JP5488594B2 - プリンリボヌクレオシド及びリボヌクレオチドの製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、微生物工業に関し、更に詳しくは、プリンヌクレオチドの合成における原料として重要なプリンリボヌクレオシドの製造方法に関する。この方法は、３−ヘキスロース−６−リン酸合成酵素（3-hexulose-6-phosphate synthase）をコードする遺伝子の発現を低減させるよう改変されたバチルス（Bacillus）属細菌を使用するものである。

アデニン栄養要求性株を利用するプリンヌクレオシドの発酵生産の方法は公知である。更に、プリンアナログ及びスルファグアニジンのような種々の薬剤に対する耐性をこれらの株に更に付与することができる。これらの株の例には、種々のバチルス属の株（特許文献１〜８）、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属の株（特許文献９、１０、非特許文献１）、及びエシュリヒア（Escherichia）属の株（特許文献１１）等が含まれる。

従来、この種の変異株の取得は、微生物をＵＶ照射による変異誘発又はニトロソグアニジン（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）を用いた処理による変異誘発に供し、適切な選択培地を使用することにより所望の特性を備えた株を選択することによって行われている。代替的に、例えば、バチルス属（特許文献１２〜２２）及びブレビバクテリウム属（特許文献２３）の株について、遺伝子操作技術を使用する育種によって変異株が取得されている。これらのイノシン生産株の生産性は、イノシンを排出する能力を増加させることによって更に向上させることができる（特許文献２４〜２６）。

リブロースモノホスフェート（RuMP）経路は、１炭素単位から炭素−炭素結合を含む化合物を合成する代謝経路の１つであり、メチロトローフとして知られている多くのメタン資化性細菌及びメタノール資化性細菌に見出される。この経路の特徴的な酵素は、３−ヘキスロース−６−リン酸合成酵素（3-hexulose-6-phosphate synthase, HPS）及び６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ（6-phospho-3-hexuloisomerase, PHI）であるが、これらはいずれもメチロトローフ以外に存在するとは考えられていなかった。しかしながら、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）の推定されるyckG遺伝子産物（YckG）は、メチロトローフHPSのものと類似する一次構造を有している。yckF遺伝子産物（YckF）とメチロトローフPHIとの間の配列の類似性についても検討されており、バチルス・ズブチリスのyckG及びyckF遺伝子は、それぞれHPS及びPHIの酵素活性を備えたタンパク質を発現することが見出されている。これらの両者の活性は共に、バチルス・ズブチリスにおいてホルムアルデヒドにより誘発され、yckH遺伝子に対して依存性を示すが、メタノール、ギ酸エステル（塩）、又はメチルアミンによっては誘発されない。いずれかの遺伝子の破壊により、ホルムアルデヒドに対する適度な感受性が引き起こされ、これらの酵素が、バチルス・ズブチリスにおいてホルムアルデヒドの解毒系として作用していることが示唆される。活性なyckG（HPS）−yckF（PHI）遺伝子構造（ここではhxlA-hxlBと名づける）が、非メチロトローフであり、本来的にRuMP経路を有するバチルス・ズブチリスにおいて見出されている（非特許文献２）。

しかしながら、プリンリボヌクレオシドの生産性を向上させる目的で３−ヘキスロース−６−リン酸合成酵素をコードする遺伝子を不活性化させることは、これまで報告されていない。

特公昭38-23039号公報 特公昭54-17033号公報 特公昭55-2956号公報 特公昭55-45199号公報 特開昭56-162998号公報 特公昭57-14160号公報 特公昭57-41915号公報 特開昭59-42895号公報 特公昭51-5075号公報 特公昭58-17592号公報 国際公開第9903988号パンフレット 特開昭58-158197号公報 特開昭58-175493号公報 特開昭59-28470号公報 特開昭60-156388号公報 特開平1-27477号公報 特開平1-174385号公報 特開平3-58787号公報 特開平3-164185号公報 特開平5-84067号公報 特開平5-192164号公報 米国特許第7,326,546号 特開昭63-248394号公報 ロシア特許出願第2002101666号 ロシア特許出願第2002104463号 ロシア特許出願第2002104464号

Agric. Biol. Chem., 42, 399 (1978) Yasueda, H. et. al., J. Bacteriology, 181(23), p. 7154-7160 (1999)

本発明の一態様は、発酵によってプリンヌクレオシドを生産するのに適切な微生物を改良し、微生物の株を使用してプリンヌクレオシドを製造する方法を提供することである。

この目的は、３−ヘキスロース−６−リン酸合成酵素をコードする遺伝子の発現を低減させることにより、イノシン、キサントシン、グアノシン、又はアデノシンのようなプリンヌクレオシドの生産を増強させることができることを見出したことによって達成された。

本発明は、プリンヌクレオシド生産能が増大したバチルス属に属する細菌、特にバチルス・ズブチリス及びバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）を提供するものである。

本発明の態様によれば、プリンヌクレオシドを生産能を有するバチルス属細菌であって、３−ヘキスロース−６−リン酸合成酵素（ＨＰＳ）活性が減少するよう改変されたバチルス属細菌が提供される。

本発明の更なる態様によれば、プリンヌクレオシドを生産能を有し、３−ヘキスロース−６−リン酸合成酵素をコードする遺伝子の発現が低減するよう改変された前記細菌が提供される。

本発明の更なる態様によれば、３−ヘキスロース−６−リン酸合成酵素をコードする遺伝子の発現が、当該遺伝子を不活性化させることによって低減された前記細菌が提供される。

本発明の更なる態様によれば、３−ヘキスロース−６−リン酸合成酵素をコードする遺伝子がhxlA遺伝子である前記細菌が提供される。

本発明の更なる態様によれば、バチルス・ズブチリスである前記細菌が提供される。

本発明の更なる態様によれば、バチルス・アミロリケファシエンスである前記細菌が提供される。

本発明の更なる態様によれば、プリンヌクレオシドが、イノシン、キサントシン、グアノシン、及びアデノシンからなる群から選択される前記細菌が提供される。

本発明の更なる態様によれば、前記細菌を培養培地中で培養し、プリンヌクレオシドを培養培地中に排出させ、前記プリンヌクレオシドを培養培地から回収することを含むことを特徴とするプリンヌクレオシドの製造方法が提供される。

本発明の更なる態様によれば、プリンヌクレオシドが、イノシン、キサントシン、グアノシン、及びアデノシンからなる群から選択される前記方法が提供される。

本発明の更なる態様によれば、前記細菌を培養培地中で培養し、プリンヌクレオシドを培養培地中に排出させ、プリンヌクレオシドをリン酸化し、プリンヌクレオチドを単離することを含むプリンヌクレオチドの製造方法が提供される。

本発明の更なる態様によれば、プリンヌクレオチドが、5'-イノシン酸、キサントシン-5'-リン酸、5'-グアニル酸、及び5'-アデニル酸からなる群から選択される前記方法が提供される。

pKS1プラスミドの構造及び特有の制限部位を示す図である。

本発明を以下に詳細に説明する。

１．本発明の細菌
この細菌は、プリンヌクレオシドを生産することができ、３−ヘキスロース−６−リン酸合成酵素活性が減少するよう改変されたものである。この細菌は、バチルス属に属する。

バチルス属細菌の例には、Bacillus subtilis subsp. subtilis168株（バチルス・ズブチリス168）又はバチルス・アミロリケファシエンスが含まれる。バチルス・アミロリケファシエンスは、異型遺伝子性の種である。多数のバチルス・アミロリケファシエンス株が知られており、これらにはSB、T、P、W、F、N、K、及びHが含まれる（Welker N. E., Campbell L. L., Unrelatedness of Bacillus amyloliquefaciens and Bacillus subtilis
. J. Bacteriol., 94: 1124-1130, 1967）。最近、バチルス属の株が植物から単離され、これらはバチルス・アミロリケファシエンスの別個の生態型であると考えられている（Reva et al., Taxonomic characterization and plant colonizing abilities of some bacteria related to Bacillus amyloliquefaciens and Bacillus subtilis. FEMS Microbiol. Ecol., 48:249-259, 2004）。前記の株の１つであるバチルス・アミロリケファシエンス FZB42の全ヌクレオチド配列が決定されている（Chen et al., Comparative analysis
of the complete genome sequence of the plant growth-promoting bacterium Bacillus amyloliquefaciens FZB42. Nat. Biotechnol., 25: 1007-1014, 2007）。

バチルス属に属する細菌の例には以下のものも含まれる：バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・プミリス（Bacillus pumilis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・ポリミキサ（Bacillus polymixa）、及びバチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）。

既に言及した性質に加えて、これらの細菌は、種々の栄養要求性、薬剤耐性、薬剤感受性、及び薬剤依存性も有し得る。

「プリンヌクレオシド」という記載は、イノシン、キサントシン、グアノシン、及びアデノシンを含み、好ましくはイノシンである。

「プリンヌクレオシド生産能」という文言は、培地中においてプリンヌクレオシドを生成して蓄積させる能力を意味する。「細菌がプリンヌクレオシド生産能を有する」という文言は、バチルス属に属する細菌が、バチルス属細菌の野生型又は非改変株、例えば、バチルス・ズブチリス168のようなバチルス・ズブチリスの野生型又は非改変株よりも多い量で、培地中においてプリンヌクレオシドなどのプリンを生成して蓄積させることが可能なことを意味する。好ましくは、この記載は、微生物が、培地中においてイノシン、キサントシン、グアノシン、及び／又はアデノシンのようなプリンヌクレオシドを10mg/l以上、更に好ましくは50mg/l以上の量で生成して蓄積させることが可能なことを意味する。

「HPS活性」という用語は、リブロース-5-リン酸を用いるホルムアルデヒドのMg²⁺依存性アルドール縮合によるD-アラビノ-3-ヘキスロース-6-リン酸の形成反応を触媒する活性を意味する。HPS活性は、Yasueda, Hら（J. Bacteriology, 181(23), p. 7154-7160 (1999)）に記載されたように測定することができる。

バチルス・ズブチリス由来のHPSをコードする遺伝子、詳しくは、Bacillus subtilis subsp. subtilis 168株由来のhxlA遺伝子（yckGと同義）は、既に解明されている（GenBank Accession NC_000964の配列中のヌクレオチド374725〜375357と相補的なヌクレオチド）。バチルス・ズブチリス由来のhxlA遺伝子は、染色体上でhxlB遺伝子とhxlR遺伝子との間に位置する。バチルス・ズブチリスhxlA遺伝子のヌクレオチド配列及びhxlA遺伝子にコードされるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１及び配列番号２に示されている。

バチルス・アミロリケファシエンス由来のHPSをコードする遺伝子、更に詳しくは、バチルス・アミロリケファシエンス FZB42株由来のhxlA遺伝子は、既に解明されている（GenBank Accession NC_009725の配列中のヌクレオチド340797〜341432と相補的なヌクレオチド）。バチルス・アミロリケファシエンス由来のhxlA遺伝子は、染色体上でhxlB遺伝子とhxlR遺伝子との間に位置する。バチルス・アミロリケファシエンスhxlA遺伝子のヌクレオチド配列及びhxlA遺伝子にコードされるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３及び配列番号４に示されている。

典型的には、これらの遺伝子は、細菌に導入する前に、バチルス属細菌中で機能することが可能なベクターにクローン化することができる。このような目的のためには、pHY300PLK、pMWMX1、pLF22、又はpKS1のようなシャトルベクターを使用することができる。野生型の遺伝子は、相同組換えによって変異体と置換することができる。

バチルス属の株の間でDNA配列に幾分かの相異があり得るため、染色体上の不活性化されるhxlA遺伝子は、配列番号１及び配列番号３に示される遺伝子に限定されるものではなく、バリアントHPSタンパク質をコードする、配列番号１及び配列番号３と相同な遺伝子を含み得る。「バリアントHPSタンパク質」という記載は、本発明で使用するように、アミノ酸の欠失、挿入、付加、又は置換のいずれであるかに拘らず配列の変更を有するが、HPSタンパク質の活性を依然として維持するタンパク質を意味する。バリアントタンパク質における変更の数は、タンパク質の三次元構造における位置又はアミノ酸残基の種類に依存する。これは、配列番号２及び配列番号４において、１〜30、好ましくは１〜15、更に好ましくは１〜５とし得る。これらの変更は、タンパク質の機能に対して重要ではないタンパク質の領域に生じ得る。これは、幾つかのアミノ酸は互いに高い相同性を有することから、三次元構造又は活性はこのような変更によって影響を受けないからである。したがって、hxlA遺伝子によってコードされるタンパク質のバリアントは、hxlA遺伝子を不活性化する前のHPSタンパク質の活性が維持されている限り、配列番号２及び配列番号４に示す全アミノ酸配列に対して、80％以上、好ましくは90％以上、更に好ましくは95％以上、なお更に好ましくは98％以上、最も好ましくは99％以上の相同性を有するものとし得る。

２つのアミノ酸配列の間の相同性は、周知の方法、例えば、コンピュータプログラムBLAST2.0を使用して決定することができ、この場合、３つのパラメータ、すなわちスコア、同一性、及び類似性を計算する。

更に、ｈｘｌＡ遺伝子は、不活性化する前の機能的なＨＰＳタンパク質をコードする限り、配列番号１及び配列番号３に示されるヌクレオチド配列又はこのヌクレオチド配列から調製することのできるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするバリアントとすることができる。「ストリンジェントな条件」には、特異的なハイブリッド、例えば、６０％以上、好ましくは７０％以上、更に好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、なお更に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有するハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッド、例えば、前記より低い相同性を有するハイブリッドが形成されないものが含まれる。例えば、ストリンジェントな条件としては、６０℃において１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの塩濃度での１回以上の洗浄、好ましくは２〜３回の洗浄が例示される。洗浄の持続時間は、ブロッティングに使用する膜の種類に依存するが、通例、製造業者によって推奨されるものとすることができる。例えば、ストリンジェントな条件下におけるＨｙｂｏｎｄ（商品名）Ｎ＋ナイロン膜（Amersham）についての推奨される洗浄の持続時間は１５分である。好ましくは、洗浄は２〜３回行うものとすることができる。プローブの長さは、ハイブリダイゼーションの条件に依存して適切に選択することができるが、通常は100 bp〜１kbpである。

hxlA遺伝子の発現は、遺伝子にコードされるタンパク質の細胞内の活性が、改変されていない株と比較して減少するよう、染色体上の遺伝子に変異を導入することによって低減させることができる。このような変異は、遺伝子によってコードされるタンパク質におけるアミノ酸の置換（ミスセンス変異）につながる１塩基以上の置換、ストップコドンの導入（ノンセンス変異）、フレームシフトを引き起こす１または２塩基の欠失、薬剤耐性遺伝子の挿入、又は遺伝子の一部若しくは遺伝子全体の欠失とすることができる。hxlA遺伝子の発現は、プロモータ、シャイン・ダルガーノ（Shine-Dalgarno, SD）配列等のような
発現調節配列を改変することによっても低減させることができる。

例えば、遺伝子組換えによって変異を導入するために、以下の方法を用いることができる。変異遺伝子を含むDNA断片を調製し、細菌に形質転換する。その後、相同組換えによって細菌染色体上の本来遺伝子（native gene）を変異遺伝子で置換し、この結果得られる株を選択する。相同組換えを使用するこのような遺伝子の置換は、「Red-driven integration」として知られている線状（linear）DNAを用いる方法（Datsenko, K. A. and Wanner, B. L.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 12, p. 6640-6645 (2000)）、又は温度感受性複製開始点を含むプラスミドを用いる方法（米国特許第6,303,383号又は特開平5-007491号公報（JP 05-007491A））によって行うことができる。更に、前記したような相同組換えを使用する遺伝子置換による部位特異的変異の組込みは、宿主中で複製する能力を欠如したプラスミドを用いた形質転換によっても行うことができる。

遺伝子の発現は、遺伝子のコード領域にトランスポゾンまたはIS因子を挿入することによっても（米国特許第5,175,107号）、又はUV照射を使用する変異誘発若しくはニトロソグアニジン（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）を用いる処理のような従来の方法によっても低減させることができる。

遺伝子の不活性化は、UV照射を使用する変異誘発若しくはニトロソグアニジン（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）を用いる処理、部位特異的変異誘発、相同組換えを使用する遺伝子の破壊、及び／又は挿入−欠失変異誘発のような従来の方法によっても行うことができる。

細菌は、プリンヌクレオシド生産能を本来的に有する細菌において、HPSをコードする遺伝子の発現を低減させることによって得ることができる。代替的に、細菌は、HPS遺伝子の発現が低減された細菌に対して、プリンヌクレオシド生産能を付与することによって得ることができる。

バチルス属細菌を誘導するのに使用し得る親バチルス株の例は、バチルス・ズブチリス
イノシン生産KMBS375株（KMBS375: Ppur*-ΔattΔpurAΔpurRΔpupGΔdeoDguaB24；参考例）である。他の親バチルス株には、バチルス・ズブチリスAJ12707株(FERM P-12951)（特願昭61-13876号（JP6113876A2））、バチルス・ズブチリスAJ3772株(FERM P-2555)（特願昭62-014794号（JP62014794A2））、バチルス・プミリス（Bacillus pumilus）NA-1102
(FERM BP-289)、バチルス・ズブチリス NA-6011 (FERM BP-291)、バチルス・ズブチリス
G1136A (ATCC No. 19222)（米国特許第3,575,809号）、2005年10月３日にVKPMにバチルス・アミロリケファシエンス G1136A (VKPM B-8994)として寄託され2006年10月13日に国際寄託に移行され、再同定されたバチルス・アミロリケファシエンス AJ1991、バチルス・ズブチリス NA-6012 (FERM BP-292)（米国特許第4,701,413号）、バチルス・プミリス Gottheil No. 3218 (ATCC No. 21005)（米国特許第3,616,206号）、バチルス・アミロリケファシエンスAS115-7株 (VKPM B-6134)（ロシア特許第2003678号）等が含まれる。バチルス・サブチルスKMBS16株も使用することができる。この株は、公知のバチルス・ズブチリス 168 trpC2株の誘導体であり、プリンリプレッサー（purR::spc）をコードするpurR遺伝子、スクシニルAMP合成酵素（purA::erm）をコードするpurA遺伝子、及びプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（deoD::kan）をコードするdeoD遺伝子全てが変異を含むものである（ロシア特許出願第2002103333号、米国特許第7,326,546号（2008））。

細菌は、バチルス・ズブチリスのpurオペロンを含む、プリン生合成に関与する１以上の遺伝子の発現を増強することによって更に改良することができる（Ebbole D.J. and Zalkin H. J. Biol. Chem., 262: 8274-87 (1987), Bacillus subtilis and Its Closest Relatives, Editor in Chief: A.L. Sonenshein, ASM Press, Washington D.C., 2002）。
改変されたpurオペロン調節領域を有するイノシン生産性バチルス・ズブチリス株が記載されている（米国特許第7,326,546号（2008））。

染色体DNAの調製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの消化及び連結、形質転換、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択等のための方法は、当業者に周知の通常の方法とすることができる。これらの方法は、Sambrook, J.and Russell D.「Molecular Cloning A Laboratory Manual, Third Edition」、Cold Spring Harbor Laboraroty Press (2001)等に記載されている。

２．ヌクレオシドの製造方法
イノシン及び／又はグアノシンのようなヌクレオシドを製造する方法は、培養培地中で細菌を培養し、培養培地中でヌクレオシドを生産して蓄積させ、培養培地からヌクレオシドを回収する工程を含む。

培養並びに培地からのプリンヌクレオシドの回収及び精製等は、微生物を使用してプリンヌクレオシドを製造する従来の発酵と類似した様式で行うことができる。プリンヌクレオシド製造のための培養培地は、炭素源、窒素源、無機イオン、及び必要に応じて他の有機成分を含有する典型的な培地とすることができる。炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロース、リボース、及び澱粉の加水分解物のような糖類、グリセリン、マンニトール、及びソルビトールのようなアルコール、グルコン酸、フマル酸、クエン酸、及びコハク酸のような有機酸等を使用することができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、及びリン酸アンモニウムのような無機アンモニウム塩、大豆加水分解物のような有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を使用することができる。ビタミンＢ１のようなビタミン、要求物質、例えば、アデニン及びＲＮＡのような核酸のような有機窒素、又は酵母エキス等が適切な量で、又は微量であっても存在するのが望ましい。これら以外に、必要に応じて、少量のリン酸カルシウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等を添加することができる。

培養は、好ましくは、好気条件下で１６〜７２時間行うことができ、培養中の培養温度は３０〜４５℃以内に制御し、pHは５〜８以内に制御する。ｐＨは、無機若しくは有機酸又はアルカリ物質並びにアンモニアガスを使用することによって調整することができる。

培養後、細胞のような固体は、遠心分離又は膜ろ過によって液体培地から除去することができ、その後にイオン交換樹脂及び沈殿のような従来の技術のいずれかの組合せによって、目的とするプリンヌクレオシドを発酵液から回収することができる。

３．プリンヌクレオチドの製造方法
プリンヌクレオチドを製造する方法は、培養培地中で細菌を培養し、所望のプリンヌクレオシドをリン酸化し、細菌によって培地中に排出させ、プリンヌクレオチドを回収する工程を含む。更に、５’−イノシン酸を製造する方法は、培養培地中で細菌を培養し、イノシンをリン酸化し、細菌によって培養物中に排出させ、５’−イノシン酸を回収する工程を含む。更に、５’−キサンチル酸を製造する方法は、培養培地中で細菌を培養し、キサントシンをリン酸化し、細菌によって培養培地中に排出させ、５’−キサンチル酸を回収する工程を含む。更に、５’−グアニル酸を製造する方法は、培養培地中で細菌を培養し、グアノシンをリン酸化し、細菌によって培養培地中に排出させ、５’−グアニル酸を回収する工程を含む。そして、５’−グアニル酸を製造する方法は、培養培地中で細菌を培養し、キサントシンをリン酸化し、細菌によって培養培地中に排出させ、５’−キサンチル酸をアミノ化し、５’−グアニル酸を回収する工程を含む。

リン酸化するプリンヌクレオシドは、細菌がプリンヌクレオシドを培地中に排出した培地から回収することができる。しかしながら、プリンヌクレオシドの単離又は精製を行うことなく、プリンヌクレオシドを含有する培地をリン酸化反応のために使用することができる。

培養並びに培地からのイノシンの回収及び精製等は、微生物を使用してイノシンを製造する従来の発酵法と類似する様式で行うことができる。更に、イノシンをリン酸化し、細菌によって培養培地中に排出させ、5'-イノシン酸を回収する工程は、5'-イノシン酸のようなプリンヌクレオチドをイノシンのようなプリンヌクレオシドから製造する従来の発酵法と類似する様式で行うことができる。

プリンヌクレオシドのリン酸化は、異なるホスファターゼ、ヌクレオシドキナーゼ、又はヌクレオシドホスホトランスフェラーゼを使用して酵素的に、又はPOCl₃等のようなリン酸化試薬を使用して化学的に行うことができる。ピロリン酸のホスホリル基のヌクレオシドへのC-5'位置での選択的な転移を触媒することのできるホスファターゼ（Mihara et.
al, Phosphorylation of nucleosides by the mutated acid phosphatase from Morganella morganii. Appl. Environ. Microbiol., 66:2811-2816 (2000)）又はポリリン酸（塩）、フェニルリン酸（塩）、又はカルバミルリン酸（塩）をリン酸供与体として利用する酸性ホスファターゼ（国際公開第9637603号パンフレット）等を使用することができる。また、p-ニトロフェニルリン酸（Mitsugi, K., et al, Agric. Biol. Chem., 28, 586-600 (1964)）、無機リン酸（特願昭第42-1185号又は特開昭42-1185号公報（JP42-1186））、又はアセチルリン酸（特願昭第61-41555号又は特開昭第61-41555号公報（JP61-41555））を基質として利用したヌクレオシドのC-2', 3'又は5'位置へのリン酸基（phosphoryl group）の転移を触媒することのできるホスファターゼ等も使用することができる。ヌクレオシドキナーゼの例としては、E. coli由来のグアノシン／イノシンキナーゼ（Mori, H. et. al. Cloning of a guanosine-inosine kinase gene of Escherichia coli and characterization of the purified gene product. J. Bacteriol. 177:4921-4926 (1995)；国際公開第9108286号パンフレット）等を使用することができる。Hammer-Jespersen, K.によって記載されたヌクレオシドホスホトランスフェラーゼ（Nucleoside catabolism, p. 203-258. In A Munch-Petesen (ed.), Metabolism of nucleotides, nucleosides, and nucleobases in microorganism. 1980, Academic Press, New York）等を使用することができる。POCl₃のようなリン酸化試薬等を使用してヌクレオシドの化学的リン酸化を行うことができる（Yoshikawa, K. et. al. Studies of phosphorylation. III. Selective phosphorylation of unprotected nucleosides. Bull. Chem. Soc. Jpn. 42:3505-3508 (1969)）。

5'-キサンチル酸のアミノ化は、例えば、E. coli由来のGMP合成酵素を使用して酵素的に行うことができる（Fujio et. al. High level of expression of XMP aminase in Escherichia coli and its application for the industrial production of 5'- guanylic acid. Biosci. Biotech. Biochem. 1977, 61: 840-845；欧州特許第0251489号）。

以下の限定的でない実施例を参照し、本発明を以下に更に具体的に説明する。

実施例１：不活性化したhxlA遺伝子を有する株の構築
バチルス・ズブチリスイノシン生産菌KMBS375の染色体上のhxlA遺伝子を不活性化するために（KMBS375株の構築は参考例に記載されている）、pKS1プラスミド（Shatalin K. Y.とNeyfakh A. A., FEMS Microbiology Letters, 245: 315-9 (2005)）（図１）の２つのマルチクローニングサイトにhxlA遺伝子の上流及び下流領域をクローン化した。プライマーP1（配列番号５）及びP2（配列番号６）を用いバチルス・ズブチリス KMBS375の染色体
DNAを鋳型（template）として使用するPCRによって、hxlA遺伝子の上流領域の886 bp断片の増幅を行った。プライマーP1及びP2は、それぞれエンドヌクレアーゼSacII及びPstIの認識部位を含んでいる。プライマーP3（配列番号７）及びP4（配列番号８）を用いバチルス・ズブチリス KMBS375の染色体DNAを鋳型として使用するPCRによって、hxlA遺伝子の下流領域の923 bp断片の増幅を行った。プライマーP3及びP4は、それぞれエンドヌクレアーゼClaI及びKpnIの認識部位を含んでいる。P1及びP2を使用したPCR産物を精製し、エンドヌクレアーゼSacII及びPstIを用いて消化した後、pKS1プラスミドの対応する部位にクローン化した。P3及びP4を使用したPCR産物を精製し、エンドヌクレアーゼClaI及びKpnIを用いて消化した後、同様にpKS1プラスミドの対応する部位にクローン化した。両者の断片をクローン化した後、Km^Rカセット並びにhxlA遺伝子の上流及び下流領域を含むプラスミドをエンドヌクレアーゼSacII及びKpnIにより消化し、この結果得られた断片（3194 bp）をバチルス由来の非複製pBluescript II KSベクター（Stratagene）にサブクローン化した。この結果得られたプラスミドを使用してバチルス・ズブチリス KMBS375を形質転換し、12のKm^R形質転換体を単離した。Km^Rカセットの組込みによってhxlA遺伝子が不活性化されたことを確認するために、プライマーP1及びP4を使用したコントロールPCR実験を行った。プライマーP1及びP4を使用しhxlA遺伝子の野生型対立遺伝子を用いたPCRによって得られたDNA断片の大きさは2476 bpである。これに対して、3194 bpのDNA断片の存在により、hxlA遺伝子へのKm^Rカセットの組込みが確認される。プライマーP5（配列番号９：プライマーP5は、P1プライマーに相補的な領域の上流であって、hxlA遺伝子の翻訳開始位置から1013 bpの位置に局在する領域に相補的な20塩基を含む）及びプライマーP6（配列番号１０：プライマーP6は、Km^Rカセット内に局在する領域に相補的な21塩基を含む）を使用する追加的なコントロールPCR実験では、1491 bpのPCR生成断片の存在により、KMBS375染色体上のhxlA遺伝子へのKm^Rカセットの組込みが確認される。組込まれたKm^Rカセットを含むKMBS375形質転換体の１つを次のプロセスに使用した。この株は、KMBS375Δhxl::Kmと命名した。

実施例２：バチルス・ズブチリス株KMBS375Δhxl::Kmによるイノシンの生産
イノシン生産に対するhxlAの不活性化の効果を試験するために、バチルス・ズブチリスKMBS375株及びKMBS375Δhxl::Km株をそれぞれL-ブロス中で34℃で18時間培養した後、0.3
mlの培養物を20×200 mm試験管中の３mlの発酵培地に接種し、34℃で72時間ロータリーシェーカー上で培養した。結果を表１に示す。

発酵培地の組成（g/l）：
グルコース 30.0
NH₄Cl 32.0
KH₂PO₄ 1.0
MgSO₄・7H₂O 0.4
FeSO₄・7H₂O 0.01
MnSO₄・5H₂O 0.01
マメノ-TN (Mameno-TN) （大豆加水分解物） 1.35（全窒素として）
DL-メチオニン 0.3
アデニン 0.1
グアニン 0.05
消泡剤（アデカノール） 0.5 ml
CaCO₃ 50.0
pH 6.0 （KOHによる）

培養後、培地中に蓄積されたイノシンの量をHPLCによって決定した。

HPLC分析の条件カラム：
Luna C18(2) 250×３mm、5u（Phenomenex、米国）。
緩衝液：２％v/v C₂H₅OH；0.8％v/vトリエチルアミン；0.5％v/v酢酸（氷酢酸）；pH 4.5。温度：30℃。
流速：0.3 ml/分。
注入容積：５μl。
検出：UV 250 nm。
保持時間（分）：
キサントシン 13.7
イノシン 9.6
ヒポキサンチン 5.2
グアノシン 11.4
アデノシン 28.2

表１の通り、KMBS375Δhxl::Kmは、KMBS375と比較して、より高い量のイノシン（HxR）を生産した。

参考例：KMBS375の構築
＜バチルス・ズブチリス 168 Marburgの原栄養株の構築＞
バチルス・ズブチリス 168 Marburg（ATCC6051）は、染色体上の変異対立遺伝子trpC2（trpC；インドール-3-グリセリンリン酸合成酵素（indole-3-glycerol phosphate synthase）遺伝子）によりTrp栄養要求株である（Albertini A. M.とA. Galizzi, 1999）。バチルス・ズブチリス 168 Marburg株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection (ATCC)（住所P. O. Box 1549 Manassas, VA 20108、米国））から取得することができる。（バチルス・ズブチリス 168 (trpC2)のtrpオペロンの配列の再掲載。Microbiology, 145: 3319-3320）。trpC2開始コドンから位置328以降の３つのヌクレオチド「att」を有するtrpC2対立遺伝子を、以下のようにしてPCR増幅しバチルス・ズブチリス 168 Marburgに導入した。

（１）組換えPCRによるtrpC⁺対立遺伝子の増幅
trpC⁺対立遺伝子の5'末端及びその上流領域を増幅するに際し、GenBank（Accession No. NC_000964）及びAlbertiniとGalizzi（Microbiology, 145: 3319-3320）からの情報に基いて、PCRプライマー７（配列番号１１）及び８（配列番号１２）を設計した。

前記したプライマー及びバチルス・ズブチリス 168 Marburgの染色体DNAの鋳型を使用し、PCR（94℃で30秒、53℃で１分、72℃で１分、30サイクル、Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer)）を行い、trpC⁺対立遺伝子の5'末端領域及び上流領域を含む断片を増幅した。

trpC⁺対立遺伝子の3'末端及びその下流領域を増幅するに際し、GenBank（Accession No. NC_000964）及びAlbertiniとGalizzi（Microbiology, 145: 3319-3320）からの情報に基いて、PCRプライマー９（配列番号１３）及び１０（配列番号１４）を設計した。

前記したプライマー及びバチルス・ズブチリス 168 Marburgの染色体DNAの鋳型を使用し、PCR（94℃で30秒、53℃で１分、72℃で１分、30サイクル、Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer)）を行い、trpC⁺対立遺伝子の3'末端領域及び下流領域を含む断片を増幅した。

組換えPCRにより全trpC⁺対立遺伝子を増幅するに際し、MicroSpin Column S-400（Amersham Pharmacia Biotech）を使用し、前記したように増幅した２つのDNA断片を精製した。鋳型として適切な量の２つの断片の混合物並びにプライマー７（配列番号１１）及び１０（配列番号１４）を使用してPCRを行った（94℃で30秒、55℃で１分、72℃で２分、30サイクル、Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer)）。trpC⁺対立遺伝子の増幅断片（約1.2 kb）を得た。

（２）バチルス・ズブチリス 168 Marburg株からのTrp原栄養株の構築
アガロースゲル電気泳動の後に、trpC⁺対立遺伝子の断片をゲルから抽出した。DubnauとDavidoff-Abelson（Dubnau, D. and R. Davidoff-Abelson, J. Mol. Biol., 56: 209-221 (1971)）によって記載されたようにして調製したバチルス・ズブチリス 168 Marburgのコンピテント細胞をDNA断片で形質転換し、最小培地寒天平板上で生育することのできるコロニーを選択した。染色体DNAをコロニーから調製した。鋳型としての染色体DNA並びに７（配列番号１１）及び１０（配列番号１４）のプライマーを使用するPCRによってDNA断片を増幅した後に配列決定し、他のPCR誘導変異が不在であるtrpC2対立遺伝子への３つのヌクレオチドの挿入を確認した。このようにして得られた形質転換体はTrp栄養要求株ではなく、この株をKMBS275と命名した。

＜バチルス・ズブチリス 168 MarburgのHis栄養要求株の構築＞
ヒスチジノールリン酸アミノトランスフェラーゼをコードするhisC遺伝子においてフレーム内欠失（in-frame deletion）を作成し（ΔhisC：403番目〜606番目の204ヌクレオチドの欠失）、以下のようにしてバチルス・ズブチリス 168 Marburg株（trpC2）に導入した。

（１）組換えPCRによるΔhisCの増幅
ΔhisCの5'末端及びその上流領域を増幅するに際し、GenBank（Accession No. NC_000964）からの情報に基いてPCRプライマー１１（配列番号１５）及び１２（配列番号１６）を設計した。プライマー３８は、その5'末端にEcoRI部位を含む。プライマー３８は、フレーム内欠失によって生成した接合部（junction）を含む。

前記したプライマー及びバチルス・ズブチリス 168 Marburgの染色体DNAの鋳型を使用し、PCR（94℃で30秒、55℃で１分、72℃で１分、30サイクル、Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer)）を行い、ΔhisCの5'末端領域及び上流領域を含む断片を増幅した。

ΔhisCの3'末端及びその下流領域を増幅するに際し、GenBank（Accession No. NC_000964）からの情報に基いてPCRプライマー１３（配列番号１７）及び１４（配列番号１８）を設計した。プライマー４０は、フレーム内欠失によって生成した接合部を含む。プライマー４１は、その5'末端にBamHI部位を含む。

前記したプライマー及びバチルス・ズブチリス 168 Marburgの染色体DNAの鋳型を使用し、PCR（94℃で30秒、55℃で１分、72℃で１分、30サイクル、Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer)）を行い、ΔhisCの3'末端領域及び下流領域を含む断片を増幅した。

組換えPCRにより全ΔhisCを増幅するに際し、MicroSpin Column S-400（Amersham Pharmacia Biotech）を使用し、前記したように増幅した２つのDNA断片を精製した。鋳型として適切な量の２つの断片の混合物並びにプライマー１１（配列番号１５）及び１４（配列番号１８）を使用してPCRを行った（94℃で30秒、55℃で１分、72℃で２分、30サイクル、Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer)）。ΔhisCの増幅断片（約1.5 kb）を得た。

（２）ΔhisC遺伝子のクローン化
増幅した断片をEcoRI及びBamHIにより消化し（37℃、一夜）、アガロースゲルを使用して分離した。目的断片をゲルから抽出し、同一酵素で予め消化した（37℃、３時間）バチルス・ズブチリス染色体組込みベクターpJPM1（Mueller, J. P.、G. Bukusoglu and A. L. Sonenshein. 1992. Transcriptional regulation of Bacillus subtilis glucose starvation-inducible genes: control of gsiA by the ComP-ComA signal transduction system. J. Bacteriol. 174:4361-4373.）と連結した。正しく挿入されたΔhisC遺伝子を含むプラスミドを選択し、DNA配列決定によって他のPCR誘導性変異を有さないことを確認し、pKM186と命名した。

（３）バチルス・ズブチリス 168 Marburg株からのHis栄養要求株の構築
前記したように調製したバチルス・ズブチリス 168 Marburg株のコンピテント細胞をpKM186により形質転換し、2.5μg/mLのクロラムフェニコール（Cm）を含有するLB寒天平板上で生育することのできるコロニー（シングルクロスオーバー組換え体）を選択した。

20mg/Lのグアニンを補填した10mLのLB培地（LB+Gua培地）にシングルクロスオーバー組換え体の１つを接種し、37℃で２日間、継続的に継代培養した。Cmを含む又は含まないLB+Gua寒天培地を使用し、クロラムフェニコール感受性を示すコロニーを選択した。Cm感受性コロニーから染色体DNAを調製した。１１（配列番号１５）及び１４（配列番号１８）を使用し、前記と同様の様式でPCRを行った。ダブルクロスオーバー組換えによって染色体上のhisC遺伝子が破壊型の（disrupted-type）hisC遺伝子（ΔhisC）で置換された株を同定した。二重組換え株（double-recombinant strain）はKMBS276（ΔhisCtrpC2）と命名した。

＜バチルス・ズブチリス KMBS375の構築＞
１．KMBS350(ΔpurAΔpurRΔpupG)の構築
破壊型のpupG、purR、及びpurA遺伝子（それぞれグアノシン／イノシンホスホリラーゼ、プリンオペロンリプレッサー、スクシニルAMP合成酵素）をバチルス・ズブチリス 168 Marburgから誘導した組換えKMBS276株（ΔhisCtrpC2）に順次導入し、この株から以下のようにして原栄養株を得た。

（１）ΔpupG（334番目〜537番目の204のヌクレオチドのフレーム内欠失）のKMBS276への導入

（ｉ）組換えPCRによるΔpupGの増幅
ΔpupGの5'末端及びその上流領域を増幅するに際し、GenBank（Accession No. NC_000964）からの情報に基いてPCRプライマー１５（配列番号１９）及び１６（配列番号２０）を設計した。プライマー４２は、その5'末端にBamHI部位を含む。プライマー４３は、フレーム内欠失によって生成した接合部を含む。

前記したプライマー及びバチルス・ズブチリス 168 Marburgの染色体DNAの鋳型を使用し、PCR（94℃で30秒、55℃で１分、72℃で1.5分、30サイクル、Gene Amp PCR System Mo
del 9600 (Perkins Elmer)）を行い、ΔpupGの5'末端領域及び上流領域を含む断片を増幅した。

ΔpupGの3'末端及びその下流領域を増幅するに際し、GenBank（Accession No. NC_000964）からの情報に基いてPCRプライマー１７（配列番号２１）及び１８（配列番号２２）を設計した。プライマー４４は、フレーム内欠失によって生成した接合部を含む。プライマー４５は、その5'末端にBamHI部位を含む。

前記したプライマー及びバチルス・ズブチリス 168 Marburgの染色体DNAの鋳型を使用し、PCR（94℃で30秒、50℃で１分、72℃で1.5分、30サイクル、Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer)）を行い、ΔpupGの3'末端領域及び下流領域を含む断片を増幅した。

組換えPCRにより全ΔpupGを増幅するに際し、MicroSpin Column S-400（Amersham Pharmacia Biotech）を使用し、前記したように増幅した２つのDNA断片を精製した。鋳型として適切な量の２つの断片の混合物並びにプライマー１５（配列番号１９）及び１８（配列番号２２）を使用してPCRを行った（94℃で30秒、55℃で１分、72℃で３分、30サイクル、Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer)）。ΔpupGの増幅断片（約２kb）を得た。

（ｉｉ）ΔpupG遺伝子のクローン化
増幅した断片をBamHIにより消化し（37℃、一夜）、アガロースゲルを使用して分離した。目的断片をゲルから抽出し、同一酵素で予め消化した（37℃、３時間）バチルス・ズブチリス染色体組込みベクターpJPM1（J. Bacteriol. 174: 4361-4373）と連結した後、子ウシ腸ホスファターゼを用いた処理を行った。正しく挿入されたΔpupG遺伝子を含むプラスミドを選択し、DNA配列決定によって他のPCR誘導性変異を有さないことを確認し、pKM199と命名した。

（ｉｉｉ）ΔpupGのKMBS276への導入
前記したようにして調製したKMBS276株のコンピテント細胞をpKM199により形質転換し、2.5μg/mLのCmを含有するLB寒天平板上で生育することのできるコロニー（シングルクロスオーバー組換え体）を選択した。

10mLのLB+Gua培地にシングルクロスオーバー組換え体の１つを接種し、37℃で２日間、継続的に継代培養した。Cmを含む又は含まないLB+Gua寒天培地を使用し、クロラムフェニコール感受性を示すコロニーを選択した。Cm感受性コロニーから染色体DNAを調製した。プライマー１５（配列番号１９）及び１８（配列番号２２）を使用し、前記と同様の様式でPCRを行った。ダブルクロスオーバー組換えによって染色体上のpupG遺伝子が破壊型のpupG遺伝子（ΔpupG）と入れ替えられた株を同定した。二重組換え株はKMBS334（ΔpupGΔhisCtrpC2）と命名した。

（２）ΔpurR（31番目〜825番目の795のヌクレオチドのフレーム内欠失）のKMBS334への導入

（ｉ）組換えPCRによるΔpurRの増幅
ΔpurRの5'末端及びその上流領域を増幅するに際し、GenBank（Accession No. NC_000964）からの情報に基いてPCRプライマー１９（配列番号２３）及び２０（配列番号２４）を設計した。プライマー４６は、その5'末端にBamHI部位を含む。プライマー４７は、フレーム内欠失によって生成した接合部を含む。

前記したプライマー及びバチルス・ズブチリス 168 Marburgの染色体DNAの鋳型を使用し、PCR（94℃で30秒、55℃で１分、72℃で1.5分、30サイクル、Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer)）を行い、ΔpurRの5'末端領域及び上流領域を含む断片を増幅した。

ΔpurRの3'末端及びその下流領域を増幅するに際し、GenBank（Accession No. NC_000964）からの情報に基いてPCRプライマー２１（配列番号２５）及び２２（配列番号２６）を設計した。プライマー４８は、フレーム内欠失によって生成した接合部を含む。プライマー４９は、その5'末端にBamHI部位を含む。

前記したプライマー及びバチルス・ズブチリス 168 Marburgの染色体DNAの鋳型を使用し、PCR（94℃で30秒、50℃で１分、72℃で1.5分、30サイクル、Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer)）を行い、ΔpurRの3'末端領域及び下流領域を含む断片を増幅した。

組換えPCRにより全ΔpurRを増幅するに際し、MicroSpin Column S-400（Amersham Pharmacia Biotech）を使用し、前記したように増幅した２つのDNA断片を精製した。鋳型として適切な量の２つの断片の混合物並びにプライマー１９（配列番号２３）及び２２（配列番号２６）を使用してPCRを行った（94℃で30秒、55℃で１分、72℃で2.5分、30サイクル、Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer)）。ΔpurRの増幅断片（約2.1 kb）を得た。

（ｉｉ）ΔpurR遺伝子のクローン化
増幅した断片をBamHIにより消化し（37℃、一夜）、アガロースゲルを使用して分離した。目的断片をゲルから抽出し、同一酵素で予め消化した（37℃、３時間）バチルス・ズブチリス染色体組込みベクターpJPM1（J. Bacteriol. 174: 4361-4373）と連結した後、子ウシ腸ホスファターゼを用いた処理を行った。正しく挿入されたΔpurR遺伝子を含むプラスミドを選択し、DNA配列決定によって他のPCR誘導性変異を有さないことを確認し、pKM200と命名した。

（ｉｉｉ）ΔpurRのKMBS334への導入
前記したように調製したKMBS334株のコンピテント細胞をpKM200により形質転換し、2.5μg/mLのCmを含有するLB寒天平板上で生育することのできるコロニー（シングルクロスオーバー組換え体）を選択した。

10mLのLB+Gua培地にシングルクロスオーバー組換え体の１つを接種し、37℃で２日間、継続的に継代培養した。Cmを含む又は含まないLB+Gua寒天培地を使用し、クロラムフェニコール感受性を示すコロニーを選択した。Cm感受性コロニーから染色体DNAを調製した。プライマー１９（配列番号２３）及び２２（配列番号２６）を使用し、前記と同様の様式でPCRを行った。ダブルクロスオーバー組換えによって染色体上のpurR遺伝子が破壊型のpurR遺伝子（ΔpurR）で置換された株を同定した。二重組換え株はKMBS337（ΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2）と命名した。

（３）ΔpurA（307番目〜675番目の369のヌクレオチドのフレーム内欠失）のKMBS337への導入

（ｉ）組換えPCRによるΔpurAの増幅
ΔpurAの5'末端及びその上流領域を増幅するに際し、GenBank（Accession No. NC_000964）からの情報に基いてPCRプライマー２３（配列番号２７）及び２４（配列番号２８）を設計した。プライマー５０は、その5'末端にBamHI部位を含む。プライマー５１は、フ
レーム内欠失によって生成した接合部を含む。

前記したプライマー及びバチルス・ズブチリス 168 Marburgの染色体DNAの鋳型を使用し、PCR（94℃で30秒、55℃で１分、72℃で１分、30サイクル、Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer)）を行い、ΔpurAの5'末端領域及び上流領域を含む断片を増幅した。

ΔpurAの3'末端及びその下流領域を増幅するに際し、GenBank（Accession No. NC_000964）からの情報に基いてPCRプライマー２５（配列番号２９）及び２６（配列番号３０）を設計した。プライマー５２は、フレーム内欠失によって生成した接合部を含む。プライマー５３は、その5'末端にBamHI部位を含む。

前記したプライマー及びバチルス・ズブチリス 168 Marburgの染色体DNAの鋳型を使用し、PCR（94℃で30秒、55℃で１分、72℃で１分、30サイクル、Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer)）を行い、ΔpurAの3'末端領域及び下流領域を含む断片を増幅した。

組換えPCRにより全ΔpurAを増幅するに際し、MicroSpin Column S-400（Amersham Pharmacia Biotech）を使用し、前記したように増幅した２つのDNA断片を精製した。鋳型として適切な量の２つの断片の混合物並びにプライマー２３（配列番号２７）及び２６（配列番号３０）を使用してPCRを行った（94℃で30秒、55℃で１分、72℃で２分、30サイクル、Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer)）。ΔpurAの増幅断片（約1.4 kb）を得た。

（ｉｉ）ΔpurA遺伝子のクローン化
増幅した断片をBamHIにより消化し（37℃、一夜）、アガロースゲルを使用して分離した。目的断片をゲルから抽出し、同一酵素で予め消化した（37℃、３時間）バチルス・ズブチリス染色体組込みベクターpJPM1（J. Bacteriol. 174: 4361-4373）と連結した後、子ウシ腸ホスファターゼを用いた処理を行った。正しく挿入されたΔpurA遺伝子を含むプラスミドを選択し、DNA配列決定によって他のPCR誘導性変異を有さないことを確認し、pKM208と命名した。

（ｉｉｉ）ΔpurAのKMBS337への導入
前記したように調製したKMBS337株のコンピテント細胞をpKM208により形質転換し、2.5μg/mLのCmを含有するLB寒天平板上で生育することのできるコロニー（シングルクロスオーバー組換え体）を選択した。

10mLのLB+Gua培地にシングルクロスオーバー組換え体の１つを接種し、37℃で２日間、継続的に継代培養した。Cmを含む又は含まないLB+Gua寒天培地を使用し、クロラムフェニコール感受性を示すコロニーを選択した。Cm感受性コロニーから染色体DNAを調製した。プライマー２３（配列番号２７）及び２６（配列番号３０）を使用し、前記と同様の様式でPCRを行った。ダブルクロスオーバー組換えによって染色体上のpurA遺伝子が破壊型のpurA遺伝子（ΔpurA）で置換された株を同定した。二重組換え株はKMBS349（ΔpurAΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2）と命名した。

（４）trpC⁺及びhisC⁺のKMBS349への導入
前記したように調製したKMBS349株のコンピテント細胞をKMBS275由来の染色体DNA（＜バチルス・ズブチリス 168 Marburgの原栄養株の構築＞参照）により形質転換し、20mg/Lのアデニン（Ade）を含有する最小培地寒天平板上で生育することのできるコロニーを選択した。

Adeを含む又は含まない最小培地寒天平板を使用し、得られた形質転換体からアデニン栄養要求性を有する株を選択した。その後、コロニーPCRにより（対応する遺伝子、pupG、purR、及びpurAについてのPCR条件は前記した通りである）、染色体上の３つの遺伝子が破壊型の遺伝子（ΔpupG、ΔpurR、及びΔpurA）で置換された株を同定した。この株はKMBS350（ΔpurAΔpurRΔpupG）と命名した。

２．KMBS356（ΔpurAΔpurRΔpupGguaB24）の構築
IMPデヒドロゲナーゼをコードするguaB遺伝子におけるグアニン栄養要求性リーキー（leaky）変異guaB24（米国特許出願公開第2006275874号（US2006275874A1）に記載されたguaB(A1)と同一）を、バチルス・ズブチリス 168 Marburgから誘導した組換えKMBS349株（ΔpurAΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2）に導入し、結果的に得られた株から以下のようにして原栄養株を取得した。

（１）KMBS349からのguaB破壊株の構築
前記したように調製したKMBS349株（ΔpurAΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2）のコンピテント細胞を、KMBS193（guaB::kantrpC；米国特許出願公開第2006275874号明細書（US2006275874A1））由来の染色体DNAにより形質転換し、2.5μg/mlのカナマイシン（Kan）を補填したLB培地の平板上で生育することのできるコロニーを選択した。

Gua栄養要求性を有するKan耐性株を形質転換体から同定した。得られた株は、KMBS351（guaB::kanΔpurAΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2）と命名した。

（２）KMBS349からのguaBリーキー株の構築
前記したように調製したKMBS351株（guaB::kanΔpurAΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2）のコンピテント細胞を、YMBS9の染色体DNA（guaB24trpC2；KMBS193のコンピテント細胞を、バチルス・ズブチリス 168 Marburgの誘導株における染色体上のguaB24変異を含むguaB領域のPCR増幅により得られるDNAにより形質転換することによって、YMBS9が得られる）により形質転換し、20mg/LのAde、His、及びTrpを含有する最小培地寒天平板上で生育できるコロニーを選択した。

Ade+Hisを含む又は含まない最小培地寒天平板を使用し、Ade及びHis栄養要求性の株を組換え体から選択した。その後、コロニーPCR（対応する遺伝子pupG及びpurRについてのPCR条件は前記した通りである）及びDNA配列決定により、染色体上の２つの遺伝子が破壊型の遺伝子（ΔpupG及びΔpurR）で置換され、guaB::kanがguaB24により正しく置換された株を同定した。得られた株は、KMBS353（guaB24ΔpurAΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2）と命名した。

（３）trpC⁺及びhisC⁺のKMBS353への導入
前記したように調製したKMBS353株のコンピテント細胞を、KMBS350の染色体DNAにより形質転換し（１．KMBS350（ΔpurAΔpurRΔpupG）の構築参照）、20mg/LのAdeを含有する最小培地寒天平板上で生育することのできるコロニーを選択した。

その後、組換え体におけるguaB遺伝子のDNA配列決定により、染色体上の野生型のguaBがリーキー型のguaB24対立遺伝子で置換された株を同定した。得られた株は、KMBS356（guaB24ΔpurAΔpurRΔpupG）と命名した。

３．KMBS375（Ppur*-ΔattΔdeoDΔpurAΔpurRΔpupG）の構築
改変されたプリンオペロンプロモーター（Ppur）及び部分的に欠失したアテニュエータ配列（Ppur*-Δatt；Ppur1-Δattと同一、米国特許出願公開第2006275874号明細書（US20
06275874A1）に記載されている）、破壊型のpurA遺伝子、IMPデヒドロゲナーゼをコードするguaB遺伝子におけるグアニン栄養要求性リーキー変異guaB24（米国特許出願公開第2006275874号明細書（US2006275874A1）に記載されたguaB(A1)と同一）、並びに破壊型の、プリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするdeoD遺伝子を、以下のようにして、バチルス・ズブチリス 168 Marburgから誘導された組換え体KMBS337株（ΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2；１．（２）ΔpurR（31番目〜825番目の795のヌクレオチドのフレーム内欠失）のKMBS334への導入参照）に順次導入した。

（１）KMBS337からのPpur破壊株の構築
前記したようにして調製したKMBS337株（ΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2）のコンピテント細胞を、KMBS198（Ppur::cattrpC2；米国特許出願公開第2006275874号明細書（US2006275874A1））の染色体DNAにより形質転換し、LB+Gua+Cm培地上で生育することのできるコロニーを選択した。

Ade及びHis栄養要求性を有する株を、Ade+Hisを含む又は含まない最小培地寒天平板を使用して組換え体から選択した。その後、コロニーPCR（対応するpupG及びpurRについてのPCR条件は前記した通りである）により、染色体上の２つの遺伝子が破壊型の遺伝子（ΔpupG及びΔpurR）で置換された株を同定した。得られた株は、KMBS340（Ppur::catΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2）と命名した。

（２）Ppur*-ΔattによるPpur::catの置換
前記したように調製したKMBS340株（Ppur::catΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2）のコンピテント細胞を、KMBS261（Ppur1-ΔattpurR::spcΔpupG*trpC2；米国特許出願公開第2006275874号明細書（US2006275874A1））由来の染色体DNAにより形質転換し、20mg/LのTrp及びHisを含有する最小培地寒天平板上で生育することのできるコロニーを選択した。

Ade+Hisを含む又は含まない最小培地寒天平板を使用し、Ade及びHis栄養要求性を有する株を組換え体から選択した。その後、コロニーPCR（対応する遺伝子pupG及びpurRについてのPCR条件は前記した通りである）およびDNA配列決定により、染色体上の２つの遺伝子が破壊型の遺伝子（ΔpupG及びΔpurR）で置換され、Ppur*-ΔattがPpur::catにより正しく置換された株を同定した。得られた株は、KMBS352（Ppur*-ΔattΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2）と命名した。

（３）ΔpurA（307番目〜675番目の369ヌクレオチドのフレーム内欠失）のKMBS352への導入
前記したようにして調製したKMBS352株（Ppur*-ΔattΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2）のコンピテント細胞を、KMBS350の染色体DNA（ΔpurAΔpurRΔpupG；１．KMBS350（ΔpurAΔpurRΔpupG）の構築参照）により形質転換し、20mg/LのHis及びAdeを含有する最小培地寒天平板上で生育することのできるコロニーを選択した。

「コングレッション（congression）」により得られるAde栄養要求性を有する株を、Ade+Hisを含む又は含まない最小培地寒天平板を使用して組換え体から選択した。これらの株の１つは、ΔhisCの代わりにhisC⁺を有することが見出された。その後、コロニーPCR（purAについてのPCR条件は前記した通りである）及びDNA配列決定により、染色体上のpurA遺伝子が破壊型の遺伝子（ΔpurA）で置換され、Ppur*-Δattが野生型のPpurにより置換されていない株を同定した。得られた株は、KMBS359（Ppur*-ΔattΔpurAΔpurRΔpupG）と命名した。

（４）KMBS359からのguaB破壊株の構築
前記したようにして調製したKMBS359株（Ppur*-ΔattΔpurAΔpurRΔpupG）のコンピテ
ント細胞を、KMBS351（guaB::kanΔpurAΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2；２．（１）KMBS349からのguaB破壊株の構築参照）の染色体DNAにより形質転換し、2.5μg/mlのKanを補填したLB+Gua培地の平板上で生育することのできるコロニーを選択した。

Gua栄養要求性を有するKan耐性株を組換え体から同定した。その後、PCRにより（PpurについてのPCR条件は米国特許出願公開第2006275874号明細書（US2006275874A1）に記載されている）、Ppur*-Δattが野生型のPpurにより置換されていない株を選択した。得られた株は、KMBS364（guaB::kanPpur*-ΔattΔpurAΔpurRΔpupG）と命名した。

（５）KMBS346からのguaBリーキー株の構築
前記したようにして調製したKMBS364株（guaB::kanPpur*-ΔattΔpurAΔpurRΔpupG）のコンピテント細胞を、KMBS356の染色体DNA（guaB24ΔpurAΔpurRΔpupG；２．（３）trpC+及びhisC+のKMBS353への導入参照）により形質転換し、20mg/LのAdeを含有する最小培地寒天平板上で生育することのできるコロニーを選択した。

その後、DNA配列決定により、guaB::kan対立遺伝子がguaB24により正しく置換され、Ppur*-Δattが野生型Ppurにより置換されていない株を同定した。得られた株は、KMBS365（guaB24Ppur*-ΔattΔpurAΔpurRΔpupG）と命名した。

（６）ΔdeoD（262番目〜450番目の189のヌクレオチドのフレーム内欠失）のKMBS365への導入
（ｉ）組換えPCRによるΔdeoDの増幅
ΔdeoDの5'末端及びその上流領域を増幅するに際し、GenBank（Accession No. NC_000964）からの情報に基いてPCRプライマー２７（配列番号３１）及び２８（配列番号３２）を設計した。プライマー５４は、その5'末端にBamHI部位を含む。プライマー５５は、フレーム内欠失によって生成した接合部を含む。

前記したプライマー及びバチルス・ズブチリス 168 Marburgの染色体DNAの鋳型を使用し、PCR（94℃で30秒、55℃で１分、72℃で1.5分、30サイクル、Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer)）を行い、ΔdeoDの5'末端領域及び上流領域を含む断片を増幅した。

ΔdeoDの3'末端及びその下流領域を増幅するに際し、GenBank（Accession No. NC_000964）からの情報に基いてPCRプライマー２９（配列番号３３）及び３０（配列番号３４）を設計した。プライマー５６は、フレーム内欠失によって生成した接合部を含む。プライマー５７は、その5'末端にBamHI部位を含む。

前記したプライマー及びバチルス・ズブチリス168 Marburgの染色体DNAの鋳型を使用し、PCR（94℃で30秒、55℃で１分、72℃で１分、30サイクル、Gene Amp PCR System Model
9600 (Perkins Elmer)）を行い、ΔdeoDの3'末端領域及び下流領域を含む断片を増幅した。

組換えPCRにより全ΔdeoDを増幅するに際し、MicroSpin Column S-400（Amersham Pharmacia Biotech）を使用し、前記したように増幅した２つのDNA断片を精製した。鋳型として適切な量の２つの断片の混合物並びにプライマー２７（配列番号３１）及び３０（配列番号３４）を使用してPCRを行った（94℃で30秒、50℃で１分、72℃で３分、30サイクル、Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer)）。ΔdeoDの増幅断片（約2.0 kb）を得た。

（ｉｉ）ΔdeoD遺伝子のクローン化
増幅した断片をBamHIにより消化し（37℃、一夜）、アガロースゲルを使用して分離した。目的断片をゲルから抽出し、同一酵素で予め消化した（37℃、３時間）バチルス・ズブチリス染色体組込みベクターpJPM1（J. Bacteriol. 174: 4361-4373）と連結した後、子ウシ腸ホスファターゼを用いた処理を行った。正しく挿入されたΔdeoD遺伝子を含むプラスミドを選択し、DNA配列決定によって他のPCR誘導性変異を有さないことを確認し、pKM201と命名した。

（ｉｉｉ）ΔdeoDのKMBS365への導入
前記したように調製したKMBS365株のコンピテント細胞をpKM201により形質転換し、2.5μg/mLのCmを含有するLB+Gua寒天平板上で生育することのできるコロニー（シングルクロスオーバー組換え体）を選択した。

10mLのLB+Gua培地にシングルクロスオーバー組換え体の１つを接種し、37℃で２日間、継続的に継代培養した。Cmを含む又は含まないLB+Gua寒天培地を使用し、Cm感受性を示すコロニーを選択した。Cm感受性コロニーから染色体DNAを調製した。プライマー２７（配列番号３１）及び３０（配列番号３４）を使用し、前記と同様の様式でPCRを行った。ダブルクロスオーバー組換えによって染色体上のdeoD遺伝子が破壊型のdeoD遺伝子（ΔdeoD）で置換された株を同定した。二重組換え株はKMBS375（ΔdeoDguaB24Ppur*-ΔattΔpurAΔpurRΔpupG）と命名した。

本発明をその好適な形態を参照して詳細に説明したが、本発明の範囲を逸脱することなく種々の変更を行うことができ、等価物を用いることができることは当業者に明らかであろう。前記した文書のそれぞれは、参考により全体としてここに組入れるものとする。

Claims (10)

1. プリンヌクレオシド生産能を有し、３−ヘキスロース−６−リン酸合成酵素（HPS）活性が減少するよう改変されたバチルス属細菌を培養培地中で培養し、プリンヌクレオシドを培養培地中に排出させ、プリンヌクレオシドを培養培地から回収することを含む、プリンヌクレオシドの製造方法。
2. 前記バチルス属細菌は、３−ヘキスロース−６−リン酸合成酵素（HPS）をコードする遺伝子の発現が低減するよう改変されたバチルス属細菌である、請求項１記載のプリンヌクレオシドの製造方法。
3. 前記発現は、前記遺伝子を不活性化させることによって低減された、請求項２記載のプリンヌクレオシドの製造方法。
4. 前記遺伝子がhxlA遺伝子である、請求項２または３記載のプリンヌクレオシドの製造方法。
5. 前記hxlA遺伝子は、配列番号２もしくは４のアミノ酸配列、または配列番号２もしくは４のアミノ酸配列において１〜５個のアミノ酸の欠失、挿入、付加もしくは置換を含むアミノ酸配列を含む、請求項４記載のプリンヌクレオシドの製造方法。
6. 前記バチルス属細菌は、バチルス・ズブチリスである請求項１〜５のいずれか一項に記載のプリンヌクレオシドの製造方法。
7. 前記バチルス属細菌は、バチルス・アミロリケファシエンスである請求項１〜５のいずれか一項に記載のプリンヌクレオシドの製造方法。
8. 前記プリンヌクレオシドが、イノシン、キサントシン、グアノシン、及びアデノシンからなる群から選択される請求項１〜７のいずれか一項に記載のプリンヌクレオシドの製造方法。
9. プリンヌクレオシド生産能を有し、３−ヘキスロース−６−リン酸合成酵素（HPS）活性が減少するよう改変されたバチルス属細菌を培養培地中で培養し、プリンヌクレオシドを培養培地中に排出させ、プリンヌクレオシドをリン酸化し、プリンヌクレオチドを単離することを含む、プリンヌクレオチドの製造方法。
10. プリンヌクレオチドが、5'-イノシン酸、キサントシン-5'-リン酸、5'-グアニル酸、及び5'-アデニル酸からなる群から選択される請求項９記載のプリンヌクレオチドの製造方法。

Images