RU2699180C1 - Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации рнк возбудителей сапа burkholderia mallei и мелиоидоза burkholderia pseudomallei на основе транскрипционной амплификации (nasba) в режиме "реального времени" - Google Patents
Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации рнк возбудителей сапа burkholderia mallei и мелиоидоза burkholderia pseudomallei на основе транскрипционной амплификации (nasba) в режиме "реального времени" Download PDFInfo
- Publication number
- RU2699180C1 RU2699180C1 RU2018118282A RU2018118282A RU2699180C1 RU 2699180 C1 RU2699180 C1 RU 2699180C1 RU 2018118282 A RU2018118282 A RU 2018118282A RU 2018118282 A RU2018118282 A RU 2018118282A RU 2699180 C1 RU2699180 C1 RU 2699180C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- nasba
- burkholderia
- melioidosis
- real time
- labeled probe
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии. Предложен набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации РНК возбудителей сапа Burkholderia mallei и мелиоидоза Burkholderia pseudomallei на основе транскрипционной амплификации NASBA в режиме реального времени. Изобретение может быть использовано для выявления РНК возбудителей сапа Burkholderia mallei и мелиоидоза Burkholderia pseudomallei в пробах чистых культур, биологическом материале и объектах окружающей среды для нужд здравоохранения, службы Роспотребнадзора и в научных исследованиях. 1 ил., 1 табл., 3 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологии и может быть использовано для выявления РНК возбудителей сапа Burkholderia mallei и мелиоидоза Burkholderia pseudomallei в пробах чистых культур, биологическом материале и объектах окружающей среды специалистами учреждений как практического здравоохранения, службы Роспотребнадзора, так и в научных исследованиях.
В связи с развитием транспортного сообщения между странами, расширением туристических направлений, а также значительными миграционными потоками населения возникает настороженность в отношении завоза на территорию РФ новых или «забытых» для страны патогенов, к числу которых относятся возбудители сапа и мелиоидоза. Рост числа подтвержденных случаев заболевания мелиоидозом отмечается не только в эндемичных по данной инфекции регионах Юго-Восточной Азии и Северной Австралии, но и в ряде стран Европы, Северной и Латинской Америки. Заболеваемость людей сапом отмечается редко, в основном носит профессиональный характер, но в ряде стран, в том числе сопредельных с РФ (Монголия, Турция, Иран и др.) продолжают регистрировать вспышки заболевания у животных. Не исключена возможность использования данных возбудителей, которые относятся к микроорганизмам I-II групп патогенности, в качестве потенциальных агентов биотерроризма. Многообразие клинических проявлений сапа и мелиоидоза существенно затрудняют диагностику и своевременное назначение этиотропной терапии этих опасных заболеваний. Совокупность данных факторов определяет необходимость исследований, направленных на совершенствование лабораторных методов выявления патогенных буркхольдерий.
В настоящее время среди молекулярно-генетических способов диагностики различных инфекций все более широкое применение находят методы изотермической амплификации нуклеиновых кислот, что обусловлено их способностью выявлять генетический материал микроорганизма в концентрации меньшей нижнего предела детекции полимеразной цепной реакции (ПЦР). К числу таких методов относится основанная на транскрипции амплификация нуклеиновых кислот NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification). Высокая чувствительность метода достигается использованием в качестве целевой мишени молекул матричной РНК (мРНК) или рибосомальной РНК (рРНК) микроорганизмов, количество которых может достигать нескольких десятков тысяч на одну бактериальную клетку. В ПЦР используемые в качестве мишени даже многокопийные участки ДНК не превышают двух десятков на бактериальную клетку. Поэтому, с помощью метода NASBA можно детектировать возбудителей и в тех случаях, когда их количество очень мало и недостаточно для выявления методом ПЦР. Это особенно актуально при латентном течении инфекции, на фоне отсутствия клинических признаков заболевания. Другим важным свойством РНК в качестве мишени амплификации является ее меньшая стабильность по сравнению с молекулой ДНК, что определяет возможность использования метода NASBA для контроля эффективности проведенной терапии.
В основе метода транскрипционной амплификации NASBA лежит обнаружение фрагмента РНК в изотермических условиях (при температуре 41°С) с помощью двух специфических праймеров и совместной ферментативной активности трех ферментов: обратной транскриптазы вируса миелобластоза птиц {avian myeloblastosis virus reverse transcriptase - AMV RT), РНКазы H Escherichia coli и РНК-полимеразы фага T7. При этом происходит экспоненциальное накопление одноцепочечной РНК, которая является удобной мишенью для гибридизационных методов детекции. Использование флуоресцентно-меченых зондов позволяет регистрировать специфический продукт амплификации непосредственно в процессе реакции в режиме «реального времени», что существенно сокращает время анализа, снижает риск контаминации и увеличивает специфичность метода.
Технология транскрипционной амплификации NASBA в режиме «реального времени» была применена для выявления возбудителей особо опасных инфекций, таких как Vibrio cholerae [Fykse Е.М., Skogan G., Davies W., et al. (2007) Detection of Vibrio cholerae by real-time nucleic acid sequence-based amplification. Appl. Environ. Microbiol. 73(5), 1457-1466] и ряда РНК-содержащих вирусов - высоковирулентного штамма вируса гриппа AH5N1, вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), коронавируса SARS, вируса энцефалита Сент-Луис, вируса гепатита С, вируса бешенства, а также вирусов лихорадок Денге, Западного Нила и Чикунгунья [Sidoti F., Bergallo М., Costa С, Cavallo R. (2013) Alternative molecular tests for virological diagnosis. Mol. Biotechnol. 53(3), 352-362]. Однако диагностические реагенты на основе реакции транскрипционной амплификации NASBA для выявления В. mallei и В. pseudomallei не разработаны.
Наиболее близким аналогом являются панбактериальные праймеры и зонд, сконструированные на основе нуклеотидной последовательности гена 23 S рибосомальной РНК и предназначенные для выявления целевого фрагмента нуклеиновой кислоты бактерий методом NASBA в режиме «реального времени» с целью мониторинга микробиологического качества рециркулируемой воды на борту международной космической станции [Bechy-Loizeau A.L., Flandrois J.P., Abaibou Н. (2015) Assessment of polycarbonate filter in a molecular analytical system for the microbiological quality monitoring of recycled waters onboard ISS. Life Sci. Space. Res. (Amst). 6, 29-35]. Однако отсутствие определения видовой специфичности бактерий с помощью олигонуклеотидов, используемых в вышеприведенном прототипе, исключает возможность их использования для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза.
Целью настоящего изобретения является разработка набора высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации В. mallei и В, pseudomallei методом транскрипционной амплификации NASBA в режиме «реального времени».
Цель достигается созданием набора олигонуклеотидов для идентификации РЫК возбудителей сапа и мелиоидоза, содержащего пару высокоспецифичных олигонуклеотидных полимеров к целевой последовательности гена 23 S рРНК, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в реакции транскрипционной амплификации NASBA, и флуоресцентно-меченый зонд с комплементарными концевыми последовательностями по типу «молекулярного маяка», обеспечивающего детекцию продуктов реакции в режиме «реального времени», имеющих следующую структуру:
5'-ААТ ТСТ ААТ ACG ACT САС TAT AGG GAG ACG GCT ААС ААТ АСА ААТ AAA GAG ТА-3' - Burk23SrRNA-T7-P1
5'-ССТ ТТТ GGG ТСА ТСС TAG А-3' - Burk23SrRNA-P2
5'(FAM)-CCA САС ATA GGT СТА GTG AGG CGT GTG G-(RTQ-1)3' - Burk23SrRNA-MM
где FAM - карбоксифлуоресцеин, флуоресцентный краситель, длина волны поглощения которого составляет 490 нм, а длина волны флуоресценции - 520 нм. RTQ-1 - гаситель флуоресценции с диапазоном гашения 470-570 нм.
Характеристика олигонуклеотидных праймеров, зонда и РНК-мишени для гибридизации.
Основываясь на данных, представленных в международной базе GenBank Национального центра биотехнологической информации США (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome), подобраны праймеры, обозначенные Burk23SrRNA-T7-P l/Burk23SrRNA-P2, комплементарные участку гена 23S pPHK и обеспечивающие в реакции NASBA амплификацию специфичного фрагмента рибонуклеиновой кислоты размером 159 п.н.
Для детекции продуктов амплификации NASBA в режиме «реального времени» сконструирован зонд формата «молекулярный маяк», обозначенный Burk23SrRNA-MM, на разных концах которого расположены флуорофор и гаситель флуоресценции. Подобная структура зонда обеспечивает максимальный эффект тушения и низкую фоновую флуоресценцию, поскольку молекулы флуорофора и гасителя сближены в пространстве.
Апробация разработанного набора олигонуклеотидов была осуществлена на наборе штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза из коллекции ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора. В качестве положительного контроля в экспериментах использовали референтные штаммы В. mallei 10230 и В. pseudomallei С-141. Выделение РНК проводили из обеззараженных бактериальных суспензий микроорганизмов в концентрациях от 1×109 м.к./мл до 1×100 м.к./мл. Специфичность амплификации дополнительно подтверждали секвенированием.
Оптимизацию условий реакции NASBA в режиме «реального времени» проводили с использованием коммерчески доступных реагентов, ферментов и приборов, предназначенных для массового использования в лабораторной практике, что позволяет осуществлять быстрое и надежное применение данного изобретения в медицинских и научно-исследовательских лабораториях.
Примеры конкретного выполнения.
Пример 1. Методика конструирования олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого гибридизационного зонда для идентификации РНК возбудителей сапа и мелиоидоза методом NASBA в режиме «реального времени».
На основе изучения in silico структуры рибосомального кластера генов (16SpPHK, 23SpPHK, 5S рРНК) в составе секвенированных нуклеотидных последовательностей возбудителей сапа и мелиоидоза, представленных в генетической базе данных GenBank NCBI, для конструирования праймеров и зонда был выбран ген 23S рРНК (GeneID: 3112968 (BPSLr08)) (таб. 1).
Для синтеза целевого фрагмента 23 S рРНК методом транскрипционной амплификации NASBA подобрана пара праймеров Burk23SrRNA-T7-P1 и Burk23SrRNA-P2, длина нуклеотидной последовательности которых составила 53 и 19 нуклеотидов, соответственно. GC-содержание гибридизующихся частей праймеров с мишенью составило 32% для праймера Burk23SrRNA-T7-P1 и 47,4% для праймера Burk23SrRNA-P2. При конструировании праймера Burk23SrRNA-T7-P1 для формирования функционального промотора Т7 РНК-полимеразы к 5'-концевому участку добавлена последовательность длиной 25 нуклеотидов. Между промоторной зоной праймера Burk23SrRNA-T7-P1 и его участком, гибридизующимся с мишенью, дополнительно добавлены три пуриновых нуклеотида с целью улучшения амплификации. Расчетный размер фрагмента гена 23S рРНК, фланкируемого предлагаемыми праймерами, - 159 п.н.
Для детекции продуктов реакции NASBA в режиме «реального времени» сконструирован зонд Burk23SrRNA-MM в формате «молекулярный маяк», потенциально способный гибридизоваться с амплифицированными 23 S рРНК-мишенями возбудителей сапа и мелиоидоза с образованием стабильных гибридов при температуре 41°С. Флуоресцентное мечение зонда осуществляли ко мбинацией красителя FAM на 5'-конце и гасителя RTQ-1 на 3'-конце. Сконструированный флуоресцентно-меченый зонд представлял собой стебель-петля-структурированный олигонуклеотид и имел в регионе стебля 6 взаимнокомплементарных нуклеотидов, при этом размер петли составил 16 нуклеотидов. Вторичную структуру и термодинамические параметры разработанного зонда оценивали в онлайн-режиме с использованием сервера Mfold Web Server (http://mfold.rna.albany.edu).
Предварительно специфичность разработанных праймеров и зонда оценивали in silico методом множественного сравнения последовательностей с помощью ресурса BLAST NCBI для установления гомологии между ними и нуклеотидными последовательностями близкородственных видов рода Burkholderia и гетерологичных микроорганизмов. На момент проведения компьютерного анализа гомологии выявлено не было.
Пример 2. Амплификация и детекция специфических фрагментов 23S рРНК с помощью разработанного набора праймеров Burk23SrRNA-T7-P1/Burk23SrRNA-P2 и флуоресцентно-меченого зонда Burk23SrRNA-MM для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза методом NASBA в режиме «реального времени».
Для проведения NASBA в режиме «реального времени» с разработанными праймерами Burk23SrRNA-T7-P1/Burk23SrRNA-P2 и олигонуклеотидным зондом Burk23SrRNA-MM необходимо отдельно приготовить раствор ферментов и реакционную смесь, содержащую все остальные компоненты реакции.
Реакционная смесь объемом 12.3 мкл (из расчета на одну пробу) включала следующие компоненты: 40 мМ Tris-HCl (рН=8,5), 1 мМ каждого из дезоксинуклеозидтрифосфатов («Fermentas», США), 2 мМ каждого из рибонуклеозидтрифосфатов («Fermentas», США), 12 мМ MgCb («Dialat Ltd», Россия), 87 мМ KCl («Sigma-ALDRICH», Германия), 0.5 мМ DTT («Fermentas», США), 15% ДМСО («АррНСЬет», Германия), 0.125 мкМ прямого и обратного праймеров и 0.0625 мкМ флуоресцентно-меченого зонда. Полученную реакционная смесь выдерживали при температуре 65°С в течение 5 мин.
Раствор ферментов объемом 2.7 мкл (из расчета на одну пробу) включал следующие компоненты: 2.1 мкг BSA («Fermentas», США), 0.08 активных единиц RNase Н («Thermo Scientific)), США), 6.4 активных единиц AMV Reverse Transcriptase («Promega», США), 32 активные единицы Т7 RNA Polymerase («Thermo Scientific)), США).
В микроцентрифужные пробирки объемом 0,2 мл вносили 12.3 мкл приготовленной реакционной смеси и 5 мкл экстракта РНК анализируемых образцов, после чего термостатировали в следующем режиме: 65°С - 5 мин, 41°С - 5 мин. По окончании инкубации добавляли раствор ферментов и устанавливали пробирки в амплификатор. В качестве отрицательного контрольного образца в реакционную смесь добавляли РНК-буфер.
Реакцию транскрипционной амплификации NASBA в режиме «реального времени» проводили на приборе «Rotor-Gene Q» («QIAGEN GmbH», Германия) в изотермических условиях: 41°С - 5 мин, затем 95 циклов (41°С - 60 с) с детекцией интенсивности флуоресцентного сигнала.
Регистрацию результатов проводили в графической и табличной форме. Детекцию продукта амплификации участка 23SpPHK В. mallei и В. pseudomallei для флуорофора FAM осуществляли по каналу Green. Результат считали положительным в случае, если кривая накопления флуоресценции для соответствующего образца имела характерную «сигмовидную» форму и пересекала установленную на определенном уровне пороговую линию, что соответствует наличию значения порогового цикла «Ct» в соответствующей графе в таблице результатов.
Пример 3. Определение чувствительности и специфичности реакции транскрипционной амплификации NASBA в режиме «реального времени» с помощью разработанного набора олигонуклеотидных праймеров Burk23SrRNA-T7-P l/Burk23SrRNA-P2 и флуоресцентно-меченого зонда Burk23SrRNA -ММ для идентификации РНК В. mallei и В. pseudomallei.
Чувствительность реакции транскрипционной амплификации NASBA с разработанным набором олигонуклеотидных праймеров Burk23SrRNA-T7-Pl/Burk23SrRNA-P2 и флуоресцентно-меченого зонда Burk23SrRNA-MM оценивали при исследовании десятикратных разведений препаратов РНК, полученных из чистых культур возбудителей сапа и мелиоидоза. Штаммы буркхольдерий выращивали на плотных питательных средах в течение 1-2 суток. Готовили бактериальные взвеси клеток в 4 мл 0,15 М раствора натрия хлорида в концентрации 1×109 м.к./мл по отраслевому стандартному образцу мутности 10 единиц ФГБУ «НЦЭСМП» (ОСО 42-28-85-П (10МЕ).
Предварительную инактивацию образцов и выделение нуклеиновых кислот проводили в условиях, регламентированных СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности» и методическими указаниями МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Процедуру выделения нуклеиновых кислот из исследуемого материала осуществляли с использованием набора «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) согласно инструкции производителя. Постановку реакции NASBA в режиме «реального времени» проводили, как описано в примере 2.
Измерение концентрации РНК проводили при помощи коммерческого набора «Qubit™ RNA HS Assay Kit» («Invitrogen», США) и флуориметра «QUBIT 2.0» («Invitrogen», США). Определение количества тотальной РНК осуществляли в пробах чистых культур В. mallei и В. pseudomallei, выделенных из концентрации 1×108 м.к./мл, а затем проводили последовательные десятикратные разведения образцов нуклеиновых кислот.
В результате была определена чувствительность реакции транскрипционной амплификации NASBA в режиме «реального времени» с разработанным набором олигонуклеотидов, составившая 0.4 фг/мкл тотальной РНК в образце, что соответствовало 101 м.к./мл (рис. 1).
Рисунок 1 отображает график нарастания кривых флуоресценции, полученных при амплификации РНК штаммов В. mallei 10230 и В. pseudomallei С-141 с помощью сконструированных праймеров Burk23SrRNA-T7-P1/Burk23SrRNA-P2 и зонда Burk23SrRNA-ММ (1 - В. mallei 10230 в концентрации 102 м.к./мл, 2 - В. pseudomallei С-141 в концентрации 102 м.к./мл, 3-B. mallei 10230 в концентрации 101 м.к./мл, 4 - В. pseudomallei С-141 в концентрации 101 м.к./мл, 5 - отрицательный контроль).
Специфичность разработанного набора олигонуклеотидов оценена на коллекции из 58 штаммов микроорганизмов, из которых 14 штаммов В. mallei, 20 штаммов В. pseudomallei и 24 штаммов гетерологичных микроорганизмов (12 штаммов Burkholderia cepacia, 5 штаммов Burkholderia thailandensis и по 1 штамму Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Bacillus anthracis, Echerichia coli). Оценка специфичности показала отсутствие перекрестных реакций с гетерологичными штаммами и наличие специфической амплификации со всеми штаммами В. mallei и В. pseudomallei.
Таким образом, разработанный набор олигонуклеотидных праймеров Burk23SrRNA-T7-P1/Burk23SrRNA-P2 и флуоресцентно-меченого зонда Burk23SrRNA-MM может быть использован для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза методом транскрипционной амплификации NASBA в режиме «реального времени» и позволяет в короткий срок с высокой чувствительностью и специфичностью детектировать РНК В. mallei и В. pseudomallei в пробах чистых культур, биологическом материале и объектах окружающей среды.
Claims (5)
- Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации РНК возбудителей сапа Burkholderia mallei и мелиоидоза Burkholderia pseudomallei на основе транскрипционной амплификации (NASBA) в режиме «реального времени», содержащий пару высокоспецифичных олигонуклеотидных полимеров к целевой последовательности гена 23S рРНК, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в реакции транскрипционной амплификации NASBA, и флуоресцентно-меченый зонд с комплементарными концевыми последовательностями по типу «молекулярного маяка», обеспечивающего детекцию продуктов реакции в режиме «реального времени», имеющих следующую структуру:
- 5'-AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ACG GCT AAC AAT ACA AAT AAA GAG TA-3' - Burk23SrRNA-T7-P1
- 5'-CCT TTT GGG TCA TCC TAG A-3' - Burk23SrRNA-P2
- 5'(FAM)-CCA CAC ATA GGT CTA GTG AGG CGT GTG G-(RTQ-1)3' - Burk23SrRNA-MM,
- где FAM - карбоксифлуоресцеин, флуоресцентный краситель, длина волны поглощения которого составляет 490 нм, а длина волны флуоресценции - 520 нм. RTQ-1 - гаситель флуоресценции с диапазоном гашения 470-570 нм.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018118282A RU2699180C1 (ru) | 2018-05-17 | 2018-05-17 | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации рнк возбудителей сапа burkholderia mallei и мелиоидоза burkholderia pseudomallei на основе транскрипционной амплификации (nasba) в режиме "реального времени" |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018118282A RU2699180C1 (ru) | 2018-05-17 | 2018-05-17 | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации рнк возбудителей сапа burkholderia mallei и мелиоидоза burkholderia pseudomallei на основе транскрипционной амплификации (nasba) в режиме "реального времени" |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2699180C1 true RU2699180C1 (ru) | 2019-09-03 |
Family
ID=67851850
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018118282A RU2699180C1 (ru) | 2018-05-17 | 2018-05-17 | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации рнк возбудителей сапа burkholderia mallei и мелиоидоза burkholderia pseudomallei на основе транскрипционной амплификации (nasba) в режиме "реального времени" |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2699180C1 (ru) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011146756A1 (en) * | 2010-05-19 | 2011-11-24 | The Translational Genomics Research Institute | Methods and kits useful in the differentiation of burkholderia species |
| RU2545710C2 (ru) * | 2013-07-26 | 2015-04-10 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Олигонуклеотидные праймеры burk1526s/burk1526as для оценки адаптационной изменчивости генома патогенных буркхольдерий |
| AU2013262783B2 (en) * | 2012-05-15 | 2018-03-29 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Northern Arizona University | Primers, assays and methods for detecting Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei |
-
2018
- 2018-05-17 RU RU2018118282A patent/RU2699180C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011146756A1 (en) * | 2010-05-19 | 2011-11-24 | The Translational Genomics Research Institute | Methods and kits useful in the differentiation of burkholderia species |
| AU2013262783B2 (en) * | 2012-05-15 | 2018-03-29 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Northern Arizona University | Primers, assays and methods for detecting Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei |
| RU2545710C2 (ru) * | 2013-07-26 | 2015-04-10 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Олигонуклеотидные праймеры burk1526s/burk1526as для оценки адаптационной изменчивости генома патогенных буркхольдерий |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| САВЧЕНКО С.С. Генотипирование штаммов Burkholderia mallei и Burkholderia pseudomallei. Авто диссертации. ВАК РФ 03.00.07, Микробиология. ВОЛГОГРАД - 2008. * |
| САВЧЕНКО С.С. Генотипирование штаммов Burkholderia mallei и Burkholderia pseudomallei. Автореферат диссертации. ВАК РФ 03.00.07, Микробиология. ВОЛГОГРАД - 2008. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Uphoff et al. | Detection of Mycoplasma contamination in cell cultures | |
| JP2024081792A (ja) | ウイルスおよび細菌病原体の直接増幅および検出 | |
| CN108546736A (zh) | 用于检测和鉴定生物样品中的核酸序列的组合物和方法 | |
| TW201706414A (zh) | 核酸偵測和定量方法及組合物 | |
| JP4903722B2 (ja) | ウイルスを用いることによる試料中の生細胞を検出するための方法 | |
| US20080090224A1 (en) | Nucleic acid detection | |
| JP2023536962A (ja) | 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ｓａｒｓ－２）、インフルエンザａ及びインフルエンザｂの検出のための組成物及び方法 | |
| US11041216B2 (en) | Compositions and methods for detecting and quantifying nucleic acid sequences in blood samples | |
| JP2014501494A (ja) | 核酸標的の定量的多重同定 | |
| RU2551208C1 (ru) | НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ И ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНОГО ЗОНДА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ Burkholderia mallei И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЕГО ОТ Burkholderia pseudomallei | |
| CN106916903A (zh) | 结核分枝杆菌85B mRNA的实时荧光RT‑PCR检测方法及试剂盒 | |
| RU2699180C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации рнк возбудителей сапа burkholderia mallei и мелиоидоза burkholderia pseudomallei на основе транскрипционной амплификации (nasba) в режиме "реального времени" | |
| JP2009039105A (ja) | 抗酸菌属細菌の検出用オリゴヌクレオチドおよびその用途 | |
| AU2019375773B2 (en) | Rapid PCR methodology | |
| US20170283888A1 (en) | Use of rnase h for the selective amplification of viral dna | |
| WO2019163672A1 (ja) | 白癬菌の遺伝子をｌａｍｐ法により検出するためのプライマーセット及びそれを含むキット並びにそれらを用いて白癬菌を検出する方法 | |
| Zhuang et al. | Unique Barcoded Primer-Assisted Sample-Specific Pooled Testing (Uni-Pool) for Large-Scale Screening of Viral Pathogens | |
| US20120082995A1 (en) | Method for quantitative pcr amplification of deoxyribonucleic acids from a sample containing pcr inhibitors | |
| RU2738358C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов и способ выявления ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза методом ПЦР с детекцией продукта в режиме реального времени | |
| RU2556810C1 (ru) | НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ И ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНОГО ЗОНДА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ Burkholderia pseudomallei | |
| JP7472476B2 (ja) | プライマー及び百日咳菌 ｒＲＮＡの検出方法 | |
| RU2776163C1 (ru) | Способ выявления ДНК бактерии Mycobacterium tuberculosis с помощью изотермической петлевой амплификации | |
| RU2737396C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса западного нила 4 генотипа (west nile virus lineage 4) | |
| Yang et al. | Design of synthetic biology for the detection of microorganisms | |
| WO2017091809A1 (en) | Compositions and methods for detecting and quantifying nucleic acid sequences in blood samples |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200518 |