val Val Lys Lys His Ile Lys Glu Leu Leu Asp Met Met

    40                  45                  50

att gct gaa gag gaa agc ctg aag gaa aga ctc atc aaa agc ata tcc    367

Ile Ala Glu Glu Glu Ser Leu Lys Glu Arg Leu Ile Lys Ser Ile Ser

55                  60                  65                  70

gtc tgt cag aaa gag ctg aac act ctg tgc agc gag tta cat gtt gag    415

Val Cys Gln Lys Glu Leu Asn Thr Leu Cys Ser Glu Leu His Val Glu

                75                  80                  85

cca ttt cag gaa gaa gga gag acg acc atc ttg caa cta gaa aaa gat    463

Pro Phe Gln Glu Glu Gly Glu Thr Thr Ile Leu Gln Leu Glu Lys Asp

            90                  95                  100

ttg cgc acc caa gtg gaa ttg atg cga aaa cag aaa aag gag aga aaa    511

Leu Arg Thr Gln Val Glu Leu Met Arg Lys Gln Lys Lys Glu Arg Lys

        105                 110                 115

cag gaa ctg aag cta ctt caa gag caa gat caa gaa ctg tgc gaa att    559

Gln Glu Leu Lys Leu Leu Gln Glu Gln Asp Gln Glu Leu Cys Glu Ile

    120                 125                 130

ctt tgt atg ccc cac tat gat att gac agt gcc tca gtg ccc agc tta    607

Leu Cys Met Pro His Tyr Asp Ile Asp Ser Ala Ser Val Pro Ser Leu

135                 140                 145                 150

gaa gag ctg aac cag ttc agg caa cat gtg aca act ttg agg gaa aca    655

Glu Glu Leu Asn Gln Phe Arg Gln His Val Thr Thr Leu Arg Glu Thr

                155                 160                 165

aag gct tct agg cgt gag gag ttt gtc agt ata aag aga cag atc ata    703

Lys Ala Ser Arg Arg Glu Glu Phe Val Ser Ile Lys Arg Gln Ile Ile

            170                 175                 180

ctg tgt atg gaa gaa tta gac cac acc cca gac aca agc ttt gaa aga    751

Leu Cys Met Glu Glu Leu Asp His Thr Pro Asp Thr Ser Phe Glu Arg

        185                 190                 195

gat gtg gtg tgt gaa gac gaa gat gcc ttt tgt ttg tct ttg gag aat    799

Asp Val Val Cys Glu Asp Glu Asp Ala Phe Cys Leu Ser Leu Glu Asn

    200                 205                 210

att gca aca cta caa aag ttg cta cgg cag ctg gaa atg cag aaa tca     847

Ile Ala Thr Leu Gln Lys Leu Leu Arg Gln Leu Glu Met Gln Lys Ser

215                 220                 225                 230

caa aat gaa gca gtg tgt gag ggg ctg cgt act caa atc cga gag ctc     895

Gln Asn Glu Ala Val Cys Glu Gly Leu Arg Thr Gln Ile Arg Glu Leu

                235                 240                 245

tgg gac agg ttg caa ata cct gaa gaa gaa aga gaa gct gtg gcc acc     943

Trp Asp Arg Leu Gln Ile Pro Glu Glu Glu Arg Glu Ala Val Ala Thr

            250                 255                 260

att atg tct ggg tca aag gcc aag gtc cgg aaa gcg ctg caa tta gaa     991

Ile Met Ser Gly Ser Lys Ala Lys Val Arg Lys Ala Leu Gln Leu Glu

        265                 270                 275

gtg gat cgg ttg gaa gaa ctg aaa atg caa aac atg aag aaa gtg att    1039

Val Asp Arg Leu Glu Glu Leu Lys Met Gln Asn Met Lys Lys Val Ile

    280                 285                 290

gag gca att cga gtg gag ctg gtt cag tac tgg gac cag tgc ttt tat    1087

Glu Ala Ile Arg Val Glu Leu Val Gln Tyr Trp Asp Gln Cys Phe Tyr

295                 300                 305                 310

agc cag gag cag aga caa gct ttt gcc cct ttc tgt gct gag gac tac    1135

Ser Gln Glu Gln Arg Gln Ala Phe Ala Pro Phe Cys Ala Glu Asp Tyr

                315                 320                 325

aca gaa agt ctg ctc cag ctc cac gat gct gag att gtg cgg tta aaa    1183

Thr Glu Ser Leu Leu Gln Leu His Asp Ala Glu Ile Val Arg Leu Lys

            330                 335                 340

aac tac tat gaa gtt cac aag gaa ctc ttt gaa ggt gtc cag aag tgg    1231

Asn Tyr Tyr Glu Val His Lys Glu Leu Phe Glu Gly Val Gln Lys Trp

        345                 350                 355

gaa gaa acc tgg agg ctt ttc tta gag ttt gag aga aaa gct tca gat    1279

Glu Glu Thr Trp Arg Leu Phe Leu Glu Phe Glu Arg Lys Ala Ser Asp

    360                 365                 370

cca aat cga ttt aca aac cga gga gga aat ctt cta aaa gaa gaa aaa    1327

Pro Asn Arg Phe Thr Asn Arg Gly Gly Asn Leu Leu Lys Glu Glu Lys

375                 380                 385                 390

caa cga gcc aag ctc cag aaa atg ctg ccc aag ctg gaa gaa gag ttg    1375

Gln Arg Ala Lys Leu Gln Lys Met Leu Pro Lys Leu Glu Glu Glu Leu

                395                 400                 405

aag gca cga att gaa ttg tgg gaa cag gaa cat tca aag gca ttt atg    1423

Lys Ala Arg Ile Glu Leu Trp Glu Gln Glu His Ser Lys Ala Phe Met

            410                 415                 420

gtg aat ggg cag aaa ttc atg gag tat gtg gca gaa caa tgg gag atg    1471

Val Asn Gly Gln Lys Phe Met Glu Tyr Val Ala Glu Gln Trp Glu Met

        425                 430                 435

cat cga ttg gag aaa gag aga gcc aag cag gaa aga caa ctg aag aac    1519

His Arg Leu Glu Lys Glu Arg Ala Lys Gln Glu Arg Gln Leu Lys Asn

    440                 445                 450

aaa aaa cag aca gag aca gag atg ctg tat ggc agc gct cct cga aca    1567

Lys Lys Gln Thr Glu Thr Glu Met Leu Tyr Gly Ser Ala Pro Arg Thr

455                 460                 465                 470

cct agc aag cgg cga gga ctg gct ccc aat aca ccg ggc aaa gca cgt    1615

Pro Ser Lys Arg Arg Gly Leu Ala Pro Asn Thr Pro Gly Lys Ala Arg

                475                 480                 485

aag ctg aac act acc acc atg tcc aat gct acg gcc aat agt agc att    1663

Lys Leu Asn Thr Thr Thr Met Ser Asn Ala Thr Ala Asn Ser Ser Ile

            490                 495                 500

cgg cct atc ttt gga ggg aca gtc tac cac tcc ccc gtg tct cga ctt    1711

Arg Pro Ile Phe Gly Gly Thr Val Tyr His Ser Pro Val Ser Arg Leu

        505                 510                 515

cct cct tct ggc agc aag cca gtc gct gct tcc acc tgt tca ggg aag    1759

Pro Pro Ser Gly Ser Lys Pro Val Ala Ala Ser Thr Cys Ser Gly Lys

    520                 525                 530

aaa aca ccc cgt act ggc agg cat gga gcc aac aag gag aac ctg gag    1807

Lys Thr Pro Arg Thr Gly Arg His Gly Ala Asn Lys Glu Asn Leu Glu

535                 540                 545                 550

ctc aac ggc agc atc ctg agt ggt ggg tac cct ggc tcg gcc ccc ctc    1855

Leu Asn Gly Ser Ile Leu Ser Gly Gly Tyr Pro Gly Ser Ala Pro Leu

                555                 560                 565

cag cgc aac ttc agc att aat tct gtt gcc agc acc tat tct gag ttt    1903

Gln Arg Asn Phe Ser Ile Asn Ser Val Ala Ser Thr Tyr Ser Glu Phe

            570                 575                 580

gcg aag gat ccg tcc ctc tct gac agt tcc act gtt ggg ctt cag cga    1951

Ala Lys Asp Pro Ser Leu Ser Asp Ser Ser Thr Val Gly Leu Gln Arg

        585                 590                 595

gaa ctt tca aag gct tcc aaa tct gat gct act tct gga atc ctc aat    1999

Glu Leu Ser Lys Ala Ser Lys Ser Asp Ala Thr Ser Gly Ile Leu Asn

    600                 605                 610

tca acc aac atc cag tcc tga gaagccctga tcagtcaacc agctgtggct       2050

Ser Thr Asn Ile Gln Ser

615                 620

tcctgtgcct agactggacc taattatatg ggggtgactt tagtttttct tcagcttagg    2110

cgtgcttgaa accttggcca ggttccatga ccatgggcct aacttaaaga tgtgaatgag    2170

tgttacagtt gaaagcccat cataggttta gtggtcctag gagacttggt tttgacttat    2230

atacatgaaa agtttatggc aagaagtgca aattttagca tatggggcct gacttctcta    2290

ccacataatt ctacttgctg aagcatgatc aaagcttgtt ttatttcacc actgtaggaa    2350

aatgattgac tatgcccatc cctgggggta attttggcat gtatacctgt aactagtaat    2410

taacatcttt tttgtttagg catgttcaat taatgctgta gctatcatag ctttgctctt    2470

acctgaagcc ttgtccccac cacacaggac agccttcctc ctgaagagaa tgtctttgtg    2530

tgtccgaagt tgagatggcc tgccctactg ccaaagaggt gacaggaagg ctgggagcag    2590

ctttgttaaa ttgtgttcag ttctgttaca cagtgcattg ccctttgttg ggggtatgca    2650

tgtatgaaca cacatgcttg tcggaacgct ttctcggcgt ttgtcccttg gctctcatct    2710

cccccattcc tgtgcctact ttgcctgagt tcttctaccc ccgcagttgc cagccacatt    2770

gggagtctgt ttgttccaat gggttgagct gtctttgtcg tggagatctg gaactttgca    2830

catgtcacta ctggggaggt gttcctgctc tagcttccac gatgaggcgc cctctttacc  2890

tatcctctca atcactactc ttcttgaagc actattattt attcttccgc tgtctgcctg  2950

cagcagtact actgtcaaca tagtgtaaat ggttctcaaa agcttaccag tgtggacttg  3010

gtgttagcca cgctgtttac tcatacagta cgtgtcctgt ttttaaaata tacaattatt  3070

cttaaaaata aattaaaatc tgtatactta catttcaaaa agaaaaaaaa aaaaaaaa    3128

<210>40

<211>620

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>40

Met Arg Arg Ser Glu Val Leu Ala Glu Glu Ser Ile Val Cys Leu Gln

1               5                  10                  15

Lys Ala Leu Asn His Leu Arg Glu Ile Trp Glu Leu Ile Gly Ile Pro

            20                  25                  30

Glu Asp Gln Arg Leu Gln Arg Thr Glu Val Val Lys Lys His Ile Lys

        35                  40                  45

Glu Leu Leu Asp Met Met Ile Ala Glu Glu Glu Ser Leu Lys Glu Arg

    50                  55                  60

Leu Ile Lys Ser Ile Ser Val Cys Gln Lys Glu Leu Asn Thr Leu Cys

65                  70                  75                  80

Ser Glu Leu His Val Glu Pro Phe Gln Glu Glu Gly Glu Thr Thr Ile

                85                  90                  95

Leu Gln Leu Glu Lys Asp Leu Arg Thr Gln Val Glu Leu Met Arg Lys

            100                 105                 110

Gln Lys Lys Glu Arg Lys Gln Glu Leu Lys Leu Leu Gln Glu Gln Asp

        115                 120                 125

Gln Glu Leu Cys Glu Ile Leu Cys Met Pro His Tyr Asp Ile Asp Ser

    130                 135                 140

Ala Ser Val Pro Ser Leu Glu Glu Leu Asn Gln Phe Arg Gln His Val

145                 150                 155                 160

Thr Thr Leu Arg Glu Thr Lys Ala Ser Arg Arg Glu Glu Phe Val Ser

                165                 170                 175

Ile Lys Arg Gln Ile Ile Leu Cys Met Glu Glu Leu Asp His Thr Pro

            180                 185                 190

Asp Thr Ser Phe Glu Arg Asp Val Val Cys Glu Asp Glu Asp Ala Phe

        195                 200                 205

Cys Leu Ser Leu Glu Asn Ile Ala Thr Leu Gln Lys Leu Leu Arg Gln

    210                 215                 220

Leu Glu Met Gln Lys Ser Gln Asn Glu Ala Val Cys Glu Gly Leu Arg

225                 230                 235                 240

Thr Gln Ile Arg Glu Leu Trp Asp Arg Leu Gln Ile Pro Glu Glu Glu

                245                 250                 255

Arg Glu Ala Val Ala Thr Ile Met Ser Gly Ser Lys Ala Lys Val Arg

            260                 265                 270

Lys Ala Leu Gln Leu Glu Val Asp Arg Leu Glu Glu Leu Lys Met Gln

        275                 280                 285

Asn Met Lys Lys Val Ile Glu Ala Ile Arg Val Glu Leu Val Gln Tyr

    290                 295                 300

Trp Asp Gln Cys Phe Tyr Ser Gln Glu Gln Arg Gln Ala Phe Ala Pro

305                 310                 315                 320

Phe Cys Ala Glu Asp Tyr Thr Glu Ser Leu Leu Gln Leu His Asp Ala

                325                 330                 335

Glu Ile Val Arg Leu Lys Asn Tyr Tyr Glu Val His Lys Glu Leu Phe

            340                 345                 350

Glu Gly Val Gln Lys Trp Glu Glu Thr Trp Arg Leu Phe Leu Glu Phe

        355                 360                 365

Glu Arg Lys Ala Ser Asp Pro Asn Arg Phe Thr Asn Arg Gly Gly Asn

    370                 375                 380

Leu Leu Lys Glu Glu Lys Gln Arg Ala Lys Leu Gln Lys Met Leu Pro

385                 390                 395                 400

Lys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Ala Arg Ile Glu Leu Trp Glu Gln Glu

                405                 410                 415

His Ser Lys Ala Phe Met Val Asn Gly Gln Lys Phe Met Glu Tyr Val

            420                 425                 430

Ala Glu Gln Trp Glu Met His Arg Leu Glu Lys Glu Arg Ala Lys Gln

        435                 440                 445

Glu Arg Gln Leu Lys Asn Lys Lys Gln Thr Glu Thr Glu Met Leu Tyr

    450                 455                 460

Gly Ser Ala Pro Arg Thr Pro Ser Lys Arg Arg Gly Leu Ala Pro Asn

465                 470                 475                 480

Thr Pro Gly Lys Ala Arg Lys Leu Asn Thr Thr Thr Met Ser Asn Ala

                485                 490                 495

Thr Ala Asn Ser Ser Ile Arg Pro Ile Phe Gly Gly Thr Val Tyr His

            500                 505                 510

Ser Pro Val Ser Arg Leu Pro Pro Ser Gly Ser Lys Pro Val Ala Ala

        515                 520                 525

Ser Thr Cys Ser Gly Lys Lys Thr Pro Arg Thr Gly Arg His Gly Ala

    530                 535                 540

Asn Lys Glu Asn Leu Glu Leu Asn Gly Ser Ile Leu Ser Gly Gly Tyr

545                 550                 555                 560

Pro Gly Ser Ala Pro Leu Gln Arg Asn Phe Ser Ile Asn Ser Val Ala

                565                 570                 575

Ser Thr Tyr Ser Glu Phe Ala Lys Asp Pro Ser Leu Ser Asp Ser Ser

            580                 585                 590

Thr Val Gly Leu Gln Arg Glu Leu Ser Lys Ala Ser Lys Ser Asp Ala

        595                 600                 605

Thr Ser Gly Ile Leu Asn Ser Thr Asn Ile Gln Ser

    610                 615                 620

<210>41

<211>3091

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(158)..(1978)

<400>41

gcttcgcccc gtggcgcggt ttgaaatttt gcggggctca acggctcgcg gagcggctac    60

gcggagtgac atcgccggtg tttgcgggtg gttgttgctc tcggggccgt gtggagtagg   120

tctggacctg gactcacggc tgcttggagc gtccgcc atg agg aga agt gag gtg    175

                                         Met Arg Arg Ser Glu Val

                                         1               5

ctg gcg gag gag tcc ata gta tgt ctg cag aaa gcc cta aat cac ctt    223

Leu Ala Glu Glu Ser Ile Val Cys Leu Gln Lys Ala Leu Asn His Leu

            10                  15                  20

cgg gaa ata tgg gag cta att ggg att cca gag gac cag cgg tta caa    271

Arg Glu Ile Trp Glu Leu Ile Gly Ile Pro Glu Asp Gln Arg Leu Gln

        25                  30                  35

aga act gag gtg gta aag aag cat atc aag gaa ctc ctg gat atg atg    319

Arg Thr Glu Val Val Lys Lys His Ile Lys Glu Leu Leu Asp Met Met

    40                  45                  50

att gct gaa gag gaa agc ctg aag gaa aga ctc atc aaa agc ata tcc    367

Ile Ala Glu Glu Glu Ser Leu Lys Glu Arg Leu Ile Lys Ser Ile Ser

55                  60                  65                  70

gtc tgt cag aaa gag ctg aac act ctg tgc agc gag tta cat gtt gag    415

Val Cys Gln Lys Glu Leu Asn Thr Leu Cys Ser Glu Leu His Val Glu

                75                  80                  85

cca ttt cag gaa gaa gga gag acg acc atc ttg caa cta gaa aaa gat    463

Pro Phe Gln Glu Glu Gly Glu Thr Thr Ile Leu Gln Leu Glu Lys Asp

            90                  95                  100

ttg cgc acc caa gtg gaa ttg atg cga aaa cag aaa aag gag aga aaa    511

Leu Arg Thr Gln Val Glu Leu Met Arg Lys Gln Lys Lys Glu Arg Lys

        105                 110                 115

cag gaa ctg aag cta ctt caa gag caa gat caa gaa ctg tgc gaa att     559

Gln Glu Leu Lys Leu Leu Gln Glu Gln Asp Gln Glu Leu Cys Glu Ile

    120                 125                 130

ctt tgt atg ccc cac tat gat att gac agt gcc tca gtg ccc agc tta     607

Leu Cys Met Pro His Tyr Asp Ile Asp Ser Ala Ser Val Pro Ser Leu

135                 140                 145                 150

gaa gag ctg aac cag ttc agg caa cat gtg aca act ttg agg gaa aca     655

Glu Glu Leu Asn Gln Phe Arg Gln His Val Thr Thr Leu Arg Glu Thr

                155                 160                 165

aag gct tct agg cgt gag gag ttt gtc agt ata aag aga cag atc ata     703

Lys Ala Ser Arg Arg Glu Glu Phe Val Ser Ile Lys Arg Gln Ile Ile

            170                 175                 180

ctg tgt atg gaa gaa tta gac cac acc cca gac aca agc ttt gaa aga     751

Leu Cys Met Glu Glu Leu Asp His Thr Pro Asp Thr Ser Phe Glu Arg

        185                 190                 195

gat gtg gtg tgt gaa gac gaa gat gcc ttt tgt ttg tct ttg gag aat     799

Asp Val Val Cys Glu Asp Glu Asp Ala Phe Cys Leu Ser Leu Glu Asn

    200                 205                 210

att gca aca cta caa aag ttg cta cgg cag ctg gaa atg cag aaa tca     847

Ile Ala Thr Leu Gln Lys Leu Leu Arg Gln Leu Glu Met Gln Lys Ser

215                 220                 225                 230

caa aat gaa gca gtg tgt gag ggg ctg cgt act caa atc cga gag ctc     895

Gln Asn Glu Ala Val Cys Glu Gly Leu Arg Thr Gln Ile Arg Glu Leu

                235                 240                 245

tgg gac agg ttg caa ata cct gaa gaa gaa aga gaa gct gtg gcc acc     943

Trp Asp Arg Leu Gln Ile Pro Glu Glu Glu Arg Glu Ala Val Ala Thr

            250                 255                 260

att atg tct ggg tca aag gcc aag gtc cgg aaa gcg ctg caa tta gaa     991

Ile Met Ser Gly Ser Lys Ala Lys Val Arg Lys Ala Leu Gln Leu Glu

        265                 270                 275

gtg gat cgg ttg gaa gaa ctg aaa atg caa aac atg aag aaa gtg att    1039

Val Asp Arg Leu Glu Glu Leu Lys Met Gln Asn Met Lys Lys Val Ile

    280                 285                 290

gag gca att cga gtg gag ctg gtt cag tac tgg gac cag tgc ttt tat    1087

Glu Ala Ile Arg Val Glu Leu Val Gln Tyr Trp Asp Gln Cys Phe Tyr

295                 300                 305                 310

agc cag gag cag aga caa gct ttt gcc cct ttc tgt gct gag gac tac    1135

Ser Gln Glu Gln Arg Gln Ala Phe Ala Pro Phe Cys Ala Glu Asp Tyr

                315                 320                 325

aca gaa agt ctg ctc cag ctc cac gat gct gag att gtg cgg tta aaa    1183

Thr Glu Ser Leu Leu Gln Leu His Asp Ala Glu Ile Val Arg Leu Lys

            330                 335                 340

aac tac tat gaa gtt cac aag gaa ctc ttt gaa ggt gtc cag aag tgg    1231

Asn Tyr Tyr Glu Val His Lys Glu Leu Phe Glu Gly Val Gln Lys Trp

        345                 350                 355

gaa gaa acc tgg agg ctt ttc tta gag ttt gag aga aaa gct tca gat    1279

Glu Glu Thr Trp Arg Leu Phe Leu Glu Phe Glu Arg Lys Ala Ser Asp

    360                 365                 370

cca aat cga ttt aca aac cga gga gga aat ctt cta aaa gaa gaa aaa    1327

Pro Asn Arg Phe Thr Asn Arg Gly Gly Asn Leu Leu Lys Glu Glu Lys

375                 380                 385                 390

caa cga gcc aag ctc cag aaa atg ctg ccc aag ctg gaa gaa gag ttg    1375

Gln Arg Ala Lys Leu Gln Lys Met Leu Pro Lys Leu Glu Glu Glu Leu

                395                 400                 405

aag gca cga att gaa ttg tgg gaa cag gaa cat tca aag gca ttt atg    1423

Lys Ala Arg Ile Glu Leu Trp Glu Gln Glu His Ser Lys Ala Phe Met

            410                 415                 420

gtg aat ggg cag aaa ttc atg gag tat gtg gca gaa caa tgg gag atg    1471

Val Asn Gly Gln Lys Phe Met Glu Tyr Val Ala Glu Gln Trp Glu Met

        425                 430                 435

cat cga ttg gag aaa gag aga gcc aag cag gaa aga caa ctg aag aac    1519

His Arg Leu Glu Lys Glu Arg Ala Lys Gln Glu Arg Gln Leu Lys Asn

    440                 445                 450

aaa aaa cag aca gag aca gag atg ctg tat ggc agc gct cct cga aca    1567

Lys Lys Gln Thr Glu Thr Glu Met Leu Tyr Gly Ser Ala Pro Arg Thr

455                 460                 465                 470

cct agc aag cgg cga gga ctg gct ccc aat aca ccg ggc aaa gca cgt    1615

Pro Ser Lys Arg Arg Gly Leu Ala Pro Asn Thr Pro Gly Lys Ala Arg

                475                 480                 485

aag ctg aac act acc acc atg tcc aat gct acg gcc aat agt agc att    1663

Lys Leu Asn Thr Thr Thr Met Ser Asn Ala Thr Ala Asn Ser Ser Ile

            490                 495                 500

cgg cct atc ttt gga ggg aca gtc tac cac tcc ccc gtg tct cga ctt    1711

Arg Pro Ile Phe Gly Gly Thr Val Tyr His Ser Pro Val Ser Arg Leu

        505                 510                 515

cct cct tct ggc agc aag cca gtc gct gct tcc acc tgt tca ggg aag    1759

Pro Pro Ser Gly Ser Lys Pro Val Ala Ala Ser Thr Cys Ser Gly Lys

    520                 525                 530

aaa aca ccc cgt act ggc agg cat gga gcc aac aag gag aac ctg gag    1807

Lys Thr Pro Arg Thr Gly Arg His Gly Ala Asn Lys Glu Asn Leu Glu

535                 540                 545                 550

ctc aac ggc agc atc ctg agt ggt ggg tac cct ggc tcg gcc ccc ctc    1855

Leu Asn Gly Ser Ile Leu Ser Gly Gly Tyr Pro Gly Ser Ala Pro Leu

                555                 560                 565

cag cgc aac ttc agc att aat tct gtt gcc agc acc tat tct gag ttt    1903

Gln Arg Asn Phe Ser Ile Asn Ser Val Ala Ser Thr Tyr Ser Glu Phe

            570                 575                 580

gcg cga gaa ctt tca aag gct tcc aaa tct gat gct act tct gga atc    1951

Ala Arg Glu Leu Ser Lys Ala Ser Lys Ser Asp Ala Thr Ser Gly Ile

        585                 590                 595

ctc aat tca acc aac atc cag tcc tga gaagccctga tcagtcaacc          1998

Leu Asn Ser Thr Asn Ile Gln Ser

    600                 605

agctgtggct tcctgtgcct agactggacc taattatatg ggggtgactt tagtttttct    2058

tcagcttagg cgtgcttgaa accttggcca ggttccatga ccatgggcct aacttaaaga    2118

tgtgaatgag tgttacagtt gaaagcccat cataggttta gtggtcctag gagacttggt    2178

tttgacttat atacatgaaa agtttatggc aagaagtgca aattttagca tatggggcct    2238

gacttctcta ccacataatt ctacttgctg aagcatgatc aaagcttgtt ttatttcacc  2298

actgtaggaa aatgattgac tatgcccatc cctgggggta attttggcat gtatacctgt  2358

aactagtaat taacatcttt tttgtttagg catgttcaat taatgctgta gctatcatag  2418

ctttgctctt acctgaagcc ttgtccccac cacacaggac agccttcctc ctgaagagaa  2478

tgtctttgtg tgtccgaagt tgagatggcc tgccctactg ccaaagaggt gacaggaagg  2538

ctgggagcag ctttgttaaa ttgtgttcag ttctgttaca cagtgcattg ccctttgttg  2598

ggggtatgca tgtatgaaca cacatgcttg tcggaacgct ttctcggcgt ttgtcccttg  2658

gctctcatct cccccattcc tgtgcctact ttgcctgagt tcttctaccc ccgcagttgc  2718

cagccacatt gggagtctgt ttgttccaat gggttgagct gtctttgtcg tggagatctg  2778

gaactttgca catgtcacta ctggggaggt gttcctgctc tagcttccac gatgaggcgc  2838

cctctttacc tatcctctca atcactactc ttcttgaagc actattattt attcttccgc  2898

tgtctgcctg cagcagtact actgtcaaca tagtgtaaat ggttctcaaa agcttaccag  2958

tgtggacttg gtgttagcca cgctgtttac tcatacagta cgtgtcctgt ttttaaaata  3018

tacaattatt cttaaaaata aattaaaatc tgtatactta catttcaaaa agaaaaaaaa  3078

aaaaaaaaaa aaa                                                     3091

<210>42

<211>606

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>42

Met Arg Arg Ser Glu Val Leu Ala Glu Glu Ser Ile Val Cys Leu Gln

1               5                  10                  15

Lys Ala Leu Asn His Leu Arg Glu Ile Trp Glu Leu Ile Gly Ile Pro

            20                  25                  30

Glu Asp Gln Arg Leu Gln Arg Thr Glu Val Val Lys Lys His Ile Lys

        35                  40                  45

Glu Leu Leu Asp Met Met Ile Ala Glu Glu Glu Ser Leu Lys Glu Arg

    50                  55                  60

Leu Ile Lys Ser Ile Ser Val Cys Gln Lys Glu Leu Asn Thr Leu Cys

65                  70                  75                  80

Ser Glu Leu His Val Glu Pro Phe Gln Glu Glu Gly Glu Thr Thr Ile

                85                  90                  95

Leu Gln Leu Glu Lys Asp Leu Arg Thr Gln Val Glu Leu Met Arg Lys

            100                 105                 110

Gln Lys Lys Glu Arg Lys Gln Glu Leu Lys Leu Leu Gln Glu Gln Asp

        115                 120                 125

Gln Glu Leu Cys Glu Ile Leu Cys Met Pro His Tyr Asp Ile Asp Ser

    130                 135                 140

Ala Ser Val Pro Ser Leu Glu Glu Leu Asn Gln Phe Arg Gln His Val

145                 150                 155                 160

Thr Thr Leu Arg Glu Thr Lys Ala Ser Arg Arg Glu Glu Phe Val Ser

                165                 170                 175

Ile Lys Arg Gln Ile Ile Leu Cys Met Glu Glu Leu Asp His Thr Pro

            180                 185                 190

Asp Thr Ser Phe Glu Arg Asp Val Val Cys Glu Asp Glu Asp Ala Phe

        195                 200                 205

Cys Leu Ser Leu Glu Asn Ile Ala Thr Leu Gln Lys Leu Leu Arg Gln

    210                 215                 220

Leu Glu Met Gln Lys Ser Gln Asn Glu Ala Val Cys Glu Gly Leu Arg

225                 230                 235                 240

Thr Gln Ile Arg Glu Leu Trp Asp Arg Leu Gln Ile Pro Glu Glu Glu

                245                 250                 255

Arg Glu Ala Val Ala Thr Ile Met Ser Gly Ser Lys Ala Lys Val Arg

            260                 265                 270

Lys Ala Leu Gln Leu Glu Val Asp Arg Leu Glu Glu Leu Lys Met Gln

        275                 280                 285

Asn Met Lys Lys Val Ile Glu Ala Ile Arg Val Glu Leu Val Gln Tyr

    290                 295                 300

Trp Asp Gln Cys Phe Tyr Ser Gln Glu Gln Arg Gln Ala Phe Ala Pro

305                 310                 315                 320

Phe Cys Ala Glu Asp Tyr Thr Glu Ser Leu Leu Gln Leu His Asp Ala

                325                 330                 335

Glu Ile Val Arg Leu Lys Asn Tyr Tyr Glu Val His Lys Glu Leu Phe

            340                 345                 350

Glu Gly Val Gln Lys Trp Glu Glu Thr Trp Arg Leu Phe Leu Glu Phe

        355                 360                 365

Glu Arg Lys Ala Ser Asp Pro Asn Arg Phe Thr Asn Arg Gly Gly Asn

    370                 375                 380

Leu Leu Lys Glu Glu Lys Gln Arg Ala Lys Leu Gln Lys Met Leu Pro

385                 390                 395                 400

Lys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Ala Arg Ile Glu Leu Trp Glu Gln Glu

                405                 410                 415

His Ser Lys Ala Phe Met Val Asn Gly Gln Lys Phe Met Glu Tyr Val

            420                 425                 430

Ala Glu Gln Trp Glu Met His Arg Leu Glu Lys Glu Arg Ala Lys Gln

        435                 440                 445

Glu Arg Gln Leu Lys Asn Lys Lys Gln Thr Glu Thr Glu Met Leu Tyr

    450                 455                 460

Gly Ser Ala Pro Arg Thr Pro Ser Lys Arg Arg Gly Leu Ala Pro Asn

465                 470                 475                 480

Thr Pro Gly Lys Ala Arg Lys Leu Asn Thr Thr Thr Met Ser Asn Ala

                485                 490                 495

Thr Ala Asn Ser Ser Ile Arg Pro Ile Phe Gly Gly Thr Val Tyr His

            500                 505                 510

Ser Pro Val Ser Arg Leu Pro Pro Ser Gly Ser Lys Pro Val Ala Ala

        515                 520                 525

Ser Thr Cys Ser Gly Lys Lys Thr Pro Arg Thr Gly Arg His Gly Ala

    530                 535                 540

Asn Lys Glu Asn Leu Glu Leu Asn Gly Ser Ile Leu Ser Gly Gly Tyr

545                 550                 555                 560

Pro Gly Ser Ala Pro Leu Gln Arg Asn Phe Ser Ile Asn Ser Val Ala

                565                 570                 575

Ser Thr Tyr Ser Glu Phe Ala Arg Glu Leu Ser Lys Ala Ser Lys Ser

            580                 585                 590

Asp Ala Thr Ser Gly Ile Leu Asn Ser Thr Asn Ile Gln Ser

        595                 600                 605

<210>43

<211>3011

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(158)..(1858)

<400>43

gcttcgcccc gtggcgcggt ttgaaatttt gcggggctca acggctcgcg gagcggctac  60

gcggagtgac atcgccggtg tttgcgggtg gttgttgctc tcggggccgt gtggagtagg  120

tctggacctg gactcacggc tgcttggagc gtccgcc atg agg aga agt gag gtg   175

                                         Met Arg Arg Ser Glu Val

                                         1               5

ctg gcg gag gag tcc ata gta tgt ctg cag aaa gcc cta aat cac ctt    223

Leu Ala Glu Glu Ser Ile Val Cys Leu Gln Lys Ala Leu Asn His Leu

            10                  15                  20

cgg gaa ata tgg gag cta att ggg att cca gag gac cag cgg tta caa    271

Arg Glu Ile Trp Glu Leu Ile Gly Ile Pro Glu Asp Gln Arg Leu Gln

        25                  30                  35

aga act gag gtg gta aag aag cat atc aag gaa ctc ctg gat atg atg    319

Arg Thr Glu Val Val Lys Lys His Ile Lys Glu Leu Leu Asp Met Met

    40                  45                  50

att gct gaa gag gaa agc ctg aag gaa aga ctc atc aaa agc ata tcc    367

Ile Ala Glu Glu Glu Ser Leu Lys Glu Arg Leu Ile Lys Ser Ile Ser

55                  60                  65                  70

gtc tgt cag aaa gag ctg aac act ctg tgc agc gag tta cat gtt gag    415

Val Cys Gln Lys Glu Leu Asn Thr Leu Cys Ser Glu Leu His Val Glu

                75                  80                  85

cca ttt cag gaa gaa gga gag acg acc atc ttg caa cta gaa aaa gat    463

Pro Phe Gln Glu Glu Gly Glu Thr Thr Ile Leu Gln Leu Glu Lys Asp

            90                  95                  100

ttg cgc acc caa gtg gaa ttg atg cga aaa cag aaa aag gag aga aaa    511

Leu Arg Thr Gln Val Glu Leu Met Arg Lys Gln Lys Lys Glu Arg Lys

        105                 110                 115

cag gaa ctg aag cta ctt caa gag caa gat caa gaa ctg tgc gaa att    559

Gln Glu Leu Lys Leu Leu Gln Glu Gln Asp Gln Glu Leu Cys Glu Ile

    120                 125                 130

ctt tgt atg ccc cac tat gat att gac agt gcc tca gtg ccc agc tta    607

Leu Cys Met Pro His Tyr Asp Ile Asp Ser Ala Ser Val Pro Ser Leu

135                 140                 145                 150

gaa gag ctg aac cag ttc agg caa cat gtg aca act ttg agg gaa aca    655

Glu Glu Leu Asn Gln Phe Arg Gln His Val Thr Thr Leu Arg Glu Thr

                155                 160                 165

aag gct tct agg cgt gag gag ttt gtc agt ata aag aga cag atc ata    703

Lys Ala Ser Arg Arg Glu Glu Phe Val Ser Ile Lys Arg Gln Ile Ile

            170                 175                 180

ctg tgt atg gaa gaa tta gac cac acc cca gac aca agc ttt gaa aga    751

Leu Cys Met Glu Glu Leu Asp His Thr Pro Asp Thr Ser Phe Glu Arg

        185                 190                 195

gat gtg gtg tgt gaa gac gaa gat gcc ttt tgt ttg tct ttg gag aat    799

Asp Val Val Cys Glu Asp Glu Asp Ala Phe Cys Leu Ser Leu Glu Asn

    200                 205                 210

att gca aca cta caa aag ttg cta cgg cag ctg gaa atg cag aaa tca    847

Ile Ala Thr Leu Gln Lys Leu Leu Arg Gln Leu Glu Met Gln Lys Ser

215                 220                 225                 230

caa aat gaa gca gtg tgt gag ggg ctg cgt act caa atc cga gag ctc    895

Gln Asn Glu Ala Val Cys Glu Gly Leu Arg Thr Gln Ile Arg Glu Leu

                235                 240                 245

tgg gac agg ttg caa ata cct gaa gaa gaa aga gaa gct gtg gcc acc    943

Trp Asp Arg Leu Gln Ile Pro Glu Glu Glu Arg Glu Ala Val Ala Thr

            250                 255                 260

att atg tct ggg tca aag gcc aag gtc cgg aaa gcg ctg caa tta gaa    991

Ile Met Ser Gly Ser Lys Ala Lys Val Arg Lys Ala Leu Gln Leu Glu

        265                 270                 275

gtg gat cgg ttg gaa gaa ctg aaa atg caa aac atg aag aaa gtg att    1039

Val Asp Arg Leu Glu Glu Leu Lys Met Gln Asn Met Lys Lys Val Ile

    280                 285                 290

gag gca att cga gtg gag ctg gtt cag tac tgg gac cag tgc ttt tat    1087

Glu Ala Ile Arg Val Glu Leu Val Gln Tyr Trp Asp Gln Cys Phe Tyr

295                 300                 305                 310

agc cag gag cag aga caa gct ttt gcc cct ttc tgt gct gag gac tac    1135

Ser Gln Glu Gln Arg Gln Ala Phe Ala Pro Phe Cys Ala Glu Asp Tyr

                315                 320                 325

aca gaa agt ctg ctc cag ctc cac gat gct gag att gtg cgg tta aaa    1183

Thr Glu Ser Leu Leu Gln Leu His Asp Ala Glu Ile Val Arg Leu Lys

            330                 335                 340

aac tac tat gaa gtt cac aag gaa ctc ttt gaa ggt gtc cag aag tgg    1231

Asn Tyr Tyr Glu Val His Lys Glu Leu Phe Glu Gly Val Gln Lys Trp

        345                 350                 355

gaa gaa acc tgg agg ctt ttc tta gag ttt gag aga aaa gct tca gat    1279

Glu Glu Thr Trp Arg Leu Phe Leu Glu Phe Glu Arg Lys Ala Ser Asp

    360                 365                 370

cca aat cga ttt aca aac cga gga gga aat ctt cta aaa gaa gaa aaa    1327

Pro Asn Arg Phe Thr Asn Arg Gly Gly Asn Leu Leu Lys Glu Glu Lys

375                 380                 385                 390

caa cga gcc aag ctc cag aaa atg ctg ccc aag ctg gaa gaa gag ttg    1375

Gln Arg Ala Lys Leu Gln Lys Met Leu Pro Lys Leu Glu Glu Glu Leu

                395                 400                 405

aag gca cga att gaa ttg tgg gaa cag gaa cat tca aag gca ttt atg    1423

Lys Ala Arg Ile Glu Leu Trp Glu Gln Glu His Ser Lys Ala Phe Met

            410                 415                 420

gtg aat ggg cag aaa ttc atg gag tat gtg gca gaa caa tgg gag atg    1471

Val Asn Gly Gln Lys Phe Met Glu Tyr Val Ala Glu Gln Trp Glu Met

        425                 430                 435

cat cga ttg gag aaa gag aga gcc aag cag gaa aga caa ctg aag aac    1519

His Arg Leu Glu Lys Glu Arg Ala Lys Gln Glu Arg Gln Leu Lys Asn

    440                 445                 450

aaa aaa cag aca gag aca gag atg ctg tat ggc agc gct cct cga aca    1567

Lys Lys Gln Thr Glu Thr Glu Met Leu Tyr Gly Ser Ala Pro Arg Thr

455                 460                 465                 470

cct agc aag cgg cga gga ctg gct ccc aat aca ccg ggc aaa gca cgt    1615

Pro Ser Lys Arg Arg Gly Leu Ala Pro Asn Thr Pro Gly Lys Ala Arg

                475                 480                 485

aag ctg aac act acc acc atg tcc aat gct acg gcc aat agt agc att    1663

Lys Leu Asn Thr Thr Thr Met Ser Asn Ala Thr Ala Asn Ser Ser Ile

            490                 495                 500

cgg cct atc ttt gga ggg aca gtc tac cac tcc ccc gtg tct cga ctt    1711

Arg Pro Ile Phe Gly Gly Thr Val Tyr His Ser Pro Val Ser Arg Leu

        505                 510                 515

cct cct tct ggc agc aag cca gtc gct gct tcc acc tgt tca ggg aag    1759

Pro Pro Ser Gly Ser Lys Pro Val Ala Ala Ser Thr Cys Ser Gly Lys

    520                 525                 530

aaa aca ccc cgt act ggc agg cat gga gcc aac aag gag aac ctg gag    1807

Lys Thr Pro Arg Thr Gly Arg His Gly Ala Asn Lys Glu Asn Leu Glu

535                 540                 545                 550

ctc aac ggc agc atc ctg agt gcg aga act ttc aaa ggc ttc caa atc    1855

Leu Asn Gly Ser Ile Leu Ser Ala Arg Thr Phe Lys Gly Phe Gln Ile

                555                 560                 565

tga tgctacttct ggaatcctca attcaaccaa catccagtcc tgagaagccc         1908

tgatcagtca accagctgtg gcttcctgtg cctagactgg acctaattat atgggggtga  1968

ctttagtttt tcttcagctt aggcgtgctt gaaaccttgg ccaggttcca tgaccatggg  2028

cctaacttaa agatgtgaat gagtgttaca gttgaaagcc catcataggt ttagtggtcc  2088

taggagactt ggttttgact tatatacatg aaaagtttat ggcaagaagt gcaaatttta  2148

gcatatgggg cctgacttct ctaccacata attctacttg ctgaagcatg atcaaagctt  2208

gttttatttc accactgtag gaaaatgatt gactatgccc atccctgggg gtaattttgg  2268

catgtatacc tgtaactagt aattaacatc ttttttgttt aggcatgttc aattaatgct  2328

gtagctatca tagctttgct cttacctgaa gccttgtccc caccacacag gacagccttc  2388

ctcctgaaga gaatgtcttt gtgtgtccga agttgagatg gcctgcccta ctgccaaaga  2448

ggtgacagga aggctgggag cagctttgtt aaattgtgtt cagttctgtt acacagtgca  2508

ttgccctttg ttgggggtat gcatgtatga acacacatgc ttgtcggaac gctttctcgg  2568

cgtttgtccc ttggctctca tctcccccat tcctgtgcct actttgcctg agttcttcta  2628

cccccgcagt tgccagccac attgggagtc tgtttgttcc aatgggttga gctgtctttg  2688

tcgtggagat ctggaacttt gcacatgtca ctactgggga ggtgttcctg ctctagcttc  2748

cacgatgagg cgccctcttt acctatcctc tcaatcacta ctcttcttga agcactatta  2808

tttattcttc cgctgtctgc ctgcagcagt actactgtca acatagtgta aatggttctc  2868

aaaagcttac cagtgtggac ttggtgttag ccacgctgtt tactcataca gtacgtgtcc  2928

tgtttttaaa atatacaatt attcttaaaa ataaattaaa atctgtatac ttacatttca  2988

aaaagaaaaa aaaaaaaaaa aaa                                          3011

<210>44

<211>566

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>44

Met Arg Arg Ser Glu Val Leu Ala Glu Glu Ser Ile Val Cys Leu Gln

1               5                   10                  15

Lys Ala Leu Asn His Leu Arg Glu Ile Trp Glu Leu Ile Gly Ile Pro

            20                  25                  30

Glu Asp Gln Arg Leu Gln Arg Thr Glu Val Val Lys Lys His Ile Lys

        35                  40                  45

Glu Leu Leu Asp Met Met Ile Ala Glu Glu Glu Ser Leu Lys Glu Arg

    50                  55                  60

Leu Ile Lys Ser Ile Ser Val Cys Gln Lys Glu Leu Asn Thr Leu Cys

65                  70                  75                  80

Ser Glu Leu His Val Glu Pro Phe Gln Glu Glu Gly Glu Thr Thr Ile

                85                  90                  95

Leu Gln Leu Glu Lys Asp Leu Arg Thr Gln Val Glu Leu Met Arg Lys

            100                 105                 110

Gln Lys Lys Glu Arg Lys Gln Glu Leu Lys Leu Leu Gln Glu Gln Asp

        115                 120                 125

Gln Glu Leu Cys Glu Ile Leu Cys Met Pro His Tyr Asp Ile Asp Ser

    130                 135                 140

Ala Ser Val Pro Ser Leu Glu Glu Leu Asn Gln Phe Arg Gln His Val

145                 150                 155                 160

Thr Thr Leu Arg Glu Thr Lys Ala Ser Arg Arg Glu Glu Phe Val Ser

                165                 170                 175

Ile Lys Arg Gln Ile Ile Leu Cys Met Glu Glu Leu Asp His Thr Pro

            180                 185                 190

Asp Thr Ser Phe Glu Arg Asp Val Val Cys Glu Asp Glu Asp Ala Phe

        195                 200                 205

Cys Leu Ser Leu Glu Asn Ile Ala Thr Leu Gln Lys Leu Leu Arg Gln

    210                 215                 220

Leu Glu Met Gln Lys Ser Gln Asn Glu Ala Val Cys Glu Gly Leu Arg

225                 230                 235                 240

Thr Gln Ile Arg Glu Leu Trp Asp Arg Leu Gln Ile Pro Glu Glu Glu

                245                 250                 255

Arg Glu Ala Val Ala Thr Ile Met Ser Gly Ser Lys Ala Lys Val Arg

            260                 265                 270

Lys Ala Leu Gln Leu Glu Val Asp Arg Leu Glu Glu Leu Lys Met Gln

        275                 280                 285

Asn Met Lys Lys Val Ile Glu Ala Ile Arg Val Glu Leu Val Gln Tyr

    290                 295                 300

Trp Asp Gln Cys Phe Tyr Ser Gln Glu Gln Arg Gln Ala Phe Ala Pro

305                 310                 315                 320

Phe Cys Ala Glu Asp Tyr Thr Glu Ser Leu Leu Gln Leu His Asp Ala

                325                 330                 335

Glu Ile Val Arg Leu Lys Asn Tyr Tyr Glu Val His Lys Glu Leu Phe

            340                 345                 350

Glu Gly Val Gln Lys Trp Glu Glu Thr Trp Arg Leu Phe Leu Glu Phe

        355                 360                 365

Glu Arg Lys Ala Ser Asp Pro Asn Arg Phe Thr Asn Arg Gly Gly Asn

    370                 375                 380

Leu Leu Lys Glu Glu Lys Gln Arg Ala Lys Leu Gln Lys Met Leu Pro

385                 390                 395                 400

Lys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Ala Arg Ile Glu Leu Trp Glu Gln Glu

                405                 410                 415

His Ser Lys Ala Phe Met Val Asn Gly Gln Lys Phe Met Glu Tyr Val

            420                 425                 430

Ala Glu Gln Trp Glu Met His Arg Leu Glu Lys Glu Arg Ala Lys Gln

        435                 440                 445

Glu Arg Gln Leu Lys Asn Lys Lys Gln Thr Glu Thr Glu Met Leu Tyr

    450                 455                 460

Gly Ser Ala Pro Arg Thr Pro Ser Lys Arg Arg Gly Leu Ala Pro Asn

465                 470                 475                 480

Thr Pro Gly Lys Ala Arg Lys Leu Asn Thr Thr Thr Met Ser Asn Ala

                485                 490                 495

Thr Ala Asn Ser Ser Ile Arg Pro Ile Phe Gly Gly Thr Val Tyr His

            500                 505                 510

Ser Pro Val Ser Arg Leu Pro Pro Ser Gly Ser Lys Pro Val Ala Ala

        515                 520                 525

Ser Thr Cys Ser Gly Lys Lys Thr Pro Arg Thr Gly Arg His Gly Ala

    530                 535                 540

Asn Lys Glu Asn Leu Glu Leu Asn Gly Ser Ile Leu Ser Ala Arg Thr

545                 550                 555                 560

Phe Lys Gly Phe Gln Ile

                565

<210>45

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列

<400>45

aacttagagg tgggagcag                    19

<210>46

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列

<400>46

cacaaccatg ccttacttta tc                22

<210>47

<211>29

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于PCR的人工合成引物序列

<400>47

ccggaattct ccgccatgag gagaagtga       29

<210>48

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于PCR的人工合成引物序列

<400>48

ttgccgctcg agggactgga tgttggttga a    31

<210>49

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于PCR的人工合成引物序列

<400>49

ccggaattca tggccatgga ctcgtcg         27

<210>50

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于PCR的人工合成引物序列

<400>50

gctccgctcg agctggggcc gtttctt        27

Claims (30)

1. 一种治疗或预防受试者中乳腺癌的方法，包括向所述受试者施用组合物，所述组合物含有抑制A2254(SEQ ID NO：35或37)或A5623(SEQ IDNO：39，41或43)表达的小干扰RNA(siRNA)。

2. 权利要求1的方法，其中所述siRNA包括有义核酸序列和反义核酸序列，所述反义核酸序列与来自A2254或A5623的序列特异杂交。

3. 权利要求2的方法，其中所述siRNA包含如下所述的核糖核苷酸序列作为靶序列：该核糖核苷酸序列对应于选自SEQ ID NO：21、25、29和33的序列。

4. 权利要求3的方法，其中所述siRNA具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]是与从SEQ ID NO：21、25、29和33的核苷酸中选择的序列对应的核糖核苷酸序列；

[B]是由3-23个核苷酸构成的核糖核苷酸环序列，

[A’]是由[A]的互补序列构成的核糖核苷酸序列。

5. 权利要求1的方法，其中所述组合物包括转染增强剂。

6. 一种双链分子，包括有义链和反义链，其中有义链包括与从SEQ IDNO：21、25、29和33中选择的靶序列对应的核糖核苷酸序列，其中反义链包括与所述有义链互补的核糖核苷酸序列，其中所述有义链和所述反义链彼此杂交形成所述双链分子，并且其中所述双链分子在被引入到表达A2254或A5623基因的细胞内时抑制所述基因的表达。

7. 权利要求6的双链分子，其中所述靶序列包括来自从SEQ ID NO：35、37、39、41和43中选择的核苷酸序列的至少大约10个连续核苷酸。

8. 权利要求7的双链分子，其中所述靶序列包括来自从SEQ ID NO：35、37、39、41和43中选择的核苷酸序列的大约19至大约25个连续核苷酸。

9. 权利要求8的双链分子，其中所述双链分子是单一核糖核苷酸转录物，包括通过单链核糖核苷酸序列连接的有义链和反义链。

10. 权利要求7的双链分子，其中该双链分子是长度小于大约100个核苷酸的寡核苷酸。

11. 权利要求10的双链分子，其中该双链分子是长度小于大约75个核苷酸的寡核苷酸。

12. 权利要求11的双链分子，其中该双链分子是长度小于大约50个核苷酸的寡核苷酸。

13. 权利要求12的双链分子，其中该双链分子是长度小于大约25个核苷酸的寡核苷酸。

14. 权利要求13的双链分子，其中该双链分子是长度为大约19-大约25个核苷酸的寡核苷酸。

15. 一种编码权利要求7的双链分子的载体。

16. 权利要求15的载体，其中该载体编码转录物，所述转录物具有二级结构并且包括有义链和反义链。

17. 权利要求16的载体，其中该转录物进一步包括连接所述有义链和所述反义链的单链核糖核苷酸序列。

18. 一种包含多核苷酸的载体，该多核苷酸包括有义链核酸和反义链核酸的组合，其中所述有义链核酸包括SEQ ID NO：21、25、29和33的核苷酸序列，所述反义链核酸由与有义链互补的序列构成。

19. 权利要求18的载体，其中所述多核苷酸具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’

其中[A]是SEQ ID NO：21、25、29和33的核苷酸序列；[B]是由3-23个核苷酸构成的核苷酸序列；[A’]是与[A]互补的核苷酸序列。

20. 一种用于治疗或预防乳腺癌的药物组合物，包括作为活性成分的药物有效量的小干扰RNA(siRNA)和药物可接受的载体，其中该siRNA可抑制A2254或A5623的表达。

21. 权利要求20的药物组合物，其中该siRNA包含从SEQ ID NO：21、25、29和33选择的核苷酸序列作为靶序列。

22. 权利要求21的组合物，其中该siRNA具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’

其中[A]是相应于SEQ ID NO：21、25、29和33的核苷酸序列的核糖核苷酸序列；[B]是由3-23个核苷酸构成的核糖核苷酸序列；[A’]是与[A]互补的核糖核苷酸序列。

23. 一种筛选用于治疗或预防乳腺癌的化合物的方法，所述方法包括如下步骤：

(a)在测试化合物的存在下，使包含A5623多肽的A2254-结合域的多肽与包含A2254多肽的A5623-结合域的多肽接触；

(b)检测多肽间的结合；和

(c)选择抑制多肽间结合的测试化合物。

24. 权利要求23的方法，其中该含有A2254-结合域的多肽包括A5623多肽。

25. 根据权利要求23的方法，其中该含有A5623-结合域的多肽包括A2254多肽。

26. 筛选可用于治疗或预防乳腺癌的化合物的试剂盒，其中该试剂盒包括：

(a)包含A5623多肽A2254-结合域的多肽；

(b)包含A2254多肽A5623-结合域的多肽；和

(c)用于检测多肽间相互作用的试剂。

27. 根据权利要求26的试剂盒，其中该含有A2254-结合域的多肽包括A5623多肽。

28. 根据权利要求26的试剂盒，其中该含有A5623-结合域的多肽包括A2254多肽。

29. 用于治疗或预防受试者中乳腺癌的方法，其中该方法包括施用药物有效量的抑制A5623多肽与A2254多肽结合的化合物的步骤。

30. 用于治疗或预防乳腺癌的组合物，其中该组合物包括药物有效量的抑制A5623多肽与A2254多肽结合的化合物和药物可接受的载体。

Images