CN102101840A - 由桑叶中提取分离高纯度1-脱氧野尻霉素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种中药有效成分提取及分离的技术，特指一种由桑叶中提取分离高纯度1-脱氧野尻霉素的方法，包括以下顺序步骤：将原料粉末用含水溶剂提取，滤掉药渣，物料离心，得提取液；提取液浓缩至无乙醇，超滤膜过滤；再用无机酸调pH至3.0-4.0，沉淀，离心除杂；酸化料液上强酸性阳离子树脂柱，水洗，再进行氨水洗脱；料液上大孔树脂柱，水洗，再用不同浓度的乙醇梯度洗脱，收集目标洗脱液；目标洗脱液减压浓缩、干燥，得到粗品；粗品用无水乙醇溶解，过碱性吸附柱除杂，收集流出液；流出液减压浓缩，进行常温结晶和重结晶，得到1-DNJ精制品。本发明整个工艺过程中，除乙醇外未使用其它有机溶剂，操作安全，1-DNJ含量可达98.3%。

Description

由桑叶中提取分离高纯度1-脱氧野尻霉素的方法

技术领域

本发明涉及一种中药有效成分提取及分离的技术，特指一种由桑叶中提取分离高纯度1-脱氧野尻霉素的方法。

背景技术

桑叶为桑科(Moraceae)桑属植物(Morus L.)的叶，是国家***公布的药食两用植物，全国大部分地区均有栽培生产，以南方蚕桑主产区产量最多，如江苏、广西、浙江、安徽、四川等。我国桑属植物有15个种4个变种，其中入药者多为白桑(Morus alba)。桑叶在我国资源丰富，又是古代医方中的一种常用中药。桑在《诗经》中已有记载，桑叶入药首见于《神农本草经》。桑叶味苦、甘，性寒，归肺、肝经，具有疏散风热、清肺润燥、平肝明目、凉血止血之功效。历代中医药书籍中记载桑叶能够治疗消渴症。现代医学在研究桑叶化学成分和动物实验基础上，发现桑叶具有降血压、降血糖、降低胆固醇、抗肿瘤、抗过敏、抗氧化、抗毛细管渗透及利尿等功能。

1-脱氧野尻霉素（1-DNJ）是一种哌啶类多羟基生物碱，英文名称为1-Deoxynojirimycin，简称1-DNJ，化学名称为3，4，5-三羟基-2-羟甲基四氢吡啶，分子式为C₆H₁₃NO₄ ，分子量为163，具有降血糖、抗病毒、抗肿瘤转移等多种生物活性。截至目前的研究结果，自然界中以桑叶中含量最高。1-DNJ作为一种糖苷酶抑制剂，可以防止血糖浓度升高，具有降血糖、抗病毒和抗肿瘤转移等作用，具有良好的开发前景和应用价值，因而由桑叶中提取1-DNJ已成为国内外学者研究的焦点。

现有专利中，如专利号为 CN1579445A的发明专利是通过加入絮凝剂再醇沉得到桑叶提取物，1-DNJ含量1.0-3.0%；如专利号为CN1175818C的发明专利是通过絮凝、柱色谱分离精制，得到较高含量的桑叶浸膏，其中1-DNJ含量大于浸膏总重的50%。CN1430964A则是采用絮凝、离子柱色谱分离工艺；CN101654428A不使用絮凝剂，提取液酸化，浓缩除杂，再经阴、阳离子柱层析，凝胶柱层析等步骤得纯化产物；CN101020655A也是不使用絮凝剂，桑叶提取液加无机酸酸化处理，冷却除杂，再柱层析，得到提取物，1-DNJ含量大于10%。中国专利CN101020655A提供了一种从桑叶中提取1一脱氧野尻霉素(DNJ)的方法,是通过在桑叶的提取液中加入无机酸酸化处理,经冷却除去杂质,再经过柱层析获得1-DNJ含量不低于10%的桑叶提取物。该发明方法由于不需要加入絮凝剂,在降低成本、提高含量的同时保证了后处理过程中没有外源性的物质带入,再将酸化液浓缩后直接采用国产离子交换柱层析进行分离,大大降低了成本；该专利最大缺陷在于制得的1-脱氧野尻霉素含量较低，仅为10%左右。

而有关于由桑叶中提取分离高纯度1-DNJ的整套工艺还未见报道。

发明内容

为了解决上述现有技术的不足和缺点，本发明提供了一种由桑叶中提取分离高纯度1-脱氧野尻霉素的方法。

本发明的技术方案是：一种由桑叶中提取分离高纯度1-脱氧野尻霉素的方法，包括以下顺序步骤：

（1）取桑叶药材粉碎，过筛，得提取用桑叶粉末；

（2）原料粉末用含水溶剂提取，滤掉药渣，物料离心，得提取液；

（3）提取液浓缩至无乙醇，超滤膜过滤；

（4）料液用无机酸调pH至3.0-4.0，沉淀，离心除杂；

（5）酸化料液上强酸性阳离子树脂柱，水洗，再进行氨水洗脱，收集pH9-12洗脱液，用盐酸调至pH值中性；

（6）料液上大孔树脂柱，水洗，再用不同浓度的乙醇梯度洗脱，收集目标洗脱液；

（7）目标洗脱液减压浓缩、干燥，得粗品；

（8）粗品用无水乙醇溶解，过碱性吸附柱除杂，收集流出液；

（9）流出液减压浓缩，进行常温结晶和重结晶，得到质量含量高于98%的1-DNJ精制品。

优选地，步骤（1）中桑叶药材粉碎后过40目筛。

优选地，步骤（2）中的含水溶剂由水与乙醇混配而成；步骤（4）中无机酸为盐酸，其质量浓度为10%。

优选地，步骤（3）中超滤膜为中空醋酸纤维素膜。

优选地，步骤（5）中阳离子树脂选自型号002SC、D001、001×4、001×7或001×8，水和氨水洗脱体积均为3倍柱体积，氨水浓度为0.5-1.0%，流速为0.5-1倍柱体积/h。

优选地，步骤（6）中大孔树脂选自型号D101、HP20、AB-8、CAD-40、DM301或HPD-400，水和乙醇洗脱体积均为2倍柱体积，流速为0.5-1倍柱体积/h。

优选地，步骤（5）中阳离子树脂选自型号001×8，步骤（6）中大孔树脂选自型号AB-8。

优选地，步骤（7）中真空减压浓缩，干燥温度为55-60℃。

优选地，步骤（8）中碱性吸附柱中设置有碱性氧化铝作为碱性吸附剂。

优选地，步骤（9）中真空减压浓缩，浓缩温度为55-60℃，自然冷却、结晶，重结晶1-2次。

本发明的提取分离方法具有下述有益效果：

（1）整个工艺过程，除乙醇外未使用其它有机溶剂，操作安全，且避免溶剂残留；

（2）整个工艺过程，除盐酸、氨水，未带入其他外源物质，且在大孔树脂层析中均可脱除；

（3）采用超滤除杂，滤除掉大分子杂质，避免其带入后续工艺；

（4）酸化液直接用阳离子树脂柱层析，再上大孔树脂柱层析，极大地提高纯度，并且避免了反复调整pH的重复操作；

（5）上碱性氧化铝吸附柱除杂，进一步除去杂质及色素，便于结晶，有利于保证产物纯度，1-DNJ含量可达98.3%。

附图说明

图1为本发明方法的工艺流程图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详细说明，但并不是对本发明保护范围的限制。

实施例1

参照图1，一种由桑叶中提取分离高纯度1-脱氧野尻霉素的方法，包括以下顺序步骤：

将桑叶药材粉碎，过40目筛；

取10kg原料粉末，采用75%乙醇在60℃条件下提取两次（溶媒倍量分别为10倍和8倍），每次1h；

合并提取液，离心，60℃真空减压浓缩至约20L；

浓缩液过超滤膜，超滤液加盐酸调pH至3.0，离心，得酸化液；

取2L酸化液，上柱体积为1L的001×8树脂柱，水洗3倍柱体积后，再用3倍柱体积浓度为1.0%氨水洗脱，流速为1倍柱体积/h，收集pH9-12的洗脱液；

取氨水洗脱液3L，用盐酸调至中性；上柱体积为1L的D101大孔树脂柱，水洗2倍柱体积后，再用2倍柱体积浓度为10-70%的乙醇溶液梯度洗脱，流速为1倍柱体积/h，分步收集洗脱液；

合并乙醇浓度为20%-40%的洗脱液，真空减压浓缩（55℃-60℃）后，真空干燥，得含量为45.2%的粗品，总转化率为85.4%，收率为0.51%；

取制得的粗品8.0g，200ml无水乙醇溶解，过碱性氧化铝吸附柱，收集流出液，真空减压浓缩（55℃-60℃）至适当体积，常温结晶、重结晶1-2次，得含量98.3%的1-DNJ精制品。

实施例2

取实施例1中的氨水洗脱液3L，用盐酸调至中性；

上柱体积为1L的HP20大孔树脂柱，水洗2倍柱体积后，再用2倍柱体积浓度为10-70%的乙醇溶液梯度洗脱，流速为1倍柱体积/h，分步收集洗脱液；

合并乙醇浓度为20%-40%的洗脱液，真空减压浓缩（55℃-60℃）后，真空干燥，得含量为52.8%的粗品，总转化率为84.2%，收率为0.43%；

取制得的粗品8.0g，200ml无水乙醇溶解，通过碱性氧化铝吸附柱，收集流出液，真空减压浓缩（55℃-60℃）至适当体积，常温结晶、重结晶1-2次，得含量98.4%的1-DNJ精制品。

实施例3

取实施例1中的氨水洗脱液3L，用盐酸调至中性；

上柱体积为1L的CAD-40大孔树脂柱，水洗2倍柱体积后，再用2倍柱体积浓度为10-70%的乙醇溶液梯度洗脱，流速为1倍柱体积/h，分步收集洗脱液；

合并乙醇浓度为20%-40%的洗脱液，真空减压浓缩（55℃-60℃）后，真空干燥，得含量为54.1%的粗品，总转化率为86.1%，收率为0.42%；

取制得的粗品8.0g，200ml无水乙醇溶解，通过碱性氧化铝吸附柱，收集流出液，真空减压浓缩（55℃-60℃）至适当体积，常温结晶、重结晶1-2次，得含量高于98%的1-DNJ精制品。

实施例4

取实施例1中的氨水洗脱液3L，用盐酸调至中性；

上柱体积为1L的DM301大孔树脂柱，水洗2倍柱体积后，再用2倍柱体积浓度为10-70%的乙醇溶液梯度洗脱，流速为1倍柱体积/h，分布收集洗脱液；

合并乙醇浓度为20%-40%的洗脱液，真空减压浓缩（55℃-60℃）后，真空干燥，得含量为55.3%的粗品，总转化率为77.9%，收率为0.38%；

取制得的粗品8.0g，200ml无水乙醇溶解，通过碱性氧化铝吸附柱，收集流出液，真空减压浓缩（55℃-60℃）至适当体积，常温结晶、重结晶1-2次，得含量高于98%的1-DNJ精制品。

实施例5

取实施例1中的氨水洗脱液3L，用盐酸调至中性；

上柱体积为1L的HPD-400大孔树脂柱，水洗2倍柱体积后，再用2倍柱体积浓度为10-70%的乙醇溶液梯度洗脱，流速为1倍柱体积/h，分步收集洗脱液；

合并乙醇浓度为20%-40%的洗脱液，真空减压浓缩（55℃-60℃）后，真空干燥，得含量为54.3%的粗品，总转化率为80.4%，收率为0.4%；

取制得的粗品8.0g，200ml无水乙醇溶解，通过碱性氧化铝吸附柱，收集流出液，真空减压浓缩（55℃-60℃）至适当体积，常温结晶、重结晶1-2次，得含量98.3%的1-DNJ精制品。

实施例6

取实施例1中的氨水洗脱液3L，用盐酸调至中性；

上柱体积为1L的AB-8大孔树脂柱，水洗2倍柱体积后，再用2倍柱体积浓度为10-70%的乙醇溶液梯度洗脱，流速为1倍柱体积/h，分步收集洗脱液；

合并乙醇浓度为20%-40%的洗脱液，真空减压浓缩（55℃-60℃）后，真空干燥，得含量为58.3%的粗品，总转化率为87.5%，收率为0.4%；

取制得的粗品8.0g，200ml无水乙醇溶解，通过碱性氧化铝吸附柱，收集流出液，真空减压浓缩（55℃-60℃）至适当体积，常温结晶、重结晶1-2次，得含量98.5%的1-DNJ精制品。

含量测定方法

本发明1-DNJ含量测定采用高效液相法，包含以下步骤：

HPLC条件：C18柱，柱温25℃，流动相为乙腈：0.1%醋酸水溶液（35︰65），流速1ml/min，检测波长254nm。

样品制备：取0.2g样品粉末，装入250ml锥形瓶，按50倍量加入0.05mol/LHCl溶液，超声提取30min，离心，残渣再照例提取一次，离心，合并上清液，蒸馏水定容至50ml。

柱前衍生化：取上述提取液1OuL于1.5mL的离心管中，加1OuLK₃BO₃缓冲液(pH8.5)，再加入2OuL5mmol/L FMOC-Cl的乙腈溶液，混匀后于2O℃水浴反应20min，加入1OuL0.1 mol/L的甘氨酸，让剩余的衍生化试剂反应，最后加入950uL0.1％(V/V)的醋酸水溶液，混匀，用针头过滤器(0.45um)过滤，进样分析。

Claims (10)

1.一种由桑叶中提取分离高纯度1-脱氧野尻霉素的方法，其特征是包括以下顺序步骤：

（1）取桑叶药材粉碎，过筛，得提取用桑叶粉末；

（2）原料粉末用含水溶剂提取，滤掉药渣，物料离心，得提取液；

（3）提取液浓缩至无乙醇，超滤膜过滤； 

（4）料液用无机酸调pH至3.0-4.0，沉淀，离心除杂；

（5）酸化料液上强酸性阳离子树脂柱，水洗，再进行氨水洗脱，收集pH9-12洗脱液，用盐酸调至pH值中性；

（6）料液上大孔树脂柱，水洗，再用不同浓度的乙醇梯度洗脱，收集目标洗脱液； 

（7）目标洗脱液减压浓缩、干燥，得粗品；

（8）粗品用无水乙醇溶解，过碱性吸附柱除杂，收集流出液；

（9）流出液减压浓缩，进行常温结晶和重结晶，得到质量含量高于98%的1-DNJ精制品。

2.根据权利要求1所述由桑叶中提取分离高纯度1-脱氧野尻霉素的方法，其特征是：步骤（1）中桑叶药材粉碎后过40目筛。

3.根据权利要求1所述由桑叶中提取分离高纯度1-脱氧野尻霉素的方法，其特征是：步骤（2）中的含水溶剂由水与乙醇混配而成；步骤（4）中无机酸为盐酸，其质量浓度为10%。

4.根据权利要求1所述由桑叶中提取分离高纯度1-脱氧野尻霉素的方法，其特征是：步骤（3）中超滤膜为中空醋酸纤维素膜。

5.根据权利要求1所述由桑叶中提取分离高纯度1-脱氧野尻霉素的方法，其特征是：步骤（5）中阳离子树脂选自型号002SC、D001、001×4、001×7或001×8，水和氨水洗脱体积均为3倍柱体积，氨水浓度为0.5-1.0%，流速为0.5-1倍柱体积/h。

6.根据权利要求1所述由桑叶中提取分离高纯度1-脱氧野尻霉素的方法，其特征是：步骤（6）中大孔树脂选自型号D101、HP20、AB-8、CAD-40、DM301或HPD-400，水和乙醇洗脱体积均为2倍柱体积，流速为0.5-1倍柱体积/h。

7.根据权利要求1所述由桑叶中提取分离高纯度1-脱氧野尻霉素的方法，其特征是：步骤（5）中阳离子树脂选自型号001×8，步骤（6）中大孔树脂选自型号AB-8。

8.根据权利要求1所述由桑叶中提取分离高纯度1-脱氧野尻霉素的方法，其特征是：步骤（7）中真空减压浓缩，干燥温度为55-60℃。

9.根据权利要求1所述由桑叶中提取分离高纯度1-脱氧野尻霉素的方法，其特征是：步骤（8）中碱性吸附柱中设置有碱性氧化铝作为碱性吸附剂。

10.根据权利要求1所述由桑叶中提取分离高纯度1-脱氧野尻霉素的方法，其特征是：步骤（9）中真空减压浓缩，浓缩温度为55-60℃，自然冷却、结晶，重结晶1-2次。