CN102171346A - 产生嘌呤核糖核苷和核糖核苷酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术,并具体涉及产生嘌呤核糖核苷的方法,其作为供合成嘌呤核苷酸的原材料是重要的。所述方法使用经修饰而减少3-己酮糖-6-磷酸合酶活性的属于芽孢杆菌属的细菌。
Description
技术领域
本发明涉及微生物工业,且具体涉及产生嘌呤核糖核苷的方法,其作为嘌呤核苷酸合成中的原材料是重要的。所述方法使用经修饰而弱化编码3-己酮糖-6-磷酸的基因的表达的芽孢杆菌属(Bacillus)细菌。
背景技术
已知使用腺嘌呤营养缺陷型菌株发酵产生嘌呤核苷的方法。而且,这些菌株可被进一步赋予针对多种药物如嘌呤类似物和磺胺胍(sulfaguanidine)的抗性。这些菌株的实例包括多种芽孢杆菌属菌株(日本专利公开号38-23039(1963)、54-17033(1979)、55-2956(1980)和55-45199(1980),日本专利申请公开号56-162998(1981)、日本专利公开号57-14160(1982)和57-41915(1982),以及日本专利申请公开号59-42895(1984)),短杆菌属(Brevibacterium)菌株(日本专利公开号51-5075(1976)和58-17592(1972),以及Agric.Biol.Chem.,42,399(1978)),埃希氏菌属(Escherichia)菌株(WO9903988)等。
获得上述突变体菌株常规地是通过对微生物通过UV辐射或通过用亚硝基胍(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)处理进行诱变,并通过使用合适的选择培养基来选择具有所需特征的菌株而实现的。或者,突变体菌株已通过使用遗传工程技术进行培育而获得,例如对于芽孢杆菌属的菌株(日本专利申请公开号58-158197(1983)、58-175493(1983)、59-28470(1984)、60-156388(1985)、1-27477(1989)、1-174385(1989)、3-58787(1991)、3-164185(1991)、5-84067(1993)和5-192164(1993)号,美国专利7,326,546(2008))和短杆菌属的菌株(日本专利申请公开号63-248394(1988))。这些产生肌苷的菌株的生产力(productivity)可进一步通过增加它们分泌肌苷酸的能力来改进(俄罗斯专利申请号2002101666、2002104463和2002104464)。
核酮糖单磷酸(RuMP)途径是用于从一碳单位合成含碳碳键化合物的代谢途径之一,并存在于许多利用甲醇和甲醛,称作甲基营养菌(methylotroph)的细菌中。该途径的特征性酶是3-己酮糖-6-磷酸合酶(3-hexulose-6-phosphatesynthase,HPS)和6-磷酸-3-己酮糖异构酶(6-phospho-3-hexuloisomerase,PIH),人们认为两者皆不存在于非甲基营养菌之外。然而,枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的假定的yckG基因产物(YckG)具有类似于甲基营养菌HPS相应基因产物的一级结构。也研究了yckF基因产物(YckF)与甲基营养菌PHI之间的序列相似性,并发现枯草芽孢杆菌的yckG和yckF基因分别表达具有HPS和PHI酶活性的蛋白质。在枯草芽孢杆菌中,用甲醛可相伴地诱导这两种活性,显示对yckH基因的依赖性,但用甲醇、甲酸或甲胺并无法对其进行诱导。破坏两个基因任一导致对甲醛的中等敏感性,表明这些酶可在枯草芽孢杆菌中作为对甲醛的解毒***起作用。在非甲基营养菌枯草芽孢杆菌中发现了活性的yckG(对于HPS)-yckF(对于PHI)基因结构,其固有地保存了RuMP途径(Yasueda,H.等,J.Bacteriology,181(23),p.7154-7160(1999))。
然而,先前并未报道为了改善嘌呤核糖核苷生产力的目的使编码3-己酮糖-6-磷酸合酶的基因失活。
发明内容
本发明的一个方面是改善适于通过发酵产生嘌呤核苷的微生物,并提供使用所述微生物的菌株产生嘌呤核苷的方法。
该目标是通过发现弱化编码3-己酮糖-6-磷酸合酶的基因的表达可增强嘌呤核苷如肌苷、黄苷、鸟苷或腺苷的产生而实现的。
本发明提供了具有增加的产生嘌呤核苷的能力的属于芽孢杆菌属的细菌,特别是,提供了枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。
本发明的一个方面是提供能够产生嘌呤核苷的芽孢杆菌属细菌,其中所述细菌经修饰而减少了3-己酮糖-6-磷酸合酶(HPS)活性。
本发明的另一个方面是提供能够产生嘌呤核苷的细菌,其中所述细菌经修饰而弱化了编码3-己酮糖-6-磷酸合酶(HPS)的基因的表达。
本发明的另一个方面是提供如上所述的细菌,其中所述编码3-己酮糖-6-磷酸合酶的表达是通过使所述基因失活来弱化的。
本发明的另一个方面是提供如上所述的细菌,其中所述编码3-己酮糖-6-磷酸合酶的基因是hxlA基因。
本发明的另一个方面是提供如上所述的细菌,其中所述细菌是枯草芽孢杆菌。
本发明的另一个方面是提供如上所述的细菌,其中所述细菌是解淀粉芽孢杆菌。
本发明的另一个方面是提供如上所述的细菌,其中所述嘌呤核苷选自下组:肌苷、黄苷、鸟苷和腺苷。
本发明的另一个方面是提供产生嘌呤核苷的方法,其包括在培养基中培养如上所述的细菌,使所述嘌呤核苷分泌至所述培养基中,并从培养基收集所述嘌呤核苷。
本发明的另一个方面是提供如上所述的方法,其中所述嘌呤核苷选自下组:肌苷、黄苷、鸟苷和腺苷。
本发明的另一个方面是提供产生嘌呤核苷酸的方法,其包括在培养基中培养如上所述的细菌,使所述嘌呤核苷能够分泌至所述培养基中,将所述嘌呤核苷磷酸化,并分离嘌呤核苷酸。
本发明的另一个方面是提供如上所述的方法,其中所述嘌呤核苷酸选自下组:5’-肌苷酸、黄苷-5’-磷酸、5’-鸟苷酸和5’-腺苷酸。
附图简述
图1显示pKS1质粒的结构和独特的限制位点。
优选实施方案的详述
下面详细描述本发明。
1.本发明的细菌
所述细菌能够产生嘌呤核苷,并经修饰而减少3-己酮糖-6-磷酸合酶活性。所述细菌属于芽孢杆菌属。
芽孢杆菌属细菌的实例包括枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subsp.subtilis)菌株168(B.subtilis 168)或解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)。解淀粉芽孢杆菌是异源物种。已知多种解淀粉芽孢杆菌菌株,包括SB、T、P、W、F、N、K和H(Welker N.E.,Campbell L.L.,Unrelatedness of Bacillusamyloliquefaciens and Bacillus subtilis.J.Bacteriol.,94:1124-1130,1967)。近来,从植物分离了芽孢杆菌属菌株,其视为解淀粉芽孢杆菌的不同生态型(Reva等, Taxonomic characterization and plant colonizing abilities of some bacteria relatedto Bacillus amyl
属于芽孢杆菌属的细菌的实例还包括下述:地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymixa),和嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)。
除了已经提及的性质之外,所述细菌还可具有多种营养需求、药物抗性、药物敏感性和药物依赖性。
短语“嘌呤核苷”包括肌苷、黄苷、鸟苷和腺苷,优选为肌苷。
短语“能够产生嘌呤核苷”意指产生嘌呤核苷并导致其在培养基中积累的能力。短语“细菌具有产生嘌呤核苷的能力”意指所述属于芽孢杆菌属的细菌能够以大于或芽孢杆菌属细菌例如枯草芽孢杆菌(如枯草芽孢杆菌168)的野生型或未经修饰的菌株的量产生嘌呤如嘌呤核苷,并导致其在培养基中积累。优选地,该短语意指所述微生物能够以不少于10mg/l,更优选不少于50mg/l的量产生嘌呤核苷(如肌苷、黄苷、鸟苷和腺苷),并导致其在培养基中积累。
术语“HPC的活性”意指催化通过甲醛与核酮糖-5-磷酸的Mg2+-依赖性羟醛缩合而形成D-***-3-己酮糖-6-磷酸的反应的活性。所述HPS活性可如Yasueda,H.等(J.Bacteriology,181(23),p.7154-7160(1999))中所述进行测量。
已经阐明了编码来自枯草芽孢杆菌的HPS的基因,更具体地,来自枯草芽孢杆菌枯草亚种菌株168的hxlA基因(同物异名:yckG)(与GenBank登录号NC 000964的核苷酸374725至375357互补的核苷酸)。来自枯草芽孢杆菌的hxlA基因位于染色体上hxlB和hxlR基因之间。枯草芽孢杆菌hxlA基因的核苷酸序列和由hxlA基因编码的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
已经阐明了编码来自解淀粉芽孢杆菌的HPS的基因,更具体地,来自解淀粉芽孢杆菌菌株FZB42的hxlA基因(与GenBank登录号NC 009725的核苷酸340797至341432互补的核苷酸)。来自解淀粉芽孢杆菌的hxlA基因位于染色体上hxlB和hxlR基因之间。解淀粉芽孢杆菌hxlA基因的核苷酸序列和由hxlA基因编码的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
通常,基因在引入细菌之前,可克隆入能够在芽孢杆菌属细菌中起作用的载体。为此目的,可使用穿梭载体如pHY300PLK、pMWMX1、pLF22或pKS1。通过同源重组将野生型基因替换为突变体。
因为在芽孢杆菌属菌株的DNA序列之间可能有一些差异,在染色体上待失活的hxlA基因并不限于示于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的基因,而可包括与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3同源并编码变体HPS蛋白质的基因。如本发明中所用的短语“变体HPS蛋白质”意指在序列上具有变化(所述变化无论为缺失、***、添加或取代)但仍保持HPS蛋白质的活性的蛋白质。变体蛋白质中的变化数取决于蛋白质三维结构中的位置或氨基酸残基的类型。其可为在SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4中1至30,优选1至15,且更优选1至5个。这些变化可发生于蛋白质中对该蛋白质功能并不重要的区域中。这是因为一些氨基酸彼此具有高同源性,从而使三维结构或活性不受上述变化的影响。因此,由hxlA基因编码的蛋白质变体可为与SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:4中所示的完整氨基酸序列相比具有不少于80%,优选不少于90%,更优选不少于95%,还更优选不少于98%,且最优选不少于99%的同源性的变体,只要其在失活所述hxlA基因之前保持HPS蛋白质的活性。
两个氨基酸序列之间的同源性可使用众所周知的方法来确定,例如,计算机程序BLAST 2.0,其计算三个参数:得分、同一性和相似性。
而且,所述hxlA基因可为在严格条件下与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3中所示的核苷酸序列,或在严格条件下与可从该核苷酸序列制备的探针杂交的变体,只要其编码在失活之前具有功能的HPS蛋白质。“严格条件”包括那些形成特异性杂合体例如具有不少于60%,优选不少于70%,更优选不少于80%,更优选不少于90%,更优选不少于95%,还更优选不少于98%,且最优选不少于99%的特异性的杂合体,且不形成非特异性杂合体如具有低于上述同源性的杂合体的条件。例如,严格条件可例示为:在60℃,在1xSSC,0.1%SDS,优选0.1xSSC,0.1%SDS的盐浓度洗涤一次或多次,优选两次或三次。洗涤的持续时间取决于用于印迹的膜的类型,并一般而言,可为制造商推荐的持续时间。例如,在严格条件下,对于HybondTM N+尼龙膜(Amersham)的推荐的洗涤持续时间是15分钟。优选地,洗涤可进行2至3次。可根据杂交条件合适地选择探针的长度,通常为100bp至1kbp。
可通过将突变引入染色体上的hxlA基因来弱化其表达,从而使得由该基因编码的蛋白质的胞内活性与未经修饰的菌株相比减少。上述突变可为一个或多个碱基的替代,导致由该基因编码的蛋白质中的氨基酸取代(错义突变),引入终止密码子(无义突变),缺失一个或两个碱基以导致移码,***药物抗性基因,或缺失基因的部分或整个基因。还可通过修饰表达调节序列如启动子,Shine-Dalgarno(SD)序列等来弱化hxlA基因的表达。
例如,可使用下述方法通过基因重组引入突变。制备含突变基因的DNA片段,并将其转化入细菌。然后通过同源重组用所述突变基因替代细菌染色体上的天然基因,并选择所得的菌株。所述使用同源重组的基因替代可通过采用线性DNA的方法来进行,其称作“Red-驱动整合(Red-driven integration)”(Datsenko,K.A.和Wanner,B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97,12,p6640-6645(2000)),或可通过采用含温度敏感性复制起点的质粒的方法来进行(美国专利6,303,383或JP 05-007491A)。而且,如上所述的使用同源重组通过基因取代来并入位点-特异性突变还可通过用缺乏在宿主中复制能力的质粒转化来进行。
还可通过将转座子或IS因子***基因的编码区(美国专利5,175,107号),或通过常规方法如通过使用UV辐射的诱变或用亚硝基胍(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)处理来弱化所述基因的表达。
还可通过常规方法如通过使用UV辐射的诱变或用亚硝基胍(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)处理、定位诱变、使用同源重组的基因破坏和/或***-缺失诱变来进行基因的失活。
可通过在固有地具有产生嘌呤核苷的能力的细菌中弱化编码HPS的基因的表达来获得所述细菌。或者,可通过将产生嘌呤核苷的能力赋予其中HPS基因的表达弱化的细菌来获得所述细菌。
可用于得到所述芽孢杆菌属细菌的亲本芽孢杆菌属菌株的实例是产生肌苷的枯草芽孢杆菌菌株KMBS375(KMBS375:Ppur*-Δatt ΔpurA ΔpurR ΔpupGΔdeoD guaB24;参考实施例)。其它亲本芽孢杆菌属菌株包括枯草芽孢杆菌菌株AJ12707(FERM P-12951)(日本专利申请JP6113876A2)、枯草芽孢杆菌菌株AJ3772(FERM P-2555)(日本专利申请JP62014794A2)、短小芽孢杆菌NA-1102(FERMBP-289)、枯草芽孢杆菌NA-6011(FERMBP-291)、枯草芽孢杆菌G1136A(ATCC No.19222)(美国专利3,575,809)(重新鉴定为解淀粉芽孢杆菌AJ1991,于2005年10月3日作为解淀粉芽孢杆菌G1136A保藏于VKPM(VKPM B-8994),并在2006年10月13日转为国际保藏)、枯草芽孢杆菌NA-6012(FERM BP-292)(美国专利4,701,413)、短小芽孢杆菌Gottheil No.3218(ATCC No.21005)(美国专利3,616,206)、解淀粉芽孢杆菌菌株AS115-7(VKPM B-6134)(俄罗斯专利号2003678)等。还可使用枯草芽孢杆菌菌株KMBS16。该菌株是已知的枯草芽孢杆菌168trpC2菌株的衍生物,其中编码嘌呤阻遏物的purR基因(purR::spc)、编码琥珀酰-AMP合酶的purA基因(purA::erm)和编码嘌呤核苷磷酸化酶的deoD基因(deoD::kan)(俄罗斯专利申请号2002103333,美国专利7,326,546,2008)均含有突变。
可通过增强一种或多种涉及嘌呤生物合成的基因,包括枯草芽孢杆菌的pur操纵子(Ebbole D.J.和Zalkin H.J.Biol.Chem.,262:8274-87(1987),Bacillus subtilis and Its Closest Relatives,Editor in Chief:A.L.Sonenshein,ASMPress,Washington D.C.,2002)的表达来进一步改善所述细菌。已经描述了具有经修饰的pur操纵子调节区的产生肌苷的枯草芽孢杆菌菌株(美国专利7,326,546,2008)。
用于制备染色体DNA、杂交、PCR、制备质粒DNA,消化和连接DNA、转化、选择寡聚核苷酸作为引物等的方法可为本领域技术人员公知的普通方法。这些方法描述于Sambrook,J.,和Russell D.,“Molecular Cloning ALaboratory Manual,第3版”,Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)等。
2.产生核苷的方法
产生核苷如肌苷和/或鸟苷的方法,包括下述步骤:在培养基中培养细菌,以使所述核苷在所述培养基中产生并积累,并从培养基收集所述核苷。
培养和从所述培养基收集和纯化嘌呤核苷等可以以类似于常规发酵的方式进行,其中使用微生物产生嘌呤核苷。用于嘌呤核苷产生的培养基可为含有碳源、氮源、无机离子和根据需要的其它有机组分的一般培养基。作为碳源,可使用糖类如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖、***糖、麦芽糖、木糖、海藻糖、核糖和淀粉水解物;醇类如甘油、甘露醇和山梨醇;有机酸如葡糖酸、延胡索酸、柠檬酸和琥珀酸等。作为氮源,可使用无机铵盐如硫酸铵、氯化铵和磷酸铵;有机氮如大豆水解物;氨气;氨水等。合意的是维生素如维生素B1,必需物质,例如有机营养物如核酸(如腺嘌呤和RNA),或者酵母提取物等可以适量或甚至痕量存在。除这些之外,如果需要,可添加少量磷酸钙、硫酸镁、铁离子、锰离子等。
培养优选在有氧条件下进行16至72小时,且将培养期间的培养温度控制在30至45℃,而pH控制在5至8。可使用无机或有机的酸性或碱性物质以及氨气来调整pH。
在培养之后,可通过离心或膜过滤从液体培养基去除固形物如细胞,然后可从发酵液通过常规技术(如离子交换树脂和沉淀)的任意组合回收目标嘌呤核苷。
3.产生嘌呤核苷酸的方法
产生嘌呤核苷酸的方法包括下述步骤:在培养基中培养细菌,将所需的嘌呤核苷磷酸化,使其通过细菌分泌入培养基,并收集嘌呤核苷酸。此外,产生5’-肌苷酸的方法包括下述步骤:在培养基中培养细菌,将肌苷磷酸化,使其通过细菌分泌入培养基,并收集5’-肌苷酸。此外,产生5’-黄苷酸的方法包括下述步骤:在培养基中培养细菌,将黄苷磷酸化,使其通过细菌分泌入培养基,并收集5’-黄苷酸。此外,产生5’-鸟苷酸的方法包括下述步骤:在培养基中培养细菌,将鸟苷磷酸化,使其通过细菌分泌入培养基,并收集5’-鸟苷酸。且产生5’-鸟苷酸的方法包括下述步骤:在培养基中培养细菌,将黄苷磷酸化,使其通过细菌分泌入培养基,将5’-黄苷酸胺化,并收集5’-鸟苷酸。
可从细菌将嘌呤核苷分泌至培养基的培养基收集待磷酸化的嘌呤核苷。然而含有嘌呤核苷的培养基可用于磷酸化反应,而无需分离或纯化嘌呤核苷。
培养和从所述培养基收集和纯化肌苷等可以以类似于常规发酵方法的方式进行,其中使用微生物产生肌苷。此外,将肌苷磷酸化,使其通过细菌分泌至培养基和收集5’-肌苷酸的步骤可以以类似于常规发酵方法的方式进行,其中从嘌呤核苷如肌苷产生嘌呤核苷酸如5’-肌苷酸。
嘌呤核苷的磷酸化可使用不同的磷酸酶、核苷激酶或核苷磷酸转移酶以酶法进行,或使用磷酸化剂如POCl3等以化学方法进行。可使用能够催化将焦磷酸的磷酰基C-5’位选择性转移至核苷的磷酸酶(Mihara等,Phosphorylation ofnucleosides by the mutated acid phosphatase from Morganella morganu.Appl.Environ.Microbiol.,66:2811-2816(2000))或利用多聚磷酸(盐)、苯基磷酸(盐)或氨甲酰磷酸(盐)作为磷酸供体的酸性磷酸酶(WO9637603A1)等。同样,可使用能够利用对硝基苯基磷酸(Mitsugi,K.等,Agric.Biol.Chem.,28,586-600(1964))、无机磷酸(日本专利申请或日本专利申请公开号JP42-1186)或乙酰基磷酸(日本专利申请或日本专利申请公开号JP61-41555)作为底物,催化将磷酰基转移至核苷的C-2’、3’或5’位的磷酸酶。作为核苷激酶的实例,可使用来自大肠杆菌的鸟苷/肌苷激酶(Mori,H.等Cloning of a guanosine-inosine kinasegene of Escherichia coli and characterization of the purified gene product.J.Bacteriol.177:4921-4926(1995);WO9108286)等。可使用由Hammer-Jespersen,K.(Nucleoside catabolism,p.203-258.In A Munch-Petesen(编),Metabolism ofnucleotides,nucleosides,and nucleobases in microorganism.1980,Academic Press,New York)描述的核苷磷酸转移酶等。核苷的化学磷酸化可使用磷酸化剂如POCl3(Yoshikawa,K.等Studies of phosphorylation.III.Selective phosphorylationof unprotected nucleosides.Bull.Chem.Soc.Jpn.42:3505-3508(1969))等进行。
5’黄苷酸的胺化可使用例如来自大肠杆菌的GMP合酶以酶法进行(Fujio等.High level of expression of XMP aminase in Escherichia coli and itsapplication for the industrial production of 5’-guanylic acid.Biosci.Biotech.Biochem.1997,61:840-845;EP0251489B1)。
实施例
下面参照下述非限定性实施例更具体地解释本发明。
实施例1.构建具有经失活的hxlA基因的菌株
为了将枯草芽孢杆菌肌苷产生者KMBS375的染色体上的hxlA基因失活(菌株KMBS375的构建描述于参考实施例),将hxlA基因的上游和下游区克隆入pKS1质粒的两个多克隆位点(Shatalin K.Y.和Neyfakh A.A.,FEMSMicrobiology Letters,245:315-9(2005))(图1)。所述hxlA基因上游区中的886bp片段的扩增是使用引物P1(SEQ ID NO:5)和P2(SEQ ID NO:6)和作为模板的枯草芽孢杆菌KMBS375的染色体DNA通过PCR来进行的。引物P1和P2分别含有内切核酸酶SacII和PstI的识别位点。所述hxlA基因下游区中的923bp片段的扩增是使用引物P3(SEQ ID NO:7)和P4(SEQ ID NO:8)和作为模板的枯草芽孢杆菌KMBS375的染色体DNA通过PCR来进行的。引物P3和P4分别含有内切核酸酶ClaI和KpnI的识别位点。将使用P1和P2得到的纯化PCR产物用内切核酸酶SacII和PstI消化,然后克隆入pKS1质粒的相应位点。将使用P3和P4得到的纯化PCR产物用内切核酸酶ClaI和KpnI消化,然后也克隆入pKS1质粒的相应位点。在克隆了两个片段后,将含有KmR盒和hxlA基因上游和下游区的质粒用内切核酸酶SacII和KpnI消化,并将所得的片段(3194bp)亚克隆入来自芽孢杆菌属的非复制性的pBluescript II KS载体(Stratagene)。将所得的质粒用于转化枯草芽孢杆菌KMBS375,并分离了12个KmR转化体。为了确证KmR盒的整合将hxlA基因失活,进行了使用引物P1和P4的对照PCR实验。通过使用引物P1和P4及hxlA基因的野生型等位基因的PCR获得的DNA片段的大小为2476bp;然而3194bp的DNA片段的存在确证了KmR盒整合入hxlA基因。在使用引物P5(SEQ ID NO:9-引物P5含有20-nt,与位于距hxlA基因翻译起始位置-1013bp的位置的区域互补,在与P1引物互补的区域上游)和引物P6(SEQ ID NO:10-引物P6含有21-nt,其与位于KmR盒内的区域互补)的其它对照PCR实验中,PCR生成的1491bp的片段的存在确证了KmR盒整合入KMBS375染色体上的hxlA基因中。含有整合的KmR盒的KMBS375转化体之一用于进一步工作。该菌株命名为KMBS375Δhxl::Km。
实施例2.由枯草芽孢杆菌菌株KMBS375Δhxl::Km产生肌苷
为了测试hxlA对肌苷产生的失活作用,将枯草芽孢杆菌菌株KMBS375和KMBS375Δhxl::Km各在34℃在L-培养液中培养18小时,然后将0.3ml培养物接种入20x200mm试管中的3ml发酵培养基中,并在旋转振荡器上在34℃培养72小时。结果示于表1。
发酵培养基的组成(g/l):
在培养之后,通过HPLC确定培养基中积累的肌苷的量。
HPLC分析的条件:
柱:Luna C18(2)250x3mm,5u(Phenomenex,USA)。缓冲液:2%v/vC2H5OH;0.8%v/v三乙胺;0.5%v/v乙酸(冰);pH 4.5。温度:30℃。流速:0.3ml/分钟。注入体积:5μl。检测:UV 250nm。
保留时间(分钟):
表1
如表1所示,与KMBS375相比,KMBS375Δhxl::Km产生较高量的肌苷(HxR)。
参照实施例.KMBS375的构建
<枯草芽孢杆菌168Marburg原养型的构建>
枯草芽孢杆菌168Marburg(ATCC6051)是由于染色体上突变体等位基因trpC2(trpC;吲哚-3-甘油磷酸合酶基因)而导致的Trp-营养缺陷型(AlbertiniA.M.和A.Galizzi.1999The sequence of the trp operon of Bacillus subtilis 168(trpC2)revisited.Microbiology.145:3319-3320)。枯草芽孢杆菌168Marburg菌株可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)(P.O.Box 1549Manassas,VA 20108,United States of America)获得。将在距trpC2起始密码子328位之后具有三个核苷酸“att”的trpC2等位基因用PCR扩增,并如下所述引入枯草芽孢杆菌168Marburg。
(1)通过重组PCR扩增trpC+等位基因
为了扩增trpC+等位基因的5’-端及其上游区,基于来自GenBank(登录号NC_000964)以及Albertini和Galizzi(Microbiology.145:3319-3320)的信息设计PCR引物7(SEQ ID NO:11)和8(SEQ ID NO:12)。
使用上述引物和枯草芽孢杆菌168Marburg的染色体DNA作为模板进行PCR(94℃,30秒;53℃,1分钟;72℃,1分钟;30循环;Gene Amp PCRSystem Model 9600(Perkins Elmer))以扩增含有trpC+等位基因5’-端区和上游区的片段。
为了扩增trpC+等位基因的3’-端及其下游区,基于来自GenBank(登录号NC_000964)以及Albertini和Galizzi(Microbiology.145:3319-3320)的信息设计PCR引物9(SEQ ID NO:13)和10(SEQ ID NO:14)。
使用上述引物和枯草芽孢杆菌168Marburg的染色体DNA作为模板进行PCR(94℃,30秒;53℃,1分钟;72℃,1分钟;30循环;Gene Amp PCRSystem Model 9600(Perkins Elmer))以扩增含有trpC+等位基因3’-端区和下游区的片段。
在通过重组PCR扩增整个trpC+等位基因的过程中,使用MicroSpinColumn S-400(Amersham Pharmacia Biotech)纯化如上所述扩增的两个DNA片段。使用合适量的两种片段的混合物作为模板,以及引物7(SEQ ID NO:11)和10(SEQ ID NO:14)进行PCR(94℃,30秒;55℃,1分钟;72℃,2分钟;30循环;Gene Amp PCR System Model 9600(Perkins Elmer))。获得了trpC+等位基因的扩增片段(约1.2kb)。
(2)从枯草芽孢杆菌168Marburg菌株构建Trp-原养型
在琼脂糖凝胶电泳之后从凝胶中提取将trpC+等位基因片段。用该DNA片段转化如Dubnau和Davidoff-Abelson(Dubnau,D.和R.Davidoff-Abelson,J.Mol.Biol.,56:209-221(1971))所述制备的枯草芽孢杆菌168Marburg的感受态细胞,并选择能够在基本培养基琼脂板上生长的菌落。从这些菌落制备染色体DNA。使用染色体DNA作为模板以及引物7(SEQ ID NO:11)和10(SEQ ID NO:14)通过PCR扩增DNA片段,然后测序以确证所述三个核苷酸***trpC2等位基因,而无其它PCR衍生的突变。由此获得的重组体不是Trp-营养缺陷型,该菌株命名为KMBS275。
<枯草芽孢杆菌168Marburg的His-营养缺陷型的构建>
在编码组氨醇磷酸氨基转移酶的hisC基因中进行框内缺失(in-framedeletion)(ΔhisC:从第403至第606缺失了204个核苷酸),并将其引入枯草芽孢杆菌168Marburg菌株(trpC2),如下所述。
(1)通过重组PCR扩增ΔhisC
在ΔhisC的5’-端及其上游区的扩增中,基于来自GenBank(登录号NC_000964)的信息设计PCR引物11(SEQ ID NO:15)和12(SEQ ID NO:16)。引物38在其5’-端含有EcoRI位点。引物38含有由所述框内突变构建的接点(junction)。
使用上述引物和枯草芽孢杆菌168Marburg的染色体DNA作为模板进行PCR(94℃,30秒;55℃,1分钟;72℃,1分钟;30循环;Gene Amp PCR SystemModel 9600(Perkins Elmer))以扩增含有ΔhisC 5’-端区和上游区的片段。
在ΔhisC的3’-端及其下游区的扩增中,基于来自GenBank(登录号NC_000964)的信息设计PCR引物13(SEQ ID NO:17)和14(SEQ ID NO:18)。引物40含有由所述框内突变构建的接点。引物41在其5’-端含有BamHI位点。
使用上述引物和枯草芽孢杆菌168Marburg的染色体DNA作为模板进行PCR(94℃,30秒;55℃,1分钟;72℃,1分钟;30循环;Gene Amp PCR SystemModel 9600(Perkins Elmer))以扩增含有ΔhisC 3’-端区和下游区的片段。
在通过重组PCR扩增整个ΔhisC的过程中,使用MicroSpin ColumnS-400(Amersham Pharmacia Biotech)纯化如上所述扩增的两个DNA片段。使用合适量的两种片段的混合物作为模板,以及引物11(SEQ ID NO:15)和14(SEQ ID NO:18)进行PCR(94℃,30秒;55℃,1分钟;72℃,2分钟;30循环;Gene Amp PCR System Model 9600(Perkins Elmer))。获得了ΔhisC的扩增片段(约1.5kb)。
(2)ΔhisC基因的克隆
将经扩增的片段用EcoRI和BamHI(37℃,过夜)消化,并使用琼脂糖凝胶分离。从凝胶中提取靶片段,并连接于已用相同酶消化(37℃,3小时)的枯草芽孢杆菌染色体整合载体pJPM1(Mueller,J.P.,G.Bukusoglu和A.L.Sonenshein.1992.Transcriptional regulation of Bacillus subtilis glucosestarvation-inducible genes:control of gsiA by the ComP-ComA signal transductionsystem.J.Bacteriol.174:4361-4373.)。选择含有正确***ΔhisC基因的质粒,其通过DNA测序确证不具有其它PCR衍生的突变,并命名为pKM186。
(3)从枯草芽孢杆菌168Marburg菌株构建His-原养型
将如上所述制备的枯草芽孢杆菌168Marburg菌株的感受态细胞用pKM186转化,并选择能够在含有2.5μg/mL氯霉素(Cm)的LB琼脂板上生长的菌落(单交换(single crossover)重组体)。
将所述单交换重组体之一接种入10mL补充有20mg/L鸟嘌呤的LB培养基(LB+Gua培养基),并在37℃连续传代培养2日。通过使用含或不含Cm的LB+Gua琼脂培养基选择显示氯霉素敏感性的菌落。从Cm敏感性菌落制备染色体DNA。使用引物11(SEQ ID NO:15)和14(SEQ ID NO:18)以与如上所述相同的方式进行PCR。鉴定了其中染色体上的hisC基因已通过双交换(double-crossover)重组用破坏型hisC基因(ΔhisC)替代的菌株。所述双-重组体菌株命名为KMBS276(ΔhisC trpC2)。
<枯草芽孢杆菌KMBS375的构建>
1.KMBS350(ΔpurA ΔpurR ΔpupG)的构建
将破坏型pupG、purR和purA基因(相应为鸟苷/肌苷磷酸化酶,嘌呤操纵子阻遏物和琥珀酰AMP合酶)连续引入源自枯草芽孢杆菌168Marburg的重组体KMBS276菌株(ΔhisC trpC2),并从该菌株获得原养型,如下所述。
(1)将ΔpupG(从第334至第573的204个核苷酸的框内缺失)引入KMBS276
(i)通过重组PCR扩增ΔpupG
在ΔpupG的5’-端及其上游区的扩增中,基于来自GenBank(登录号NC_000964)的信息设计PCR引物15(SEQ ID NO:19)和16(SEQ ID NO:20)。引物42在其5’-端含有BamHI位点。引物43含有由所述框内突变构建的接点。
使用上述引物和枯草芽孢杆菌168Marburg的染色体DNA作为模板进行PCR(94℃,30秒;55℃,1分钟;72℃,1.5分钟;30循环;Gene Amp PCRSystem Model 9600(Perkins Elmer))以扩增含有ΔpupG 5’-端区和上游区的片段。
在ΔpupG的3’-端及其下游区的扩增中,基于来自GenBank(登录号NC_000964)的信息设计PCR引物17(SEQ ID NO:21)和18(SEQ ID NO:22)。引物44含有由所述框内突变构建的接点。引物45在其5’-端含有BamHI位点。
使用上述引物和枯草芽孢杆菌168Marburg的染色体DNA作为模板进行PCR(94℃,30秒;50℃,1分钟;72℃,1.5分钟;30循环;Gene Amp PCRSystem Model 9600(Perkins Elmer))以扩增含有ΔpupG 3’-端区和下游区的片段。
在通过重组PCR扩增整个ΔpupG的过程中,使用MicroSpin ColumnS-400(Amersham Pharmacia Biotech)纯化如上所述扩增的两个DNA片段。使用合适量的两种片段的混合物作为模板,以及引物15(SEQ ID NO:19)和18(SEQ ID NO:22)进行PCR(94℃,30秒;55℃,1分钟;72℃,3分钟;30循环;Gene Amp PCR System Model 9600(Perkins Elmer))。获得了ΔpupG的扩增片段(约2kb)。
(ii)ΔpupG基因的克隆
将经扩增的片段用BamHI(37℃,过夜)消化,并使用琼脂糖凝胶分离。从凝胶中提取靶片段,并连接于已用相同酶消化(37℃,3小时)的枯草芽孢杆菌染色体整合载体pJPM1(J.Bacteriol.174:4361-4373),然后用小牛肠磷酸酶处理。选择含有正确***ΔpupG基因的质粒,其通过DNA测序确证不具有其它PCR衍生的突变,并命名为pKM199。
(iii)将ΔpupG引入KMBS276
将如上所述制备的KMBS276菌株的感受态细胞用pKM199转化,并选择能够在含有2.5μg/mL氯霉素(Cm)的LB琼脂板上生长的菌落(单交换重组体)。
将所述单交换重组体之一接种入10mL LB+Gua培养基,并在37℃连续传代培养2日。通过使用含或不含Cm的LB+Gua琼脂培养基选择显示氯霉素敏感性的菌落。从Cm敏感性菌落制备染色体DNA。使用引物15(SEQ IDNO:19)和18(SEQ ID NO:22)以与如上所述相同的方式进行PCR。鉴定了其中染色体上的pupG基因已通过双交换(double-crossover)重组用破坏型的pupG基因(ΔpupG)替代的菌株。所述双-重组体菌株命名为KMBS334(ΔpupGΔhisC trpC2)。
(2)将ΔpurR(从第31至第825的795个核苷酸的框内缺失)引入KMBS334
(i)通过重组PCR扩增ΔpurR
在ΔpurR的5’-端及其上游区的扩增中,基于来自GenBank(登录号NC_000964)的信息设计PCR引物19(SEQ ID NO:23)和20(SEQ ID NO:24)。引物46在其5’-端含有BamHI位点。引物47含有由所述框内突变构建的接点。
使用上述引物和枯草芽孢杆菌168Marburg的染色体DNA作为模板进行PCR(94℃,30秒;55℃,1分钟;72℃,1.5分钟;30循环;Gene Amp PCRSystem Model 9600(Perkins Elmer))以扩增含有ΔpurR 5’-端区和上游区的片段。
在ΔpurR的3’-端及其下游区的扩增中,基于来自GenBank(登录号NC_000964)的信息设计PCR引物21(SEQ ID NO:25)和22(SEQ ID NO:26)。引物48含有由所述框内突变构建的接点。引物49在其5’-端含有BamHI位点。
使用上述引物和枯草芽孢杆菌168Marburg的染色体DNA作为模板进行PCR(94℃,30秒;50℃,1分钟;72℃,1.5分钟;30循环;Gene Amp PCRSystem Model 9600(Perkins Elmer))以扩增含有ΔpurR 3’-端区和下游区的片段。
在通过重组PCR扩增整个ΔpurR的过程中,使用MicroSpin ColumnS-400(Amersham Pharmacia Biotech)纯化如上所述扩增的两个DNA片段。使用合适量的两种片段的混合物作为模板,以及引物19(SEQ ID NO:23)和22(SEQ ID NO:26)进行PCR(94℃,30秒;55℃,1分钟;72℃,2.5分钟;30循环;Gene Amp PCR System Model 9600(Perkins Elmer))。获得了ΔpurR的扩增片段(约2.1kb)。
(ii)ΔpurR基因的克隆
将经扩增的片段用BamHI(37℃,过夜)消化,并使用琼脂糖凝胶分离。从凝胶中提取靶片段,并连接于已用相同酶消化(37℃,3小时)的枯草芽孢杆菌染色体整合载体pJPM1(J.Bacteriol.174:4361-4373),然后用小牛肠磷酸酶处理。选择含有正确***ΔpurR基因的质粒,其通过DNA测序确证不具有其它PCR衍生的突变,并命名为pKM200。
(iii)将ΔpurR引入KMBS334
将如上所述制备的KMBS334菌株的感受态细胞用pKM200转化,并选择能够在含有2.5μg/mL氯霉素(Cm)的LB琼脂板上生长的菌落(单交换重组体)。
将所述单交换重组体之一接种入10mL LB+Gua培养基,并在37℃连续传代培养2日。通过使用含或不含Cm的LB+Gua琼脂培养基选择显示氯霉素敏感性的菌落。从Cm敏感性菌落制备染色体DNA。使用引物19(SEQ IDNO:23)和22(SEQ ID NO:26)以与如上所述相同的方式进行PCR。鉴定了其中染色体上的purR基因通过双交换重组用破坏型的purR基因(ΔpurR)替代的菌株。所述双-重组体菌株命名为KMBS337(ΔpurRΔpupG ΔhisC trpC2)。
(3)将ΔpurA(从第307至第675的369个核苷酸的框内缺失)引入KMBS337
(i)通过重组PCR扩增ΔpurA
在ΔpurA的5’-端及其上游区的扩增中,基于来自GenBank(登录号NC 000964)的信息设计PCR引物23(SEQ ID NO:27)和24(SEQ ID NO:28)。引物50在其5’-端含有BamHI位点。引物51含有由所述框内突变构建的接点。
使用上述引物和枯草芽孢杆菌168Marburg的染色体DNA作为模板进行PCR(94℃,30秒;55℃,1分钟;72℃,1分钟;30循环;Gene Amp PCR SystemModel 9600(Perkins Elmer))以扩增含有ΔpurA 5’-端区和上游区的片段。
在ΔpurA的3’-端及其下游区的扩增中,基于来自GenBank(登录号NC 000964)的信息设计PCR引物25(SEQ ID NO:29)和26(SEQ ID NO:30)。引物52含有由所述框内突变构建的接点。引物53在其5’-端含有BamHI位点。
使用上述引物和枯草芽孢杆菌168Marburg的染色体DNA作为模板进行PCR(94℃,30秒;50℃,1分钟;72℃,1分钟;30循环;Gene Amp PCR SystemModel 9600(Perkins Elmer))以扩增含有ΔpurA 3’-端区和下游区的片段。
在通过重组PCR扩增整个ΔpurA的过程中,使用MicroSpin ColumnS-400(Amersham Pharmacia Biotech)纯化如上所述扩增的两个DNA片段。使用合适量的两种片段的混合物作为模板,以及引物23(SEQ ID NO:27)和26(SEQ ID NO:30)进行PCR(94℃,30秒;55℃,1分钟;72℃,2分钟;30循环;Gene Amp PCR System Model 9600(Perkins Elmer))。获得了ΔpurA的扩增片段(约1.4kb)。
(ii)ΔpurA基因的克隆
将经扩增的片段用BamHI(37℃,过夜)消化,并使用琼脂糖凝胶分离。从凝胶中提取靶片段,并连接于已用相同酶消化(37℃,3小时)的枯草芽孢杆菌染色体整合载体pJPM1(J.Bacteriol.174:4361-4373),然后用小牛肠磷酸酶处理。选择含有正确***ΔpurA基因的质粒,其通过DNA测序确证不具有其它PCR衍生的突变,并命名为pKM208。
(iii)将ΔpurA引入KMBS337
将如上所述制备的KMBS337菌株的感受态细胞用pKM208转化,并选择能够在含有2.5μg/mL氯霉素(Cm)的LB琼脂板上生长的菌落(单交换重组体)。
将所述单交换重组体之一接种入10mL LB+Gua培养基,并在37℃连续传代培养2日。通过使用含或不含Cm的LB+Gua琼脂培养基选择显示氯霉素敏感性的菌落。从Cm敏感性菌落制备染色体DNA。使用引物23(SEQ IDNO:27)和26(SEQ ID NO:30)以与如上所述相同的方式进行PCR。鉴定了其中染色体上的purA基因通过双交换重组用破坏型purA基因(ΔpurA)替代的菌株。所述双-重组体菌株命名为KMBS349(ΔpurA ΔpurR ΔpupG ΔhisC trpC2)。
(4)将ΔtrpC+和hisC+引入KMB S349
将如上所述制备的KMBS349菌株的感受态细胞用来自KMBS275的染色体DNA转化(参见<枯草芽孢杆菌168Marburg原养型的构建>),并选择能够在含有20mg/L腺嘌呤(Ade)的基本培养基琼脂板上生长的菌落。
使用含或不含Ade的基本培养基琼脂板从获得的重组体选择具有腺嘌呤营养缺陷型的菌株,然后,通过菌落PCR(相应基因pupG、purR和purA的PCR条件如上所述),鉴定了其中染色体上所述三个基因已用破坏型基因(ΔpupG、ΔpurR和ΔpurA)替代的菌株。该菌株命名为KMBS350(ΔpurA ΔpurRΔpupG)。
2.KMBS356(ΔpurA ΔpurR ΔpupG guaB24)的构建
将在编码IMP脱氢酶的guaB基因中的鸟嘌呤营养缺陷型渗漏突变guaB24(与描述于US2006275874A1的guaB(A1)相同)引入源自枯草芽孢杆菌168Marburg的重组KMBS349菌株(ΔpurA ΔpurR ΔpupG ΔhisC trpC2),并从所得的菌株获得原养型,如下所述。
(1)从KMBS349构建guaB-破坏的菌株
将如上所述制备的KMBS349菌株(ΔpurAΔhisC trpC2)的感受态细胞用来自KMBS193(guaB::kan trpC2;US2006275874A1)的染色体DNA转化,并选择能够在补充有2.5μg/ml卡那霉素(Kan)的LB培养基上生长的菌落。
从重组体鉴定具有Gua营养缺陷型的Kan抗性菌株。所得的菌株命名为KMB S351(guaB::kanΔpurA ΔpurR ΔpupG ΔhisC trpC2)。
(2)从KMBS349构建guaB-渗漏菌株
将如上所述制备的KMBS351菌株(guaB::kan ΔpurA ΔpurR ΔpupG ΔhisCtrpC2)的感受态细胞用YMBS9(guaB24 trpC2;将KMBS193感受态细胞用在染色体上含有guaB24突变的枯草芽孢杆菌168Marburg的衍生株中含有guaB的区域经PCR扩增的DNA进行转化,获得YMBS9)的染色体DNA转化,并选择能够在含有20mg/L Ade、His和Trp的基本培养基琼脂板上生长的菌落。
使用含或不含Ade+His的基本培养基琼脂板从重组体选择具有Ade和His营养缺陷型的菌株,然后,通过菌落PCR(相应基因pupG和purR的PCR条件如上所述)并进行DNA测序,鉴定了其中染色体上所述两个基因用破坏型基因(ΔpupG和ΔpurR)替代,且guaB::kan用guaB24正确替代的菌株。所得的菌株命名为KMB S353(guaB24 ΔpurA ΔpurR ΔpupG ΔhisC trpC2)。
(3)将trpC+和hisC+引入KMBS353
将如上所述制备的KMBS353菌株的感受态细胞用KMBS350的染色体DNA(参见1.KMBS350(ΔpurA ΔpurR ΔpupG)的构建)转化,并选择能够在含有20mg/L Ade的基本培养基琼脂板上生长的菌落。
然后,通过对重组体中的guaB基因进行DNA测序,鉴定了其中染色体上野生型guaB已用渗漏型的guaB24等位基因替代的菌株。所得的菌株命名为KMBS356(guaB24 ΔpurA ΔpurR ΔpupG)。
3.KMBS375(Ppur*-Δatt ΔdeoD ΔpurA ΔpurR ΔpupG)的构建
将修饰的嘌呤操纵子启动子(Ppur)和部分缺失的弱化子序列(Ppur*-Δatt;与US2006275874A1中描述的Ppur1-Δatt相同),破坏型purA基因,在编码IMP脱氢酶的guaB基因中的鸟苷-营养缺陷型渗漏突变guaB24(与US2006275874A1中描述的guaB(A1)相同),和编码嘌呤核苷磷酸化酶的破坏型deoD基因连续引入源自枯草芽孢杆菌168Marburg的重组KMBS337菌株(ΔpurR ΔpupG ΔhisC trpC2;参见1(2)将ΔpurR(从第31至第825的795个核苷酸的框内缺失)引入KMBS334)中,如下所述。
(1)从KMBS337构建Ppur-破坏的菌株
将如上所述制备的KMBS337菌株(ΔhisC trpC2)的感受态细胞用KMBS198(Ppur::cat trpC2;US2006275874A1)的染色体DNA转化,并选择能够在LB+Gua+Cm培养基上生长的菌落。
使用含或不含Ade+His的基本培养基琼脂板从重组体选择具有Ade和His营养缺陷型的菌株,然后,通过菌落PCR(相应基因pupG和purR的PCR条件如上所述),鉴定了其中染色体上所述两个基因已用破坏型基因(ΔpupG和ΔpurR)替代的菌株。所得的菌株命名为KMBS340(Ppur::cat ΔpurR ΔpupGΔhisC trpC2)。
(2)用Ppur*-Δatt替代Ppur::cat
将如上所述制备的KMBS340菌株(Ppur::cat ΔpurR ΔpupG ΔhisC trpC2)的感受态细胞用来自KMBS261(Ppur1-Δatt purR::spc ΔpupG*trpC2;US2006275874A1)的染色体DNA转化,并选择能够在含有20mg/L Trp和His的基本培养基琼脂板上生长的菌落。
使用含或不含Ade+His的基本培养基琼脂板从重组体选择具有Ade和His营养缺陷型的菌株,然后,通过菌落PCR(相应基因pupG和purR的PCR条件如上所述)和DNA测序,鉴定了其中染色体上所述两个基因已用破坏型基因(ΔpupG和ΔpurR)替代,且Ppur::cat用Ppur*-Δatt正确替代的菌株。所得的菌株命名为KMBS352(Ppur*-Δatt ΔpurR ΔpupG ΔhisC trpC2)。
(3)将ΔpurA(从第307至第675的369个核苷酸的框内缺失)引入KMBS352
将如上所述制备的KMBS352菌株(Ppur*-Δatt ΔpurR ΔpupG ΔhisC trpC2)的感受态细胞用KMBS350(ΔpurA ΔpurR ΔpupG;参见1.构建KMBS350(ΔpurA ΔpurR ΔpupG))的染色体DNA转化,并选择能够在含有20mg/L His和Ade的基本培养基琼脂板上生长的菌落。
使用含或不含Ade+His的基本培养基琼脂板从重组体选择通过“中板集合(congression)”获得的具有Ade营养缺陷型的菌株,然后,通过菌落PCR(purA的PCR条件如上所述)和DNA测序,鉴定了其中染色体上的purA基因已用破坏型基因(purA)替代,且Ppur*-Δatt未用野生型Ppur替代的菌株。所得的菌株命名为KMBS359(Ppur*-Δatt ΔpurA ΔpurR ΔpupG)。
(4)从KMBS359构建guaB-破坏的菌株
将如上所述制备的KMBS359菌株(Ppur*-Δatt ΔpurA ΔpurR ΔpupG)的感受态细胞用KMBS351(guaB::kan ΔpurA ΔpurR ΔpupG ΔhisC trpC2;参见2.(1)从KMBS349构建guaB-破坏的菌株)的染色体DNA转化,并选择能够在补充有2.5μg/ml Kan的LB+Gua培养基板上生长的菌落。
从重组体鉴定具有Gua营养缺陷型的Kan抗性菌株。然后,通过PCR(Ppur的PCR条件描述于US2006275874A1),选择了其中Ppur*-Δatt未用野生型Ppur替代的菌株。所得的菌株命名为KMBS364(guaB::kan Ppur*-ΔattΔpurA ΔpurR ΔpupG)。
(5)从KMBS364构建guaB-渗漏菌株
将如上所述制备的KMBS364菌株(guaB::kan Ppur*-Δatt ΔpurA ΔpurRΔpupG)的感受态细胞用KMBS356(guaB24ΔpurA ΔpurR ΔpupG;参见2.(3)将trpC+和hisC+引入KMBS353)的染色体DNA转化,并选择能够在含有20mg/L Ade的基本培养基琼脂板上生长的菌落。
然后,通过DNA测序,鉴定了其中guaB::kan等位基因用guaB24正确替代,而Ppur*-Δatt并未用野生型Ppur替代的菌株。所得的菌株命名为KMB S365(guaB24 Ppur*-Δatt ΔpurA ΔpurR ΔpupG)。
(6).将ΔdeoD(从第262至第450的189个核苷酸的框内缺失)引入KMBS365
(1)通过重组PCR扩增ΔdeoD
在ΔdeoD的5’-端及其上游区的扩增中,基于来自GenBank(登录号NC_000964)的信息设计PCR引物27(SEQ ID NO:31)和28(SEQ ID NO:32)。引物54在其5’-端含有BamHI位点。引物55含有由所述框内突变构建的接点。
使用上述引物和枯草芽孢杆菌168Marburg的染色体DNA作为模板进行PCR(94℃,30秒;55℃,1分钟;72℃,1.5分钟;30循环;Gene Amp PCRSystem Model 9600(Perkins Elmer))以扩增含有ΔdeoD 5’-端区和上游区的片段。
在ΔdeoD的3’-端及其下游区的扩增中,基于来自GenBank(登录号NC_000964)的信息设计PCR引物29(SEQ ID NO:33)和30(SEQ ID NO:34)。引物56含有由所述框内突变构建的接点。引物57在其5’-端含有BamHI位点。
使用上述引物和枯草芽孢杆菌168Marburg的染色体DNA作为模板进行PCR(94℃,30秒;55℃,1分钟;72℃,1分钟;30循环;Gene Amp PCR SystemModel 9600(Perkins Elmer))以扩增含有ΔdeoD 3’-端区和下游区的片段。
在通过重组PCR扩增整个ΔhisC的过程中,使用MicroSpin ColumnS-400(Amersham Pharmacia Biotech)纯化如上所述扩增的两个DNA片段。使用合适量的两种片段的混合物作为模板,以及引物27(SEQ ID NO:31)和30(SEQ ID NO:34)进行PCR(94℃,30秒;50℃,1分钟;72℃,3分钟;30循环;Gene Amp PCR System Model 9600(Perkins Elmer))。获得了ΔdeoD的扩增片段(约2.0kb)。
(2)ΔdeoD基因的克隆
将经扩增的片段用BamHI(37℃,过夜)消化,并使用琼脂糖凝胶分离。从凝胶中提取靶片段,并连接于已用相同酶消化(37℃,3小时)的枯草芽孢杆菌染色体整合载体pJPM1(J.Bacteriol.174:4361-4373.),然后用小牛肠磷酸酶处理。选择含有正确***ΔdeoD基因的质粒,其通过DNA测序确证不具有其它PCR衍生的突变,并命名为pKM201。
(iii)将ΔdeoD引入KMBS365
将如上所述制备的KMBS365菌株的感受态细胞用pKM201转化,并选择能够在含有2.5μg/mL Cm的LB+Gua琼脂板上生长的菌落(单交换重组体)。
将所述单交换重组体之一接种入10mL LB+Gua培养基,并在37℃连续传代培养2日。通过使用含或不含Cm的LB+Gua琼脂培养基选择显示Cm敏感性的菌落。从Cm敏感性菌落制备染色体DNA。使用引物27(SEQ ID NO:31)和30(SEQ ID NO:34)以与如上所述相同的方式进行PCR。鉴定了其中染色体上的deoD基因通过双交换重组已用破坏型的deoD基因(ΔdeoD)替代的菌株。所述双-重组体菌株命名为KMBS375(ΔdeoD guaB24 Ppur*-Δatt ΔpurAΔpurR ΔpupG)。
虽然已参照优选实施方式详细描述了本发明,对于本领域技术人员显而易见可进行多种变化,采用等同方式,而不背离本发明的范围。每一篇前述文件均通过提述以其整体并入本文。
Claims (11)
1.一种能够产生嘌呤核苷的芽孢杆菌属细菌,其中所述细菌经修饰而减少了3-己酮糖-6-磷酸合酶(HPS)活性。
2.根据权利要求1的细菌,其中所述细菌经修饰而弱化了编码3-己酮糖-6-磷酸合酶(HPS)的基因的表达。
3.根据权利要求2的细菌,其中所述表达是通过使所述基因失活来弱化的。
4.根据权利要求2或3的细菌,其中所述基因是hxlA基因。
5.根据权利要求1至4中任一项的细菌,其中所述细菌是枯草芽孢杆菌。
6.根据权利要求1至4中任一项的细菌,其中所述细菌是解淀粉芽孢杆菌。
7.根据权利要求1至6中任一项的细菌,其中所述嘌呤核苷选自下组:肌苷、黄苷、鸟苷和腺苷。
8.一种产生嘌呤核苷的方法,其包括在培养基中培养根据权利要求1至7中任一项的细菌,使所述嘌呤核苷分泌至所述培养基中,并从所述培养基收集所述嘌呤核苷。
9.根据权利要求8的产生嘌呤核苷的方法,其中所述嘌呤核苷选自下组:肌苷、黄苷、鸟苷和腺苷。
10.一种产生嘌呤核苷酸的方法,其包括在培养基中培养根据权利要求1至7中任一项的细菌,使所述嘌呤核苷分泌至所述培养基中,将所述嘌呤核苷磷酸化,并分离嘌呤核苷酸。
11.根据权利要求10的产生嘌呤核苷酸的方法,其中所述嘌呤核苷酸选自下组:5’-肌苷酸、黄苷-5’-磷酸、5’-鸟苷酸和5’-腺苷酸。
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