CN102105151B - Cdk抑制剂在治疗神经胶质瘤中的应用 - Google Patents

Cdk抑制剂在治疗神经胶质瘤中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种能穿过血脑屏障的低分子量ATP-竞争性CDK抑制剂，用于治疗恶性神经胶质瘤，特别是成胶质细胞瘤。该化合物可以与一种或多种选自细胞毒性剂或细胞抑制剂的药物和电离辐射一起施用。

Description

CDK抑制剂在治疗神经胶质瘤中的应用
技术领域
本发明涉及通过使用能穿过血脑屏障的低分子量ATP-竞争性CDK(周期蛋白依赖性激酶)抑制剂治疗神经胶质瘤患者。
背景技术
恶性神经胶质瘤是高度侵入性和神经破坏性肿瘤，其最有攻击性的表现是成胶质细胞瘤。术语“神经胶质瘤”涵盖了一类癌症，包括星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、寡星状细胞瘤和室管膜瘤。神经胶质瘤最广泛使用的分类和分级方案是世界卫生组织的方案，其中根据它们假设的分化线来给神经胶质瘤分类，也就是根据它们是否显示星状细胞、少突胶质或室管膜细胞的特征来分类的。根据它们恶性的程度，将它们分为I至IV级。成胶质细胞瘤(GBM)分类为IV级多形性成胶质细胞瘤。
成胶质细胞瘤是成人中最常见的原发性脑肿瘤。在美国，每年诊断为恶性原发性脑肿瘤的18，000名患者中超过一半具有GBM。GBM是一种间变性很强的细胞性肿瘤，具有很高的增殖指数、微血管增殖和局灶性坏死。体征和症状取决于很多因素(脑内肿瘤的大小、生长速度、位置)，主要表现为头痛、癫痫发作、神经学缺陷、精神状态的改变。GBM的预后仍然是很差的。对于大多数患者而言，生存时间少于2年。Karnofsky表现状态(KPS)是最重要的预后因素之一：KPS＞70的患者生存18个月的几率是约18％，与之相比KPS得分较低的患者则只有13％。原发性的GBM是由胶质细胞形成的，一般具有小于6个月的临床史，在老年患者中更为常见，并存在小细胞组织学。继发性GBM是由预先形成的低级星细胞瘤经过数月或数年形成的，主要影响较年轻的人，并存在巨细胞组织学。
神经胶质瘤的分子生物学为这种疾病的研究提供了新的认识，通过分子靶向治疗来控制细胞信号途径失调成为新的治疗方向。
复杂的遗传改变与原发性和继发性GBMs的发生有关，在原发性和次发性肿瘤中失去了相同的遗传途径。
与GBM发病学有关的主要途径有两种[Rich JN，Bigner DD.NatRev Drug Discov 2004；3(5)：430-46]。第一种是由酪氨酸激酶生长因子受体介导的信号途径：在几乎所有GBMs中ras-MAP激酶信号转导级联被激活，而在约70％的GBMs中Akt被激活。的确，也已经报道了很多酪氨酸激酶受体扩增[Puputti M等人，Mol Cancer Res 2006；4(12)：927-934]。
在该病理学以及很多其他人癌中常被中断的第二种途径是RB-CDK-CDKI(周期蛋白依赖性激酶抑制剂)调节回路：在40-57％的GBMs中检测到了INK4A(也称作p16)的缺失，在14-33％的GBMs中鉴定出了肿瘤抑制剂视网膜母细胞瘤(RB)的缺失。总起来，在超过80％的GBMs和50％的多形性成胶质细胞瘤中检测到了INK4A/CDK2/RB的变异[Zhu Y和Parada LF.Nature Reviews Cancer 2002；2：616-626]。
当前GBM的治疗选择包括手术、放射疗法和化学疗法。最广泛使用的药物是卡莫司汀、洛莫司汀、长春新碱、丙卡巴肼、卡铂、依托泊苷和依立替康。使用这些药物的新辅助或辅助疗法显示出可以延长无病生存时间(disease-free survival)，但是不能延长总存活时间。
现在，共用替莫唑胺(TMZ)和放射疗法(RT)变成新诊断出GBM患者的新护理标准，与单用RT相比在存活时间方面有临床上意义重大的改善(用TMZ/RT治疗的患者平均存活时间是15个月，而单用RT治疗的患者则为12个月；TMZ/RT组的2年存活率是26％，而RT组则为10％。
尽管成功引入了TMZ，但临床医生仍然一致认为，应当对神经胶质瘤的新活性药物的研制进行进一步的研究。的确，仍然未能满足对治疗神经胶质瘤的新有效药物的医学需求。本发明解决了这个问题。
发明综述
本发明提供一种低分子量的化合物，它能穿过血脑屏障，能通过抑制CDKs和酪氨酸激酶生长因子受体-介导的信号通道来抑制与神经胶质瘤发病机制有关的两种主要途径，并有效抑制神经胶质瘤增殖。
显示所希望活性的本发明的化合物是一种吡唑并喹唑啉，设计用于靶向于蛋白激酶的ATP袋。该化合物已经显示出是CDKs有效的ATP-竞争性抑制剂。出人意料地，我们已经发现，所述化合物对TRKA(Thropomyosin受体激酶A)显示出显著的抑制效力。此外，我们已经发现，所述化合物能大量进入脑中。
考虑到其生物活性，本发明的化合物为治疗患神经胶质瘤的患者人群的研究提供了一种新的途径。
发明详述
在第一个方面，本发明涉及式(I)的化合物
或其药学可接受的盐，用于治疗恶性胶质瘤的方法。
本文使用的术语“恶性胶质瘤”或“神经胶质瘤”包括星形细胞瘤(特别是成胶质细胞瘤)、少突神经胶质瘤、寡星状细胞瘤、室管膜瘤以及混合型胶质-神经瘤(显示神经和胶质要素的肿瘤，例如，神经节神经胶质瘤、非胚胎形成性神经上皮瘤)和源自神经细胞的肿瘤(例如，神经节细胞瘤、中枢神经节细胞瘤)。
在本发明一个优选的实施方案中，上述定义的式(I)的化合物用于治疗成胶质细胞瘤(GBM)的方法。
式(I)的化合物的化学名称为8-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基)-苯氨基]-1，4，4-三甲基-4，5-二氢-1H-吡唑[4，3-h]喹唑啉-3-甲酸甲基酰胺。它可以WO2004104007所述来制备，具有蛋白激酶抑制活性，因此可以作为抗肿瘤剂用于治疗。具体地，式(I)的化合物的优选制备方法在上述国际专利申请的实施例58中进行了描述。
式(I)的化合物的药学可接受的盐包括与无机或有机酸的酸加成盐，这些酸是例如，硝酸、盐酸、氢溴酸、硫酸、高氯酸、磷酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、羟乙酸、乳酸、草酸、丙二酸、苹果酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、羟乙磺酸和水杨酸等。
在要求保护的本发明的范围内，使用式(I)的化合物所有可能的异构体和它们的混合物、代谢产物和药学可接受的生物前体(也称作前药)。前药是任意的共价结合的化合物，它在体内释放出式(I)的活性母体药物。
治疗有效量的式(I)的化合物可以在确定个体患有疾病或不希望有的病症时施用于该个体，所述疾病或病症能通过所述化合物治疗获益。作为个体疾病或病症诊断的一部分，医学或临床人员可以做这种决定。该化合物也可以用于预防这些病症，这可以视为降低个体患有一种或多种病症的几率。
本文使用的“治疗有效量”的化合物是指足以达到其预期目的的量。基于所期望效果的实现，有效量的确定在本领域技术人员的能力范围内。有效量取决于各种因素，包括但不限于，个体的体型和/或个体所患疾病或不希望有的病症的发展程度。有效量也取决于该化合物是否以单一剂量或随时间定时施用于个体。
本发明的式(I)的化合物意欲用于治疗个体。本文使用的术语“个体”包括哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物的例子包括但不限于，哺乳动物类的任何成员：人、非人的灵长类例如猩猩，以及其他猿和猴类；农场动物例如牛、马、羊、山羊、猪；家畜类动物例如兔、狗和猫；实验室动物包括啮齿类，例如大鼠、小鼠和豚鼠，等等。非哺乳动物的例子包括但不限于，鸟、鱼等。
本文使用的术语“治疗”包括实现治疗益处。治疗益处是指根除或改善所治疗的潜在病症。例如，在癌症患者中，治疗益处包括根除或改善潜在的癌症。同时，根除或改善与潜在病症有关的一种或多种生理学症状以致在患者中观察到改善也是实现了治疗益处，尽管事实上患者仍然被潜在疾病折磨。
本发明的另一个目的是一种治疗组合，包含上述定义的式(I)的化合物和(b)一种或多种选自细胞毒性或细胞生长抑制性化学药物的抗肿瘤剂和电离辐射，用于治疗恶性胶质瘤的方法。
示例性的细胞毒性或细胞生长抑制性化学药物包括抗生素类药物、烷化剂、抗代谢剂、抗微管剂、激素类药物、免疫剂、干扰素类药物、环氧合酶抑制剂(例如，COX-2抑制剂)、间质金属蛋白酶抑制剂、端粒末端转移酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、抗生长因子受体药物、抗-HER剂、抗-EGFR剂、抗血管生成剂(例如，血管生成抑制剂)、法尼基转移酶抑制剂、ras-raf信号转导途径抑制剂、细胞周期抑制剂、其他cdks抑制剂、微管蛋白结合剂、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶I I抑制剂等。
在本发明一个特别优选的实施方案中，细胞毒性或细胞生长抑制性化学药物是替莫唑胺(temozolomide)。
电离辐射，也称作放射疗法，一般用于癌症治疗领域，包括具有足够的用于键离子化的能量的光子，例如，来源于放射性核的α-、β-和γ-射线，以及X-射线。
本发明也涉及一种药物组合物，包含如上述定义的式(I)的化合物与药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂的混合，用于治疗恶性神经胶质瘤。
在另一个实施方案中，本发明的药物组合物还包含一种或多种选自细胞毒性或细胞生长抑制性化学药物的抗肿瘤剂和电离辐射。在一个特别优选的实施方案中，所述化学药物是替莫唑胺。
包含本发明的化合物的药物组合物一般是根据常规方法制备的，并以适当的药物形式施用。
例如，固体口服形式可以包含与活性化合物在一起的稀释剂，例如，乳糖、右旋糖、二糖(saccharose)、蔗糖、纤维素、玉米淀粉或马铃薯淀粉；润滑剂，例如，硅石、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁或钙和/或聚乙二醇；粘合剂，例如淀粉类、***胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；崩解剂，例如淀粉、海藻酸、海藻酸盐或淀粉羟乙酸钠；起泡混合物；染料；甜味剂；湿润剂例如卵磷脂、聚山梨酯、月桂硫酸盐(酯)；和药物制剂中常用的无活性且药理学无活性的物质。这些药物制剂可以以已知方式制备，例如，通过混合、制粒、制片、糖包衣或膜包衣处理的方法。
口服给予的液体分散液可以是，例如糖浆、乳剂或混悬液。
例如，糖浆可以包含作为载体的二糖，或者二糖和甘油和/或甘露醇和山梨糖醇。
混悬液和乳剂可以包含，作为载体例子的天然胶、琼脂、海藻酸钠、果胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯醇。
在治疗应用中，以每天约10mg/m2-约600mg/m2体表面积的剂量水平将式(I)的化合物施用于个体。约20mg/m2-200mg/m2的剂量水平构成了特别适当的范围。对于成人个体而言，每剂量约20mg-约1000mg，更优选每剂量约60mg-约400mg，连续1-28天的剂量可以用作非限制性的例子。施用方案的其他例子是：在2周周期的第1-7天每天施用；在4周周期的连续3周的各周第1-4天每日施用；在3周周期的第1-14天每日施用；在4周周期的第1-7和15-21天每日施用。
如果需要，可以使用比上述公开更低或更高的剂量。但是，可以根据很多变量来调节这些剂量，这些变量不限于所使用化合物的活性、所治疗的病症、施用方式、治疗方案、个体患者的需要、所治疗病症的严重度和医生的判断。上述范围仅是建议性的，因为个体治疗方案的变量数目是很大的，相当大地偏离这些推荐值并不少见。
为了更好地说明本发明，而非对其进行任何限制，现在给出下列实施例。
附图简述
图1显示了未治疗细胞(C)和用两种剂量(1和3μM)的式(I)的化合物(T)处理的细胞中蛋白质的表达。分析了与控制细胞周期进程有关的蛋白质(cdc6；细胞周期蛋白A和细胞周期蛋白B)以及CDK2(RB蛋白)的直接底物的磷酸化。
图2显示了未治疗细胞(C)和用3μM的式(I)的化合物(T)处理的细胞中蛋白质的表达。显示的是磷酸化的TRKA、总的TRKA蛋白、磷酸化的p44/42MAPK和AKT以及总的p44/42MAPK的量。
图3显示了具有颅内植入的神经胶质瘤细胞株的小鼠的存活时间：未治疗的小鼠(黑线)、用式(I)的化合物治疗的小鼠(虚线)。
实施例
实施例1.激酶的闪烁迫近分析法(SPA)方式
该分析可以测定受试化合物对特定酶的激酶活性的抑制，可以平行测定不同的激酶。
在包括γ33-ATP示踪剂的ATP存在下，通过特定的激酶将生物素酰化的底物转磷酸化。在反应结束时，然后用抗生蛋白链菌素包被的SPA珠捕捉该磷酸化底物。加入密度较高的5M CsCl溶液，将该混合物培养4小时。这会导致SPA珠飘浮到包含未混合的放射标记的ATP的CsCl溶液的顶部。用β-计数器测定磷酸化的程度。
在这些测定中，式(I)的化合物显示出对CDK2/细胞周期蛋白A复合物具有有效的抑制活性(IC50＝45nM)，同时对密切相关的CDKs，即CDK1、CDK4和CDK5也显示出活性(IC50分别为398，160和265nM)，对Thropomyos in受体激酶A(TRKA)也具有活性(IC50＝53nM)。
实施例2.脑中式(I)的化合物的水平
连续6天以60mg/kg的剂量口服式(I)的化合物来治疗Han Wistar大鼠。在第6天给药后第2和6小时处死这些动物。在处死时取出脑和血浆。将血液放置于肝素化的塑料管中，保持于冰-水浴中，然后离心(10分钟，在4℃下1200g)。将脑和血浆样品保存在-80℃的冰箱中，直至分析。用LC/MS/MS分析式(I)化合物的水平。
在给药后2和6小时，式(I)的化合物的脑水平结果是平均为88.9和69.4nmoles/gr组织。血浆中相应的水平分别为9.8和8.4nmoles/mL。假定密度等于1，式(I)的化合物的脑水平比血浆水平高6.1-9.6倍。
实施例3.在给Sprague Dawley大鼠施用[14C]-标记的式(I)的化合物后，通过放射自显影发光绘图法确定脑中放射性的分布
通过单次口服(20mg/kg的马来酸盐，约3.7MBq/kg，放射性剂量为100mCi/kg)，给6只雄性大白鼠(Sprague Dawley大鼠，来自Charles River Italy；给药时体重为259-273g)施用[14C]-标记的式(I)的化合物(比放射性为5μCi/mg，室内制备)。
在施用后2，6和24小时处死动物(每个所选择的时间处死2只动物)，在切除后，在完整的脑中评价与化合物相关的物质的放射性分布。放射自显影发光绘图法是用于评价脑中定量的放射性分布。
还从处死后的动物中收集的血液和血浆中评价放射性分布。通过液体闪烁计数(LSC)确定血液和血浆中的放射性水平。
表1显示了大鼠单次口服给药(20mg/kg)后14C-标记的式(I)的化合物的分布。
表1
实施例4.式(I)的化合物对神经胶质瘤细胞的体外效果
将SF-268，SF-295，SF-539和U251细胞株在加入了10％FCS和2mM谷氨酰胺的RPMI 1640中培养，将U-87MG细胞株在加入了10％FCS，2nM谷氨酰胺和1％NEAA的EMEM中培养。对于所有实验而言，以1x104/cm2的密度植入细胞，用该化合物治疗后的天数是规定的时间，然后在所报告的时间收集。
对细胞增殖的抑制
在治疗72小时后，洗涤细胞并计数。通过细胞内三磷腺苷监测***测定细胞增殖。将细胞增殖与对照细胞进行比较。计算抑制50％细胞增殖的浓度(IC50)。
BrdU混合的分析。
在24小时治疗的最后一小时，以最终浓度为30μM将BrdU(5-溴-2’脱氧尿苷)加入到细胞培养基中。用PBS洗涤细胞，在70％乙醇中固定，并贮存于-20℃。在分析时，将细胞离心分离，用1％FCS的PBS液和用HCl 2N变性的DNA洗涤20分钟。在Na2B4O7 0.1M pH 8.5中洗涤1次后，用0.5％ Tween20的PBS+1％FCS溶液培养细胞15分钟，然后离心分离。将沉淀再悬浮于150μl的1∶10稀释的未轭合抗-BrdU单克隆抗体(Becton Dickinson)中，并在室温下培养1小时。在PBS中洗涤1次后，再用0.5％Tween20培养；然后加入次级抗体(1∶50稀FITC-轭合的山羊抗小鼠球蛋白(Jackson Lab.))。在室温下1小时后，再冲洗细胞，并用碘化丙啶复染(2μg/ml+12.5μg/ml无DNAse的RNAse)过夜，然后通过FACS分析。
吖啶橙染色以评价自吞噬。
在培养的最后15分钟，向细胞中加入吖啶橙(1μg/ml)，然后收集细胞，用PBS洗涤，并通过FACS分析它们的荧光放射。吖啶橙自由移动穿过生物膜，但是，当在细胞质和细胞核中时，发出亮绿色和暗红色的荧光；在自吞噬产生的酸性空泡中显示亮红色。
所有这些分析的结果报告于表1。式(I)的化合物对于所有的受试神经胶质瘤细胞(第一栏)都具有活性：它能抑制增殖，IC50范围为1.4-5.4μM(第二栏)；它对于DNA合成具有作用，所测定的对BrdU混合的抑制范围为39-92％(第三栏)，而且它能在36-70％的细胞中诱导自吞噬(第四栏)。据报道，这种类型的肿瘤对化学疗法和γ-辐射应答优先发生自吞噬，而非凋亡。
表2
神经胶质瘤   IC50(μM)    ％BrdU抑制   自吞噬％
U251         2.8+/-0.8    74           58(3μM)
SF539        1.4+/-0.5    39           35(6μM)
SF258        2.5+/-0.6    78           70(3μM)
SF295        5.4+/-0.6    74           68(3μM)
U87MG        1.6+/-0.8    92           50(3μM)
实施例5.通过蛋白印迹分析评价式(I)的化合物的作用方式
通过加入SDS样品缓冲液(0.125M Tris-HCl pH6.8，5％SDS)溶解要处理的细胞。将样品加热至95℃5分钟，然后用超声2000 ARTEK进行声处理。以13,000 RPM将溶解的细胞离心分离10分钟。用BCA缓冲液(Pierce)和BSA标准曲线确定蛋白质的量。每孔载入20μg蛋白质提取物，并通过SDS-PAGE凝胶7.5-10％(PAGE-PLUS 40％浓缩物AMRESCO)分离。在包含25mM Tris HCl pH 8.3，192mM甘氨酸和20％甲醇的缓冲液中，将该凝胶沾到硝化纤维素滤纸(Hybond Amersham)上。在5％低脂乳的TBS(包含0.1％ Tween 20)(TBS-T)液中，将该滤纸在室温下饱和2小时，然后在4℃下用初级单克隆体培养过夜，然后在TBS-T中洗涤，并用次级抗小鼠抗体培养。用“Super Signal West Pico”Pierce观察所形成带。
在所有受试细胞株中得到的结果表明，式(I)的化合物能干扰与神经胶质瘤有关的全部两种主要途径。实际上，不依赖于Rb途径的状况，在所有神经胶质瘤细胞株中都观察到了与细胞周期相关的标记物减少。例如，图1显示了用两种剂量的式(I)的化合物处理24小时的U251细胞中得到结果。显然，强烈抑制了Rb磷酸化以及cdc6、细胞周期蛋白A和B1表达。
也评价了式(I)的化合物抑制酪氨酸激酶生长因子受体介导的途径的能力。图2显示，在处理6小时的SF-539细胞中，在MAPK和AKT途径中抑制了TRKA受体和下游蛋白质的磷酸化。
实施例6.式(I)的化合物对神经胶质瘤的体内作用
对人神经胶质瘤的异种移植模型的抗肿瘤效力
将来自Harlan(意大利)的BaIb，Nu/Nu雄性小鼠保持于具有纸过滤器盖的笼中，将食物和睡觉用品消毒，并将水酸化。在无胸腺小鼠中皮下植入2.5x106 U251人神经胶质瘤细胞(来自American Type CultureCollection)。连续10天以10ml/kg的体积，40mg/kg的剂量，每日2次(BID)，通过口服途径施用式(I)的化合物。每3天测定肿瘤生长和体重。通过测径器评价肿瘤生长。记录两个直径，根据下式计算肿瘤重量：长度(mm)x宽2/2。基于体重减轻来评价毒性。
报告于表2的结果表明，式(I)的化合物在人神经胶质瘤的异种移植模型U251中产生了明显的抗肿瘤效果。
表3
  治疗   最大肿瘤生长抑制(％)   毒性
  式(I)的化合物40mg/kg   80   0/8
对颅内植入的神经胶质瘤肿瘤模型的效力
根据下述方案之一来麻醉要进行手术操作的动物，即***，80-100mg/kg i.p.+Xilazin：10mg/kg i.p.；异荧烷：1.5-2％。麻醉6-8周龄的无胸腺雄性裸鼠，放置于立体定位仪下，轻轻用耳棒固定，并伸入头部固定器中。纵向(平行于耳)切除头部的皮肤，露出小鼠的颅骨。使用该装置的X和Y轴控制器，鉴别出前囟点(箭头形中间和前冠缝之间的截点，以进行向大脑核中的注射)和人字点(矢状缝中间和后冠缝之间的截点，以进行向小脑中的注射)，作为0点。在该装置中设置下列坐标并鉴定注射点。使用微钻，在所期望的点作出小孔。就在要注射前，用Hamilton注射器抽吸细胞(通常2-5ml)(抽吸前进行细胞的短混合，以防止细胞沉淀)。通过指向该孔，将Z轴固定到0点，将注射器轻轻***到脑中，直至到达正确的坐标(-3.0mm深)。以1μl/分钟的速度注射U251细胞。在移出前将注射器在孔中再放置5分钟，以防止细胞抽吸。用骨蜡封闭该孔，并用无菌的关闭伤口的小手术夹封闭伤口。在手术结束后，监测小鼠的复苏，直至完全苏醒。
图3的结果表明，与载体治疗的对照小鼠相比，在用40mg/kg的剂量的式(I)的化合物bid OS治疗(bid OS)时，具有颅内植入人神经胶质瘤模型的小鼠存活时间增加了30％。

Claims (5)

1.式(I)的化合物
Figure FFW0000008631890000011
或其药学可接受的盐在制备用于治疗成胶质细胞瘤的药物中的用途。
2.一种治疗组合物在制备用于治疗成胶质细胞瘤的药物中的用途，其中所述治疗组合物包含如权利要求1定义的式(I)的化合物和替莫唑胺。
3.根据权利要求2的用途，其中所述药物与电离辐射联用。
4.一种药物组合物在制备用于治疗成胶质细胞瘤的药物中的用途，其中所述药物组合物包含如权利要求1定义的式(I)的化合物与药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂的混合。
5.根据权利要求4的用途，其中所述药物与替莫唑胺和/或电离辐射联用。
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