CN102099058A - 用于缀合生物分子的新试剂和方法 - Google Patents

用于缀合生物分子的新试剂和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102099058A
CN102099058A CN2009801284953A CN200980128495A CN102099058A CN 102099058 A CN102099058 A CN 102099058A CN 2009801284953 A CN2009801284953 A CN 2009801284953A CN 200980128495 A CN200980128495 A CN 200980128495A CN 102099058 A CN102099058 A CN 102099058A
Authority
CN
China
Prior art keywords
group
chemical compound
peg
alkyl
pegylation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2009801284953A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102099058B (zh
Inventor
A·戈德温
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Abzena UK Ltd
Original Assignee
Polytherics Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB0813339A external-priority patent/GB0813339D0/en
Priority claimed from GB0905762A external-priority patent/GB0905762D0/en
Application filed by Polytherics Ltd filed Critical Polytherics Ltd
Publication of CN102099058A publication Critical patent/CN102099058A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102099058B publication Critical patent/CN102099058B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C317/00—Sulfones; Sulfoxides
    • C07C317/44—Sulfones; Sulfoxides having sulfone or sulfoxide groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C317/48—Sulfones; Sulfoxides having sulfone or sulfoxide groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by singly-bound nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C317/50—Sulfones; Sulfoxides having sulfone or sulfoxide groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by singly-bound nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups at least one of the nitrogen atoms being part of any of the groups, X being a hetero atom, Y being any atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/64—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C07C233/67—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms
    • C07C233/68—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom
    • C07C233/73—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom of a carbon skeleton containing six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C317/00—Sulfones; Sulfoxides
    • C07C317/26—Sulfones; Sulfoxides having sulfone or sulfoxide groups and nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the same carbon skeleton
    • C07C317/32—Sulfones; Sulfoxides having sulfone or sulfoxide groups and nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the same carbon skeleton with sulfone or sulfoxide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C49/00—Ketones; Ketenes; Dimeric ketenes; Ketonic chelates
    • C07C49/20—Unsaturated compounds containing keto groups bound to acyclic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D295/00—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms
    • C07D295/04—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms
    • C07D295/14—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C07D295/155—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals with the ring nitrogen atoms and the carbon atoms with three bonds to hetero atoms separated by carbocyclic rings or by carbon chains interrupted by carbocyclic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Polyethers (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
  • Other Resins Obtained By Reactions Not Involving Carbon-To-Carbon Unsaturated Bonds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

一种通式X-[Q-W-(CH＝CH)n-(CH2)2-L]m(I)的化合物，其中X代表一个聚合物；Q代表一个连接基团；W代表一个吸电子基团；n代表0或1-4中的一个整数；L代表一个离去基团；m代表1-8中的一个整数。所述化合物可用于缀合生物分子。

Description

用于缀合生物分子的新试剂和方法
本发明涉及用于缀合生物分子特别是蛋白和肽的新试剂和新方法。
许多治疗活性分子例如蛋白不具有实现临床医用效力所需的性质。例如，许多天然蛋白不能形成好的药物，原因是在对患者给药时存在若干固有缺点，包括：(1)蛋白被许多存在于血液或组织中的内源和外源肽酶消化；(2)许多蛋白具有某种程度的免疫原性；以及(3)蛋白可通过肾脏超滤和内吞作用迅速***。可能在药物中作为活性治疗剂使用的某些分子具有全身毒性或者缺少最佳生物利用率和药代动力学。当蛋白从血液中迅速清除时，通常不得不频繁地将其给予患者。频繁给药还增加毒性危险，特别是免疫引起的毒性。
水溶性合成聚合物特别是聚亚烷基二醇广泛地用于缀合治疗活性分子例如蛋白、肽和低分子量药物。这些治疗缀合物已被证明可有利地通过延长循环时间和降低清除率来改变药代动力学，降低全身毒性，并且在多种情况下呈现临床效力的提高。将聚乙二醇PEG共价缀合于蛋白的方法通常称为“聚乙二醇化”。
对于使效力最优化并确保剂量与剂量一致重要的是：对于每种分子，每个蛋白缀合的聚合物分子的数量相同；并且每个聚合物分子特异地共价缀合于每个蛋白分子的相同氨基酸残基。在沿蛋白分子的位点上的非特异性缀合可导致缀合产物以及通常非缀合蛋白的分布，从而产生纯化困难且昂贵的复杂混合物。
对于硫醇特异性缀合，通常使用具有一端以马来酰亚胺基团终止的PEG链的聚乙二醇化试剂。许多出版物例如WO 2004/060965描述了这样的试剂。马来酰亚胺终止的试剂可市购获得。然而，许多PEG-马来酰亚胺在贮存和与药物候选物缀合的过程中是水解不稳定的。具体地，在缀合之前和之后均会发生马来酰亚胺环的很大程度的水解。
我们现在已经发现一种类型的聚乙二醇化试剂，所述试剂可用于将包括蛋白和肽的分子经单个亲核残基例如硫醇基团缀合于聚合物，并且所述试剂优于这类市售试剂。
因此，本发明提供一种使含有硫醇或氨基基团的分子缀合于聚合物的方法，该方法包括使所述分子与如下通式的化合物反应：
X-[Q-W-(CH＝CH)n-(CH2)2-L]m    (I)
其中X代表一个聚合物；Q代表一个连接基团；W代表一个吸电子基团；n代表0或1-4中的一个整数；L代表一个离去基团；m代表1-8中的一个整数。
由本发明方法获得的直接产物通常可由如下通式表示：
X-[Q-W-(CH＝CH)n-(CH2)2-Z]m    (IIa)
其中X、Q、W、n和m具有上面给出的意义，Z代表通过一个硫醇或氨基基团缀合的所述分子。如果需要，可使所获得的式IIa的化合物转变为任何其他所需的产物。具体地，可使获得的通式IIa的化合物转变为通式II的化合物
X-[Q-W′-(CH＝CH)n-(CH2)2-Z]m    (II)
其中W′代表一个吸电子部分或一个可通过还原吸电子部分制备的部分。
通式(I)的化合物是新化合物，本发明因此还提供了这些化合物本身。特别优选的式(I)的新化合物是如下定义的式(Ia)的化合物。
通式(II)的化合物式也是新化合物，本发明因此还提供了这些化合物本身。特别优选的式(II)的新化合物是如下定义的式(IIb)的化合物。
m代表1-8例如1-6、优选1-4中的一个整数，例如1。当m为1时，单个分子与所述聚合物缀合。当m大于1时，可实现多于一个分子与聚合物的缀合。2-8个-Q-W′-(CH＝CH)n-(CH2)2-Z或-Q-W-(CH＝CH)n-(CH2)2-L基团连接于所述聚合物，并且每个所述基团的变量Q、W、W′、n、L和Z可相同或不同。可获得多官能聚合物化合物，例如可使用可从NOF获得的商标名为“Sunbright”的多臂(multi-arm)化合物作为起始材料将多个基团连接在一起，所述多臂化合物例如式C[CH2O(CH2CH2O)n-Y]4的4臂产物，其中Y可为多种不同末端基团中的一种。多聚体缀合物可导致协同和加合益处。例如，如果m为1，那么获得的缀合物在远离所述缀合分子的PEG链末端上必然具有一个末端基团。这通常为烷氧基或类似基团，并且已表明这种基团在用于药物应用时可造成不想要的免疫原性效应。如果m大于1，缀合的分子可连接于所述PEG链的两端，从而不需末端基团例如烷氧基。
聚合物X可为例如聚亚烷基二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯例如聚丙烯酰吗啉、聚甲基丙烯酸酯、聚噁唑啉、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺或聚甲基丙烯酰胺例如聚羧甲基丙烯酰胺，或者HPMA共聚物。另外，X可为一种易于酶降解或水解降解的聚合物。这种聚合物包括例如聚酯、聚缩醛、聚(原酸酯)、聚碳酸酯、聚(碳酸亚胺酯)和聚酰胺例如聚(氨基酸)。聚合物X可为均聚物、随机共聚物或结构确定的共聚物例如嵌段共聚物。例如，X可为由两种或更多种烯化氧、或者来源于聚(烯化氧)与聚酯、聚缩醛、聚(原酸酯)或聚(氨基酸)的任一种的嵌段共聚物。可用的多官能聚合物包括二乙烯基醚马来酸酐和苯乙烯-马来酸酐的共聚物。
也可使用天然聚合物，例如多糖类例如几丁质、葡聚糖、糊精、壳聚糖、淀粉、纤维素、糖原、聚(唾液酸)及其衍生物。也可使用蛋白作为所述聚合物。这使得一种蛋白例如抗体或抗体片段可与另一种蛋白例如酶或其他活性蛋白缀合。同时，如果使用含有催化序列例如糖基转移酶的O-多糖受***点的肽，那么其允许纳入后续酶反应的底物或靶标。也可使用聚(氨基酸)例如聚谷氨酸或聚甘氨酸，也可使用来源于天然单体例如糖类或氨基酸和合成单体例如环氧乙烷或甲基丙烯酸的杂合聚合物。
如果所述聚合物为聚亚烷基二醇，那么优选含有C2和/或C3单元的聚亚烷基二醇，特别是聚乙二醇。聚合物特别是聚乙二醇可含有单条直链，或其可具有由许多短或长链构成的分支形态。所谓的Pluronics(聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物)是一种重要的PEG嵌段共聚物类型。它们衍生自环氧乙烷和环氧丙烷嵌段。可使用被取代的聚亚烷基二醇，例如甲氧基聚乙二醇。在本发明的一个优选实施方案中，单链聚乙二醇由合适的基团例如烷氧基如甲氧基、芳氧基、羧基或羟基开始，并在链的另一末端连接于连接基团Q。
所述聚合物X可任选地以任何所需的方式衍生或官能化。反应基团可连接于所述聚合物末端或末端基团，或通过突出的接头沿所述聚合物链连接；在这种情况下，所述聚合物为例如聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯或马来酸酐共聚物。这种官能化的聚合物提供了制备多体缀合物(即其中所述聚合物缀合于多于一个分子的缀合物)的另一可能性。根据需要，可使用常规方法使所述聚合物连接于固体支持物。
所述聚合物的最佳分子量当然应取决于预计的应用。优选地，其数均分子量为250g/摩尔到约75,000g/摩尔。当打算将通式II的化合物用于医用并且使其离开循环***并穿透组织时，例如用于治疗恶性肿瘤、感染或自免疫疾病或者创伤引起的炎症，使用范围在2000-30,000g/摩尔的较低分子量的聚合物可能是有利的。对于打算使通式II的化合物保留在循环***中的应用，使用例如范围在20,000-75,000g/摩尔的更高分子量的聚合物可能是有利的。
应选择要使用的聚合物以使所述缀合物可溶于适合其预计应用的溶剂介质中。对于生物学应用，特别是对哺乳动物临床治疗给药的诊断应用和治疗应用，所述缀合物应可溶于水性介质中。然而，许多生物分子，例如蛋白如酶，具有工业用途例如催化化学反应。对于打算用于这些用途的缀合物，所述缀合物需要可溶于水性或有机介质的一种或两种之中。所述聚合物当然不应过分损害要缀合的分子的预计功能。
优选地，所述聚合物是合成聚合物，并且优选是水溶性聚合物。使用水溶性聚乙二醇对于许多应用是特别优选的。
连接基团Q可为例如直接键合、一个亚烷基基团(优选C1-10亚烷基基团)或者一个任选被取代的芳基或杂芳基基团，所述基团的任一种都可被一个或多个如下原子或基团终止或中断：氧原子、硫原子、-NR基团(其中R代表一个氢原子或一个烷基(优选C1-6烷基)、芳基(优选苯基)或烷基-芳基(优选C1-6烷基-苯基)基团)、酮基团、-O-CO-基团、-CO-O-基团、-O-CO-O、-O-CO-NR-、-NR-CO-O-、-CO-NR-和/或-NR.CO-基团。所述芳基和杂芳基基团Q构成本发明的一个优选实施方案。合适的芳基基团包括苯基和萘基基团，而合适的杂芳基基团包括吡啶、吡咯、呋喃、吡喃、咪唑、吡唑、噁唑、哒嗪、嘌呤和嘧啶。特别合适的连接基团Q为杂芳基或者特别是芳基基团，特别是苯基基团，所述连接基团Q在邻近聚合物X处被NR.CO-基团终止。与所述聚合物的连接可通过一个易水解的键或通过一个不易水解的键。
可存在于任选地被取代的芳基或杂芳基基团上的取代基包括例如一个或多个相同或不同的选自如下基团的取代基：烷基(优选任选被OH或CO2H取代的C1-4烷基，特别是甲基)、-CN、-NO2、-CO2R、-COH、-CH2OH、-COR、-OR、-OCOR、-OCO2R、-SR、-SOR、-SO2R、-NHCOR、-NRCOR、NHCO2R、-NR.CO2R、-NO、-NHOH、-NR.OH、-C＝N-NHCOR、-C＝N-NR.COR、-N+R3、-N+H3、-N+HR2、-N+H2R、卤素如氟或氯、-C≡CR、-C＝CR2和-C＝CHR，其中每个R均独立地代表一个氢原子或一个烷基(优选C1-6烷基)、芳基(优选苯基)或烷基-芳基(优选C1-6烷基-芳基)基团。吸电子取代基的存在是特别优选的。优选的取代基包括例如CN、NO2、-OR、-OCOR、-SR、-NHCOR、-NR.COR、-NHOH和-NR.COR。
W可例如表示一个酮基团CO、一个酯基团-O-CO-或一个砜基团-SO2-，并且W′可代表这类基团或者通过还原这类基团得到的基团，例如CH.OH基团、醚基团CH.OR、酯基团CH.O.C(O)R、胺基团CH.NH2、CH.NHR或CH.NR2，或者酰胺CH.NHC(O)R或CH.N(C(O)R)2。
优选地，n是0。
离去基团L可例如代表-SR、-SO2R、-OSO2R、-N+R3-N+HR2、-N+H2R、卤素或其中R具有上文给出的意义，并且
Figure BPA00001303965000052
代表一个含有至少一个吸电子取代基的被取代芳基特别是苯基基团，所述吸电子取代基例如-CN、-NO2、-CO2R、-COH、-CH2OH、-COR、-OR、-OCOR、-OCO2R、-SR、-SOR、-SO2R、-NHCOR、-NRCOR、-NHCO2R、-NR’CO2R、-NO、-NHOH、-NR’OH、-C＝N-NHCOR、-C＝N-NR’COR、-N+R3、-N+HR2、-N+H2R、卤素特别是氯或氟、-C≡CR、-C＝CR2和-C＝CHR，其中每个R均独立地具有上文给出的意义之一。
如果m代表2-8中的一个整数，那么不同的L基团可视需要存在。通过选择不同活性的L基团提供了一种在连续反应中使不同分子缀合于聚合物X的可能性。
优选地，本发明方法使用如下通式的试剂：
X-[NH-CO-Ar-W-(CH＝CH)n-(CH2)2-SO2R’]m    (Ia)
其中Ar代表未被取代或被取代的芳基基团特别是苯基基团，其中任选的取代基选自上文对在连接基团Q中含有的芳基基团所提到的取代基；R，代表氢原子或任选被取代的烷基(优选C1-6烷基)、芳基(优选苯基)或烷基-芳基(优选C1-6烷基-芳基)基团；并且W和m具有上面给出的意义；以产生如下通式的新缀合物：
X-[NH-CO-Ar-W′-(CH＝CH)n-(CH2)2-Z]m    (IIb)
在这些优选化合物Ia和IIb中，优选n是0，并且优选m代表1-4中的一个整数，特别是1。优选每个W均代表CO基团，并且W′代表CO基团或CH.OH基团。优选R′代表任选被取代的烷基基团，例如一个任选被羟基取代的C1-4烷基基团，例如-CH2CH2OH，或特别是C1-4烷基-芳基基团，特别是对甲苯基。优选Ar是一个未被取代的苯基基团。优选X是聚亚烷基二醇，特别是聚乙二醇。
式I的化合物，特别是式Ia的化合物，被认为是意料不到稳定的，并且对含有硫醇或氨基基团的分子具有高活性。本发明的缀合过程被认为通过形成如下通式的中间化合物而进行
X-[Q-W-(CH＝CH)n-CH＝CH2]m    V
其中X、Q、W和m具有上文给出的含义。
要通过本发明方法缀合的分子可为任何所需的分子。其可为例如天然分子或来源于天然分子的分子，或者其可为具有生物活性的任何分子，例如任何药物，条件是其含有硫醇(-SH)或氨基(-NHR)基团。例如，其可为蛋白或肽：在整个此说明书中，为了方便将使用术语“蛋白”，除非上下文另有要求，否则提及蛋白应理解为是指“蛋白或肽”。
所述分子通过其连接的所述硫醇或氨基基团是一种能够与试剂I反应、除去离去基团L的亲核试剂。这种基团可存在于天然生物分子中，或可在缀合之前引入生物分子中。
两个硫醇基团可通过还原可位于链内或链间的天然的或设计的二硫(半胱氨酸)键生成。一个生物分子可含有一个或多个二硫键，可进行生成游离巯基部分的还原，以还原一个或多个二硫键。根据二硫键还原的程度和所用多聚体缀合试剂的化学计量比，可能将一个或多个聚合物分子缀合于所述生物分子。如果需要还原少于总数的二硫键，那么可使用固定化的还原剂，也可使用不同反应条件或加入变性剂进行部分还原。
或者，硫醇基团可为单个半胱氨酸残基或者非源于二硫键的其他硫醇基团。单个半胱氨酸可通过合成方式引入，以提供合适的结合点。这一方法特别可用于缀合肽。
胺基团可为例如赖氨酸或组氨酸残基。这些基团可存在于天然生物分子中，或通过合成引入。例如，组氨酸残基可通过组氨酸标签(his-tag)的方式引入，组氨酸标签是一种通过合成方法结合于蛋白的连续组氨酸残基短链，例如含有多至12个组氨酸残基，但通常含有5或6个组氨酸残基。组氨酸标签强结合于镍和钴，使得它们可结合于在称为固定化金属亲和色谱的分离方法中使用的含有镍或钴的色谱柱。组氨酸标签被广泛使用，它们结合于大量蛋白和肽，以使所述蛋白和肽或者其来源的产物将来可从混合物中分离。
当所述分子为蛋白时，其可为例如肽、多肽、抗体、抗体片段、酶、细胞因子、趋化因子、受体、血液因子、肽激素、毒素、转录蛋白或多聚体蛋白。
下面给出一些根据所需应用可用于本发明的具体蛋白。酶包括碳水化合物特异性酶、蛋白水解酶等。对于工业(基于有机的反应)和一般性生物应用特别是治疗应用，感兴趣的酶包括US 4,179,337公布的氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和连接酶。感兴趣的具体酶包括天冬酰胺酶、精氨酸酶、腺苷脱氨酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、糜蛋白酶、脂酶、尿酸酶、胆红素氧化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖醛酸酶、半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、葡萄糖醛酸酶和谷氨酰胺酶。
用于通式I化合物的蛋白包括例如血液蛋白如白蛋白、转移蛋白、因子VII、因子VIII或因子IX、von Willebrand因子、胰岛素、ACTH、胰高血糖素、生长抑素、生长素、胸腺素、甲状旁腺激素、色素激素、生长调节素、***、促黄体激素、下丘脑释放因子、抗利尿激素、催乳素、白细胞介素、干扰素、集落刺激因子、血红蛋白、细胞因子、抗体、抗体片段、绒毛膜***、促卵泡激素、促甲状腺激素和组织型纤溶酶原激活因子。
某些上述蛋白例如白细胞介素、干扰素和集落刺激因子也以非糖基化形式存在，通常由重组蛋白技术制备产生。所述非糖基化形式可用于本发明。
其他感兴趣蛋白是由Dreborg et al Crit.Rev.Therap.Drug Carrier Syst.(1990)6 315-365公开的变应原蛋白，这些蛋白在与聚合物例如聚(烯化氧)缀合时已降低了变应原性并因此适合用作耐受诱导物。在这些变应原中，公开的有Ragweed抗原E、蜂毒(honeybee venom)、螨变应原等。
对糖聚肽例如免疫球蛋白、卵清蛋白、脂酶、葡糖脑苷脂酶、凝集素、组织型纤溶酶原激活因子、糖基化白细胞介素、干扰素和集落刺激因子感兴趣，也对免疫球蛋白例如IgG、IgE、IgM、IgA、IgD及其片段感兴趣。
特别感兴趣的是在用于诊断和治疗目的的临床药物中使用的受体和配体结合蛋白以及抗体和抗体片段。所述抗体可单独使用或可共价缀合(“加载”)于另一原子或分子例如放射性同位素或细胞毒性/抗感染药物。表位可用于疫苗接种以产生免疫原性聚合物-蛋白缀合物。
如果需要，可将所述生物分子衍生化或功能化。具体而言，在进行缀合前，可先使所述分子例如天然蛋白与多种阻断基团反应以保护其上的敏感基团；或者可先使用本发明方法或使用其他方法将所述分子与一种或多种聚合物或其他分子缀合。
所述分子可为分子量相对低的合成分子。例如，它可以是缀合对其有利的任何药物。对于许多这类分子，必须***携带硫醇或氨基基团以使其可与本发明试剂缀合的合适接头。典型药物包括例如卡托普利、两性霉素B、喜树碱、紫杉醇、伊立替康及其衍生物如SN38、多烯紫杉醇和利巴韦林。
可使用本发明方法缀合的其他感兴趣的分子包括在WO 2004/060965中列出的那些。
本发明方法可在全部反应物在其中可溶的溶剂或溶剂混合物中进行。可使要缀合的分子，例如蛋白，在水性反应介质中直接与通式I的化合物反应。此反应介质也可根据亲核基团(硫醇或胺)的pH需要被缓冲。在许多情况下，所述反应的最佳pH为至少6.0，通常为约6.8到约8.5，例如约7.0-8.0，优选约7.5-8.0；但在其他情况下，可使用低至4.0的pH，特别是当需要与多组氨酸标签缀合时，致使可用pH范围是4.0-8.5。如果优选在存在要缀合的分子的情况下原位生成上式V的化合物，那么适合在整个过程中使用较高pH。或者，如果优选在单独步骤中生成上式V的化合物并随后加入要缀合的分子，那么所述第一步骤适合在相对较高pH(例如7.5-8.0)下进行，而所述随后步骤适合在更低pH(例如6.0-6.5)下进行。本发明试剂的一个优点是其可成功地在较宽范围的pH条件下使用。
3-37℃之间的反应温度通常是合适的：如果缀合反应在可发生蛋白的降解、聚集或变性的温度下进行，那么蛋白可能发生这些损害功能和/或反应效率的过程。在有机介质(例如THF、乙酸乙酯、丙酮)中进行的反应通常在最高至室温的温度下进行。
与许多其他试剂不同，使用等于化学计量或稍微过量的所需试剂可使所述分子与试剂有效缀合。然而，由于所述试剂与用于溶剂合物例如蛋白的水性介质不发生竞争性反应，因此可以用化学计量过量的试剂进行缀合反应。过量的试剂和产物可通过常规纯化过程中的离子交换色谱，或者在存在组氨酸标签时可通过使用镍进行分离容易地分离。
如果所述分子通过其进行缀合的基团为硫醇基团，本发明方法可如下进行：原位地部分还原来源于所述生物分子中两个半胱氨酸的二硫键，随后所还原产物与式(I)化合物反应。二硫键可通过常规方法用例如二硫苏糖醇、巯基乙醇或三(羧乙基)膦进行还原。
本发明方法的中间产物是其中W′为吸电子基团的通式II化合物。这些化合物本身是有用的：因为本发明方法在合适的条件下是可逆的，其中W′为吸电子部分的式(II)化合物可用于需要所述分子从缀合物中释放的应用中，例如直接的临床应用中。然而，吸电子基团W′可被还原以生成阻止所述分子释放的部分，并且这种化合物还可用于许多临床、工业和诊断应用中。
因此，例如，含有酮基团的W′基团可被还原为含有CH(OH)基团的W′部分；醚基团CH.OR可通过羟基基团与醚化试剂的反应得到；酯基团CH.O.C(O)R可通过羟基基团与酰化试剂的反应得到；胺基团CH.NH2、CH.NHR或CH.NR2可通过还原性胺化从酮或醛制备；或者酰胺CH.NHC(O)R或CH.N(C(O)R)2可通过胺的酰化形成。使用氢硼化物，例如硼氢化钠、氰基硼氢化钠、硼氢化钾或三乙酰氧基硼氢化钠作为还原剂是特别优选的。其他可用的还原剂包括例如氯化亚锡、醇盐例如烷醇铝以及氢化铝锂。
通式(I)的化合物可通过使通式(III)的化合物与通式(IV)的化合物反应而制备：
A-Q-W-(CH＝CH)n-(CH2)2-L (III)
其中Q、W、n和L具有上文给出的含义
X-Bm    (IV)
其中X代表聚合物；选择基团A和B使得化合物(III)和(IV)一起反应以得到所需的式(I)化合物。
通式II的化合物具有多种应用。例如，它们可用于对患者的直接临床应用，从而本发明还提供了一种包含通式II的新化合物和可药用载体的药物组合物。本发明还提供一种在治疗中使用的通式II的新化合物，以及治疗患者的方法，该方法包括对患者给予药物有效量的式II的新化合物或本发明的药物组合物。通过合适地选择生物分子可得到任何所需的药学效应，例如创伤治疗、酶替代、蛋白替代、伤口护理、排毒、抗炎、抗感染、免疫调节、疫苗接种或抗癌。通式II的化合物可包括显像剂，例如放射核苷酸，以能够在体内追踪所述化合物。
通式II的化合物还可用于非临床应用中。例如，许多生理活性化合物例如酶能够在有机溶剂中催化反应，通式II的化合物可用于这些应用中。此外，通式II的化合物还可用作诊断工具。
下面的实施例对本发明进行了举例说明。在附图中：
图1示出了实施例1步骤1的反应路线。
图2示出了实施例1步骤2的反应路线。
图3示出了实施例1步骤3的反应路线。
图4示出了实施例1步骤4的反应路线。
图5示出了实施例2产物的SDS-PAGE分析结果。
图6示出了实施例3产物的SDS-PAGE分析结果。
图7示出了实施例5产物的SDS-PAGE分析结果。
图8示出了实施例6中反应的反向色谱分析。
图9示出了实施例7产物的SDS-PAGE分析结果。
图10示出了实施例8中反应的阳离子交换色谱分析。
图11示出了实施例8的ELISA结果。
图12示出了实施例9产物的SDS-PAGE分析结果。
图13示出了实施例11时间过程聚乙二醇化的色谱图。
图14示出了在实施例10和11中提到的化合物9、10和11的互变。
图15示出了实施例11的转变结果。
图16示出了实施例12的反向色谱结果。
图17示出了实施例13的稳定性结果。
图18示出了实施例17中间产物的SDS-PAGE分析结果。
图19示出了实施例17终产物的SDS-PAGE分析结果。
图20示出了实施例17的吸光度结果。
图21示出了实施例19的反应路线。
图22示出了实施例20的反应路线。
实施例1：PEG试剂合成：10kDa PEG试剂9的合成。
步骤1，对羧基-3-哌啶基苯丙酮盐酸盐2的合成。
此步骤的反应路线示于图1。
在一个250ml圆底烧瓶中装入对乙酰基苯甲酸(15.0g，1)、11.11g哌啶盐酸盐和8.23g多聚甲醛。然后加入无水乙醇(90ml)和浓盐酸(1ml)，将得到的悬液在氩气下搅拌回流加热10小时。在停止回流后，加入丙酮(150ml)并使反应混合物冷却至室温。将所得白色沉淀在一个玻璃过滤器(G3)上分离并用预冷的丙酮洗涤两次。然后将所得固体在真空下干燥以得到白色结晶粉末(2，9.72g)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ1.79，2.96，3.45(br m，哌啶部分的CH2)，3.36(t，2H，COCH2)，3.74(t，2H，NCH2)，8.09(m，4H，ArH)。
步骤2：4-(3-(对甲苯基硫)丙酰)苯甲酸5的合成。
此步骤的反应路线示于图2。
将对羧基-3-哌啶基苯丙酮盐酸盐2(1.0g)和4-甲基苯硫酚(417mg，3)悬浮在无水乙醇(7.5ml)和甲醇(5ml)的混合物中。然后加入哌啶(50μl)并将所得悬液在氩气下搅拌回流加热6小时。将冷却至室温得到的白色沉淀用玻璃过滤器(G3)过滤，用冷丙酮小心洗涤并真空干燥以得到5(614mg)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ2.27(s，3H，苯基-CH3)，3.24，3.39(t，2 x 2H，CH2)，7.14，7.26(d，2 x 2H，甲苯基部分的ArH)，8.03(m，4H，羧酸基团的ArH)。
步骤3，4-(3-甲苯磺酰基丙酰)苯甲酸6的合成。
此步骤的反应路线示于图3。
将4-(3-(对甲苯基硫)丙酰)苯甲酸5(160mg)悬浮在水(10ml)和甲醇(10ml)的混合物中。在冰浴中冷却后，加入过氧硫酸氢钾(oxone)(720mg，Aldrich)并使反应混合物升温至室温伴随搅拌过夜(15小时)。将所得悬液另外用水(40ml)稀释从使得其近乎匀质，然后将混合物用氯仿(共100ml)萃取3次。将合并的氯仿萃取物用盐水洗涤，然后用MgSO4干燥。于30℃在真空下蒸发挥发性物质，得到白色固体6(149mg)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ2.41(s，3H，苯基-CH3)，3.42(t，2H，CO-CH2)，3.64(t，2H，SO2-CH2)，7.46，7.82(d，2x 2H，甲苯基部分的ArH)，8.03(m，4H，羧酸部分的ArH).
步骤4，聚乙二醇化4-(3-甲苯磺酰基丙酰)苯甲酸——PEG试剂9的合成。
此步骤的反应路线示于图4。
将4-(3-甲苯磺酰基丙酰)苯甲酸6(133mg)和O-(2-氨基乙基)-O′-甲基-PEG 8(MW 10kDa，502mg，BioVectra)溶解于干甲苯(5ml)中。将溶剂在真空下不加热除去，然后将干固体剩余物在氩气下重新溶解于干二氯甲烷(15ml)中。在氩气下向在冰浴中冷却的所得溶液中缓慢加入二异丙基碳化二亚胺(DIPC，60mg)。然后将反应混合物在室温下搅拌过夜(15小时)。然后在真空下除去挥发性物质(30℃，水浴)以得到固体剩余物，将所述固体剩余物伴随轻微加热(35℃)重新溶解在丙酮(20ml)中。将所述溶液用不吸水脱脂棉过滤以除去不溶物质。然后将所述溶液在干冰浴中冷却以得到白色沉淀，将所述沉淀通过离心(4600rpm，30分钟)分离。倾去液相，将此沉淀步骤重复三次。然后将所得灰白色固体在真空下干燥，得到PEG试剂9(437mg)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.46(s，3H，苯基-CH3)，3.38(s，3H，PEG-OCH3)，3.44-3.82(br m，PEG)，7.38，7.83(d，2 x 2H，甲苯基部分的ArH)，7.95(m，4H，羧酸部分的ArH)。
不同PEG分子量的类似PEG试剂通过相同的通用方法制备。因此，20kDa PEG通过使砜6(20.8mg)、O-(2-氨基乙基)-O′-甲基-PEG(20kDa，250mg，Fluka)和DIPC(8.7mg，7)在干二氯甲烷(15ml)中反应制备，在丙酮沉淀纯化过程后得到灰白色固体(245mg)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.46(s，3H，苯基-CH3)，3.38(s，3H，PEG-OCH3)，3.44-3.82(br m，PEG)，7.38，7.83(d，2 x 2H，甲苯基部分的ArH)，7.95(m，4H，羧酸部分的ArH).
实施例2：用分子量5、10和20kDa的PEG试剂9对具有单一铰链二硫键(两个硫醇)的Fab抗体片段进行的聚乙二醇化。
向100μl的Fab溶液(Abcam cat.no.AB6520，1mg/ml)中加入5μl的DTT储液(100mM的去离子水溶液)，使所得溶液在室温下静置30分钟。将所述溶液用95μl pH 7.8的含有0.15M NaCl和10mM EDTA的50mM磷酸盐缓冲液稀释至200μl，然后加载至经pH7.8的含有0.15M NaCl和10mM EDTA的50mM磷酸盐缓冲液预平衡的illustra NAP-5柱(GE Healthcare cat.No.17-0854-01)上。将该NAP-5柱用5×300μl的pH 7.8的新鲜磷酸盐缓冲液洗脱。对于全部级分测量280nm下的UV吸光度，其中还原的Fab被鉴定出主要存在于级分3中，并且蛋白浓度估计为0.23mg/ml。
将分子量为5kDa、10kDa和20k Da的三种PEG试剂溶解于pH 7.8的磷酸盐缓冲液中，分别得到0.5mg/ml、1mg/ml和2mg/ml的溶液浓度。
对于每个聚乙二醇化反应，使用了5.0μl的还原Fab溶液(0.23mg/ml)和0.42μl的PEG溶液(还原的铰链二硫键硫醇的1摩尔当量)。所述Fab反应溶液也用4.6μl的pH 7.8的磷酸盐缓冲液稀释，得到终体积10μl。将反应溶液在4℃下孵育12小时。
然后使用NuPAGENovex 4-12％ Bis-Tris凝胶(Invitrogen cat.No.NP0321BOX)和NuPAGE MES SDS电泳缓冲液(Invitrogen cat.No.NP002)对反应溶液进行SDS-PAGE分析。将所述凝胶用InstantBlue(Expedeon cat.No.ISB1L)染色。在下图5中示出结果。以蛋白分子量标准来看，PEG在SDS-PAGE分析上的电泳情况是其实际大小的约两倍，因此5kDa PEG的电泳情况如同10kDa蛋白。Fab是一种约50kDa的蛋白，并在SDS-PAGE凝胶上的电泳情况在未还原时为约50kDa处的单条带，或者对于还原形式为约25kDa处的两条带。所述两条带是在还原条件和SDS孵育下不再通过铰链二硫键保持在一起的重链和轻链。因此，尽管在溶液中Fab可被双聚乙二醇化，从而单个PEG连接于还原的铰链二硫键的两个半胱氨酸中的每一个，然而SDS-PAGE分析显示了25kDa重链和轻链的单聚乙二醇化。在标记为1的泳道中是蛋白分子量标准(Novex sharp protein standards，Invitrogen cat.No.LC5800)。泳道2示出了Fab本身。标记为4的泳道中示出了被DTT还原的Fab(约25kDa)。泳道5示出了5kDa聚乙二醇化结果，主要产物是对应聚乙二醇化Fab的35kDa处的带。只有少量还原Fab仍为25kDa，表明Fab大都被聚乙二醇化。泳道6示出了10kDa聚乙二醇化结果，主要产物是对应10kDa聚乙二醇化Fab的在40kDa分子量标准之上的带。泳道7示出了20kDa的结果，主要产物是对应20kDa聚乙二醇化Fab的在60kDa分子量标准之上的带。泳道3示出了无在先还原步骤的未果聚乙二醇化的结果：无聚乙二醇化产物的事实说明聚乙二醇化的反应位点是还原的二硫键。
实施例3.天门冬酰胺酶以5kDa PEG试剂9的聚乙二醇化
向1ml的1mg/ml天门冬酰胺酶(Sigma cat.no A3809)在pH 7.8的含有150mM NaCl和5mM EDTA的20mM磷酸钠缓冲液中的溶液中加入DTT(15.4mg)，震荡数秒后将所得溶液在室温下放置40分钟。然后将这1ml溶液加入经pH 7.8的含有150mM NaCl和5mM EDTA的20mM磷酸钠缓冲液预平衡的PD-10柱(GE Healthcare cat.No.17-0851-01)中，收集洗脱液作为上样级分。然后将该柱用5×1ml的新鲜磷酸盐缓冲液洗脱。将级分3和4合并得到2ml。
在去离子水中制备5kDa PEG试剂9的10mg/ml溶液，并向100μl还原的天门冬酰胺酶中加入2.0μl(游离硫醇的1.5当量的PEG)。将所述溶液震荡数秒，然后置于4℃下过夜，之后取样进行SDS-PAGE分析。结果示于图6。泳道1示出了用于估计MW的蛋白分子量标准，泳道2示出了聚乙二醇化之前的天门冬酰胺酶，泳道3示出了还原的天门冬酰胺酶与5kDa PEG试剂的反应溶液。观察到对应于两个半胱氨酸都被聚乙二醇化的强带，作为恰好在60kDa蛋白分子量标准之上的主要产物。第二条较低MW的带恰好在50kDa蛋白分子量标准之上，该带对应予两个半胱氨酸中仅之一被聚乙二醇化。在30和40kDa蛋白分子量标准之间仅有对应还原的天门冬酰胺酶的非常微弱的带，表明几乎全部蛋白都被PEG试剂9聚乙二醇化。
实施例4，以分子量5、10和20kDa的PEG试剂9对具有游离单半胱氨酸的G-CSF(粒细胞集落刺激因子)的聚乙二醇化以及与以具有马来酰亚胺官能团的5kDa PEG的比较。
将GCSF储液(0.66mg/ml在pH 6.2的含有150mM NaCl和10mM EDTA的50mM的磷酸钠缓冲液中)分为每份100μL的5部分(天然G-CSF和用于聚乙二醇化反应的4部分)。将所述部分与相对于G-CSF的1摩尔当量PEG试剂在4℃下孵育过夜。对于5kDaPEG试剂9和对于5kDa PEG马来酰亚胺(Fluka cat.no.63187)，这包括加入3.5μl的5mg/ml的PEG的去离子水溶液。对于10kDa PEG试剂9，这包括加入7μl的5mg/ml的PEG的去离子水溶液。对于20kDa PEG试剂9，这包括加入14.0μl的5mg/ml的去离子水溶液。这些聚乙二醇化反应物通过SDS-PAGE(NuPAGENovex 4-12％ Bis-Tris凝胶、MES缓冲液，均来自Invitrogen，以及Instant-Blue染色剂(Expedeon cat.No.ISB1L))进行分析。未加入PEG试剂的G-CSF呈现为在15和20kDa蛋白分子量标准之间的带。对于试剂9的5kDa聚乙二醇化，可见一条对应于5kDa单聚乙二醇化GCSF的在约30kDa处的带。对于试剂9的10kDa聚乙二醇化，可见一条对应于10kDa单聚乙二醇化G-CSF的在40kDa之下的带。对于20kDaPEG的结果，可见一条对应于20kDa单聚乙二醇化G-CSF的在50和60kDa之间的带。对于5kDa PEG马来酰亚胺反应物，除了未反应的G-CSF之外未见其他带，表明用此试剂时无反应发生。
实施例5.用10kDa和20kDa PEG试剂9对在C端含有8个组氨酸序列的IFN α-2b中的组氨酸的聚乙二醇化。
向20μl IFN α-2b的溶液(1.13mg/ml在pH 7.5的含有2mM EDTA和150mM NaCl的10mM磷酸钠缓冲液中)中加入1摩尔当量的10kD PEG试剂9(1.8μl的6mg/ml的去离子水溶液)，并将所得溶液在室温下孵育过夜。用1摩尔当量的20kD PEG试剂9(3.3μl的6.6mg/ml的去离子水溶液)重复上述过程。然后将这两个样品均通过SDS-PAGE(NuPAGE
Figure BPA00001303965000162
Novex 4-12％ Bis-Tris凝胶、MES电泳缓冲液，均来自Invitrogen，以及Instant-Blue染色剂(Expedeon cat.No.ISB1L))进行分析。结果示于图7中。在标记为1的泳道中是蛋白分子量标准。泳道2中仅起始IFN。泳道3示出了10kDa PEG试剂9反应的结果。在30和160kDa蛋白分子量标准之间有对应于缀合有1-5条PEG链的IFN的5条可区分带。泳道4示出了20kDa PEG试剂9反应的结果。在60和110kDa蛋白分子量标准之间有对应于缀合有1-3条PEG链的IFN的3条可区分带。标记为5的泳道是未染色的20kDa PEG试剂，因此无可见带。标记为6的泳道是未染色的10kDa PEG试剂，因此无可见带。
实施例6.5kDa PEG试剂9对肽(瘦素(Leptin)片段，其结构中有单游离半胱氨酸)的聚乙二醇化。
将1mg瘦素片段116-130酰胺(小鼠)(Sigma cat.no.L6788)溶解在1ml pH 7.8的含有150mM NaCl和10mM EDTA的50mM磷酸钠缓冲液中。在pH 7.8的相同缓冲液中制备5mg/ml的5kDa PEG试剂9的溶液。向50μl所述瘦素片段溶液中加入50μl缓冲液和96.1μl所述PEG溶液(相对于半胱氨酸上的游离硫醇3摩尔当量的PEG)。将所述溶液震荡数秒，然后置于4℃下过夜，之后对样品进行RP-HPLC分析。RP-HPLC由连接于JASCO HPLC***的分析柱Source 5RPC 4.6/150(Amersham bioscience cat.no.17511601)构成。缓冲液A为水+0.05％三氟乙酸(Fisher scientific，HPLC级)，缓冲液B为乙腈(Fisher scientific，HPLC级)。方法为缓冲液A以1ml/分钟的流速在30分钟内从100％到0％。在214nm和280nm监测HPLC谱。瘦素片段、PEG试剂和反应溶液的结果示于图8中。
所述瘦素片段具有11.4分钟的保留时间。在所述反应混合物中，此峰消失并被16.5分钟处的峰代替，表明此片段已被成功衍生化。
实施例7：分子量20kDa的PEG试剂9对带有多组氨酸标签的结构域抗体片段的聚乙二醇化及该片段的生物活性。
向2.7ml抗TNF-α结构域抗体片段溶液(蛋白序列取自专利WO 2005/035572，为图12中作为TAR1-5-19列出的序列，并表达为在该蛋白C端带有6组氨酸的标签；1.5mg/ml在pH 7.5的50mM磷酸钠、150mM氯化钠和350mM咪唑溶液中)中加入0.3ml PEG试剂的去离子水溶液(40mg/ml，相对于蛋白1.9摩尔当量)。将所述溶液转移到D-TubeTM透析仪(Novagen，cat.No.71508-3)中，并在4℃下相对1L pH 6.2的缓冲液(50mM磷酸钠、150mM氯化钠、20mMEDTA)透析16小时。使用在30分钟内从pH 4.5的20mM乙酸钠到pH 4.5的含有700mM氯化钠的20mM乙酸钠的线性梯度，将所得反应溶液在Resource S柱(GE Healthcare，cat.No.17-1178-01)上纯化。
收集级分，并用SDS-PAGE分析，结果示于图9中。使用了NuPAGE
Figure BPA00001303965000181
Novex 4-12％ Bis-Tris凝胶(Invitrogen cat.No.NP0321BOX)和NuPAGE MES SDS电泳缓冲液(Invitrogen cat.No.NP002)，并且以InstantBlue(Expedeon cat.No.ISB1L)染色凝胶。以蛋白分子量标准来看，PEG在SDS-PAGE分析上的电泳情况是其实际大小的约两倍，因此20kDa PEG的电泳情况如同40kDa蛋白。所述结构域抗体片段是一种约12.7kDa的蛋白。在标记为1的泳道中是蛋白分子量标准(Novex sharp protein standards，Invitrogen cat.No.LC5800)。泳道2示出仅该蛋白。标记为3的泳道是反应溶液。53kDa处的带对应于单聚乙二醇化的蛋白。双PEG-蛋白被一条约80kDa的带所表示，并且在泳道顶端有微量的多聚乙二醇化的蛋白。泳道4以没有来自未聚乙二醇化蛋白污染的单条带示出了纯化单聚乙二醇化结构域抗体片段。
实施例8.20kDa PEG试剂9对抗TNF-α的亲合体(affibody)(1个游离硫醇半胱氨酸)的聚乙二醇化和ELISA结合。
向1ml的1mg/ml抗TNF-α的亲合体(Affibody AB cat.no 10.0841.01)在pH 7.8的含有150mM NaCl和20mM EDTA的50mM磷酸钠缓冲液中的溶液中加入DTT(3.0mg)以还原任何二硫键，在震荡数秒后将所得溶液置于室温下30分钟。然后将这1ml溶液加载至经pH 6.2的缓冲液(50mM磷酸钠、150mM NaCl和20mM EDTA)预平衡的PD-10柱(GE Healthcare cat.No.17-0851-01)中。然后将该柱用5×1ml的pH 6.2的新鲜磷酸盐缓冲液洗脱。280nm的测量值表明级分3和4含有还原蛋白，将这两个级分合并得到2ml。向所述蛋白溶液中加入10μl对苯二酚饱和水溶液并充分混合。在去离子水中制备20mg/ml的20kDa PEG试剂9溶液并将73μl(相对于游离半胱氨酸硫醇1摩尔当量的PEG)加入DTT处理的亲合体中。将所述溶液震荡数秒，然后置于室温下3小时，之后取样进行SDS-PAGE分析。
在3小时后，大量的聚乙二醇化的蛋白已经形成，因此纯化此聚乙二醇化反应物而不使此反应进行完全。纯化使用Resource S阳离子交换色谱柱(GE Healthcare，cat.No.17-1178-01)实现，使用以pH4.5的20mM乙酸钠作为流动相经30分钟的线性盐梯度(0-700mMNaCl)。结果示于图10中。图10中标记为1的泳道示出了用于估计MW的蛋白分子量标准。标记为2的泳道示出了用DTT处理前的亲合体溶液。DTT存在下的亲合体示于标记为3的泳道。泳道4示出了通过PD-10柱除去DTT后的亲合体，可见对应于单体亲合体(可用于聚乙二醇化的游离硫醇半胱氨酸)和二聚体(不可用于聚乙二醇化的半胱氨酸)亲合体的两条带。标记为5的泳道示出了聚乙二醇化反应溶液。对于单聚乙二醇化的亲合体可见一条恰好在50kDa蛋白分子量标准之上的带。阳离子交换色谱纯化的单聚乙二醇化的亲合体在泳道6中显示为没有来自未聚乙二醇化的蛋白污染的单条带。
所述纯化的单聚乙二醇化产物与TNF-α的结合活性通过ELISA方法进行了分析：
将TNF-α(10ug/ml在pH 9.6的15mM Na2CO3、34.9mM NaHCO3溶液中)以100μl/孔加入96孔微量滴定板(Maxisorp，Nunc)并在4℃下孵育过夜。然后除去TNF-α，以100μl/孔加入PBS/1％ BSA并在室温下孵育1小时。然后除去PBS/1％ BSA，加入聚乙二醇化抗-TNF-α的亲合体(以0.026、0.13、0.65、3.25ug/ml在PBS/1％ BSA中)并在室温下孵育1小时。不将聚乙二醇化亲合体加入对照孔中。然后将所述板用300μl/孔的PBS/0.1％ Tween 20(PBS/T)洗涤三次。然后以100μl/孔加入抗-PEG兔抗体(Epitomics，cat no.2061-1；1∶1000稀释于1％ BSA/PBS中)并在室温下孵育1小时。用PBS/T洗涤3次后，以100μl/孔加入辣根过氧化物酶缀合的抗-兔抗体(Abcam，cat no.ab6721；1∶1000稀释于1％ BSA/PBS中)并在室温下孵育1小时。然后将孔用PBS/T洗涤3次，以100μl/孔加入3，3′，5，5′四甲基联苯氨底物(Sigma-Aldrich，cat no.T0440)。在黑暗下孵育15分钟后，以100μl/孔加入终止试剂(Sigma-Aldrich，cat no.S5689)并在650nm下读取吸光度。
示于图11的ELISA结果表明聚乙二醇化的亲合体对TNF-α的特异性结合，证实该蛋白在聚乙二醇化后保持活性。在不存在TNF-α的情况下无抗-PEG抗体的结合。
实施例9.使用20kDa PEG试剂9对在N端具有8组氨酸序列的干扰素α-2b(IFN α-2b)的组氨酸序列的聚乙二醇化。经和不经氢化硼钠还原的20kDa聚乙二醇化IFN的抗病毒活性。
向4.67ml在N端具有8组氨酸序列的IFNα-2b的溶液(1.07mg/ml在pH 7.4的含有150mM NaCl的50mM磷酸钠缓冲液中)中加入2.6摩尔当量的20kD PEG试剂9(217μl的60mg/ml的去离子水溶液)，并将所得溶液在室温下孵育过夜。在SDS-PAGE(NuPAGE 
Figure BPA00001303965000201
Novex 4-12％ Bis-Tris凝胶、MES电泳缓冲液，均来自Invitrogen，以及InstantBlue染色剂(Expedeon cat.No.ISB1L))分析后，对反应样品进行高效阳离子交换色谱(连接于Jasco HPLC***的TOSOH DEAE柱，S TSKgel DEAE-5PW，Supelco Cat No.8-07164)以纯化单聚乙二醇化的IFN α-2b。将从所述离子交换色谱柱得到的(每个1ml)级分用SDS-PAGE分析。将主要含单聚乙二醇化IFN的级分进行冷冻干燥。将冷冻干燥后得到的剩余物溶解于含有150mM NaCl和2mM硼氢化钠的50mM磷酸钠缓冲液中并仍置于室温下1小时。然后将所得溶液进行尺寸排阻色谱(HiLoad 16/60，Superdex 200，以50mM PBS作为洗脱液，流速为1.6ml/分钟并在214nm下检测)以分离单聚乙二醇化的IFN。将分离的样品用SDS-PAGE分析，结果示于图12中。图12标记为1的泳道中是蛋白分子量标准。标记为2的泳道示出仅起始IFN。泳道3示出了对应于纯化的20kDa单聚乙二醇化IFN α-2b的50和60kDa蛋白分子量标准之间的单条带。
抗病毒活性：抗病毒测定对培养在含有青霉素和链霉素的DMEM/10％胎牛血清(FCS)中的A549细胞进行。将A549细胞以0.2×106细胞/ml的浓度悬浮在DMEM/10％ FCS中，并以50μl/孔分装到96孔微量滴定板中。第二天，以2倍稀释液制备聚乙二醇化的IFN样品和天然IFN样品，并将50μl的每种稀释液加入孔中。然后将所述板孵育24小时。然后除去培养基并将细胞以在DMEM/5％ FCS中配制的脑心肌炎病毒(EMCV)接种(50μl/孔)。再将细胞孵育24小时，然后用300μl/孔的PBS洗涤并用4％甲醛/0.1％甲基紫(50μl/孔；Sigma-Aldrich，cat no.198099)染色30分钟。然后将所述板用300μl/孔的PBS洗涤两次并空气干燥。用2％ SDS溶液(50μl/孔)增溶染料并在570nm下测量吸光度。(A)未处理的或(B)用硼氢化钠处理的20kDa聚乙二醇化IFN-α2b分别显示64pg/ml和68pg/ml的活性。
实施例10.与具有马来酰亚胺官能团的市售PEG试剂相比PEG试剂9的稳定性。
在pH 7.4下通过核磁共振(NMR)光谱法比较PEG试剂9(5kDa和20kDa样品)与甲氧基聚(乙二醇)马来酰亚胺-丙酰胺(Chirotech Technology Ltd，cat.no.008-008，lot no.223126001)和α-甲氧基-ω-乙基-聚乙二醇(Iris Biotech cat.no.PEG1146，lot no.128512)的稳定性。首先通过冷冻干燥pH 7.4的含有150mM NaCl和20mM EDTA的50mM磷酸钠水溶液并用重水重新配制至相同体积，制备pH 7.4的D2O溶液。将丙酮作为标准物以1.0μl/3ml加入所述缓冲液中。将PEG试剂的样品以1μmol溶解于0.75ml所述缓冲液中，并且在4小时和25.5小时后通过400MHz NMR光谱法分析。在使用2.17ppm的丙酮标准物的完整度标准化之后，通过比较6.86ppm的完整度确定PEG马来酰亚胺样品的稳定性。在使用2.21ppm的丙酮标准物的完整度标准化之后，通过比较7.31、7.40、7.47、7.73和8.03ppm的信号的总完整度来确定PEG试剂9的稳定性。7.31、7.47和8.03ppm的峰来自如预计从PEG试剂9形成的蛋白活性PEG试剂10(图14)。在此实验过程中，对于样品1和2，PEG试剂9与蛋白活性PEG试剂10的比在整个实验过程中都介于1.46-1.77∶1。此稳定性研究结果示于表1中。在pH 7.4下所述PEG马来酰亚胺样品经过21.5小时降解了19-55％，而PEG试剂9在相同条件下未降解。
表1.比较PEG试剂9与PEG马来酰亚胺的NMR稳定性研究的结果。
Figure BPA00001303965000221
实施例11.在不同pH下含有单个游离半胱氨酸硫醇的层粘连蛋白片段925-983(Lamβ1925-933)的聚乙二醇化。
Lamβ1925-933是合成的线性九肽(Cys-Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-NH2)(Sigma cat.no.C0668)，其对应于层粘连蛋白B1链的残基925-933并含有单个半胱氨酸硫醇。在不同pH下以PEG试剂9的聚乙二醇化：将冻干的Lamβ1925-933肽(1mg)溶解于500μl去离子水中，得到2mg/ml的储液。在震荡后，将所述肽储液新鲜使用，或者分成等分保存在-80℃下至使用。将所述Lamβ1925-933储液稀释两倍，在聚乙二醇化反应混合物中形成终浓度1mg/ml(1mM)。将5kDa PEG试剂9(5mg)溶解于200μl去离子水中，得到25mg/ml的储液。在震荡后，将所述PEG试剂储液新鲜使用，或者分成等分保存在-80℃下至使用。将所述PEG储液稀释5倍，在聚乙二醇化反应混合物中形成终浓度5mg/ml(1mM)。对于pH 6.0-8.0，所述缓冲储液含有1M磷酸钠缓冲剂；对于pH 8.5-10.0，所述缓冲储液含有1M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲剂。对于所有pH值，所述缓冲储液还含有10mM EDTA和381μM对苯二酚。将所述缓冲储液稀释10倍，得到终浓度100mM的缓冲剂(磷酸钠或碳酸钠-碳酸氢钠)、1mM的EDTA和38μM的对苯二酚。
每种聚乙二醇化反应混合物均含有5μl的Lamβ1925-933储液、1μl缓冲溶液、2μl的PEG试剂溶液(对应于摩尔比为1∶1的PEG试剂与Lamβ1925-933模型肽)和2μl去离子水，以得到10μl的总反应体积。震荡数秒后，进行短暂离心(5,000×g，30秒)以将溶液收集到管下部，将反应混合物在室温下静置孵育0.25、0.5、1、2、4、16和24小时。在室温下孵育后，将含有反应混合物的管置于-80℃下保存直至用反相色谱分析。
对于反相色谱测定，使用了Source 5RPC ST 4.6/150(GE Healthcare，cat.no.17-5116-01)柱。将该柱连接于Jasco HPLC***，该***包括：Jasco PU-980 Intelligent HPLC Pump、Jasco LG-980-02 Ternary Gradient Unit、Jasco Degassys Populaire Degassing Unit、Jasco UV-970 4-λIntelligent UV Detector、用于连接至PC的A Jasco LC-NetII/ADC Interface以及Rheodyne 7725i手动注射阀。所述HPLC***使用EZchrom SI version 3.2.1 Build 3.2.1.34色谱软件包(Agilent Technologies)通过计算机进行控制。色谱分析和数据输出也使用EZchrom SI色谱数据***进行。
使用了一种三洗脱液***。洗脱液A在去离子水中含有5％乙腈(Far UV，HPLC级，Fisher cat.no.A/0627/17)和0.065％三氟乙酸(TFA)(Acros cat.no.139721000)。洗脱液B在乙腈中含有0.075％ TFA，而洗脱液C为100％乙腈。将洗脱液在用前通过声波处理脱气。洗脱程序包括在20分钟内0-64％ B梯度，然后在100％乙腈中洗涤并在洗脱液A中重平衡(表2)。在整个运行过程中保持1ml/分钟的恒定流速。在整个运行过程中记录215、250、280和350nm下的吸光度。将每个样品(10μl)解冻并短暂离心(14,000g，1分钟)，然后立即将5μl上清液注入反向色谱柱中。
表2：用于反向色谱测定的梯度洗脱程序的设置。
时间(分钟)  流速(ml/分钟)  A(％)  B(％)  C(％)
                                                     
起始        1.00           100    0      0
20.00       1.00           36     64     0
20.20       1.00           0      0      100
24.00       1.00           0      0      100
24.20       1.00           100    0      0
30.00       1.00           100    0      0
色谱图中每个峰的特性通过运行标准样品(PEG试剂、还原的和氧化的未反应肽)并通过分析型尺寸排阻色谱(SEC)估算相对大小(对于聚乙二醇化产物：肽-PEG缀合物)进行确认。用于分析SEC的柱为BioSep-SEC-S3000(300×7.8mm)分析型柱(Phenomenex，cat.no.00H-2146-KO)。所用的运行洗脱液为含有10％(v/v)乙腈的10mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)并且在整个运行过程中都保持2ml/分钟的恒定流速。
图13示出了使用1摩尔当量的5Kda PEG试剂9，在pH 6.5下的时间过程聚乙二醇化实验的色谱图。在室温下孵育15分钟后可见5个峰：PEG反应肽Lamβ1925-933(峰1)；通过形成二硫键形成的非反应肽二聚体(峰2)；PEG试剂9磺酸离去基团(峰3，图14中的化合物11)；对应于聚乙二醇化的肽产物(5kDa PEG-Lamβ1925-933缀合物)的峰(峰4)和PEG试剂9(峰6，非反应形式)。
4小时孵育后，全部游离肽(峰1)均随着聚乙二醇化完成而耗尽。还存在一些过量的活化PEG试剂的峰(峰5，图14中的化合物10)，因为一些肽形成了非反应二聚体(峰2，注意在相同浓度下PEG试剂比所述肽吸收更强)。氧化的Lamβ1925-933(峰2)不能被聚乙二醇化，因为其不具有游离硫醇并因此其对应的峰(峰2)在实验过程中保持不变。此结果与还原的肽发生的半胱氨酸硫醇聚乙二醇化一致。
PEG试剂1在pH 6.0和pH 8.0之间对Lamβ1925-933的反应性通过测量肽(峰1)向5kDa聚乙二醇化Lamβ1925-933产物(峰4)的转化率进行评定。所述肽峰结果通过将值100分配给对应于每个聚乙二醇化反应中所用肽总量的校准峰面积进行标准化，而所述产物峰结果使用对应于肽向产物的总转化率的推导最大产物峰面积进行标准化。转化率(％)定义为聚乙二醇化的肽与反应中所用肽的初始量的比例。结果示于图15中。在pH 6.0、6.5、7.0、7.5和8.0下，所有肽均被聚乙二醇化。完成速度取决于pH，pH越高则速度越快，并且反映在不同pH下形成所述反应性结构10(图14)的不同速度。
实施例12.在不同pH下PEG试剂9与市售PEG马来酰亚胺的反应性比较。
将PEG试剂9对实施例11的Lamβ1925-933肽的反应性与市售硫醇反应性PEG试剂PEG马来酰亚胺(O-(2-马来酰亚胺基乙基)-Ω’-甲基-聚乙二醇5000，Fluka cat.no.63187)进行比较。为确保PEG试剂9在实验时间范围内可立即用于反应，首先使所述试剂通过在pH7.5下孵育(2小时，4℃)形成硫醇反应性形式(试剂10，图14)并通过RP色谱分离试剂10，然后再进行肽缀合。所有肽反应均用新鲜溶解的PEG试剂进行。简而言之，所述聚乙二醇化反应溶液(反应体积(scale)10μl)在含有1mM EDTA的100mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0-8.0)或100mM碳酸钠-碳酸氢钠(pH 8.5-10.0)缓冲液中含有10μg Lamβ1925-933、50μg PEG(5kDa)试剂(对应于1∶1摩尔比的PEG试剂与Lamβ1925-933模型肽)。在室温下孵育后，将所述反应混合物通过如前面实施例11中所述的反向色谱进行分析。结果示于图16中。对于PEG试剂9(pH 9.0-10)和10(pH 6.0-8.0)，所述肽向聚乙二醇化形式的完全转化可在pH 6.0和pH 10之间在15分钟内完成。
对于PEG马来酰亚胺试剂，在15分钟后转化率最大只达到78.9％。在更高的pH下，转化率甚至更低(在pH 10下为51.2％)。在16小时后对pH 8.5下的PEG马来酰亚胺反应物再次取样，所有肽均已耗尽。
因此，在所有检测的pH下，PEG试剂9和10均比所述PEG马来酰亚胺试剂更高效。
实施例13.PEG试剂9肽缀合物的稳定性及其与来源于PEG马来酰亚胺的肽缀合物的比较。
对实施例12中由PEG试剂9和PEG马来酰亚胺制备的纯化Lamβ1925-933肽缀合物进行经过12天的比较。所述缀合物的稳定性通过使用如实施例11中所述的反向液相色谱监测PEG-肽的峰面积来确定。
用PEG试剂9进行的聚乙二醇化Lamβ1925-933的合成：使用改良的实施例11的方法(pH 6.0，使用1.6mg/ml的肽终浓度和0.4mg肽)制备所述缀合物。通过RP色谱分离所述产物。收集对应于Lamβ1925-933-PEG缀合物的洗脱峰，冻干，随后重悬浮在去离子水中。最后，加入2mM硼氢化钠(Acros Organics，cat.no.200050250)，并且在将所述样品在室温下孵育30分钟后，加入50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.5)。
用PEG马来酰亚胺进行的聚乙二醇化Lamβ1925-933的合成：使用Lamβ1925-933(0.4mg)与5kDa PEG马来酰亚胺试剂(5kDa，Fluka cat no.63187)进行聚乙二醇化。简而言之，将20μl 10×缓冲储液(含有1M磷酸钠缓冲剂(pH 8.0)和10mM EDTA)和40μl PEG试剂储液(25mg/ml在去离子水中)加入至200μl肽储液(2mg/ml在去离子水中)中。在室温下孵育1.5小时后，将产物使用如实施例11中所述的RP色谱进行纯化。将洗脱峰样品冻干，随后重悬浮在去离子水中，然后加入50mM的磷酸钠缓冲液以将pH调节至8.0。将RP色谱法用于确保所述两种PEG-肽溶液的浓度大致相等。
两种稳定样品均在室温下孵育。在12天后，将样品通过分析型RPC进行分析，并且通过如图17所示的缀合物峰的积分面积的变化确定稳定性。来源于PEG试剂9的缀合物经过12天仍保持稳定。对于来源于PEG马来酰亚胺的缀合物，只有63％保留在色谱图中，表明PEG试剂9生成更稳定的产物。
实施例14.使用两端均PEG官能化的PEG试剂12进行的聚乙二醇化。
Figure BPA00001303965000271
使用O，O’-双(2-氨基乙基)聚乙二醇6000(Fluka cat.no.14504)以与制备PEG试剂9类似的方式制备PEG试剂12，并使其与实施例11的模型肽(Lamβ1925-933)反应。将水(6μl)、2μl 10×缓冲储液(含有1M磷酸钠缓冲剂(pH 8.0)、381μM对苯二酚和10mM EDTA)和2μl PEG试剂12(25mg/ml)加入至10μl的Lamβ1925-933储液(2mg/ml在去离子水中)中。这对应于摩尔比为1∶0.375的模型肽与PEG试剂。在室温下孵育2.5小时后，将反应溶液(5μl)通过分析型RPC进行分析(如实施例11中所述)进行分析。反应溶液中的所有组分均洗脱为分离的峰：Lamβ1925-933单体在8.1分钟洗脱，氧化的Lamβ1925-933二聚体在8.9分钟洗脱，未活化的PEG试剂在17.3分钟洗脱，活化的PEG试剂在15.7分钟洗脱，离去基团11在10.1分钟洗脱。产物峰在14.2分钟洗脱。在2.5小时后，反应溶液中存在的65％的游离Lamβ1925-933已被缀合(86％的试剂12反应)，表明PEG试剂12的两个反应性末端均发生反应，并且此双官能试剂可成功地用于将一个肽连接到PEG分子的两个末端。
实施例15.聚(1-乙烯基-2-吡咯烷酮)(PVP)作为聚合物组分的应用：PVP与Lamβ1925-933模型肽的缀合。
PVP试剂的制备(3个步骤)：
步骤1：具有末端胺基团的PVP：在一个压力管中装入巯乙胺(0.028g)、二噁烷(8ml)和磁力搅拌棒。在轻微加热以形成溶液后，在室温下用氩气吹洗溶液5分钟。然后，在仍在吹洗的同时，加入1-乙烯基-2-吡咯烷酮(2.0g)，再过5分钟后加入2，2’-偶氮二(2-甲基丙腈)(0.089g)。再过2分钟后，在氩气下将所述压力管用螺帽密封，置于60℃油浴中搅拌17小时。在使所述管和内容物冷却至室温后，加入***(15ml)使聚合产物沉淀。倾出液相并将固体剩余物重溶解于丙酮(3ml)中。然后将所得丙酮溶液逐滴加入快速搅拌的***(25ml)中，并将沉淀物在有轻微真空出现的2号烧结玻璃漏斗上分离。将所述固体物用新鲜***(10ml)洗涤然后将其在室温下真空干燥(质量＝1.44g，白色固体)。
步骤2-蛋白反应性末端基团与PVP-胺的缀合：将PVP-胺(500mg)、4-(3-甲苯磺酰基丙酰)苯甲酸(图3中的结构6，166mg)和4-二甲基氨基吡啶(6mg)与无水二氯甲烷(10ml)在氩气下混合，然后伴随搅拌加入1，3-二异丙基碳化二亚胺(155μl)。将所得混合物在室温下搅拌一个周末。挥发性物质在周末蒸发，将固体剩余物重新溶解于二氯甲烷(10ml)中，然后过滤通过非吸收性原棉。然后向滤液中加入***(30ml)，并通过离心分离所得沉淀物(4600rpm，-9℃，10分钟)。倾出液相并将剩余物重新溶解在二氯甲烷(10ml)中。将此***沉淀纯化方法再重复两次并使剩余物在真空下干燥(513mg)。PVP缀合的连接基团的诊断NMR信号在CDCl3中发生在7.97、7.82、7.59和7.38处。
步骤3-PVP试剂的分级分离：将从上述步骤得到的固体物质的一部分(120mg)与pH 4.0的含有150mM NaCl的20mM乙酸钠水性缓冲液混合，然后以13,000rpm离心直至可见澄清的溶液，将液相进行0.45μm过滤。然后，在HiLoad 16/60 SuperdexTM 200制备级尺寸排阻柱(GE Healthcare)上——以1ml/分钟运行pH 4.0的含有150mM的20mM乙酸钠缓冲液，通过在峰洗脱期间每1分钟收集级分，来对所述滤液进行分级分离(加载1.9ml)。在73.9与74.9分钟之间洗脱的级分在冷冻干燥后用于蛋白缀合。所述肽反应在含有1mMEDTA、38μM对苯二酚、1.03mM Lamβ1925-933和过量PVP试剂的100mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)中进行。反应混合物通过如实施例11中所述的分析型RPC进行分析。在室温下孵育1小时后，反应混合物中约60％的游离Lamβ1925-933模型肽成功转化为Lamβ1925-933-PVP缀合物(RPC保留时间为11.3分钟)，证明可以使用PEG以外的聚合物。
实施例16.带有基于胺的离去基团L的PEG试剂的合成与应用。
Figure BPA00001303965000291
PEG试剂13的合成：PEG试剂13(图19)是以与实施例1类似的方法使用DIPC(11mg)在DMSO(5ml)中直接缀合化合物2(26mg)与5kDa mPEG-NH2(40mg)以得到灰白色固体(31mg)而制备的。所述产物(在CDCl3中)的NMR波谱在8.02和7.59ppm处发出诊断信号。
与实施例11的Lamβ1925-933模型肽的反应：所述反应在含有1mMEDTA、38μM对苯二酚、1.03mM Lamβ1925-933和3摩尔当量的PEG试剂13的100mM磷酸钠缓冲液(pH 7.5)中进行。反应混合物通过如实施例11中所述的分析型RPC进行分析。单体Lamβ1925-933在8.1分钟洗脱，二聚的Lamβ1925-933在8.9分钟洗脱，胺离去基团在9.3分钟洗脱，不含胺离去基团的PEG试剂在15.2分钟洗脱，PEG试剂13在15.75分钟洗脱，产物峰在14.2分钟。在室温下孵育1小时后，反应混合物中约10％的游离Lamβ1925-933模型肽转化为Lamβ1925-933-PVP缀合物。
实施例17.使用PEG试剂9的IL-1-Ra的硫醇聚乙二醇化及活性。
使用重组非糖基化形式的人白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1-Ra)作为模型蛋白。IL-1-Ra由153个氨基酸、两个二硫键(Cys69/Cys116和Cys66/Cys122)构成，分子量为17.3kDa并含有N-末端6组氨酸标签。
一系列硫醇聚乙二醇化在50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0和7.5)中使用1-4摩尔当量的10kDa PEG试剂9进行。由于此蛋白表达为还原形式，因此不必先还原二硫键再进行聚乙二醇化。此蛋白的浓度为0.1mg/ml。在4℃下孵育1小时后，取样进行SDS-PAGE分析，结果示于图18中。在pH 6.0和7.5下，当使用1摩尔当量的PEG试剂时，聚乙二醇化反应的主要产物是单聚乙二醇化IL-1-Ra。除了对应于未乙二醇化IL-1-Ra的带外，还可见对应于双乙二醇化产物的微弱带。增加反应中所用PEG的摩尔当量导致了双聚乙二醇化物、三聚乙二醇化物和四聚乙二醇化物的增加。然后使用1.5mg IR-1-Ra(0.2mg/ml)和1.5摩尔当量的20kDa PEG试剂9在pH 6.0的含有20mM EDTA的50mM磷酸钠中进行更大规模的pH6.0下的聚乙二醇化。将所述溶液短暂震荡并于4℃下放置2小时。聚乙二醇化的IL-1-Ra通过固定化金属亲和色谱(IMAC)和尺寸排阻色谱纯化。在IMAC之前，使用Amicon ultra-4 3000 Da MWCO超滤离心装置(Millipore，cat.no.UFC 800324)以pH 7.4的新鲜磷酸盐缓冲液通过浓缩和稀释的反复循环除去EDTA。最后，将所述样品在室温下浓缩至4ml并用2mM硼氢化钠处理30分钟，然后加入用pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)预平衡的HisTrap HP(1ml)柱(GE Healthcare cat.no.17-5247-01)中。将该柱用20ml PBS洗涤，洗脱包括在40分钟内从PBS到含有500mM咪唑的PBS的梯度。收集洗脱液的级分(1ml)并从每种级分中取一份通过SDS-PAGE分析以鉴定含有聚乙二醇化产物的级分。随后，将含有聚乙二醇化产物的级分合并在一起并通过超滤(Amicon ultra-43,000 Da MWCO)浓缩至0.6ml的终体积。将浓缩的IMAC级分加载至用pH 7.4的PBS预平衡的HiLoad Superdex 20016/600柱(GE Healthcare，cat.no.17-1069-01)中。在运行过程中将流速保持在1ml/分钟，并且单聚乙二醇化产物在约62分钟洗脱。在洗脱峰附近收集级分(1ml)并从每种级分中取一份通过SDS-PAGE进行分析。将含有纯单聚乙二醇化产物的级分通过超滤浓缩并通过SDS-PAGE再次分析以确认纯度，结果示于图19的泳道2中。该凝胶示出了对应于单聚乙二醇化蛋白的单条带，并且未见游离蛋白。
通过UV分光光度法定量后，将所述样品通过评定对MG-63细胞中IL-1β依赖的IL-6释放的抑制分析体外生物活性。将MG-63细胞以20,000细胞/孔加入100μl DMEM/10％ FCS中。在第二天，移出培养基并加入50μl/孔的新鲜培养基。将样品稀释5倍一式两份地加入(25μl/孔)，预孵育1小时，然后加入终浓度为0.3ng/ml(25μl/ml)的IL-1β。将板再孵育24小时。为评定细胞活力，向每孔中加入噻唑蓝溴化四唑(MTT；5mg/ml在DMEM中；Sigma-Aldrich cat no.M5655)并孵育3小时。将所述板以1500g离心5分钟，然后小心地吸出培养基。然后将代谢活性细胞中的甲
Figure BPA00001303965000311
产物溶解在DMSO(100μl/孔)中并在570nm下测量吸光度。结果示于图20中，表明聚乙二醇化的IL-1Ra在以试剂9进行聚乙二醇化后保留有抑制活性。
实施例18.使用PEG试剂9对IL-1Ra的多组氨酸序列的聚乙二醇化以及聚乙二醇化蛋白的活性。
在用硫酸铜将实施例17的IL-1Ra的游离半胱氨酸氧化为二硫键之后，也将所述蛋白在多组氨酸标签上聚乙二醇化，聚乙二醇化反应如下：将硫酸铜(1mM)加入2.5ml的IL-1Ra(0.6mg/ml，1.5mg IL-1-Ra)在含有200mM NaCl的50mM Tris·HCl(pH 8.0)的溶液中。在4℃下孵育16小时后，加入25mM EDTA并将样品加载至用pH 7.5的含有20mM EDTA的50mM磷酸钠缓冲液预平衡的PD-10柱(GE Healthcare)中。然后将该柱用3.5ml新鲜磷酸盐缓冲液洗脱。用于聚乙二醇化的蛋白浓度为0.43mg/ml，pH为7.4并在4℃下孵育16小时。PEG试剂9(20kDa)为蛋白的1.5摩尔当量。将反应物在4℃下孵育16小时。将单聚乙二醇化物使用与实施例17中所述相同的色谱和硼氢化钠处理进行分离。产物的SDS-PAGE结果示于图19的泳道2中，其中未见游离蛋白。产物的生物活性通过如实施例17中所述的测定对MG-63细胞中的IL-1β依赖的IL-6释放的抑制来评定，结果示于图20中。聚乙二醇化IL-1Ra在测定中具有抑制活性。
实施例19：PEG试剂合成：10kDa PEG试剂15的合成。
聚乙二醇化的4-(3-(2-羟乙基磺酰基)丙酰基)苯甲酸试剂15是以与实施例1中对聚乙二醇化的4-(3-甲苯磺酰基丙酰)苯甲酸9的合成所述相似的方法由4-(3-(2-羟乙基磺酰基)丙酰基)苯甲酸14制备的，如图21所示。首先，4-(3-(2-羟乙基磺酰基)丙酰基)苯甲酸14是以与4-(3-甲苯磺酰基丙酰)苯甲酸类似的方法但是用巯基乙醇代替4-甲基苯硫酚(步骤2，实施例1)而制备的。NMR 14(400MHz)δ3.35(t，2H，COCH2)，3.5(重叠m，4H，CH2SO2CH2)，3.8(t，2H，CH2OH)，5.2(br s，CH2OH)，8.05(m，4H，芳香族CH)，13.4(br s，1H，COOH)。对于PEG缀合步骤，将砜14(143mg)和O-(2-氨基乙基)-O′-甲基-PEG(MW 10kDa，1g，BioVectra)溶解于干甲苯(5ml)中。将溶剂在真空下不加热除去，然后将干固体剩余物在氩气下重新溶解于干二氯甲烷(10ml)中。在氩气下向在冰浴中冷却的所得溶液中缓慢加入二异丙基碳化二亚胺(DIPC，87mg)。然后将反应混合物在室温下搅拌过夜(15小时)。然后在真空下除去挥发性物质(30℃，水浴)以得到固体剩余物，将所述固体剩余物伴随轻微加热(35℃)重新溶解于丙酮(45ml)。将所述溶液用非吸收性原棉过滤以除去不溶物质。然后将所述溶液在干冰浴中冷却以得到白色沉淀，将所述沉淀通过离心(4600rpm，30分钟)分离。倾去液相，将此沉淀步骤重复三次。然后将所得灰白色固体在真空下干燥，得到PEG试剂15(1g)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.30(t，2H，COCH2)，δ3.40(s，3H，PEG-OCH3)，δ3.40-3.85(br m，PEG)，δ3.50(重叠m，2 x 2H，CH2SO2CH2)，δ3.80(t，2H，CH2OH)，δ7.95，δ8.05(2 x d，2 x 2H，羧酸部分的ArH)。
不同PEG分子量的类似PEG试剂通过相同的通用方法制备。因此，5kDa PEG通过砜14(256mg)、O-(2-氨基乙基)-O′-甲基-PEG(5kDa，1g，Biovectra)和DIPC(174mg)在干二氯甲烷(15ml)中的反应制备，在丙酮沉淀纯化过程后得到灰白色固体15(1g)。
实施例20：PEG试剂合成：10kDa PEG试剂17的合成。
PEG试剂17是由PEG试剂9按如下制备的(图22)：将PEG试剂9(10kDa，75mg)与巯基琥珀酸(6mg)和碳酸氢钠(20mg)在去离子水(2ml)中搅拌约18小时。然后在旋转蒸发器上除去挥发性物质，将固体剩余物重新溶解于温的丙酮(4ml)中并将不溶物通过经非吸收性原棉的过滤除去。然后通过在干冰浴中冷却所述溶液使产物从丙酮中沉淀出来，然后通过在离心后倾去液相而分离。再将所述丙酮沉淀重复3次，然后在真空下干燥所述固体以得到16(51mg)。然后通过将化合物16(40mg)与过氧硫酸氢钾在1∶1甲醇∶水(1ml)中混合约18小时而将化合物16氧化为砜形式17。然后用丙酮(10ml)稀释混合物，然后将不溶物通过在重力下经非吸收性原棉的过滤除去。在旋转蒸发器上将匀质滤出液蒸发至干，然后重新溶解在加入2滴1N HCl的丙酮(2ml)中，然后通过单次如对16(mg)所述的丙酮沉淀进行分离。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.24-3.08(重叠m，CH2CH，COCH2)，3.38(s，PEG-OCH3)，3.44-3.84(br s，重叠m，PEG & CH2SO2)，4.44(dd，SO2CH)，7.45(br s，NH)，7.98 & 8.06(2 x d，4H，羧酸部分的ArH)。

Claims (20)

1.一种如下通式的化合物：
X-[Q-W-(CH＝CH)n-(CH2)2-L]m    (I)
其中X代表一个聚合物；Q代表一个连接基团；W代表一个吸电子基团；n代表0或1-4中的一个整数；L代表一个离去基团；m代表1-8中的一个整数。
2.权利要求1的化合物，其中Q代表直接键合、一个亚烷基基团或者一个任选被取代的芳基或杂芳基基团，所述基团的任一种都可被一个或多个如下原子或基团终止或中断：氧原子、硫原子、-NR基团(其中R代表一个氢原子或一个烷基、芳基或烷基-芳基基团)、酮基团、-O-CO-基团、-CO-O-基团和/或-NR.CO-基团。
3.权利要求2的化合物，其中Q代表一个任选被取代的在邻近所述聚合物X处被NR.CO-基团终止的芳基或杂芳基基团。
4.前述权利要求任一项的化合物，其中X为聚亚烷基二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚噁唑啉、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、HPMA共聚物、聚酯、聚缩醛、聚(原酸酯)、聚碳酸酯、聚(碳酸亚胺酯)、聚酰胺、二乙烯基醚-马来酸酐和苯乙烯-马来酸酐的共聚物、多糖或蛋白。
5.权利要求4的化合物，其中X为聚亚烷基二醇。
6.权利要求5的化合物，其中X为聚乙二醇。
7.前述权利要求任一项的化合物，其中W代表一个酮基团CO、一个酯基团-O-CO-或一个砜基团-SO2-。
8.前述权利要求任一项的化合物，其中n是0。
9.前述权利要求任一项的化合物，其中L代表-SR、-SO2R、-OSO2R、-N+R3、-N+HR2、-N+H2R、卤素或
Figure FPA00001303964900021
其中R代表一个氢原子或一个烷基、芳基或烷基-芳基基团，
Figure FPA00001303964900022
代表一个含有至少一个吸电子取代基的被取代芳基。
10.前述权利要求任一项的化合物，其具有通式：
X-[NH-CO-Ar-W-(CH＝CH)n-(CH2)2-SO2R’]m    (Ia)
其中Ar代表一个未被取代或被取代的芳基基团，R’代表一个氢原子或一个未被取代或被取代的烷基、芳基或烷基-芳基基团。
11.权利要求10的化合物，其中Ar代表任选被一个或多个相同或不同的选自如下基团的取代基取代的苯基基团：烷基，-CN、-NO2、-CO2R、-COH、-CH2OH、-COR、-OR、-OCOR、-OCO2R、-SR、-SOR、-SO2R、-NHCOR、-NRCOR、-NHCO2R、-NR.CO2R、-NO、-NHOH、-NR.OH、-C＝N-NHCOR、-C＝N-NR.COR、-N+R3、-N+H3、-N+HR2、-N+H2R、卤素、-C≡CR、-C＝CR2和一C＝CHR，其中每个R均独立地代表一个氢原子或一个烷基、芳基或烷基-芳基基团。
12.权利要求11的化合物，其中Ar代表一个苯基基团，R’代表一个对甲苯基基团。
13.一种使含有硫醇或氨基基团的分子缀合于一种聚合物的方法，包括使所述分子与前述权利要求任一项的化合物反应。
14.权利要求13的方法，其中所述分子为一种肽或一种蛋白。
15.一种通式II的化合物：
X-[Q-W′-(CH＝CH)n-(CH2)2-Z]m    (II)
其中X、Q、n和m具有前述权利要求任一项给出的含义，Z代表通过一个硫醇或氨基基团缀合的分子，W′代表一个吸电子部分或可通过还原吸电子部分制备的部分。
16.权利要求15的化合物，其具有通式：
X-[NH-CO-Ar-W′-(CH＝CH)n-(CH2)2-Z]m    (IIa)
其中Ar代表一个未被取代或被取代的芳基基团。
17.权利要求16所要求的化合物，其中Ar代表任选被一个或多个相同或不同的选自如下基团的取代基取代的苯基：烷基，-CN、-NO2、-CO2R、-COH、-CH2OH、-COR、-OR、-OCOR、-OCO2R、-SR、-SOR、-SO2R、-NHCOR、-NRCOR、-NHCO2R、-NR.CO2R、-NO、-NHOH、-NR.OH、-C＝N-NHCOR、-C＝N-NR.COR、-N+R3、-N+H3、-N+HR2、-N+H2R、卤素、-C≡CR、-C＝CR2和-C＝CHR，其中每个R均独立地代表一个氢原子或一个烷基、芳基或烷基-芳基基团。
18.权利要求17的化合物，其中Ar代表一个苯基基团。
19.权利要求17或18的化合物，其中Z为一种肽或一种蛋白。
20.一种药物组合物，包含权利要求15-19任一项的化合物和可药用载体。
CN200980128495.3A 2008-07-21 2009-07-17 用于缀合生物分子的新试剂和方法 Expired - Fee Related CN102099058B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0813339.9 2008-07-21
GB0813339A GB0813339D0 (en) 2008-07-21 2008-07-21 Novel reagents and method for conjugating biological molecules
GB0905762A GB0905762D0 (en) 2009-04-02 2009-04-02 Novel reagents and method for conjugating biological molecules
GB0905762.1 2009-04-02
PCT/GB2009/001764 WO2010010324A1 (en) 2008-07-21 2009-07-17 Novel reagents and method for conjugating biological molecules

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102099058A true CN102099058A (zh) 2011-06-15
CN102099058B CN102099058B (zh) 2014-10-22

Family

ID=41226122

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200980128495.3A Expired - Fee Related CN102099058B (zh) 2008-07-21 2009-07-17 用于缀合生物分子的新试剂和方法

Country Status (10)

Country Link
US (4) US8969626B2 (zh)
EP (2) EP2374481B1 (zh)
JP (2) JP5622117B2 (zh)
KR (1) KR101763559B1 (zh)
CN (1) CN102099058B (zh)
AU (1) AU2009275358C1 (zh)
DK (2) DK2326349T3 (zh)
ES (2) ES2536882T3 (zh)
PL (1) PL2326349T3 (zh)
WO (1) WO2010010324A1 (zh)

Families Citing this family (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0316294D0 (en) 2003-07-11 2003-08-13 Polytherics Ltd Conjugated biological molecules and their preparation
CN105838699A (zh) 2006-12-15 2016-08-10 巴克斯艾尔塔公司 具有延长的体内半衰期的因子VIIa-聚唾液酸结合物
JP5622117B2 (ja) 2008-07-21 2014-11-12 ポリテリクスリミテッド 生体分子を接合するための新規な試薬及び方法
EP2403538B1 (en) 2009-03-04 2017-10-04 Polytherics Limited Conjugated proteins and peptides
CN102573920B (zh) 2009-07-27 2015-01-14 利普森技术有限公司 非凝血蛋白的糖基多唾液酸化
US8637640B2 (en) 2009-07-27 2014-01-28 Baxter International Inc. Blood coagulation protein conjugates
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
ES2856055T3 (es) 2009-07-27 2021-09-27 Baxalta GmbH Glicopolisialilación de proteínas diferentes de las proteínas de coagulación de la sangre
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
GB201007356D0 (en) * 2010-04-30 2010-06-16 Leverton Licence Holdings Ltd Conjugated factor VIIa
GB201007357D0 (en) * 2010-04-30 2010-06-16 Leverton Licence Holdings Ltd Conjugated factor VIII
US8945897B2 (en) 2010-07-26 2015-02-03 Baxter International Inc. Materials and methods for conjugating a water soluble fatty acid derivative to a protein
US9339554B2 (en) * 2010-09-21 2016-05-17 Cristal Delivery B.V. Tunable, biodegradable linker molecules for transient conjugation of components in drug delivery systems, and drug delivery systems prepared therewith
WO2012166622A1 (en) * 2011-05-27 2012-12-06 Baxter International Inc. Therapeutic proteins with increased half-life and methods of preparing same
JP5841768B2 (ja) * 2011-08-05 2016-01-13 花王株式会社 脂肪蓄積抑制剤
JP2015512927A (ja) 2012-04-16 2015-04-30 カンタブ バイオファーマシューティカルズ パテンツ リミテッド 最適化された皮下治療薬
US9650331B2 (en) 2012-06-18 2017-05-16 Polytherics Limited Conjugation reagents
GB201210770D0 (en) * 2012-06-18 2012-08-01 Polytherics Ltd Novel conjugation reagents
KR102306490B1 (ko) 2013-03-15 2021-09-28 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 생물학적 활성 분자, 그의 접합체 및 치료 용도
ES2741207T3 (es) 2013-03-15 2020-02-10 Zymeworks Inc Compuestos citotóxicos y antimitóticos, y métodos de uso de los mismos
BR112016004023A2 (pt) 2013-08-26 2022-11-16 Regeneron Pharma Composição, métodos para preparar uma composição e para tratar uma doença, e, composto
PL3086815T3 (pl) 2013-12-27 2022-06-13 Zymeworks Inc. Układy łącznikowe dla koniugatów leków zawierające ugrupowanie sulfonamidowe
US9475875B2 (en) 2014-03-11 2016-10-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-EGFRvIII antibodies and uses thereof
IL287645B2 (en) 2014-09-17 2024-04-01 Zymeworks Bc Inc Cytotoxic and anti-mitotic compounds and methods for their use
KR20230158134A (ko) 2014-10-14 2023-11-17 폴리테릭스 리미티드 Peg의 일부를 포함하는 이탈기를 포함하는 시약을 사용한, 펩티드 또는 단백질의 접합방법
BR112017020149A8 (pt) 2015-03-27 2023-05-02 Regeneron Pharma Derivados de maitansinoide, conjugados dos mesmos e métodos de uso
NZ737726A (en) 2015-07-06 2023-03-31 Regeneron Pharma Multispecific antigen-binding molecules and uses thereof
CN108602890A (zh) 2015-12-11 2018-09-28 瑞泽恩制药公司 用于减少或预防对egfr和/或erbb3阻滞剂具有抗性的肿瘤生长的方法
SG11201806322QA (en) 2016-01-25 2018-08-30 Regeneron Pharma Maytansinoid derivatives, conjugates thereof, and methods of use
US10821160B2 (en) * 2016-03-01 2020-11-03 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois L-asparaginase variants and fusion proteins with reduced L-glutaminase activity and enhanced stability
WO2017190079A1 (en) 2016-04-28 2017-11-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of making multispecific antigen-binding molecules
WO2018002902A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Glaxosmithkline Intellectual Property (No.2) Limited Antibody-drug conjugates and therapeutic methods using the same
CA3037732A1 (en) 2016-09-23 2018-03-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-steap2 antibodies, antibody-drug conjugates, and bispecific antigen-binding molecules that bind steap2 and cd3, and uses thereof
CN110036032B (zh) 2016-09-23 2023-09-05 瑞泽恩制药公司 抗muc16(粘蛋白16)抗体
IL266353B2 (en) 2016-11-08 2024-03-01 Regeneron Pharma Steroids and their protein conjugates
TWI782930B (zh) 2016-11-16 2022-11-11 美商再生元醫藥公司 抗ｍｅｔ抗體，結合ｍｅｔ之雙特異性抗原結合分子及其使用方法
IL270594B2 (en) 2017-05-18 2024-06-01 Regeneron Pharma Protein conjugates - a drug of cyclodextrin
MX2020006994A (es) 2018-01-08 2020-11-06 Regeneron Pharma Esteroides y conjugados de anticuerpos de los mismos.
AU2019262953A1 (en) 2018-04-30 2020-11-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antibodies, and bispecific antigen-binding molecules that bind HER2 and/or APLP2, conjugates, and uses thereof
KR20210008008A (ko) 2018-05-09 2021-01-20 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 항-msr1 항체 및 이의 사용 방법
WO2019222663A1 (en) 2018-05-17 2019-11-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-cd63 antibodies, conjugates, and uses thereof
BR112021012233A2 (pt) 2018-12-21 2021-09-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Análogos de rifamicina e conjugados de anticorpo-fármaco dos mesmos
SG11202108525VA (en) 2019-02-21 2021-09-29 Regeneron Pharma Methods of treating ocular cancer using anti-met antibodies and bispecific antigen binding molecules that bind met
EP4031574A1 (en) 2019-09-16 2022-07-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Radiolabeled met binding proteins for immuno-pet imaging
US11814428B2 (en) 2019-09-19 2023-11-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-PTCRA antibody-drug conjugates and uses thereof
AU2021228225A1 (en) 2020-02-28 2022-09-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bispecific antigen binding molecules that bind HER2, and methods of use thereof
CA3179154A1 (en) 2020-04-16 2021-10-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Diels-alder conjugation methods
IL299153A (en) 2020-07-13 2023-02-01 Regeneron Pharma Camptothecin analogs conjugated to a glutamine residue in protein, and their uses
MX2023002974A (es) 2020-09-14 2023-05-25 Regeneron Pharma Conjugados de anticuerpo-farmaco que comprenden peptidomimeticos glp1 y usos de los mismos.
JP2023547323A (ja) 2020-10-22 2023-11-10 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 抗ｆｇｆｒ２抗体及びその使用方法
CN113461929B (zh) * 2021-07-13 2023-04-21 浙江倍合德制药有限公司 一种tpgs系列产品的精制提纯方法
US20230287138A1 (en) 2022-01-12 2023-09-14 Regneron Pharmaceuticals, Inc. Protein-drug conjugates comprising camptothecin analogs and methods of use thereof
US20230330254A1 (en) 2022-03-11 2023-10-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-glp1r antibody-tethered drug conjugates comprising glp1 peptidomimetics and uses thereof
US20240218011A1 (en) 2022-07-21 2024-07-04 Firefly Bio, Inc. Glucocorticoid receptor agonists and conjugates thereof
WO2024138000A1 (en) 2022-12-21 2024-06-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Prodrugs of topoisomerase i inhibitor for adc conjugations and methods of use thereof

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US147443A (en) * 1874-02-10 Improvement in lamp-extinguishers
US6552170B1 (en) * 1990-04-06 2003-04-22 Amgen Inc. PEGylation reagents and compounds formed therewith
US5414135A (en) * 1991-12-30 1995-05-09 Sterling Winthrop Inc. Vinyl sulfone coupling of polyoxyalkylenes to proteins
US5446090A (en) * 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
US5877224A (en) 1995-07-28 1999-03-02 Rutgers, The State University Of New Jersey Polymeric drug formulations
GB9713979D0 (en) * 1997-07-03 1997-09-10 Univ Nottingham Method for attaching peg to macromolecules
US6958212B1 (en) * 1999-02-01 2005-10-25 Eidgenossische Technische Hochschule Zurich Conjugate addition reactions for the controlled delivery of pharmaceutically active compounds
US6828412B1 (en) 1999-09-03 2004-12-07 School Of Pharmacy, University Of London Degradable polymers
ATE297954T1 (de) 1999-09-08 2005-07-15 Polytherics Ltd Polymere mit uniformem molekulargewicht
KR101025143B1 (ko) * 2002-12-31 2011-04-01 넥타르 테라퓨틱스 가수분해상으로 안정한 말레이미드－종결 중합체
JP4009721B2 (ja) * 2003-05-23 2007-11-21 独立行政法人産業技術総合研究所 イオン結合性ポリマー含有基板、該基板を含有する検出用センサー及び病原菌又は病原菌が生産する毒素の検出方法
GB0316294D0 (en) * 2003-07-11 2003-08-13 Polytherics Ltd Conjugated biological molecules and their preparation
EP1828244A2 (en) 2004-12-22 2007-09-05 Kuros Biosurgery AG Michael-type addition reaction functionalised peg hydrogels with factor xiiia incorporated biofactors
KR20100090684A (ko) 2007-10-09 2010-08-16 폴리테릭스 리미티드 신규한 접합 단백질 및 펩티드
JP5622117B2 (ja) * 2008-07-21 2014-11-12 ポリテリクスリミテッド 生体分子を接合するための新規な試薬及び方法
EP2403538B1 (en) * 2009-03-04 2017-10-04 Polytherics Limited Conjugated proteins and peptides
GB0912485D0 (en) 2009-07-17 2009-08-26 Polytherics Ltd Improved conjugation method

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BROCCHINI ET AL: "Disulfide bridge based PEGylation of proteins", 《ADVANCED DRUG DELIVERY REVIEWS》 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP5622117B2 (ja) 2014-11-12
US20140081047A1 (en) 2014-03-20
KR20110053430A (ko) 2011-05-23
DK2326349T3 (en) 2015-05-26
AU2009275358C1 (en) 2015-09-24
ES2536882T3 (es) 2015-05-29
US20110136723A1 (en) 2011-06-09
KR101763559B1 (ko) 2017-08-14
US8969626B2 (en) 2015-03-03
CN102099058B (zh) 2014-10-22
EP2374481A2 (en) 2011-10-12
JP2011252167A (ja) 2011-12-15
AU2009275358B2 (en) 2015-05-28
US20110262994A1 (en) 2011-10-27
US20150148544A1 (en) 2015-05-28
EP2374481A3 (en) 2012-06-13
WO2010010324A1 (en) 2010-01-28
US9896412B2 (en) 2018-02-20
DK2374481T3 (en) 2016-02-01
EP2326349A1 (en) 2011-06-01
JP5626655B2 (ja) 2014-11-19
ES2560807T3 (es) 2016-02-22
US8618333B2 (en) 2013-12-31
EP2326349B1 (en) 2015-02-25
EP2374481B1 (en) 2015-11-04
AU2009275358A1 (en) 2010-01-28
PL2326349T3 (pl) 2015-08-31
JP2011528706A (ja) 2011-11-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102099058B (zh) 用于缀合生物分子的新试剂和方法
CN101820920B (zh) 新的缀合蛋白质和肽
EP2403538B1 (en) Conjugated proteins and peptides
AU2013279079B2 (en) Conjugation reagents
EP1648518B1 (en) Conjugated biological molecules and their preparation
US10174125B2 (en) Conjugation reagents

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20141022

Termination date: 20180717