CN105287383A - 新型米托蒽醌脂质体联合化疗药物在抗肿瘤治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了新型米托蒽醌脂质体联合化疗药物在抗肿瘤治疗中的应用。在国际上首次制备心磷脂等组分的米托蒽醌脂质体新制剂并将其用于与其他临床常规一线化疗药物联用应用在抗肿瘤治疗中。本发明阐述了新型脂质体制剂的制备方法及表征研究，该制剂具有包封率高、粒径分布均匀、稳定性好、延长化疗药物半衰期、降低毒副作用等特点；并且在乳腺癌和白血病肿瘤动物模型中，米托蒽醌脂质体新制剂与其他化疗药物联合应用的抗肿瘤疗效比其他治疗方法的疗效更加显著。

Description

新型米托蒽醌脂质体联合化疗药物在抗肿瘤治疗中的应用

技术领域

本发明公开了新型米托蒽醌脂质体联合化疗药物在抗肿瘤治疗中的应用。涉及米托蒽醌脂质体制剂与其他临床常规一线化疗药物联合***的应用，还涉及米托蒽醌脂质体的制备方法及其相关的表征研究。

背景技术

在中国，癌症的健康负担逐年增长，每年超160万人被诊断为癌症，120万人因癌症而死亡。值得关注的是，全球有20％的新发癌症病人在中国，24％的癌症死亡病人在中国。目前中国每死亡5人，即有1人是死于癌症；而在0～64岁人口中，每死亡4人，即有1人死于癌症，癌症呈现年轻化、发病率和死亡率“三线”走高的趋势。世界卫生组织(WHO)2014年发表了《全球癌症报告2014》，称2012年全球癌症患者和死亡病例都在令人不安地增加，新增癌症病例有近一半出现在亚洲，其中大部分在中国，中国新增癌症病例高居第一位。2012年全世界共新增1400万癌症病例并有820万人死亡。其中，中国新增307万癌症患者并造成约220万人死亡，分别占全球总量的21.9％和26.8％。报告预测全球癌症病例将呈现迅猛增长态势，由2012年的1400万人，逐年递增至2025年的1900万人，到2035年将达到2400万人。

目前，肿瘤的治疗方法仍然是外科手术治疗、放疗和化学疗法。对于处于中晚期阶段肿瘤已经转移的患者、接受手术后的肿瘤患者、以及无法进行手术或放疗的肿瘤患者，化疗药物可以直接杀死肿瘤细胞或控制肿瘤细胞，在肿瘤的治疗中占有非常重要的地位。虽然抗肿瘤的化学药物治疗取得了巨大进步，但药物在***的同时所产生的毒副作用严重降低了患者的生命质量和依从性。药物剂型对药物的释放、体内分布以及药物疗效的发挥起着极其重要的作用，选择合适的药物载体以改善药物的释放及分布从而减少药物的毒副作用，最大效应地发挥疗效成为人们关注的焦点。

脂质体作为药物载体具有保护药物在循环***中不被降解、使药物靶向于网状内皮***、延长药效、降低药物毒性、提高疗效、避免药物耐受性、改变给药途径等优点，同时脂质体制剂所应用的制剂原料具有生物可降解性，不会对机体产生免疫反应及各种毒副作用，因此是一种良好的药物载体***，具有病毒类载体无法比拟的优点，因而受到医药界的广泛关注。

米托蒽醌(MitoxantroneHydrochloride，MTO)(分子式：C22H28N4O6·2HCl，分子量：517.41)是一种蒽醌类药物，其结构及抗癌作用与阿霉素相近，因其无氨基糖结构，不产生自由基，且有抑制脂质过氧化作用，故对心脏毒性较低。其主要作用机制为拓扑异构酶II抑制剂，可嵌入DNA和形成交叉键链，抑制核酸合成而导致细胞死亡，为细胞周期非特异性药物。因它可杀灭任何细胞周期的癌细胞，增殖与非增殖细胞均受到抑制。***细胞比休止细胞对本品更敏感，S后期对本品最敏感。临床上主要用于急性非淋巴细胞白血病和晚期乳腺癌以及非霍奇金淋巴瘤有很高的抗肿瘤活性，对肺癌等10余种恶性肿瘤也有疗效。在2000年，美国食品药品监督管理局(FDA)又批准了MTO用于多发性硬化症(MS)的治疗。虽然MTO在临床上具有较好的抗肿瘤效果，但其严重的不良反应(骨髓抑制、剂量限制性心脏毒性、胃肠毒性、乏力等)限制了其临床使用。

目前，米托蒽醌脂质纳米粒等剂型在国内外均有研究，但效果均不理想。国内在此领域研究还处于刚刚起步阶段，应用含心磷脂的脂质体包封米托蒽醌的脂质体制剂除本课题组相关成果外还未见其他报道，且尚未有米托蒽醌脂质体与其他化疗药物联合应用的相关报道。

本项目研究的目的旨在解决米托蒽醌在临床应用过程中的局限性，即利用脂质体这一药物载体，在国际上首次应用含心磷脂的脂质体对米托蒽醌进行包裹，制备出一种新型的米托蒽醌脂质体制剂，从降低药物在体内的清除速率，改变药物的代谢途径，降低药物对机体的毒副作用，并提高其抗肿瘤疗效。

临床上，与单一用药相比，联合化疗有明显的优越性。联合使用不同作用机制的化疗药物，旨在杀灭肿瘤细胞方面产生协同作用或增效作用，从而提高抗肿瘤疗效。同时，通过使用数种药物，避免了单独使用一种药物剂量过大、时间过长所导致的该药物毒副作用明显增加的可能性；长期、反复使用同一种药物还是导致肿瘤耐药的因素之一。联合化疗可以去除耐药因素，从而减少了癌细胞产生耐药的可能性；大多数化疗药物不能或者极少进入脑内，因而无法起到预防或者治疗脑转移的作用，联合使用一种能进入脑内的化疗药物，则可弥补许多药物在该方面的缺陷。

发明内容

本发明公开了一种高包封率、高稳定性的新型米托蒽醌脂质体纳米制剂。该制剂应符合包封率高、稳定性好、粒径均一、临床给药操作简单、可重复放大生产等要求。

上述米托蒽醌脂质体制剂可以进一步降低米托蒽醌的药物毒性，提高药物治疗指数。

本发明不仅可以解决米托蒽醌在临床应用过程中的局限性，同时提供了联合其他化疗药物达到更好的抗肿瘤疗效的新用途。

上述米托蒽醌脂质体可联合的化疗药物包括烷化剂，如尼莫司汀、卡莫司汀、洛莫司汀、环磷酰胺、异环磷酰胺、甘磷酰芥等；抗代谢药，如去氧氟鸟苷、多西氟鸟啶、5-氟尿嘧啶、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、氟鸟苷、替加氟、吉西他滨、卡莫氟、羟基脲、甲氨蝶呤、优福定、安西他滨等；抗肿瘤抗生素，如放线菌素D、多柔比星、柔红霉素、表柔比星、丝裂霉素、培洛霉素、平阳霉素、吡柔比星等；植物类抗癌药，如伊立替康、三尖杉酯碱、羟基喜树碱、长春瑞宾、紫杉醇、多西紫杉醇、拓扑替康、长春新碱、长春地辛、长春酰胺、长春碱、替尼泊苷、依托泊苷、榄香烯等；激素及内分泌类药物，如阿他美坦、阿那曲唑、氨鲁米特、他莫昔芬、福美坦等；杂类，如门冬酰胺酶、顺铂、卡铂、达卡巴嗪、奥沙利铂、乐沙定、丙卡巴肼等；生物反应调节剂，如干扰素、香菇多糖、胸腺肽等。

上述米托蒽醌脂质体可联合的化疗药物为以上化疗药物的一种或多种。

上述米托蒽醌脂质体的制备方法可以选择常用的脂质体制备方法，任意方法均可，只要所涉及的制备方法不影响脂质体对米托蒽醌药物的包封率及相关表征，本发明主要采用薄膜水化法及硫酸铵梯度法制备米托蒽醌脂质体，并通过冻干法进行中试放大研究。

上述薄膜水化法，即将磷脂和胆固醇按照一定比例混合，溶解于氯仿-乙醇溶液中，将混合物利用旋转蒸发仪在真空条件下干燥，形成脂质薄膜后再继续干燥10min。其次将一定浓度的米托蒽醌盐溶液加入到脂质膜上使脂质膜水化1～3h，之后进行涡旋振荡至混悬液处于均质状态，再对样品进行超声处理以获得脂质体包裹的米托蒽醌，即米托蒽醌脂质体制剂。

上述硫酸铵梯度法，即将磷脂和胆固醇按照一定比例溶解于有机溶剂中，在氮气流的作用下形成薄膜，除去有机溶剂。利用硫酸铵溶液对脂质膜进行水化1～3h。对混合物超声即可得到空白脂质体。其次，将空白脂质体装于透析袋内，置于盛有生理盐水的锥形瓶中透析，以建立硫酸铵梯度。最后，在透析后脂质体中加入米托蒽醌氯化钠溶液进行药物装载，用生理盐水调节米托蒽醌浓度。

上述冻干法是指采用低温干燥技术，通过反复包封、冻干和重新融合来实现较高的包封率。冻干法工艺稳定、适合于工业化生产，质量易于控制和产品稳定性好。即将磷脂与胆固醇以一定比例溶于氯仿，通氮气旋转蒸发至干后加入含2％聚乙烯吡咯酮，pH7.4的磷酸盐缓冲液浸泡2h。涡旋混合器下震荡10min使之完全混溶后分装入小瓶，在冻干机中程序冷冻干燥24h后取出小瓶，密封保存于常温或4℃冰箱中。制备米托蒽醌脂质体时，将1mg/ml的米托蒽醌盐溶液，与冻干的脂质混合，药脂摩尔比控制在1:15。混合物在室温下水化2h，之后超声处理10分钟即得米托蒽醌脂质体制剂。

上述制备米托蒽醌脂质体所用磷脂材料包括天然的、人工合成的、及半合成的生物相容性材料。材料可以是亲水性的或疏水性的。可选用带有正电荷或带有负电荷及电中性的材料作为脂质体的制备材料。合适的脂质体制备材料包括：磷脂类、脂肪酸类、甾醇类等。若对脂质体进一步优化，可选用心磷脂、磷脂酰胆碱、胆固醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇，生育酚等，更优选为带负电磷脂如心磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇等。

上述脂质体的选择配方可包括卵磷脂、胆固醇、心磷脂、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、硬脂胺等。更为优化的脂质体制备方案的材料选择可包括心磷脂、卵磷脂、胆固醇。

上述米托蒽醌脂质体制备过程中所需溶剂可以是极性的、弱极性的、中性的或非极性的。例如可选用：乙酸、丙酸、氯仿、丙酮、三乙胺等，也可包括无菌注射用水。溶剂的选择标准应该是溶剂易蒸发去除而不产生残留，或其残留量在允许限度之内。

上述脂质体中米托蒽醌与脂质的相对摩尔质量比有一个合适的范围，优选的范围在1:1-30更为优选的范围在1:1-25、更优选的范围在1:1-20、最优选比例在1:15。

在脂质体制备过程中可进行脂膜的水化等操作诱导脂质体的形成，水化的溶液可选择极性溶液，具体可包括生理盐水溶液及PBS溶液，溶液可进一步溶有米托蒽醌。溶液加入后可以选择多种混合方式进行脂膜对药物的包裹。混旋振荡过程应为脂质体的形成提供足够的剪切力，例如可采用磁力搅拌，涡旋振荡、超声处理等方式进行脂质体的制备。优选的方法可采用涡旋振荡的方式，得到的脂质体形式是多层脂质体，若想得到单层脂质体可通过滤膜过滤或进一步超声等方式。

上述所得米托蒽醌脂质体通过光镜下观测可见脂质体的粒径均匀，且无团块状物，透过电镜观察可更清晰的看见大小均匀的脂质体微粒。采用电子显微镜和粒径分析仪进行粒径测定，脂质体粒径范围应在150nm以下，更优选的范围为100～120nm。

上述所得米托蒽醌脂质体可利用多种方法对其包封率进行测定，例如可采用高速离心法、透析法等。包封率的计算方法为：米托蒽醌脂质体的包封率(％)＝透析后包裹于脂质体内的米托蒽醌量/米托蒽醌的投药量×100％。本发明中米托蒽醌脂质体的包封率应控制在80％之上，进一步可提高到85％之上，更进一步可提高到90％之上。

上述所得米托蒽醌脂质体在贮藏期间有良好的稳定性，在体内发挥其缓释作用之前保持一定的大小及完整性。本发明中考察了米托蒽醌新剂型的稳定性，其在8小时内的包封率处于稳定状态，稳定性良好。

上述所得米托蒽醌脂质体较常规米托蒽醌制剂毒副作用小，主要体现在单次给药毒性实验中米托蒽醌脂质体与游离米托蒽醌药物相比，可以使用更高的剂量，小鼠的长期生存率可达100％，并且在相同剂量下，米托蒽醌脂质体对白细胞的杀伤力及骨髓抑制毒性均较常规米托蒽醌更小；多次给药毒性实验中，相同剂量的米托蒽醌脂质体组小鼠生存率较常规米托蒽醌组显著上升。

上述所得米托蒽醌脂质体制剂半衰期可达0.96h，较常规米托蒽醌(半衰期：0.11h)显著延长，且达峰浓度显著提高，清除速率显著降低，在心脏中的分布比游离米托蒽醌低3倍，表明米托蒽醌脂质体制剂的药代动力学行为得到很好的改善，且其对心肌的毒副作用显著降低。

上述所得米托蒽醌脂质体制剂与游离米托蒽醌相比具备更好的抗肿瘤疗效，米托蒽醌脂质体对肿瘤体积增长的抑制效果更加显著。此外利用脂质体制剂可降低米托蒽醌毒副作用，在米托蒽醌给药剂量相同的情况下，脂质体剂型可更好的降低由于药物毒性造成的实验动物死亡率。

上述所得米托蒽醌脂质体制剂的使用方法是与其他一线化疗药物的一种或多种联合应用治疗包括白血病或乳腺癌在内的良恶性肿瘤，联合用药的抗肿瘤作用优于单一用药且优于游离MTO与其他药物联和使用。本发明中LEM分别与阿糖胞苷、环磷酰胺或长春新碱联合使用可以显著提高白血病模型小鼠的生存率；LEM分别与紫杉醇、顺铂或环磷酰胺联合使用，与其他实验组相比，对乳腺癌模型小鼠肿瘤生长的抑制作用更加显著，说明LEM其他化疗药物联合使用可以显著提高肿瘤的治疗效果。

上述所得米托蒽醌脂质体制剂的给药途径多种多样，可以选择口服给药、静脉给药、局部给药、腹膜内给药等，但首选非肠道途径给药，更优选给药方式为静脉给药。

综上所述，本发明中公开的米托蒽醌脂质体制剂大大提高了米托蒽醌药物的摄取；提高了急性及长期毒性实验中小鼠的生存率，且降低了MTO骨髓抑制毒性及心肌毒性，说明LEM降低药物了毒副作用；小鼠体内半衰期是MTO的8.7倍，大大延长了药物的作用时间；体内外抗肿瘤活性均优于MTO，更好发挥了药物的疗效；并且与阿糖胞苷、环磷酰胺、长春新碱、紫杉醇、顺铂等化疗药物联合应用时，其抗肿瘤作用比单纯米托蒽醌脂质体制剂的抗肿瘤疗效更佳显著。

附图说明

图1：LEM粒径分布图。

图2：不同浓度MTO及LEM对HL-60细胞毒性作用。

图3：不同浓度MTO及LEM对MCF-7细胞毒性作用。

图4：MTO和LEM血浆药时曲线。

图5：LEM联合阿糖胞苷对L1210模型小鼠生存率结果。

图6：LEM联合环磷酰胺对L1210模型小鼠生存率结果。

图7：LEM联合长春新碱对L1210模型小鼠生存率结果。

图8：LEM联合阿糖胞苷对HL-60模型小鼠生存率结果。

图9：LEM联合环磷酰胺对HL-60模型小鼠生存率结果。

图10：LEM联合长春新碱对HL-60模型小鼠生存率结果。

图11：LEM联合阿糖胞苷对P388模型小鼠生存率结果。

图12：LEM联合环磷酰胺对P388模型小鼠生存率结果。

图13：LEM联合长春新碱对P388模型小鼠生存率结果。

图14：LEM联合紫杉醇对4T1模型小鼠肿瘤体积结果。

图15：LEM联合紫杉醇对4T1模型小鼠各组体重变化结果。

图16：LEM联合顺铂对4T1模型小鼠肿瘤体积结果。

图17：LEM联合顺铂抗4T1小鼠肿瘤照片。

图18：LEM联合环磷酰胺对4T1模型小鼠肿瘤体积结果。

图19：LEM联合紫杉醇对MCF-7模型小鼠肿瘤体积结果。

图20：LEM联合顺铂化疗MCF-7模型小鼠肿瘤体积结果。

图21：LEM联合环磷酰胺化疗MCF-7模型小鼠肿瘤体积结果。

图22：LEM联合紫杉醇化疗MDA-MB-231模型小鼠肿瘤体积结果。

图23：LEM联合顺铂化疗MDA-MB-231模型小鼠肿瘤体积结果。

图24：LEM联合环磷酰胺化疗MDA-MB-231模型小鼠肿瘤体积结果。

具体实施方式

现利用实施例对本发明做进一步的说明，实施例仅用于解释发明目的，而不是用来限定本发明。

实施例1：制备米托蒽醌脂质体(LEM)制剂

1，1’，2，2’-4肉豆蔻酰心磷脂，卵磷脂和胆固醇以摩尔比为1:5:10的比例冻干成粉末形式。将浓度为1.0mg/ml的无菌米托蒽醌生理盐水溶液加入到干燥的脂质当中。药物与脂质的摩尔比例是1:15。将以上混合物在室温条件下水化2h，然后将水化后的混悬液在浴式超声器中超声处理10min，得到LEM。

本发明所得脂质体的包封率为89.41±1.26％。该方法制得的脂质体平均粒径100-120nm(图1)，8h内脂质体稳定性达到94％。

实施例2：制备米托蒽醌脂质体(LEM)制剂

将心磷脂、磷脂酰胆碱、胆固醇以摩尔比为1:7:12的比例冻干成粉末。0.5mg/ml米托蒽醌生理盐水溶液与干燥脂质混合。药脂摩尔比为1:12.5。混合物于室温下水化2h，超声10min。可获得包裹米托蒽醌的脂质体。脂质体中米托蒽醌的量通过分光光度计于658nm处测定。药物包封率通过以下公式计算：包封率＝(透析后的药物浓度/透析前的药物浓度)×100％。

上述方法所制备得到的米托蒽醌脂质体的包封率为94.62±3.19％，所得脂质体的粒径为57.63±1.24nm，且稳定性良好，室温下，米托蒽醌脂质体8小时以内的稳定性良好，渗漏率低于5％，见表1。

表1LEM三批样品渗漏率检测

实施例3：LEM的体外细胞毒实验

将对数生长期的HL60白血病细胞接种到96孔细胞培养板(细胞分组：生理盐水组，空白脂质体组，LEM组，MTO组)进行培养，之后加入不同浓度的LEM或MTO，每个浓度3复孔，在5％CO₂、37℃细胞培养箱中培养72小时，采用MTT法评价LEM及MTO对不同细胞系的细胞毒作用，以初步预测LEM的作用强度和对不同类型肿瘤细胞的敏感性。阴性对照为生理盐水或空白脂质体对照。采用MTT法对两种制剂的细胞毒性进行研究。

按下式求细胞存活率，根据线性方程求IC50。

细胞存活率＝{处理组D(570)值/对照组D(570)值}×100％

细胞抑制率＝1-细胞存活率。

结果所示，相同浓度的MTO和LEM相比较，LEM治疗组有较强的细胞毒作用(图2)。

实施例4：LEM的体外细胞毒实验

将对数生长期的MCF-7乳腺癌细胞接种到96孔细胞培养板，于37℃和5％CO₂的细胞培养箱中培养，贴壁后移去培养基，每孔加不同浓度的含LEM或MTO的培养基，调零孔和对照组加相应体积的培养基。采用MTT法对两种制剂的细胞毒性进行研究。

结果表明LEM和MTO均显示出对MCF-7细胞的生长抑制作用，且随着药物浓度的增加,对肿瘤细胞的抑制作用增强。LEM和MTO与MCF-7细胞共孵育72h后，LEM和MTO的浓度为1000ng/ml时，肿瘤细胞存活率分别为(17±0.41)％和(11±0.72)％。(图3)。

实施例5：LEM的体内毒性试验

采用CD2F1小鼠单次或多次注射MTO和LEM以比较两种制剂毒性。

单次给药实验中，取雄性CD2F1小鼠分别单次尾静脉注射MTO5.0mg/kg、25.0mg/kg或LEM5.0-35.0mg/kg。对照组分别注射生理盐水或空白脂质体溶液(脂类浓度相当于35.0mg/kgLEM内脂类浓度)，每天观察小鼠，每周称量小鼠体重2次。实验进行67天。于给药后第3天和实验最后一天各组取小鼠进行组织病理学检测。实验结果表明，LEM表现出较MTO更低的毒性，注射LEM35.0mg/kg的小鼠无死亡，长期生存率为100％，见表2；白细胞计数及脾脏和骨髓病理检测结果显示，LEM的毒副作用更低，见表3。

表2MTO和LEM在小鼠体内的生存率研究结果(单次给药)

NA:MTO剂量未检测；*与MTO组相比，P<0.001；中位生存期为9.5天；中位生存期为6.5天。

表3MTO和LEM单次给药各组小鼠的白细胞计数及脾脏和骨髓病理情况

§空白脂质体(BL)剂量相当于35.0mg/kg的LEM；*MTO组与生理盐水组相比或LEM组与BL相比，P<0.01；MTO组与生理盐水组相比或LEM组与BL相比，P<0.001；无存活者；++轻度毒性；+++中度毒性；N正常；NA未检测。

多次给药实验中，取雌性CD2F1小鼠每5天分别尾静脉注射同一剂量药物(MTO：2.5-7.5mg/kg；LEM：2.5-10.0mg/kg)。对照组分别注射生理盐水或空白脂质体溶液(脂类浓度相当于7.5mg/kgLEM内脂类浓度)，每天观察小鼠，每周称量小鼠体重2次。于第一次给药后64天停止实验。于给药后第7天和实验最后一天各组取小鼠进行组织病理学检测。结果显示，LEM各组小鼠生存率显著增加，见表4。

表4MTO和LEM多次给药各组小鼠生存率

NA:MTO剂量组未检测；*与MTO组相比，P<0.001；

中位生存期为7.5天；中位生存期为6.5天；中位生存期为7.5天。

实施例6：LEM小鼠体内药代动力学研究

取雄性CD2F1小鼠，分别尾静脉注射5.0mg/kg的MTO或LEM。于给药后5min，15min，30min，1h，2h，4h，8h，24h和48h每组取4只小鼠麻醉后进行心脏穿刺取血置于含有20μl100mg/ml抗坏血酸的柠檬酸盐缓冲液(pH3.0)的肝素管内，4℃下2000rpm离心10min分离血浆。取心，肝，脾，肺，肾用冰生理盐水冲洗。组织和血浆-20℃储存以备检测。采用反相高效液相色谱法分析血浆和组织样品内的米托蒽醌。米托蒽醌采用反相色谱柱分离，使用流动相为乙腈(33％)和0.16M且pH2.7的甲酸铵缓冲液(67％)的混合溶液，流速为1.0ml/min。米托蒽醌检测波长是600nm。内标物和米托蒽醌的保留时间分别为3.7和4.3min。在米托蒽醌治疗范围内，该方法是线性的，可再生的。灵敏度为10ng/ml。血浆药代动力学参数由实用药代动力学程序(3P87)进行评估分析。

结果表明LEM较MTO具有更长的循环时间和更高的峰浓度，组织分布结果表明LEM在重要脏器内(心脏中)分布较常规MTO显著降低。MTO和LEM小鼠血药浓度曲线见图4，药代动力学参数见表5，组织分布浓度见表6。

表5MTO和LEM在CD2F1小鼠体内的血浆药代动力学参数(剂量：5.0mg/kg，i.v.)(n＝4)

*P<0.001；**P<0.03；***P<0.002。

表6MTO和LEM在CD2F1小鼠体内重要器官的分布(剂量：5.0mg/kg，i.v.)(n＝4)

*P<0.02；**P<0.001

实施例7：LEM联合其他化疗药物在白血病动物模型中的抗肿瘤疗效研究

取Balb/c雄性小鼠2只，腹腔注射L1210细胞液，1×10⁶细胞/0.2ml。待形成腹水后无菌条件下抽取腹水离心除去红细胞，进行L1210细胞计数并调整细胞浓度为5×10⁶个/ml。动物适应环境饲养一周后随机分为12组，每组6只。于d0腹腔注射L1210腹水稀释液，1×10⁶个/只。于接种后24h开始静脉给予治疗药物。具体如下：

模型组：尾静脉注射生理盐水，0.2ml/只。

MTO组：尾静脉注射MTO，5mg/kg。

LEM组：尾静脉注射LEM，5mg/kg。

阿糖胞苷组：尾静脉注射阿糖胞苷19.5mg/kg，每天一次，连续5天。

MTO联合阿糖胞苷组：尾静脉注射MTO1mg/kg,每天一次，连续3天；阿糖胞苷19.5mg/kg，每天一次，连续5天。

LEM联合阿糖胞苷组：尾静脉注射LEM1mg/kg,每天一次，连续3天；阿糖胞苷19.5mg/kg，每天一次，连续5天。

环磷酰胺组：尾静脉注射环磷酰胺126mg/kg。

MTO联合环磷酰胺组：d1尾静脉注射MTO1mg/kg,每天一次，连续3天；d2尾静脉注射环磷酰胺126mg/kg。

LEM联合环磷酰胺组：d1尾静脉注射LEM1mg/kg,每天一次，连续3天；d2尾静脉注射环磷酰胺126mg/kg。

长春新碱组：尾静脉注射长春新碱0.26mg/kg/w。

MTO联合长春新碱组：d1尾静脉注射MTO1mg/kg，每天一次，连续3天；长春新碱0.26mg/kg/w。

LEM联合长春新碱组：d1尾静脉注射LEM1mg/kg，每天一次，连续3天；长春新碱0.26mg/kg/w。

本实验表明，LEM的抗肿瘤作用较MTO更好，有效延长生存时间，提高动物生存率。且LEM与各化疗药物联合能够起到更好的抗肿瘤作用。其中，LEM联合环磷酰胺组小鼠60天内生存率可达50％，LEM联合阿糖胞苷组小鼠生存率达20％，见图5-7。

实施例8：LEM联合其他化疗药物在白血病动物模型中的抗肿瘤疗效研究

取SCID小鼠60只，4-6周龄，体重(16.5～20.5)g，无菌环境饲养。尾静脉注射HL-60细胞1×10⁷个/只。将模型小鼠随机分为12组，每组6只。给药方式同实施例7，观察各组小鼠生存时间。

结果表明，LEM能够较MTO更好的提高模型小鼠生存率，且与临床常用一线化疗药物联合所取得治疗效果更佳，见图8-10。

实施例9：LEM联合其他化疗药物在白血病动物模型中的抗肿瘤疗效研究

取DBA小鼠60只，4-6周龄，体重(18～22)g，无菌环境饲养。腹腔注射对数生长期P388细胞5×10⁶个/只。将模型小鼠随机分为12组，每组6只。给药方式同实施例7，观察各组小鼠生存时间。

本实验表明，LEM的抗肿瘤作用较MTO更好，有效延长生存时间，提高动物生存率。且LEM与各化疗药物联合能够起到更好的抗肿瘤作用。其中，LEM联合环磷酰胺组和LEM联合阿糖胞苷组小鼠60天内生存率可达30％，结果见图11-13。

实施例10：LEM联合其他化疗药物在乳腺癌动物模型中的抗肿瘤疗效研究

将4T1乳腺癌细胞胰酶消化后离心弃上清，用4ml无菌生理盐水重悬后计数，再次离心后用无菌生理盐水配置为4×10⁶/ml的细胞悬液，接种于小鼠第二***脂肪垫下，接种体积为0.05ml即2×10⁵个细胞。待肿瘤平均直径为4-5mm即平均肿瘤体积约为50mm³为模型成立。将肿瘤小于50mm³的剔除，其余小鼠随机分为12组，每组8只。分别给予治疗药物。分别给予治疗药物。具体如下：

空白对照组：尾静脉注射生理盐水，0.2ml/只。

模型组：尾静脉注射生理盐水，0.2ml/只。

MTO组：尾静脉注射米托蒽醌生理盐水溶液，5mg/kg。

LEM组：尾静脉注射米托蒽醌脂质体溶液，5mg/kg。

紫杉醇组：尾静脉注射紫杉醇葡萄糖溶液36.8mg/kg。

MTO联合紫杉醇组：尾静脉注射紫杉醇葡萄糖溶液36.8mg/kg后尾静脉注射米托蒽醌生理盐水溶液2.5mg/kg。

LEM联合紫杉醇组：尾静脉注射紫杉醇葡萄糖溶液36.8mg/kg后尾静脉注射米托蒽醌脂质体溶液2.5mg/kg。

顺铂组：尾静脉注射顺铂生理盐水溶液6.31mg/kg，连续2天。

MTO联合顺铂组：尾静脉注射米托蒽醌生理盐水溶液2.1mg/kg，注射顺铂生理盐水溶液6.31mg/kg，连续2天。

LEM联合顺铂组：尾静脉注射米托蒽醌脂质体溶液2.1mg/kg，注射顺铂生理盐水溶液6.31mg/kg，连续2天。

环磷酰胺组：尾静脉注射环磷酰胺105mg/kg。

MTO联合环磷酰胺组：尾静脉注射米托蒽醌生理盐水溶液2.1mg/kg及环磷酰胺105mg/kg。

LEM联合环磷酰胺组：尾静脉注射米托蒽醌脂质体溶液2.1mg/kg及环磷酰胺105mg/kg。

每组荷瘤动物在接种后第1天起，用游标卡尺测量肿瘤大小，每周测定2次，并计算肿瘤体积。肿瘤体积(tumorvolume,TV)的计算公式为：V＝1/2×a×b²。其中：a和b分别表示长和宽。

不同给药组在Balb/c小鼠模型中的抗癌作用实验进行了29天，结果表明各治疗组的小鼠肿瘤体积明显比生理盐水组的肿瘤体积小(p＜0.05)；LEM较MTO具有更好的抑瘤活性，显著限制了模型小鼠肿瘤组织的生长，并且与其他一线化疗药物联合应用效果更好，且各组小鼠体重曲线表明LEM较MTO毒性更低，结果见图14-18。

实施例11：LEM联合其他化疗药物在乳腺癌动物模型中的抗肿瘤疗效研究

在Balb/c裸鼠体内建立乳腺癌模型：取对数生长期的MCF-7(2×10⁶个细胞/0.2ml)，皮下注射于Balb/c裸鼠左侧乳腺区域。待肿瘤生长到平均体积大约为50mm³后，开始治疗。荷MCF-7肿瘤小鼠随机分为13组(n＝8)。各组给药方式同实施例10，定期测量各组小鼠肿瘤体积。

结果表明LEM与MTO相比具有更好的抗肿瘤活性，并且与其他化疗药物联合应用效果最佳，结果见图19-21。

实施例12：LEM联合其他化疗药物在乳腺癌动物模型中的抗肿瘤疗效研究

在Balb/c裸鼠体内建立乳腺癌模型：取对数生长期的MDA-MB-231(1×10⁶个细胞/0.1ml)，皮下注射于Balb/c裸鼠左侧乳腺区域。待肿瘤生长到平均体积大约为50mm³后，开始治疗。荷MDA-MB-231肿瘤小鼠随机分为13组(n＝8)。各组给药方式同实施例10，定期测量各组小鼠肿瘤体积。

结果表明LEM与MTO相比具有更好的抗肿瘤活性，并且与其他化疗药物联合应用效果最佳，见图22-24。

Claims (10)

1.本发明公开了新型米托蒽醌脂质体联合化疗药物在抗肿瘤治疗中的应用，其特征在于：其与其他化疗药物联合应用具有更好的抗肿瘤疗效。

2.权利1所述的脂质体制剂为米托蒽醌脂质体，也可以是其他化疗药物的脂质体制剂，其特征在于：所述的脂质体制剂组成成分磷脂材料可以是天然的、人工合成的及半合成的；可以是亲水性的或疏水性的；可以是带有正电荷或带有负电荷及电中性的，更优选为带负电磷脂如心磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇等，可在静电吸引作用下增加如米托蒽醌的包封率。

3.权利要求1和2所述的脂质体制剂制备方法可以是薄膜法、超声法、硫酸铵梯度法及冻干法、表面活性剂去除法，高压均质法等，更为常用的是薄膜法、硫酸铵梯度法和冻干法；本发明所用的制备方法可以从以上众多方法中选择且所制备的脂质体制剂包封率至少在85％以上，粒径范围应在10nm-0.5μm范围内。

4.权利要求1、2、3所述的脂质体制剂给药途径可以是口服给药、静脉给药、局部给药、腹膜内给药等；药物安全性要高于米托蒽醌，可包括用药后动物体重减轻少、动物死亡率低、体内白细胞杀伤低、心肌毒性低、骨髓及脾脏造血功能抑制低等方面。

5.权利要求1、2、3所述的脂质体制剂药物代谢动力学行为较游离米托蒽醌有明显改善，体现在药物半衰期延长，在心肌等主要脏器分布浓度降低等。

6.权利要求1、2、3中所述的脂质体制剂可与其他化疗药物联合应用，所述的第二种治疗剂包括抗肿瘤药，抗真菌药，抗生素以及其它活性药物。

7.权利要求6中所述的抗肿瘤药可以是烷化剂，包括环磷酰胺、尼莫司汀等；也可以是抗代谢药，包括5-氟尿嘧啶、吉西他滨、甲氨蝶呤等；还可以是抗肿瘤抗生素，包括阿糖胞苷、多柔比星、放线菌素D、丝裂霉素等；还可以是植物类抗癌药，包括伊立替康、紫杉醇、长春新碱等；还可以是激素及内分泌类药物，包括他莫昔芬、阿他美坦等；还可以是杂类，包括顺铂、达卡巴嗪等；还可以生物反应调节剂，如干扰素、香菇多糖、胸腺肽等。

8.权利要求1中所述的治疗的恶性肿瘤可以是恶性淋巴瘤、乳腺癌、急性白血病、肺癌、黑色素瘤、软组织肉瘤、多发性骨髓瘤、肝癌、大肠癌、肾癌、***癌、子宫内膜癌、睾丸肿瘤、卵巢癌和头颈部癌等。

9.如权利要求2和7所述，米托蒽醌脂质体制剂较米托蒽醌游离药物对白血病具有更好的疗效；米托蒽醌脂质体制剂与阿糖胞苷、环磷酰胺及长春新碱分别联合使用治疗白血病的疗效更佳。

10.如权利要求2和7所述，米托蒽醌脂质体制剂较米托蒽醌游离药物对乳腺癌具有更好的疗效；米托蒽醌脂质体制剂与紫杉醇、顺铂及环磷酰胺分别联合使用治疗乳腺癌的疗效更佳。