CN102079744B - 氘代非手性克里唑蒂尼及其衍生物、制备方法和应用 - Google Patents

氘代非手性克里唑蒂尼及其衍生物、制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药化合物合成领域，特别涉及氘代非手性克里唑蒂尼及其制备方法和应用。本发明所提供的非手性克里唑蒂尼(Crizotinib)氘代衍生物具有与克里唑蒂尼(Crizotinib)相似的药效，从而为合成新型抗肿瘤药物提供了新的化合物，也为抗肿瘤药物的合成开辟了一条新的途径。

Description

氘代非手性克里唑蒂尼及其衍生物、制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药化合物合成领域，特别涉及氘代非手性克里唑蒂尼及其衍生物、制备方法和应用。
背景技术
非小细胞肺癌是最常见的肺癌类型，占所有肺癌患者的80％至85％，其中部分患者伴随有基因突变。基因突变型非小细胞肺癌患者群主要为非吸烟者和已戒烟者。国际卫生组织统计，现阶段，全球每年新增确诊肺癌患者1200万人，每年因肺癌死亡800万人。
由美国辉瑞制药有限公司研发的克里唑蒂尼（Crizotinib）经临床验证可有效缩小晚期基因突变型非小细胞肺癌（NSCLC）患者的恶性肿瘤大小。一期临床试验证实，克里唑蒂尼对90％的晚期基因突变型非小细胞肺癌患者产生效果，其中57％的患者口服药物８周后肿瘤明显收缩。
近年来，随着对抗肿瘤药物研究的进一步深入，提供新的具有缩小恶性肿瘤大小作用的化合物及其制备方法已成为开发新型抗肿瘤药物的关键。
发明内容
本发明的目的在于提供一种氘代非手性克里唑蒂尼及其衍生物、制备方法和应用，对克里唑蒂尼(Crizotinib)结构中的两个部位进行了氘代，为合成新型抗肿瘤药物提供新的化合物，也为抗肿瘤药物的合成开辟新的途径。
本发明采用的技术方案如下：
氘代非手性克里唑蒂尼及其衍生物，其结构式如（I）或（II）所示：
Figure 760452DEST_PATH_IMAGE001
 
Figure 474331DEST_PATH_IMAGE002
其中，R为氢或叔丁氧基羰基。
本发明还提供了制备非手性氘代克里唑蒂尼及其衍生物的中间体，如式5a或5b所示：
Figure 332696DEST_PATH_IMAGE003
。
所述的氘代非手性克里唑蒂尼的衍生物的制备方法为，将式5a化合物和非氘代的式5b化合物或者将非氘代的式5a化合物和式5b化合物先溶于N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、二乙基酰胺（DMA）、二氧六环或三乙胺，之后加入碳酸钠、碳酸钾、醋酸钾或三乙胺，氮气保护下，依次加入醋酸钯、三苯基磷，升温至60-150℃加热搅拌2-24h，冷却至室温，加入乙酸乙酯稀释，过滤，干燥，浓缩，硅胶柱层析分离，得到氘代非手性克里唑蒂尼衍生物。
进一步，将所述的氘代非手性克里唑蒂尼衍生物溶于有机溶剂中，向其中通入氯化氢气体，监控至衍生物消失时，浓缩，调PH为碱性，之后常规后处理即可获得氘代非手性克里唑蒂尼，所述的有机溶剂可选择二氧六环或四氢呋喃。
式5a化合物的制备方法如下：
将式1a化合物和氘代的还原剂溶于有机溶剂中室温反应，得到式2a化合物；其中氘代的还原剂可选择氘代的氢化锂铝（LiAlD4）、氘代的硼氢化钠(NaBD4)、氘代的醋酸硼氢化钠(NaB (OAc)3D)或者氘代的氰基硼氢化钠(NaBCND3)，有机溶剂为苯、二氯甲烷、乙腈、四氢呋喃、甲苯、甲醇、乙醇、二氧六环或三氯甲烷；式1a化合物结构式如下所示：
Figure 790222DEST_PATH_IMAGE004
。
氮气气氛下，将三苯基磷和偶氮二甲酸二乙酯DEAD溶于四氢呋喃、二氧六环、N，N-二甲基甲酰胺、二乙基酰胺、二氧六环或三乙胺中，冷却至0oC，磁力搅拌下，3-羟基-2-硝基吡啶和式2a化合物的四氢呋喃溶液通过恒压滴液漏斗加入；得到的橙色透明溶液升至室温搅拌，薄层色谱显示式2a化合物消失，常规后处理，浓缩得到固体式3a化合物；其中投料物质的量比为：式2a化合物：三苯基磷：DEAD：3-羟基-2-硝基吡啶为1：1-3：1-3：1-3；
Figure 653530DEST_PATH_IMAGE005
。
在反应容器中依次加入醋酸、乙醇、式3a化合物，还原铁粉，缓慢加热至回流并保持回流不超过5h，冷却至室温后浓缩除去一半至三分之二的溶剂，然后加入乙酸乙酯和水等体积的混合物，再向上述混合体系中缓慢注入饱和碳酸钠溶液中和，常规后处理浓缩得到式4a化合物，其中还原铁粉的物质的量为式3a化合物的8-20 倍；将化合物4a溶于乙腈中，冷却，N-溴代琥珀酰亚胺分批次缓慢加入，冷却下继续搅拌，之后常规后处理，柱层析，得到式5a化合物，其中N-溴代琥珀酰亚胺物质的量为式4a化合物的0.6-3.0 倍；式3a化合物、式4a化合物结构式如下所示：
Figure 803888DEST_PATH_IMAGE006
。
所述的中间体式5b化合物的制备方法如下：
将1b和氘代的还原剂溶于有机溶剂中室温反应，得到式2b化合物；其中氘代的还原剂为氘代的氢化锂铝（LiAlD4）、氘代的硼氢化钠(NaBD4)、氘代的醋酸硼氢化钠(NaB (OAc)3D)或氘代的氰基硼氢化钠(NaBCND3)，有机溶剂为苯、二氯甲烷、乙腈、四氢呋喃、甲苯、甲醇或乙醇。
将式2b化合物溶于二氯甲烷、苯、乙腈、四氢呋喃、甲苯、甲醇或乙醇中，加入有机胺，冷却至-10到10oC，缓慢滴加甲磺酰氯，加入N,N-二甲基氨基吡啶（DMAP）；加料完毕后升温到室温，继续搅拌1-8h，向反应体系中加入水并经常规后处理得式3b化合物；投料物质的量比为：式2b化合物：有机胺：甲磺酰氯：DMAP为1：1-5：1-5：0.01-0.25；
Figure 883971DEST_PATH_IMAGE007
。
将4-碘代吡唑溶于干燥的N，N-二甲基甲酰胺、二乙基酰胺、二氧六环、四氢呋喃或甲苯中，氮气气氛，0oC下，分批次缓慢加入总物质的量为4-碘代吡唑1.0-3.0 倍的氢化钠；反应混合液-10oC至10oC下继续搅拌后，加入式3b化合物，反应温度升至60-120oC并继续搅拌，待反应体系温度降至室温后，加水淬灭反应，常规后处理浓缩得到式4b化合物；
氮气气氛下，将醋酸钾加入干燥的N，N-二甲基甲酰胺、二乙基酰胺、二氧六环、四氢呋喃或甲苯中，依次向其中加入式4b化合物、联硼烷嚬哪醇酯、醋酸钯、三苯基磷，升温至80-150℃搅拌1-24h，反应体系冷却至室温，硅藻土过滤，常规后处理得式5b化合物；投料物质的量比为：式4b化合物：醋酸钾：联硼烷嚬哪醇酯: 醋酸钯：三苯基磷为1：1-5：0.8-2.0：0.01-0.15：0.01-0.4；式3b化合物、式4b化合物的结构式如下：
Figure 456772DEST_PATH_IMAGE008
。
所述的氘代非手性克里唑蒂尼在制备治疗癌症药物方面有很好的应用前景。
特别是肺癌。
本发明所合成的氘代非手性克里唑蒂尼(Crizotinib) 及其衍生物具有与克里唑蒂尼(Crizotinib)相似的生物活性，作用的靶点都是间变型淋巴瘤激酶ALK（Anaplastic Lymphoma Kinase）。
本发明相对于现有技术，有以下优点：
本发明所提供的非手性克里唑蒂尼(Crizotinib)氘代衍生物具有与克里唑蒂尼(Crizotinib)相似的药效，从而为合成新型抗肿瘤药物提供了新的化合物，也为抗肿瘤药物的合成开辟了一条新的途径。
具体实施方式
   以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此：
实施例1
Figure 922389DEST_PATH_IMAGE009
化合物1b（10g，50.25mmol）溶于无水甲醇（100mL），置于250mL的单口圆底烧瓶，室温，磁力搅拌下，分批次加入硼氢化钠（3.8g，100mmol），加入完毕后继续搅拌1h，加入2mL水淬灭，浓缩后再加入100mL水，乙酸乙酯萃取（150mL×2），有机相依次用饱和食盐水（100mL）,水（100mL）洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液浓缩得透明无色粘稠油状产品（静置一天后变为白色固体）化合物2b（9.6g，产率95%）。1H NMR(400MHz, CDCl3) δ1.42(s, 9H), 1.51(m, 2H), 1.84(m, 2H), 3.03(m, 2H), 3.85(m, 3H).
化合物2b(9.6g,47.8mmol)溶于二氯甲烷（120mL），置于250mL三口圆底烧瓶，加入三乙胺（5g，48mmol），冷却至0oC，缓慢滴加甲磺酰氯（5.5g，47.8mmol），加入DMAP（0.6g，4.7mmol）。加料完毕后升温到室温，继续搅拌3h，向反应体系中加入水（50mL），二氯甲烷萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤浓缩得白色固体化合物3b（13g，产率98%）。1H NMR(400MHz, CDCl3) δ1.45(s, 9H), 1.83(m, 2H), 1.95(m, 2H), 3.02(s, 3H), 3.28(m, 2H), 3.70(m, 2H), 4.88(m, 1H).
4-碘代吡唑（8.2g，42.4mmol）溶于干燥的DMF（150mL），置于250mL的三口圆底烧瓶中，氮气气氛，0oC下，分批次缓慢加入氢化钠（2g，50.6mmol，含量60%）。反应混合液0oC下继续搅拌1h后，加入化合物3b，反应温度升至120oC并继续搅拌12h，待反应体系温度降至室温后，加水（2mL）淬灭反应，浓缩除去大部分DMF，然后加入水（100mL），乙酸乙酯萃取（150mL×2），合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，使用硅胶柱层析，乙酸乙酯：石油醚=1：10为洗脱剂，将含有化合物4b的组分合并，浓缩得到白色固体化合物4b（25g，产率79%）。1H NMR(400MHz, CDCl3) δ1.47(s, 9H), 1.86(m, 2H), 2.09(m, 2H), 2.87(m, 2H), 4.26(m, 3H), 7.45(s, 1H), 7.51(s, 1H).
醋酸钾（5.2g，53.2mmol）置于250mL三口圆底烧瓶中除水（30mm， 180oC，10min），氮气气氛下，加入干燥的DMF，依次向其中加入化合物4b（5g，13.3mmol），联硼烷嚬哪醇酯（3.7g，14.6mmol），醋酸钯（150mg，0.67mmol），三苯基磷（370mg，1.4mmol），抽真空置换氮气后，升温至80oC搅拌2h。反应体系冷却至室温，硅藻土过滤，乙酸乙酯洗涤，浓缩除去大部分DMF后，然后加入水（100mL），乙酸乙酯萃取（150mL×2），合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，使用硅胶柱层析，乙酸乙酯：石油醚=1：5为洗脱剂，将含有化合物5b的组分合并，浓缩得到白色固体化合物5b（2.2g，产率45%）。1H NMR(400MHz, CDCl3) δ1.27(s, 12H),1.47(s, 9H), 1.88(m, 2H), 2.12(m, 2H), 2.90(m, 2H), 4.26(m, 3H), 7.73(s, 1H), 7.79(s, 1H).
合成路线2
 
Figure 994381DEST_PATH_IMAGE010
化合物1a（10g，48.5mmol）溶于无水甲醇（100mL），置于250mL的单口圆底烧瓶，室温，磁力搅拌下，分批次加入氘代硼氢化钠（3g，78mmol），加入完毕后继续搅拌1h，加入2mL水淬灭，浓缩后再加入100mL水，乙酸乙酯萃取（150mL×2），有机相依次用饱和食盐水（100mL）,水（100mL）洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液浓缩得透明无色粘稠油状产品（静置一天后变为白色固体），化合物2a （10g，产率99%）。1H NMR(400MHz, CDCl3) δ1.65(s, 3H), 7.03(t, J=8.4Hz, 1H), 7.27(dd, J=4.8Hz,8.8Hz, 1H).
氮气气氛下，三苯基磷（17.6g，67.2mmol）和DEAD（11.7g，67.2mmol）溶于四氢呋喃（200mL），置于1L的三口圆底烧瓶，冷却至0oC，磁力搅拌下，3-羟基-2-硝基吡啶（7.4g，53mmol）和化合物2a（10g，48mmol）的四氢呋喃溶液（200mL）通过恒压滴液漏斗加入到圆底烧瓶中。所得到的橙色透明溶液升至室温搅拌3h，薄层色谱显示化合物2a消失，将反应液转移到500mL单口圆底烧瓶中，浓缩，柱层析，乙酸乙酯：石油醚=1：5为洗脱剂，将含有化合物3a的组分合并，浓缩得到粉色固体化合物3a(16g，产率99%)。1H NMR(400MHz, CDCl3) δ1.84(s, 3H), 7.03(d, J=8.4Hz, 8.8Hz, 1H), 7.21(d, J=1.6Hz,4.4Hz, 1H), 7.32(dd, J=4.8Hz, 8.4Hz, 1H), 7.38(dd, J=4.8Hz, 8.4Hz, 1H), 8.04(dd, J=1.2Hz, 4.4Hz, 1H).
向2L的圆底烧瓶中依次加入醋酸（900mL），乙醇（700mL），化合物3a（16g，48.5mmol），还原铁粉（27g，485mmol），缓慢加热至回流并保持回流1h，冷却至室温后浓缩除去大部分乙酸和乙醇，然后加入乙酸乙酯（500mL）和水（500mL），再向上述混合体系中缓慢加入饱和碳酸钠溶液中和。乙酸乙酯萃取（500mL×2），合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠（200mL），水（200mL），饱和食盐水（200mL），洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩得到化合物4a，粉色固体，13g，产率90%。1H NMR(400MHz, CDCl3) δ1.80(s, 3H),4.83(br, 2H), 6.45(dd, J=4.2Hz,8.0Hz, 1H), 6.68(dd, J=1.2Hz,7.6Hz, 1H), 7.04(dd, J=8.0Hz, 8.8Hz, 1H), 7.26(dd, J=4.4Hz, 5.2Hz, 1H), 7.59(dd, J=1.6Hz, 5.6Hz, 1H).
化合物4a（13g，43.3mmol）溶于乙腈（150mL）置于250mL的圆底烧瓶中，冷却至0oC，NBS（7.8g，43.3mmol）分批次缓慢加入，添加完毕后0oC下继续搅拌30min。将反应液浓缩，柱层析，乙酸乙酯：石油醚=1：1为洗脱剂，将含有化合物5a的组分合并，浓缩得到褐色固体化合物5a(9g，产率55%)。1H NMR(400MHz, CDCl3) δ1.81(s, 3H),4.82(br, 2H), 6.84(d, J=1.6Hz, 1H), 7.08(dd, J=8Hz,8.8Hz, 1H), 7.32(dd, J=4.8Hz, 8.8Hz, 1H), 7.26(d, J=2.0Hz, 1H).
Figure 811027DEST_PATH_IMAGE011
化合物5a（2.6g,7mmol）和化合物5b(3g,8mmol)溶于DME（75mL），置于250mL的三口圆底烧瓶，向此体系中加入碳酸钠水溶液（2.6g，8.3mL），抽真空置换氮气，依次加入醋酸钯（90mg，0.4mmol），三苯基磷（210mg，0.8mmol），再抽真空置换氮气。升温至87oC加热搅拌16h，冷却至室温，加入乙酸乙酯（100mL）稀释，硅藻土过滤，乙酸乙酯洗涤，滤液用饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，硅胶柱层析，乙酸乙酯：石油醚=1：1为洗脱剂，得到含有化合物6的粗品1g。
将粗品化合物6溶于二氧六环（100mL）中，向其中通入氯化氢气体，薄层层析追踪至化合物6消失，浓缩，加水（25mL）溶解，加入碳酸钠调至PH=10，二氯甲烷萃取，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，柱层析，二氯甲烷：甲醇：三乙胺=10:1:0.1，浓缩含有目标物的组分，最终得到目标产物氘代非手性克里唑蒂尼(Crizotinib)式 I化合物（R为H） (330mg，白色固体)。1H NMR(400MHz, CDCl3) δ1.84(s, 3H),1.90(m, 2H), 2.15(m, 2H), 2.77(m, 2H), 3.23(m, 2H), 4.21(m, 1H),4.76(br, 2H), 6.87(d, J=1.6Hz, 1H), 7.08(dd, J=8Hz,8.8Hz, 1H), 7.32(dd, J=4.8Hz, 8.8Hz, 1H),7.50(s, 1H),7.76(s, 1H) 7.26(d, J=1.6Hz, 1H).
实施例2
Figure 924870DEST_PATH_IMAGE012
化合物1b（10g，50.25mmol）溶于无水甲醇（100mL），置于250mL的单口圆底烧瓶，室温，磁力搅拌下，分批次加入氘代硼氢化钠（3.8g，100mmol），加入完毕后继续搅拌1h，加入2mL水淬灭，浓缩后再加入100mL水，乙酸乙酯萃取（150mL×2），有机相依次用饱和食盐水（100mL）,水（100mL）洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液浓缩得透明无色粘稠油状产品（静置一天后变为白色固体）化合物2b（9.6g，产率95%）。1H NMR(400MHz, CDCl3) δ1.18(m, 2H),1.35(s, 9H), 1.62(m, 2H), 2.91(m, 2H), 3.62(m, 2H), 4.62(s, 1H).
化合物2b(9.6g,47.8mmol)溶于二氯甲烷（120mL），置于250mL三口圆底烧瓶，加入三乙胺（5g，48mmol），冷却至0oC，缓慢滴加甲磺酰氯（5.5g，47.8mmol），加入DMAP（0.6g，4.7mmol）。加料完毕后升温到室温，继续搅拌3h，向反应体系中加入水（50mL），二氯甲烷萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤浓缩得白色固体化合物3b（13g，产率98%）。1H NMR(400MHz, CDCl3) δ1.46(s, 9H), 1.82(m, 2H), 1.95(m, 2H), 3.06(s, 3H) 3.31(m, 2H), 3.71(m, 2H).
4-碘代吡唑（8.2g，42.4mmol）溶于干燥的DMF（150mL），置于250mL的三口圆底烧瓶中，氮气气氛，0oC下，分批次缓慢加入氢化钠（2g，50.6mmol，含量60%）。反应混合液0oC下继续搅拌1h后，加入化合物3b，反应温度升至120oC并继续搅拌12h，待反应体系温度降至室温后，加水（2mL）淬灭反应，浓缩除去大部分DMF，然后加入水（100mL），乙酸乙酯萃取（150mL×2），合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，使用硅胶柱层析，乙酸乙酯：石油醚=1：10为洗脱剂，将含有化合物4b的组分合并，浓缩得到白色固体，25g，产率79%。1H NMR(400MHz, CDCl3) δ1.47(s, 9H), 1.86(m, 2H), 2.09(m, 2H), 2.87(m, 2H), 4.23(m, 2H), 7.45(s, 1H), 7.51(s, 1H).
醋酸钾（5.2g，53.2mmol）置于250mL三口圆底烧瓶中除水（30mm， 180oC，10min），氮气气氛下，加入干燥的DMF，依次向其中加入化合物4b（5g，13.3mmol），联硼烷嚬哪醇酯（3.7g，14.6mmol），醋酸钯（150mg，0.67mmol），三苯基磷（370mg，1.4mmol），抽真空置换氮气后，升温至80oC搅拌2h。反应体系冷却至室温，硅藻土过滤，乙酸乙酯洗涤，浓缩除去大部分DMF后，然后加入水（100mL），乙酸乙酯萃取（150mL×2），合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，使用硅胶柱层析，乙酸乙酯：石油醚=1：5为洗脱剂，得油状粗品，直接用于下一步。
Figure 261305DEST_PATH_IMAGE013
化合物1a（10g，48.5mmol）溶于无水甲醇（100mL），置于250mL的单口圆底烧瓶，室温，磁力搅拌下，分批次加入硼氢化钠（3g，78mmol），加入完毕后继续搅拌1h，加入2mL水淬灭，浓缩后再加入100mL水，乙酸乙酯萃取（150mL×2），有机相依次用饱和食盐水（100mL）,水（100mL）洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液浓缩得透明无色粘稠油状产品（静置一天后变为白色固体）化合物2a（10g，产率99%）。1H NMR(400MHz, CDCl3) δ1.65(d, J=6.8Hz, 3H), 2.90(d, J=6.0Hz, 1H),5.59(m, 1H), 7.03(t, J=8.4Hz, 1H), 7.27(t, J=8.4Hz, 1H).
氮气气氛下，三苯基磷（17.6g，67.2mmol）和DEAD（11.7g，67.2mmol）溶于四氢呋喃（200mL），置于1L的三口圆底烧瓶，冷却至0oC，磁力搅拌下，3-羟基-2-硝基吡啶（7.4g，53mmol）和化合物2a（10g，48mmol）的四氢呋喃溶液（200mL）通过恒压滴液漏斗加入到圆底烧瓶中。所得到的橙色透明溶液升至室温搅拌3h，薄层色谱显示化合物2a消失，将反应液转移到500mL单口圆底烧瓶中，浓缩，柱层析，乙酸乙酯：石油醚=1：5为洗脱剂，将含有化合物3a的组分合并，浓缩得到粉色固体化合物3a（16g，产率99%）。1H NMR(400MHz, CDCl3) δ1.86(d, J=6.8Hz, 3H), 6.10(q, J=6.8Hz, 1H), 7.09(d, J=8.0Hz,8.8Hz, 1H), 7.21(dd, J=0.8Hz,8.4Hz, 1H). 7.32(dd, J=4.8Hz, 8.4Hz, 1H), 7.38(dd, J=4.8Hz, 8.4Hz, 1H), 8.04(dd, J=0.8Hz, 4.4Hz, 1H).
向2L的圆底烧瓶中依次加入醋酸（900mL），乙醇（700mL），化合物3a（16g，48.5mmol），还原铁粉（27g，485mmol），缓慢加热至回流并保持回流1h，冷却至室温后浓缩除去大部分乙酸和乙醇，然后加入乙酸乙酯（500mL）和水（500mL），再向上述混合体系中缓慢加入饱和碳酸钠溶液中和。乙酸乙酯萃取（500mL×2），合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠（200mL），水（200mL），饱和食盐水（200mL），洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩得到粉色固体化合物4a（13g，产率90%）。1H NMR(400MHz, CDCl3) δ1.83(d, J=6.4Hz, 3H), 4.82(br, 1H),6.01(q, J=6.8Hz, 1H), 6.49(dd, J=4.8Hz,7.6Hz, 1H), 6.71(dd, J=1.2Hz, 8.0Hz, 1H). 7.05(dd, J=7.6Hz, 8.4Hz, 1H), 7.30(dd, J=4.8Hz, 8.8Hz, 1H), 7.61(dd, J=1.2Hz, 5.2 Hz, 1H).
化合物4a（13g，43.3mmol）溶于乙腈（150mL）置于250mL的圆底烧瓶中，冷却至0oC，NBS（7.8g，43.3mmol）分批次缓慢加入，添加完毕后0oC下继续搅拌30min。将反应液浓缩，柱层析，乙酸乙酯：石油醚=1：1为洗脱剂，将含有化合物5a的组分合并，浓缩得到褐色固体化合物5a（9g，产率55%）。1H NMR(400MHz, CDCl3) δ1.81(d, J=6.8Hz, 3H), 4.82(br, 1H),5.97(q, J=6.4Hz, 1H), 6.83 (d, J=1.6Hz, 1H), 7.08(t, J= 8.0Hz, 1H), 7.31(dd, J=4.8Hz, 8.8Hz, 1H), 7.65 (d, J=1.6Hz, 1H)
化合物5a（2.6g,7mmol）和化合物5b(3g,8mmol)溶于DME（75mL），置于250mL的三口圆底烧瓶，向此体系中加入碳酸钠水溶液（2.6g，8.3mL），抽空换氮，依次加入醋酸钯（90mg，0.4mmol），三苯基磷（210mg，0.8mmol），再抽真空置换氮气。升温至87oC加热搅拌16h，冷却至室温，加入乙酸乙酯（100mL）稀释，硅藻土过滤，乙酸乙酯洗涤，滤液用饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，硅胶柱层析，乙酸乙酯：石油醚=1：1为洗脱剂，得到含有化合物6的粗品（1g）。
将粗品化合物6溶于二氧六环（100mL）中，向其中通入氯化氢气体，薄层层析追踪至化合物6消失，浓缩，加水（25mL）溶解，加入碳酸钠调至PH=10，二氯甲烷萃取，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，柱层析，二氯甲烷：甲醇：三乙胺=10:1:0.1，浓缩含有目标物的组分，最终得到目标产物氘代非手性克里唑蒂尼(Crizotinib)式 II化合物（R为氢）（330mg，白色固体）。δ1.85(d, J=6.8Hz, 3H),1.97(m, 2H), 2.18(m, 2H), 2.78(m, 2H), 3.27(m, 2H), 479(br, 1H),6.08(q, J=6.0Hz, 1H), 6.87 (d, J=1.6Hz, 1H), 7.05(t, J= 8.0Hz, 1H), 7.31(dd, J=4.8Hz, 8.8Hz, 1H), 7.51(s, 1H), 7.56(s, 1H), 7.76 (d, J=1.6Hz, 1H)
生物活性的测定
目的：使用Caliper Mobility Shift Assay方法在不同三磷酸腺苷（ATP）浓度下Km 值研究筛选了式I化合物和式II化合物对间变型淋巴瘤激酶(ALK) 的活性。
技术背景：使用Caliper Mobility Shift Assay 方法在ATP Km 浓度下筛选式I化合物和式II化合物（R皆为氢） 对间变型淋巴瘤(ALK) 的体外活性，并使用星孢菌素（Staurosporine）做对照品，化合物的生物活性筛选将在10个浓度下重复测定。
材料：
间变型淋巴瘤激酶(ALK)（Carna，Cat.No.08-105,Lot. No. 08CBS-0112）
肽 FAM-P22(GL Biochem，Cat. No.112393, Lot. No. P080401-XY112393)
腺嘌呤核苷三磷酸ATP(Sigma, Cat.No.A7699-1G, CAS No.987-65-5)
二甲亚砜（DMSO）(Sigma, Cat.No.D2650, Lot. No.474382)
乙二胺四乙酸（EDTA）(Sigma, Cat.No.E5134, CAS No.60-00-4)
96-孔测试盘（Corning公司，Cat.3365, Lot.No. 22008026）
384-孔测试盘 (Corning公司，Cat.3573, Lot.No. 12608008)
星孢菌素（Staurosporine）（Sigma， Cat.No.S4400-1MG, Lot.No.046K4080）
受试样品
样品氘代非手性克里唑蒂尼即式I化合物 和式II化合物分别称重1.58毫克和1.52毫克溶入二甲亚砜（DMSO）中，配成浓度为10mM的溶液。
实验方法
1. 为实验用激酶准备1.25x 的激酶基本缓冲溶液和淬灭缓冲溶液。
1.  不含二氯化锰（MnCl2）的1.25x激酶基本缓冲溶液
浓度为62.5mM的羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）溶液， pH=7.5
质量体积浓度（质量单位为g，体积单位为L，下同）为0.001875%的Brij-35
浓度为12.5mM的二氯化镁（MgCl2）溶液
浓度为2.5mM的二硫苏糖醇（DTT）溶液
2.  含二氯化锰（MnCl2）的1.25x激酶基本缓冲溶液
浓度为62.5mM的HEPES溶液， pH=7.5
质量体积浓度为0.001875%的Brij-35
浓度为12.5mM的二氯化镁（MgCl2）溶液
浓度为12.5mM的二氯化锰（MnCl2）溶液
浓度为2.5mM的二硫苏糖醇（DTT）溶液
3.  淬灭缓冲溶液
浓度为100mM的HEPES溶液，pH=7.5
质量体积浓度为0.015%的Brij-35
质量体积浓度为0.2% 的coating-#3 reagent（3号表面试剂，Caliper公司产品）
浓度为50mM的EDTA溶液
II．为实验用激酶准备化合物
   化合物系列(的连续)稀释
4.  吸取5微升浓度为10mM的式I和式II化合物溶液转移至试管中，加95微升DMSO，稀释至化合物浓度为500μM
5.  将试管中的化合物转移至96-孔储存盘中的其中一孔，将其中30μL转移到下一个相邻孔中，并加60μL的DMSO稀释，以此方法连续稀释，得到浓度从500μM到0.025μM的10个化合物溶液。
6.  在同一个96-孔的试验盘中，在每一排孔中都加入60μL的DMSO，做DMSO控制。
7.  从每一个孔中取5μL溶液转移至另一个96孔的测试盘中，并加45μL的H2O。
8.  转移70μL250mM的EDTA作低控制。
9.  在每一个孔中取5μL转移至384-孔分析盘中。96-孔盘中含有低控制的A1转移到384-孔盘中的A1和A2，将96-孔盘中含最高化合物浓度的A2转入384-孔盘的A3和A4，以此类推。（A1-A4为孔的标号）
这样，这个分析盘中就含有5x化合物的10%DMSO溶液，化合物的起始浓度为50μM。
激酶反应
1）            准备2.5x 酶溶液
10.             将激酶加入1.25x 的激酶基本缓冲溶液
2）准备2.5x 肽溶液
11.             将FAM-标记的肽和ATP 加入到1.25激酶基本缓冲溶液
3）将2.5x酶溶液转移至分析盘中
12. 现在分析盘中已有5μL的化合物的10%DMSO溶液
13. 加10μL 2.5x 酶溶液到384-孔分析盘的每一个孔中。
14. 在室温下孵化10分钟
4）将2.5x肽溶液转入分析盘中
    15. 加10μL 2.5x 肽溶液到384-孔分析盘的每一个孔中。
）酶反应和淬灭
    16.在28oC 下孵化1小时。
    17.加25μL 淬灭缓冲溶液以停止反应。
）Caliper 读取数据
    18. Caliper收集数据
7）曲线拟合
    19.从Caliper上拷贝数据
    20. 将转化值转变为抑制值
        抑制百分率=（最大值-转化值）/(最大值-最小值)*100
        最大值代表DMSO控制（DMSO control）；最小值代表低控制（low control）
    21. 在Xlfit 里拟合数据以得到IC50值
        使用如下方程式：
       Y= 最小值+(最大值-最小值)/(1+10^((LogIC50-X)*斜率))
（Y= Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope))）
实验结果
Figure 41097DEST_PATH_IMAGE015
受试样品对间变型淋巴瘤激酶(ALK)的抑制活性IC50（nM）值
Figure 644116DEST_PATH_IMAGE016
结论：
通过体外生物活性筛选，以星孢菌素为对照品，我们所合成的式I化合物和式II化合物对间变型淋巴瘤激酶(ALK)均有很强的抑制能力，IC50（nM）值分别为14.9和9.5。

Claims (4)

1.氘代非手性克里唑蒂尼及其衍生物，其结构式如（I）或（II）所示： 
      
Figure 776659DEST_PATH_IMAGE002
Figure 855474DEST_PATH_IMAGE004
                       
其中，R为氢或叔丁氧基羰基。
2.权利要求1所述的氘代非手性克里唑蒂尼的衍生物的制备方法，其特征在于，将式5a化合物和非氘代的式5b化合物或者将非氘代的式5a化合物和式5b化合物先溶于N，N-二甲基甲酰胺、二乙基酰胺、二氧六环或三乙胺，之后加入碳酸钠、碳酸钾、醋酸钾或三乙胺，氮气保护下，依次加入醋酸钯、三苯基磷，升温至60-150℃加热搅拌2-24h，冷却至室温，常规后处理后得到氘代非手性克里唑蒂尼的衍生物；
Figure 2011100028145100001DEST_PATH_IMAGE005
 、         
Figure 2011100028145100001DEST_PATH_IMAGE006
。
3.权利要求1所述的氘代非手性克里唑蒂尼的制备方法，其特征在于，将式5a化合物和非氘代的式5b化合物或者将非氘代的式5a化合物和式5b化合物先溶于N，N-二甲基甲酰胺、二乙基酰胺、二氧六环或三乙胺，之后加入碳酸钠、碳酸钾、醋酸钾或三乙胺，氮气保护下，依次加入醋酸钯、三苯基磷，升温至60-150℃加热搅拌2-24h，冷却至室温，常规后处理后得到氘代非手性克里唑蒂尼衍生物；将氘代非手性克里唑蒂尼衍生物溶于有机溶剂中，向其中通入氯化氢气体，监控至衍生物消失时，浓缩，调pH为碱性，之后常规后处理，获得氘代非手性克里唑蒂尼；
Figure 33078DEST_PATH_IMAGE005
 、          
Figure 804725DEST_PATH_IMAGE006
。
4.权利要求1所述的氘代非手性克里唑蒂尼在制备治疗癌症药物方面的应用。
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