CN101855346A - Pkib和naaladl2用作***癌治疗和诊断的靶基因 - Google Patents

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CN101855346A CN200880109851A CN200880109851A CN101855346A CN 101855346 A CN101855346 A CN 101855346A CN 200880109851 A CN200880109851 A CN 200880109851A CN 200880109851 A CN200880109851 A CN 200880109851A CN 101855346 A CN101855346 A CN 101855346A
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Abstract

本发明的特色是用于检测***癌，特别是激素难治性***癌(HRPC)或去势抵抗性***癌(CRPC)的方法，所述方法系通过检测与正常器官相比PKIB或NAALADL2的过表达来检测***癌。还公开了鉴定用于治疗和预防***癌(包括HRPC)的化合物的方法，所述方法系基于PKIB或NAALADL2在***癌中的过表达、PKIB或NAALADL2的细胞增殖功能、PKIB或NAALADL2的细胞内定位或PKIB与PKA-C之间的相互作用来鉴定化合物。另外，提供了通过施用针对PKIB或NAALADL2基因的双链分子来治疗***癌的方法。本发明还提供了产品，包括双链分子和编码它们的载体，以及包含可用于本发明所提供方法的分子或载体的组合物。

Description

PKIB和NAALADL2用作***癌治疗和诊断的靶基因
相关申请的交叉援引
本申请要求获得分别于2007年8月24日和2008年3月12日递交的美国临时专利申请No.60/957,853和No.61/036,030的权益。本文援引并入它们的全部内容用于各种目的。
技术领域
本发明涉及生物科学领域，更具体地，涉及癌症诊断和治疗领域。特别地，本发明涉及用于检测和诊断***癌的方法，以及用于治疗和预防***癌的方法。而且，本发明涉及用于筛选可用于预防***癌的药剂的方法。
背景技术
***癌(PC)是美国和欧洲最常见的男性恶性肿瘤，并且是第二大癌症相关死亡的原因(Gronberg H，Lancet 2003 361：859-64.)。由于西式饮食的流行和老龄人口的爆发性增长，PC的发病率在大多数发达国家显著增加(Gronberg H，Lancet 2003 361：859-64.and Hsing AW et al.，Epidemiol Rev2001 23：3-13.)。使用血清***特异抗原(PSA)进行筛选导致PC的早期检出大大改善，增加了可通过外科手术和放射治疗治愈的局部化疾病的患者的比例(Gronberg H，Lancet 2003 36 1：859-64.and Hsing AW et al.，EpidemiolRev 2001 23：3-13.)。然而，有20-30％的这类PC患者仍然受到疾病复发的困扰(Feldman BJ et al.，Nat Rev Cancer 2001 1：34-45.and Han M et al.，J Urol2001 166：416-9.)。
雄激素/雄激素受体(AR)信号途径在PC发生和发展中发挥核心作用，在相对早期阶段，PC的生长通常是雄激素依赖的(Feldman BJ et al.，Nat RevCancer 20011：34-45.and Han M et al.，J Urol 2001 166：416-9.)。因此，大多数具有复发或晚期疾病的患者对雄激素消减疗法(androgen-ablation therapy)响应良好，该疗法通过手术或医药去势抑制睾丸雄激素的产生。虽然如此，但是这些患者最终会获得不依赖雄激素的和侵袭性更高的表型，称作激素难治性***癌(HRPC)。可选择地，他们最终会获得对雄激素消减疗法(去势)的耐受性，以及侵袭性更高的表型，称作去势抵抗性***癌(CRPC)，这基本上是致死的疾病(Scher HI，Sawyers CL.J Clin Oncol 200623：8253-61.)。最近，多烯紫杉醇(docetaxel)和强的松(prednisone)的组合被确立为HRPC患者的新护理标准(Tannock IF et al.，N Engl J Med 2004351：1502-12.)，但是它们不能实现治愈，对HRPC患者的生存益处非常有限。因此，现在许多研究团队正在尝试各种方法，鉴定对HRPC生长起贡献的新型分子靶标或信号途径(Scher HI et al.，J Clin Oncol 2005 23：8253-61.)。
这种去势抵抗性进程的机制被假定为可分成两个途径，即：涉及AR的途径；和旁路AR或不依赖AR的途径。它们并不相互排斥，而往往在CRPC细胞中共存(Feldman BJ，Feldman D.Nat Rev Cancer 20011：34-45，Scher HI，Sawyers CL.J Clin Oncol 200623：8253-61.)。有报道，许多旁路AR或不依赖AR的途径在CRPC细胞中被激活，有助于获得恶性或侵袭性更高的表型。AR途径与AR非依赖途径--例如Her-2/neu和IL-6/STAT3--之间还会发生对话(Cross-talk)(Feldman BJ，Feldman D.Nat Rev Cancer 20011：34-45，Scher HI，Sawyers CL.J Clin Oncol 200623：8253-61，Grossmann ME，et al.JNCI 200193：1687-97，Yang L，et al.BBRC 2003305：462-469.)。
在独立途径中，PTEN-PI3K-Akt途径可能是可以解释CRPC表型的最关键的途径之一。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，其被磷脂肌醇(3，4，5)-磷酸(PIP3)激活，而激活的或磷酸化的Akt可通过调节GSK3beta、BAD、FOXO和mTOR来促进细胞生长和细胞存活(Sharma M，et al.J Biol Chem 2002277：30935-41，Pap M，Cooper GM.J Biol Chem 1998273：19929-32，Downward J.1998Curr Opin Cell Biol 10：262-67，Datta SR，et al.Cell 199791：231-41，Downward J.Cell Develop Biol 2004 15：177-82，Vivanco I and Sawyers C.NatRev Cancer 20022：289-501，Hay N.Cancer Cell 20058：179-83)。
在正常细胞中，肿瘤阻遏物PTEN--一种可从PIP3除去磷酸的脂质磷酸酶(lipid phosphatase)--可抑制Akt激活，使细胞发生凋亡，而一些肿瘤细胞具有PTEN突变或PTEN表达缺失，导致Akt激活。除了其抗细胞凋亡功能之外，在***癌细胞中，激活的Akt直接与AR结合，并且在没有雄激素的条件下使AR磷酸化，这也有助于CRPC表型(Wen Y，et al.CancerRes 200060：6841-45)。
实际上，在高格里森等级的PC中磷酸化AkT的水平上升，并且与PC进展或CRPC进展相关(Malik SN，et al.Clin Cancer Res 20028：1168-71，Kreisberg JI，et al.Cancer Res 200464：5232-36)。
Akt的激活需要Thr308和Ser473残基的磷酸化。磷酸肌醇依赖的激酶1(PDK1)能够催化Thr308的磷酸化，并且有人提出若干激酶可发挥所谓PDK2的功能，可催化Ser473的磷酸化，但是它们中是否有一些或全部在癌细胞中发挥生理性PDK2的作用仍然有待确认(Grossmann ME，et al.JNCI200193：1687-97，Tasken K，Aandahl EM.Physol Review 200484：137-67.)。
另一方面，cAMP依赖的蛋白激酶A(PKA)经常被认为对于介导由cAMP引发的多种生理或病理效应以及与G蛋白的偶联是至关重要的。多种配体-受体***可激活PKA信号传导途径，并且其激活与细胞生长和分化的控制有关(Tasken K，Aandahl EM.Physol Review 200484：137-67，Stork PJ，Schmitt JM.Trends Cell Biol 200212：258-66)。
在***癌中，有多项报告称，PKA参与了雄激素非依赖性生长和神经内分泌分化(Cox ME，et al.J Biol Chem 2000275：13812-8，Deeble PD，CoxME，et al.Cancer Res 200767：663-72)。还有人提出PKA途径与AR途径的对话参与了PC细胞的雄激素非依赖性或去势抵抗性生长(Stork PJ，SchmittJM.Trends Cell Biol 200212：258-66，Sadar MD.J Biol Chem 1999274：7777-83)。
该PKA途径受到多种因子的调节，例如PKA调节亚基(PKA-R)或PKA抑制物(Taylor SS，Kim C，Vigil D，et al.BBA 20051754：25-37，Dalton GD，Dewey WL.Neuropeptides 200640：23-34)，在癌细胞中，这些调节因子被异常表达从而改变PKA途径，并且其中一些是癌症治疗的靶标(Miller WR.Ann NY Acad Sci 2002968：37-48，2002)。
先前，为了表征临床HRPC或CRPC的分子特征和鉴定用于HRPC或CRPC治疗的分子靶标，对通过LMM(激光微束显微解剖)方法从HRPC或CRPC组织纯化的癌细胞进行了全基因组范围的cDNA微阵列分析，并且在HRPC或CRPC细胞中鉴定了若干不受调节的基因，其中一些可能涉及雄激素非依赖性和侵袭性表型(Tamura K et al.，Cancer Res 2007 67：5117-25.)。
发明概要
根据HRPC或CRPC细胞的全基因组范围表达谱，有两个分子靶标：PKIB(GenBank登录号：NM 181795)和NAALADL2(GenBank登录号：NM 207015andAK021754)，被鉴定为可用于PC治疗和诊断。此外，该蛋白可用作分子靶标，用于开发新的HRPC治疗方法。
PKIB是PKA途径中的调节因子之一，是CRPC中的一种过表达基因。本发明人证明，它藉由PKA途径与Akt途径之间的功能联系对PC细胞的生存力及其恶性表型起贡献。
PKIB属于PKI(蛋白激酶A抑制物)家族。PKIA被认为通过直接与PKA-C结合来抑制蛋白激酶A催化亚基(PKA-C)(GenBank登录号：NM 002730)的激酶活性，并将PKA-C从细胞核外排到细胞质(Glass DB etal.，J Biol Chem 1986261：12166-71.and Wen W et al.，J Biol Chem 1994269：32214-20.)。蛋白激酶A(PKA)，cAMP依赖的蛋白激酶A，经常被认为对于介导由cAMP引发的多种生理或病理效应以及与G蛋白的偶联是至关重要的，多种配体和受体***可激活PKA信号途径，并且PKA激活与细胞生长和分化的控制有关(Tasken K，Aandahl EM.Physol Review 200484：137-67，Stork PJ，Schmitt JM.Trends Cell Biol 200212：258-66)。在***癌中，有多项报告提示，它参与了雄激素非依赖性生长和神经内分泌分化(Cox ME，et al.J Biol Chem 2000275：13812-8，Deeble PD，Cox ME，et al.Cancer Res 200767：663-72)，PKA途径与AR途径的对话也被提示参与了PC细胞的雄激素非依赖性或去势抵抗性生长(Stork PJ，Schmitt JM.Trends Cell Biol 200212：258-66，Sadar MD.J Biol Chem 1999274：7777-83)。
NAALADL2是一种新的II型膜蛋白，属于谷氨酸羧肽酶II(GCPII)家族。GCPII的***形式称作***特异膜抗原(PSMA)，在***癌中表达，并且PSMA水平增加与PC进展和HRPC有关(Rajasekaran AK et al.，AmJ Physiol Cell Physiol 2005 288：C975-81.and Murphy GP et al.，Prostate 200042：145-9.)。考虑到它与PSMA的同源性和相似的表达模式，NAALADL2应当被称作“PSMA2”。PSMA是FDA批准的***癌显像剂--111In标记7E11单克隆抗体(Prostascint，Cytogen，Princeton，NJ)的靶标。PSMA是单克隆抗体如J591的靶标，J591正在临床试验中用于将显像剂或治疗剂特异性投递到PSMA表达细胞(Murphy GP et al.，Prostate 200042：145-9.andHolmes EH，Expert Opin Investig Drugs 200110：511-9.)。除了其作为肿瘤标志的特征之外，PSMA具有GPC活性，其底物包括多聚-γ-谷氨酸化叶酸盐(poly-γ-glutamated folates)(Zhou J et al.，Nature Review Drug Disc 20054：1015-26.)。PSMA的酶活性可被利用来设计前体药物，其中仅在表达PSMA的细胞中药物的无活性谷氨酸化形式被选择性切裂并从而被激活(DennyWA et al.，Eur J Med Chem 200136：577-95.)。然而，人们对于PSMA如何与***癌进程相关联一无所知，靶定PSMA功能或其活性自身的可能性仍然不知晓。
本发明突出提供一种通过确定来源于受试者的生物样品中PIKB和NAALADL的表达水平来诊断或确定受试者的***癌或***癌倾向的方法。任何上述基因的表达水平与该基因的正常对照水平相比的增加表明受试者罹患***癌或者具有***癌发病的危险。
本发明至少部分地基于如下的发现，即包含特定序列(尤其是SEQ IDNO：16、17和19)的双链分子可有效抑制***癌细胞的细胞生长。具体地，本发明提供了以PIKB和NAALADL2基因为靶标的小干扰RNA(siRNA)。
根据本发明的一个方面，双链分子可以被编码在载体中，并从所述载体表达。
因此，本发明提供了通过施用本发明的双链分子或载体来抑制细胞生长和治疗***癌的方法。这种方法包括向受试者施用包含一种或多种所述双链分子或载体的组合物。
本发明的另一个方面涉及用于治疗癌症的组合物，其含有至少一种本发明的双链分子或载体。或者，本发明进一步提供了一种筛选用于治疗或预防***癌的化合物的方法，其包括如下步骤：使测试化合物与表达PIKB或NAALADL2蛋白的细胞接触，然后选择可降低PIKB或NAALADL2蛋白的表达水平的测试化合物。进一步，本发明提供了一种筛选用于治疗或预防***癌的化合物的方法，其中检测PIKB和蛋白激酶A催化亚基(PKA-C)之间的结合。我们预期，可抑制PIKB与PKA-C之间结合的化合物可以减轻***癌的症状。而且，本发明提供了筛选用于检测癌症的抗体的方法，其中检测细胞表面中的NAALANDL2。将识别NAALANDL2的抗体用于检测***癌。
附图简述
图1A半定量RT-PCR确认，与同样经显微解剖的正常***上皮细胞(NPmix)、完整的正常***组织和生命器官(心、肺、肝和肾)相比，PKIB在HRPC细胞(5/5)中过表达，但在HSPC细胞中则不然。cDNA含量的定量都使用ACTB。B针对PKIB表达的多组织Northern(MTN)印迹分析显示，在成人器官中，胎盘显示大约1.5kb条带，而在生命器官(心、肺、肝和肾)则没有。PKIB表达的Northern印迹分析显示，数个PC细胞系(22Rv1和PC-3)强烈表达PKIB，而其它正常成人器官没有表达PKIB。C-F显示了PC组织的免疫组化分析。C***上皮内瘤(PIN)显示微弱的PKIB染色(+)。DGleason 3级的PC显示微弱的染色(+)，而正常***上皮(N)显示阴性染色。E Gleason 5级的PC显示强烈的PKIB阳性染色(+++)。F HRPC也显示强烈的PKIB阳性染色(+++)。
图2A半定量RT-PCR确认，与同样显微解剖的正常***上皮细胞(NPmix)、完整的正常***组织和生命器官(心、肺、肝和肾)相比，NAALADL2在HRPC细胞(7/11)中过表达。cDNA含量的定量都使用ACTB。B NAALADL2表达的MTN印迹分析显示，在成人器官中，仅在PC细胞系中存在大约10kb、6kb和5kb的三个条带，而在生命器官(心、肺、肝和肾)则没有。
图3PKIB-siRNA对PC细胞生长的影响。A RT-PCR确认在22Rv1细胞(左)和LNCaP(HP)细胞(右)中，si1和si2对PKIB表达具有敲低作用(knockdown effect)，但si3和阴性对照siEGFP都没有。B用表达针对PKIB的指定siRNA(si1、si2和si3)的载体和阴性对照载体(siEGFP)转染的22Rv1细胞(左)和LNCaP(HP)细胞(右)的各自的MTT测定。与遗传霉素(Geneticin)温育20天后，对每次的平均值作图，误差线指示SD(标准偏差)。Y轴上的ABS表示490nm吸光度，以630nm为参比，用微滴定板读数器测量。这些实验重复三次。用si1和si2转染22Rv1(左)和LNCaP(HP)细胞(右)导致存活细胞数目大大减少，而与此相比的是用si3和siEGFP转染没有观察到敲低作用(P＜0.01，Student t检验)。C用针对PKIB的指定siRNA表达载体(si1，si2和si3)和阴性对照载体(siEGFP)转染的22Rv1细胞(左)和LNCaP(HP)细胞(右)的集落形成测定。用遗传霉素温育20天后，用1％结晶紫染色(crystalviolet staining)使细胞可视化。
图4NAALADL2-siRNA对PC细胞生长的影响。A RT-PCR确认，在22Rv1细胞中，si#690对NAALADL2表达有敲低作用，但si#913，si#1328和阴性对照siEGFP没有。利用ACTB定量RNA。B用针对NAALADL2的指定siRNA表达载体(si#690，si#913和si#1328)和阴性对照载体(siEGFP)转染的22Rv1细胞的MTT测定。与遗传霉素温育20天后，对每次的平均值作图，误差线指示SD(标准偏差)。Y轴上的ABS表示490nm吸光度，以630nm为参考，用微滴定板读数器测量。这些实验重复三次。用si#690转染22Rv1细胞导致存活细胞数目大大减少，而相比之下其它siRNA处理没有观察到敲低作用(P＜0.01，Student t检验)。C用针对NAALADL2的指定siRNA表达载体(si#690，si#913和si#1328)和阴性对照载体(siEGFP)转染的22Rv1细胞的集落形成测定。与遗传霉素温育20天后，用1％结晶紫染色(crystal violet staining)细胞使之可视化。D RT-PCR确认在另一种NAALADL2表达型的C4-2B细胞中，对应于si#690的合成RNA双链体(duplex)对NAALADL2表达有敲低作用，但si#913，si#1328和阴性对照siEGFP则没有。利用ACTB定量RNA。E与对照RNA双链体siEGFP相比，对应于si#690的合成RNA双链体抑制了C4-2B细胞的细胞生存力(P＜0.01，Student t检验)。
图5PKIB蛋白(A)和NAALADL2蛋白(B)的亚细胞定位。使用抗标签抗体进行免疫细胞组化分析显示，外源PKIB定位于细胞质，外源NAALADL2蛋白主要定位于细胞质膜。C PKIB-Myc和HA-PKA-C表达载体共转染22Rv1细胞，用每种标签抗体免疫沉淀它们的细胞裂解物。PKIB-Myc与PKA-C免疫共沉淀，反之亦然，表明PKIB与PKA-C间的直接相互作用。D免疫细胞组化分析观察到，当对照siRNA转染PC-3细胞时，大多数PKA-C定位于细胞质，一些PKA-C信号位于细胞核(左)。另一方面，当siRNA敲低PC-3细胞中的内源PKIB时，免疫细胞组化分析显示在细胞核中没有或者有非常少的PKA-C信号(右)。E在PC细胞中用siRNA双链体处理后，将细胞分级为细胞核和细胞质级分，以便更加定量地分析细胞核PKA-C。使用30微克经分级的细胞裂解物，用抗PKA-C抗体和作为上样和细胞核级分对照的抗核纤层蛋白B抗体进行western印迹。与对照siRNA相比，由siRNA导致的PKIB敲低可明显降低细胞核中的PKA-C量，而细胞质中的PKA-C量在PKIB敲低中仅略微增加。
图6A RT-PCR确认了PKIB在DU145来源(deribed)的克隆(PKIB#1、#2、#3)中的组成性表达。B Western印迹确认了PKIB在DU145来源(deribed)的克隆(PKIB#1、#2、#3)中的组成性表达。C表达高水平的外源PKIB的DU145克隆(克隆1-3)和用模拟(Mock)载体转染的克隆(#1、#2、#3混合物)的体内生长速度。X和Y轴分别表示接种后的日数点和用直径吸光度(absorbance of the diameter)计算的、与作为对照的第1天的吸光度值比较的相对生长速度。PKIB过表达细胞比模拟细胞生长更快速，提示PKIB在***癌中的促生长作用。D将2×106个稳定表达PKIB的DU145来源的克隆(右)或者模拟细胞(左)接种在雄性裸鼠的胁部(frank)。接种15周后，仅在右胁部建立了肿瘤(PKIB++；箭头)，而在左胁部(模拟)没有。E基质胶侵袭测定(Matrigel invasion assay)显示了NIH3T3细胞在被PKIB表达载体转染后的侵袭性质。Y轴表示迁移通过基质胶包被膜的细胞数目。试验重复三次，对每次的平均值作图，误差线表示SD(标准偏差)。PKIB的过表达显著促进了NIH3T3细胞的侵袭性(P＝0.0052)。
图7A在LNCaP和PC-3细胞中用siRNA双链体(siPKIB)敲低PKIB导致Akt的Ser 473磷酸化减弱。用siEGFP双链体转染作为阴性对照。用RT-PCR确认PKIB的敲低，使用ACTB作为上样对照。B PKIB在PC-3和22Rv1细胞中的过表达提高了Akt的Ser 473磷酸化。PKIB过表达通过使用HA标签抗体进行western印迹加以确认。C PKA-C在PC-3细胞中的过表达也提高了Akt的Ser 473磷酸化。PKA-C的过表达通过使用HA标签抗体进行western印迹加以确认，以Akt总量作为上样对照。D使用重组PKIB和PKA-C蛋白进行Akt的体外激酶测定。Akt-Ser473的磷酸化通过抗磷酸-Akt(Ser473)抗体(Cell Signaling)进行检测，Akt总量作为上样对照。用抗Akt抗体检测Akt总量。在PKA-C的基础上添加PKIB在体外显著增加了Akt-Ser473的磷酸化。
图8在临床PC组织中，PKIB表达与Akt磷酸化关联。图片代表了在PC组织的面对面切片(face-to-face slides)上进行的A PKIB和B磷酸化Akt的免疫组织化学。
发明的公开
定义
除非具体指出，否则词语“一”、“一个(一种)”和“该”在本文中的意思是“至少一个”。
如本文使用的，术语“生物样品”是指整个生物体或由其组织、细胞或组成部分(例如体液，包括但不仅限于，血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊液、唾液、羊水、羊膜脐带血、***分泌物和***)构成的子集。“生物样品”还指从整个生物体，或从由其细胞、组织或组成部分、或级分或部分构成的子集，所制备的匀浆、裂解物、提取物、细胞培养物或组织培养物。最后，“生物样品”指这样的介质，例如其中已有生物体繁殖的营养液或凝胶：其含有细胞成分，例如蛋白质或多核苷酸。
术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”在本文中若无具体指出可交换使用，并且用它们公认的单字母编码指示。这两个术语适用于这样的核酸(核苷酸)聚合物，其中有一个或多个核酸通过酯键连接。多核苷酸或寡核苷酸可以由DNA、RNA或其组合构成。
双链分子
术语“分离的双链分子”是指可抑制靶基因的表达的核酸分子，包括例如短干扰RNA(siRNA；例如双链核糖核酸(dsRNA)或小发夹RNA(shRNA))和短干扰DNA/RNA(siD/R-NA；例如DNA和RNA的双链嵌合体(dsD/R-NA)或DNA和RNA的小发夹嵌合体(shD/R-NA))。
如本文所使用的，术语“siRNA”是指可阻止靶mRNA翻译的双链RNA分子。使用将siRNA引入到细胞中的常规技术，包括以DNA为RNA转录模板的技术。siRNA包括PKIB或NAALADL2有义核酸序列(也称作“有义链”)、PKIB或NAALADL2反义核酸序列(也称作“反义链”)、或两者。siRNA可以被构建成使单个转录本同时具有靶基因的有义核酸序列和互补的反义核酸序列，例如发夹。siRNA可以是dsRNA或shRNA。
如本文所使用的，术语“dsRNA”是指两个RNA分子的构建体，两个RNA分子包含彼此互补的序列，并通过互补序列退火在一起形成双链RNA分子。两条链的核苷酸序列可能不仅包括从靶基因序列蛋白编码序列选出的“有义”或“反义”RNA，还包括具有从靶基因非编码区选出的核苷酸序列的RNA分子。
如本文所使用的，术语“shRNA”是指具有茎环结构的siRNA，包括彼此互补的第一和第二区，即有义和反义链。所述区域的互补程度和方向足以使得两个区域间形成碱基配对，其中第一和第二区通过环区连接，该环是由于环区内核苷酸(或核苷酸模拟物)之间缺乏碱基配对产生的。shRNA的环区是介于有义和反义链之间的单链区，也可以称作“间插单链”。
如本文所使用的，术语“siD/R-NA”是指同时包含RNA和DNA的双链多核苷酸分子，包括RNA和DNA的杂交体和嵌合体，其可阻止靶mRNA的翻译。这里，杂交体指示这样的分子，其中一个由DNA构成的多核苷酸与一个由RNA构成的多核苷酸彼此杂交形成双链分子；而嵌合体是指构成双链分子的一条链含有或两条链都含有RNA和DNA。使用将siD/R-NA引入细胞内的常规技术。siD/R-NA包括PKIB或NAALADL2有义核酸序列(也称作“有义链”)、PKIB或NAALADL2反义核酸序列(也称作“反义链”)或两者。siD R-NA可以被构建成使单个转录本同时具有靶基因的有义和互补核酸序列，例如发夹。siD/R-NA可以是dsD/R-NA或shD/R-NA。
如本文所使用的，术语“dsD/R-NA”是指由两个包含彼此互补的序列的分子所成的构建体，两个分子通过互补序列退火在一起从而形成双链多核苷酸分子。两条链的核苷酸序列不仅包括从靶基因序列蛋白编码序列选出的“有义”或“反义”多核苷酸，还包括具有从靶基因非编码区选出的核苷酸序列的多核苷酸。构成dsD/R-NA的两个分子中的一个或两个都由RNA和DNA二者构成(嵌合分子)，或者，其中一个分子由RNA构成，另一个由DNA构成(杂交双链)。
如本文所使用的，术语“dsD/R-NA”是指具有茎环结构的siD/R-NA，包括彼此互补的第一和第二区，即有义和反义链。所述区域的互补程度和方向足以使得两个区域间形成碱基配对，第一和第二区通过环区连接，环是由于环区内核苷酸(或核苷酸模拟物)之间缺乏碱基配对而形成的。siD/R-NA的环区是介于有义和反义链之间的单链区，可以称作“间插单链”。
如本文所使用的，“分离核酸”是指从其原始环境(例如其自然存在的天然环境)被取出，因此从其自然状态发生了人工改变(synthetically altered)的核酸。在本发明中，分离核酸包括DNA、RNA和其衍生物。
针对PKIB或NAALADL2的双链分子，是与靶mRNA杂交的分子，可通过与基因的在正常情况下为单链的mRNA转录本结合(associate)，干扰蛋白翻译进而抑制蛋白的表达，从而降低或抑制由PKIB或NAALADL2基因编码的PKIB或NAALADL2蛋白的产生。PKIB在***癌细胞系中的表达被1或2不同的dsRNA抑制(图3)；NAALADL2在***癌细胞系中的表达被dsRNA抑制(图4)。
因此，本发明提供了具有下述性质的分离的双链分子：它们在被引入到表达PKIB或NAALADL2基因的细胞内时可抑制该基因的表达。双链分子的靶序列通过下文提到的siRNA设计算法加以设计。
PKIB靶序列包括，例如，核苷酸：
SEQ ID NO：16，
SEQ ID NO：17
NAALADL2靶序列包括，例如，核苷酸：
SEQ ID NO：19
具体地，本发明提供了如下的双链分子[1]-[16]：
[1]一种分离的双链分子，其在被引入到细胞内时，可抑制PKIB或NAALADL2基因的表达和细胞生长，该分子包括有义链和与之互补的反义链，它们彼此杂交形成该双链分子，并且其中有义链包括从SEQ ID NO：16、17和19的组中选出的靶序列；
[2][1]所述的双链分子，其长度小于大约100个核苷酸；
[3][2]所述的双链分子，其长度小于大约75个核苷酸；
[4][3]所述的双链分子，其长度小于大约50个核苷酸；
[5][4]所述的双链分子，其长度小于大约25个核苷酸；
[6][5]所述的双链分子，其长度为大约19-大约25个核苷酸；
[7][1]所述的双链分子，其由单个多核苷酸构成，所述多核苷酸包含通过间插单链连接起来的有义链和反义链；
[8][7]所述的双链分子，其具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]是包含选自SEQ ID NO：16、17和19的序列的有义链，[B]是由3-23个核苷酸组成的间插单链，[A’]是包含与[A]互补的序列的反义链；
[9][1]所述的双链分子，其包含RNA；
[10][1]所述的双链分子，其包含DNA和RNA；
[11][10]所述的双链分子，其是DNA多核苷酸与RNA多核苷酸的杂交体；
[12][11]所述的双链分子，其中有义链和反义链分别由DNA和RNA构成；
[13][10]所述的双链分子，其是DNA和RNA的嵌合体；
[14][13]所述的双链分子，其中反义链3’端侧翼的区域由RNA构成，或者有义链5’端侧翼的区域和反义链3’端侧翼的区域均由RNA构成；
[15][14]所述的双链分子，其中侧翼区域由9-13个核苷酸组成；和
[16][1]所述的双链分子，其包含3’突出端。
下面将更详细地介绍本发明的双链分子。
具有抑制细胞内靶基因表达的能力的双链分子的设计方法是已知的。(见例如，美国专利No.6,506,559，本文援引并入其全部内容)。例如，可以从Ambion网站访问一种用于设计siRNA的计算机程序(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA finder.html)。
该计算机程序根据如下方案选择双链分子的靶核苷酸序列。
靶位点的选择
1.从转录本的AUG起始密码子开始，向下游搜寻AA二核苷酸序列。记录每个AA的出现以及3’毗邻的19个核苷酸，作为潜在的siRNA靶位点。Tuschl等推荐避免在5’和3’非翻译区(UTR)以及临近起始密码子的区域(75个碱基内)设计siRNA，因为这些区域可能更富含调节蛋白结合位点，并且UTR结合蛋白和/或翻译起始复合体可能干扰siRNA内切酶复合体的结合。
2.比较潜在靶位点与合适的基因组数据库(人、小鼠、大鼠等)，将任何与其它编码序列具有显著同源性的靶序列排除在考虑之外。基本上使用BLAST，其可通过NCBI服务器访问：www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/(Altschul SF et al.，Nucleic Acids Res 1997Sep 1，25(17)：3389-402)
3.选择合格的靶序列用于合成。典型地，沿着基因的长度选择数个靶序列进行评估。
通过这个方案，本发明分离双链分子的靶序列设计如下：
SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17用于PKIB基因；核苷酸
SEQ ID NO：19用于NAALADL2基因；核苷酸
对于靶定上述靶序列的双链分子，分别检查它们抑制表达所述靶基因的细胞的生长的能力。因此，本发明提供了以选自下组的任何序列为靶标的双链分子：
SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17用于PKIB基因；核苷酸
SEQ ID NO：19用于NAALADL2基因；核苷酸
本发明的双链分子针对单个靶标PKIB或NAALADL2基因序列，或者可以针对多个PKIB或NAALADL2基因序列。
所谓PKIB或NAALADL2靶序列，意思是与PKIB基因或NAALADL2基因的一部分(即PKIB或NAALADL2基因内的多核苷酸，其与siRNA长度相等并且与之互补)相同的核苷酸序列。靶序列可包括人PKIB或NAALADL2基因的5’非翻译(UT)区、开放阅读框(ORF)或3’非翻译(UT)区。或者，siRNA是与PKIB或NAALADL2基因表达的上游或下游调节子(modulator)互补的核酸序列。上游和下游调节子的实例包括：与PKIB或NAALADL2基因启动子结合的转录因子，与PKIB或NAALADL2多肽相互作用的激酶或磷酸酶，PKIB或NAALADL2启动子或增强子。
以上述的PKIB或NAALADL2基因靶序列为靶标的本发明双链分子包括这样的分离的核苷酸，它们包括靶序列的任何核酸序列和/或与靶序列互补的序列。靶定PKIB基因的多核苷酸的实例包括：含有SEQ ID NO：16或17的序列和/或这些核苷酸的互补序列的多核苷酸；靶定NAALADL2基因的多核苷酸包括：含有SEQ ID NO：19的序列和/或这些核苷酸的互补序列的多核苷酸。然而，本发明并不仅限于这些实例，前述核酸序列的微小修饰也是可以接受的，只要经过修饰的分子仍保持抑制PKIB或NAALADL2基因表达的能力即可。这里，核酸序列中的“微小修饰”是指对序列进行1、2或数个核酸的替换、删除、添加或***。典型地，微小修饰是对序列进行4个或者更少，有时是3个或者更少，经常是2个或者更少核酸的替换、删除、添加或***。
根据本发明，可以用实施例中采用的方法对本发明双链分子的能力进行测试。在实施例中，对于包含PKIB或NAALADL2基因不同部分的有义链和与之互补的反义链的双链分子，根据常规方法体外测试了它们降低***癌细胞系(例如使用22Rv1、LNCaP(HP)和C4-2B)中PKIB或NAALADL2基因产物的产生的能力。而且，例如，与不存在候选分子时培养的细胞相比，与候选双链分子接触的细胞中PKIB或NAALADL2基因产物的减少，可以通过例如RT-PCR方法，使用实施例1，题目“半定量RT-PCR”中提到的PKIB或NAALADL2mRNA引物进行检测。然后，对于可在体外细胞测定中降低PKIB或NAALADL2基因产物的产生的序列，测试它们对细胞生长的抑制作用。然后，对于在体外细胞测定中抑制细胞生长的序列，用患有癌症的动物，例如裸鼠异种移植模型，测试它们在体内的能力，以确认PKIB或NAALADL2产物生成的减少和癌细胞生长的降低。
当分离的多核苷酸是RNA或其衍生物时，核苷酸序列中的碱基“t”应当用“u”代替。如本文所使用的，术语“互补”是指多核苷酸的核苷酸单位之间的Watson-Crick或Hoogsteen碱基配对，术语“结合”的意思是两个多核苷酸之间的物理或化学相互作用。当多核苷酸包含经过修饰的核苷酸和/或非磷酸二酯联结时，这些多核苷酸也可以用相同的方式彼此结合。一般地，互补多核苷酸序列在合适的条件下杂交，形成稳定的、含有极少错配或没有错配的双链体。而且，本发明的分离多核苷酸的有义链和反义链可以通过杂交形成双链分子或者发夹环结构。在优选实施方案中，这种双链体每10个配对含有不超过1个错配。在特别优选的实施方案中，双链体的链完全互补，这种双链体不含有错配。
多核苷酸的长度，对于PKIB小于1909个核苷酸，对于NAALADL2小于4912个核苷酸。例如，对于所有这些基因，多核苷酸的长度小于500、200、100、75、50或25个核苷酸。本发明的分离多核苷酸可用于形成针对PKIB或NAALADL2基因的双链分子，或用于制备编码这样的双链分子的模板DNA。当使用所述多核苷酸形成双链分子时，多核苷酸的长度可以超过19个核苷酸，优选地超过21个核苷酸，更优选地，长度为大约19-大约25个核苷酸。
本发明的双链分子可以含有一个或多个经过修饰的核苷酸和/或非磷酸二酯联结。本领域中众所周知的化学修饰能够提高双链分子的稳定性、利用度和/或细胞摄取。技术人员知道可用于本发明分子的其它类型的化学修饰(WO03/070744；WO2005/045037)。在一个实施方案中，可利用修饰来提高对降解的抵抗性或者改善摄取。这些修饰的实例包括硫代磷酸酯联结(phosphorothioate linkage)，2’-O-甲基核糖核苷酸(特别是在双链分子的有义链上)，2’-脱氧-氟代核糖核苷酸，2’-脱氧-核糖核苷酸，“通用碱基”核苷酸(“universal base”nucleotide)，5’-C-甲基核苷酸，和倒置脱氧碱基残基掺入(inverted deoxyabasic residue incorporation)(US20060122137)。在另一个实施方案中，修饰可用于提高双链分子的稳定性或提高靶定效率。修饰包括双链分子两条互补链之间的化学交联，双链分子一条链的3’或5’末端化学修饰，糖基化修饰，核苷碱基修饰和/或骨架修饰，2-氟修饰的核糖核苷酸和2’-脱氧核糖核苷酸(WO2004/029212)。在另一个实施方案中，修饰可用于增加或降低互补核苷酸在靶mRNA和/或在互补双链分子链内的亲和性(WO2005/044976)。例如，非修饰的嘧啶核苷酸可以被2-硫，5-炔基，5-甲基，或5-丙炔基嘧啶代替。此外，非修饰的嘌呤可以被7-脱氮，7-烷基，或7-烯基嘌呤代替。在另一个实施方案中，当双链分子是具有3’突出端的双链分子时，可以把3’末端核苷酸的悬置核苷酸替换为脱氧核糖核苷酸(ElbashirSM et al.，Genes Dev 2001Jan 15，15(2)：188-200)。更详细的内容可以参见已公开的文献，例如US20060234970。本发明并不仅限于这些实施例，任何已知的化学修饰均可用于本发明的双链分子，只要所得的分子仍保持抑制靶基因表达的能力即可。
而且，本发明的双链分子可以同时包括DNA和RNA，例如dsD/R-NA或shD/R-NA。具体地，DNA链和RNA链的杂交多核苷酸或DNA-RNA嵌合多核苷酸显示更高的稳定性。可形成DNA和RNA的混合，即由一条DNA链(多核苷酸)和一条RNA链(多核苷酸)的杂交型双链分子，在一条或两条单链(多核苷酸)上同时包含DNA和RNA的嵌合型双链分子，或诸如此类，以提高双链分子的稳定性。DNA链和RNA链的杂交体可以是有义链为DNA，反义链为RNA，或者相反，只要其在引入到表达靶基因的细胞内时具有抑制靶基因表达的能力即可。优选地，有义链多核苷酸是DNA，反义链多核苷酸是RNA。另外，嵌合型双链分子可以是两条有义和反义链都由DNA和RNA构成，或者是有义链和反义链中的任何一个由DNA和RNA构成，只要其在引入表达该基因的细胞内时具有抑制靶基因表达的活性即可。为了提高双链分子的稳定性，分子优选地含有尽可能多的DNA，而为了诱导靶基因表达的降低，分子需要有一定范围的RNA，以诱导充分的表达抑制。作为嵌合型双链分子的优选实例，双链分子的上游部分区域(即有义或反义链内位于靶序列或其互补序列之侧翼的区域)是RNA。优选地，上游部分区域是指有义链的5’侧(5’端)和反义链的3’侧(3’端)。或者，将位于有义链5’端侧翼和/或反义链3’端侧翼的区域称作上游部分区域。也就是说，在优选实施方案中，位于反义链3’端侧翼的区域包含RNA，或者位于有义链5’端侧翼的区域和反义链3’端侧翼的区域均包含RNA。例如，本发明的嵌合或杂交型双链分子包括如下组合：
有义链：    5’-[DNA]-3’
            3’-(RNA)-[DNA]-5’：反义链
有义链：    5’-(RNA)-[DNA]-3’
            3’-(RNA)-[DNA]-5’：反义链，和
有义链：    5’-(RNA)-[DNA]-3’
            3’-(RNA)-5’：反义链。
上游部分区域优选地是由双链分子有义或反义链内从靶序列或其互补序列的末端数起的9-13个核苷酸组成的区域。而且，这种嵌合型双链分子的优选实例包括链长为19-21个核苷酸，其中多核苷酸的至少上游一半(对于有义链而言为5’侧区域，对于反义链而言是3’侧区域)是RNA，另一个半区是DNA。在这种嵌合型双链分子中，抑制靶基因表达的效果比整个反义链都是RNA时的效果高得多(US20050004064)。
在本发明中，双链分子可以形成发夹，例如短发夹RNA(shRNA)和由DNA和RNA组成的短发夹(shD/R-NA)。shRNA或shD/R-NA是一段RNA序列或RNA和DNA的混合序列，其形成紧密的发夹转角(turn)，可用于通过RNA干扰来沉默基因表达。shRNA或shD/R-NA包含位于一条链上的有义靶序列和反义靶序列，其中所述序列被一个环序列分开。一般地，发夹结构被细胞机制切割成dsRNA或dsD/R-NA，它进而结合RNA诱导的沉默复合体(RISC)。该复合体结合并切割与所述dsRNA或dsD/R-NA的靶序列匹配的mRNA。
有义和反义序列之间可以有由任意核苷酸序列构成的环序列，以形成发夹环结构。因此，本发明还提供了一种双链分子，其具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]是包含靶序列的有义链，[B]是间插单链，[A’]是包含与[A]互补的序列的反义链。靶序列可从例如如下核苷酸的组中选出：
SEQ ID NO：16，或
SEQ ID NO：17用于PKIB；核苷酸
SEQ ID NO：19用于NAALADL2；核苷酸
本发明不仅限于这些实例，[A]中的靶序列可以是这些实例的修饰序列，只要该双链分子保留抑制靶定PKIB或NAALADL2基因的表达的能力即可。区域[A]与[A’]杂交，形成由区域[B]构成的环。间插单链部分[B]，即环序列，的长度优选地为3-23个核苷酸。环序列可以从例如包含如下序列的组中选出(http://www.ambion.com/techlib/tb/tb 506.html)。进一步，由23个核苷酸构成的环序列也可提供活性siRNA(Jacque JM et al.，Nature 2002Jul25，418(6896)：435-8，电子形式公布于2002年6月26日)：
CCC、CCACC、或CCACACC：Jacque JM et al.，Nature 2002 Jul 25，418(6896)：435-8，电子形式公布于2002年6月26日；
UUCG：Lee NS et al.，Nat Biotechnol 2002May，20(5)：500-5；FruscoloniP et al.，Proc Natl Acad Sci USA 2003Feb 18，100(4)：1639-44，电子形式公布于2003年2月10日；和
UUCAAGAGA：Dykxhoorn DM et al.，Nat Rev Mol Cell Biol 2003Jun，4(6)：457-67。
作为举例，下面显示了优选的本发明具有发夹环结构的双链分子。在下面的结构中，环序列可以选自AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC和UUCAAGAGA；然而，本发明并不仅限于此：
gauaugccaucccagauuu-[B]-aaaucugggauggcauauc(用于靶序列SEQ ID NO：16)；
gucaaauuccccaaauuaa-[B]-uuaauuuggggaauuugac(用于靶序列SEQ ID NO：17)；和
guguccagaggccaauauu-[B]-aauauuggccucuggacac(用于靶序列SEQ ID NO：19)；
进一步，为了提高双链分子的抑制活性，可以向靶序列反义链的3’端添加核苷酸“u”，作为3’突出端。添加的“u”的数目至少为2个，一般为2-10个，优选地为2-5个。添加的“u”在双链分子反义链的3’端形成单链。
制备双链分子的方法没有特殊限制，但优选地使用本领域已知的化学合成方法。根据化学合成方法，分别合成有义和反义单链多核苷酸，然后通过合适的方法将它们退火在一起，以获得双链分子。退火的具体实例包括，其中合成的单链多核苷酸以优选地至少大约3∶7；更优选地大约4∶6，最优选地基本上等摩尔量(即大约5∶5的摩尔比)的比例混合。接着，将混合物加热到双链分子会解离的温度，然后缓慢冷却下来。经退火的双链分子可以通过本领域已知的通常使用的方法加以纯化。纯化方法的实例包括使用琼脂糖凝胶电泳的方法，或者视情况除去剩余的单链多核苷酸(例如通过用合适的酶降解)的方法。
PKIB或NAALADL2序列的侧翼调节序列可以是相同或不同的，从而它们的表达可以独立地接受调节，或者按照时间(temporal)或空间(spatial)的方式接受调节。可以通过将PKIB或NAALDADL2基因模板克隆到载体内，例如含有来自小核RNA(snRNA)U6或人H1RNA启动子的RNA pol III转录单元的载体内，来在细胞内转录出双链分子。
含有双链分子的载体
本发明还包括含有一个或多个本文所述双链分子的载体，和含有该载体的细胞。本发明的载体优选地以可表达的形式编码本发明的双链分子。这里，术语“以可表达的形式”是指载体在被引入到细胞内时会表达所述分子。在优选的实施方案中，载体包括双链分子表达必需的调节元件。本发明的这些载体可用于产生本发明的双链分子，或者直接作为用于癌症治疗的活性成分。
本发明载体的产生可以通过例如将PKIB或NAALADL2序列克隆到表达载体内，使调节序列与PKIB或NAALADL2序列以允许两条链表达(通过DNA分子的转录)的方式操作连接(Lee NS et al.，Nat Biotechnol 2002May，20(5)：500-5)。例如，相对于mRNA为反义的RNA分子被第一个启动子(例如所克隆DNA的3’端侧翼的启动子序列)转录，相对于mRNA为有义的RNA分子则被第二个启动子(例如所克隆DNA 5’端侧翼的启动子序列)转录。有义链和反义链在体内杂交，产生用于沉默基因的双链分子构建体。或者，使用两个载体构建体，它们分别编码双链分子有义和反义链，来分别表达有义链和反义链，然后形成双链分子构建体。而且，所克隆的序列可以编码具有二级结构(例如发夹)的构建体；即载体的单个转录本同时含有靶基因的有义序列和互补反义序列。
还可以为本发明的载体提供必要的装备，以实现在靶细胞的基因组中的稳定***(同源重组盒载体的描述见例如Thomas KR&Capecchi MR，Cell1987，51：503-12)。见例如Wolff et al.，Science 1990，247：1465-8；US PatentNos.5,580,859；5,589,466；5,804,566；5,739,118；5,736,524；5,679,647；和WO98/04720。基于DNA的递送技术的实例包括“裸DNA”，协助(布比卡因(bupivicaine)、聚合物、肽介导的)递送、阳离子脂质复合体和颗粒介导的(“基因枪”)或压力介导的递送(见例如美国专利No.5,922,687)。
本发明的载体可以是，例如，病毒或细菌载体。表达载体的实例包括减毒病毒宿主，例如牛痘或禽痘(见例如美国专利No.4,722,848)。这种方法涉及使用痘苗病毒，例如作为载体来表达编码该双链分子的核苷酸序列。在被引入到表达靶基因的细胞内时，重组牛痘病毒表达该分子，借此抑制细胞的增殖。可使用的载体的另一个实例包括卡介苗(BCG)。BCG载体在Stover et al.，Nature 1991，351：456-60中有记载。多种其它载体也可用于双链分子的治疗性施用和产生；实例包括腺病毒载体和腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)载体、脱毒的炭疽毒素载体等。见例如Shata et al.，Mol Med Today 2000，6：66-71；Shedlock et al.，J LeukocBiol 2000，68：793-806；和Hipp et al.，In Vivo 2000，14：571-85。
用双链分子治疗癌症的方法
在本发明中，为PKIB构建了3种不同的dsRNA，为NAALADL2构建了3种不同的dsRNA，测试它们抑制细胞生长的能力。PKIB的两种dsRNA有效敲低了基因在两种***癌细胞系中的表达，同时细胞增殖被抑制(图3A、B和C)。NAALADL2的一个dsRNA显著降低了***细胞系中的表达水平和细胞生长能力(图4A-E)。
因此，本发明提供了通过抑制PKIB或NAALADL2基因的表达，诱导PKIB或NAALADL2基因的功能障碍，从而抑制细胞生长，即***癌细胞生长的方法。PKIB或NAALADL2基因的表达可以被任何前述的特异性靶定PKIB或NAALADL2基因的本发明双链分子所抑制，或者被能够表达任何该双链分子的本发明载体所抑制。
本发明双链分子和载体的这种抑制癌性细胞的细胞生长的能力提示它们能够用于癌症治疗方法。因此，本发明提供了治疗***癌患者的方法，所述方法施用针对PKIB或NAALADL2基因的双链分子或表达该分子的载体，而没有不良作用，因为这些基因在正常器官中几乎未检出(图1和2)。
术语“特异性抑制”，在抑制性多核苷酸和多肽的语境中，是指试剂或配体抑制PKIB或NAALADL2的表达或生物学功能的能力。特异性抑制通常导致PKIB或NAALADL2的表达(例如转录或翻译)或测得的生物学功能(例如细胞生长或增殖，细胞凋亡的抑制)与背景相比至少有大约2倍的抑制，优选地大于大约10倍，最优选地大于100倍的抑制。表达水平和/或生物学功能可以通过比较经过处理的和未经处理的细胞或者处理之前和之后的细胞群体加以测量。在一些实施方案中，PKIB或NAALADL2的表达或生物学功能被完全抑制。典型地，特异性的抑制，是利用合适的统计检验，显示PKIB或NAALADL2的表达或生物学功能的统计学上有意义的降低(例如p≤0.05)。
具体地，本发明提供了如下的方法[1]-[23]：
[1]一种用于治疗***癌的方法，包括施用至少一种分离的双链分子的步骤，所述双链分子抑制PKIB或NAALADL2在过表达该基因的细胞内的表达和细胞的增殖，该分子包括有义链和与之互补的反义链，它们彼此杂交形成该双链分子。
[2][1]所述的方法，其中该有义链包含与从SEQ ID NO：16，17和19的组中选出的靶序列对应的序列。
[3][1]所述的方法，其中待治疗的***癌是激素难治性***癌或去势抵抗性***癌；
[4][1]所述的方法，其中施用多种双链分子；
[5][4]所述的方法，其中所述多种双链分子靶定相同的基因；
[6][1]所述的方法，其中双链分子的长度小于约100个核苷酸；
[7][6]所述的方法，其中双链分子的长度小于约75个核苷酸；
[8][7]所述的方法，其中双链分子的长度小于约50个核苷酸；
[9][8]所述的方法，其中双链分子的长度小于约25个核苷酸；
[10][9]所述的方法，其中双链分子的长度为大约19-大约25个核苷酸；
[11][1]所述的方法，其中双链分子由单一多核苷酸构成，所述多核苷酸包含通过间插单链连接起来的有义链和反义链；
[12][11]所述的方法，其中双链分子具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]是包含选自SEQ ID NO：16、17和19的序列的有义链，[B]是由3-23个核苷酸组成的间插单链，[A’]是包含与[A]互补的序列的反义链；
[13][1]所述的方法，其中双链分子包含RNA；
[14][1]所述的方法，其中双链分子包含DNA和RNA；
[15][14]所述的方法，其中双链分子是DNA多核苷酸与RNA多核苷酸的杂交体；
[16][15]所述的方法，其中所述有义链多核苷酸和反义链多核苷酸分别由DNA和RNA构成；
[17][14]所述的方法，其中所述双链分子是DNA和RNA的嵌合体；
[18][17]所述的方法，其中位于反义链3’端侧翼的区域由RNA构成，或者位于有义链5’端侧翼的区域和反义链3’端侧翼的区域均由RNA构成；
[19][18]所述的方法，其中所述侧翼区域由9-13个核苷酸组成；
[20][1]所述的方法，其中所述双链分子含有3’突出端；
[21][1]所述的方法，其中所述双链分子由载体编码；
[22][21]所述的方法，其中所述由载体编码的双链分子具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]是包含选自SEQ ID NO：16、17和19的序列的有义链，[B]是由3-23个核苷酸组成的间插单链，[A’]是包含与[A]互补的序列的反义链；和
[23][1]所述的方法，其中双链分子包含在组合物中，该组合物除了该分子之外还包括转染增强剂和药学上可接受的载体。
下文中将更详细地描述本发明的方法。
通过使表达PKIB或NAALADL2基因的细胞与针对PKIB或NAALADL2基因的双链分子、表达该分子的载体、或包含它(们)的组合物接触，可抑制该细胞的生长。进一步使细胞与转染剂接触。合适的转染剂是本领域已知的。术语“抑制细胞生长”表示与没有暴露于该分子的细胞相比，细胞增殖速度更低或者生存力降低。细胞生长可以用本领域已知的方法测量，例如使用MTT细胞增殖测定。
任何类型细胞的生长均可根据本发明加以抑制，只要该细胞表达或过表达本发明双链分子的靶基因即可。示例细胞包括***癌细胞。
因此，对于患有或有风险患上与PKIB或NAALADL2相关的疾病的患者，可以通过施用至少一种本发明的双链分子、至少一种表达至少一种该分子的载体、或至少一种含有至少一种该分子的组合物加以治疗。例如，***癌患者可以根据本发明的方法加以治疗。癌症的类型可以利用与待诊断肿瘤的具体类型相应的常规方法加以鉴定。***癌可以用例如***特异抗原(PSA)或直肠指检(digital rectal exam)进行诊断。更优选地，通过RT-PCR或免疫测定检测来自患者的活检物中的PKIB或NAALADL2的表达，据此选择可通过本发明方法治疗的患者。优选地，在用本发明治疗之前，通过本领域已知的方法，例如免疫组织化学分析或RT-PCR，确认来自受试者的活检样本中PKIB或NAALADL2基因的过表达。
根据该抑制细胞生长以治疗癌症的方法，在施用多种双链分子(或表达这些分子的载体或含有这些分子的组合物)时，每种分子可以针对PKIB和/或NAALADL2的相同靶序列或者不同靶序列。例如，所述方法可以采用针对PKIB或NAALADL2的双链分子。或者，例如，所述方法可以采用针对从PKIB和NAALADL2选出的1种、2种或多种靶序列的双链分子。
为了抑制细胞生长，可以将本发明的双链分子以该分子与相应的mRNA转录本相结合的形式直接导入到细胞内。或者，如上文所述，可将编码该双链分子的DNA作为载体导入到细胞内。为了将双链分子和载体导入到细胞内，可以采用转染增强剂，例如FuGENE(Rochediagnostices)，Lipofectamine 2000(Invitrogen)、Oligofectamine(Invitrogen)、和Nucleofector(Wako pure Chemical)。
如果治疗可导致临床利益，例如患者体内PKIB或NAALADL2基因的表达降低，或癌症的大小、普遍性(prevalence)或转移潜力下降，则治疗可被确定有效。当治疗是预防性施用时，“有效”的意思是它可阻止或预防癌症形成，或者预防或减轻癌症的临床症状。有效性的确定可以和任何已知的用于诊断或治疗特定肿瘤类型的方法结合进行。
预防(prevention和prophylaxis)包括任何可以减轻疾病所致的死亡率或发病率负担的活动。预防可以在“一级、二级和三级预防水平”上进行。一级预防是避免疾病的发生，而二级和三级水平的预防包括旨在预防疾病进展和症状出现、以及通过恢复功能和减少疾病相关并发症来减轻已成形的疾病的负面影响的活动。或者，预防包括广泛的旨在减轻特定疾病严重性的预防性治疗，例如降低肿瘤的增殖和转移，减少血管新生。
癌症的治疗和/或防治，和/或术后复发的预防包括任何如下步骤，例如手术除去癌细胞、抑制癌性细胞的生长、肿瘤的消退或衰退，诱导癌症的减轻和抑制癌症的发生、肿瘤衰退、和减少或抑制转移。癌症的有效治疗和/或防治可降低患癌个体的死亡率，改善患癌个体的预后，降低血液中肿瘤标志物的水平，和减轻可检测的癌症伴随症状。
应当理解，本发明的双链分子以亚化学计量的方式降解靶mRNA(PKIB或NAALADL2)。不希望受限于任何理论，我们相信，本发明的双链分子是以催化的方式降解靶mRNA的。因此，与常规的癌症治疗相比，为发挥治疗效果而需要在癌症部位或其附近递送的双链分子显著较少。
本领域的技术人员通过考虑如下因素，例如受试者的体重、年龄、性别、疾病类型、症状和其它条件；施用途径；施用是局部性还是全身性的等，能够容易地确定施予给定受试者的本发明双链分子的有效量。一般地，本发明双链分子的有效量包括癌症部位或附近的细胞内浓度，为大约1纳摩尔(nM)-大约100nM，优选地大约2nM-大约50nM，更优选地大约2.5nM-大约10nM。我们意图可以施用更大或更小量的双链分子。
本方法可用于抑制癌症的生长或转移；例如***癌，特别是激素难治性***癌或去势抵抗性***癌。特别地，包含PKIB靶序列(即SEQ IDNO：16和17)的双链分子是治疗***癌特别优选的；包含NAALADL2靶序列(即SEQ ID NO：19)的双链分子是治疗***癌特别优选的。
为了治疗癌症，还可以将本发明的双链分子和与该双链分子不同的药剂组合施用给受试者。或者，可以将本发明的双链分子和另一种设计用于治疗癌症的治疗方法组合施用给受试者。例如，本发明的双链分子可以和目前用于治疗癌症或防止癌症转移的治疗方法(例如放射治疗，手术和使用化疗剂例如顺铂、卡铂、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、亚德里亚霉素、柔红霉素(daunorubicin)或他莫昔芬(tamoxifen)的治疗)组合施用。
在本方法中，双链分子可以作为裸双链分子施用、与递送剂联合施用、或者作为表达双链分子的重组质粒或病毒载体施用给受试者。
用于和本发明双链分子联合施用的合适递送剂包括Mirus Transit亲脂试剂；lipofectin；lipofectamine；cellfectin；或多聚阳离子(例如多聚赖氨酸)；或脂质体。优选地递送剂是脂质体。
脂质体能够辅助将双链分子递送到特定组织，例如***肿瘤组织，并且还能够增加双链分子的血液半衰期。适于用在本发明的脂质体由常规的囊泡形成性脂质(vesicle-forming lipids)形成，它们一般包括中性或带负电荷的磷脂和甾醇，例如胆固醇。一般通过考虑期望的脂质体大小和脂质体在血流中的半衰期等因素来指导脂质的选择。已知有多种方法用于制备脂质体，例如在下列文献中记载的：Szoka et al.，Ann Rev Biophys Bioeng 1980，9：467；和US Pat.Nos.4,235,871；4,501,728；4,837,028；和5,019,369，本文援引并入它们的全部公开内容。
优选地，封装本发明双链分子的脂质体包括能够将脂质体递送到癌症部位的配体分子。与普遍存在于肿瘤或血管内皮细胞中的受体结合的配体，例如与肿瘤抗原或内皮细胞表面抗原结合的单克隆抗体，是优选的。
特别优选的是对封装本发明双链分子的脂质体加以修饰，以避免被单核巨噬细胞和网状内皮***(reticuloendothelial system)所清除，例如通过使结构的表面结合有调理作用抑制部分(moieties)。在一个实施方案中，本发明的脂质体可以同时包括调理作用抑制部分和配体。
用于制备本发明的脂质体的调理作用抑制部分通常是与脂质体膜结合的大型亲水性聚合物。如在本说明书中所使用的，例如，当调理作用抑制部分化学地或物理地搭接在膜上时，例如通过脂溶性锚(anchor)***膜本身，或者通过与膜脂质的活性基团直接结合，则调理作用抑制部分与脂质体膜“结合”。这些调理作用抑制性亲水性聚合物形成保护性表层，显著地减少单核巨噬细胞***(“MMS”)和网状内皮***(”RES”)对脂质体的摄入；在例如美国专利第4,920,016号中对此有记载，后者的全部公开内容援引并入本说明书。因此，与未修饰的脂质体相比，被调理作用抑制部分修饰过的脂质体能够保留在血液循环中的时间显著更长。出于以上理由，上述脂质体有时也被称为“隐形”(stealth)脂质体。
已知隐形脂质体蓄积在依靠多孔性或“渗漏性”微血管***供给的组织中。因此，在以这样的微血管***缺损为特征的靶组织，例如实体瘤中，这些脂质体会高效率地蓄积。参见Gabizon等，Proc Natl Acad Sci USA 1988，18：6949-53。此外，由于RES的摄入的减少，防止隐形脂质体在肝脏和脾脏中的显著蓄积，从而降低隐形脂质体的毒性。因此，用调理作用抑制部分修饰的本发明的脂质体能够将本发明的双链核酸分子输送至肿瘤细胞。
适用于修饰脂质体的调理作用抑制部分优选为分子量约500～约40,000道尔顿、更优选约2,000～约20,000道尔顿的水溶性聚合物。这样的聚合物中包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物；例如，甲氧基PEG或PPG、和PEG或PPG硬脂酸酯；合成聚合物如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；直链状、分枝状或者树状聚酰胺胺(polyamidoamine)；聚丙烯酸；多元醇，诸如化学结合有羧基或氨基的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神经节苷脂，诸如神经节苷脂GM1。PEG、甲氧基PEG、或甲氧基PPG或其衍生物的共聚体也是适合的。此外，抑制调理作用的聚合物可以是PEG与聚氨基酸、多糖、聚酰胺胺、聚亚乙基胺或者多核苷酸中的任何一种的嵌段共聚物。抑制调理作用的聚合物还可以是含有氨基酸或羧酸的天然多糖，例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明质酸、果胶酸、神经氨酸、海藻酸、角叉胶；氨基化多糖类或寡糖(直链状或者分枝状)；或者羧基化的多糖或寡糖，例如，与碳酸的衍生物反应而生成了羧基结合的羧基化多糖类或寡糖。
优选地，调理作用抑制部分是PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG衍生物修饰的脂质体有时称作“PEG化脂质体”。
调理作用抑制部分可以通过许多公知技术中的任何一种结合到脂质体膜上。例如，PEG的N-羟基琥珀酰亚胺酯能够与磷脂酰乙醇胺脂溶性锚(lipid-soluble anchor)结合，然后再结合到膜上。相似地，可以通过还原性氨基化，用硬脂酰胺脂溶性锚来将右旋糖酐聚合物衍生化，所述还原性氨基化中使用Na(CN)BH3和混合溶剂，如60℃的四氢呋喃与水的30∶12比例混合物。
上文讨论了表达本发明的双链核酸分子的载体。这样的表达至少一种本发明的双链核酸分子的载体也可以直接施用或者与合适的投递试剂，包括Mirus Transit
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脂溶性试剂、lipofectin、lipofectamine、cellfectin、聚阳离子(例如聚赖氨酸)或脂质体等组合施用。将表达本发明的双链核酸分子的重组病毒载体投递到患者的癌症区域的方法在本技术领域的技术范围内。
本发明的双链核酸分子可以通过适于将双链核酸分子投递到癌症区域的任何手段来施用给受试者。例如，双链核酸分子可以通过基因枪、电穿孔、或者其它合适的非消化道或肠内施用途径来施用。
合适的肠内施用途径包括口服、直肠或鼻内投递。
合适的非消化道施用途径包括静脉内施用(例如静脉内推注、静脉内输注、动脉内推注、动脉内输注和向血管网络中的导管滴注)，组织周围和组织内注射(例如肿瘤周围和肿瘤内注射)，皮下注射或沉积，包括皮下输注(例如利用浸透压泵)，直接施加到癌症区域或其附近，例如借助导管或其它放置装置(例如，包含多孔性、非多孔性或明胶状材料的视网膜片剂(retinal pellet)或栓剂或植入物)，和吸入。优选通过注射或输注将双链核酸分子或载体施用到癌症部位或其附近。
本发明的双链核酸分子可以以单一剂量或分多个剂量来施用。当本发明的双链核酸分子通过输注方式施用时，输注可以是单个持续剂量，或者通过多次输注来输送。优选的是将药剂直接注射到癌症部位或其附近的组织中。特别优选的是将药剂多次注射到癌症部位或其附近的组织中。
本领域技术人员可以容易地确定合适的剂量方案来给受试者施用本发明的双链核酸分子。例如，可以将双链核酸分子一次施用给受试者，例如以单次注射或者沉积的形式施用到癌症部位或其附近。或者，双链核酸分子可以在约3～约28日、更优选约7～约10日的期间内施用给受试者，每日一次或二次。在优选的剂量方案中，在7日期间内每日一次地将双链核酸分子注射到癌症部位或其附近。当剂量方案包括多次施用时，应该理解的是，给受试者施用的双链核酸分子的有效量，可以包含在整个剂量方案中施用的该双链核酸分子的总量。
包含双链分子的组合物
进一步，本发明提供了包含至少一种本发明双链分子或编码这些分子的载体的药物组合物。具体地，本发明提供了如下的组合物[1]-[23]：
[1]一种用于治疗***癌的组合物，包括至少一种分离的双链分子，该双链分子抑制PKIB或NAALADL2的表达和细胞增殖，该分子包含有义链和与之互补的反义链，它们彼此杂交形成该双链分子。
[2][1]所述的组合物，其中该有义链包含与从SEQ ID NO：16，17和19中选出的靶序列对应的序列。
[3][1]所述的组合物，其中待治疗的***癌是激素难治性***癌或去势抵抗性***癌；
[4][1]所述的组合物，其中该组合物含有多种所述的双链分子；
[5][4]所述的组合物，其中所述多种双链分子靶定相同的基因；
[6][1]所述的组合物，其中双链分子的长度少于约100个核苷酸；
[7][6]所述的组合物，其中双链分子的长度少于约75个核苷酸；
[8][7]所述的组合物，其中双链分子的长度少于约50个核苷酸；
[9][8]所述的组合物，其中双链分子的长度少于约25个核苷酸；
[10][9]所述的组合物，其中双链分子的长度为约19-大约25个核苷酸；
[11][1]所述的组合物，其中双链分子由单一多核苷酸构成，所述多核苷酸包含通过间插单链连接起来的有义链和反义链；
[12][11]所述的组合物，其中双链分子具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]是包含选自SEQ ID NO：16、17和19的序列的有义链，[B]是由3-23个核苷酸组成的间插单链，[A’]是包含与[A]互补的序列的反义链；
[13][1]所述的组合物，其中所述双链分子包含RNA；
[14][1]所述的组合物，其中所述双链分子包含DNA和RNA；
[15][14]所述的组合物，其中所述双链分子是DNA多核苷酸与RNA多核苷酸的杂交体；
[16][15]所述的组合物，其中所述有义链多核苷酸和反义链多核苷酸分别由DNA和RNA构成；
[17][14]所述的组合物，其中双链分子是DNA和RNA的嵌合体；
[18][17]所述的组合物，其中位于反义链3’端侧翼的区域由RNA构成，或者位于有义链5’端侧翼的区域和反义链3’端侧翼的区域均由RNA构成；
[19][18]所述的组合物，其中所述侧翼区域由9-13个核苷酸构成；
[20][1]所述的组合物，其中所述双链分子含有3’突出端；
[21][1]所述的组合物，其中所述双链分子由载体所编码，并且包含在组合物内；
[22][21]所述的组合物，其中所述双链分子具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]是包含选自SEQ ID NO：16、17和19的序列的有义链，[B]是由3-23个核苷酸组成的间插单链，[A’]是包含与[A]互补的序列的反义链；和
[23][1]所述的组合物，其中该组合物包含转染增强剂和药学上可接受的载体。
本发明的方法在下文将有更加详细的记载。
对于本发明的双链核酸分子，在施用给受试者之前，优选采用本技术领域公知的技术将其配制成药物组合物。本发明的药物组合物的特征在于至少是无菌和无热源的。如在本说明书中使用的，“药物制剂”包括人用和兽医用的制剂。本发明的药物组合物的制备方法在本技术领域的技术范围内，例如如Remington′s Pharmaceutical Science，17th ed.，Mack PublishingCompany，Easton，Pa.(1985)所记载的，将其全部内容援引并入本说明书。
本药物制剂包含至少一种本发明的双链分子或编码它们的载体(例如重量比0.1-90％)，或者所述分子的生理可接受的盐，与生理可接受的载体介质相混合。优选的生理可接受的载体介质是水、缓冲水(buffered water)、生理盐水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。
根据本发明，该组合物可以含有多种类型的双链分子，每一种分子可以被导向到PKIB和/或NAALADL2的相同靶序列或不同靶序列。例如，所述组合物可以含有针对PKIB或NAALADL2的双链分子。或者，例如，所述组合物可以包含针对从PKIB或NAALADL2选出的一个、两个或更多个靶序列的双链分子。
进一步，本组合物可以含有编码一个或多个双链分子的载体。例如，载体可以编码一种、两种或多种本发明双链分子。或者，本组合物可以包含多种类型的载体，每一种载体编码一种不同的双链分子。
而且，本双链分子可以作为脂质体包含在本发明组合物中。关于脂质体的细节，见条目“使用双链分子治疗癌症的方法”。
此外，本发明的药物组合物中还可以包含常规的药用赋形剂和/或添加剂。合适的药用赋形剂包括稳定化剂、抗氧化剂、浸透压调节剂、缓冲剂、和pH调节剂。合适的添加剂包括：生理学上生物相容性的缓冲液(例如氨基丁三醇盐酸盐)、补加螯合剂(例如DTPA或DTPA-双酰胺等)，或钙螯合剂复合物(例如、钙DTPA、CaNaDTPA-双酰胺)，或者，任选地，补加钙或钠盐(例如氯化钙、抗坏血酸酸钙、葡糖酸钙或乳酸钙)。本发明的药物组合物可以进行包装以便作为液体使用，或者也可以加以冷冻干燥。
对于固体组合物，可以使用常规的无毒固态载体；例如，药物级的甘露醇、乳酸、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。
例如，用于口服的固体药物组合物可以包括任何上面列举的载体和赋形剂，和10-95％，优选地25-75％的一种或多种本发明双链分子。用于喷雾(吸入)施用的药物组合物可以包括重量比0.01-20％，优选地重量比1-10％的一种或多种如上所述地包被在脂质体中的本发明双链分子，和推进剂。还可以视需要包含载体；例如卵磷脂，用于鼻内递送。
除了上述之外，本组合物可以含有其它的药物活性成分，只要它们不抑制本双链分子的体内功能即可。例如，组合物可以含有常规用于治疗癌症的化疗剂。
在其它实施方案中，本发明还提供本发明的双链核酸分子在制备用于治疗表达PKIB和/或NAALADL2基因的癌症的药物组合物中的用途。例如，本发明涉及下述双链核酸分子在制备用于治疗表达PKIB和/或NAALADL2基因的癌症的药物组合物中的用途：该双链核酸分子在细胞中抑制PKIB和/或NAALADL2基因的表达，该分子包含有义链和与之互补的反义链，所述有义链和与之互补的反义链彼此杂交而形成所述双链核酸分子，且该分子以选自SEQ ID NO：16、17和19中的序列为靶标。
或者，本发明进一步提供了用于制造用于治疗表达PKIB和/或NAALADL2基因的癌症的药物组合物的方法或过程，其中该方法或过程包括将药学上或生理学上可接受的载体与作为活性成分的、可抑制PKIB和/或NAALADL2基因在细胞内的表达的双链核酸分子一起配制的步骤，该分子包括有义链和与之互补的反义链，所述有义链和反义链彼此杂交形成所述双链核酸分子，并且该分子以选自SEQ ID NO：16、17和19的序列为靶标。
在另一个实施方案中，本发明还提供了用于制造用于治疗表达PKIB和/或NAALADL2基因的癌症的药物组合物的方法或过程，其中该方法或过程包括混合活性成分与药学上或生理学上可接受的载体的步骤，其中该活性成分是抑制PKIB和/或NAALADL2基因在细胞内表达的双链核酸分子，该分子包括有义链和与之互补的反义链，所述有义链和反义链彼此杂交形成所述双链核酸分子，并且该分子以选自SEQ ID NO：16、17和19的序列为靶标。
或者，根据本发明，提供了本发明双链分子在制造用于治疗***癌的药物组合物方面的应用。进一步，本发明还提供了用于治疗***癌的本发明双链分子。
诊断***癌的方法
PKIB或NAALADL2的表达被发现特异性地在***癌细胞中变得更高(图1A、B、C、D、E、F和图2A，B)。因此，本文鉴定的基因以及其转录和翻译产物可作为标志用于诊断***癌，并且，通过测量PKIB或NAALADL2在细胞样品中的表达，可以诊断***癌。具体地说，本发明提供了通过确定PKIB或NAALADL2在受试者中的表达水平来诊断***癌的方法。可以通过本方法诊断的***癌包括激素难治性***癌或去势抵抗性***癌。
本发明的方法可以为确定受试者状况提供初始结果。这些初始结果可以和其他信息结合，来帮助医生、护士或其它从业人员诊断疾病。或者，本发明可用于检测受试者来源组织中的癌性细胞，并为医生提供诊断疾病的有用信息。
具体地，本发明提供了如下方法[1]-[10]：
[1]一种用于诊断或检测***癌存在的方法，所述方法包括如下步骤：
(a)检测生物样品中编码PKIB或NAALADL2氨基酸序列的基因的表达水平；和
(b)将该基因与正常对照水平相比的表达水平增加与疾病相关联。
[2][1]所述的方法，其中表达水平比正常对照水平至少高10％。
[3][1]所述的方法，其中通过选自下组的任何一种方法检测表达水平：
(a)检测包含PKIB或NAALADL2的序列的mRNA，
(b)检测包含PKIB或NAALADL2的氨基酸序列的蛋白质，和
(c)检测包含PKIB或NAALADL2的氨基酸序列的蛋白质的生物活性。
[4][1]所述的方法，其中***癌是激素难治性***癌或去势抵抗性***癌。
[5][3]所述的方法，其中通过检测探针与基因转录本的杂交确定表达水平。
[6][3]所述的方法，其中表达水平的确定是通过检测抗体与由基因编码的蛋白质的结合作为基因的表达水平。
[7][1]所述的方法，其中生物样品包括活检物、痰、血液或尿。
[8][1]所述的方法，其中受试者来源的生物样品包括上皮细胞。
[9][1]所述的方法，其中受试者来源的生物样品包括癌细胞。
[10][1]所述的方法，其中受试者来源的生物样品包括癌性上皮细胞。
下文将更详细地记载诊断或检测***癌存在的方法。
本方法要诊断的受试者优选地是哺乳动物。哺乳动物的实例包括，但不限于，例如人、非人灵长动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马和牛。
优选地从待诊断的受试者收集生物样品来进行诊断。任何生物材料均可用作供测定的生物样品，只要其包含PKIB或NAALADL2的目标转录产物或翻译产物即可。生物样品包括，但不仅限于，身体组织或体液，例如血液、痰和尿。优选地，生物样品含有细胞群体，包括上皮细胞，更优选地是癌上皮细胞或来自怀疑为癌性的***组织的上皮细胞。进一步，如果需要，可以从所得身体组织和体液纯化出细胞，然后用作生物样品。
根据本发明，测定PKIB或NAALADL2在受试者来源的生物样品中的表达水平。表达水平可以在转录本(核酸)产物水平上加以确定，使用本领域已知的方法。例如，PKIB或NAALADL2的mRNA可以通过杂交方法(例如Northern杂交)用探针进行定量。检测可以在芯片或阵列上进行。对于包括PKIB或NAALADL2在内的多数个基因(例如各种癌特异基因)的表达水平的检测，阵列的使用是优选的。本领域的技术人员可以利用PKIB(SEQ IDNO 1；GenBank登录号：NM 181795)或NAALADL2(SEQ ID NO 3；GenBank登录号：NM 207015或SEQ ID NO 5；GenBank登录号：AK021754)的序列信息制备这些探针。例如，可以使用PKIB或NAALADL2的cDNA作为探针。如果需要，可以用合适的标签，例如染料、荧光和同位素等，来标记探针，由此基因的表达水平可以作为杂交标签的强度加以检测。进一步，PKIB或NAALADL2的转录产物可以通过基于扩增的检测方法(例如RT-PCR)用引物进行定量。这些引物还可以根据基因的可用序列信息加以制备。例如，实施例中使用的引物(SEQ ID NO 8-15)可以用来实施RT-PCR或Northern印迹检测，但是本发明并不仅限于此。
具体地，用于本方法的探针或引物在严格、中等严格或低严格条件下与PKIB或NAALADL2的mRNA杂交。如本文所使用的，术语“严格(杂交)条件”是指这样的条件，在该条件下，探针或引物与其靶序列杂交，但不与其它序列杂交。严格条件是依赖于序列的，在不同的环境下会不同。较长序列的特异杂交与较短序列相比在较高温度下发生。一般地，严格条件的温度应选择比特定序列在限定的离子强度和pH下的熔点(Tm)低大约5℃。Tm是(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)平衡状态下有50％的与靶序列互补的探针与靶序列杂交的温度。因为靶序列一般过量存在，因此在Tm下，平衡时50％的探针被占据。典型地，严格条件是这样的：其中盐浓度小于大约1.0M钠离子，典型地大约0.01-1.0M钠离子(或其它盐)，pH7.0-8.3，温度对于较短的探针或引物(例如10-50个核苷酸)是至少大约30℃，用于较长的探针或引物是至少大约60℃。严格条件也可以通过添加去稳定剂，例如甲酰胺，来实现。
或者，可以检测翻译产物以进行本发明的诊断。例如，可以确定PKIB或NAALADL2蛋白的量。测定作为翻译产物的蛋白量的方法包括免疫测定法，此类方法使用特异识别PKIB或NAALADL2蛋白的抗体。抗体可以是单克隆或多克隆的。而且，抗体的任何片段或修饰(例如嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等)均可用于检测，只要该片段保留对PKIB或NAALADL2蛋白的结合能力即可。制备这些类型的用于检测蛋白的抗体的方法是本领域众所周知的，并且在本发明中可以使用任何方法制备这些抗体和它们的等价物。优选地，结合PKIB的抗体被制备为具有表位肽，所述表位肽包含SARAGRRNALPDIQSSAATD(SEQ ID NO：33)或KEKDEKTTQDQLEKPQNEEK(SEQ ID NO：34)的氨基酸序列。而与NAALADL2结合的抗体则被制备为具有含有胞外域(SEQ ID NO：32)的表位肽。
作为根据翻译产物检测PKIB或NAALADL2基因的表达水平的另一种方法，可以用针对PKIB或NAALADL2蛋白的抗体通过免疫组织化学分析观察染色的强度。也就是说，强染色观察结果表明蛋白存在量增加，同时表明PKIB或NAALADL2基因的表达水平升高。
而且，除了PKIB或NAALADL2基因的表达水平之外，还可以确定其它癌症相关基因的表达水平，例如已知在***癌中差异表达的基因，以提高诊断的准确度。
如果PKIB或NAALADL2在生物样品中的表达水平比PKIB或NAALADL2基因的对照水平增加例如10％、25％或50％；或者增加到超过1.1倍，超过1.5倍，超过2.0倍，超过5.0倍，超过10.0倍或者更多，则可看作该表达水平升高。
对照水平可以与测试生物样品同时确定，使用先前从疾病状态(患癌或未患癌)已知的患者收集和保存的样品。或者，对照水平可以借助统计方法，根据通过分析先前测定的来自疾病状态已知的受试者的样品的PKIB或NAALADL2基因表达水平获得的结果加以确定。进一步，对照水平可以是来自先前测试过的细胞的表达模式数据库。而且，根据本发明的一个方面，可以将生物样品中PKIB或NAALADL2基因的表达水平与从多个参考样品确定的多个对照水平比较。优选地使用从来自与患者来源样品组织类型相似的组织类型的参考样品确定的对照水平。而且，优选地，使用具有已知的疾病状态的群体中PKIB或NAALADL2基因表达水平的标准值。标准值可以通过本领域已知的任何方法获得。例如，平均值±2S.D.或平均值±3S.D.的范围可以用作标准值。在本发明的语境下，从已知非癌性的生物样品确定的对照水平称作“正常对照水平”。另一方面，如果对照水平从癌性生物样品确定，则称作“癌对照水平”。
当PKIB或NAALADL2基因的表达水平比正常对照水平增加或者与癌对照水平相似时，可以诊断患者罹患或者具有发生癌症的危险。而且，当比较多种癌症相关基因的表达水平时，样品与癌参考样品之间基因表达模式相似表明受试者罹患或具有发生癌症的危险。
测试生物样品的表达水平与对照水平间的差异，可以相对已知表达水平不会随着细胞的癌或非癌状态改变的对照核酸，例如管家基因，的表达水平加以标准化。示例对照基因包括，但不仅限于，β-肌动蛋白、甘油醛-3磷酸脱氢酶和核糖体蛋白P1。
抗***癌化合物的筛选
在本发明的内容中，待通过本筛选方法鉴定的治疗剂可以是任何化合物或包含数种化合物的组合物。而且，根据本发明筛选方法暴露于细胞或蛋白的测试剂可以是单个化合物或多个化合物的组合。当在方法中使用化合物组合时，化合物可以顺次或同时加以接触。
任何测试剂，例如，细胞提取物、细胞培养上清、发酵微生物产物、海洋生物提取物、植物提取物、纯化或粗蛋白质、肽、非肽化合物、合成小分子化合物以及天然化合物，均可用于本发明的筛选方法中。也可使用本领域熟知的很多组合文库方法中的任何途径来获得测试化合物，包括(1)生物文库，(2)空间可寻址平行固相或液相文库(spatially addressable parallelsolid phase or solution phase libraries)，(3)需要解卷积(deconvolution)的合成文库法，(4)“一珠一化合物”(“one-bead one-compound”)文库法，以及(5)使用亲和色谱选择的合成文库法。使用亲和色谱选择的生物文库法限于肽文库，而其它四种途径适用于肽、非肽寡聚物或化合物小分子文库(Lam(1997)Anticancer Drug Des.12：145-67)。合成分子文库方法的例子可在本领域技术中找到(DeWitt et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1993，90：6909-13；Erb etal.，Proc Natl Acad Sci USA 1994，91：11422-6；Zuckermann et al.，J Med Chem37：2678-85，1994；Cho et al.，Science 1993，261：1303-5；Carell et al.，AngewChem Int Ed Engl 1994，33：2059；Carell et al.，Angew Chem Int Ed Engl 1994，33：2061；Gallop et al.，J Med Chem 1994，37：1233-51)。化合物文库可提供于溶液中(见Houghten，Bio/Techniques 1992，13：412-21)或珠子上(Lam，Nature1991，354：82-4)、芯片上((Fodor，Nature 1993，364：555-6)、细菌上(美国专利5,223,409)、孢子上(美国专利5,571,698；5,403,484和5,223,409)，质粒上(Cullet al.，Proc Natl Acad Sci USA 1992，89：1865-9)或噬菌体上(Scott and Smith，Science 1990，249：386-90；Devlin，Science 1990，249：404-6；Cwirla et al.，ProcNatl Acad Sci USA 1990，87：6378-82；Felici，J Mol Biol 1991，222：301-10；美国专利申请2002103360)。
通过本发明任何筛选方法筛选到的化合物的一部分结构通过添加、删除、和/或置换方式被转换而得到的化合物，包括在通过本发明筛选方法鉴定的治疗剂之内。
此外，当所筛选的测试剂是蛋白质时，为了获得编码该蛋白的DNA，可以确定蛋白的全部氨基酸序列，以此推定编码蛋白的核酸序列，或者可以分析所得蛋白的部分氨基酸序列，根据该序列制备寡DNA作为探针，并用该探针筛选cDNA文库，以获得编码该蛋白的DNA。对所得的DNA进行确认，以其在制备治疗或预防癌症的候选物测试剂中的有用性为准。
可用于本文所述筛选的测试剂还可以是这样的抗体，它们特异结合PKIB或NAALADL2蛋白或它们的在体内缺乏原始蛋白生物活性的部分肽。
尽管测试剂文库的构建是本领域众所周知的，在下文中还是进一步提供了鉴定测试剂和构建用于本筛选方法的这些治疗剂文库的指导。
(i)分子建模
对具有目标性质的化合物的分子结构和/或对待抑制靶分子即PKIB和NAALADL2的分子结构的知识为人们构建测试剂文库提供了便利。预筛选适于进一步评估的受试作用剂的方法之一，是对受试作用剂与其靶标的相互作用进行计算机建模。
计算机建模技术为针对选定分子的三维原子结构的可视化以及会与该分子相互作用的新化合物的合理设计提供了可能。三维构建典型地依赖于从选定分子的x-射线晶体分析或NMR成像而来的数据。分子动力学需要力场数据。计算机图形***为预测新化合物如何连接靶分子，以及实验操作化合物和靶分子的结构以优化结合特异性提供了可能。为了预测当分子和化合物之一或二者发生细小改变时分子-化合物相互作用是什么样的，需要分子力学软件和计算密集型计算机，它们通常耦联着分子设计程序和用户之间的用户友好的、菜单驱动的界面。
上文一般性描述的分子建模***的一个实例包括CHARMm和QUANTA程序，Polygen Corporation，Waltham，Mass。CHARMm执行能量最小化和分子动力学功能。QUANTA执行构建、图形建模和分子结构分析。利用QUANTA可进行分子相互行为的互动性构建、修饰、和可视化分析。
有多篇文献综述了与特异蛋白相互作用的药物的计算机建模，例如Rotivinen et al.Acta Pharmaceutica Fennica 1988，97：159-66；Ripka，NewScientist 1988，54-8；McKinlay&Rossmann，Annu Rev Pharmacol Toxiciol1989，29：111-22；Perry&Davies，Prog Clin Biol Res 1989，291：189-93；Lewis&Dean，Proc R Soc Lond 1989，236：125-40，141-62；以及综述关于核酸组分模型受体的Askew et al.，J Am Chem Soc 1989，111：1082-90。
其它可筛选并图形描述化学物质的计算机程序可以从例如Mississauga，Ontario，Canada的BioDesign，Inc.，Pasadena，Calif.，Allelix，Inc公司、Cambridge，Ontario的Hypercube，Inc.等公司获取。见例如DesJarlais et al.，JMed Chem 1988，31：722-9；Meng et al.，J Computer Chem 1992，13：505-24；Meng et al.，Proteins 1993，17：266-78；Shoichet et al.，Science 1993，259：1445-50。
(ii)组合化学合成
测试剂的组合文库可以作为合理药物设计程序--其涉及有关已知化合物中存在的核心结构的知识--的一部分生成。该方法允许文库保持合理的规模，便于高通量筛选。或者，简单的、特别是短的聚合物分子文库，可以通过直接合成构成该文库的分子家族的所有排列来加以构建。后一种方法的一个实例是全部由长度为6个氨基酸组成的肽文库。这种肽文库包含每一种6氨基酸序列组合。这种类型的文库称作线性组合化学文库。
组合化学文库的制备是本领域技术人员所熟知的，可以通过化学或生物合成来产生。组合化学文库包括，但不仅限于，肽文库(见例如美国专利5,010,175；Furka，Int J Pept Prot Res 1991，37：487-93；Houghten et al.，Nature1991，354：84-6)。也可以使用其它用于产生化学多样性文库的化学。这些化学包括，但不仅限于，肽(例如PCT申请号WO 91/19735)，被编码的肽(例如WO 93/20242)，随机生物寡聚体(例如WO 92/00091)，苯并二氮卓(benzodiazepines)(例如美国专利5,288,514)，diversomer如乙内酰脲、苯并二氮卓和二肽(DeWitt et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1993，90：6909-13)，插烯化(vinylogous)多肽(Hagihara et al.，J Amer Chem Soc 1992，114：6568)，具有葡萄糖骨架(scaffolding)的非肽类肽模拟物(Hirschmann et al.，J Amer ChemSoc 1992，114：9217-8)，小化合物文库的模拟物有机合成(analogous organicsynthese)(Chen et al.，J.Amer Chem Soc 1994，116：2661)，寡聚氨基甲酸盐(Cho et al.，Science 1993，261：1303)，和/或肽酰膦酸酯(peptidylphosphonates)(Campbell et al.，J Org Chem 1994，59：658)，核酸文库(见Ausubel，CurrentProtocols in Molecular Biology 1995supplement；Sambrook et al.，MolecularCloning：A Laboratory Manual，1989，Cold Spring Harbor Laboratory New York，USA)，肽核酸文库(见例如美国专利5,539,083)，抗体文库(见例如Vaughan etal.，Nature Biotechnology 1996，14(3)：309-14和PCT/US96/10287)，碳水化合物文库(见例如Liang et al.，Science 1996，274：1520-22；美国专利5,593,853)，和有机小分子文库(见例如苯并二氮卓，Gordon EM.Curr Opin Biotechnol.1995Dec 1；6(6)：624-31；类异戊二烯(isoprenoids)，美国专利5,569,588；噻唑烷酮(thiazolidinones)和偏硫杂氮杂环己烷(metathiazanone)，美国专利5,549,974；吡咯烷(pyrrolidines)，美国专利5,525,735和5,519,134；吗啉代化合物，美国专利5,506,337；苯并二氮卓，5,288,514；等)。
(iii)噬菌体展示
另一种手段是使用重组噬菌体来产生文库。使用“噬菌体方法”(Scott&Smith，Science 1990，249：386-90；Cwirla et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1990，87：6378-82；Devlin et al.，Science 1990，249：404-6)，可以构建非常大的文库(例如106-108个化学实体)。再一种手段主要使用化学方法，其实例包括Geysen方法(Geysen et al.，Molecular Immunology 1986，23：709-15；Geysen etal.，J Immunologic Method 1987，102：259-74)和Fodor等的方法(Science 1991，251：767-73)。Furka等(14th International Congress of Biochemistry 1988，Volume#5，Abstract FR：013；Furka，Int J Peptide Protein Res 1991，37：487-93)，Houghten(美国专利4,631,211)和Rutter等(美国专利5,010,175)记载了产生肽混合物的方法，可以将这些肽作为激动剂或拮抗剂加以测试。
用于制备组合文库的设备是可商购的(见例如357MPS，390MPS，Advanced Chem Tech，Louisville KY，Symphony，Rainin，Woburn，MA，433AApplied Biosystems，Foster City，CA，9050 Plus，Millipore，Bedford，MA)。此外，有多种组合文库本身也是商业可得的(见例如ComGenex，Princeton，N.J.，Tripos，Inc.，St.Louis，MO，3D Pharmaceuticals，Exton，PA，Martek Biosciences，Columbia，MD，等等)。
PKIB或NAALADL2结合化合物的筛选
在本发明中，尽管在正常器官中没有表达，但在***癌中检测到了PKIB或NAALADL2的过表达(图1和2)。因此，使用PKIB或NAALADL2基因、由该基因编码的蛋白质、或该基因的转录调节区，能够筛选出可改变该基因的表达或改变由该基因编码的多肽的生物学活性的化合物。这些化合物可用作治疗或预防***癌的药物。
本发明提供了筛选可结合PKIB或NAALADL2的作用剂的方法。因为PKIB和NAALADL2在***癌中表达，所以与PKIB或NAALADL2结合的作用剂可用于抑制***癌细胞的增殖，从而可用于治疗或预防***癌。因此，本发明还提供了用于筛选可抑制***癌细胞增殖的作用剂的方法，以及使用PKIB或NAALADL2多肽筛选可用于治疗或预防***癌的作用剂的方法。具体地，该筛选方法的一个实施方案包括如下步骤：
a)使测试化合物与由PKIB或NAALADL2多核苷酸编码的多肽接触；
b)检测所述多肽与测试化合物之间的结合活性；和
c)选择可结合所述多肽的测试化合物。
本发明的方法在下文将有更详细的记载。
用于筛选的PKIB或NAALADL2多肽可以是重组多肽，或者是来自自然界的蛋白质，或其部分肽。与测试化合物接触的多肽可以是，例如，纯化的多肽、可溶蛋白质、与载体结合的形式、或者与其它多肽融合的融合蛋白。
作为使用PKIB或NAALADL2多肽来筛选蛋白质，例如与PKIB或NAALADL2多肽结合的蛋白质的方法，可以使用本领域技术人员周知的许多方法。这样的筛选可以根据例如免疫沉淀方法(例如，按照下文[实施例1]中“PKIB与PKA-C间的相互作用”)来进行，具体地说以如下所述的方式。将基因***到用于外源基因的表达载体(例如pSV2neo、pcDNAI，pcDNA3.1，pCAGGS和pCD8)内，在宿主(例如动物)细胞中表达编码PKIB或NAALADL2多肽的基因。用于表达的启动子可以是任何能够通用的启动子，包括例如SV40早期启动子(Rigby in Williamson(ed.)，Genetic Engineering，vol.3.Academic Press，London，83-141(1982))，EF-α启动子(Kim et al.，Gene91：217-23(1990))，CAG启动子(Niwa et al.，Gene 108：193(1991))，RSV LTR启动子(Cullen，Methods in Enzymology 152：684-704(1987))，SRα启动子(Takebe et al.，Mol Cell Biol 8：466(1988))，CMV立即早期启动子(Seed andAruffo，Proc Natl Acad Sci USA 84：3365-9(1987))，SV40晚期启动子(Gheysen and Fiers，J Mol Appl Genet 1：385-94(1982))，腺病毒晚期启动子(Kaufman et al.，Mol Cell Biol 9：946(1989))，HSV TK启动子等。将基因导入到表达外源基因的宿主细胞内可以根据本领域技术人员众所周知的任何方法来进行，例如电穿孔方法(Chu et al.，Nucleic Acids Res 15：1311-26(1987))，磷酸钙方法(Chen and Okayama，Mol Cell Biol 7：2745-52(1987))，DEAE右旋糖酐法(Lopata et al.，Nucleic Acids Res 12：5707-17(1984)；Sussman andMilman，Mol Cell Biol 4：1641-3(1984))，Lipofectin转染法(Derijard B.，Cell76：1025-37(1994)；Lamb et al.，Nature Genetics 5：22-30(1993)：Rabindran etal.，Science 259：230-4(1993))等。对于由PKIB基因或NAALADL2基因编码的多肽，可以把特异性已知的单克隆抗体的识别位点(表位)导入该多肽的N或C端，从而将该多肽表达为包含该表位的融合蛋白。可以使用商品化的表位-抗体***(Experimental Medicine 13：85-90(1995))。可商购的载体能够利用其多克隆位点表达与例如β-半乳糖苷酶、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽S转移酶和绿色荧光蛋白(GFP)形成的融合蛋白。另外，也可以使用如下的融合蛋白，其通过导入仅由数个到十余个(a dozen)氨基酸构成的小型表位加以制备，使融合不会改变PKIB或NAALADL2多肽的性质。可以使用例如多组氨酸(His-标签)、流感凝集素HA、人c-myc、FLAG、水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-GP)、T7基因10蛋白(T7-标签)、人单纯疱疹病毒糖蛋白(HSV-标签)、E-标签(多克隆噬菌体上的表位)等表位，和识别它们的单克隆抗体作为筛选与PKIB或NAALADL2多肽结合的蛋白质的表位-抗体***(Experimental Medicine 13：85-90(1995))。
在免疫沉淀中，将这些抗体添加到用合适去垢剂制备的细胞裂解物内形成免疫复合体。免疫复合体由PKIB或NAALADL2多肽、具有与该多肽结合能力的多肽、和抗体组成。除了使用针对上述表位的抗体之外，还可以使用针对PKIB或NAALADL2多肽的抗体进行免疫沉淀，这样的抗体的制备如下文所述。免疫复合体可以被沉淀，例如当抗体是小鼠IgG抗体时，可以通过蛋白A sepharose或蛋白G sepharose将其沉淀。如果将PKIB或NAALADL2基因编码的多肽制备成与表位(例如GST)的融合蛋白，则可以使用特异结合这些表位的底物，例如谷胱甘肽-sepharose 4B，按照与使用针对PKIB或NAALADL2多肽的抗体的相同的方式来形成免疫复合体。
免疫沉淀可以根据下文所述实施，或者例如按照文献中的方法(Harlowand Lane，Antibodies，511-52，Cold Spring Harbor Laboratory publications，NewYork(1988))实施。
普遍使用SDS-PAGE分析经免疫沉淀的蛋白，使用合适浓度的凝胶，可以利用结合蛋白的分子量来分析该蛋白。由于与PKIB或NAALADL2多肽结合的蛋白难以通过考马斯兰染色或银染色等普通染色方法检测到，可以通过如下的方法提高蛋白的检测灵敏度：在含有放射性同位素35S-甲硫氨酸或35S-半胱氨酸的培养基中培养细胞，标记细胞中的蛋白，并检测该蛋白。当蛋白的分子量已知时，可以直接从SDS-聚丙烯酰胺凝胶上纯化出靶蛋白并测定其序列。
作为利用PKIB或NAALADL2多肽来筛选结合该多肽的蛋白的方法，可以使用例如West-Western印迹分析法(Skolnik et al.，Cell 65：83-90(1991))。具体地，PKIB或NAALADL2多肽结合蛋白可以通过如下方法获得，从预期表达PKIB或NAALADL2多肽的培养细胞(例如LNCaP，22Rv1，PC-3DU-145和C4-2B)利用噬菌体载体(例如ZAP)制备cDNA文库，在LB琼脂糖上表达蛋白，将表达出的蛋白固定在膜上，使纯化并且标记的PKIB或NAALADL2多肽与上述膜反应，并依照标记来检测表达与PKIB或NAALADL2多肽结合的蛋白的噬菌斑。本发明的多肽可以利用生物素与抗生物素蛋白间的结合，或者利用特异结合PKIB或NAALADL2多肽或与PKIB或NAALADL2多肽融合的肽或多肽(例如GST)的抗体，来进行标记。也可以使用利用放射性同位素或荧光等的方法。
或者，在本发明筛选方法的另一个实施方案中，可以使用利用细胞的双杂交***(“MATCHMAKER Two-Hybrid  system”，“MammalianMATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit”，“MATCHMAKER one-Hybridsystem”(Clontech)；“HybriZAP Two-Hybrid Vector System”(Stratagene)；参考文献见“Dalton and Treisman，Cell 68：597-612(1992)”，“Fields and Sternglanz，Trends Genet 10：286-92(1994)”)。
在双杂交***中，例如，使本发明的多肽与SRF结合区或GAL4结合区融合，并在酵母细胞中表达。从预期表达与本发明多肽结合的蛋白的细胞制备cDNA文库，从而使该文库，在被表达时，与VP16或GAL4转录激活区融合。然后，将cDNA文库导入到上述酵母细胞中，并从检测到的阳性克隆(当酵母细胞表达可与本发明多肽结合的蛋白时，两者的结合可激活报告基因，使阳性克隆可检测)分离源自该文库的cDNA。通过将上面分离的cDNA导入到大肠杆菌中并表达该蛋白，可制备由该cDNA编码的蛋白。作为报告基因，除了HIS3基因之外，还可以使用例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、荧光酶基因等。
也可以用亲和色谱来筛选与PKIB或NAALADL2基因编码的多肽结合的化合物。例如，可以把本发明多肽固定在亲和柱的载体上，而将含有能够结合本发明多肽的蛋白的测试化合物施加到该柱上。这里的测试化合物可以是例如细胞提取物、细胞裂解物等。在加载测试化合物之后，冲洗柱子，从而可以制备得到结合于本发明多肽的化合物。当测试化合物是蛋白质时，对所得蛋白质的氨基酸序列进行分析，根据该序列合成寡DNA，并用该寡DNA作为探针筛选cDNA文库，从而获得编码该蛋白的DNA。
利用表面等离子体共振现象的生物传感器可以在本发明中用作检测或定量结合化合物的装置。当使用这种生物传感器时，可以仅使用微量并且没有标记的多肽(例如BIAcore，Pharmacia)，以表面等离子体共振信号的形式对本发明多肽与测试化合物间的相互作用进行实时的观察。因此，使用生物传感器，例如BIAcore，人们就有可能对本发明多肽与测试化合物间的结合进行评估。
用于筛选当固定的PKIB或NAALADL2多肽暴露于合成化合物或天然底物文库或随机噬菌体多肽展示文库时发生结合的分子的方法，以及使用基于高通量的组合化学技术(Wrighton et al.，Science 273：458-64(1996)；Verdine，Nature 384：11-13(1996)；Hogan，Nature 384：17-9(1996))，不仅分离与PKIB或NAALADL2蛋白结合的蛋白质，而且分离与PKIB或NAALADL2蛋白结合化合物(包括激动剂和拮抗剂)的方法，是本领域技术人员众所周知的。
在优选实施方案中，通过本发明方法选出的测试化合物可以作为候选物，用于进一步筛选评估其治疗作用。
筛选可抑制PKIB或NAALADL2生物活性的化合物
在本发明中，PKIB或NAALADL2蛋白已显示具有促进***癌细胞增殖的活性(图3C，4C和6)。而且，PKIB显示具有PKA-C细胞核积累活性(图5D和E)。在本发明中，所谓PKA-C细胞核积累，意思是抑制PKA-C从细胞核外排或者加速PKA-C转运进入细胞核。利用这些生物活性，可以筛选能够抑制这些蛋白的活性的化合物，该化合物对于治疗或预防***癌有用。因此，本发明还提供了筛选可抑制***癌细胞增殖的化合物的方法，和筛选治疗或预防***癌的化合物的方法。因此，本发明提供了使用PKIB或NAALADL2基因表达的多肽来筛选用于治疗或预防***癌的化合物的方法，该方法包括如下步骤：
a)使测试化合物与由PKIB或NAALADL2的多核苷酸编码的多肽接触；
b)检测步骤(a)的多肽的生物活性；和
c)选择与不存在测试化合物时所述多肽的生物活性相比，可抑制由PKIB或NAALADL2多核苷酸编码的多肽的生物活性的测试化合物。
下文将更详细地记载本发明的方法。
任何多肽均可用于筛选，只要它们具有PKIB或NAALADL2蛋白的生物活性即可。例如，可以使用PKIB或NAALADL2蛋白，也可以使用与这些蛋白功能上等同的多肽。这些多肽可以由细胞内源或外源表达。而且，这些生物活性包括PKIB或NAALADL2蛋白的细胞增殖活性或PKIB蛋白的PKA-C细胞核积累活性。
通过本筛选分离的化合物是PKIB或NAALADL2基因编码多肽的拮抗剂的候选物。术语“拮抗剂”是指可以通过结合多肽而抑制多肽功能的分子。所述术语还指可降低或抑制编码PKIB或NAALADL2的基因的表达的分子。而且，通过本筛选分离的化合物是如下化合物的候选物，所述化合物抑制PKIB或NAALADL2多肽与分子(包括DNA和蛋白)的体内相互作用。
当本方法中要检测的生物活性是细胞增殖时，可以通过例如如下方法进行检测：制备表达PKIB或NAALADL2多肽的细胞，在测试化合物的存在下培养细胞，确定细胞增殖速度，测量细胞周期等，以及通过测量集落形成活性，例如图3C和4C所示。“抑制生物活性”在本文中定义为，与不存在该化合物时相比，PKIB或NAALADL2的生物活性优选地至少被抑制10％，更优选地，至少抑制25％、50％或75％，最优选地，抑制90％。
当待在本方法中检测的生物活性是PKA-C细胞核积累时，可以通过例如如下方法进行检测，即通过制备表达PKIB多肽的细胞，在测试化合物的存在下培养细胞，并使用免疫细胞化学或western印迹确定细胞核中PKA-C蛋白的量，例如图5D和E所示。“抑制生物活性”在此处定义为，与不存在该化合物时相比，PKIB的生物活性优选地至少被抑制10％，更优选地，至少抑制25％、50％或75％，最优选的，被抑制90％。
在优选实施方案中，通过本发明方法筛选的测试化合物可以作为候选物，进行进一步筛选评估其治疗作用。
筛选可改变PKIB或NAALADL2表达的化合物
在本发明中，已显示利用siRNA降低PKIB或NAALADL2的表达可以抑制癌细胞增殖(图3、4)。因此，本发明提供了用于筛选可抑制PKIB或NAALADL2表达的作用剂的方法。抑制PKIB或NAALADL2表达的作用剂可用于抑制***癌细胞的增殖，因此可用于治疗或预防***癌。因此，本发明还提供了用于筛选可抑制***癌细胞增殖的作用剂的方法，以及筛选可用于治疗或预防***癌的作用剂的方法。在本发明的内容中，该筛选可以包括例如如下步骤：
a)使侯选化合物与表达PKIB或NAALADL2的细胞接触；和
b)选择与对照相比降低PKIB或NAALADL2的表达水平的候选化合物。
本发明的方法在下文将有更详细的记载。
表达PKIB或NAALADL2的细胞包括，例如，从***癌建立的细胞系；这些细胞可用于上文所述的本发明的筛选(例如LNCaP、22Rv1、PC-3、DU-145和C4-2B)。表达水平可以通过本领域技术人员众所周知的方法进行评估，例如RT-PCR、Northern印迹测定、Western印迹测定、免疫染色和流式细胞术分析。“表达水平降低”在本文中定义为，与不存在该化合物时相比，PKIB或NAALADL2的表达水平优选地被降低至少10％，更优选地，至水平少降低25％、50％或75％，最优选地，水平降低95％。本文的化合物包括化学化合物(chemical compound)、双链核苷酸等。双链核苷酸的制备如前述的记载。在筛选方法中，降低PKIB或NAALADL2表达水平的化合物可以被选择来作为用于治疗或预防***癌的候选作用剂。
或者，本发明的筛选方法可包括如下步骤：
a)使侯选化合物与导入了如下载体的细胞接触，该载体包括PKIB或NAALADL2的转录调节区和在该转录调节区控制下表达的报告基因；
b)测量所述报告基因的表达或活性；和
c)选择可降低所述报告基因表达或活性的候选化合物。
合适的报告基因和宿主细胞是本领域众所周知的。例如，报告基因是荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、香菇珊瑚(Discosoma sp.)红色荧光蛋白(DsRed)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、lacZ和β-葡糖苷酸酶(GUS)，而宿主细胞是COS7、HEK293、HeLa等。筛选所需的报告构建体可以通过使报告基因序列与PKIB或NAALADL2的转录调节区相连接来加以制备。这里，PKIB或NAALADL2的转录调节区是从起始密码子到上游至少500bp的区域，优选地是到上游1000bp，更优选地是到上游5000或10000bp的区域。含有转录调节区的核苷酸区段可以从基因组文库分离，或者可以通过PCR扩增。用于鉴定转录调节区的方法以及测定规程是众所周知的(Molecular Cloningthird edition chapter 17，2001，Cold Springs Harbor Laboratory Press)。将含有所述报告构建体的载体转染到宿主细胞，并通过本领域众所周知的方法(例如使用照度计(luminometer)、吸收光谱仪、流式细胞仪等)检测报告基因的表达或活性。“表达或活性降低”在本文中定义为，与不存在该化合物时相比，报告基因的表达或活性优选地被降低至少10％，更优选地，至少降低25％、50％或75％，最优选地，降低95％。
在优选实施方案中，通过本发明方法选出的测试化合物可以作为候选物，用于进一步筛选以评估其治疗作用。
筛选降低PKIB和PKA-C间结合的化合物
在本发明中，PKIB与PKA-C间的相互作用通过免疫沉淀显示(图5C)。而且，PKA-C在没有PKIB时从细胞核外排到细胞质中(图5D)。本发明提供了用于筛选可抑制PKIB和PKA-C间结合的化合物的方法。可抑制PKIB和PKA-C间结合的化合物可用于抑制***癌细胞的增殖，从而可用于治疗或预防***癌。因此，本发明还提供了用于筛选可抑制***癌细胞增殖的化合物的方法，和用于筛选可用于治疗或预防***癌的化合物的方法。
更具体地，该方法包括如下步骤：
a)在测试化合物的存在下，使PKIB多肽或其功能等价物与PKA-C多肽或其功能等价物接触；
b)检测多肽间的结合；和
c)选择可抑制多肽间结合的测试化合物。
这里，“PKIB多肽的功能等价物”是指包含PKA-C结合域氨基酸序列；假底物基序(RRNA：SEQ ID NO：31)的多肽。类似地，“PKA-C多肽的功能等价物”是指包含PKIB结合域氨基酸序列的多肽。
本发明的方法将在下文有更详细的记载。
作为筛选可抑制PKIB和PKA-C间结合的化合物的方法，可以使用本领域技术人员众所周知的许多方法。这些筛选可以作为体外测定***来实施。更具体地说，首先，使PKIB或PKA-C多肽与支持物结合，将另一多肽与测试化合物一起施加。接着，温育混合物，清洗，并检测和/或测量与支持物结合的另一多肽。潜在的候选化合物能够降低另一多肽的检测量(reduce the amount of detecting the other polypeptide)。这里，PKIB或PKA-C多肽不仅可以制备成天然蛋白质，还可以作为通过基因重组技术制备的重组蛋白加以制备。天然蛋白可以通过例如亲和色谱制备。另一方面，重组蛋白的制备可以通过培养用编码PKA-C的DNA转化的从而在其中表达该蛋白的细胞，然后回收该重组蛋白。
可用于结合蛋白的支持物的实例包括不溶性多糖，例如琼脂糖、纤维素和右旋糖酐；和合成树脂，例如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯和硅橡胶(silicon)；优选地，使用由上述材料制备的可商购的珠子和板(例如多孔板、生物传感器芯片等)。当使用珠子时，可以将它们填充到柱中。或者，磁珠的使用也是本领域已知的，借助磁珠能够容易地通过磁性分离珠子上结合的蛋白。
蛋白与支持物的结合可以根据常规方法进行，例如化学键合和物理吸附。或者，蛋白可以通过特异识别该蛋白的抗体与支持物结合。而且，蛋白与支持物的结合也可以通过抗生物素蛋白和生物素进行。蛋白间的结合在缓冲液中进行，缓冲液例如但不仅限于，磷酸盐缓冲液和Tris缓冲液，只要该缓冲液不抑制蛋白间的结合即可。
在本发明中，利用表面等离子体共振现象的生物传感器可用作检测或定量结合蛋白的装置。当使用这种生物传感器时，蛋白间的相互作用可以作为表面等离子体共振信号得以实时地观察，仅使用微量的多肽，并且无需标记(例如BIAcore，Pharmacia)。因此，使用生物传感器例如BIAcore来评估PKA-C和PKIB间的结合是有可能的。
或者，可以标记PKA-C或PKIB，利用多肽的标记来检测或测量结合活性。具体地，预标记其中一个多肽，然后使标记的多肽在测试化合物的存在下与另一多肽接触，经过清洗后，根据标记检测或测量结合的多肽。可用于在本发明中标记蛋白的标记物质有例如放射性同位素(例如3H、14C、32P、33P、35S、125I、131I)、酶(例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶)、荧光底物(例如异硫氰酸荧光素(FITC)、若丹明)和生物素/抗生物素蛋白。当用放射性同位素标记蛋白时，可以借助液体闪烁进行检测或测量。或者，对于用酶标记的蛋白，可以添加酶的底物，使用吸收测定仪检测底物的变化，例如颜色的产生，来检测或测量。此外，当使用荧光底物作为标记时，用荧光光度计检测或测量结合蛋白。
而且，PKA-C和PKIB间的结合还可以用针对PKA-C或PKIB的抗体进行检测或测量。例如，使固定在支持物上的PKA-C多肽与测试化合物和PKIB接触，然后温育并清洗混合物，然后可以用针对PKIB的抗体进行检测或测量。或者，可以将PKIB固定在支持物上，而使用针对PKA-C的抗体作为抗体。当在本筛选中使用抗体时，抗体优选地用上述标记物质的其中一种加以标记，并根据标记物质进行检测和测量。或者，可以用针对PKA-C或PKIB的抗体作为第一抗体，用标记底物标记的第二抗体进行检测。而且，在本发明筛选中与蛋白结合的抗体可以用蛋白G或蛋白A柱进行检测或测量。
或者，在本发明筛选方法的另一个实施方案中，可以使用利用细胞的双杂交***(“MATCHMAKER Two-Hybrid system”，“MammalianMATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit”，“MATCHMAKER one-Hybridsystem”(Clontech)；“HybriZAP Two-Hybrid Vector System”(Stratagene)；参考文献见“Dalton and Treisman，Cell 68：597-612(1992)”，“Fields and Sternglanz，Trends Genet 10：286-92(1994)”)。
在双杂交***中，例如，使PKA-C多肽与SRF结合区或GAL4结合区融合，并在酵母细胞中表达。使能结合PKA-C多肽的PKIB多肽与VP16或GAL4转录激活区融合，在测试化合物的存在下，也在酵母细胞中表达。或者，可以使PKIB多肽和SRF结合区或GAL4结合区融合，而使PKA-C多肽与VP16或GAL4转录激活区融合。两者的结合可激活报告基因，使阳性克隆可检测。作为报告基因，除了HIS3基因之外，还可以使用例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、荧光素酶基因等。
而且，本发明的筛选方法是检测PKA-C的细胞核定位，因为PKA-C在PKIB的存在下定位于细胞核，而在没有PKIB时定位于细胞质。例如，使表达PKA-C和PKIB的细胞均与测试化合物接触并清洗。细胞用例如70％乙醇或4％多聚甲醛固定，并用抗PKA-C抗体检测。当PKA-C基本上在细胞质内被检测到时，使用测试化合物预防***癌。这里，可通过本领域众所周知的方法在细胞中强制表达(force-expressed)PKA-C和PKIB。因此，使表达PKA-C和PKIB细胞均与测试化合物接触，并通过众所周知的方法制备细胞的细胞核提取物(例如使用Merck Bioscience生产的SubcellularProteoExtract Kit(S-PEK))。用western印迹测定检测细胞核提取物中PKA-C的量。
在优选实施方案中，通过本发明方法选出的测试化合物可以作为候选物，用于进一步评价其治疗作用。也就是说，上述筛选方法还包括如下步骤：
d)使步骤c)选出的侯选化合物与表达PKIB和PKA-C的细胞接触；和
e)选择与不存在该侯选化合物时检测到的表达水平相比，可降低Akt磷酸化水平的侯选化合物。
可以使用本领域技术人员众所周知的Akt磷酸化检测方法。例如，可以使用在下文实施例部分记载的western印迹分析。更具体地，在473位丝氨酸残基处检测Akt(SEQ ID NO：35)的磷酸化水平。
筛选可通过抑制PKIB功能降低Akt磷酸化的化合物
在本发明中，Akt磷酸化被PKIB siRNA降低(图7A)。而且，Akt磷酸化被PKIB和/或PKA-C的过表达所提高(图7B和C)。本发明提供了筛选可抑制PKIB和PKA-C间结合的化合物的方法。Akt磷酸化很可能在HRPC进展和其恶性表型中发挥关键作用(Sellers，W.R.&Sawyers，C.L.(2002)inSomatic Genetics of Prostate Cancer：Oncogenes and Tumor Suppressors ed.Kantoff，P.(Lippincott Williams&Wilkins，Philadelphia)，Wang Y，Kreisberg JI，Ghosh PM.，Curr Cancer Drug Targets.2007Sep；7(6)：591-604，Lin HK，Yeh S，Kang HY，Chang C，Proc Natl Acad Sci U S A 2001；98(13)：7200-5，Feldman BJ，Feldman D，Nat Rev Cancer 2001；1(1)：34-45，Malik SN，Brattain M，Ghosh PM，Troyer DA，Prihoda T，Bedolla R，Kreisberg JI.，Clin Cancer Res.2002；8(4)：1168-71)，因此我们预期，可通过抑制PKIB功能而降低Akt磷酸化的化合物可以抑制***癌细胞的增殖，从而可用于治疗或预防***癌。因此，本发明还提供了用于筛选可抑制***癌细胞增殖的化合物的方法，和用于筛选可用于治疗或预防***癌，优选地HRPC，的化合物的方法。
更具体地说，本发明包括如下步骤：
a)使候选化合物与表达PKIB和PKA-C的细胞接触；和
b)选择与不存在该侯选化合物时检测到的表达水平相比，可降低Akt磷酸化水平的候选化合物。
或者，通过本发明可以鉴定适于治疗和/或预防***癌的侯选化合物。这样的方法包括如下步骤：
a)在测试化合物的存在下，在适于PKIB磷酸化Akt的条件下，将PKIB或其功能等价物与Akt与PKA-C或其功能等价物一起温育，其中Akt是从下组中选出的多肽：
i.包含氨基酸序列SEQ ID NO：35(Akt)的多肽；
ii.包含氨基酸序列SEQ ID NO：35且其中替换、删除或***了一个或多个氨基酸的多肽，其中所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：35组成的多肽等价的生物活性；
iii.由在严格条件下与由核苷酸序列SEQ ID NO：36组成的多核苷酸杂交的多核苷酸所编码的多肽，其中该多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：35组成的多肽等价的生物活性；
b)检测Akt的磷酸化水平；
c)比较在步骤b)中测得的Akt磷酸化水平与对照水平；和
d)选择与对照水平相比，可降低Akt磷酸化水平的化合物。
在优选实施方案中，通过本发明方法选出的测试化合物可以作为候选物，用于进一步筛选评价其治疗作用。
优选地，Akt的磷酸化水平可以在氨基酸序列SEQ ID NO：35的473位丝氨酸残基或该多肽的同源位置进行检测。可以使用本领域技术人员周知的Akt磷酸化检测方法。例如，可以使用在下文实施例部分记载的western印迹分析。
在本发明的语境中，适于PKIB磷酸化Akt的条件可以通过在磷酸供体例如ATP的存在下温育Akt和PKIB及PKA-C来提供。适于PKIB磷酸化Akt的条件还包括培养表达PKIB、PKA-C和多肽的细胞。例如，所述细胞可以是携带有包含编码该多肽的多核苷酸的表达载体的转化细胞。在温育之后，可以用识别磷酸化Akt的抗体检测Akt的磷酸化水平。
在检测磷酸化Akt之前，可以将Akt与其它成分或Akt表达细胞的细胞裂解物分离。例如，可利用凝胶电泳将Akt与其余组分分离。或者，可以通过使Akt与具有抗Akt抗体的载体接触来捕获Akt。当使用标记的磷酸供体时，可以通过追踪该标记来检测Akt的磷酸化水平。例如，当放射性标记的ATP(例如32P-ATP)用作磷酸供体时，分离的Akt的放射活性与Akt的磷酸化水平相关。或者，可以使用特异识别磷酸化Akt而不识别非磷酸化Akt的抗体来检测磷酸化Akt。优选地，所述抗体识别在Ser-473残基处磷酸化的Akt。
用于制备与给定蛋白功能上等价的多肽的方法是本领域技术人员众所周知的，包括在蛋白中导入突变的已知方法。一般地说，已知蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白的功能(Mark DF et al.，Proc Natl AcadSci USA 1984，81：5662-6；Zoller MJ&Smith M，Nucleic Acids Res 1982，10：6487-500；Wang A et al.，Science 1984，224：1431-3；Dalbadie-McFarland G etal.，Proc Natl Acad Sci USA 1982，79：6409-13)。实际上，突变的或经过修饰的蛋白，具有通过在特定氨基酸序列中替换、删除、***和/或添加一个或多个氨基酸残基进行修饰的氨基酸序列的蛋白，已知可以保留原始的生物活性(Mark et al.，Proc Natl Acad Sci USA 81：5662-6(1984)；Zoller and Smith，Nucleic Acids Res 10：6487-500(1982)；Dalbadie-McFarland et al.，Proc NatlAcad Sci USA 79：6409-13(1982))。由此，本领域的技术人员将会理解，对氨基酸序列进行个别添加、删除、***或替换以改变单个氨基酸或少数氨基酸，或者被认为是“保守修饰”的那些修饰--其中蛋白质的改变的结果是产生具有相似功能的蛋白，这些都是本发明所预期的。
例如，本领域的技术人员能够通过在Akt、PKA-C或PKIB中的任一个内导入合适的突变来制备与这些蛋白功能上等价的多肽，例如使用定点诱变(Hashimoto-Gotoh et al.，Gene 152：271-5(1995)；Zoller and Smith，MethodsEnzymol 100：468-500(1983)；Kramer et al.，Nucleic Acids Res.12：9441-56(1984)；Kramer and Fritz，Methods Enzymol 154：350-67(1987)；Kunkel，ProcNatl Acad Sci USA 82：488-92(1985)；Kunkel TA，et al.，Methods Enzymol.1991；204：125-39.)。本发明的多肽包括这样的多肽，其具有Akt、PKA-C或PKIB的氨基酸序列，且其中一个或多个氨基酸被突变，其中所得的突变多肽分别与Akt、PKA-C或PKIB的功能等价。只要保留蛋白的活性，氨基酸突变的数目没有具体限制。然而，一般优选地改变氨基酸序列的5％或者更少。因此，在优选实施方案中，在这样的变体中要突变的氨基酸的数目一般为30个氨基酸或者更少，典型地20个氨基酸或者更少，更典型地10个氨基酸或者更少，优选地5-6个氨基酸或者更少，更优选地1-3个氨基酸。
要突变的氨基酸残基优选地被突变成氨基酸侧链性质保守的不同氨基酸(这个过程称作保守氨基酸替换)。氨基酸侧链的性质的实例包括疏水氨基酸(A，I，L，M，F，P，W，Y，V)，亲水氨基酸(R，D，N，C，E，Q，G，H，K，S，T)，和具有如下共同官能团或特征的侧链：脂肪族侧链(G，A，V，L，I，P)；含羟基侧链(S，T，Y)；含硫原子侧链(C，M)；含羧酸和酰胺侧链(D，N，E，Q)；含碱侧链(R，K，H)；和含芳香基侧链(H，F，Y，W)。注意，圆括号内的字母指示氨基酸的单字母编码。而且，提供功能相似氨基酸的保守替换表是本领域众所周知的。例如，下面8组中每一组含有的氨基酸彼此之间是保守替换：
1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和
8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(见例如Creighton，Proteins 1984).
这样的保守修饰的多肽包含在本Akt、PKA-C或PKIB蛋白内。然而，本发明不仅限于此，Akt、PKA-C和PKIB蛋白包含非保守修饰，只要保留原始蛋白的结合活性即可。而且，修饰蛋白不排除多态变异体、种间同源物和由这些蛋白的等位基因编码的蛋白。
向Akt、PKA-C或PKIB氨基酸序列添加了一个或多个氨基酸残基的多肽的实例是分别含有Akt、PKA-C或PKIB的融合蛋白。因此，本发明包括Akt、PKA-C或PKIB与其它肽或蛋白的融合蛋白，也就是融合物。融合蛋白可以通过本领域技术人员众所周知的技术加以制备，例如使编码Akt、PKA-C或PKIB的DNA与编码其它肽或蛋白的DNA相连，并使阅读框匹配，将融合DNA***到表达载体内，并在宿主中表达它。与本发明蛋白融合的肽或蛋白没有限制。
可用作与Akt、PKA-C或PKIB蛋白融合的肽的已知肽包括，例如，FLAG(Hopp TP et al.，Biotechnology 19886：1204-10)，含6个His(组氨酸)残基的6xHis，10xHis，流感凝集素(HA)，人c-myc片段，VSP-GP片段，p18HIV片段，T7-标签，HSV-标签，E-标签，SV40T抗原片段，lck标签，α-微管蛋白片段，B-标签，蛋白C片段等。可以和本发明蛋白融合的蛋白的实例包括GST(谷胱甘肽-S转移酶)、流感凝集素(HA)、免疫球蛋白恒定区、β-半乳糖苷酶、MBP(麦芽糖结合蛋白)等。
融合蛋白的制备可以通过使编码上面讨论的融合肽或蛋白的商业可得DNA与编码Akt、PKA-C或PKIB蛋白的DNA融合，并表达所制备的融合DNA。
另一种本领域已知可分离功能等价多肽的方法涉及，例如，杂交技术(Sambrook et al.，Molecular Cloning 2nd ed.9.47-9.58，Cold Spring Harbor Lab.Press(1989))。本领域的技术人员能够容易地从分离的DNA分离与Akt(即SEQ ID NO：36)、PKA-C或PKIB具有高同源性的DNA，并从所述分离的DNA分离出与Akt、PKA-C或PKIB功能上等价的多肽。本发明的蛋白包括由与编码Akt、PKA-C或PKIB的DNA序列的全部或一部分杂交的DNA编码，并且与Akt、PKA-C或PKIB功能上等价的蛋白。这些多肽包括对应于人源蛋白的哺乳动物同源体(例如由猴、大鼠、家兔和牛基因编码的多肽)。在从动物分离与编码Akt、PKA-C或PKIB的DNA高度同源的DNA时，特别优选地使用***癌组织。
用于分离编码与人Akt、PKA-C或PKIB蛋白功能上等价的蛋白的DNA的杂交条件可以由本领域技术人员常规地加以选择。术语“严格(杂交)条件”是指这样的条件，在该条件下核酸分子与其靶序列杂交，典型地在核酸复合体混合物中，但检测不到与其它序列杂交。严格条件是序列依赖的，并且在不同环境下会不同。序列越长，特异杂交的温度越高。Tijssen，Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes，“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays”(1993)提供了关于核酸杂交的详细指导。在本发明的语境中，合适的杂交条件可以由本领域的技术人员常规地加以选择。
一般地说，严格条件被选择为在限定的离子强度pH下，比特定序列的熔点(Tm)低大约5-10℃。Tm是如下的温度(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)，其中50％的与靶分子互补的探针在平衡状态下与靶序列杂交(因为靶序列过量存在，所以在Tm下，在平衡时50％的探针被占据)。严格条件还可以通过添加去稳定剂(例如甲酰胺)来实现。为了选择性或特异性的杂交，阳性信号优选地至少是背景的两倍，更优选地是背景杂交的10倍。
示例性的严格杂交条件包括如下：50％甲酰胺、5x SSC、和1％SDS，在42℃温育，或5x SSC、1％SDS、在65℃温育，用0.2x SSC和0.1％SDS在50℃下清洗。合适的杂交条件还可以包括使用“快速杂交缓冲液(Rapid-hyb buffer)”(Amersham LIFE SCIENCE)在68℃预杂交30分钟或者更长时间，添加标记的探针，在68℃温育1h或更长时间。
清洗步骤可以在例如低严格条件下进行。因此，示例性的低严格条件可以包括例如42℃、2x SSC、0.1％SDS、或优选地50℃、2x SSC、0.1％SDS。或者，示例性的高严格条件包括例如在室温下用2x SSC、0.01％SDS清洗三次各20分钟，然后在37℃用1x SSC、0.1％SDS清洗三次各20分钟，和在50℃下用1x SSC、0.1％SDS清洗两次各20分钟。然而，多种因素，例如温度和盐浓度，会影响杂交的严格度，本领域的技术人员能够合适地选择可实现所需严格度的因素。
优选地，功能上等价多肽的氨基酸序列与本文公开的天然Akt、PKA-C或PKIB序列具有至少大约80％的同源性(也称作序列同一性)，更优选地，至少大约85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同源性。多肽的同源性可以通过如下文献中的算法加以确定：“Wilbur and Lipman，Proc NatlAcad Sci USA 80：726-30(1983)”。在其它实施方案中，功能上等价多肽可以由在严格条件下(如下文定义)与编码这种功能上等价多肽的多核苷酸杂交的多核苷酸编码。
除了杂交，可以使用基因扩增方法，例如聚合酶链式反应(PCR)方法，使用根据Akt或PKIB的序列信息合成的引物分离编码与Akt、PKA-C或PKIB功能上等价的多肽的DNA。
可用于本发明语境下的Akt、PKA-C或PKIB功能上等价物在氨基酸序列、分子量、等电点、是否存在糖链或形式方面可以有不同，这取决于用于产生它的细胞或宿主或者所使用的纯化方法。然而，只要它是Akt、PKA-C或PKIB多肽的功能上等价物，就包含在本发明的范围内。
筛选与NAALADL2结合的抗体
NAALADL2是一种新的II型膜蛋白，属于谷氨酸羧肽酶II(GCPII)家族。著名的***癌标记--***特异膜抗原(PSMA)，也属于GCPII家族(Rajasekaran AK et al.，Am J Physiol Cell Physiol 2005288：C975-81.和Murphy GP et al.，Prostate 200042：145-9.)。NAALADL2显示与PSMA同源，具有一个跨膜区，并定位在细胞质膜上(图5B)。PSMA是一种FDA批准的***癌显像剂--111In标记的7E11单克隆抗体(Prostascint，Cytogen，Princeton，NJ)的靶标，而且PSMA被单克隆抗体如J591靶定，J591在接受临床试验，用于将显像剂或治疗剂特异递送到PSMA表达细胞(Murphy GP etal.，Prostate 200042：145-9.和Holmes EH，Expert Opin Investig Drugs 200110：511-9.)。因此，利用NAALADL2在细胞表面的结合能力作为指征进行筛选，可以鉴定用于诊断或预防***癌的抗NAALADL2抗体。该筛选方法的一个实施方案包括如下步骤：
a)使候选抗体与表达NAALADL2的细胞接触；
b)选择可结合细胞表面上的NAALADL2的测试抗体。
本发明的方法在下文将有更详细的记载。
或者，NAALADL2的推定胞外域是SEQ ID NO：32。因此，筛选在细胞外与NAALADL2结合的抗体的方法包括如下步骤：
a)使候选抗体与包含SEQ ID NO：32的多肽接触；
b)选择与该多肽结合的测试抗体。
通过检测NAALADL2表达细胞(例如***癌细胞)的亲和性来选择抗体或抗体片段或非抗体结合蛋白(在下文中描述)。通过用含有3％BSA的PBS在室温下处理30分钟，封闭与这些细胞的非特异结合。将细胞在室温下与候选抗体或抗体片段温育60分钟。用PBS清洗后，细胞在室温下用FITC偶联的第二抗体染色60分钟，并用荧光计进行检测。或者，可以使用利用表面等离子体共振现象的生物传感器作为检测或定量本发明中抗体或抗体片段的装置。在本发明中，选择能够检测细胞表面上的NAALADL2肽的抗体或抗体片段。
在优选实施方案中，通过本发明方法选出的测试化合物可以作为候选物，用于进一步筛选评估其治疗作用。
抗体
如本文所使用的，术语“抗体”意图包括可以和指定蛋白或其片段特异反应的免疫球蛋白或其片段。抗体可以包括人抗体、灵长源化(primatized)抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、人源化抗体、与其它蛋白或放射性标记融合的抗体和抗体片段。而且，本文中，抗体使用其最广泛的意义，具体地涵盖完整单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示期望的生物学活性即可。“抗体”指示所有类型(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。
本发明使用针对PKIB或NAALADL2的抗体。更优选地说，可以使用针对包含氨基酸序列SEQ ID NO：33或34的蛋白的抗体作为针对PKIB的抗体，并且可以使用针对包含氨基酸序列SEQ ID NO：32的蛋白的抗体作为针对NAALADL2的抗体。这些抗体将通过已知的方法提供。本文描述了用于产生根据本发明使用的抗体的示例技术。
(i)多克隆抗体
单克隆抗体优选地通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂在动物体内产生。可以使用双功能或衍生化试剂将相关抗原与在待免疫物种体内具有免疫原性的蛋白相偶联，所述具有免疫原性的蛋白例如钥孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂，双功能或衍生试剂例如马来酰亚胺苯甲酸硫代丁二酰亚胺酯(maleimidobenzoylsulfosuccinimide ester)(通过半胱氨酸残基偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOC12或R′N＝C＝NR，其中R和R’是不同的烷基。
用该抗原、免疫原性偶联物或衍生物免疫动物是通过，例如，组合100μg或5μg蛋白或偶联物(分别用于家兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂，并在皮内多点注射该溶液。一个月后，用1/5-1/10原始量的肽或偶联物与弗氏完全佐剂多点皮下注射来对动物加强免疫。7-14天后，对动物进行采血，并测定血清的抗体滴度。加强免疫动物，直至滴度达到高平台。优选地是，用于对动物进行加强免疫的是相同抗原的偶联物，但与不同的蛋白偶联和/或通过不同的交联剂偶联。
偶联物还可以在重组细胞培养物中作为蛋白融合物制备。另外，可以适当地使用凝集剂，例如明矾，来提高免疫响应。
(ii)单克隆抗体
单克隆抗体从基本上均质的抗体构成的群体获得，即构成该群体的单个抗体是相同的，只是可能存在少量的天然发生的突变。因此，修饰语“单克隆”是指抗体不是离散(discrete)抗体的混合物这一特征。
例如，单克隆抗体可以用杂交瘤方法制备，该方法首先在Kohler et al.，Nature，256：495(1975)中被记载，或者可以通过重组DNA方法制备(U.S.Patent No.4,816,567)。
在杂交瘤方法中，小鼠或其它合适的宿主动物，例如仓鼠，被如上文所述地免疫，从而引发出淋巴细胞，这些淋巴细胞产生或者能够产生特异结合用来进行免疫的蛋白的抗体。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后，用合适的融合剂，例如聚乙二醇，使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986))。
将这样制备的杂交瘤细胞接种并生长于合适的培养基中，其优选地含有一种或多种可抑制未融合的母骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果母骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HRPT)，则用于杂交瘤的培养基典型地可包含次黄嘌呤、氨甲喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质可阻止HGPRT缺陷细胞的生长。
优选的骨髓瘤细胞具有如下特征：融合效率高，支持所选抗体产生细胞稳定高水平产生抗体，并且对某种培养基例如HAT培养基敏感。其中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，例如从可以从Salk研究所细胞配送中心(Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego)，California USA获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤和可以从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，Manassas，Virginia，USA获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞衍生的细胞系。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也有报道用于产生人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。
对培养着杂交瘤细胞的培养基，测定其中针对抗原的单克隆抗体的产生。优选地，由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合试验加以确定，例如放射免疫试验(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA)。
单克隆抗体的结合亲和性可以通过例如Munson et al.，Anal.Biochem.，107：220(1980)的30Scatchard分析加以确定。
在鉴定出可产生具有期望特异性、亲和性和/或活性的抗体的杂交瘤细胞之后，可以通过有限稀释程序对克隆进行亚克隆，并通过常规方法来培育它们(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986))。用于此目的的合适培养基包括例如D-MEM或RPML-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可以在体内作为动物体内的腹水瘤培育。
通过常规的免疫球蛋白纯化程序，例如蛋白A-sepharose凝胶、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱，合适地将由亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水液或血清分离。
编码单克隆抗体的DNA可以用传统方法(例如通过使用能够特异结合编码鼠源抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地加以分离和测序。杂交瘤细胞是这类DNA的优选来源。一旦分离了DNA，即可将DNA置于表达载体内，然后将其转染进入宿主细胞，例如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞，或骨髓瘤细胞，这些细胞本身不会产生免疫球蛋白，从而在重组宿主细胞内合成单克隆抗体。关于在细菌体内重组表达编码抗体的DNA的综述文献见Skerra et al.，Curr.Opinion in Immunol.，5：256-262(1993)和Pluckthun，Immunol.Revs.，130：151-188(1992)。
另一种产生与PKIB或NAALADL2特异反应的抗体或抗体片段的方法，是用PKIB或NAALADL2蛋白或肽对在细菌体内表达的、编码免疫球蛋白基因或其部分的表达文库进行筛选。更优选地，可以使用包含氨基酸序列SEQ ID NO：33或34的PKIB片段作为PKIB的替代物，可以使用包含氨基酸序列SEQ ID NO：32的NAALADL2片段作为NAALADL2的替代物。例如，可以用噬菌体表达文库，在细菌内表达完整的Fab片段、VH区和Fv区。见例如Ward et al.，Nature 341：544-546(1989)；Huse et al.，Science 246：1275-1281(1989)；和McCafferty et al.，Nature 348：552-554(1990)。用例如PKIB肽、包含氨基酸序列SEQ ID NO：33或34的PKIB片段、NAALADL2肽或包含氨基酸序列SEQ ID NO：32的NAALADL2片段筛选这些文库，能够鉴定出与PKIB、PKIB片段、NAALADL2或NAALADL2片段反应的免疫球蛋白片段。或者，可以使用SCID-hu小鼠(可以从Genpharm获得)产生抗体或其片段。
在进一步的实施方案中，抗体或抗体片段可以从抗体噬菌体文库分离，抗体噬菌体文库用McCafferty et al.，Nature，348：552-554(1990)中记载的技术来产生。Clackson et al.，Nature，352：624-628(1991)和Marks et al.，J MoLBioL，222：581-597(1991)分别记载了使用噬菌体文库分离鼠源和人源抗体。随后出版物记载了通过链重排产生高亲和性(nM范围)的人抗体(Marks et al.，BiolTechnology，10：779-783(1992))，以及使用组合感染(combinatorialinfection)和体内重组作为构建超大噬菌体文库的策略(Waterhouse et al.，Nuc.Acids.Res.，21：2265-2266(1993))。因此，这些技术都是传统的单克隆抗体杂交瘤法分离单克隆抗体的切实可行的替代方式。
DNA还可以例如以下述方式进行修饰：针对编码序列，用人重链和轻链恒定域替换同源的鼠源序列(美国专利4,816,567；Morrison，et al.，Proc.Natl Acad.ScL USA，81：6851(1984))，或者将非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或部分与免疫球蛋白的编码序列共价连接。
典型地，用这些非免疫球蛋白多肽替换抗体的恒定域，或者用它们替换抗体的一个抗原结合位点的可变域而生成嵌合二价抗体，其包含一个对抗原特异的抗原结合位点，和另一个对不同抗原特异的抗原结合位点。
(iii)人源化抗体
用于将非人抗体人源化的方法在本领域中已有记载。优选地，人源化抗体中导入了一个或多个来自非人来源的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基经常称作“输入(import)”残基，通常取自某个“输入”可变域。人源化可以基本上按照Winter及其合作者的方法(Jones et al.，Nature，321：522-525(1986)；Reichmann et al.，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen et al.，Science，239：1534-1536(1988))来进行，用高变区序列替换人抗体的相应序列。因此，这些“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中完整人可变区的一小部分(substantially less than intact)被来自非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体典型的是人抗体中一些高变区残基(可能还有一些FR残基)被来自啮齿动物抗体中类似位置上的残基替代而得到的抗体。
用于制造人源化抗体的人可变区，包括轻链和重链，的选择对于减少抗原性是非常重要的。根据所谓的“最佳匹配(best-fit)”方法，用啮齿动物抗体的可变域的序列来筛选整个已知人可变区序列文库。然后，选择与啮齿动物序列最接近的人序列作为用于人源化抗体的人框架区(FR)(Suns et al.，J.Immunol.，151：2296(1993)；Chothia et al.，J.Mol.Biol，196：901(1987))。另一种方法使用来源于轻链或重链特定亚群中的所有人抗体之共有序列的特定框架区。同一框架可用于数种不同的人源化抗体(Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；Presta et al.，J.Immunol.，151：2623(1993))。
此外，人源化的抗体保留对抗原的高亲和性和其它有利的生物学性质是重要的。为了实现这一目标，根据优选的方法，人源化抗体的制备借助下述过程：使用亲本和人源化序列的三维模型来分析亲本序列和各种理论上的人源化产物。三维免疫球蛋白模型是常用的，而且本领域技术人员很熟悉它们。有可用的计算机程序来图解和显示选定的候选免疫球蛋白序列的可能三维构型结构。通过检查这些显示结果，人们可以分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即分析残基是否影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力。这样，可以选择FR残基，并与受体序列和输入序列组合，从而获得期望的抗体特性，例如增加对靶抗原的亲和性。一般地说，高变区残基直接而且最实质性地参与影响抗原的结合。
(iv)人抗体
除人源化之外，还可以生成人抗体。例如，现在有可能生产这样的转基因动物(例如小鼠)，它能够在被免疫时产生完全的人抗体谱(repertoire)，而没有内源免疫球蛋白产生。例如，已有记载，在嵌合和种系突变小鼠内纯合删除抗体重链连接区(JH)，可导致内源抗体的产生完全被抑制。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到这种种系的突变小鼠体内，可导致在抗原刺激时产生人抗体。见例如Jakobovits et al.，Proc.Mad.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits et al.，Nature，362：255-258(1993)；Bruggermann et al.，Year in immuno.，7：33(1993)；和美国专利5,591,669，5,589,369和5,545,807。
或者，噬菌体展示技术(McCafferty et al.，Nature 348：552-553(1990))可用于在体外从来自未被免疫的供体的免疫球蛋白可变(V)区基因谱(repertoire)产生人抗体和抗体片段。根据这种技术，将抗体V区基因阅读框架一致地(in-frame)克隆到丝状噬菌体(例如M13或fd)的大或小衣壳蛋白基因内，作为有功能的抗体片段在噬菌体颗粒的表面上展示。因为丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以根据抗体的功能性质进行选择也可以选出编码显示这些性质的抗体的基因。因此，噬菌体模拟B细胞的一些性质。噬菌体展示可以用多种形式进行，关于它们的综述，见例如Johnson，Kevin S.and Chiswell，David J.，Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)。有多种来源的V基因片段可用于噬菌体展示。
Clackson et al.，Nature，352：624-628(1991)从经免疫小鼠的脾脏来源的小型随机组合V基因文库分离了多种系列的抗噁唑酮抗体。可以从未被免疫的人供体构建V基因谱，并基本上按照下列文献中记载的技术分离针对多种系列抗原(包括自身抗原)的抗体：Marks et al.，J.Mol.Biol，222：581-597(1991)，或Griffith et al.，EMBO J.12：725-734(1993)。另见美国专利5,565,332和5,573,905。
人抗体也可以由体外活化的B细胞来产生(见美国专利205,567,610和5,229,275)。在共有的共同未决申请中记载了用SCID小鼠产生人抗体的一个优选手段。
(v)抗体片段
已经开发了各种技术用于产生抗体片段。传统上，这些片段是通过蛋白水解消化完整的抗体产生的(见例如Morimoto et al.，Journal ofBiochemical and Biophysical Methods 24：107-117(1992)和Brennan et al.，Science，229：81(1985))。然而，现在这些片段也可以由重组宿主细胞直接产生。例如，可以从上面讨论的抗体噬菌体文库分离抗体片段。或者，可以直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段，并加以化学偶联形成F(ab′)2片段(Carteret al.，Bio/Technology 10：163-167(1992))。根据另一种方法，F(ab′)2片段可以直接从重组宿主细胞分离。其它用于产生抗体片段的技术是技术人员容易想到的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。见WO93/16185；美国专利No.5,571,894；和美国专利No.5,587,458。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如在美国专利5,641,870中记载的。这些线性抗体片段可以是单特异性或双特异性的。
(vi)非抗体结合蛋白
术语“非抗体结合蛋白”或“非抗体配体”或“抗原结合蛋白”可互换使用，指使用非免疫球蛋白骨架的抗体模拟物，包括adnectins、avimers、单链多肽结合分子和类抗体结合肽模拟物，在下文中将更详细地进行讨论。
已经开发出了其它按照与抗体相似的方式靶定和结合靶标的化合物。这些“抗体模拟物”的一些使用非免疫球蛋白骨架作为抗体可变区的可替代蛋白框架。
例如，Ladner et al.(美国专利No.5,260,203)记载了单多肽链结合分子，其具有与抗体的聚集的、但分子水平上分离的轻链和重链可变区相似的结合特异性。单链结合分子同时含有抗体重链和轻链可变区的抗体结合位点，它们通过一段肽接头连接，并会折叠成与双肽抗体相似的结构。单链结合分子与传统的抗体相比显示有多种优势，包括尺寸更小、稳定性更高和更容易被修饰。
Ku等Proc Natl Acad Sci USA 92(14)：6552-6556(1995))公开了一种基于细胞色素b562的抗体替代物。Ku等(1995)制成了一个文库，其中细胞色素b562的两个环被随机化，并从中选择针对牛血清白蛋白的结合性。发现突变体们以与抗BSA抗体相似的方式选择性结合BSA。
Lipovsek等(美国专利6,818,418和7,115,396)公开了一种抗体模拟物，其特征是具有一个纤连蛋白或纤连蛋白样骨架和至少一个可变环。这些基于纤连蛋白的抗体模拟物称作Adnectins，它们显示出许多与天然或工程化抗体相同的特征，包括对任何靶配体的高亲和性和特异性。任何用于发展新的或改良的结合蛋白的技术均可用于这些抗体模拟物。
这些基于纤连蛋白的抗体模拟物的结构与IgG重链可变区的结构相似。因此，这些模拟物的抗原结合性质在性质上与亲和性上与天然抗体相似。而且，这些基于纤连蛋白的抗体模拟物与抗体和抗体片段相比还表现出某些优点。例如，这些抗体模拟物的天然折叠稳定性不依赖于二硫键，因此这些抗体模拟物在通常会破坏抗体的条件下仍然保持稳定。此外，因为这些基于纤连蛋白的抗体模拟物的结构与IgG重链的结构相似，所以可以在体外进行环随机化和重排处理，类似于抗体的体内亲和力成熟过程。
Beste等(Proc Natl Acad Sci USA 96(5)：1898-1903(1999))公开了一种基于脂笼蛋白骨架的抗体模拟物
Figure GPA00001078635800601
脂笼蛋白包括蛋白末端由4个超变环构成的β-桶。Beste(1999)将这些环进行随机突变，并以例如对荧光素的结合为条件进行选择。这些变异体显示对荧光素的特异性结合，其中一个变异体显示与抗-荧光素抗体相似的结合。进一步的分析显示，所有随机化位置均是可变的，表明
Figure GPA00001078635800602
可能适合于用作抗体的替代物。
Figure GPA00001078635800603
是小的单链肽，典型地为160-180个残基，与抗体相比具有多种优势，包括生产成本低、保存稳定性高和免疫反应小。
Hamilton等(美国专利No.5,770,380)公开了一种合成抗体模拟物，其使用杯芳烃(calixarene)刚性非肽有机骨架，骨架上搭接有多个可变肽环，作为结合位点。肽环相对于彼此均从杯芳烃的几何学上的同一侧突出。由于这种几何学构型，所有的环均可供结合，从而增加了与配体的结合亲和性。然而，与其它的抗体模拟物相比，基于杯芳烃的抗体模拟物不是纯粹由肽构成的，因此对蛋白酶攻击的敏感性降低。骨架也不是仅由肽、DNA或RNA构成，这意味着该抗体在极端环境条件下相对稳定，寿命较长。而且，因为基于杯芳烃的抗体模拟物相对较小，其产生免疫响应的可能性降低。
Murali等(Cell Mol Biol.49(2)：209-216(2003))讨论一种用于将抗体减小为更小的模拟肽的方法，他们称之为“类抗体结合模拟肽(antibody likebinding peptidomemetics)”(ABiP)，也可以作用抗体的替代物。
Silverman等(Nat Biotechnol.(2005)，23：1556-1561)公开了融合蛋白，它们是包含多个域的单链多肽，称作“avimers”。avimers是通过体外外显子重排和噬菌体展示从人细胞外受体域发展而来的，是一类在亲和性和对各种靶分子的特异性方面与抗体相似的结合蛋白。所得的多结构域蛋白可以包括多个独立的结合域，它们与单表位结合蛋白相比显示更高的亲和性(在某些情况下是亚纳摩尔级)和特异性。关于avimers构建和使用的更多细节参见例如美国专利申请公开Nos.20040175756，20050048512，20050053973，20050089932和20050221384。
除了非免疫球蛋白蛋白框架之外，包含RNA分子和非天然寡聚体(例如蛋白酶抑制剂、苯并二氮卓、嘌呤衍生物和β-转角模拟物)的化合物也可以模拟抗体的性质，所有这些均适用于本发明。
尽管测试剂文库的构建是本领域众所周知的，但在下文中，还是提供了关于鉴定测试剂和构建这些试剂文库用于本筛选方法的额外指导。
(vii)抗体偶联和其它修饰
本方法中使用的或者本文制造商文献中包含的抗体可以任意地与细胞毒性或治疗剂偶联。
本文也预期了抗体与一个或多个小分子毒素，如加利车霉素(calicheamicin)、美登木素(maytansine)(美国专利No.5,208,020)、trichothene、和CC1065，的偶联物。在本发明的一个优选实施方案中，抗体与一个或多个美登木素分子偶联(例如每个抗体分子与大约1-大约10个美登木素分子)。美登木素可以例如转变为May SS-Me，其可被还原成May-SH3，进而与经过修饰的抗体反应(Chari et al.Cancer Research 52：127-131(1992))，从而产生类美登木素生物碱(maytansinoid)-抗体偶联物。
或者，可以将抗体与一个或多个加利车霉素分子偶联。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度产生双链DNA断裂。可使用的加利车霉素的结构类似物包括但不限于γ1 I、α2 I、α3 I、N-乙酰基-γ1 I、PSAG和θI 1(Hinmanet al.，Cancer Research 53：3336-3342(1993)和Lode et al.，Cancer Research 58：2925-2928(1998))。
可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素(modeccin)A链、α-帚曲毒素(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca Americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒素(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(neomycin)和单端孢菌毒素(tricothecenes)。还可参见例如1993年10月28日公开的WO93/21232。
本发明进一步预期了与多种放射性同位素偶联的抗体。实例包括211At，131I，125I，90Y，186Re，188Re，153Sm，212Bi，32P和放射性同位素Lu。
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和胞毒剂的偶联物，诸如3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀酰亚氨基酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己胺-1-羧酸琥珀酰亚氨基酯、亚氨基硫烷(iminothiolane)(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸二甲基己二酰亚胺酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对重氮苯甲酰基)己二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta et al.，Science 238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与拮抗剂或抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO 94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、二甲基接头或含二硫化物接头(Chari et al.，Cancer Research 52：127-131(1992))。
或者，可以通过例如重组技术或肽合成制备包含抗体和细胞毒剂的融合蛋白。
在另外一个实施方案中，抗体可以和用于肿瘤预定位(pretargeting)的“受体”(例如链霉抗生物素蛋白)偶联，其中将抗体-受体偶联物施用给患者，随后用清除剂从循环中除去未结合的偶联物，然后施用与细胞毒剂(例如放射性核苷酸)偶联的“配体”(例如抗生物素蛋白)。
本发明的抗体还可以和前体药激活酶偶联，其将前体药物(例如肽酰化疗剂，见W081/01145)转变成活性抗癌药物。见例如WO 88/07378和美国专利No.4,975,278。
这些偶联物的酶组分包括任何能够作用于前体药的酶，这些酶将前体药转变成更有活性的细胞毒形式。
可用于本发明方法的酶包括但不限于：可用于将含磷酸盐/酯的前体药物转变为游离药物的碱性磷酸酶；可用于将含硫酸盐/酯的前体药物转变为游离药物的芳基硫酸酯酶；可用于将无毒5-氟胞嘧啶转变为抗癌药物5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；可用于将含肽的前体药物转变为游离药物的蛋白酶，诸如沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(诸如组织蛋白酶B和L)；可用于转化含D-氨基酸替代的前体药物的D-丙氨酰羧肽酶；可用于将糖基化前体药物转变为游离药物的碳水化合物切割酶类，诸如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；可用于将β-内酰胺衍生的药物转变为游离药物的β-内酰胺酶；及可用于将在其氨基氮处分别用苯氧乙酰基或苯乙酰基衍生的药物转变成游离药物的青霉素酰胺酶，诸如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。或者，可使用具有酶活性的抗体，本领域也称作“抗体酶”(abzymes)，来将本发明的前体药物转变为游离活性药物(参见例如Massey，Nature 328：457-458(1987))。可如本文所述制备抗体-抗体酶偶联物，用于将抗体酶投递至肿瘤细胞群。
可通过本领域众所周知的技术将本发明的酶与抗体共价结合，诸如使用上文讨论的异双功能交联剂。或者，可使用本领域众所周知的重组DNA技术构建包含与本发明酶的至少功能活性部分连接的抗体的至少抗原结合区的融合蛋白(参见例如Neuberger et al.，Nature 312：604-608(1984))。
本文还设想了抗体的其它修饰。例如，可将抗体与多种非蛋白质性质聚合物中的一种连接，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。
本文公开的抗体还可以被配制为脂质体。含有抗体的脂质体可通过本领域众所周知的方法加以制备，例如下列文献中所述：Epstein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：3688(1985)；Hwang et al.，Proc.Natl Acad.Sci.USA，77：4030(1980)；美国专利Nos.4,485,045和4,544,545；和1997年10月23日公开的W097/38731。美国专利No.5,013,556公开了具有更长循环时间的脂质体。
特别有用的脂质体可以通过反相蒸发法用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物来产生。将脂质体通过具有限定孔尺寸的滤膜挤出，产生具有期望直径的脂质体。本发明抗体的Fab’片段可以按照下列文献所述通过二硫键交换反应与脂质体偶联：Martin et al.J；Biol.Chem.257：286-288(1982)。脂质体中可以视需要包含化疗剂。见Gabizon et al.ANational Cancer Inst.81(19)1484(1989)。
还预期了本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，我们期望提高抗体的结合亲和性和/或其它生物学性质。通过在编码抗体的核酸中导入合适的核苷酸变化或通过肽合成制备抗体的氨基酸序列变异体。这些修饰包括，例如，从抗体氨基酸序列删除、和/或***、和/或替换残基。删除、***和替换的任意组合均可用于实现所得构建体，使所得的构建体具有期望的性质。氨基酸变化也可以改变抗体的翻译后处理，例如改变糖基化位点的数目或位置。
一种用于鉴定抗体中作为优选突变位置的某些残基或区域的有用方法称作“丙氨酸扫描突变”，，如Cunningham and Wells，Science 244：1081-1085(1989)所述。这里，鉴定了一个或一组靶残基(例如带电荷的残基，诸如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸)，并用中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)替代，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它变体，推敲那些对替代显示功能敏感性的氨基酸位置。因此，虽然引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，但是突变本身的性质不需要预先决定。例如，为了分析在指定位点处的突变的后果，在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描诱变或随机突变，并对所表达的抗体变体筛选所需活性。
氨基酸序列***包括氨基-和/或羧基-末端的融合，长度范围从一个残基至包含上百或更多残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的例子包括具有N-末端甲硫氨酰残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其它***变体包括在抗体的N-或C-末端融合酶或提高抗体血清半衰期的多肽。
另一类变体是氨基酸替代变体。这些变体在抗体分子中有至少一个氨基酸残基用不同残基替换。最感兴趣进行替代诱变的位点包括高变区或CDR，但也考虑了FR或Fc区改变。
对抗体生物学特性的实质性修饰通过选择在保持以下方面的效果上显著不同的替代来完成：(a)替代区域的多肽主链的结构，例如作为折叠片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。
天然发生的残基可以根据共有的侧链性质分成如下几组：
(1)疏水：正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；
(2)中性亲水：cys，ser，thr；
(3)酸性：asp，glu；
(4)碱性：asn，gln，his，lys，arg；
(5)影响链方向的残基：gly，pro；和
(6)芳香性：trp，tyr，phe.
非保守替换需要用这些组中其中一个的成员交换另一个组的成员。
任何不参与保持抗体的合适构象的半胱氨酸残基均可加以替换，一般是替换成丝氨酸，以提高分子的氧化稳定性，和防止异常交联。相反，可以向抗体添加半胱氨酸键，以提高其稳定性(特别是抗体是片段例如Fv片段的情况)。
特别优选的一类替代变体涉及替代亲本抗体(如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体将具有改进的生物学特性。产生此类替代变体的一种便利方法涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。简而言之，将数个高变区位点(例如6-7个位点)突变，在各个位点产生所有可能的氨基酸替代。如此产生的抗体变体以单价形式展示在丝状噬菌体颗粒上，作为与各个颗粒内包装的M13基因III产物的融合物。然后如本文所公开的对噬菌体展示的变体筛选其生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。或者/另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构，以鉴定抗体和抗原之间的接触点可能是有益的。所述接触残基及邻近残基是依照本文详述的技术进行替代的候选位点。一旦产生这样的变体，如本文所述对该组变体进行筛选，可选择在一种或多种相关测定法中具有优良特性的抗体用于进一步的开发。
抗体的另一类氨基酸变体改变了抗体的原始糖基化样式。改变意味着删除在抗体中发现的一个或多个碳水化合物模块，和/或添加抗体中不存在的一个或多个糖基化位点。
抗体的糖基化通常或是N-连接的或是O-连接的。N-连接指碳水化合物模块搭接于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是将碳水化合物模块酶促搭接于天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列其中任一的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指将糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一搭接于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
向抗体中添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列使其包含一个或多个上述三肽序列而便利的完成(对于N-连接的糖基化位点)。所述改变还可通过向原始抗体的序列中添加或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行(对于O-连接的糖基化位点)。
编码抗体氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域已知的多种方法制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然存在氨基酸序列变体的情况中)，或者通过对早期制备的变体或非变体型式的抗体进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变来加以制备。
理想的是修饰本发明中使用的抗体来改善效应物功能，例如增强抗体的抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可通过在抗体Fc区中引入一个或多个氨基酸替代来实现。或者/另外，可在Fc区中引入半胱氨酸残基，从而容许在该区中形成链间二硫键。如此产生的同二聚体抗体可具有改善的内在化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)。参见Caron et al.，J.Exp.Med.176：1191-1195(1992)和Shopes，B.，J.Immunol.148：2918-2922(1992)。
具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体还可使用如Wolff et al.，CancerResearch 53：2560-2565(1993)中描述的异双功能交联剂来制备。或者，抗体可改造成具有双重Fc区，由此可具有增强的补体溶解和ADCC能力。参见Stevenson et al.，Anti-Cancer Drug Design 3：219-230(1989)。
为了提高抗体的血清半衰期，可如例如美国专利5,739,277中所述在抗体(尤其是抗体片段)中加入补救受体结合表位。在用于本文时，术语“补救受体结合表位”指IgG分子(如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)Fc区中负责提高IgG分子体内血清半衰期的表位。
本发明的多个方面将在下面的实施例中进行描述，这些实施例并不意图限制由权利要求描述的本发明的范围。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员所普遍理解的相同的意思。尽管在实践或检验本发明时可以使用与本文所述方法和材料相似或等价的方法和材料，但是下文记载了合适的方法和材料。
本发明在下文的实施例中将进行进一步的描述，它们并不限制由权利要求描述的本发明的范围。
实施例
本发明在下文的实施例中将进行进一步的记载，它们并不限制由权利要求描述的本发明的范围。
[实施例1]通用方法
细胞系
COS7细胞和PC细胞系LNCaP、22Rv1、PC-3、DU-145和C4-2B从美国典型培养物保藏中心(ATCC、Rockville、MD)购买，LNCaP来源的HRPC细胞系C4-2B从ViroMed Laboratories(Minnetonka，MN)购买。传代超过30次的LNCaP被定义为LNCaP(HP)，其与传代次数低的LNCaP细胞在形态学上和基因表达模式方面有所不同。它们生长于Delbecco改良的Eagle培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，该培养基添加了10％胎牛血清(GeminiBio-Products，West Sacramento，CA)和1％抗生素/抗真菌剂溶液(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。将细胞保持在37℃5％CO2的湿润气氛中。
半定量RT-PCR
如前人所述地(Tamura K et al.，Cancer Res 200767：5117-25.)从冷冻PC组织中纯化PC细胞和正常***上皮细胞。在获得了患者知情同意的前提下，从正在进行***针吸活检、骨活检、TUR-P(经尿道***切除)和“温热”尸检的HRPC患者采取组织样品。同时，还从正在进行根治性***切除术的、未经治疗的可手术病例(untreated operable cases)获得未经激素处理的(hormone-
Figure GPA00001078635800671
)***癌(HNPC)样品，从已确认组织病理学上无明显***癌或PIN的良性***增生(BPH)患者和膀胱癌患者获得了正常的***上皮细胞(NPEC)。如前所述(Tamura K et al.，Cancer Res 200767：5117-25.)进行HRPC细胞、未经激素处理的***癌细胞和正常***上皮细胞的显微解剖。对来自这些样品的RNA进行两轮基于T7的RNA扩增(Epicentre Technologies，Madison，WI)，并随后合成单链cDNA。用Rneasy试剂盒(QIAGEN，Valencia，CA)根据制造商的推荐提取人HRPC细胞系的总RNA。提取的RNA用无RNA酶的DNA酶套装(QIAGEN)处理，然后利用d(T)12-18引物和Superscript II逆转录酶(Invitrogen)逆转录成单链cDNA。使用如下的引物序列：
β-肌动蛋白(ACTB)正向：TTGGCTTGACTCAGGATTTA  (SEQ ID NO.6)
β-肌动蛋白(ACTB)反向：ATGCTATCACCTCCCCTGTG  (SEQ ID NO.7)
PKIB正向：GGCACATACTAGAAGCAAAATACG  (SEQ ID NO.8)
PKIB反向：GATGGGCAAATCATTCTTGGTA  (SEQ ID NO.9)
NAALADL2正向：GAAAGCATCTCACATTGGTTTTC  (SEQ ID NO.10)
NAALADL2反向：GGGTTTCAAAGAGAAACTCTGCT  (SEQ ID NO.11)
NAALADL2-2正向：GAAGCAAAATGCCAGATGGT  (SEQ ID NO.12)
NAALADL2-2反向：TCCTGCACAGTGTTCTAGAAAGG  (SEQ ID NO.13)
该EST与NAALADL2基因的联系通过RT-PCR加以确认。确定RT-PCR的指数期，以容许对从相同反应产生的cDNA进行半定量比较。每个PCR体系包括98℃，30秒初始变性步骤，随后98℃10秒，55℃5秒，和72℃30秒进行22个循环(对于ACTB)，23个循环(对于PKIB，NAALADL2)，在GeneAmp PCR system 9600(PE Applied Biosystems，Foster，CA)上进行。
Northern印迹分析
使用Rneasy试剂盒(QIAGEN)从7种PC细胞系提取总RNA，并进行Northern印迹分析。用mRNA纯化试剂盒(GE Healthcare)根据制造商的方案纯化出mRNA。将1μg等份的来自PC细胞系以及从正常人心脏、肺、肝、肾、脑和***(BD Biosciences，Palo Alto，CA)分离的每种mRNA在1％变性琼脂糖凝胶上进行分离，并转移到尼龙膜上。261bp的PKIB特异性探针通过用上述的引物组进行PCR加以制备，706bp的NAALADL2特异性探针通过用如下的引物组进行PCR加以制备：正向5’-ccagtgcccagaaaccaata-3’(SEQ ID NO.14)和反向5’-tcaattcttcccatccaagaca-3’(SEQ ID NO.15)。根据Megaprime DNA标记***(GE bioscience，UK)的使用说明，与随机引发的α32P-dCTP-标记探针进行杂交。预杂交、杂交和清洗根据供应商的推荐进行。印迹用光增感屏在-80℃放射自显影7天。
小干扰RNA(siRNA)表达构建体和转染
为了敲低PKIB和NAALADL2在PC细胞中的表达，如前人所述地(Tamura K et al.，Cancer Res 200767：5117-25.)使用psiU6BX3.0载体表达针对靶基因的短发夹RNA。用于PKIB siRNA的合成寡核苷酸的靶序列如下：
si1；GCCCTAAGCAGCATGTGTA    (SEQ ID NO.16)，
si2；GCAGTAGGCACTTAAGCAT    (SEQ ID NO.17)
si3；GATGCAAAAGAGAAAGATG    (SEQ ID NO.18)
用于NAALADL2siRNA的合成寡核苷酸的靶序列如下：
si#690；GACTCAGTGGACCTCTTTG  (SEQ ID NO.19)
si#913；GTCATCGATGTGAGTTATG    (SEQ ID NO.20)
si#1328；GAGTCGTCAGCATGCAAGT(SEQ ID NO.21)
和siEGFP；GAAGCAGCACGACTTCTTC(SEQ ID NO.22)(作为阴性对照)。将PC细胞系22Rv1和LNCaP(HP)或C4-2B细胞铺布在10-cm盘或6孔板上，并使用FuGENE6(Roche)根据制造商的说明，用设计表达针对PKIB或NAALADL2的siRNA的质粒(8μg/盘，3μg/孔)进行转染。细胞用0.8mg/ml遗传霉素(Sigma-Aldrich)选择7天，然后收集细胞并分析对PKIB或NAALADL2表达的敲低作用。用上述引物对PKIB或NAALADL2进行RT-PCR。对于集落形成试验，将表达siRNA的转化体在含有遗传霉素的培养基内生长20天。用100％甲醇固定后，转化细胞用0.1％结晶紫-H20染色以评估集落形成。细胞生存力的定量使用细胞计数试剂盒-8(DOJINDO，Kumamoto，Japan)。在含有遗传霉素的培养基中培养20天后，添加终浓度为10％的溶液。在37℃温育2小时后，用酶标仪550(Bio-Rad，Hercules，CA)测量490nm吸光度，以630nm为参比。本发明人还合成了对应于si#690的RNA双链体：5’-GACUCAGUGGACCUCUUUGGG-3’(SEQ ID NO.23)和5’-CAAAGAGGUCCACUGAGUCUU-3’(SEQ ID NO.24)，或者阴性对照siRNA双链体(GCAGCACGACUUCTUUCAAGTT(SEQ ID NO.25)和CUUGAAGAAGUCGUGCUGCTT(SEQ ID NO.26))，将它们的分别转染进入另一种表达NAALADL2的PC细胞系：C4-2B细胞。
免疫细胞化学
通过PCR扩增编码PKIB或NAALADL2开放阅读框的cDNA，将PCR扩增产物克隆到pcDNA3.1(+)/myc-HisA载体(Invitrogen)或pIRES/HA(Clontech/BD Bioscience)中。用FuGENE6按照制造商推荐的程序(Roche)将质粒转染进入涂布在玻璃盖玻片(Becton Dickinson Labware，Franklin Lakes，NJ)上的COS7中。温育48小时后，用4％多聚甲醛固定细胞，并在室温下用溶于PBS中的0.1％Triton X-100处理1min使之通透化。用含有3％BSA的PBS在室温下处理30min，封闭非特异结合。用稀释于含1％BSA的PBS中的抗-Myc抗体(Santa Cruz)或抗-HA抗体(Sigma)在室温下温育细胞60min。用PBS清洗后，用FITC偶联第二抗体(Santa Cruz)在室温下对细胞染色60min。用PBS清洗后，用含有4’，6’-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)的VECTASHIELD(VECTOR Laboratories，Inc，Burlingame，CA)封固样品，并用光谱共聚焦扫描***(Leica，Bensheim，Germany)可视化。
PKIB与PKA-C间的相互作用
将PKIB-Myc和HA-PKA-C表达载体共转染进入22Rv1细胞，转染48小时后，用裂解缓冲液[50mM Tris-HCl(pH7.0)、250mM蔗糖、1mM DTT、10mM EDTA、1mM EGTA、5mM MgCl2]裂解这些细胞。细胞裂解物用抗-Myc抗体(Santa Cruz)或抗-HA抗体(Sigma)免疫沉淀，用抗-Myc抗体或抗-HA抗体对这些免疫沉淀物进行western印迹分析。
PKA-C定位
本发明人合成了对应于序列si1的RNA双链体(5’-GCCCUAAGCAGCAUGUGUAUA-3’(SEQ ID NO.27)和5’-UACACAUGCUGCUUAGGGCUU-3’(SEQ ID NO.28))，以更有效地敲低内源PKIB。用Lipofectamin 2000(Invitrogen)根据制造商的推荐方法将这些RNA双链体转染进入PC-3细胞。温育48小时后，用4％多聚甲醛固定细胞，并在室温下用溶于PBS中的0.1％Triton X-100通透化1min。用含有3％BSA的PBS在室温下处理30min，封闭非特异结合。用以1∶200的比例稀释于含1％BSA的PBS中的抗-PKA-C抗体(C-20，Santa Cruz)在室温下温育细胞60min。用PBS清洗后，用FITC偶联第二抗体(Santa Cruz)在室温下对细胞染色60min，并用光谱共聚焦扫描***可视化。为了分级细胞裂解物，用Lipofectamin 2000(Invitrogen)根据制造商的推荐方法将RNA双链体转染进入LNCaP(HP)细胞。温育48小时后，收集细胞，并用NE-PER细胞核和细胞质提取试剂(PIERCE)将这些细胞裂解物分级。用抗-PKA-C抗体和作为上样和细胞核分级对照的抗-核纤层蛋白B抗体(Calbiochem)，对30μg蛋白的分级的细胞裂解物进行western印迹。
PKIB过表达细胞的生成和体外/体内生长测定
通过PCR扩增了编码PKIB开放阅读框的cDNA，并将PCR扩增产物克隆到pIRES/HA(Clontech/BD Bioscience)中。用FuGENE6(Roche)根据制造商推荐的程序将质粒转染进入无PKIB的PC细胞系DU145。细胞群体用0.6mg/ml遗传霉素(Invitrogen)选择，然后通过有限稀释对形成克隆的DU145细胞进行亚克隆。通过RT-PCR如上所述地确认PKIB表达，建立了三个组成型表达PKIB的克隆。还建立了用空pIRES/HA载体转染的对照DU145细胞作为模拟细胞。使用细胞计数试剂盒-8(DOJINDO)测量这些已建立的克隆的生长曲线。
对于体内生长测定，将两个稳定克隆和两个模拟克隆的2×106个细胞分别接种在雄性裸鼠的右胁和左胁。
抗体生成和免疫组织化学
将两种来自人PKIB的肽(SARAGRRNALPDIQSSAATD(SEQ ID NO：33)和KEKDEKTTQDQLEKPQNEEK(SEQ ID NO：34))免疫接种到家兔体内，在亲和柱上对免疫血清进行纯化，其中亲和柱装填有通过基本方法与每种肽抗原偶联的Affi-Gel10活化亲和介质(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)的。PC组织的常规切片(Conventional section)从手术样品获得，HRPC组织通过尸检和TUR-P获得(Tamura et al.Cancer Res 67，5117-25，2007)。将切片在108℃的Dako Cytomation Target Retrieval Solution High pH(Dako，Carpinteria，CA)中处理15min，进行脱蜡和高压灭菌。在封闭内源过氧化物酶和蛋白质之后，将切片与抗-PKIB抗体(按1∶100稀释)在室温下温育60min。用PBS清洗后，用过氧化物酶标记的抗家兔免疫球蛋白(Envision kit，Dako)进行免疫检测。最后，用3，3’-二氨基联苯胺(Dako)对反应物进行显影。用苏木精进行复染。
Akt磷酸化
22Rv1，LNCaP或PC-3细胞如上面讨论地用对应于序列si1的PKIB寡siRNA或PKIB表达载体(pcDNA3.1/HA-PKIB)转染，在48小时或24小时后收集。用含有蛋白酶抑制剂(蛋白酶抑制剂合剂第III组；CALBIOCHEM)的RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl[pH 8.0]、150mM NaCl、1％NP-40、0.5％脱氧胆酸钠、0.1％十二烷基磺酸钠[SDS])裂解细胞。蛋白样品用SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离，并电印迹到PVDF转移膜(GE Healthcare Bio-sciences)上。将印迹与家兔单克隆抗-磷酸Akt1(Ser473)抗体(Cell signaling)、家兔单克隆抗-Akt1抗体(Cell signaling)或小鼠单克隆β-肌动蛋白(ACTB)抗体(Sigma)温育。蛋白条带通过增强化学发光(ECL)western印迹检测试剂(GE HealthcareBio-sciences)可视化。
基质胶(Matrigel)侵袭测定
用表达PKIB的质粒(pcDNA3.1/HA-PKIB)或用模拟质粒转染的NIH3T3细胞在含10％FBS的DMEM中生长至接近汇合。通过胰蛋白酶消化收集细胞，用未添加血清或蛋白酶抑制剂的DMEM清洗，并以5×105/ml的浓度悬浮在DMEM中。在制备细胞悬液之前，将基质胶基质(Becton DickinsonLabware)的干燥层用DMEM在室温下复水2小时。向每个下部小室(lowerchamber)中添加含有10％FBS的DMEM(0.75ml)；侵袭通过人工基膜(Matrigel)的细胞如上所述地固定，并用吉姆萨染色。
[实施例2]在PC细胞中PKIB和NAALADL2的过表达
在通过HRPC细胞的全基因组范围cDNA微阵列分析筛选出的数十种反式激活基因中(Tamura K et al.，Cancer Res 200767：5117-25.)，本发明关注PKIB和NAALDL2。在9个显微解剖的HRPC细胞群体中的5个内通过RT-PCR确认有PKIB过表达(图1A)，在9个显微解剖的HRPC细胞群体中的5个内确认有NAALADL2过表达(图2A)。
这两个基因在正常器官，包括心脏、肺、肝和肾中的表达微弱，与激素敏感型或未处理型PC细胞相比，HRPC细胞显示这两个基因有更高表达。使用PKIB的cDNA片段作为探针进行Northern印迹分析，在胎盘和PC细胞系中特异地鉴定出了一个大约1.3kb的转录本，但是在任何其它器官中，包括肺、心、肝、肾和脑，没有观察到表达(图1B)。使用NAALADL2的cDNA片段作为探针进行Northern印迹分析，在三个PC细胞系中特异性地鉴定出了大约10kb、6kb和5kb的条带，但是在任何其它器官中，包括肺、心、肝、肾和脑，没有观察到表达(图2B)。
数据库分析和跨NAALADL2编码区的RT-PCR提示，这三个条带反映了3’UTR的变异。制成了特异针对人PKIB的多克隆抗体，并且为了确认PKIB蛋白在PC细胞中的表达，用41个临床PC组织，包括32个激素敏感型或未经激素处理型的PC和9个HRPC，进行了免疫组织化学分析。如Northern印迹分析和RT-PCR分析所示，PIN(图1C)和正常***上皮细胞(图1D，用N表示)显示微弱的PKIB染色(+)，10/32(31％)的未经激素处理型PC也显示微弱或无PKIB染色(+)(图1D)。另一方面，22/32(69％)的未经激素处理型PC(图1E)和全部6个HRPC(图1F)显示PKIB强阳性(++或+++)，这与RT-PCR分析的结果是一致的。而且，全部(9/9)Gleason等级5级的未经激素处理型PC(图1E)以及HRPC都显示PKIB强阳性，并且PKIB表达与Gleason等级强烈相关(表1，卡方检验，P＝1.35×10-6)，提示PKIB表达可以指示PC的恶性表型和不良预后。
表1在临床PC组织中PKIB表达与Gleason分数(GS)相关
Figure GPA00001078635800731
(+++相对其它：P＝1.35×10-6)
[实施例3]PC细胞系中siRNA敲低PKIB
为了研究PKIB异常表达的潜在促生长作用构建了数个siRNA表达载体，以检查它们对表达PKIB的PC细胞系22Rv1和LNCaP(HP)细胞的敲低作用。当si1和si2构建体被转染到22Rv1细胞(左)和LNCaP(HP)细胞(右)时，通过半定量RT-PCR观察到了显著的敲低效果，但是#3si和阴性siRNA构建体siEGFP没有(图3A)。在含有遗传霉素的培养基中选择之后，MTT测定(图3B)和克隆形成测定(图3C)证明，在22Rv1细胞(左)和LNCaP(HP)细胞(右)中导入si1和si2可显著降低其细胞生长和生存力，而其它不影响PKIB表达的siRNA则不会影响细胞生长，表明PKIB很可能在PC细胞生存力中发挥重要作用。
[实施例4]PC细胞系中通过siRNA敲低NAALADL2
为了研究NAALADL2异常表达的潜在促生长作用，构建了数个siRNA表达载体，以检查它们对表达NAALADL2的PC细胞系--22Rv1细胞的敲低作用。当si#690构建体被转染到22Rv1细胞时，通过半定量RT-PCR观察到了显著的敲低效果，但是其它构建体没有(图4A)。在含有遗传霉素的培养基中选择14天之后，MTT测定(图4B)和克隆形成测定(图4C)证明，在22Rv1细胞中导入si#690可急剧降低其细胞生长和生存力，而其它没有显示对NAALADL2表达的敲低效果的siRNA则没有影响细胞生长，这表明NAALADL2很可能在癌细胞生存力中发挥重要作用。将对应于si#690的合成RNA双链体或阴性对照siRNA双链体转染进入另一个NAALADL2表达PC细胞系C4-2B细胞。RT-PCR显示，si#690RNA双链体明显地敲低了内源NAALADL2在C4-2B细胞中的表达(图4D)，并且MTT测定证明si#690RNA双链体还能抑制C4-2B细胞的生长(图4E)。
[实施例5]PKIB和NAALADL2蛋白的亚细胞定位
使用构建的哺乳动物表达载体表达带标签的全长PKIB和NAALADL2蛋白，用抗-标签抗体通过免疫细胞化学研究它们的亚细胞定位。如图5所示，外源PKIB定位于细胞质(图5A)，而外源NAALADL2蛋白定位于细胞膜(图5B)。NAALADL2具有一个跨膜，被预测作为II型膜蛋白定位于质膜。我们的数据支持这一点，因此NAALADL2蛋白很可能是II型膜蛋白。
[实施例5]PKIB与PKA-C的相互作用，和敲低PKIB所致的PKA-C转位
PKIB属于PKI (蛋白激酶A抑制剂)家族，并且PKIA能够敲低蛋白激酶A催化亚基(PKA-C)的激酶活性，并通过其假底物基序(RRNA；SEQ IDNO：31)与PKA-C直接结合从而将PKA-C从细胞核外排到细胞质(Glass DBet al.，J Biol Chem 1986261：12166-71.和Wen W et al.，J Biol Chem 1994269：32214-20.)。PKIB也具有假底物基序(RRNA)，但其抑制活性比PKIA小得多(Gamm DM et al.，J Biol Chem 1995270：7227-32.)，并且其在细胞中转位PKA-C的活性未知。为了研究PKIB是否参与PKA-C定位，首先验证PKIB与PKA-C间的直接相互作用。将PKIB-Myc和HA-PKA-C表达载体共转染22Rv1细胞，通过每种标签抗体对它们的细胞裂解物进行免疫沉淀。图5C显示，PKIB-Myc与PKA-C免疫共沉淀，反之亦然，表明PKIB与PKA-C间有直接相互作用。
接着，通过免疫细胞化学分析和细胞分级检查在敲低了PKIB的PC-3细胞或LNCaP(HP)细胞中内源PKA-C的亚细胞定位。免疫细胞化学分析观察到，当用对照siRNA转染PC-3细胞时，大多数PKA-C定位于细胞质，一些PKA-C蛋白细胞位于细胞核(图5D，左)。另一方面，当在PC-3细胞中用siRNA敲低内源PKIB时，免疫细胞化学分析显示在细胞核中没有或者仅有非常小的PKA-C信号(图5D，右)。在另一种PKIB表达PC细胞系LNCaP(HP)细胞中观察到了相同的现象。为了更加定量地分析细胞核PKA-C，对用PKIB siRNA处理过的LNCaP(HP)细胞的裂解物进行分级。
如图5E所示，与对照siRNA相比，PKA-C在细胞核中的量在PKIB敲低中被明显降低，而PKA-C在细胞质中的量在PKIB敲低中则有微小增加。这些发现暗示，PKIB能够帮助PKA-C进入细胞核，或者抑制PKA-C从细胞核外排，这与PKIA的细胞核外排功能不同。
[实施例7]PKIB过表达促进PC细胞生长
为了研究PKIB的致癌功能，从DU145细胞(其不表达或仅表达很少量内源PKIB)建立了三个组成性表达外源PKIB的克隆，将这些克隆的生长与模拟DU145细胞进行比较。如图所示，所有三个克隆均组成性表达外源PKIB(图6A，图6B)，并且它们在体外(图6C)和体内(图6D)比模拟细胞生长得更快，提示PKIB在***癌中的促生长作用。如本免疫组织化学分析所示，PKIB过表达与高Gleason分数强相关，这表明PKIB可能对***癌细胞的恶性和侵袭潜能有贡献。然后，通过基质胶侵袭测定考察了PKIB在细胞侵袭中的可能作用。如图6E所示，用PKIB表达载体转染的NIH3T3细胞与用模拟载体转染的细胞相比，显著增强了其透过基质胶的迁移。
[实施例8]PKIB参与PC内的Akt磷酸化
许多报道提示，PTEN的功能丧失和Akt的激活与***癌的进展显著相关，并且PTEN-PI3K-Akt途径很可能在HRPC进展和其恶性表型中发挥关键作用(Sellers，W.R.&Sawyers，C.L.(2002)，《Somatic Genetics ofProstate Cancer：Oncogenes and Tumor Suppressors》Kantoff，P.编辑(Lippincott Williams&Wilkins，Philadelphia)，Wang Y，Kreisberg JI，Ghosh PM.，Curr Cancer Drug Targets.2007Sep；7(6)：591-604，Lin HK，Yeh S，Kang HY，Chang C，Proc Natl Acad Sci U S A 2001；98(13)：7200-5，Feldman BJ，FeldmanD，Nat Rev Cancer 2001；1(1)：34-45，Malik SN，Brattain M，Ghosh PM，TroyerDA，Prihoda T，Bedolla R，Kreisberg JI.，Clin Cancer Res.2002；8(4)：1168-71)。于是，我们研究了PKIB是否能够影响Akt磷酸化。首先，用对应于si1的RNA双链体敲低PKIB在PC细胞系(LNCaP和PC-3)中的表达，通过western印迹分析检查Akt在Ser 473位的Akt磷酸化。RNA双链体对PKIB的敲低得到了RT-PCR的验证(数据未显示)。结果，PKIB敲低显著影响了PC细胞中的Akt磷酸化(图7A)。而且，如图7B所示，还观察到，PKIB在PC细胞中的过表达显著提高Akt在Ser473位的磷酸化。结果证明，PKIB直接相互作用于PKA-C激酶，并可能修饰其功能，并且已经确认，PKA-C激酶过表达也会提高Akt在Ser473的磷酸化(图7A)。这些发现提示，PKIB可能参与PC细胞中的Akt磷酸化(Ser473)，可能是通过修饰PKA-C激酶的功能。
接着，如图7B所示，我们观察到，PKIB在PC细胞中的过表达可提高Akt磷酸化。结果证明PKIB与PKA-C激酶直接相互作用，并可能修饰后者的功能，并且已经确认，PKA-C激酶过表达也会提高Akt磷酸化(图7C)。这些发现提示，PKIB可能参与Akt磷酸化，可能是通过修饰PKA-C激酶。
此外，为了确认Akt Ser473是否直接被PKA-C和/或PKIB磷酸化，使用重组PKIB、PKA-C激酶和Akt蛋白进行体外激酶测定。如图7D所示，当PKA-C激酶与重组Akt反应时磷酸化Ser473特异抗体可检测到磷酸化的Akt，而且PKIB的添加显著提高了Akt(Ser473)的磷酸化水平。这提示，PKA-C激酶和PKIB可以直接并且有效地磷酸化Akt Ser473，这有助于PC细胞的生长促进和进展。
[实施例9]PC组织中的Akt磷酸化和PKIB过表达
最后，在临床PC组织中检查PKIB表达与Akt Ser473磷酸化的关联。图8显示了代表性的PC组织图片，比较PC组织面对面切片(face-on-faceslide)中PKIB的染色模式和pAkt(Ser473)的染色模式，表明在该PC组织中PKIB表达和Akt磷酸化具有相关性。表2总结了临床PC组织中PKIB表达与Akt磷酸化间的相关性(P＝0.0156，卡方检验)。
表2临床组织中PKIB表达与Akt Ser473磷酸化间的关联
Figure GPA00001078635800761
(P＝0.0156，卡方检验)
讨论
在本发明中，用临床HRPC细胞的全基因组范围基因表达谱分析鉴定了两种***癌--特别是激素难治性***癌--的分子靶标。***癌显示相对良好的预后，激素耗竭疗法(hormone depletion therapy)在大多数复发或晚期PC中有效。但是一旦出现HRPC细胞，PC患者护理的选项就非常少了。结果，现有技术已经认识到，需要为HRPC患者鉴定新的分子靶标，并通过靶定这些新分子开发HRPC的新疗法。
PKIB属于PKI(蛋白激酶A抑制剂)家族，PKIA能够抑制蛋白激酶A催化亚基(PKA-C)的激酶活性，并通过与PKA-C直接结合将PKA-C从细胞核外排到细胞质(Glass DB et al.，J Biol Chem 1986261：12166-71.和Wen Wet al.，J Biol Chem 1994269：32214-20.)。蛋白激酶A(PKA)、cAMP-依赖的蛋白激酶A，多被认为对于介导由cAMP引发的广泛的生理和病理作用和与G蛋白的偶联至关重要，有多种配体和受体***可激活PKA信号途径，并且其激活与细胞生长和分化的控制有关(Tasken K et al.，Physol Review200484：137-67.and Stork PJ et al.，Trends Cell Biol 200212：258-66.)。
在***癌中，有多个报道提示，它涉及不依赖雄激素的生长和神经内分泌性分化(Cox ME et al.，J Biol Chem 2000275：13812-8.)，还有人提出HRPC细胞的雄激素非依赖性生长中涉及了PKA途径和AR途径之间的对话(cross-talk)(Stork PJ et al.，Trends Cell Biol 200212：258-66.和Sadar MD，JBiol Chem 1999274：7777-83.)。
在本发明中，已经证明PKIB能够帮助PKA-C的细胞核定位并促进PC细胞生长，而不是像PKI家族成员那样抑制PKA-C活性或PKA途径。先前的报道提示，PKIB在体外具有一些PKA-C抑制活性，但是其Km比PKIA高得多，并且辅助PKA-C的细胞核转入或抑制其细胞核导出是PKIB在PC细胞中的主要功能。而且，PKIB与在CRPC的侵袭和恶性表型中发挥关键作用的Akt Ser473磷酸化强烈相关。
NAALADL2是一种新的II型膜蛋白，属于谷氨酸羧肽酶II(GCPII)家族。GCPII的***形式，称作***特异膜抗原(PSMA)，在***癌中表达，并且PSMA的表达水平增加与PC进展和HRPC相关(Rajasekaran AK et al.，Am J Physiol Cell Physiol 2005 288：C975-81.和Murphy GP et al.，Prostate200042：145-9.)。考虑到其与PSMA的同源性和其相似的表达模式，这种新型分子NAALADL2应当称作“PSMA2”。PSMA是一种FDA批准的***癌显像剂--111In-标记的7E 11单克隆抗体(Prostascint，Cytogen，Princeton，NJ)--的靶标，并且PSMA被单克隆抗体例如J591靶定，该抗体在临床试验中用于将成像剂或治疗剂特异递送到PSMA表达细胞(Murphy GP et al.，Prostate 200042：145-9.和Holmes EH，Expert Opin Investig Drugs 2001 10：511-9.)。
除了充当肿瘤标志物之外，PSMA具有GPC活性，其底物包括聚-γ-谷氨酸叶酸(Zhou J et al.，Nature Review Drug Disc 20054：1015-26.)。PSMA的酶活性可用于设计前体药物，其中药物的无活性谷氨酸化形式仅在表达PSMA的细胞中被选择性切割并由此激活(Denny WA et al.，Eur J Med Chem200136：577-95.)。然而，PSMA如何与***癌进程相关则完全未知，并且靶定PSMA功能或其自身活性的可能性也尚未知晓。NAALADL2在HRPC细胞中高表达，而其在正常成人器官中的表达则非常有限，如图2B所示。除了其作为肿瘤标记的限制性表达之外，它很可能与PC生存力或生长有关，这得到了siRNA实验的支持。因此，和肿瘤标志一样，针对PSMA2的特异单克隆抗体亦可用于通过阻断PSMA2活性进行PC治疗。
工业应用性
人基因PKIB和NAALADL2的表达在***癌中，特别是激素难治性***癌或去势抵抗性***癌，比正常器官显著提高。因此，这些基因可以方便地用作***癌诊断标记，借此所编码的蛋白可以用于***癌的诊断试验。
本发明人证明，细胞生长被特异靶定PKIB和NAALADL2基因的双链分子抑制。因此，这些新的双链分子可用于开发抗癌药物。例如，阻断PKIB或NAALADL2蛋白表达或阻止其活性的试剂可应用为抗癌剂，特别是用于治疗***癌，尤其是激素难治性***癌或去势抵抗性***癌，的抗癌剂的治疗用途。
而且，无论是PKIB还是NAALADL2多肽均是开发抗癌药物的有用靶标。例如，与PKIB或NAALADL2结合、或阻断PKIB或NAALADL2的表达或阻止其活性、或者抑制PKIB与PKA-C结合的试剂，或者抗-NAALADL2抗体，可用作抗癌剂，特别是用于治疗***癌，尤其是激素难治性***癌或去势抵抗性***癌，的抗癌剂。
尽管本文对于本发明参考其具体的实施方案进行了详细的记载，但是本领域的技术人员显然可以想到，在不背离本发明精神和范围的前提下可以在其中进行各种改变和修饰。
序列表
<110>肿瘤疗法科学股份有限公司(ONCOTHERAPY SCIENCE，INC.)
 
<120>PKIB和NAALADL2用作***癌治疗和诊断的靶基因
 
<130>ONC-A0718P
 
<150>US 60/957,853
<151>2007-08-24
 
<150>US 61/036,030
<151>2008-03-12
 
<160>36
<170>PatentIn version 3.4
 
<210>1
<211>1909
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
 
<400>1
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<211>78
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
 
<400>2
 
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Asn Phe Ala Ser Ser Ala Arg Ala Gly Arg Arg Asn Ala Leu Pro Asp
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Ile Gln Ser Ser Ala Ala Thr Asp Gly Thr Ser Asp Leu Pro Leu Lys
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<210>3
<211>4912
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
 
<400>3
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tataagcttt cctcattgga aaaggctgga tttggaggtg ttcttctgta tatcgatcct    1080
tgtgatttgc caaagactgt gaatcctagc catgatacct tcatggtgtc actgaatcca    1140
ggaggagacc cttctacgcc tggttaccca agtgtcgatg aaagttttag acaaagccga    1200
tcaaacctca cctctctatt agtgcagccc atctctgcac ccctcgttgc aaaactgatc    1260
tcttcgccaa aagctagaac caaaaatgaa gcgtgtagct ctctagagct tccaaataat    1320
gaaataagag tcgtcagcat gcaagttcag acagtcacaa aattgaaaac agttactaat    1380
gttgttggat ttgtaatggg cttgacatct ccagaccggt atatcatagt tggcagccat    1440
catcacactg cacacagtta taatggacaa gaatgggcca gtagtactgc aataatcaca    1500
gcgtttatcc gtgccttgat gtcaaaagtt aagagagggt ggagaccaga ccgaactatt    1560
gttttctgtt cttggggagg aacagctttt ggcaatattg gctcatatga atggggagag    1620
gatttcaaga aggttcttca gaaaaatgtt gtggcttata ttagcctcca cagtcccata    1680
agggggaact ctagtctgta tcctgtagca tcaccatctc ttcagcaact ggtagtagag    1740
aaaaataatt tcaactgtac cagaagagcc cagtgcccag aaaccaatat cagttctata    1800
cagatacaag gtgatgctga ttatttcatc aaccatcttg gagttcccat cgtgcagttt    1860
gcttacgagg acatcaaaac attagagggt ccaagttttc tctccgaggc ccgtttttct    1920
acacgagcaa caaaaattga agaaatggat ccctctttca accttcatga aaccattact    1980
aagctctcag gagaagtgat tttgcaaatt gccaacgaac ctgttctgcc ctttaatgca    2040
cttgatatag ctttagaagt tcaaaacaac cttaaaggtg atcaacccaa cactcatcaa    2100
ctgttagcca tggcgttacg cctgcgggag agtgctgaac tttttcagtc tgatgagatg    2160
cgacctgcta atgatcccaa ggagagagca cccatccgca tccggatgct gaatgacatt    2220
ctccaagaca tggagaaaag ctttctggta aagcaggcac caccaggttt ttatagaaac    2280
atcctctacc accttgatga aaagacaagc cggttttcaa tacttataga ggcttgggaa    2340
cactgcaaac cccttgcatc aaatgagacc cttcaagaag ccctgtcaga ggtgttgaac    2400
agcattaatt cagctcaggt ttacttcaaa gcaggacttg atgtgttcaa gagtgtcttg    2460
gatgggaaga attgagaaaa ctctgagcat ttttaaaagt ttgtttacaa ttccacaagc    2520
aaaagctcta atttaaccag attttctgac attgaaggct tattttcccc aatggctttt    2580
tgacaagtat aaagctatta ttacattgta ttttttaaat gtaaatatag aaagaacatt    2640
ttgcacattt aatatttttc ttatatctac atttctgaat atgtaaagca agttattgaa    2700
ataggactta agaattacct attaaaaaga aatctgatat ataaaaatat gtactatttt    2760
aaggaaaaat ttccaagaag ttctggacta tctttgttcc tatggggagg gcatatagga    2820
acacagttta ttctctctga tagagctatt aatgacttag tttctgtaaa agaaatggag    2880
agttgatatg gttcagatta acttcactat taagtgttca atatgaagaa ttcaagtatt    2940
ctgactgagt gattggttga cctaaaccac tttgaatgtt tctattttat gaaatgaagt    3000
ttctcttctt aacacaacta gatgtagtaa tacactggtt atgaaattgt atttttttaa    3060
gtattaatga aaaaagagcc ataagcattc caggagaaaa tctcaaggga gctacataga    3120
gcaatttaaa tgcaaatttt tttcctaaca acttacaagg tgactagctt tgaaacccct    3180
aatttgcctc agttgatttt ctaagaattt caggagtgat gtatgtctta agagggagaa    3240
aaaaatattt cttattactt tttctcttgt ttctgttgga aacactgaag cagggactct    3300
aaaatgaaag catctcacat tggttttctt tcttgtatct tttctgaaac tccttgctgt    3360
aaggcagctt tctcagagta ctatatattt tcaacagtaa agtagcagag tttctctttg    3420
aaacccaaaa tgtcttctaa agaatcaaat ttctatttct gcctctgaca aaaagaactt    3480
actatgaaag aaatagttgt tttatcaata aaagcccctt aatattatga agaaactttt    3540
catatttttt cttctttatc cttaattgtg actaagatgg aaatctagaa aatattcatg    3600
cttctaagtt tctgcagtgt tactgtaaga gagtgtctcg tctacacttc agttcttctc    3660
tcatgtggaa aactaagctt tttatattga cattgccatt gaatagctct agcaactatt    3720
attattcccc caaaccctaa aattctacct attaggtgtc aggttaaagt tctaatttat    3780
ctttagaaat ttatgtgaaa aatggttttc ctatactgga taaagcaatt ccccttagga    3840
aacatagcct cagagtattt catataaatt ttctctatct aattcaaaca tatctcccca    3900
tgatacaccg ccagagtgac attgcagaca gtctgtgtat gtttaaattt tcacttttta    3960
tggatgagca taaacctagt cttagtttaa aggcaaacta aagttgaggg gaaataatta    4020
atcaatactg attaattgat ttataaggtt caacactgtc taccctaaat aatttttata    4080
tgctcaaggc aaagcaggga atagaggcaa ttagctagat aattcaagca gaaatccatt    4140
ttcatcgaaa ttgcctgtgt gcacatattt ttagatgaaa aatgaaacta ccttacaata    4200
ttattttttt aaccaatgta tttgtttgca aacatttgcc atgttgaaga gtgtgtatag    4260
gaaaggtcta gaaataaata ggcttgtgca tacctaggca ttcatgctct ttcttcctct    4320
tcagagatca tcagaaaaga ggtgggaata cacaagcagg tgcatgtaag cccaaaagct    4380
agaaagcctt atatttaacc aaaggttgat gtgttcattc cagttattca cttacagatg    4440
aaactaaaac aaataaaggc aagctattat cagtttggta gttcattatt ttagaacaaa    4500
tttctaaatt aatttattcc cataacctac aatagcactg agaacagaaa acatgtttct    4560
tcttcatttt gtttaaagat tgcgtaccta ggtaagtcac actgtataga taaaaacctt    4620
cttctgtatt cctcacctct aaattatatg ttatttgcta tttgaaaact gtagttaact    4680
atggtttttt attagtctat taaaagatac gtggagatat taaattatac ctaaagcaga    4740
cgtccaacaa attctgtaca tgctgcttta catctttgca acaaacctct taactagcag    4800
cattatttct atagtgtgat tacctgaggg tgcctccaaa tgtatatcat ttcactcccc    4860
tcccctcccc acccccaata gattcaaata aataaaatcc tgagcaaatt aa            4912
<210>4
<211>795
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
 
<400>4
 
Met Gly Glu Asn Glu Ala Ser Leu Pro Asn Thr Ser Leu Gln Gly Lys
1               5                   10                  15
Lys Met Ala Tyr Gln Lys Val His Ala Asp Gln Arg Ala Pro Gly His
            20                  25                  30
Ser Gln Tyr Leu Asp Asn Asp Asp Leu Gln Ala Thr Ala Leu Asp Leu
        35                  40                  45
Glu Trp Asp Met Glu Lys Glu Leu Glu Glu Ser Gly Phe Asp Gln Phe
    50                  55                  60
Gln Leu Asp Gly Ala Glu Asn Gln Asn Leu Gly His Ser Glu Thr Ile
65                  70                  75                  80
Asp Leu Asn Leu Asp Ser Ile Gln Pro Ala Thr Ser Pro Lys Gly Arg
                85                  90                  95
Phe Gln Arg Leu Gln Glu Glu Ser Asp Tyr Ile Thr His Tyr Thr Arg
            100                 105                 110
Ser Ala Pro Lys Ser Asn Arg Cys Asn Phe Cys His Val Leu Lys Ile
        115                 120                 125
Leu Cys Thr Ala Thr Ile Leu Phe Ile Phe Gly Ile Leu Ile Gly Tyr
    130                 135                 140
Tyr Val His Thr Asn Cys Pro Ser Asp Ala Pro Ser Ser Gly Thr Val
145                 150                 155                 160
Asp Pro Gln Leu Tyr Gln Glu Ile Leu Lys Thr Ile Gln Ala Glu Asp
                165                 170                 175
Ile Lys Lys Ser Phe Arg Asn Leu Val Gln Leu Tyr Lys Asn Glu Asp
            180                 185                 190
Asp Met Glu Ile Ser Lys Lys Ile Lys Thr Gln Trp Thr Ser Leu Gly
        195                 200                 205
Leu Glu Asp Val Gln Phe Val Asn Tyr Ser Val Leu Leu Asp Leu Pro
    210                 215                 220
Gly Pro Ser Pro Ser Thr Val Thr Leu Ser Ser Ser Gly Gln Cys Phe
225                 230                 235                 240
His Pro Asn Gly Gln Pro Cys Ser Glu Glu Ala Arg Lys Asp Ser Ser
                245                 250                 255
Gln Asp Leu Leu Tyr Ser Tyr Ala Ala Tyr Ser Ala Lys Gly Thr Leu
            260                 265                 270
Lys Ala Glu Val Ile Asp Val Ser Tyr Gly Met Ala Asp Asp Leu Lys
        275                 280                 285
Arg Ile Arg Lys Ile Lys Asn Val Thr Asn Gln Ile Ala Leu Leu Lys
    290                 295                 300
Leu Gly Lys Leu Pro Leu Leu Tyr Lys Leu Ser Ser Leu Glu Lys Ala
305                 310                 315                 320
Gly Phe Gly Gly Val Leu Leu Tyr Ile Asp Pro Cys Asp Leu Pro Lys
                325                 330                 335
Thr Val Asn Pro Ser His Asp Thr Phe Met Val Ser Leu Asn Pro Gly
            340                 345                 350
Gly Asp Pro Ser Thr Pro Gly Tyr Pro Ser Val Asp Glu Ser Phe Arg
        355                 360                 365
Gln Ser Arg Ser Asn Leu Thr Ser Leu Leu Val Gln Pro Ile Ser Ala
    370                 375                 380
Pro Leu Val Ala Lys Leu Ile Ser Ser Pro Lys Ala Arg Thr Lys Asn
385                 390                 395                 400
Glu Ala Cys Ser Ser Leu Glu Leu Pro Asn Asn Glu Ile Arg Val Val
                405                 410                 415
Ser Met Gln Val Gln Thr Val Thr Lys Leu Lys Thr Val Thr Asn Val
            420                 425                 430
Val Gly Phe Val Met Gly Leu Thr Ser Pro Asp Arg Tyr Ile Ile Val
        435                 440                 445
Gly Ser His His His Thr Ala His Ser Tyr Asn Gly Gln Glu Trp Ala
    450                 455                 460
Ser Ser Thr Ala Ile Ile Thr Ala Phe Ile Arg Ala Leu Met Ser Lys
465                 470                 475                 480
Val Lys Arg Gly Trp Arg Pro Asp Arg Thr Ile Val Phe Cys Ser Trp
                485                 490                 495
Gly Gly Thr Ala Phe Gly Asn Ile Gly Ser Tyr Glu Trp Gly Glu Asp
            500                 505                 510
Phe Lys Lys Val Leu Gln Lys Asn Val Val Ala Tyr Ile Ser Leu His
        515                 520                 525
Ser Pro Ile Arg Gly Asn Ser Ser Leu Tyr Pro Val Ala Ser Pro Ser
    530                 535                 540
Leu Gln Gln Leu Val Val Glu Lys Asn Asn Phe Asn Cys Thr Arg Arg
545                 550                 555                 560
Ala Gln Cys Pro Glu Thr Asn Ile Ser Ser Ile Gln Ile Gln Gly Asp
                565                 570                 575
Ala Asp Tyr Phe Ile Asn His Leu Gly Val Pro Ile Val Gln Phe Ala
            580                 585                 590
Tyr Glu Asp Ile Lys Thr Leu Glu Gly Pro Ser Phe Leu Ser Glu Ala
        595                 600                 605
Arg Phe Ser Thr Arg Ala Thr Lys Ile Glu Glu Met Asp Pro Ser Phe
    610                 615                 620
Asn Leu His Glu Thr Ile Thr Lys Leu Ser Gly Glu Val Ile Leu Gln
625                 630                 635                 640
Ile Ala Asn Glu Pro Val Leu Pro Phe Asn Ala Leu Asp Ile Ala Leu
                645                 650                 655
Glu Val Gln Asn Asn Leu Lys Gly Asp Gln Pro Asn Thr His Gln Leu
            660                 665                 670
Leu Ala Met Ala Leu Arg Leu Arg Glu Ser Ala Glu Leu Phe Gln Ser
        675                 680                 685
Asp Glu Met Arg Pro Ala Asn Asp Pro Lys Glu Arg Ala Pro Ile Arg
    690                 695                 700
Ile Arg Met Leu Asn Asp Ile Leu Gln Asp Met Glu Lys Ser Phe Leu
705                 710                 715                 720
Val Lys Gln Ala Pro Pro Gly Phe Tyr Arg Asn Ile Leu Tyr His Leu
                725                 730                 735
Asp Glu Lys Thr Ser Arg Phe Ser Ile Leu Ile Glu Ala Trp Glu His
            740                 745                 750
Cys Lys Pro Leu Ala Ser Asn Glu Thr Leu Gln Glu Ala Leu Ser Glu
        755                 760                 765
Val Leu Asn Ser Ile Asn Ser Ala Gln Val Tyr Phe Lys Ala Gly Leu
    770                 775                 780
Asp Val Phe Lys Ser Val Leu Asp Gly Lys Asn
785                 790                 795
<210>5
<211>1724
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
 
<400>5
ttaaaaaagc ctcgttagaa tttgctattc gaaaagacct taaaaaccct cacagagttc     60
taaacatccc attcattgaa aatacttttc agttaagtag atttgttttg tgcacttcac    120
aacttttagg tgacatgaat ttgaagcgta gcaaaagaaa tgtataaaga tagccttttc  180
tggtcattac catgtctact caagtttctg ttttctaggt acactctagc attgtaactt  240
tttccccctg agaagtaatt ttaagatcta tcagtctcaa tttaaatgat ctgttaatca  300
gccagagttt tagtttcata atatcgttcc attgcctgac aaagatatac acactgaagt  360
gcctttagca gacctgggac cgtcaagaat cttgttaccc tgattattgc aagatgacat  420
atttcttaag ccatttataa tctcatattc gggttgaatc tgtatttaca aataaaaggg  480
ttaaattgag gcagtttcaa gcagcattta ggaaaatgaa gtggcttcaa attttagtgt  540
ttctggttac attattttgt ttgaattata caattacata attttctgta accaaaatgg  600
taattttgat ggatttttta aatgccaaaa tccaatcatc aaggccaaag aaatgcatga  660
ttactctgat ttcttatgca ccattcagtc aagacttaac tcagaggcag ttgattcagt  720
gcttacatct agacaaagct ttaatgagtg cagacccagc ctaacagtat ttcatctaat  780
ttctttgatg gcttaagcca ataagcactg aggtagcttt tctcagaagg aaacagattt  840
tattttccag gggctaatta atatgcacca cctaagtccc caaaggatca cacaggtgcc  900
tgtatcatgc catatgtcat gtgctatatt cctgcaagct caagagatta atatacaatc  960
attattatga attattatgt tgcattgaag ttaatgtcgg tcttttgttc taattaaagt 1020
acaaacgtgg catctgaata gaagcttagc tagagaagtg gagttagagt ccctatttta 1080
atgaactaca tatatttttc aatcaaaatg tgtaattatt taattatcta gcctgctcag 1140
taatcataac tctccaactt cttcaaaggg cctttattca atatgttacc actcatatgg 1200
tcattacttg gtaagtgttt tatattttga atttcttaga tgctttcagt gtatgtgcta 1260
gtgttttatt aatattaaaa atttttgttt acttatatat caagctgctg caaatggact 1320
accttatttt aaaagttaga ataaaatgct attactctct aaacagaact ttagcatatc 1380
tgtttgataa gaaatacaca aacaaaatat ttttctatgc tattgcaaat tgtccgcagg 1440
aagcaaaatg ccagatggtt aagtgtagct cacataatta tattccaaag gtgttataaa 1500
caattctatt tagcatctga gataggtcta tattaggcaa tttcatgttt acatttctaa 1560
cagaaaggtt taatggcaaa tattccttat attctaactt gctacttgga gaatatggat 1620
attctgaaaa gaaaaaccct ttctagaaca ctgtgcagga ctaatttttt tttaatagac 1680
atccagaaaa tagcctgggc aacaaagtga gaccctgtct ctct                  1724
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>用于PCR的人工合成的引物
 
<400>6
ttggcttgac tcaggattta                                               20
 
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>用于PCR的人工合成的引物
 
<400>7
atgctatcac ctcccctgtg                                               20
<210>8
<211>24
<212>DNA
<213>用于PCR的人工合成的引物
 
<400>8
ggcacatact agaagcaaaa tacg     24
 
<210>9
<211>22
<212>DNA
<213>用于PCR的人工合成的引物
<400>9
gatgggcaaa tcattcttgg ta       22
 
<210>10
<211>23
<212>DNA
<213>用于PCR的人工合成的引物
 
<400>10
gaaagcatct cacattggtt ttc      23
 
<210>11
<211>23
<212>DNA
<213>用于PCR的人工合成的引物
 
<400>11
gggtttcaaa gagaaactct gct      23
 
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>用于PCR的人工合成的引物
 
<400>12
gaagcaaaat gccagatggt          20
 
<210>13
<211>23
<212>DNA
<213>用于PCR的人工合成的引物
 
<400>13
tcctgcacag tgttctagaa agg      23
 
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>用于RNA印迹探针的人工合成的引物
 
<400>14
ccagtgccca gaaaccaata          20
 
<210>15
<211>22
<212>DNA
<213>用于RNA印迹探针的人工合成的引物
 
<400>15
tcaattcttc ccatccaaga ca       22
<210>16
<211>19
<212>DNA
<213>用于siRNA的人工合成的靶序列
 
<400>16
gccctaagca gcatgtgta    19
 
<210>17
<211>19
<212>DNA
<213>用于siRNA的人工合成的靶序列
 
<400>17
gcagtaggca cttaagcat    19
 
<210>18
<211>19
<212>DNA
<213>用于siRNA的人工合成的靶序列
 
<400>18
gatgcaaaag agaaagatg    19
 
<210>19
<211>19
<212>DNA
<213>用于siRNA的人工合成的靶序列
 
<400>19
gactcagtgg acctctttg    19
 
<210>20
<211>19
<212>DNA
<213>用于siRNA的人工合成的靶序列
 
<400>20
gtcatcgatg tgagttatg    19
 
<210>21
<211>19
<212>DNA
<213>用于siRNA的人工合成的靶序列
 
<400>21
gagtcgtcag catgcaagt    19
 
<210>22
<211>19
<212>DNA
<213>用于siRNA的人工合成的靶序列
 
<400>22
gaagcagcac gacttcttc    19
 
<210>23
<211>19
<212>DNA
<213>用于siRNA的人工合成的靶序列
 
<400>23
gacucagugg accucuuug    19
<210>24
<211>21
<212>DNA
<213>用于siRNA的人工合成的靶序列
 
<400>24
caaagagguc cacugagucu u         21
 
<210>25
<211>22
<212>DNA
<213>用于siRNA的人工合成的靶序列
 
<400>25
gcagcacgac uuctuucaag tt        22
<210>26
<211>21
<212>DNA
<213>用于siRNA的人工合成的靶序列
 
<400>26
cuugaagaag ucgugcugct t         21
 
<210>27
<211>21
<212>DNA
<213>用于siRNA的人工合成的靶序列
 
<400>27
gcccuaagca gcauguguau a         21
 
<210>28
<211>21
<212>DNA
<213>用于siRNA的人工合成的靶序列
 
<400>28
uacacaugcu gcuuagggcu u         21
 
<210>29
<211>2689
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
 
<400>29
gatcttgggc tgaggttccc gggcgggcgg gcgcggagag acgcgggaag caggggctgg    60
gcgggggtcg cggcgccgca gctagcgcag ccagcccgag ggccgccgcc gccgccgccc   120
agcgcgctcc ggggccgccg gccgcagcca gcacccgccg cgccgcagct ccgggaccgg   180
ccccggccgc cgccgccgcg atgggcaacg ccgccgccgc caagaagggc agcgagcagg   240
agagcgtgaa agaattctta gccaaagcca aagaagattt tcttaaaaaa tgggaaagtc   300
ccgctcagaa cacagcccac ttggatcagt ttgaacgaat caagaccctc ggcacgggct   360
ccttcgggcg ggtgatgctg gtgaaacaca aggagaccgg gaaccactat gccatgaaga   420
tcctcgacaa acagaaggtg gtgaaactga aacagatcga acacaccctg aatgaaaagc   480
gcatcctgca agctgtcaac tttccgttcc tcgtcaaact cgagttctcc ttcaaggaca   540
actcaaactt atacatggtc atggagtacg tgcccggcgg ggagatgttc tcacacctac   600
ggcggatcgg aaggttcagt gagccccatg cccgtttcta cgcggcccag atcgtcctga   660
cctttgagta tctgcactcg ctggatctca tctacaggga cctgaagccg gagaatctgc   720
tcattgacca gcagggctac attcaggtga cagacttcgg tttcgccaag cgcgtgaagg   780
gccgcacttg gaccttgtgc ggcacccctg agtacctggc ccctgagatt atcctgagca   840
aaggctacaa caaggccgtg gactggtggg ccctgggggt tcttatctat gaaatggccg   900
ctggctaccc gcccttcttc gcagaccagc ccatccagat ctatgagaag atcgtctctg   960
ggaaggtgcg cttcccttcc cacttcagct ctgacttgaa ggacctgctg cggaacctcc  1020
tgcaggtaga tctcaccaag cgctttggga acctcaagaa tggggtcaac gatatcaaga  1080
accacaagtg gtttgccaca actgactgga ttgccatcta ccagaggaag gtggaagctc  1140
ccttcatacc aaagtttaaa ggccctgggg atacgagtaa ctttgacgac tatgaggaag  1200
aagaaatccg ggtctccatc aatgagaagt gtggcaagga gttttctgag ttttaggggc  1260
atgcctgtgc ccccatgggt tttctttttt cttttttctt ttttttggtc gggggggtgg  1320
gagggttgga ttgaacagcc agagggcccc agagttcctt gcatctaatt tcacccccac  1380
cccaccctcc agggttaggg ggagcaggaa gcccagataa tcagagggac agaaacacca  1440
gctgctcccc ctcatcccct tcaccctcct gccccctctc ccacttttcc cttcctcttt  1500
ccccacagcc ccccagcccc tcagccctcc cagcccactt ctgcctgttt taaacgagtt  1560
tctcaactcc agtcagacca ggtcttgctg gtgtatccag ggacagggta tggaaagagg  1620
ggctcacgct taactccagc ccccacccac acccccatcc cacccaacca caggccccac  1680
ttgctaaggg caaatgaacg aagcgccaac cttcctttcg gagtaatcct gcctgggaag  1740
gagagatttt tagtgacatg ttcagtgggt tgcttgctag aattttttta aaaaaacaac  1800
aatttaaaat cttatttaag ttccaccagt gcctccctcc ctccttcctc tactcccacc  1860
cctcccatgt ccccccattc ctcaaatcca ttttaaagag aagcagactg actttggaaa  1920
gggaggcgct ggggtttgaa cctccccgct gctaatctcc cctgggcccc tccccgggga  1980
atcctctctg ccaatcctgc gagggtctag gcccctttag gaagcctccg ctctcttttt  2040
ccccaacaga cctgtcttca cccttgggct ttgaaagcca gacaaagcag ctgcccctct  2100
ccctgccaaa gaggagtcat cccccaaaaa gacagagggg gagccccaag cccaagtctt  2160
tcctcccagc agcgtttccc cccaactcct taattttatt ctccgctaga ttttaacgtc  2220
cagccttccc tcagctgagt ggggagggca tccctgcaaa agggaacaga agaggccaag  2280
tccccccaag ccacggcccg gggttcaagg ctagagctgc tggggagggg ctgcctgttt  2340
tactcaccca ccagcttccg cctcccccat cctgggcgcc cctcctccag cttagctgtc  2400
agctgtccat cacctctccc ccactttctc atttgtgctt ttttctctcg taatagaaaa  2460
gtggggagcc gctggggagc caccccattc atccccgtat ttccccctct cataacttct  2520
ccccatccca ggaggagttc tcaggcctgg ggtggggccc cgggtgggtg cgggggcgat  2580
tcaacctgtg tgctgcgaag gacgagactt cctcttgaac agtgtgctgt tgtaaacata  2640
tttgaaaact attaccaata aagttttgtt taaaaaaaaa aaaaaaaaa              2689
<210>30
<211>351
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
 
<400>30
 
Met Gly Asn Ala Ala Ala Ala Lys Lys Gly Ser Glu Gln Glu Ser Val
1               5                   10                  15
Lys Glu Phe Leu Ala Lys Ala Lys Glu Asp Phe Leu Lys Lys Trp Glu
            20                  25                  30
Ser Pro Ala Gln Asn Thr Ala His Leu Asp Gln Phe Glu Arg Ile Lys
        35                  40                  45
Thr Leu Gly Thr Gly Ser Phe Gly Arg Val Met Leu Val Lys His Lys
    50                  55                  60
Glu Thr Gly Asn His Tyr Ala Met Lys Ile Leu Asp Lys Gln Lys Val
65                  70                  75                  80
Val Lys Leu Lys Gln Ile Glu His Thr Leu Asn Glu Lys Arg Ile Leu
                85                  90                  95
Gln Ala Val Asn Phe Pro Phe Leu Val Lys Leu Glu Phe Ser Phe Lys
            100                 105                 110
Asp Asn Ser Asn Leu Tyr Met Val Met Glu Tyr Val Pro Gly Gly Glu
        115                 120                 125
Met Phe Ser His Leu Arg Arg Ile Gly Arg Phe Ser Glu Pro His Ala
    130                 135                 140
Arg Phe Tyr Ala Ala Gln Ile Val Leu Thr Phe Glu Tyr Leu His Ser
145                 150                 155                 160
Leu Asp Leu Ile Tyr Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu Ile Asp
                165                 170                 175
Gln Gln Gly Tyr Ile Gln Val Thr Asp Phe Gly Phe Ala Lys Arg Val
            180                 185                 190
Lys Gly Arg Thr Trp Thr Leu Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro
        195                 200                 205
Glu Ile Ile Leu Ser Lys Gly Tyr Asn Lys Ala Val Asp Trp Trp Ala
    210                 215                 220
Leu Gly Val Leu Ile Tyr Glu Met Ala Ala Gly Tyr Pro Pro Phe Phe
225                 230                 235                 240
Ala Asp Gln Pro Ile Gln Ile Tyr Glu Lys Ile Val Ser Gly Lys Val
                245                 250                 255
Arg Phe Pro Ser His Phe Ser Ser Asp Leu Lys Asp Leu Leu Arg Asn
            260                 265                 270
Leu Leu Gln Val Asp Leu Thr Lys Arg Phe Gly Asn Leu Lys Asn Gly
        275                 280                 285
Val Asn Asp Ile Lys Asn His Lys Trp Phe Ala Thr Thr Asp Trp Ile
    290                 295                 300
Ala Ile Tyr Gln Arg Lys Val Glu Ala Pro Phe Ile Pro Lys Phe Lys
305                 310                 315                 320
Gly Pro Gly Asp Thr Ser Asn Phe Asp Asp Tyr Glu Glu Glu Glu Ile
                325                 330                 335
Arg Val Ser Ile Asn Glu Lys Cys Gly Lys Glu Phe Ser Glu Phe
            340                 345                 350
<210>31
<211>4
<212>PRT
<213>PKIB中的PKA-C-结合序列
 
<400>31
 
Arg Arg Asn Ala
1
<210>32
<211>649
<212>PRT
<213>胞外域
 
<400>32
 
His Thr Asn Cys Pro Ser Asp Ala Pro Ser Ser Gly Thr Val Asp Pro
1               5                   10                  15
Gln Leu Tyr Gln Glu Ile Leu Lys Thr Ile Gln Ala Glu Asp Ile Lys
            20                  25                  30
Lys Ser Phe Arg Asn Leu Val Gln Leu Tyr Lys Asn Glu Asp Asp Thr
        35                  40                  45
Glu Ile Ser Lys Lys Ile Lys Thr Gln Trp Thr Ser Leu Gly Leu Glu
    50                  55                  60
Asp Val Gln Phe Val Asn Tyr Ser Val Leu Leu Asp Leu Pro Gly Pro
65                  70                  75                  80
Ser Pro Ser Thr Val Thr Leu Ser Ser Ser Gly Gln Cys Phe His Pro
                85                  90                  95
Asn Gly Gln Pro Cys Ser Glu Glu Ala Arg Lys Asp Ser Ser Gln Asp
            100                 105                 110
Leu Leu Tyr Ser Tyr Ala Ala Tyr Ser Ala Lys Gly Thr Leu Lys Ala
        115                 120                 125
Glu Val Ile Asp Val Ser Tyr Gly Met Ala Asp Asp Leu Lys Arg Ile
    130                 135                 140
Arg Lys Ile Lys Asn Val Thr Asn Gln Ile Ala Leu Leu Lys Leu Gly
145                 150                 155                 160
Lys Leu Pro Leu Leu Tyr Lys Leu Ser Ser Leu Glu Lys Ala Gly Phe
                165                 170                 175
Gly Gly Val Leu Leu Tyr Ile Asp Pro Cys Asp Leu Pro Lys Thr Val
            180                 185                 190
Asn Pro Ser His Asp Thr Phe Met Val Ser Leu Asn Pro Gly Gly Asp
        195                 200                 205
Pro Ser Thr Pro Gly Tyr Pro Ser Val Asp Glu Ser Phe Arg Gln Ser
    210                 215                 220
Arg Ser Asn Leu Thr Ser Leu Leu Val Gln Pro Ile Ser Ala Ser Leu
225                 230                 235                 240
Val Ala Lys Leu Ile Ser Ser Pro Lys Ala Arg Thr Lys Asn Glu Ala
                245                 250                 255
Cys Ser Ser Leu Glu Leu Pro Asn Asn Glu Ile Arg Val Val Ser Met
            260                 265                 270
Gln Val Gln Thr Val Thr Lys Leu Lys Thr Val Thr Asn Val Val Gly
        275                 280                 285
Phe Val Met Gly Leu Thr Ser Pro Asp Arg Tyr Ile Ile Val Gly Ser
    290                 295                 300
His His His Thr Ala His Ser Tyr Asn Gly Gln Glu Trp Ala Ser Ser
305                 310                 315                 320
Thr Ala Ile Ile Thr Ala Phe Ile Arg Ala Leu Met Ser Lys Val Lys
                325                 330                 335
Arg Gly Trp Arg Pro Asp Arg Thr Ile Val Phe Cys Ser Trp Gly Gly
            340                 345                 350
Thr Ala Phe Gly Asn Ile Gly Ser Tyr Glu Trp Gly Glu Asp Phe Lys
        355                 360                 365
Lys Val Leu Gln Lys Asn Val Val Ala Tyr Ile Ser Leu His Ser Pro
    370                 375                 380
Ile Arg Gly Asn Ser Ser Leu Tyr Pro Val Ala Ser Pro Ser Leu Gln
385                 390                 395                 400
Gln Leu Val Val Glu Lys Asn Asn Phe Asn Cys Thr Arg Arg Ala Gln
                405                 410                 415
Cys Pro Glu Thr Asn Ile Ser Ser Ile Gln Ile Gln Gly Asp Ala Asp
            420                 425                 430
Tyr Phe Ile Asn His Leu Gly Val Pro Ile Val Gln Phe Ala Tyr Glu
        435                 440                 445
Asp Ile Lys Thr Leu Glu Gly Pro Ser Phe Leu Ser Glu Ala Arg Phe
    450                 455                 460
Ser Thr Arg Ala Thr Lys Ile Glu Glu Met Asp Arg Ser Phe Asn Leu
465                 470                 475                 480
His Glu Thr Ile Thr Lys Leu Ser Gly Glu Val Ile Leu Gln Ile Ala
                485                 490                 495
Asn Glu Pro Val Leu Pro Phe Asn Ala Leu Asp Ile Ala Leu Glu Val
            500                 505                 510
Gln Asn Asn Leu Lys Gly Asp Gln Pro Asn Thr His Gln Leu Leu Ala
        515                 520                 525
Met Ala Ser Arg Leu Arg Glu Ser Ala Glu Leu Phe Gln Ser Asp Glu
    530                 535                 540
Met Arg Pro Ala Asn Asp Pro Lys Glu Arg Ala Pro Ile Arg Ile Arg
545                 550                 555                 560
Met Leu Asn Asp Ile Leu Gln Asp Met Glu Lys Ser Phe Leu Val Lys
                565                 570                 575
Gln Ala Pro Pro Gly Phe Tyr Arg Asn Ile Leu Tyr His Leu Asp Glu
            580                 585                 590
Lys Thr Ser Arg Phe Ser Ile Leu Ile Glu Ala Trp Glu His Cys Lys
        595                 600                 605
Pro Leu Ala Ser Asn Glu Thr Leu Gln Glu Ala Leu Ser Glu Val Leu
    610                 615                 620
Asn Ser Ile Asn Ser Ala Gln Val Tyr Phe Lys Ala Gly Leu Asp Val
625                 630                 635                 640
Phe Lys Ser Val Leu Asp Gly Lys Asn
                645
<210>33
<211>20
<212>PRT
<213>用于制备抗体的人工合成的表位肽
 
<400>33
 
Ser Ala Arg Ala Gly Arg Arg Asn Ala Leu Pro Asp Ile Gln Ser Ser
1               5                   10                  15
Ala Ala Thr Asp
            20
<210>34
<211>20
<212>PRT
<213>用于制备抗体的人工合成的表位肽
 
<400>34
 
Lys Glu Lys Asp Glu Lys Thr Thr Gln Asp Gln Leu Glu Lys Pro Gln
1               5                   10                  15
Asn Glu Glu Lys
            20
<210>35
<211>480
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
 
<400>35
 
Met Ser Asp Val Ala Ile Val Lys Glu Gly Trp Leu His Lys Arg Gly
1               5                   10                  15
Glu Tyr Ile Lys Thr Trp Arg Pro Arg Tyr Phe Leu Leu Lys Asn Asp
            20                  25                  30
Gly Thr Phe Ile Gly Tyr Lys Glu Arg Pro Gln Asp Val Asp Gln Arg
        35                  40                  45
Glu Ala Pro Leu Asn Asn Phe Ser Val Ala Gln Cys Gln Leu Met Lys
    50                  55                  60
Thr Glu Arg Pro Arg Pro Asn Thr Phe Ile Ile Arg Cys Leu Gln Trp
65                  70                  75                  80
Thr Thr Val Ile Glu Arg Thr Phe His Val Glu Thr Pro Glu Glu Arg
                85                  90                  95
Glu Glu Trp Thr Thr Ala Ile Gln Thr Val Ala Asp Gly Leu Lys Lys
            100                 105                 110
Gln Glu Glu Glu Glu Met Asp Phe Arg Ser Gly Ser Pro Ser Asp Asn
        115                 120                 125
Ser Gly Ala Glu Glu Met Glu Val Ser Leu Ala Lys Pro Lys His Arg
    130                 135                 140
Val Thr Met Asn Glu Phe Glu Tyr Leu Lys Leu Leu Gly Lys Gly Thr
145                 150                 155                 160
Phe Gly Lys Val Ile Leu Val Lys Glu Lys Ala Thr Gly Arg Tyr Tyr
                165                 170                 175
Ala Met Lys Ile Leu Lys Lys Glu Val Ile Val Ala Lys Asp Glu Val
            180                 185                 190
Ala His Thr Leu Thr Glu Asn Arg Val Leu Gln Asn Ser Arg His Pro
        195                 200                 205
Phe Leu Thr Ala Leu Lys Tyr Ser Phe Gln Thr His Asp Arg Leu Cys
    210                 215                 220
Phe Val Met Glu Tyr Ala Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His Leu Ser
225                 230                 235                 240
Arg Glu Arg Val Phe Ser Glu Asp Arg Ala Arg Phe Tyr Gly Ala Glu
                245                 250                 255
Ile Val Ser Ala Leu Asp Tyr Leu His Ser Glu Lys Asn Val Val Tyr
            260                 265                 270
Arg Asp Leu Lys Leu Glu Asn Leu Met Leu Asp Lys Asp Gly His Ile
        275                 280                 285
Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Cys Lys Glu Gly Ile Lys Asp Gly Ala
    290                 295                 300
Thr Met Lys Thr Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu Val
305                 310                 315                 320
Leu Glu Asp Asn Asp Tyr Gly Arg Ala Val Asp Trp Trp Gly Leu Gly
                325                 330                 335
Val Val Met Tyr Glu Met Met Cys Gly Arg Leu Pro Phe Tyr Asn Gln
            340                 345                 350
Asp His Glu Lys Leu Phe Glu Leu Ile Leu Met Glu Glu Ile Arg Phe
        355                 360                 365
Pro Arg Thr Leu Gly Pro Glu Ala Lys Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu
    370                 375                 380
Lys Lys Asp Pro Lys Gln Arg Leu Gly Gly Gly Ser Glu Asp Ala Lys
385                 390                 395                 400
Glu Ile Met Gln His Arg Phe Phe Ala Gly Ile Val Trp Gln His Val
                405                 410                 415
Tyr Glu Lys Lys Leu Ser Pro Pro Phe Lys Pro Gln Val Thr Ser Glu
            420                 425                 430
Thr Asp Thr Arg Tyr Phe Asp Glu Glu Phe Thr Ala Gln Met Ile Thr
        435                 440                 445
Ile Thr Pro Pro Asp Gln Asp Asp Ser Met Glu Cys Val Asp Ser Glu
    450                 455                 460
Arg Arg Pro His Phe Pro Gln Phe Ser Tyr Ser Ala Ser Gly Thr Ala
465                 470                 475                 480
<210>36
<211>3008
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
 
<400>36
taattatggg tctgtaacca ccctggactg ggtgctcctc actgacggac ttgtctgaac     60
ctctctttgt ctccagcgcc cagcactggg cctggcaaaa cctgagacgc ccggtacatg    120
ttggccaaat gaatgaacca gattcagacc ggcaggggcg ctgtggttta ggaggggcct    180
ggggtttctc ccaggaggtt tttgggcttg cgctggaggg ctctggactc ccgtttgcgc    240
cagtggcctg catcctggtc ctgtcttcct catgtttgaa tttctttgct ttcctagtct    300
ggggagcagg gaggagccct gtgccctgtc ccaggatcca tgggtaggaa caccatggac    360
agggagagca aacggggcca tctgtcacca ggggcttagg gaaggccgag ccagcctggg    420
tcaaagaagt caaaggggct gcctggagga ggcagcctgt cagctggtgc atcagaggct    480
gtggccaggc cagctgggct cggggagcgc cagcctgaga ggagcgcgtg agcgtcgcgg    540
gagcctcggg caccatgagc gacgtggcta ttgtgaagga gggttggctg cacaaacgag    600
gggagtacat caagacctgg cggccacgct acttcctcct caagaatgat ggcaccttca    660
ttggctacaa ggagcggccg caggatgtgg accaacgtga ggctcccctc aacaacttct    720
ctgtggcgca gtgccagctg atgaagacgg agcggccccg gcccaacacc ttcatcatcc    780
gctgcctgca gtggaccact gtcatcgaac gcaccttcca tgtggagact cctgaggagc    840
gggaggagtg gacaaccgcc atccagactg tggctgacgg cctcaagaag caggaggagg    900
aggagatgga cttccggtcg ggctcaccca gtgacaactc aggggctgaa gagatggagg    960
tgtccctggc caagcccaag caccgcgtga ccatgaacga gtttgagtac ctgaagctgc   1020
tgggcaaggg cactttcggc aaggtgatcc tggtgaagga gaaggccaca ggccgctact   1080
acgccatgaa gatcctcaag aaggaagtca tcgtggccaa ggacgaggtg gcccacacac   1140
tcaccgagaa ccgcgtcctg cagaactcca ggcacccctt cctcacagcc ctgaagtact   1200
ctttccagac ccacgaccgc ctctgctttg tcatggagta cgccaacggg ggcgagctgt   1260
tcttccacct gtcccgggag cgtgtgttct ccgaggaccg ggcccgcttc tatggcgctg   1320
agattgtgtc agccctggac tacctgcact cggagaagaa cgtggtgtac cgggacctca   1380
agctggagaa cctcatgctg gacaaggacg ggcacattaa gatcacagac ttcgggctgt   1440
gcaaggaggg gatcaaggac ggtgccacca tgaagacctt ttgcggcaca cctgagtacc   1500
tggcccccga ggtgctggag gacaatgact acggccgtgc agtggactgg tgggggctgg   1560
gcgtggtcat gtacgagatg atgtgcggtc gcctgccctt ctacaaccag gaccatgaga   1620
agctttttga gctcatcctc atggaggaga tccgcttccc gcgcacgctt ggtcccgagg   1680
ccaagtcctt gctttcaggg ctgctcaaga aggaccccaa gcagaggctt ggcgggggct   1740
ccgaggacgc caaggagatc atgcagcatc gcttctttgc cggtatcgtg tggcagcacg   1800
tgtacgagaa gaagctcagc ccacccttca agccccaggt cacgtcggag actgacacca   1860
ggtattttga tgaggagttc acggcccaga tgatcaccat cacaccacct gaccaagatg   1920
acagcatgga gtgtgtggac agcgagcgca ggccccactt cccccagttc tcctactcgg   1980
ccagcggcac ggcctgaggc ggcggtggac tgcgctggac gatagcttgg agggatggag    2040
aggcggcctc gtgccatgat ctgtatttaa tggtttttat ttctcgggtg catttgagag    2100
aagccacgct gtcctctcga gcccagatgg aaagacgttt ttgtgctgtg ggcagcaccc    2160
tcccccgcag cggggtaggg aagaaaacta tcctgcgggt tttaatttat ttcatccagt    2220
ttgttctccg ggtgtggcct cagccctcag aacaatccga ttcacgtagg gaaatgttaa    2280
ggacttctgc agctatgcgc aatgtggcat tggggggccg ggcaggtcct gcccatgtgt    2340
cccctcactc tgtcagccag ccgccctggg ctgtctgtca ccagctatct gtcatctctc    2400
tggggccctg ggcctcagtt caacctggtg gcaccagatg caacctcact atggtatgct    2460
ggccagcacc ctctcctggg ggtggcaggc acacagcagc cccccagcac taaggccgtg    2520
tctctgagga cgtcatcgga ggctgggccc ctgggatggg accagggatg ggggatgggc    2580
cagggtttac ccagtgggac agaggagcaa ggtttaaatt tgttattgtg tattatgttg    2640
ttcaaatgca ttttgggggt ttttaatctt tgtgacagga aagccctccc ccttcccctt    2700
ctgtgtcaca gttcttggtg actgtcccac cgggagcctc cccctcagat gatctctcca    2760
cggtagcact tgaccttttc gacgcttaac ctttccgctg tcgccccagg ccctccctga    2820
ctccctgtgg gggtggccat ccctgggccc ctccacgcct cctggccaga cgctgccgct    2880
gccgctgcac cacggcgttt ttttacaaca ttcaacttta gtatttttac tattataata    2940
taatatggaa ccttccctcc aaattcttca ataaaagttg cttttcaaaa aaaaaaaaaa    3000
aaaaaaaa                                                             3008

Claims (46)

1.一种分离的双链分子，它在被导入细胞中时，在体内抑制PKIB或NAALADL2的表达和细胞增殖，该双链分子包含有义链和与之互补的反义链，它们彼此杂交形成该双链分子。
2.权利要求1的双链分子，其中该有义链包含与选自SEQ ID NO：16、17和19的靶序列对应的序列。
3.权利要求2的双链分子，其长度为大约19-大约25个核苷酸。
4.权利要求2的双链分子，其由单一多核苷酸组成，该多核苷酸包含通过间插单链连接在一起的有义链和反义链。
5.权利要求4的双链分子，其具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]是包含选自SEQ ID NO：16、17和19的序列的有义链，[B]是由3-23个核苷酸组成的间插单链，[A’]是包含与[A]互补的序列的反义链。
6.一种载体，其表达权利要求1的双链分子。
7.权利要求6的载体，其中该双链分子具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]是包含选自SEQ ID NO：16、17和19的序列的有义链，[B]是由3-23个核苷酸组成的间插单链，[A’]是包含与[A]互补的序列的反义链。
8.一种用于治疗癌症的方法，包括施用至少一种分离的双链分子的步骤，该双链分子抑制PKIB基因或NAALADL2基因在过表达该基因的细胞中的表达，该双链分子包含有义链和与之互补的反义链，它们彼此杂交形成该双链分子。
9.权利要求8的方法，其中该有义链包含与选自SEQ ID NO：16、17和19的靶序列对应的序列。
10.权利要求9的方法，其中该双链分子的长度为大约19-大约25个核苷酸。
11.权利要求8的方法，其中该双链分子由单一多核苷酸组成，该多核苷酸包含通过间插单链连接在一起的有义链和反义链。
12.权利要求11的方法，其中该双链分子具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]是包含选自SEQ ID NO：16、17和19的序列的有义链，[B]是由3-23个核苷酸组成的间插单链，[A’]是包含与[A]互补的序列的反义链。
13.权利要求8的方法，其中该双链分子由载体编码。
14.权利要求13的方法，其中由载体编码的双链分子具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]是包含选自SEQ ID NO：16、17和19的序列的有义链，[B]是由3-23个核苷酸组成的间插单链，[A’]是包含与[A]互补的序列的反义链。
15.权利要求8的方法，其中待治疗的癌症是***癌或激素难治性***癌或去势抵抗性***癌。
16.一种用于治疗癌症的组合物，其包含至少一种抑制PKIB或NAALADL2的表达的分离的双链分子，该双链分子包含有义链和与之互补的反义链，它们彼此杂交形成该双链分子。
17.权利要求16的组合物，其中该有义链包括与选自SEQ ID NO：16、17和19的靶序列对应的序列。
18.权利要求17的组合物，其中该双链分子的长度为大约19-大约25个核苷酸。
19.权利要求16的组合物，其中该双链分子由单一多核苷酸组成，该多核苷酸包含通过间插单链连接在一起的有义链和反义链。
20.权利要求19的组合物，其中该双链分子具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]是包含选自SEQ ID NO：16、17和19的序列的有义链序列，[B]是由3-23个核苷酸组成的间插单链，[A’]是包含与[A]互补的序列的反义链。
21.权利要求16的组合物，其中该双链分子由载体编码并包含在该组合物中。
22.权利要求21的组合物，其中该双链分子具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]是包含选自SEQ ID NO：16、17和19的序列的有义链，[B]是由3-23个核苷酸组成的间插单链，[A’]是包含与[A]互补的序列的反义链。
23.权利要求16的组合物，其中待治疗的癌症是***癌或激素难治性***癌或去势抵抗性***癌。
24.一种用于诊断***癌的方法，所述方法包括如下步骤：
(a)通过选自下组的任何一种方法测定来自受试者的生物样品中基因的表达水平：
(i)检测包含对应于SEQ ID NO：1、3或5的序列的mRNA，
(ii)检测包含SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列的蛋白质，和
(iii)检测包含SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列的蛋白质的生物活性；和
(b)将基因与正常对照水平相比的表达水平增加与***癌相关联。
25.权利要求24的方法，其中***癌是激素难治性***癌或去势抵抗性***癌。
26.权利要求24的方法，其中表达水平比正常对照水平高至少10％。
27.权利要求24的方法，其中通过检测探针与所述来自受试者的生物样品的基因转录本的杂交来测定表达水平。
28.权利要求27的方法，其中该杂交步骤在DNA阵列上进行。
29.权利要求24的方法，其中通过检测抗体与包含氨基酸序列SEQ ID NO：2或4的蛋白质的结合来测定表达水平。
30.权利要求29的方法，其中该抗体与由SEQ ID NO：32、33或34组成的多肽结合。
31.权利要求24的方法，其中该来自受试者的生物样品包括活检物、痰、血液或尿。
32.一种抗体，其结合包含SEQ ID NO：33或34的氨基酸序列的蛋白质。
33.一种用于检测***癌的组合物，其含有结合包含氨基酸序列SEQ IDNO：2或4的蛋白质的抗体。
34.权利要求33的组合物，其中该抗体结合SEQ ID NO：32，33或34。
35.筛选可用于治疗或预防***癌的化合物的方法，该方法包括如下步骤：
(a)使测试化合物与由PKIB或NAALADL2多核苷酸编码的多肽接触；
(b)检测所述多肽与测试化合物之间的结合活性；和
(c)选择与所述多肽结合的测试化合物。
36.一种筛选用于治疗或预防***癌的化合物的方法，该方法包括如下步骤：
(a)使测试化合物与由PKIB或NAALADL2多核苷酸编码的多肽接触；
(b)检测步骤(a)的多肽的生物活性；和
(c)选择这样的测试化合物：与不存在该测试化合物时检测到的由PKIB或NAALADL2多核苷酸编码的多肽的生物活性相比，该化合物可抑制所述多肽的生物活性。
37.权利要求36的方法，其中该生物活性是易化细胞增殖或PKA-C核积累活性。
38.一种筛选可用于治疗或预防***癌的化合物的方法，该方法包括如下步骤：
(a)使候选化合物与表达PKIB或NAALADL2的细胞接触；
(b)选择如下的候选化合物，与不存在该测试化合物时检测到的PKIB或NAALADL2表达水平相比，该化合物可抑制所述表达水平。
39.一种筛选用于治疗或预防***癌的化合物的方法，该方法包括如下步骤：
(a)使候选化合物与导入了载体的细胞接触，该载体包括PKIB或NAALADL2的转录调节区和在该转录调节区的控制下表达的报告基因；
(b)测量所述报告基因的表达或活性；和
(c)选择与对照相比可降低所述报告基因的表达或活性水平的候选化合物。
40.一种筛选用于治疗或预防***癌的化合物的方法，该方法包括如下步骤：
(a)在测试化合物的存在下，使PKIB多肽或其功能等价物与PKA-C多肽或其功能等价物接触；
(b)检测所述多肽之间的结合；和
(c)选择可抑制所述多肽之间结合的测试化合物。
41.权利要求40的方法，其中PKIB多肽的功能等价物包括由SEQ ID NO：31组成的多肽。
42.权利要求40的方法，其中PKA-C多肽的功能等价物包含PKIB结合域的氨基酸序列。
43.一种筛选用于治疗或预防***癌的化合物的方法，该方法包括如下步骤：
(a)在适合Akt被PKIB多肽磷酸化并有测试化合物存在的条件下温育PKIB多肽或其功能等价物、PKA-C多肽或其功能等价物、以及Akt；
(b)检测Akt的磷酸化水平；和
(c)将步骤(b)中测得的Akt的磷酸化水平与对照水平进行比较；
(d)选择与对照水平相比降低Akt磷酸化水平的化合物。
44.权利要求43的方法，其中在SEQ ID NO：35氨基酸序列的第473位丝氨酸残基处检测Akt的磷酸化水平。
45.权利要求43的方法，其中在细胞中表达PKIB多肽或其功能等价物、PKA-C多肽或其功能等价物、以及Akt，并且通过使细胞或其裂解物与测试化合物接触而将它们在测试化合物存在下进行温育。
46.权利要求35、36、38、39、40和43的方法，其中***癌是激素难治性***癌或去势抵抗性***癌。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112795650A (zh) * 2014-01-03 2021-05-14 皇家飞利浦有限公司 使用靶基因表达的数学建模评价pi3k细胞信号传导途径活性

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6083559B2 (ja) * 2009-07-31 2017-02-22 クロモセル コーポレーション 細胞運命の修飾因子を同定および検証するための方法および組成物
KR101164645B1 (ko) * 2011-10-07 2012-07-20 대한민국 Ｇｃｐⅱ 돌연변이를 함유하는 알츠하이머 예방 및 치료용 약학적 조성물
GB201303308D0 (en) * 2013-02-25 2013-04-10 Oxford Biotherapeutics Ltd Therapeutic and diagnostic target
GB201304612D0 (en) * 2013-03-14 2013-05-01 Cancer Rec Tech Ltd Diagnostic and prognostic biomarkers for prostate cancer and other disorders
KR101824303B1 (ko) 2015-08-06 2018-01-31 부경대학교 산학협력단 종이형 전립선암 진단센서, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 전립선암 진단방법
CN114177296B (zh) * 2021-12-16 2023-05-26 上海交通大学医学院附属第九人民医院 Mpc的过表达或活性提高在制备预防和/或治疗***癌的药物中的应用

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
EP1997894B1 (en) 1992-02-06 2011-03-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
WO1994011026A2 (en) 1992-11-13 1994-05-26 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human b lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of b cell lymphoma
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US7115396B2 (en) 1998-12-10 2006-10-03 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US20050053973A1 (en) 2001-04-26 2005-03-10 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
CA2444854A1 (en) 2001-04-26 2002-11-07 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
US20050048512A1 (en) 2001-04-26 2005-03-03 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
US20040175756A1 (en) 2001-04-26 2004-09-09 Avidia Research Institute Methods for using combinatorial libraries of monomer domains
US20050089932A1 (en) 2001-04-26 2005-04-28 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
US7705120B2 (en) * 2001-06-21 2010-04-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of breast cancer
EP1432724A4 (en) 2002-02-20 2006-02-01 Sirna Therapeutics Inc RNA inhibition mediated inhibition of MAP KINASE GENES
WO2004029212A2 (en) 2002-09-25 2004-04-08 University Of Massachusetts In vivo gene silencing by chemically modified and stable sirna
EP2003196A3 (en) * 2003-06-09 2009-01-07 The Regents of the University of Michigan Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
WO2005044976A2 (en) 2003-06-20 2005-05-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds for use in gene modulation
US20050136437A1 (en) 2003-08-25 2005-06-23 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Nanoparticles for delivery of nucleic acids and stable double-stranded RNA
WO2005045037A2 (en) 2003-10-23 2005-05-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF 5-ALPHA REDUCTASE AND ANDROGEN RECEPTOR GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
EP1733047A2 (en) * 2004-02-27 2006-12-20 Oncotherapy Science, Inc. Pin-prc transition genes
EP2343384A3 (en) * 2004-03-23 2012-01-04 Oncotherapy Science, Inc. Method for diagnosing non-small cell lung cancer
WO2006026051A2 (en) * 2004-08-03 2006-03-09 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Selections of genes and methods of using the same for diagnosis, prognosis and for targeting the therapy of neuroblastoma
ES2379805T3 (es) * 2005-07-27 2012-05-03 Oncotherapy Science, Inc. ECT2 como diana terapéutica del cáncer de esófago
EP2336780A1 (en) * 2005-07-27 2011-06-22 Oncotherapy Science, Inc. Genes and polypeptides relating to prostate cancers

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112795650A (zh) * 2014-01-03 2021-05-14 皇家飞利浦有限公司 使用靶基因表达的数学建模评价pi3k细胞信号传导途径活性

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Publication number Publication date
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US20120022128A1 (en) 2012-01-26
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EP2195425A1 (en) 2010-06-16
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