CN102112877B - 传感器 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种用于检测分析物的传感器(1)，该传感器包括：由焦热电或者压电聚合物衬底例如PVDF(3)和位于该衬底的表面上的透明电极层(4)组成的换能器(10)；位于该透明电极层上的帕利灵层(12)；以及固定在该换能器上的试剂(17)，所述试剂具有能够结合分析物或者分析物的衍生物的结合位点。

Description

传感器
技术领域
本发明涉及一种传感器，特别地，涉及一种应用经涂覆的换能器以提供改进的灵敏性和再现性的传感器。
背景技术
溶液中分析物，例如在生物测定例如免疫测定中的生物学上重要的化合物的监控具有广泛适用性。免疫测定是一种测量生物学流体中分析物的存在，或者更通常是分析物的浓度的试验。它典型地包括将抗原特异性结合到抗体上。抗体可以是多克隆的或单克隆的，单克隆抗体具有多种益处，包括制备的再现性以及结合到分析物的一个抗原决定基上的包容性。为了提供分析物浓度的可定量测量，将响应与已知浓度的标准样品进行比较。抗体或者抗原的浓度可通过多种方法确定，尽管最常用的方法之一是对抗原或者抗体进行标记，并且检测标记物的存在。
免疫测定可以是竞争性的或者非竞争性的。在竞争性的免疫测定中，未知样品中的抗原与标记抗原竞争着与抗体结合，抗体典型地被固定在固相上。结合到抗***点的标记抗原的数量然后被测量，通常通过将结合到固相的标记抗原分离并测量。很清楚，响应将与未知样品中抗原的浓度成反比。在类似分析原理中，溶液中的标记抗体与固定在固相上的抗原以及样品中存在的抗原竞争，给出相似的反比性。在非竞争性的免疫测定，也称为免疫测量分析中，在未知样品中的抗原与过量的固定的抗体(“捕获”抗体)结合，并测量结合的抗原的数量。与竞争性方法不同，非竞争性方法的结果将与抗原的浓度成正比。在所谓的“双位点”免疫测量分析，也称“夹心分析”中，抗原结合到捕获抗***点，然后标记抗体被引入，其结合到与捕获抗体结合的抗原上。然后测量在该位点上的标记抗体的数量。
在典型的夹心免疫测定中，对关注的抗原特异性的抗体被连接到聚合物载体，例如聚苯乙烯片材上。将一滴要测试的样品，例如细胞提取物或者血清或者尿的样品，铺置到所述片材上，所述片材在抗体-抗原复合物形成之后被洗涤。然后添加对抗原上不同位点特异性的抗体，并再次洗涤载体。这第二种抗体携带有标记(标记报道剂)，使得其可以被以高灵敏性检测到。结合到片材上的第二种抗体的数量与样品中抗原的数量成比例。这种分析以及这种类型的分析的其它变化是众所周知的，参见例如，″TheImmunoassayHandbook第二版″DavidWild编辑，NaturePublishingGroup，2001。
有很多种的分析和诊断设备可用于实施免疫测定。该设备包括选择性地结合感兴趣的分析物的传感器，然后量化结合事件。很多设备在传感器上应用试剂，该试剂在被检测的分析物存在的情况下经历可检测的变化，例如颜色改变。
WO90/13017公开了一种条带状的焦热电或者其它热电的换能器元件。提供了薄膜电极，并且一种或者多种试剂被沉积在换能器表面上。当试剂与被检测的物质接触的时候，试剂经历选择性的色度变化。该设备然后典型地被***检测器，其中换能器通常被从下部由LED光源照亮，试剂的光吸收作为换能器表面处的微观加热形式被检测。从换能器输出的电信号被处理，得出被检测的物质的浓度。
WO90/13017的***提供了与试剂反应或者组合后能够在试剂中产生颜色变化的物质的分析。例如，试剂包括pH和重金属指示剂染料，扑热息痛分析中用于检测氨基苯酚的试剂(例如在加氨的铜溶液中的邻甲酚)，以及在酶联免疫吸附测定(ELISA)中用于检测氧化还原酶的四唑染料。然而，虽然该***在某些应用中有用，但是它已经被认为只适合在被分析的物质在试剂中产生颜色变化的情况下的分析，因为所述试剂是布置在换能器的表面上的试剂。因此，该***不能应用于在试剂中不引起颜色变化的物质的分析，或者当颜色变化不是在换能器表面上时的分析。
WO2004/090512公开了一种基于WO90/13017中公开的技术的设备，但是依靠如下发现：在采用电磁辐射照射时在试剂中通过非辐射衰减产生的能量可以被换能器检测，甚至当试剂不与换能器接触的时候都可以，采用电磁辐射的照射与由换能器产生电信号之间的时间延迟是试剂与薄膜表面之间距离的函数。这个发现提供了一种设备，其能够“深度剖析”，允许设备区分结合到换能器表面的分析物与在本体液体内的分析物。这种应用因此公开了一种设备，其能够用于分析，典型地用于生物测定，在实施结合事件和检测该事件的结果之间不必须实施单独的洗涤步骤。
WO90/13017和WO2004/090512中公开的设备已经发现很广泛的适用性，进一步的变化公开在WO2006/079795，WO2007/107716，WO2007/129064和WO2007/141581中。
共同的主题是，传感器包括具有焦热电或者压电元件以及能够将能量的变化转换为电信号的电极的换能器。图1示出了这种化学传感器件1的原理。器件1依靠在使用电磁辐射照射物质2时的在物质2中的热量生成。器件1包括焦热电的或者压电的换能器3，其具有电极涂层4，5。换能器3优选是薄膜，例如极化的聚偏二氟乙烯(PVDF)薄膜。电极涂层4，5优选由氧化铟锡(ITO)形成，其厚度为大约35nm，尽管从下限为1nm和上限为100nm起几乎任何厚度都是可能的，低于所述下限电导率太低，高于所述上限光透射太低(它应该不小于95％T)。物质2使用任何合适的技术固定到换能器3上，或者与其最靠近，这里所示出的是连接到上电极涂层4上。试剂可以是任何合适的形式，并且可以沉积多种试剂。优选地，物质2被吸附在上电极上，例如通过分子间力，例如离子键、氢键或者范德华力共价偶联或者结合。
这种设备的关键特征是，当被电磁辐射源6，如光，优选可见光源照射时，物质2产生热量。光源可以是，例如，LED。光源6使用合适波长(例如，互补色)的光照射物质2。尽管不希望受理论束缚，还是相信物质2吸收光，以产生激发状态，所述激发状态然后经历非辐射衰减，因此产生能量，如图1中曲线所示。该能量主要是热的形式(也就是环境中的热运动)，尽管其它形式的能量，例如冲击波，也可能产生。然而，该能量被换能器检测到，并被转换为电信号。
该设备被对于被测量的特定的试剂而校准，因此通过非辐射衰减产生的能量的精确形式不需要确定。除非另有明确说明，这里使用的术语“热”指的是由非辐射衰减所产生的能量。光源6被定位以便照亮物质2。优选地，光源6大体上与换能器3和电极4、5垂直被定位，物质2通过换能器3和电极4、5被照亮。光源可以是位于换能器内的内部光源，其中该光源是导波***。波导可以是换能器自身，或者波导可以是连接到换能器上的附加的层。照射的波长取决于所使用的标记；例如，对于40nm金标记，优选的波长是525nm，而对于碳标记，优选的波长是650nm。
由物质2产生的能量通过换能器3检测，并转换为电信号。电信号被检测器7检测。光源6和检测器7都在控制器8的控制之下。
在一个实施方案中，光源6产生一系列的光脉冲(这里使用的术语“光”是指任何形式的电磁辐射，除非特定的波长被提及)，其被称为“斩切光”。原则上，单一次闪光，即电磁辐射的一个脉冲，会足以从换能器3产生一个信号。然而，为了获得能再现的信号，使用多次闪光，这在实际中需要斩切光。电磁辐射的脉冲应用的频率可以变化。在下限，脉冲之间的时间延迟必须足够用于测定每个脉冲和电信号的产生之间的时间延迟。在上限，每个脉冲之间的时间延迟必须不能太大，以致于用于记录数据的周期变得不合理地延长。优选地，脉冲的频率为2-50Hz，更加优选5-15Hz，最优选为10Hz。这分别对应着脉冲之间的20-500ms，66-200ms，以及100ms的时间延迟。另外，所谓的“传号空号”比，也就是有信号与没信号的比，优选为1，虽然在某些情况下可能使用其它比值更有好处。产生具有不同的斩切频率或者不同的传号空号比的斩切光的电磁辐射源是本领域中已知的。检测器7确定来自于光源6的每个光脉冲与由检测器7检测的来自于换能器3的相应的电信号之间的时间延迟(或者“相关性延迟”)。该时间延迟是距离d的函数。
用于确定光的每个脉冲与相应的电信号之间的时间延迟的提供可再现的结果的任何方法都可用。优选地，时间延迟从光的每个脉冲的起始到相应于检测器7所检测的热吸收的电信号的最大值所在的点测量。
因此物质2可与换能器表面分离，而信号仍然可被检测到。而且，不但信号是穿过居间介质可检测的，该介质能够将能量传输到换能器3，而且不同的距离d可被区分(这已经被称为“深度剖析”)，而且在距换能器3的表面为特定的距离d处，接收到的信号的强度与物质2的浓度是成比例的。
然而，仍需要继续寻求改进的信号强度和再现性。
发明内容
因此，本发明提供了一种用于检测分析物的传感器，包括：
由焦热电或者压电聚合物衬底以及位于衬底的表面上的透明电极层组成的换能器；
透明电极层上的帕利灵(parylene)层；以及
固定在换能器上的试剂，该试剂具有能够结合分析物或者分析物的衍生物的结合位点。
帕利灵层为后续的试剂的附着提供改进的表面。
附图说明
现在将参考附图描述本发明，其中：
图1示出了根据WO2004/090512的设备；
图2和3示出了本发明的传感器的示意图；
图4-6示出了具有帕利灵层(图6)和没有帕利灵层(图4和5)的衬底的XPS光谱；
图7图解示出了在不同的帕利灵C-涂覆的PVDF/ITO片材上不同区域上测量的前进接触角；
图8示出了含有本发明的传感器的样品腔；
图9示出了本发明的传感器；和
图10示出了在PBS缓冲液中使用碳粒子的1ng/mL的TSH的光刺激压电薄膜分析性能(误差线＝1标准偏差，重复次数＝12)。
已经发现参考图1描述的设备中获得的信号的强度和再现性可通过使用帕利灵层涂覆换能器的表面而改进(参考图2)。图2示出了具有换能器10的传感器9。换能器10由焦热电或者压电聚合物衬底以及位于衬底表面上的透明电极层组成，所述衬底为在上文中参考图1所描述的类型。
衬底由焦热电或者压电聚合物形成，例如聚偏二氟乙烯薄膜。聚偏二氟乙烯是公知的焦热电/压电聚合物。衬底的表面涂覆有透明电极层。所述“透明”是指该层至少在分析物和试剂之间的结合事件的检测中使用的电磁辐射的波长下是透明的。该层优选由氧化铟锡(ITO)组成。在优选实施方案中，换能器10是ITO涂覆的聚偏二氟乙烯薄膜。
图2中示出的换能器10是平面换能器，并且换能器10具有被帕利灵层12涂覆的第一表面11。换能器10的另外的表面也可以被涂覆，例如其中两个表面都与样品接触(未示出)。
帕利灵层12进一步被蛋白质层13涂覆。蛋白质被显示为生物素化的疏水性的蛋白质，其是本领域中公知类型的。该蛋白质在图2中图解示出，其中蛋白质骨架14连接到换能器10上，并且生物素结构部分15被露出。换能器10还包括抗生蛋白链菌素层16，其涂覆蛋白质层13。抗生蛋白链菌素层16具有其上结合的试剂17。
固定的试剂17能够结合被检测的分析物，或者该分析物的衍生物。结合事件然后如上文中所述的被检测。试剂17优选是抗体，该抗体被培养用于当样品被引入时选择性地与分析物或者分析物的衍生物结合。
图3示出了与参考图2所述的传感器相似的传感器9，只是帕利灵层12具有直接与其连接的聚抗生蛋白链菌素层16。生物素化的抗体17然后结合到聚抗生蛋白链菌素层16上。
表面还可以被另外的涂层覆盖，以稳定表面，例如得自SurModicsInc，EdenPrairie，MN，美国的Stabilcoat(未示出)。
帕利灵是一个通称，其描述一类从[2，2]对环芳衍生出的聚合物。通常，对二甲苯在涂覆之前未预聚，而是沉积在待通过热解沉积过程涂覆的表面。该过程包括[2，2]对环芳的蒸发，其随后被热解法裂解，形成双基单体，随后该单体沉积到要涂覆的衬底上，形成聚合物。在[2，2]对环芳内的内张力促进了裂解。蒸发条件将取决于所使用的[2，2]对环芳，但是典型地是在约50-200℃以及100-200Nm-2，例如150℃和135Nm-2下进行。热解典型地在400-700℃的温度以及40-100Nm-2，例如680℃以及65Nm-2下进行。沉积可在室温至75℃下以及5-50Nm-2下进行，例如35℃以及15Nm-2。所述过程可通过下面的示意图来概括(使用帕利灵C)：
本发明中使用的帕利灵可从典型地具有下述结构的[2，2]对环芳中得到：
其中，代表芳香族碳环或者杂环，例如亚苯基(优选1，4-亚苯基)，萘，吡啶等，其可被如下取代：卤素；氨基；任选被卤素取代的C1-C10烷基，优选任选被卤素取代的C1-C5烷基；任选被卤素取代的C3-C10环烷基，优选任选被卤素取代的C3-C7环烷基；任选被卤素取代的C2-C10烯基(alkylene)，优选任选被卤素取代的C1-C5烷基；或者任选被卤素取代的C2-C10炔基，优选任选被卤素取代的C2-C10炔基；以及
A1和A2，其可以是相同或者不同的，代表：氢；卤素；氨基；任选被卤素取代的C1-C10烷基，优选任选被卤素取代的C1-C5烷基；任选被卤素取代的C3-C10环烷基，优选任选被卤素取代的C3-C7环烷基；任选被卤素取代的C2-C10烯基，优选任选被卤素取代的C1-C5烷基；或者任选被卤素取代的C2-C10炔基，优选任选被卤素取代的C2-C10炔基。
优选地，根据本发明的帕利灵可从具有如下结构的[2，2]对环芳中得到：
其中A1和A2如上文中所限定的，S1，S2，S3和S4，其可以相同或者不同，代表：氢；卤素；氨基；任选被卤素取代的C1-C10烷基，优选任选被卤素取代的C1-C5烷基；任选被卤素取代的C3-C10环烷基，优选任选被卤素取代的C3-C7环烷基；任选被卤素取代的C2-C10烯基，优选任选被卤素取代的C1-C5烷基；或者任选被卤素取代的C2-C10炔基，优选任选被卤素取代的C2-C10炔基。
更优选，A1，A2，S1，S2，S3和S4，其可以相同或者不同，代表氢或者卤素。卤素优选是氟或者氯。
从中可得到本发明中使用的帕利灵的[2，2]对环芳的特定的实例包括：
从上文中讨论的内容清楚的是，本发明中使用所得的帕利灵聚合物是具有如下的结构的聚合物：
其中A1，A2如上文中所限定。
一旦沉积，帕利灵就不能轻易地从衬底上移除。这，结合帕利灵的低溶解性，使得沉积的帕利灵难以用传统的溶液相技术表征。因此，帕利灵的聚合度典型地通过换能器暴露在帕利灵单体中的时间长度来确定，而这又反过来影响帕利灵层的厚度。本发明的帕利灵层优选具有10nm到100μm的厚度，更优选100nm到10μm，最优选250nm至1μm。如果帕利灵层太厚，则热能就不充分地到达换能器，如果它太薄，则层就容易破碎并且有形成孔的倾向。
优选本发明中使用的帕利灵具有如下的结构：
其中A1，A2，S1，S2，S3和S4如上文中所限定。
特别优选A1，A2，S1，S2，S3和S4，其可以相同或者不同，代表氢或者卤素。
本发明中可用的帕利灵的特定实例包括如下：
帕利灵C是特别优选的。
优选在帕利灵层和被固定的试剂之间结合入蛋白质层。该蛋白质层辅助将试剂束缚到换能器的表面，也就是帕利灵层。蛋白质典型地通过非共价相互作用，主要是疏水相互作用例如范德华力，被吸附在帕利灵层上。蛋白质可以是天然的或者合成的多肽。蛋白质将充分地疏水性的以通过非共价方式结合到帕利灵层上。这可以通过在蛋白质中结合入疏水区域来实现。在蛋白质同时含有疏水和疏水区域的情况下，蛋白质能够形成三级结构，其允许疏水区域结合到帕利灵层上，并且疏水区域背向帕利灵层。在这个位置，疏水区域可用于结合到试剂上。
合适的蛋白质的实例包括α2-巨球蛋白(MW820,000)，牛血清白蛋白/人血清白蛋白(MW大约70,000)，卵蛋白质，α2HS-糖蛋白(MW大约49,000)，β1c/β1a-球蛋白，免疫球蛋白(MW大约150,000)和铁传递蛋白(MW大约90,000)。
当使用人血清白蛋白或者α2HS-糖蛋白的时候，它们优选被使得为疏水性的，并且应当被处理来产生具有较高分子量的聚合物分子。当使用铁传递蛋白的时候，交联作用足够使该物质在本发明中可用。当使用α2-巨球蛋白的时候，只需要使分子是疏水的。在无预处理的情况下合适的蛋白质包括：例如，β-脂蛋白(MW大约为320万)和α2-脂蛋白(MW大约5百万至2千万)。
疏水化可例如通过下列方式发生：利用热，用酸、变性剂和/或离液序列高的离子处理，和/或通过与疏水性化合物的化学偶联。增加分子量可例如通过下述方式发生：利用热，用酸、变性剂和/或离液序列高的离子处理，和/或通过与双官能或者多官能的蛋白质试剂交联。处理进行直到获得分子量为500,000或者更高的蛋白质聚合物。特别优选使用分子量从100,000到20,000,000，更优选500,000到5,000,000的蛋白质聚合物。
当需要交联的时候，在交联过程之前、之间或者之后可实施疏水化。为了通过加热实现疏水化，可使用40-95℃的温度经历1分钟至10小时，例如Biochem.Biophys.Acta1980，624，13-20中记载的那样。作为酸，使用例如乙酸、丙酸、乳酸或者盐酸。通常的浓度是1到100mmol/L，作用周期为10分钟至16小时。合适的离液序列高的离子包括例如硫氰酸盐或酯，碘化物，氟化物，溴化物，高氯酸盐和硫酸盐。合适的变性剂包括，例如盐酸胍和尿素。10mmol/L至6mol/L的浓度是通常使用的。至于疏水性化合物的衍生化，优选使用可溶的脂肪酸，低的和高的分子量形式的脂类，以及合成聚合物，例如聚丙二醇，或者可溶的聚苯乙烯的共聚物。衍生化根据公知方法来进行。通过双官能和多官能的化合物实现的交联使用已知的蛋白质结合试剂来进行。这些是含有至少两个官能团的化合物，所述官能团可以相同或者不同，并且可以通过这些官能团与蛋白质的官能团反应。优选使用的化合物由末端上存在例如琥珀酰亚胺、马来酰亚胺和/或醛基团的烷基链组成。蛋白质以通常的方式采用双官能或者多官能的化合物，通过可溶性蛋白质与所述双官能或者多官能的化合物一起反应而进行交联。对于疏水化和/或交联，优选使用分子量为从10,000到700,000的前体蛋白质，牛血清白蛋白，脂肪酶和免疫γ-球蛋白是特别优选的。更多的细节可参考US5,061,640。
本发明还提供一种制备传感器的方法，包括如下步骤：提供由焦热电或者压电聚合物衬底和该衬底表面上的透明电极层组成的换能器，通过帕利灵单体在该衬底上的气相沉积而采用帕利灵涂覆透明电极层，将接收器连接到该换能器上。优选在将接收器连接到该帕利灵层上的步骤之前，使用蛋白质处理所述帕利灵层。可通过使用石英微量天平来控制所沉积的物质的数量来监测传感器的沉积过程。
与未处理过的表面相比，相信使用帕利灵对衬底表面的处理导致更连续的蛋白质涂层。这又反过来导致更强的信号和测量之间的更好的再现性。这已经通过使用XPS(x-射线光电子能谱)进行研究。在XPS中，衬底的表面使用x-射线照射，引起电子从衬底表面上的原子中发射出来。所发射的电子具有依依赖于原子类型以及所述电子从中发射出来的轨道的类型的特征性能量。该技术因此用于确定薄膜表面的化学性质。
图4示出了通过等离子体蚀刻清洁后的ITO涂覆的PVDF薄膜的XPS光谱，显示出铟、锡和氧的预期的峰。图5示出了随后暴露在大气中几天后的薄膜。除了铟、锡和氧的预期的峰以外，正好低于300eV的特征峰表示有碳原子的存在。相信蛋白质优先附着在衬底的已经变得被含碳物质，例如大气中的VOC污染的区域，尽管对沉积在薄膜表面上的VOC几乎没有控制。图6示出了涂覆有帕利灵C的相同的衬底的XPS光谱。碳和氯的大峰以对于帕利灵C预期的比例被观察到。这些数据还总结在下表中。
表清洁的ITO，污染的ITO和帕利灵C涂覆的ITO压电薄膜的表面元素组成
元素组成 等离子体蚀刻的ITO 污染的ITO 帕利灵C
碳％ 0 39.2 86.1
氧％ 53.5 38.2 1.5
铟％ 43.1 20.5 0.0
锡％ 3.4 2.0 0.0
氯％ 0.0 0.0 11.8
相信帕利灵的连续涂层有利于将蛋白质结合到衬底的表面。因此，优选本
发明的传感器进一步包括位于帕利灵层和试剂之间的蛋白质层。
与例如浸渍涂覆的聚苯乙烯薄膜相比，帕利灵也得到厚度可变化性更低的合适薄的薄膜，这已经通过测量帕利灵薄膜的光干涉图案得到了证明。另外，大约95°的水滴接触角(变化很小)接近疏水蛋白质吸收的最佳条件，这通过在不同的帕利灵C涂覆的PVDF/ITO片材的不同区域上测量的前进接触角而得到证明，如图7中所示。图7中示出了93.9±1.3°的平均水接触角(1标准偏差)。测量是通过根据ISO15989：2004的动态躺滴法来实施的。
在一个优选实施方案中，本发明的传感器9结合入上文参考图1所述的设备中。
图8示出了使用本发明的传感器9的典型的捕获抗体试验。本发明的传感器9进一步包括用于盛装含有溶解或者悬浮在其中的分析物20的液体19的池18。换能器与腔室，也就是所述池整合。传感器9包括在其上连接的试剂，即抗体17。传感器进一步包括电磁辐射源，以及上文参考图1所述的用于检测电信号(未示出)的检测器。
在使用中，池18内充满含有分析物20的液体19(或者任何流体)。分析物20然后结合到抗体17上。额外的标记抗体21被加入到液体中，在结合的抗体17，分析物20和标记抗体21之间形成夹心的复合物。另选地，所述额外的标记抗体21可以与液体预混合，最终结果是一样的。过量的标记抗体21被加入，使得所有的结合的分析物20形成夹心复合物。样品因此含有结合的标记抗体21a和在溶液中游离的未结合的标记抗体21b。
在夹心复合物形成的过程之中或之后，使用一系列的电磁辐射，例如光的脉冲照射样品。在每个脉冲和由换能器3产生电信号之间的时间延迟通过检测器检测。选择合适的时间延迟来测量仅由结合的标记抗体21a产生的热量。因为时间延迟是标记物距换能器3之间的距离的函数，结合的标记抗体21a可与未结合的标记抗体21b区分开来。
标记物可以是任何能够与辐射源产生的电磁辐射相互作用，以通过非辐射衰减产生能量的物质。优选标记物选自，但是不限于，碳粒子，着色的聚合物粒子(例如着色的胶乳)，染料分子，酶，荧光分子，金属(例如金)粒子，血红蛋白分子，磁性粒子，具有非导电的核材料和至少一个金属壳层的纳米粒子，红血球，以及它们的组合。
在磁性粒子的情况下，电磁辐射是无线电频率辐射。在上文中提及的所有其它的标记物都应用光，其可包括IR或者UV辐射。优选标记物是金粒子或者碳粒子。碳粒子的益处是，它们在所有感兴趣的波长下的吸收是基本上均一的，并且比大多数的金属粒子轻得多，使得它们的在分析中的沉降现象最小化。金粒子是商业上可得到的，或可使用已知的方法制备(参见例如G.Frens，Nature1973，241，20-22)。更详细的关于纳米粒子标记物的解释可参考US6,344,272和WO2007/141581。碳粒子是商业上可得到的，例如从Degussa，Essen，德国，并且它们与蛋白质和小分子结合的方法也是本领域已知的，例如由VanDoorn等公开(US5,641,689)。
优选地，本发明使用具有粒子大小为20至1,000nm的粒子，更优选100到500nm。粒子大小指的是粒子在其最宽的点处的直径。
当结合事件已经发生的时候，标记物与换能器最接近。也就是，标记物与换能器的表面足够地接近，使得换能器能够检测到照射样品时由标记物产生的能量。然而，标记物与换能器表面的实际距离将依赖于许多变量，例如标记物的大小和性质，第一和第二抗体以及分析物的大小和性质，样品介质的性质，以及电磁辐射的性质和检测器相应的设置。关于电磁辐射的性质，本发明的传感器可包括适于产生一系列的电磁辐射脉冲的辐射源，检测器适于测定来自于辐射源的电磁辐射的每个脉冲与电信号产生之间的时间延迟，因此如参考图1所论述的那样，能够精确测定标记物相对于换能器的位置。
试剂优选是抗体，但是其它的试剂也是可用的。作为抗体-抗原反应的替代，试剂和分析物可以是第一和第二核酸，其中第一和第二核酸是互补的，或者试剂含有抗生物素蛋白或者其衍生物，分析物含有生物素或者其衍生物，或者反之亦然。***也不限于生物学分析，并可应用于，例如水中重金属的检测。体系也不需要限定为液体，任何流体体系都可用，例如空气中酶、细胞和病毒等的检测。
未知的样品预期含有分析物，但是当然本发明的分析可用于测定分析物的存在与否。分析物优选是小分子，满足该分析理想地适于这样的分子，但是本发明并不仅限于此。这里使用的术语“小分子”是本领域的术语，用于将该分子区别于大分子例如蛋白质和核酸。在免疫测定的领域中，小分子经常是指“半抗原”，是一种小分子，其当被连接到大的载体例如蛋白质上时，可引起免疫响应，并且其包括例如激素和合成药物的分子。这种类型的小分子典型地将具有2,000或者更小的分子量，经常为1,000或者更小，甚至500或者更小。试剂可适于结合到分析物本身，虽然在结合到试剂上之前，分析物可经历化学反应或者初始复合事件。例如，分析物可以在分析条件的pH下，或者在结合到第二试剂例如标记的抗体之后，被质子化/去质子化。因此，结合到试剂的分析物可能是分析物本身，或者是分析物的衍生物；二者都包括在本发明的保护范围之内。
其中可含有或者可不含感兴趣的分析物的样品一般将是流体样品，并通常为生物学样品(因此是水性的)，例如体液，如血液，血浆，唾液，血清或者尿。样品可能含有悬浮的粒子，甚至可能是全血。本发明的方法的优点为，分析可对含有悬浮粒子的样品进行，而不会对分析的结果有不适当的影响。样品典型地将为微升量级(例如1-100微升，优选1-10微升)。为了盛装流体样品，换能器优选位于样品腔，特别优选池中。在优选实施方案中，换能器与腔整合，也就是它形成了限制腔的壁之一。样品可简单地由表面张力保持，例如在毛细管道中。
这里描述的装置可以采用手持式便携读数器与一次性的含有换能器的传感器的形式。样品被收集在基本上密闭的***中，与任何其它的试剂混合并放置于读数器内，该读数器会对样品实施照射并且检测产生的电信号。
具体实施方式
实施例
实施例1
有源压电/焦热电薄膜生物传感器的制备
将极化的压电聚偏二氟乙烯(PVDF)双压电薄膜，其经使用氧化铟锡涂覆作为下文实施例中的传感器件，使用本领域技术人员已知的方法(参见例如R.Wood，2000，ToProtectandPreserve，MaterialsWorld，第8卷，第6期，第30-32页)，在型号为PDS20102涂布机(SpecialtyCoatingSystems，Indianapolis，Indiana，美国)中，采用标称厚度为500nm的帕利灵C共形涂覆。然后将其使用聚抗生蛋白链菌素溶液(在PBS中200μg/mL-含有2.7mmol/LKCl，137mmol/LNaCl和0.05％Tween的10mmol/L的磷酸盐缓冲液)通过室温下过夜培育而进行涂覆。聚抗生蛋白链菌素通过Tischer等人(US5,061,640)中描述的方法制备。
为了制备“捕获”表面，聚抗生蛋白链菌素表面使用生物素化的反-TSH(促甲状腺激素)进行培育，形成抗体涂覆的表面。PBS(通过下文中描述的方法进行生物素化)中的10μg/mL的生物素化的反-TSH(Anti-TSH5409SPTNE-5，生产代码：100034；MedixBiochemica，Kauniainen，芬兰)在室温下过在培育，然后使用过量的PBS进行清洗，使用(SurModicsInc，EdenPrairie，MN，美国)涂覆，然后在40℃下进行干燥。
抗体使用本领域技术人员已知的方法进行生物素化。例如，通过将经冻干的抗体溶解或通过稀释，制备5mg/mL的抗体在PBS(NaCl150mmol/L，磷酸盐20mmol/L，pH7.5)中的溶液。如果该溶液含有其它的蛋白质或者Tris(三羟甲基氨基甲烷)或者其它的干扰剂，就通过透析或者凝胶过滤进行纯化。然后制备20mmol/L的在无水DMSO中的NHS-生物素溶液，加入15μL的NHS-生物素溶液到抗体(1mL)中。在室温下培育1小时，然后使用含有叠氮化钠(0.01％)的PBS对抗体进行透析。可使用0.1％的叠氮化钠和20％甘油将生物素化的抗体进行稀释到1mg/mL，用于在-20℃或者+4℃下储存。生物素化的程度应该在1-3生物素/IgG的范围内。这可通过对生物素的定量来估计，或者对于高的生物素化速率，通过对胺的微分定量来估计。所得的传感器示出在图3中。
为了与帕利灵C涂覆的压电薄膜比较，还制备(精确地如上文所述)了等离子体蚀刻的“清洁”ITO和空气中暴露的“脏的”ITO压电薄膜双压电晶片元件上的传感器。这些衬底的XPS光谱已经在上文中参考图4-6进行了讨论。
实施例2
报告剂缀合物的制备
碳标记的报告剂缀合物基本上如VanDoorn等人(US5,641,689)中描述的方法来制备。为了制备抗体涂覆的报告剂缀合物，在5mmol/L的pH6.2的磷酸盐缓冲液中的1mL的特殊黑-4RCC标称150nm的碳粒子(Degussa，Essen，德国)使用200μg/mL的聚抗生蛋白链菌素溶液在室温下采用振摇过夜培育，得到抗生蛋白链菌素涂覆的表面(A1)。将得到的碳缀合物清洗(通过离心，粒化和再悬浮)。10μg/mL的在PBS中的对TSH为反应性的生物素化报告剂二级单克隆抗体(Anti-TSH5407SPTN-1，产品代码：100032；MedixBiochemica，Kauniainen，芬兰，如上文中所述生物素化的)然后与1mL的这种抗生蛋白链菌素涂覆的碳粒子悬浮液在振摇下过夜培育。将得到的碳缀合物使用0.05mol/L的pH8.5的硼酸盐缓冲液清洗(通过离心，粒化和在悬浮)3次，并在4℃下在这种缓冲液中避光保存。
实施例3
分析-抗体-涂覆的压电/焦热电薄膜传感器
如图9所示，器件22被制备用于进行分析。器件22由一块抗体涂覆的压电薄膜9(如上文中所述的)和一块透明的聚碳酸酯盖膜23制备而成。使用由一块压敏粘合剂涂覆的聚酯薄膜冲切片组成的隔板24将所述薄膜以大约500微米的距离间隔开，形成两个大小不等的腔25，26；一个腔25的大致尺寸为30×10×0.5mm，用于分析反应，另一个较小的腔26的尺寸为10×10×0.5mm，用于对照反应。规定确保压电薄膜的顶表面和底表面电连接来检测产生的电荷。
通过将较大的腔25(通过注入孔27)充满0.1mol/L的Tris缓冲液和在PBS中的TSH标准物的混合物，使得到最终的TSH浓度为1ng/mL，来进行分析，该缓冲液含有0.150mol/L的MgCl2和0.075％的Tween20溶液，含有150nm的被生物素化抗体涂覆(如上文所述)的胶态碳粒子(最终浓度为0.0025％的固体含量)，所述抗体对于TSH是反应性的。对照腔26同时充满与分析腔中相同的反应混合物，其中使用PBS代替TSH标准物。入口孔和出口孔被密封，腔室组装体连接到测试仪器，使得压电薄膜3垂直地在腔室的侧面上取向(尽管其它取向是可能的)。压电薄膜然后被相继使用四个LED(波长625nm)采用斩切LED光照明，其中三个照射分析腔的表面的不同区域，一个照射对照腔的压电薄膜的表面。对于每一个LED脉冲，使用锁相放大器和模拟数字转换器(ADC)测量贯穿压电薄膜的电压。在反应腔中，TSH的存在导致碳粒子在扩散控制下与压电薄膜结合，导致信号随时间增长。在相反的对照腔中，没有TSH的存在意味着没有观察到碳结合到表面上。做出ADC信号对时间的曲线图，信号对时间的斜率被用作TSH浓度的量度。该实验被重复12次，产生一个平均值和一个标准偏差。该实验使用帕利灵C表面，“清洁的”ITO传感器和“脏的”ITO传感器来重复进行。平均的信号(表示为计数/分钟×20)与一个标准偏差误差线示出在图10中。

Claims (14)

1.一种用于检测样品中的分析物的传感器，包括由焦热电或者压电聚合物衬底和位于该衬底的表面上的透明电极层组成的换能器；位于该透明电极层上的帕利灵层；以及固定在该换能器上的试剂，所述试剂具有能够结合分析物或者分析物的衍生物的结合位点，该传感器还包括电磁辐射源和用于检测来自换能器的电信号的检测器，且其中在使用中该电磁辐射源适于产生一系列电磁辐射脉冲，所述电磁辐射被物质吸收而后经历非辐射衰减，由此产生能量，该能量被换能器转化成电信号，该电信号可被检测器检测，其中所述帕利灵层具有10nm到100μm的厚度，并且其中所述帕利灵选自帕利灵N，帕利灵C，帕利灵D，帕利灵F和帕利灵VT-4。
2.如权利要求1所述的传感器，其中所述焦热电或者压电聚合物衬底是聚偏二氟乙烯薄膜。
3.如权利要求1或2所述的传感器，其中透明电极层是氧化铟锡层。
4.如权利要求1或2所述的传感器，其中所述换能器是氧化铟锡涂覆的聚偏二氟乙烯薄膜。
5.如权利要求1所述的传感器，其中所述传感器进一步包括位于所述帕利灵层和所述固定的试剂之间的蛋白质层。
6.如权利要求2所述的传感器，其中所述传感器进一步包括位于所述帕利灵层和所述固定的试剂之间的蛋白质层。
7.如权利要求3所述的传感器，其中所述传感器进一步包括位于所述帕利灵层和所述固定的试剂之间的蛋白质层。
8.如权利要求4所述的传感器，其中所述传感器进一步包括位于所述帕利灵层和所述固定的试剂之间的蛋白质层。
9.如权利要求5-8任一项所述的传感器，其中所述蛋白质通过非共价相互作用被吸附在帕利灵层上。
10.如权利要求1或2所述的传感器，其中所述试剂是抗体，或者核酸或者其类似物。
11.如权利要求1或2所述的传感器，进一步包括用于盛装与所述换能器接触的样品的样品腔。
12.如权利要求1或2所述的传感器，其中所述辐射源适于产生一系列的电磁辐射脉冲，所述检测器适于测定来自于所述辐射源的每一个电磁辐射脉冲与电信号的产生之间的时间延迟。
13.一种制备权利要求1-12任一项的传感器的方法，包括如下步骤：提供由焦热电或者压电聚合物衬底和位于该衬底的表面上的透明电极层组成的换能器；通过帕利灵单体气相沉积到衬底上而用帕利灵涂覆透明电极层，将接收器连接到所述换能器上。
14.如权利要求13所述的方法，其中在将接收器连接到帕利灵层上的步骤之前，使用蛋白质处理所述帕利灵层。
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