CN102141558B - 竹叶提取物及其制品中黄酮含量的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及竹叶提取物及其制品中黄酮含量的测定方法，具体地说，其包括以下步骤：(a)使竹叶提取物或其制品进行酸解处理；(b)提供用于HPLC分析用的反相高效液相色谱***；(c)分别将不同的标准品溶液注入液相色谱***，进行色谱分离；(d)将步骤(a)酸解溶液注入液相色谱***，进行色谱分离；(e)对竹叶提取物或其制品中的黄酮类化合物进行定性表征；和任选地，(f)对竹叶提取物或其制品中的黄酮类化合物进行定量表征。本发明的方法可以准确地测定竹叶提取物或其制品中的黄酮化合物的组成分布及其含量。

Description

竹叶提取物及其制品中黄酮含量的测定方法

技术领域

本发明涉及天然产物的测定方法，具体涉及天然产物中黄酮类物质的测定方法，更特别地涉及竹叶提取物及其制品中黄酮含量的测定方法。

背景技术

竹叶作为一种“药食两用的天然植物”已被广大消费者所接受，竹叶提取物主要功能性成分为黄酮糖苷，具有抗氧化和抑菌活性，可以作为一种生物黄酮类保健营养素进行开发。以竹叶为原料，利用硅胶柱层析、大孔树脂柱层析、有机溶剂液液萃取等方法制备的竹叶黄酮粉产品已经上市，因此，竹叶提取物在食品、化工、医药、农业等领域具有广阔的市场前景。

目前，用于测定竹叶提取物及其制品中黄酮含量的方法是分光光度法，分光光度法是利用黄酮类化合物结构上的酚羟基及其还原性羰基能够与金属盐试剂形成有色络合物原理进行测定。此法设备价廉，操作简便，但样品未经分离纯化，受花色素、酚酸及其它酚性成分的干扰，误差较大，结果高于实际含量。此外，由于竹叶提取物及其制品中的黄酮类成分比较复杂，不同种类的黄酮化合物相互之间的的含量亦相差非常大，分光光度法的另一项重要缺点是难以了解竹叶提取物及其制品中各种黄酮化合物的分布及其具体含量、比例等，而对这些参数的了解对于产品的深入开发和评价具有重要意义。

尽管我国林业科研人员对竹叶提取物的开发利用已进行了一定的研究，由于行业中仍缺乏测定竹叶提取物及其制品中黄酮含量的明确而有效的方法，这在一定程度上制约了竹叶提取物的开发利用。因此，建立一个更精准的测定竹叶提取物及其制品中黄酮含量的方法具有重要意义。

发明内容

本发明人令人惊奇地发现，通过将竹叶提取物或其制品进行酸水解处理，然后采用特定的色谱条件进行高效液相色谱分析，可以准确地测定竹叶提取物或其制品中的黄酮化合物的组成分布及其含量。本发明基于上述发现而得以完成。

发明概述：

因此，本发明第一方面涉及测定竹叶提取物或其制品中黄酮化合物种类和/或含量的方法，其包括以下步骤：(a)使竹叶提取物或其制品进行酸解处理；(b)提供用于HPLC分析用的反相高效液相色谱***；(c)分别将不同的标准品溶液注入液相色谱***，进行色谱分离；(d)将步骤(a)酸解溶液注入液相色谱***，进行色谱分离；(e)对竹叶提取物或其制品中的黄酮类化合物进行定性表征；和任选地，(f)对竹叶提取物或其制品中的黄酮类化合物进行定量表征。

本发明第二方面提供了一种信息说明资料，其中记载了本发明第一方面任一项所述的方法。

发明详述：

本发明第一方面涉及测定竹叶提取物或其制品中黄酮化合物种类和/或含量的方法，其包括以下步骤：

(a)使竹叶提取物或其制品在盐酸甲醇溶液中加热，进行酸解处理，过滤，得酸解溶液；

(b)提供反相高效液相色谱***，其包括色谱柱、流动相、包括等度和/或梯度的洗脱程序、以及装配有二极管阵列检测器或紫外检测器的色谱仪；

(c)分别将不同的标准品溶液注入液相色谱***，进行色谱分离，所述各标准品溶液独立地包含一种或多种选自下列7个的标准品：异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖苷、木犀草素、苜蓿素；

(d)将步骤(a)所得酸解溶液注入液相色谱***，进行色谱分离；

(e)根据步骤(c)所得各标准品的色谱响应值以及步骤(d)所得酸水解溶液的色谱响应值，对所述竹叶提取物或其制品中的黄酮类化合物进行定性表征；和任选地，

(f)根据步骤(c)所得各标准品的色谱响应值以及步骤(d)所得酸水解溶液的色谱响应值，对所述竹叶提取物或其制品中的黄酮类化合物进行定量表征。

在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中在步骤(a)中，所述盐酸甲醇溶液是甲醇与25％盐酸的混合物。在一个实施方案中，所述甲醇与25％盐酸的混合物是二者以体积比(2～6)∶1、(2～5)∶1、或约4∶1的混合物，优选是约4∶1的混合物。

在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中在步骤(a)中，所述加热是在沸水浴中加热。在一个实施方案中，所述加热是在沸水浴中回流。

在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中在步骤(a)中，所述酸解处理的时间为1～3小时。在一个实施方案中，所述酸解处理的时间为1.5～2.5小时。在一个实施方案中，所述酸解处理的时间为约2小时。

在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中在步骤(a)中，所述竹叶提取物或其制品与盐酸甲醇溶液的比为50mg∶(10ml～50ml)。在一个实施方案中，所述竹叶提取物或其制品与盐酸甲醇溶液的比为50mg∶(15ml～40ml)、50mg∶(20ml～30ml)、或约50mg∶25ml，优选的比为约50mg∶25ml。

本领域技术人员理解，根据所述竹叶提取物或其制品中的黄酮类化合物的含量不同，所述竹叶提取物或其制品与盐酸甲醇溶液的比可以作适当的改变，以获得较佳的酸解效果；类似地，其它因素亦可作适当改变。在一个实施方案中，在步骤(a)中，所述盐酸甲醇溶液是甲醇与25％盐酸二者以体积比约4∶1的混合物，所述加热是在沸水浴中回流，所述酸解处理的时间为约2小时，所述竹叶提取物或其制品与盐酸甲醇溶液的比为约50mg∶25ml。

在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中在步骤(b)中，所述色谱柱是ODS柱。在一个实施方案中，所述色谱柱是5μm粒度填料的ODS柱。在一个实施方案中，所述色谱柱是5μm粒度填料的ODS柱。在一个实施方案中，所述色谱柱是5μm粒度填料的YMC-Pack ODS AQ型色谱柱。在一个实施方案中，所述色谱柱是5μm粒度填料的YMC-PackODS AQ型(4.6mm x 250mm)色谱柱，或者是具有在本发明所述色谱条件下与该5μm粒度填料的YMC-Pack ODS AQ型(4.6mm x 250mm)色谱柱分离效果相当的色谱柱。在一个实施方案中，所述色谱柱是ODS柱，并且其在在本发明所述色谱条件下可以使下列标准品相互之间的分离度达到1.0以上：异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖苷、木犀草素、苜蓿素。优选地，该色谱柱可使上述7个标准品相互之间的分离度达到1.1以上、1.2以上、1.3以上、1.5以上、或2.0以上。

在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中在步骤(b)中，所述流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A是乙腈，所述流动相B是0.5％(V/V)磷酸水溶液。

在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中在步骤(b)中，所述洗脱程序是以0.5～2ml/min(优选约1ml/min)的流速，在第一洗脱时间段内以包含10～15％流动相A和加至100％流动相B的混合液中进行等度洗脱，然后在第一洗脱时间段内从上述混合液经线性梯度变化到包含40～50％流动相A和加至100％流动相B的混合液中进行梯度洗脱。在一个实施方案中，所述第一洗脱时间段使用的洗脱液是包含约12％流动相A和约88％流动相B(本领域技术人员理解，(1)二者之和为100％，和/或(2)两种流动相的比例可作适当调整以获得更佳的分离效果；此(1)和(2)在其它情况下亦是适用的)的混合液。在一个实施方案中，所述第二洗脱时间段使用的梯度洗脱液是包含约12％流动相A和约88％流动相B的混合液经线性梯度变化到包含约45％流动相A和约55％流动相B的混合液。在一个实施方案中，所述第一洗脱时间段为30～60min，优选35～55min，优选40～50min，优选约45min。在一个实施方案中，所述第二洗脱时间段为30～60min，优选35～55min，优选40～50min，优选约45min。本领域技术人员理解，在优选的情况下，所述第一洗脱时间段洗脱操作完毕后，即刻开始所述第二洗脱时间段。

在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中在步骤(b)中，所述色谱***设定的检测波长为320～380nm，优选330～370nm，优选340～360nm，优选约350nm。

在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中在步骤(b)中，所述色谱柱的柱温控制在15～45℃，优选20～40℃，优选25～35℃，优选约30℃。

在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中在步骤(b)中，所述色谱***的进样体积为5～50μL，优选5～40μL，优选5～30μL，优选10～20μL，优选10μL或10μL。

在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中在步骤(c)中，所述标准品溶液包括仅包含7个标准品之一的溶液，这种包含单一标准品的溶液可以方便地用于定性测定，亦可用于定量测定。在一个实施方案中，其中在步骤(c)中，所述标准品溶液包括仅包含7个标准品之一的溶液，并且包含某一个标准品的溶液可以具有不同的溶质浓度，即对于某一标准品的溶液可以配制有多个，它们之间的浓度分布在一定范围内，例如各溶质浓度独立地分布在0.0001mg/mL到1mg/mL的范围内，优选分布在0.001mg/mL到0.1mg/mL的范围内。

在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中在步骤(c)中，所述标准品溶液包含全部7个标准品，这种包含全部7个标准品的溶液可以方便地用于定量测定。在一个实施方案中，其中在步骤(c)中，所述标准品溶液包含全部7个标准品，并且该标准品溶液可以具有不同的溶质浓度，即该标准品溶液可以配制有多个，各标准品溶液之间以及每一标准品中的具体溶质的浓度分布在一定范围内，例如各溶质浓度独立地分布在0.0001mg/mL到1mg/mL的范围内，优选分布在0.001mg/mL到0.1mg/mL的范围内。

在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，在步骤(c)中，对于不论是包含全部7个标准品的标准品溶液，还是包含单个标准品的标准品溶液，其中牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖苷、木犀草素、和苜蓿素的浓度各自独立地分布在0.0001mg/mL到0.2mg/mL的范围内，优选分布在0.001mg/mL到0.02mg/mL的范围内。在一个实施方案中，在步骤(c)中，对于不论是包含全部7个标准品的标准品溶液，还是包含单个标准品的标准品溶液，其中荭草苷和异牡荆苷的浓度各自独立地分布在0.0005mg/mL到0.4mg/mL的范围内，优选分布在0.005mg/mL到0.04mg/mL的范围内。在一个实施方案中，在步骤(c)中，对于不论是包含全部7个标准品的标准品溶液，还是包含单个标准品的标准品溶液，其中异荭草苷的浓度分布在0.002mg/mL到1mg/mL的范围内，优选分布在0.02mg/mL到0.1mg/mL的范围内。

在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，在步骤(d)中，所述注入液相色谱***的所述酸解溶液可任选地用流动相稀释。该稀释优选地可以使该酸解溶液中的黄酮类化合物的浓度与步骤(c)的标准品溶液中的黄酮类化合物的浓度基本上相当的范围。在一个实施方案中，该稀释优选地可以使该酸解溶液中的各黄酮类化合物的浓度独立地分布在0.0001mg/mL到1mg/mL的范围内，优选分布在0.001mg/mL到0.1mg/mL的范围内。在一个实施方案中，该流动相可以为包含10～15％流动相A和加至100％流动相B的混合液，优选可以为包含约12％流动相A和约88％流动相B的混合液。

在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，在步骤(c)和/或步骤(d)中，所述色谱分离是根据步骤(b)所述洗脱程序进行洗脱的。

在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，在步骤(e)中，所述定性表征是根据标准品色谱图中色谱峰显示的保留时间，确定酸水解溶液的色谱中各色谱峰的归属。由此可以确定所述竹叶提取物或其制品中包含的黄酮类化合物的种类。本领域技术人员理解，在上述通过色谱峰显示的保留时间确定色谱峰归属时，标准品的保留时间与样品相应物质的保留时间之间，以及同一样品不同进样批次的保留时间之间，可以容许有本领域技术人员可理解和接受的误差，例如与对照品的保留时间相比，样品相应物质的保留时间可以有例如±0.5min、±0.25min、±0.1min、或±0.05min的偏差。

在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，在步骤(f)中，所述定量表征是根据标准品色谱图中色谱峰显示的保留时间和响应强度(例如峰高、峰面积，优选峰面积)，确定酸水解溶液的色谱中各色谱峰的归属以及其在色谱进样溶液中的浓度，进一步确定所述竹叶提取物或其制品中包含的黄酮类化合物的种类及其各自的含量，进一步确定所述竹叶提取物或其制品中包含的总黄酮含量。

在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，在步骤(f)中，所述定量表征酸水解溶液中各色谱峰所归属的黄酮在色谱进样溶液中的浓度，其是根据步骤(c)所得各标准品的色谱响应值以及步骤(d)所得酸水解溶液的色谱响应值，通过外标法或标准曲线法换算获得的。

在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，在步骤(f)中，所述定量表征竹叶提取物或其制品中所含黄酮类化合物[例如，各黄酮化合物可分别表示为：异荭草苷(X₁)、荭草苷(X₂)、牡荆苷(X₃)、异牡荆苷(X₄)、木犀草素-6-C-***糖苷(X₅)、木犀草素(X₆)、苜蓿素(X₇)]的各自含量，该各自含量是通过以下式(1)计算确定的：

$\mathrm{Xi}(\%)=\frac{\mathrm{Ci}\×V}{m}\×100\%...\left(1\right)$

式中：

Xi——样品中各个标准品黄酮单一组分的质量百分含量(％)；

Ci——根据标准曲线得出的样品中各个标准品黄酮(异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖苷、木犀草素、苜蓿素)的浓度(mg/mL)；

V——样品溶液定容体积(mL)；

m——样品质量数(mg)。

在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，在步骤(f)中，所述定量表征竹叶提取物或其制品中包含的总黄酮含量[例如，下列各黄酮化合物含量之和：异荭草苷(X₁)、荭草苷(X₂)、牡荆苷(X₃)、异牡荆苷(X₄)、木犀草素-6-C-***糖苷(X₅)、木犀草素(X₆)、苜蓿素(X₇)，即黄酮碳苷(异荭草苷(X₁)、荭草苷(X₂)、牡荆苷(X₃)、异牡荆苷(X₄)、木犀草素-6-C-***糖苷(X₅))和氧苷(木犀草素(X₆)、苜蓿素(X₇))]，该总黄酮含量是通过以下式(2)计算确定的：

X＝X₁+X₂+X₃+X₄+X₅+(X₆+X₇)×1.53………(2)

式中：

X——样品中总黄酮苷质量百分含量(％)；

X₁——样品中异荭草苷质量百分含量(％)；

X₂——样品中荭草苷质量百分含量(％)；

X₃——样品中牡荆苷质量百分含量(％)；

X₄——样品中异牡荆苷质量百分含量(％)；

X₅——样品中木犀草素-6-C-***糖苷质量百分含量(％)；

X₆——样品中木犀草素质量百分含量(％)；

X₇——样品中苜蓿素质量百分含量(％)；

1.53——苷元分子质量与糖苷分子质量的换算因子。

本发明第二方面提供了一种信息说明资料，其中记载了本发明第一方面任一项所述的方法。

在一个实施方案中，该信息说明资料是呈选自下列的形式：纸质文件(包括但不限于文件单页、小册子、刊物)、磁介质、光盘、软盘、电子出版物、网络出版物等，以及它们的组合。

本发明第一方面所述方法的各个实施方案可以与一个或多个其它实施方案进行任意组合，只要这种组合不会出现矛盾。当然在相互之间组合时，必要的话可对相应特征作适当修饰。对于本发明的其它方面的各个实施方案亦可以类似地进行任意组合。

下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

如本文使用的，术语“竹叶提取物(bamboo leaves extract)”，是指以竹叶为原料，用一定的提取、初步分离方法而得到竹叶的粗提物或进一步精制的精提物的统称，其中包含竹叶黄酮类化合物，例如本发明所述的异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖苷、木犀草素、苜蓿素等。

如本文使用的，术语“竹叶提取物制品(product from bamboo leavesextract)”，是指以竹叶为原料，用一定的提取、精细分离纯化方法而得到的以竹叶黄酮为主要功能性成分的初级加工品；或者是指本文所述竹叶提取物为功能性成分，任选加入其它辅助性成分(例如动物或人体的生理学可接受的赋形剂)而得到的加工品，例如保健食品、饲料添加剂、饮料品等。

如本文使用的，术语“酸解”，亦可称为“酸水解”。

如本文使用的，术语“色谱响应值”，包括但不限于，峰高、峰面积等。

如本文使用的，术语“总黄酮”、“总黄酮苷”、“黄酮类化合物”等，表示异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖苷、木犀草素、苜蓿素、2，3，4-三甲氧基肉桂酸、反式2，4，5-三甲氧基肉桂酸等，以及它们各自的苷元、糖苷、碳苷、氧苷等。

在本发明中，术语“％”时，如基础物质是液态并且分散于该基础物质中的物质是固体，则该％是重量/体积表示的百分数。其它情况下使用％亦具有类似含义。

在本发明中，术语“标准品”，亦可称为“标准物质”、“对照品”、“标准对照品”等，其纯度一般达到本领域技术人员可接受的作为“标准品”的纯度。

在本发明中，涉及异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖苷、木犀草素、苜蓿素、2，3，4-三甲氧基肉桂酸、反式2，4，5-三甲氧基肉桂酸，它们可以是通过商业方法购得，或者可以通过例如色谱方法制备并经结构确证而获得，或者通过文献描述的方法来制备。

尽管人们知晓，高效液相色谱法是一种比较常用的定性、定量分析方法。但是，要使用同一种液相色谱条件同时对成分复杂的植物提取物进行多组分分析，例如本发明同时对5种以上特别是7种黄酮类化合物的多组分定性、定量分析，其难度是极大的。然而，本发明人突人意料地发现，通过酸解处理提取物，然后通过独特的高效液相色谱条件，可以同时对5种以上特别是7种黄酮类化合物的多组分定性、定量分析。这对于竹叶产品的质量控制和深入开发以及推动我国竹产业的发展极具应用价值。

本发明结合样品前处理方法和高效液相色谱测定色谱方法，以我国主要竹叶提取物生产企业的产品(分别来自“安吉圣氏生物制品有限公司”、“金华贝康生物科技开发有限公司”、“杭州天草科技有限公司”，下文将这三种产品分别以“安吉圣氏”、“金华贝康”、和“杭州天草”标注)为样品，经过反复试验验证，优化出高效液相色谱测定的样品前处理方法和色谱方法，通过综合分析确定了一种可作为竹叶提取物质量控制的标准，该标准的方法简单，在实际生产中切实可行。

附图说明

图1是黄酮标准品的HPLC色谱图，图中1异荭草苷(保留时间：44.034min)；2荭草苷(保留时间：46.231min)；3牡荆苷(保留时间：57.229min)；4异牡荆苷(保留时间：58.83min)；5木犀草素-6-C-***糖苷(保留时间：62.407min)；6木犀草素(保留时间：75.772min)；7苜蓿素(保留时间：82.817min)。

图2是安吉圣氏竹叶提取物产品HPLC测定色谱图。

图3是金华贝康竹叶提取物产品HPLC测定色谱图。

图4是杭州天草竹叶提取物产品HPLC测定色谱图。

图5是安吉圣氏竹叶提取物产品酸解后HPLC测定色谱图。

图6是金华贝康竹叶提取物产品酸解后HPLC测定色谱图。

图7是杭州天草竹叶提取物产品酸解后HPLC测定色谱图。

图8是酸解时间对苜蓿素和木犀草素含量的影响。

具体实施方式

下面通过具体的实施例/实验例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例和实验例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。在下文中，提及样品或者是竹叶提取物样品时，分别是指来自“安吉圣氏”、“金华贝康”、和“杭州天草”的竹叶提取物。

一、根据本发明方法选择的一种优选色谱条件实例

1、方法适用：

本色谱条件记载的方法适用于竹叶提取物及其制品中1)异荭草苷、2)荭草苷、3)牡荆苷、4)异牡荆苷、5)木犀草素-6-C-***糖苷、6)木犀草素、7)苜蓿素的定性测定以及各自含量和总黄酮含量的测定。

本方法的检出限：固体样品中异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖苷、木犀草素、苜蓿素组分的检出限均可达到为5mg/kg。

2、原理：

用待测组分的标准品作对照物质，以对照物质和样品中待测组分在相同的色谱条件下的响应信号相比较进行定量，并可根据保留时间进行定性。

3、标准品：

异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖苷、木犀草素、苜蓿素，它们的纯度均≥99％。

4、色谱条件

使用YMC-Pack ODS-AQ不锈钢色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)；以乙腈作为流动相A，0.5％(V/V)的磷酸水溶液作为流动相B。

洗脱程序为：以12％流动相A/88％流动相B的混合液为流动相平衡色谱柱；将样品或标准品注入液相色谱仪后，以12％流动相A/88％流动相B的混合液作为洗脱溶液等度洗脱45min；然后使洗脱溶液从上述混合液开始，在45分钟时间内线性梯度变化到45％流动相A/55％流动相B的混合液进行洗脱。

柱温：30℃。

进样量：10μL。

检测波长：350nm。

5、标准曲线的绘制：

(1)称取异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖苷、木犀草素、苜蓿素各10.0mg，分别置于7个25mL容量瓶中，先加入20mL的甲醇，在60℃水浴锅加热，待充分溶解冷却后用甲醇定容，得到浓度为0.4mg/mL的母液，备用。

(2)取5个10mL容量瓶，编号为1、2、3、4、5，在1号容量瓶中加入牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖苷、木犀草素、苜蓿素母液各0.500mL，荭草苷、异牡荆苷母液各1.000mL，异荭草苷母液2.500mL；在2号容量瓶中加入牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖苷、木犀草素、苜蓿素母液各0.250mL，荭草苷、异牡荆苷母液各0.750mL，异荭草苷母液2.000mL；在3号容量瓶中加入牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖苷、木犀草素、苜蓿素母液各0.125mL，荭草苷、异牡荆苷母液各0.500mL，异荭草苷母液1.500mL；在4号容量瓶中加入牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖苷、木犀草素、苜蓿素母液各0.050mL，荭草苷、异牡荆苷母液各0.250mL，异荭草苷母液1.000mL；在5号容量瓶中加入牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖苷、木犀草素、苜蓿素母液各0.025mL，荭草苷、异牡荆苷母液各0.125mL，异荭草苷母液0.500mL，得到混标浓度梯度溶液，牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖苷、木犀草素、苜蓿素浓度梯度为0.001、0.002、0.005、0.01、0.02mg/mL，荭草苷、异牡荆苷浓度梯度为0.005、0.01、0.02、0.03、0.04mg/mL，异荭草苷浓度梯度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/mL，待测。

(3)分别将(1)配好的母液，按第4项所载色谱条件进行测定，得到各个标准品的保留时间，根据保留时间对混标溶液和样品溶液中的异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖苷、木犀草素、苜蓿素组分进行确认，色谱图参见图1。

(4)将(2)配好的标准品梯度溶液，按第4项所载色谱条件进行测定，得到标准品溶液的色谱图，以峰面积对应浓度作图，分别得到异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖苷、木犀草素、苜蓿素的标准曲线。

6、样品测定

(1)样品配制

称取干燥的样品50.0mg，置于50mL平底烧瓶中，先加入20mL甲醇，再加入25％盐酸5mL，装好冷凝回流玻璃装置，在沸水浴中加热酸解2小时，迅速冷却后，倒入50mL容量瓶中，用甲醇定容，待测。

(2)样品测定

取(1)制备的样品溶液1mL过0.45微孔滤膜后，按上文“4、色谱条件”进行测定，根据保留时间和峰面积，由标准曲线计算出样品溶液中异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖苷、木犀草素、苜蓿素的浓度。

7、结果计算

(1)样品中各个标准品黄酮[异荭草苷(X₁)、荭草苷(X₂)、牡荆苷(X₃)、异牡荆苷(X₄)、木犀草素-6-C-***糖苷(X₅)、木犀草素(X₆)、苜蓿素(X₇)]的含量，分别按以下式(1)计算：

$\mathrm{Xi}(\%)=\frac{\mathrm{Ci}\×V}{m}\×100\%...\left(1\right)$

式中：

Xi——样品中各个标准品黄酮单一组分的质量百分含量(％)；

Ci——根据标准曲线得出的样品中各个标准品黄酮(异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖苷、木犀草素、苜蓿素)的浓度(mg/mL)；

V——样品溶液定容体积(mL)；

m——样品质量数(mg)。

(2)样品中黄酮碳苷和氧苷含量(即总黄酮含量)，按以下式(2)计算：

X＝X₁+X₂+X₃+X₄+X₅+(X₆+X₇)×1.53……………(2)

式中：

X——样品中总黄酮苷质量百分含量(％)；

X₁——样品中异荭草苷质量百分含量(％)；

X₂——样品中荭草苷质量百分含量(％)；

X₃——样品中牡荆苷质量百分含量(％)；

X₄——样品中异牡荆苷质量百分含量(％)；

X₅——样品中木犀草素-6-C-***糖苷质量百分含量(％)；

X₆——样品中木犀草素质量百分含量(％)；

X₇——样品中苜蓿素质量百分含量(％)；

1.53——苷元分子质量与糖苷分子质量的换算因子。

另外，经计算，本发明上述色谱条件下可以使下列标准品相互之间的分离度均达到1.5以上，完全可以满足分离度要求。

二、标准品的确定

1、未酸解产品直接进行高效液相色谱测定

本发明人从市场上购买了分别来自安吉圣氏、金华贝康、杭州天草的竹叶提取物产品，用上文“一、根据本发明方法选择的一种优选色谱条件实例”中所记载的方法，对三个企业产品样品直接进行了测定，色谱图分别如图2、图3和图4。

通过比较分析三家企业产品HPLC测定的色谱图发现，在350nm紫外检测波长条件下，其主要色谱峰为黄酮类物质。因此，本发明人对安吉圣氏的竹叶提取物产品进行了分离纯化和结构鉴定，得到了5个黄酮碳苷，并根据保留时间进一步确认，即保留时间约为43.847min是异荭草苷，保留时间约为46.346min是荭草苷，保留时间约为57.361min是牡荆苷，保留时间约为58.919min是异牡荆苷，保留时间约为62.506min是木犀草素-6-C-***糖苷。

2、对竹叶提取物产品酸解后进行高效液相色谱测定

本发明人对三家企业产品分别通过本发明一般性记载的酸解条件进行了酸解处理，酸解后按上文“一、根据本发明方法选择的一种优选色谱条件实例”中所记载的方法和色谱条件进行了测定，色谱图分别见图5、图6、图7。

通过比较分析三家企业产品酸解后HPLC测定的色谱图发现，在350nm紫外检测波长条件下，其主要黄酮碳苷没有变化，多出了四个响应值较高的色谱峰。因此，本发明人对安吉圣氏的竹叶提取物产品进行了酸解，对酸解后的样品分离纯化和结构鉴定，得到了2个黄酮苷元(即木犀草素和苜蓿素)，2个肉桂酸类物质(即2，3，4-三甲氧基肉桂酸和反式2，4，5-三甲氧基肉桂酸)，并根据保留时间进一步确认，即保留时间约为76.080min是木犀草素，保留时间约为83.162min是苜蓿素，保留时间约为77.599min是2，3，4-三甲氧基肉桂酸，保留时间约为78.178min是反式2，4，5-三甲氧基肉桂酸。

因此，对竹叶提取物及其制品中黄酮含量进行定量，确定选择的标准品为异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖苷、木犀草素、苜蓿素。

三、酸解时间的确定

采取本发明一般性记载的酸解条件进行了酸解处理，回流条件是比较容易控制的，因此在本试验中采用回流处理。

称取干燥的样品50.0mg，置于50mL平底烧瓶中，先加入20mL甲醇，再加入25％盐酸5mL，装好冷凝回流玻璃装置，在沸水浴中分别加热酸解20min，迅速冷却后，倒入50mL容量瓶中，用甲醇定容，待测。重复上述步骤八次，酸解时间分别为30、50、60、90、120、150、180、240min。

对酸解后样品测定结果显示，样品中黄酮碳苷异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖苷含量没有随酸解时间而变化，而苷元木犀草素、苜蓿素含量随酸解时间变化明显(见图8)。从图8可以看出：样品酸解20min，木犀草素和苜蓿素含量均为最低，随着酸解时间的增加，木犀草素和苜蓿素含量逐渐增加，样品酸解120min，木犀草素和苜蓿素含量达到最高值，酸解时间超过120min后，随酸解时间的增加，木犀草素和苜蓿素含量略有下降且渐趋稳定。因此，样品酸解120min为最佳酸解时间。

四、酸解对黄酮碳苷含量的影响

在酸解的过程中，研究了酸解两小时对黄酮碳苷含量的影响，结果显示：酸解对异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖以及黄酮碳苷总量没有影响(见表1)。

表1、酸解对安吉圣氏样品黄酮碳苷含量的影响

五、黄酮苷元换算为氧苷换算系数的确定

20世纪90年代，瑞士A.Hasler、O.Sticher提出HPLC测定银杏黄酮含量的方法取代了国内曾流行的比色法，此法已被许多国家采用。据Hasler报道，银杏黄酮主要成分以黄酮苷氧苷存在，经酸水解后主要生成槲皮素、异鼠李素和山奈素三种黄酮苷元。用HPLC分离测定其含量，再用计算方式转换成总黄酮的含量。

银杏叶中黄酮的含量是指黄酮苷的含量，主要是指槲皮素、山奈素、异鼠李素的单、双和三糖苷的含量。由于银杏叶中黄酮苷的成分十分复杂，标准品也不易找到，故一般不直接测定苷的含量。在测定中向提取液中加入盐酸溶液回流是为了把黄酮苷水解出苷元，其主要是槲皮素、山奈素、异鼠李素，分析方法直接测定这三种苷元的含量。为求得黄酮苷的含量，需要把苷元的含量还原成黄酮苷的含量。

根据资料显示，银杏叶含有槲皮素，山奈素，异鼠李素的黄酮苷类化合物主要有以下一些，山奈素-3-鼠李葡萄糖苷，山奈素-3-(6-对香豆酰葡萄糖基-β-1，4-鼠李糖苷)，山奈素-3-O-(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基)-α-L-吡喃鼠李糖苷，山奈素-3-O-[2-O-6-O-[对-(7-O-β-D-吡喃葡萄糖基)香豆酰基]-β-D-吡喃葡萄糖基]-α-L-吡喃鼠李糖苷，山奈素-3-O-(2-O-α-L-吡喃鼠李糖基-6-O-α-D-吡喃葡萄糖苷)，槲皮素-3-O-(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基)-α-L-吡喃鼠李糖苷，槲皮素-3-O-[2-O-6-O-[对(-7-O-β-D-吡喃葡萄糖基)香豆酰基]β-D-吡喃葡萄糖基]-α-L-吡喃鼠李糖苷，槲皮素-3-O-[2-O-(6-O-对香豆酰基)β-D-吡喃葡萄糖基]-α-L-吡喃鼠李糖基-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，槲皮素-3-O-(2-O-α-L-吡喃鼠李糖基-6-O-α-D-吡喃鼠李糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷)，槲皮素-3-O-α-6-对香豆酰葡萄糖基-β-1，4-鼠李糖苷，槲皮素-3-O-芸香糖苷，异鼠李素-3-O-芸香糖苷。由于各种黄酮苷葡萄糖苷基的个数不同，且苷基的形式也不尽相同，所以组成非常复杂，直接通过分子量换算得到确切的换算系数几乎是不可能的。通过对大量前人分析结果的统计处理得到，槲皮素换算成槲皮素苷的系数为2.51、山奈素换算成山奈素苷的系数为2.64、异鼠李素换算成异鼠李素苷的系数为2.39。如以槲皮素为标准品，则黄酮苷的含量换算可统一采用2.51这一换算系数。在中国药典、美国药典、欧洲药典中的银杏苷的换算公式(见式(3))如下：

总黄酮苷含量＝(槲皮素含量+山奈素含量+异鼠李素含量)×2.51

                                                    ………(3)

目前，竹叶中发现的木犀草素氧苷有：木犀草素-5-O-葡萄糖苷，木犀草素-7-O-葡萄糖苷；苜蓿素氧苷有：苜蓿素-7-O-葡萄糖苷，苜蓿素-7-O-葡萄糖基-1，2-芹糖苷，由于这四种氧苷有三种是单糖苷，只有一个双糖苷，而且其在样品中的含量也不能确定，所以均以单糖苷的分子量进行换算，换算结果为样品中最低氧苷含量，所以竹叶中木犀草素和苜蓿素换算为氧苷的换算系数如下(见表2)。

表2、木犀草素和苜蓿素换算为氧苷的换算系数

因此，竹叶中木犀草素和苜蓿素换算为氧苷的换算公式(见式(4))如下：

黄酮氧苷含量＝(木犀草素含量+苜蓿素含量)×1.53………(4)

六、本发明的HPLC法与分光光度法的比较

分光光度法是利用黄酮类化合物结构上的酚羟基及其还原性羰基能够与金属盐试剂形成有色络合物原理进行测定，样品未经分离纯化，受花色素，酚酸及其它酚性成分的干扰，误差较大，结果高于实际含量。为了比较说明本发明HPLC法和分光光度法测定黄酮含量结果差异，用本发明HPLC法和分光光度法分别对异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖苷、木犀草素、苜蓿素、2，3，4-三甲氧基肉桂酸标准品溶液黄酮含量进行定量(见表3)。从表3可以看出，两种方法的测定结果差异很大，在黄酮类物质标准品中，黄酮含量测定结果偏高的有异荭草苷、荭草苷、木犀草素-6-C-***糖苷、木犀草素，测定结果分别为115.83％、129.26％、146.06％、203.80％，黄酮含量测定结果偏低的有牡荆苷、异牡荆苷、苜蓿素标准品溶液，测定结果分别为17.20％、4.87％、26.68％，即便是不属于黄酮类物质的2，3，4-三甲氧基肉桂酸溶液，测定结果显示，其黄酮含量为70.19％。结果说明用分光光度法对样品中黄酮类物质进行定量，不仅受其它物质的干扰，还与样品中含有黄酮类物质种类有关，不同黄酮类物质，分光光度法测定结果差异也很大。

表3、不同标准品分光光度法测定黄酮含量结果比较

用本发明HPLC法和分光光度法分别测定了安吉圣氏(样品一)、金华贝康(样品二)、杭州天草(样品三)的竹叶提取物产品，测定结果见表4。从表4可以看出，用本发明HPLC法测定的三个样品的总黄酮含量分别为12.36％，10.30％，9.68％，用分光光度法测定的三个样品的总黄酮含量分别为42.56％，37.97％，75.95％，各黄酮单体对分光光度法测定结果贡献值分别为11.12％，9.94％，9.32％，差值分别为31.44％，28.03％，66.63％。黄酮类物质的结构特点决定了该类物质在350nm检测时均有很强的吸收峰，因此，在本发明HPLC法的条件下，对样品中绝大部分黄酮类物质进行了定量，在三个样品分光光度法测定结果中，黄酮类化合物的贡献值中是一小部分，而大部分其它类物质的贡献值。

表4、HPLC法和分光光度法对不同样品中黄酮单体和总黄酮含量测定结果

^*各黄酮单体对分光光度法测定结果贡献值：根据表3不同标准品分光光度法测定黄酮含量结果换算求得。

此外，对上述三个样品，在同一实验室的不同实验人员之间，以及在不同的实验室之间，采用本发明方法，测定各个黄酮化合物和总黄酮的含量。结果表明实验室内偏差和实验室间偏差均能满足要求，小于0.1％。

七、根据本发明方法选择的另一种优选色谱条件实例

1、范围

本实例方法中规定了竹叶提取物及其制品中异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖苷、木犀草素、苜蓿素含量的高效液相色谱测定方法。

本实例方法适用于竹叶提取物及其制品中异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖苷、木犀草素、苜蓿素含量的测定。

本实例方法的检出限：固体样品中异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖苷、木犀草素、苜蓿素组分的检出限均为5mg/kg。

2、规范性引用文件

GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T 6682-2008，ISO3696：1987，MOD)

3术语和定义(略)

4原理

用待测组分的标准品作对照物质，以对照物质和样品中待测组分在相同的色谱条件下的响应信号相比较进行定量。

5试剂和材料

本实例方法使用符合GB/T 6682规定的一级水。

5.1乙腈：色谱纯。

5.2甲醇：分析纯。

5.3磷酸：分析纯。

5.4盐酸：分析纯。

5.5标准品：异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖苷、木犀草素、苜蓿素，纯度均≥99％。

6仪器设备

6.1高效液相色谱仪：配有二极管阵列检测器或紫外检测器。

6.2分析天平：精确度0.0001g。

6.3超声波震荡器。

6.4水浴锅。

6.5平底烧瓶：100mL，并配有冷凝回流玻璃装置。

6.6容量瓶：50mL、25mL、10mL。

6.7微孔滤膜：孔径为0.45μm。

7分析步骤

7.1色谱条件

7.1.1色谱柱

YMC-Pack ODS-AQ不锈钢色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)，或其它分离效果相当的色谱柱。

7.1.2流动相

流动相A：乙腈；流动相B：0.5％(V/V)的磷酸水溶液。

7.1.3梯度洗脱条件

见表5。

表5、梯度洗脱条件

时间/min	0	45	90
				流速/mL/min	1	1	1
流动相A/％	12	12	45
				流动相B/％	88	88	55

7.1.4柱温：30℃。

7.1.5进样量：10μL。

7.1.6检测波长：350nm。

7.2标准曲线的绘制

7.2.1称取异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖苷、木犀草素、苜蓿素各10.0mg，分别置于7个25mL容量瓶中，先加入20mL的甲醇，在60℃水浴锅加热，待充分溶解冷却后用甲醇定容，得到浓度为0.4mg/mL的母液，备用。

7.2.2取5个10mL容量瓶，编号为1、2、3、4、5，在1号容量瓶中加入牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖苷、木犀草素、苜蓿素母液各0.500mL，荭草苷、异牡荆苷母液各1.000mL，异荭草苷母液2.500mL；在2号容量瓶中加入牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖苷、木犀草素、苜蓿素母液各0.250mL，荭草苷、异牡荆苷母液各0.750mL，异荭草苷母液2.000mL；在3号容量瓶中加入牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖苷、木犀草素、苜蓿素母液各0.125mL，荭草苷、异牡荆苷母液各0.500mL，异荭草苷母液1.500mL；在4号容量瓶中加入牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖苷、木犀草素、苜蓿素母液各0.050mL，荭草苷、异牡荆苷母液各0.250mL，异荭草苷母液1.000mL；在5号容量瓶中加入牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖苷、木犀草素、苜蓿素母液各0.025mL，荭草苷、异牡荆苷母液各0.125mL，异荭草苷母液0.500mL，得到混标浓度梯度溶液，牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖苷、木犀草素、苜蓿素浓度梯度为0.001、0.002、0.005、0.01、0.02mg/mL，荭草苷、异牡荆苷浓度梯度为0.005、0.01、0.02、0.03、0.04mg/mL，异荭草苷浓度梯度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/mL，待测。

7.2.3分别将7.2.1配好的母液，按色谱条件7.1进行测定，得到各个标准品的保留时间，根据保留时间对混标溶液和样品溶液中的异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖苷、木犀草素、苜蓿素组分进行确认，色谱图参见附录A。

7.2.4把7.2.2配好的标准品梯度溶液，按色谱条件7.1进行测定，得到标准品溶液的色谱图，以峰面积对应浓度作图，分别得到异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖苷、木犀草素、苜蓿素的标准曲线。

7.3样品测定

7.3.1样品配制

称取干燥的样品50.0mg，置于50mL平底烧瓶中，先加入20mL甲醇，再加入25％盐酸5mL，装好冷凝回流玻璃装置，在沸水浴中加热酸解2小时，迅速冷却后，倒入50mL容量瓶中，用甲醇定容，待测。

7.3.2样品测定

取7.3.1制备的样品溶液1mL过0.45微孔滤膜后，按色谱条件7.1进行测定，根据保留时间和峰面积，由标准曲线计算出样品溶液中异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖苷、木犀草素、苜蓿素的浓度。

8结果计算

参见上文“一、根据本发明方法选择的一种优选色谱条件实例”中的“7、结果计算”进行。

9精密度

计算结果精确到0.01％。

在重复性条件下，两次独立测定结果之差不得超过算术平均值的10％。

虽然本发明结合实验例进行了详细的说明，然而，本领域技术人员理解，本发明的精神和范围不应限于这些实施例，还应包括本发明权利要求所限定的范围及其等同方案。

Claims (12)

1.测定竹叶提取物或其制品中黄酮化合物种类和/或含量的方法，其包括以下步骤：

(a)使竹叶提取物或其制品在盐酸甲醇溶液中加热，进行酸解处理，过滤，得酸解溶液；

(b)提供反相高效液相色谱***，其包括色谱柱、流动相、包括等度和梯度的洗脱程序、以及装配有二极管阵列检测器或紫外检测器的色谱仪；

(c)分别将不同的标准品溶液注入液相色谱***，进行色谱分离，所述各标准品溶液独立地包含一种或多种选自下列7个的标准品：异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖苷、木犀草素、苜蓿素；

(d)将步骤(a)所得酸解溶液注入液相色谱***，进行色谱分离；

(e)根据步骤(c)所得各标准品的色谱响应值以及步骤(d)所得酸水解溶液的色谱响应值，对所述竹叶提取物或其制品中的黄酮类化合物进行定性表征；和任选地，

(f)根据步骤(c)所得各标准品的色谱响应值以及步骤(d)所得酸水解溶液的色谱响应值，对所述竹叶提取物或其制品中的黄酮类化合物进行定量表征，

其中：

在步骤(a)中，所述盐酸甲醇溶液是甲醇与25％盐酸二者以体积比4∶1的混合物，所述加热是在沸水浴中回流，所述酸解处理的时间为2小时，所述竹叶提取物或其制品与盐酸甲醇溶液的比为50mg∶25ml；

在步骤(b)中，所述流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A是乙腈，所述流动相B是0.5％(V/V)磷酸水溶液；所述洗脱程序是以0.5～2ml/min的流速，在第一洗脱时间段内以包含12％流动相A和88％流动相B的混合液作为洗脱液等度洗脱45min，然后在45min的第二洗脱时间段内从上述混合液经线性梯度变化到包含45％流动相A和55％流动相B的混合液进行梯度洗脱。

2.根据权利要求1的方法，在步骤(b)中，所述色谱柱是5μm粒度填料的ODS柱。

3.根据权利要求1的方法，在步骤(b)中，所述色谱柱是5μm粒度填料的YMC-Pack ODS AQ型色谱柱。

4.根据权利要求1的方法，在步骤(b)中，所述色谱柱是ODS柱，并且其在色谱条件下可以使下列标准品相互之间的分离度达到1.0以上：异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖苷、木犀草素、苜蓿素。

5.根据权利要求1的方法，在步骤(b)中，所述色谱***设定的检测波长为320～380nm，所述色谱柱的柱温控制在15～45℃，所述色谱***的进样体积为5～50μL。

6.根据权利要求1的方法，在步骤(c)中，所述标准品溶液包括仅包含7个标准品之一的溶液，并且包含某一个标准品的溶液，其溶质浓度独立地分布在0.0001mg/mL到1mg/mL的范围内。

7.根据权利要求1的方法，在步骤(c)中，所述标准品溶液包含全部7个标准品，并且其中各溶质浓度独立地分布在0.0001mg/mL到1mg/mL的范围内。

8.根据权利要求1的方法，在步骤(e)中，所述定性表征是根据标准品色谱图中色谱峰显示的保留时间，确定酸水解溶液的色谱中各色谱峰的归属。

9.根据权利要求1的方法，在步骤(f)中，所述定量表征是根据标准品色谱图中色谱峰显示的保留时间和响应强度，确定酸水解溶液的色谱中各色谱峰的归属以及其在色谱进样溶液中的浓度，进一步确定所述竹叶提取物或其制品中包含的黄酮类化合物的种类及其各自的含量，进一步确定所述竹叶提取物或其制品中包含的总黄酮含量。

10.根据权利要求9的方法，在步骤(f)中，所述定量表征酸水解溶液中各色谱峰所归属的黄酮在色谱进样溶液中的浓度，其是根据步骤(c)所得各标准品的色谱响应值以及步骤(d)所得酸水解溶液的色谱响应值，通过外标法或标准曲线法换算获得的。

11.根据权利要求1-10任一项的方法中，在步骤(f)中，所述定量表征竹叶提取物或其制品中所含黄酮类化合物的各自含量，该各自含量是通过以下式(1)计算确定的：

$\mathrm{Xi}(\%)=\frac{\mathrm{Ci}\×V}{m}\×100\%...............\left(1\right)$

式中：

Xi——样品中各个标准品黄酮单一组分的质量百分含量(％)；

Ci——根据标准曲线得出的样品中各个标准品黄酮的浓度(mg/mL)，所述黄酮包括异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素-6-C-***糖苷、木犀草素、苜蓿素；

V——样品溶液定容体积(mL)；

m——样品质量数(mg)。

12.根据权利要求9的方法中，在步骤(f)中，所述定量表征竹叶提取物或其制品中包含的总黄酮含量，该总黄酮含量是通过以下式(2)计算确定的：

X＝X₁+X₂+X₃+X₄+X₅+(X₆+X₇)×1.53.........(2)

式中：

X——样品中总黄酮苷质量百分含量(％)；

X₁——样品中异荭草苷质量百分含量(％)；

X₂——样品中荭草苷质量百分含量(％)；

X₃——样品中牡荆苷质量百分含量(％)；

X₄——样品中异牡荆苷质量百分含量(％)；

X₅——样品中木犀草素-6-C-***糖苷质量百分含量(％)；

X₆——样品中木犀草素质量百分含量(％)；

X₇——样品中苜蓿素质量百分含量(％)；

1.53——苷元分子质量与糖苷分子质量的换算因子。

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