CN102076851A - Rna的选择性的5′连接标记 - Google Patents

Rna的选择性的5′连接标记 Download PDF

Info

Publication number
CN102076851A
CN102076851A CN2009801253796A CN200980125379A CN102076851A CN 102076851 A CN102076851 A CN 102076851A CN 2009801253796 A CN2009801253796 A CN 2009801253796A CN 200980125379 A CN200980125379 A CN 200980125379A CN 102076851 A CN102076851 A CN 102076851A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rna
enzyme
sample
make
contact
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2009801253796A
Other languages
English (en)
Inventor
J·J·詹德里萨克
R·维迪亚纳桑
G·达尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
EPICT TECHNOLOGIES CORP
Original Assignee
EPICT TECHNOLOGIES CORP
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by EPICT TECHNOLOGIES CORP filed Critical EPICT TECHNOLOGIES CORP
Publication of CN102076851A publication Critical patent/CN102076851A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C12Q1/6855—Ligating adaptors

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供了用于选择性地5′连接标记需要的RNA分子类别的新颖的组合物、试剂盒和方法，它们采用RNA 5′多磷酸酶、RNA 5′单磷酸酶、加帽酶、脱帽酶、核酸焦磷酸酶和RNA连接酶以及其它酶，所述需要的RNA分子类别的差别在于它们的5′末端上的特定化学部分。5′标记的RNA分子可以用于合成标记的第一链cDNA、双链cDNA和有义或反义RNA，它们用于多种用途。

Description

RNA的选择性的5′连接标记
本申请要求2008年5月2日提交的美国临时申请系列号61/050,046的优先权，它通过引用整体并入本文。
发明领域
本发明涉及用于选择性地标记一个或多个需要的RNA分子类别或类型的5′-末端的新颖的方法、组合物和试剂盒，其中每个类别由在5′-核苷酸的5′-位具有特定化学部分或基团的RNA分子组成。某些方法使用申请人发现的新颖的新的酶类别，称作RNA 5′多磷酸酶(polyphosphatatse，RPP)。这些酶特异性地将具有5′-多磷酸基团的RNA转化成具有5′-单磷酸基团的RNA，但是不转化5′-加帽的RNA。申请人发现的某些新颖的方法也使用另一种新颖的酶类别，称作RNA 5′单磷酸酶(RMP)，其将具有5′单磷酸基团的RNA转化成具有5′羟基的RNA，但是不转化具有5′多磷酸基团的RNA。其它方法单独地或组合地按顺序使用RPP、RMP和/或其它酶(包括加帽酶、脱帽酶和核酸焦磷酸酶)，以提供需要的RNA分子类别的选择性的5′-连接标记的新方法。所述方法、组合物和试剂盒可用于例如，研究、人或非人诊断或治疗。
发明背景
近期的研究已经证实，人基因组的几乎所有部分(甚至包括所谓的“非编码区”)都被转录成RNA(例如，参见Genome Research第17卷，第6期：2007年6月)。结果，鉴别、表征和测定所有转录的RNA(包括mRNA、非编码RNA、诸如微RNA(miRNA)或它们的pri-miRNA或前-miRNA前体)和其它RNA分子(包括尚未鉴别出的那些)的生物学命运和功能，在目前具有重大意义。
鉴别和分析各种RNA分子的表达，从而理解分化、对环境的生物学响应和真核生物的正常和异常细胞中的其它生物学过程，也具有持续的兴趣。例如，研究真核细胞中疾病相关的RNA分子，从而理解每种疾病的开始和发展，并有希望地发现治疗或预防该疾病或该疾病进展的方法，具有重大意义。
关于由病原性细菌、支原体和病毒造成的真核生物的疾病，鉴别、表征和测定在感染过程中、疾病开始和疾病进展期间由宿主和病原体的基因组编码的RNA的生物学功能，具有很大兴趣。
不同的RNA分子类别的5′末端的性质在它们的生物学结构和功能中起重要作用。RNA分子的5′末端上的化学部分会影响它们在细胞或有生物体中的结构、稳定性、生化加工、运输、生物学功能和命运。在不同的RNA类别的5′末端处常见的化学部分包括三磷酸、单磷酸、羟基和帽核苷酸。5′末端上的特定化学部分会提供关于RNA的起源、加工、成熟和稳定性的重要线索。在新鉴别的RNA中的该部分的表征，甚至可以提示RNA在细胞中的作用。因此，可以区分含有不同5′末端基团的RNA分子类别的方法，是用于表征、研究和操纵RNA的重要工具。
例如，细菌mRNA通常在它们的5′末端上具有三磷酸基团。另外，已经描述了许多不翻译成蛋白的真核RNA(称作“非编码RNA”或“ncRNA”)，且许多这样的ncRNA具有5′三磷酸基团。另外，小的原核和真核核糖体RNA(例如，5S或5.8S rRNA)和转运RNA(tRNA)通常具有5′三磷酸基团。
大多数真核细胞mRNA和大多数真核病毒mRNA转录物在它们的5′端处“加帽”。“帽”或“帽核苷酸”由鸟嘌呤核苷组成，其通过它的5′-碳连接至三磷酸基团，后者又连接至初级mRNA转录物的最5′的核苷酸的5′-碳，且在大多数真核生物中，在帽核苷酸中的鸟嘌呤的7位处的氮被甲基化。因而，大多数真核细胞mRNA和大多数真核病毒mRNA在它们的5′末端具有“N7-甲基鸟苷”或“m7G”帽或帽核苷酸。
除了真核细胞和病毒mRNA以外，某些ncRNA也被加帽，且某些加帽的ncRNA像大多数真核mRNA一样也具有3′聚(A)尾序。例如，Rinn，JL等人(Cell 129：1311-1323，2007)描述了在人12号染色体的HOXC区域(称作“HOTAIR”)中编码的一种加帽的且聚腺苷酸化的2.2-千碱基ncRNA，其对2号染色体上的HOXD基因的表达具有深远影响。另外，样品中的某些其它真核RNA(诸如小核RNA(“snRNA”)和前-miRNA)可以被加帽。
真核细胞和病毒mRNA(和某些其它形式的RNA)的5′帽在mRNA代谢中起重要作用，且在不同程度上是细胞核中mRNA转录物的加工和成熟、mRNA从细胞核向细胞质的运输、mRNA稳定性和mRNA向蛋白的有效翻译所需要的。例如，所述帽在蛋白合成的开始和真核mRNA加工以及体内稳定性中起关键作用。所述帽会提供对5′核糖核酸外切酶(XRN)活性的抗性，且它的缺失会导致mRNA的快速降解(例如，参见Mol.Biol.Med.5：1-14，1988；Cell 32：681-694，1983)。因而，为导入(例如，通过显微注射进***或转染进细胞)和在真核细胞中表达而制备(例如，在体外)的mRNA应当被加帽。
许多真核病毒RNA仅在被加帽时是感染性的，且当通过转染或显微注射将没有加帽的RNA分子(即，它们是“未加帽的”)导入细胞时，它们会被细胞RNA酶迅速降解(例如，参见Krieg，和Melton，Nucleic Acids Res.12：7057，1984；Drummond，等人Nucleic Acids Res.13：7375，1979)。
许多真核细胞基因和真核病毒基因的初级转录物需要加工，以去除这些转录物的编码区内的间插序列(内含子)，且帽的益处也延伸至这样的前-mRNA的稳定化。例如，已经证实，前-mRNA上帽的存在，会增强酵母中前-mRNA的体内剪接，但不是体内剪接或使用体外酵母剪接***的剪接所需的(Fresco，LD和Buratowski，S，RNA 2：584-596，1996；Schwer，B等人，Nucleic Acids Res.26：2050-2057，1998；Schwer，B和Shuman，S，RNA 2：574-583，1996)。剪接的增强，主要是由于前-mRNA的增加的稳定性，因为在缺少帽的情况下，前-mRNA会被5′核糖核酸外切酶迅速降解(Schwer，B，Nucleic Acids Res.26：2050-2057，1998)。因而，将为体外RNA剪接实验合成的转录物加帽，也是有益的。
尽管在从细胞核运出后加帽的mRNA保留在细胞质中，某些其它RNA(诸如某些snRNA)具有被进一步甲基化的帽，然后运回细胞核中，它们在那里参与来自前-mRNA的内含子的剪接，产生mRNA外显子(Mattaj，Cell 46：905-911，1986；Hamm等人，Cell 62：569-577，1990；Fischer，等人，J.Cell Biol.113：705-714，1991)。
剪接反应产生剪接的内含子RNA，其最初包含具有5′单磷酸基团的RNA。因而，至少某些从前-mRNA剪接反应最初产生的内含子RNA分子也具有5′磷酸基团。另外，某些其它的RNA，诸如真核的或病毒编码的微RNA(miRNA)，和真核和原核大核糖体RNA分子(rRNA)，包括18S和26S或28S真核rRNA或16S和23S原核rRNA，在它们的5′末端上具有单磷酸基团。
RNA酶A-降解的RNA和某些其它的内切核酸酶水解加工的RNA分子具有5′羟基。
修饰RNA的5′末端的酶是用于体外表征和操作不同RNA分子的有用工具。例如，碱性磷酸酶(AP)(例如，APEXTM碱性磷酸酶(EPICENTRE)、虾碱性磷酸酶(USB，Cleveland，OH)或北极碱性磷酸酶(New England Biolabs，MA)会将未加帽的初级RNA的5′三磷酸和rRNA的5′单磷酸转化成5′羟基，生成具有5′羟基的RNA，但是不影响加帽的RNA。核酸焦磷酸酶(PPase)(例如，烟酸焦磷酸酶(TAP))会切割加帽的和未加帽的RNA的三磷酸基团，合成具有5′单磷酸基团的RNA。脱帽酶(例如，酵母脱帽酶、哺乳动物脱帽酶、拟南芥脱帽酶或痘苗病毒脱帽酶D9或D10)会将加帽的RNA(例如，m7G-加帽的RNA)转化成具有5′单磷酸基团的RNA。加帽酶(例如，SCRIPTCAPTM加帽酶，EPICENTRE；痘病毒加帽酶；痘苗病毒加帽酶；或啤酒糖酵母加帽酶RNA三磷酸酶)会将具有5′三磷酸基团的RNA或具有5′二磷酸基团的RNA转化成加帽的RNA。多核苷酸激酶(PNK；例如，T4PNK)会将RNA分子的5′末端上的羟基单磷酸化，并去除在RNA分子的3′末端上的单磷酸基团(例如，通过RNA酶A的作用产生的3′单磷酸)。此外，5′核糖核酸外切酶(XRN；例如，啤酒糖酵母Xrn I核糖核酸外切酶)会将5′-单磷酸化的RNA消化成单核苷酸，但是通常不消化具有5′三磷酸、5′帽或5′羟基的RNA。
RNA连接酶的反应特异性也可以作为区分具有不同5′末端基团的RNA分子的有用工具。该酶会特异性地催化供体RNA的5′单磷酸和受体寡核苷酸(例如，RNA受体寡核苷酸)的3′-羟基之间的磷酸二酯键形成。因而，无论是在样品中存在的还是通过用TAP处理5′-三磷酸化的或5′-加帽的RNA得到的、在5′末端具有单磷酸基团的RNA，都是使用RNA连接酶连接具有3′羟基的受体核酸的供体底物。含有三磷酸、二磷酸、羟基或加帽的5′末端基团的RNA分子不起RNA连接酶(例如，T4RNA连接酶，EPICENTRE或噬菌体TS2126 RNA连接酶)的供体分子的功能。因而，无论是在样品中存在的还是通过AP处理得到的在5′末端具有羟基的RNA，不能用作RNA连接酶(例如，T4 RNA连接酶，EPICENTRE或噬菌体TS2126 RNA连接酶)的供体底物。类似地，含有3′-端封闭基团的RNA分子(例如，具有3′-磷酸基团或3′-β-甲氧基苯基磷酸基团的RNA分子)不能起RNA连接酶的受体底物的功能。
许多出版物公开了碱性磷酸酶(AP)、烟酸焦磷酸酶(TAP)和RNA连接酶用于操纵m7G-加帽的真核mRNA的应用，其中使用所谓的“寡核苷酸加帽方法”。例如，寡核苷酸加帽方法和它们的应用公开在：世界专利申请WO0104286；和WO 2007/117039A1；美国专利5,597,713；Suzuki，Y等人，Gene 200：149-156，1997；Suzuki，Y和Sugano，S，Methods in Molecular Biology，175：143-153，2001，Starkey，MP和Elaswarapu，R编，Humana Press，Totowa，NJ；Fromont-Racine，M等人，Nucleic Acids Res.21：1683-4，1993；和Maruyama，K和Sugano，S，Gene138：171-174，1994。
在那些寡核苷酸加帽方法中，首先用AP处理总真核RNA或分离的聚腺苷酸化的RNA，然后将AP灭活或去除。AP会将具有5′三磷酸的RNA(例如，未加帽的初级RNA)和具有5′单磷酸的RNA转化成具有5′羟基的RNA。然后用TAP处理样品，所述TAP将5′-加帽的真核mRNA转化成具有5′单磷酸的mRNA。然后使用RNA连接酶，用受体寡核苷酸将得到的5′-单磷酸化的mRNA“寡核苷酸加帽”(或“5′连接标记”)。具有与它的5′末端相连的“标记”的“寡核苷酸加帽的”mRNA又用作合成第一链cDNA的模板，所述第一链cDNA具有与它的3′末端相连的标记。然后，使用第二链cDNA合成引物(其与第一链cDNA的3′末端所连接的标记互补)可以制备双链cDNA，并且可以使用得到的双链cDNA(例如，生成全长cDNA文库)。本领域的寡核苷酸加帽方法可用于m7G-加帽的RNA的5′连接标记，用于使用5′-连接标记的RNA作为模板制备全长第一链cDNA，用于制备全长双链cDNA(包括全长cDNA文库)，和用于鉴别真核mRNA的5′末端(例如，通过测序或诸如cDNA末端的随机扩增(5′RACE)等方法)。
但是，寡核苷酸加帽和本领域现有的其它方法的一个问题是，AP步骤将具有5′三磷酸或5′单磷酸基团的所有RNA分子的5′末端转化成5′羟基(例如，参见世界专利申请WO0104286的图2)。因而，尽管AP步骤对于某些用途而言是有益的，因为它导致5′-单磷酸化的RNA分子(例如，miRNA)的脱磷酸，所以它们不能用作通过RNA连接酶连接受体寡核苷酸的供体，该AP步骤也导致未加帽的mRNA分子和未加帽的非编码初级RNA分子(它们可能具有功能重要性)的脱磷酸，所以它们不能用作连接受体寡核苷酸的供体。本领域需要选择性地5′连接标记样品中的5′-三磷酸化的未加帽的RNA分子(诸如未加帽的mRNA和非编码初级RNA)并将所述5′-连接标记的RNA分子转化成cDNA、而不5′连接标记样品中的5′-单磷酸化的RNA分子的方法。
另外，本领域需要选择性地对样品中具有5′单磷酸基团的那些RNA分子脱磷酸、而不从初级RNA转录物去除5′三磷酸基团的方法。需要采用酶组合物的方法、组合物和试剂盒，所述酶组合物能选择性地将不需要的RNA的5′单磷酸基团消化成5′羟基，使得不需要的RNA不会被受体寡核苷酸5′连接标记。因而，需要采用RNA 5′单磷酸酶组合物的方法、组合物和试剂盒。
另外，尽管本领域已知的方法可以用于m7G-加帽的RNA分子的选择性的5′连接标记，目前本领域没有仅选择性地5′连接标记样品(其也含有加帽的RNA分子)中的未加帽的初级RNA分子的好方法。这是令人遗憾的，因为希望特异性地寡核苷酸加帽(或“5′连接标记”)和研究据信在细胞生物学活性中起作用(包括调节基因表达)的未加帽的真核初级RNA。本领域另外需要选择性地5′连接标记样品(其也含有加帽的真核RNA分子)中的未加帽的真核初级RNA分子的方法。
目前本领域没有仅选择性5′连接标记样品(其也含有加帽的RNA分子)中的未加帽的初级RNA分子的好方法，也是令人遗憾的，因为一般而言细菌mRNA分子是未加帽的。因而，难以研究与真核细胞有关的病原性的(例如，支原体)或共生的(例如，根瘤菌属)原核生物的基因的表达。本领域需要选择性5′连接标记原核生物的5′-多磷酸化的RNA、而不5′连接标记加帽的真核mRNA分子(例如，为了研究在病原性的或共生的过程中原核基因表达)的方法，所述原核生物的5′-多磷酸化的RNA包括在真核细胞中存在的或与真核细胞有关的细菌或支原体(诸如与真核细胞有关的病原性的或共生的原核生物)的未加帽的初级RNA分子。
本领域另外需要选择性5′连接标记来自不同环境(例如，来自土壤、海洋、湖泊、河流和其它环境，包括具有不同的或极端的温度、pH、元素或化学物质含量等条件或其它性质的那些)的样品中的初级原核RNA分子、从而为实用目的(例如，为了鉴别RNA转录物以表达具有医学或工业用途的酶或蛋白)得到、鉴别、表征、克隆、表达、研究和开发那些RNA分子的方法。作为实例，需要比本领域已知的方法(例如，J.Frias-Lopez等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105：3805-3810，2008所述的方法)更容易的、更有效的并提供更多且更好的用于后转录组学(metatranscriptomic)调查和研究的数据的5′连接标记方法。
因而，本领域需要选择性5′连接标记样品中的需要的RNA分子、而不5′连接标记不需要的RNA分子的方法(例如，选择性地5′连接标记含有未加帽的和加帽的RNA的样品中的未加帽的初级RNA分子，而不5′连接标记加帽的RNA分子)。
在本发明之前，本领域未知使用选择性地将初级RNA(诸如未加帽的真核初级RNA或细菌mRNA)的5′三磷酸消化成5′单磷酸、而不消化加帽的真核mRNA的酶的方法。因而，本领域已知的寡核苷酸加帽方法不能用于从未加帽的真核初级RNA和/或全长原核mRNA选择性地合成cDNA、用于克隆从未加帽的全长真核初级RNA和/或原核mRNA制备的cDNA、用于未加帽的全长真核初级RNA和/或原核mRNA的RNA扩增、或用于捕获和鉴别也含有加帽的RNA分子的样品中的未加帽的全长真核初级RNA和/或原核初级mRNA的精确5′末端。本领域需要这样的方法、组合物和试剂盒：其采用在所述酶组合物不消化加帽的RNA的5′末端的条件下能将未加帽的初级RNA的5′三磷酸基团消化成单磷酸的酶组合物。因而，需要采用RNA 5′多磷酸酶组合物的方法、组合物和试剂盒。
本领域需要这样的方法、组合物和试剂盒：其采用RNA 5′多磷酸酶组合物和/或RNA 5′单磷酸酶组合物，包括与本领域已知的一种或多种其它酶的组合，用于使用RNA连接酶对含有受体寡核苷酸的任意需要的RNA分子群体进行5′连接标记，用于从全长需要的RNA(例如，全长加帽的真核RNA、全长未加帽的真核初级RNA和/或全长原核初级mRNA)合成cDNA，和用于克隆所述cDNA，用于所述需要的RNA的RNA扩增，和用于捕获和鉴别所述需要的RNA的精确5′末端(例如，通过测序，或通过使用诸如cDNA末端的随机扩增(RACE)、外显子阵列或其它微阵列等方法)。需要更好且更有效的从样品中的特定RNA分子类型制备标记的DNA片段的方法，所述标记的DNA片段用于核酸扩增、用于制备标记的进行表达分析的靶(例如，使用微阵列或qPCR)和用作下一代测序的模板。
发明概述
在有些实施方案中，本发明提供了5′连接标记样品中具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA的方法，所述方法包含下述步骤：(A)提供：(i)样品，其含有具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA，包括其中所述样品另外含有具有5′单磷酸基团的RNA和/或加帽的RNA和/或具有5′羟基的RNA；(ii)RNA 5′多磷酸酶；(iii)显示标记的受体寡核苷酸；和(iv)RNA连接酶；(B)使所述样品接触RNA 5′多磷酸酶，接触的条件和时间足以使得其中具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA被转化成具有5′单磷酸基团的RNA；和(C)使来自步骤(B)的样品接触受体寡核苷酸和RNA连接酶，接触的条件和时间足以使得其中受体寡核苷酸的3′末端被连接到具有5′单磷酸基团的RNA上，但是不连接到加帽的RNA上，并且生成5′-连接标记的RNA。
在其它实施方案中，本发明提供了在步骤(A)中提供的样品，其另外含有具有5′单磷酸基团的RNA，但是所述受体寡核苷酸仅连接到在步骤(B)中从具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA转化得到的具有5′单磷酸基团的RNA上，且不连接到在步骤(A)中提供的样品中已经存在的具有5′单磷酸基团的RNA上，其中所述方法另外包含下述子步骤：提供RNA5′单磷酸酶；且在步骤(B)之前，使所述样品接触RNA 5′单磷酸酶，接触的条件和时间足以使得其中样品中具有5′单磷酸基团的RNA被转化成具有5′羟基的RNA；和灭活或去除RNA 5′单磷酸酶。
在其它实施方案中，所述方法另外包含5′连接标记样品中加帽的RNA，其中所述方法另外包含下述子步骤：提供核酸焦磷酸酶或脱帽酶；和，在步骤(C)之前，使来自步骤(B)的样品接触核酸焦磷酸酶或脱帽酶，接触的条件和时间足以使得其中样品中加帽的RNA被转化成具有5′单磷酸基团的RNA，由此在步骤(A)中提供的样品中包含的加帽的RNA也在步骤(C)中被5′-连接标记。
在有些实施方案中，本发明提供了5′连接标记样品中加帽的RNA的方法，所述方法包含下述步骤：(A)提供：(i)样品，其含有加帽的RNA，并任选地含有具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA，和/或具有5′单磷酸基团的RNA；和/或具有5′羟基的RNA，(ii)RNA 5′多磷酸酶；(iii)RNA5′单磷酸酶；(iv)核酸焦磷酸酶或脱帽酶；(v)受体寡核苷酸；和(vi)RNA连接酶；(B)使所述样品接触RNA 5′多磷酸酶，接触的条件和时间足以使得其中具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA被转化成具有5′单磷酸基团的RNA；(C)使来自步骤(B)的样品接触RNA 5′单磷酸酶，接触的条件和时间足以使得其中具有5′单磷酸基团的RNA被转化成具有5′羟基的RNA；(D)灭活或去除RNA 5′单磷酸酶；(E)使步骤(D)之后的样品接触核酸焦磷酸酶或脱帽酶，接触的条件和时间足以使得其中样品中加帽的RNA被转化成具有5′单磷酸基团的RNA；(F)使来自步骤(E)的样品接触受体寡核苷酸和RNA连接酶，接触的条件和时间足以使得其中受体寡核苷酸的3′末端被连接到步骤(E)中生成的具有5′单磷酸基团的RNA的5′末端上，但是未连接到在步骤(B)中从具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA转化得到的具有5′单磷酸基团的RNA上或在步骤(A)中提供的样品中已经存在的具有5′单磷酸基团的RNA上，并且从加帽的RNA生成5′-连接标记的RNA。
在某些实施方案中，本发明提供了5′连接标记具有5′多磷酸基团的加帽的RNA和/或未加帽的RNA的方法，所述方法包含下述步骤：(A)提供：(i)样品，其含有具有5′多磷酸基团的加帽的RNA和/或未加帽的RNA；(ii)核酸焦磷酸酶；(iii)受体寡核苷酸；和(iv)RNA连接酶；(B)使样品(其中所述样品尚未接触碱性磷酸酶)接触核酸焦磷酸酶，接触的条件和时间足以使得其中具有5′多磷酸基团的加帽的RNA和未加帽的RNA被转化成具有5′单磷酸基团的RNA；(C)使来自步骤(B)的样品接触受体寡核苷酸和RNA连接酶，接触的条件和时间足以使得其中受体寡核苷酸的3′末端被连接到具有5′单磷酸基团的RNA的5′末端上，生成5′-连接标记的RNA。
在具体实施方案中，在步骤(A)中提供的样品另外含有具有5′单磷酸基团的RNA，但是所述受体寡核苷酸仅连接到在步骤(B)中从具有5′多磷酸基团的加帽的RNA和/或未加帽的RNA转化得到的具有5′单磷酸基团的RNA上，且未连接到在步骤(A)中提供的样品中已经存在的具有5′单磷酸基团的RNA上，其中所述方法另外包含下述子步骤：提供RNA 5′单磷酸酶；且在步骤(B)之前，使所述样品接触RNA 5′单磷酸酶，接触的条件和时间足以使得其中样品中具有5′单磷酸基团的RNA被转化成具有5′羟基的RNA；和灭活或去除RNA 5′单磷酸酶。
在其它实施方案中，本发明提供了5′连接标记样品中具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA、而不5′连接标记样品中具有5′单磷酸基团的RNA的方法，所述方法包含下述步骤：(A)提供：(i)样品，其含有具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA和具有5′单磷酸基团的RNA；(ii)加帽酶；(iii)RNA 5′单磷酸酶或碱性磷酸酶；(iv)核酸焦磷酸酶或脱帽酶；(v)受体寡核苷酸；和(vi)RNA连接酶；(B)使所述样品接触加帽酶，接触的条件和时间足以使得其中具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA被转化成加帽的RNA；(C)使来自步骤(B)的样品接触RNA 5′单磷酸酶或碱性磷酸酶，接触的条件和时间足以使得其中具有5′单磷酸基团的RNA被转化成具有5′羟基的RNA；(D)灭活或去除在步骤(C)中使用的RNA 5′单磷酸酶或碱性磷酸酶；(E)使步骤(D)之后的样品接触核酸焦磷酸酶或脱帽酶，接触的条件和时间足以使得其中加帽的RNA被转化成具有5′单磷酸基团的RNA；(F)使来自步骤(E)的样品接触受体寡核苷酸和RNA连接酶，接触的条件和时间足以使得其中受体寡核苷酸的3′末端被连接到具有5′单磷酸基团的RNA的5′末端上，生成5′-连接标记的RNA。
在有些实施方案中，在步骤(A)中提供的样品另外含有加帽的RNA，且其中从在步骤(A)的样品中提供的加帽的RNA和从在步骤(B)中加帽的、样品中的具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA，生成5′-连接标记的RNA。
在具体实施方案中，本发明提供了5′连接标记样品中加帽的RNA和具有5′单磷酸基团的RNA、而不5′连接标记样品中具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA的方法，所述方法包含下述步骤：(A)提供：(i)样品，其至少含有加帽的RNA、具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA和具有5′单磷酸基团的RNA；(ii)脱帽酶；(iii)受体寡核苷酸；和(iv)RNA连接酶；(B)使所述样品接触脱帽酶，接触的条件和时间足以使得其中加帽的RNA被转化成具有5′单磷酸基团的RNA；和(C)使来自步骤(B)的样品接触受体寡核苷酸和RNA连接酶，接触的条件和时间足以使得其中受体寡核苷酸的3′末端被连接到具有5′单磷酸基团的RNA的5′末端上，生成5′-连接标记的RNA。
在其它实施方案中，本发明提供了5′连接标记样品中加帽的RNA、而不5′连接标记具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA或具有5′单磷酸基团的RNA的方法，所述方法包含下述步骤：(A)提供：(i)样品，其含有加帽的RNA、具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA、具有5′单磷酸基团的RNA和/或具有5′羟基的RNA；(ii)RNA 5′单磷酸酶或碱性磷酸酶；(iii)脱帽酶；(iv)受体寡核苷酸；和(v)RNA连接酶；(B)使所述样品接触RNA 5′单磷酸酶或碱性磷酸酶，接触的条件和时间足以使得其中各个酶是有活性的，且它催化的反应可以完成；(C)灭活或去除在步骤(B)中使用的RNA 5′单磷酸酶或碱性磷酸酶；(D)使来自步骤(C)的样品接触脱帽酶，接触的条件和时间足以使得其中加帽的RNA被转化成具有5′单磷酸基团的RNA；和(E)使来自步骤(D)的样品接触受体寡核苷酸和RNA连接酶，接触的条件和时间足以使得其中受体寡核苷酸的3′末端被连接到在步骤(D)中从加帽的RNA生成的具有5′单磷酸基团的RNA的5′末端上，生成5′-连接标记的RNA。
在其它实施方案中，所述方法另外包含下述步骤：提供聚(A)聚合酶和ATP；并且使样品接触聚(A)聚合酶和ATP，接触的条件和时间足以使得其中聚(A)尾序被添加到样品中的RNA分子的3′-末端上，生成具有聚(A)尾序的RNA。
在具体实施方案中，所述样品包含第一种样品，其含有源自第一种类型或第一种条件或第一种环境的细胞的RNA，且其中所述方法另外包含：从由第一种样品生成的5′-连接标记的RNA中扣除在源自第二种类型或第二种条件或第二种环境的细胞的第二种样品中也存在的那些RNA分子，从而产生源自仅在第一种样品中存在、但是在第二种样品中缺乏的RNA的5′-连接标记的RNA分子群体，所述方法包含下述步骤：(i)提供从第一种样品产生的5′-连接标记的RNA，和第二种样品，其含有源自第二种类型或第二种条件或第二种环境的细胞的RNA；(ii)通过第二种样品中的RNA的逆转录，制备第一链cDNA；(iii)使从第一种样品产生的5′-连接标记的RNA与从来自第二种样品的RNA制备的第一链cDNA退火，退火的条件和时间足以使得其中在从第一种样品产生的5′-连接标记的RNA和从来自第二种样品的RNA制备的第一链cDNA之间形成杂交复合体；和(iv)用RNA酶H处理杂交复合体，处理的条件和时间足以使得其中与cDNA退火的RNA被消化，并生产经扣除的5′-连接标记的RNA，其由源自仅在第一种样品中存在、但是在第二种样品中缺乏的RNA的5′-连接标记的RNA组成。
在其它实施方案中，在步骤(A)中提供的用于从第一种样品中的RNA生成5′-连接标记的RNA的受体寡核苷酸含有亲和分子，且所述方法另外包含下述步骤：提供固体表面，能结合亲和分子的亲和结合物质附着在所述固体表面上；和，在步骤(iv)之前或之后，使从第一种样品产生的5′-连接标记的RNA接触固体表面，接触的条件和时间足以使得其中来自第一种样品的5′-连接标记的RNA结合到亲和结合物质所附着的固体表面上，且源自第一种样品中的RNA的5′-连接标记的RNA被捕获到固体表面上。
在有些实施方案中，所述方法另外包含从5′-连接标记的RNA合成第一链cDNA，其中所述方法另外包含下述步骤：提供RNA-依赖性的DNA聚合酶；和使5′-连接标记的RNA接触RNA-依赖性的DNA聚合酶，接触的条件和时间足以使得其中合成与5′-连接标记的RNA互补的第一链cDNA；包括其中所述方法另外包含：提供与5′-连接标记的RNA互补的第一链cDNA合成引物，和使5′-连接标记的RNA接触第一链cDNA合成引物和RNA-依赖性的DNA聚合酶，接触的条件和时间足以使得其中合成与5′-连接标记的RNA互补的cDNA；诸如其中所述第一链cDNA合成引物包含这样的序列，即其中至少它的3′末端显示选自下述的序列：与同聚序列互补的序列，所述同聚序列在转录后(在体内细胞中或在体外)添加到样品中RNA的3′末端上或5′-连接标记的RNA的3′末端上；与一个或多个RNA分子的3′末端处的已知序列互补的序列；与一个或多个RNA分子的一个或多个内部区域互补的序列；所有可能的序列的集合，其中每个序列是随机的；与聚(A)尾序互补的序列，其选自寡(dT)n序列、寡(dU)n序列、寡(U)n序列、寡(dT)nX锚定的序列、寡(dU)nX锚定的序列、和寡(U)nX锚定的序列；和与寡核苷酸标记互补的序列，所述寡核苷酸标记添加到样品中RNA的3′末端或5′-连接标记的RNA的3′末端；和/或其中所述第一链cDNA合成引物另外显示特异性5′序列，它位于所述引物的3′末端显示的序列的5′，其中所述特异性5′序列能用作合成第二链cDNA的模板，该第二链cDNA显示特异性3′序列，该特异性3′序列与所述特异性5′序列互补并提供用于第二链cDNA的特异性引发的位点。
在具体实施方案中，所述方法另外包含下述步骤：提供RNA酶H和RNA酶I；和使含有第一链cDNA的样品接触RNA酶H和RNA酶I，接触的条件和时间足以使得其中所述RNA被消化。在其它实施方案中，所述方法另外包含下述步骤：提供DNA-依赖性的DNA聚合酶；和使第一链cDNA接触DNA-依赖性的DNA聚合酶，接触的条件和时间足以使得其中合成双链cDNA；包括其中所述方法另外包含下述步骤：提供第二链cDNA合成引物和DNA-依赖性的DNA聚合酶，所述引物与第一链cDNA的一部分互补，所述部分与在步骤(A)中提供的受体寡核苷酸互补；和使第二链cDNA合成引物和DNA-依赖性的DNA聚合酶接触第一链cDNA，接触的条件和时间足以使得其中合成双链cDNA；其中所述DNA-依赖性的DNA聚合酶与为第一链cDNA的合成所提供的RNA-依赖性的DNA聚合酶相同；或其中所述DNA-依赖性的DNA聚合酶不同于为第一链cDNA的合成所提供的RNA-依赖性的DNA聚合酶。
在具体实施方案中，受体寡核苷酸的5′部分、第一链cDNA合成引物的5′-部分或第二链cDNA合成引物的5′-部分显示双链RNA聚合酶启动子的一条链的序列，且所述方法另外包含下述步骤：提供可以使用双链RNA聚合酶启动子合成RNA的RNA聚合酶、第一链cDNA合成引物，或第二链cDNA合成引物，所述启动子一条链的序列显示在受体寡核苷酸中；和使双链cDNA接触RNA聚合酶，接触的条件和时间足以使得其中合成RNA。
在有些实施方案中，受体寡核苷酸、第一链cDNA引物或第二链cDNA引物含有亲和分子或连接到亲和分子上，且所述方法另外包含下述步骤：提供固体表面，其共价地或非共价地包被有能特异性地结合亲和分子的亲和结合物质；和，在涉及亲和分子的步骤之前或之后，接触化学连接到亲和分子上的受体寡核苷酸、第一链cDNA引物或第二链cDNA引物，接触的条件和时间足以使得其中亲和分子结合于连接到固体表面上的亲和结合物质。
在其它实施方案中，合成的各个5′-连接标记的RNA、第一链cDNA或第二链cDNA含有亲和分子，且含有亲和分子的5′-连接标记的RNA、第一链cDNA或第二链cDNA通过它与固体表面的结合被捕获、分离或纯化，所述方法包含下述步骤：在存在促进含有亲和分子的5′-连接标记的RNA、第一链cDNA或第二链cDNA与附着在固体表面上的亲和结合物质的结合的试剂和条件下，使含有亲和分子的5′-连接标记的RNA、第一链cDNA或第二链cDNA接触固体表面，其中所述含有亲和分子的5′-连接标记的RNA、第一链cDNA或第二链cDNA被结合到表面上，由此捕获、分离或纯化含有亲和分子的5′-连接标记的RNA、第一链cDNA或第二链cDNA；包括其中所述亲和分子是生物素，且所述亲和结合物质是亲和素或链霉亲和素，或其中所述亲和分子是洋地黄毒苷，且所述亲和结合物质是特异性地结合洋地黄毒苷的抗体。
在有些实施方案中，本发明提供了用于执行权利要求1-26中任一项的方法的试剂盒，其中所述试剂盒包含RNA 5′多磷酸酶(RPP)和至少一种选自下述的其它组分：RNA 5′单磷酸酶(RMP)；碱性磷酸酶(AP)；核酸焦磷酸酶；脱帽酶；加帽酶；连接酶；RNA受体寡核苷酸；聚(A)聚合酶；聚(U)聚合酶；RNA-依赖性的DNA聚合酶(RT)；第一链cDNA合成引物；RNA酶H；第二链cDNA合成引物；RNA聚合酶(RNAP)；5核糖核酸外切酶(Xrn)；多核苷酸激酶(PNK)；和具有5′三磷酸或二磷酸基团的RNA分子，其中所述基团的β或γ磷酸被标记；或其中所述试剂盒包含RNA 5′单磷酸酶(RMP)(例如，RNA 5′单磷酸酶1(RMP1，EPICENTRE)和至少一种选自下述的其它组分：RNA 5′多磷酸酶(例如，铝-可诱导的RNA 5′多磷酸酶，例如，大肠杆菌RNA 5′多磷酸酶I(RPP I)，EPICENTRE或志贺氏菌属RNA 5′多磷酸酶I)；碱性磷酸酶(例如，APEXTM碱性磷酸酶(EPICENTRE)、虾碱性磷酸酶(USB，Cleveland，OH)或北极碱性磷酸酶(New England Biolabs，MA)；核酸焦磷酸酶(例如，烟酸焦磷酸酶(TAP)，EPICENTRE)；脱帽酶(例如，酵母脱帽酶、哺乳动物脱帽酶、拟南芥脱帽酶和痘病毒或痘苗病毒脱帽酶(例如，痘苗病毒脱帽酶D9和D10))；加帽酶(例如，痘病毒加帽酶、啤酒糖酵母加帽酶或SCRIPTCAPTM加帽酶试剂盒，(EPICENTRE))；RNA连接酶(例如，T4RNA连接酶，EPICENTRE或噬菌体TS2126RNA连接酶)；RNA受体寡核苷酸；聚(A)聚合酶(例如，大肠杆菌聚(A)聚合酶，EPICENTRE)；RNA-依赖性的DNA聚合酶(RT)(例如，SUPERSCRIPT RT(Invitrogen，Carlsbad，CA)、AMV RT、MMLV RT(EPICENTRE))；第一链cDNA合成引物；RNA酶H(例如，大肠杆菌RNA酶H或HYBRIDASETM RNA酶H，EPICENTRE)；第二链cDNA合成引物；RNA聚合酶(RNAP)(例如，T7-型RNAP，例如，T7 RNAP、T3 RNAP或SP6 RNAP，EPICENTRE)；5′核糖核酸外切酶(例如，TERMINATORTM 5′-磷酸-依赖性的外切核酸酶或啤酒糖酵母Xrn I核糖核酸外切酶(Xrn I)，EPICENTRE)；多核苷酸激酶(PNK)(例如，T4PNK，EPICENTRE)；具有5′三磷酸或二磷酸基团的RNA分子，其中所述基团的β或γ磷酸被标记；包括其中所述RPP选自铝-可诱导的RPP、大肠杆菌RPP I和志贺氏菌属RPP I；和，如果包含在试剂盒中，所述至少一种其它组分选自：所述RMP是RNA 5′单磷酸酶1(RMP1)；所述AP选自APEXTM碱性磷酸酶、虾碱性磷酸酶和北极碱性磷酸酶；所述核酸焦磷酸酶是烟酸焦磷酸酶(TAP)；所述脱帽酶选自酵母脱帽酶、哺乳动物脱帽酶、拟南芥脱帽酶、痘病毒脱帽酶和痘苗病毒脱帽酶(例如，痘苗病毒脱帽酶D9和D10)；所述加帽酶选自痘病毒加帽酶、啤酒糖酵母加帽酶和SCRIPTCAPTM加帽酶；所述RNA连接酶选自T4 RNA连接酶和噬菌体TS2126 RNA连接酶；所述聚(A)聚合酶选自大肠杆菌聚(A)聚合酶和啤酒糖酵母聚(A)聚合酶；所述RT选自SUPERSCRIPTTM RT、AMV RT和MMLV RT；所述RNA酶H选自大肠杆菌RNA酶H和HYBRIDASETM RNA酶H；所述RNAP选自T7-型RNAP、T7 RNAP、T3 RNAP和SP6 RNAP；所述5′核糖核酸外切酶选自TERMINATORTM 5′-磷酸-依赖性的外切核酸酶和啤酒糖酵母XrnI核糖核酸外切酶(Xrn I)；或所述PNK是T4 PNK。
在其它实施方案中，本发明提供了向样品中的2’OMe-RNA分子的3′-末端添加聚(A)尾序的方法，其中所述2’-OMe基团是在它们的3′-端核苷酸上，其中所述方法包含：(a)使样品与腺苷酸化的单核苷酸(A5′pp5′X)(例如，腺苷酸化的腺苷5′-单磷酸或二腺苷焦磷酸(A5′pp5′A))和T4 RNA连接酶(例如，T4 RNA连接酶1或T4 RNA连接酶2或截短的T4 RNA连接酶2)一起温育，温育的条件和时间足以使得其中至少一个单核苷酸-5′-磷酸残基(5′-XMP)(例如，5′-AMP)被连接到2’OMe-RNA分子的3′-末端；然后，(b)使来自步骤(a)的样品接触聚(A)聚合酶和ATP，接触的条件和时间足以使得其中聚(A)尾序被添加到2’OMe RNA分子的3′末端上，所述分子具有至少一个连接到它们的3′-末端的单核苷酸-5′-磷酸残基(5′-XMP)(例如，5′-AMP)。
在有些实施方案中，本发明提供了向样品中感兴趣的RNA分子的3′-末端(包括，向在3′-端核苷酸具有2’Ome基团的感兴趣的RNA分子，或向在3′-端核苷酸缺乏2’Ome基团的感兴趣的RNA分子)添加同聚多核苷酸尾序(即，聚(X)尾序)(例如聚(A)尾序)的方法，其中所述方法包含：将样品与摩尔过量的腺苷酸化的5′-单核苷酸(A5′pp5′X)(例如，腺苷酸化的腺苷-5′-单磷酸或二腺苷焦磷酸(A5′pp5′A))和T4 RNA连接酶(例如，T4 RNA连接酶1或T4 RNA连接酶2或截短的T4 RNA连接酶2)一起温育，温育的条件和时间足以使得其中作为从腺苷酸化的5′-单核苷酸连接供体(A5′pp5′X)(例如，A5′pp5′A))多次连续连接转移5′-单核苷酸(5′-XMP)残基的结果，同聚核苷酸尾序(聚(X)尾序)(例如，聚(A)尾序)被添加到感兴趣的RNA分子的3′-末端。
附图说明
图1显示了由RNA 5′多磷酸酶催化的反应的实例。
图2显示了酶对具有不同的5′末端基团的RNA底物的活性。
图3显示了在图2中指出的酶与RNA底物的反应。
图4显示了大肠杆菌RNA 5′多磷酸酶的DNA和氨基酸序列。
发明描述
本发明涉及用于选择性地标记一个或多个需要的RNA分子类别或类型的5′-末端的用于研究、人或非人诊断或治疗用途的新颖的方法、组合物和试剂盒。每个RNA类别由在5′-核苷酸的5′-位具有特定化学部分或基团的RNA分子组成。称作“5′连接标记”的方法的选择性，由一种或多种特异性的酶赋予，所述酶单独地或组合地选择性地仅将一个或多个需要的RNA分子类别转化成具有5′单磷酸的RNA分子，所述RNA分子然后可以用作使用RNA连接酶连接受体寡核苷酸(例如，RNA受体寡核苷酸)的供体，且一种或多种其它特异性的酶单独地或组合地选择性地仅将一个或多个不需要的RNA分子类别转化成具有5′羟基的RNA分子，所述RNA分子不能用作连接受体寡核苷酸的供体。例如，公开了新颖的使用RNA 5′多磷酸酶(RPP)(由申请人发现的新颖的新的酶类别)选择性地将具有5′三磷酸的RNA(但是不转化5′-加帽的RNA)转化成具有5′单磷酸的RNA、然后使用RNA受体寡核苷酸连接标记具有5′单磷酸的RNA的方法。另外，公开了申请人发现的使用RNA 5′单磷酸酶(RMP)选择性地将具有5′单磷酸的RNA(但是不转化具有5′三磷酸的RNA)转化成不能用作连接供体的具有5′羟基的RNA的方法。在有些实施方案中，将5′-连接标记的RNA用作合成标记的第一链cDNA或双链cDNA的模板(例如，用作DNA测序的标记的模板，包括使用Roche454、Illumina Solexa或其它大规模平行的或“下一代”测序平台，或用于制备用于克隆、扩增或其它用途的全长cDNA)。在有些实施方案中，双链cDNA含有RNA聚合酶启动子，且所述方法另外包含：合成扩增的有义或反义RNA(例如，用于RT-qPCR，作为微阵列表达分析的靶，启动子鉴别，RNA加工分析，和5′或3′RACE)。
在有些实施方案中，本发明提供了采用申请人发现的酶类别，即RNA 5′多磷酸酶的方法。例如，在有些实施方案中，本发明提供了采用新颖的细菌RNA 5′多磷酸酶(RPP)(申请人命名为“RNA 5′多磷酸酶I”(“RPP I”))的方法。不同于烟酸焦磷酸酶(TAP)，RNA 5′多磷酸酶不消化加帽的RNA(例如，m7G-加帽的RNA)的三磷酸桥，但是它将5′-三磷酸化的RNA或5′-二磷酸化的RNA转化成具有5′单磷酸基团的RNA(图1)。用RNA 5′多磷酸酶处理未加帽的初级RNA或5′-二磷酸化的RNA后，使用RNA连接酶，可以用受体寡核苷酸(例如，RNA受体寡核苷酸)标记β-γ-脱磷酸的RNA。
我们在本文中进一步公开了RNA 5′单磷酸酶(RMP)用于将具有5′单磷酸基团的RNA转化成具有5′羟基的RNA的新颖用途。RMP会将具有5′单磷酸的RNA(例如，大多数真核“微RNA”或“miRNA”)转化成具有5′羟基的RNA，使它不能用作连接供体，且因此，不会被5′连接标记。除了miRNA以外，大多数核糖体RNA(rRNA)，诸如18S和26S或28S真核rRNA或16S和23S原核rRNA，也具有5′-单磷酸基团。申请人发现，RMP1会从这些rRNA分子去除5′-单磷酸基团，且可以用于该目的。但是，申请人发现，就去除大部分样品中的大量rRNA(例如，rRNA占大多数细胞中的总RNA的约95-98％)而言，某些其它方法比RMP处理更有效。因而，在某些优选的实施方案中，从为用于本发明的方法所提供的样品中去除rRNA(例如，使用来自Invitrogen Life Technologies的RIBOMINUSTM试剂盒)。使用替代方法去除rRNA，使得为用于5′连接标记所提供的样品基本上不含有rRNA，使用户能使用本发明的方法更有效地5′-连接标记样品中其它较不丰富的具有5′-单磷酸基团的RNA分子(例如，miRNA)。因此，除非在本文中另外特别说明，应该理解，在某些优选的实施方案中，已经从在本发明方法的步骤(A)中提供的样品中基本上去除了5′-单磷酸化的rRNA分子。
RPP和RMP可以与本领域已知的其它酶组合使用(例如，图2)，以便将在5′末端具有特定基团的基本上任意需要的RNA分子群体转化成具有5′单磷酸基团的RNA，后者然后能使用RNA连接酶用RNA受体寡核苷酸进行5′连接标记。或者，RPP和RMP，单独地或与本领域已知的其它酶组合，可以用于将在5′末端具有特定基团的基本上任意需要的RNA分子群体转化成具有5′羟基的RNA，后者然后不能使用RNA连接酶用RNA受体寡核苷酸进行5′连接标记。因而，单独地或与本领域已知的其它酶组合地使用的RPP和RMP，提供了基于一个或多个5′末端基团的性质而高度选择性地5′连接标记需要的RNA分子群体的新颖的方法(例如，图3)。下面显示了这些方法的不同的实施方案。但是，基于本文的描述，本领域技术人员会知道和理解使用与本领域已知的修饰RNA的5′末端的其它酶相组合的RPP或RMP 5′连接标记特定RNA群体的其它方法，所有这些方法都在本发明的范围内。
本发明的方法1是5′连接标记具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA的方法，所述方法包含下述步骤：(A)提供：(i)样品，其含有具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA(例如，具有5′三磷酸的RNA或具有5′二磷酸基团的RNA)；(ii)RNA 5′多磷酸酶(例如，大肠杆菌RPP I或志贺氏菌属RPP I)；(iii)受体寡核苷酸(例如，RNA受体寡核苷酸)；和(iv)RNA连接酶(例如，T4 RNA连接酶，EPICENTRE或噬菌体TS2126 RNA连接酶)；(B)使所述样品接触RNA 5′多磷酸酶，接触的条件和时间足以使得其中具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA被转化成具有5′单磷酸基团的RNA；和(C)使来自步骤(B)的样品接触受体寡核苷酸和RNA连接酶，接触的条件和时间足以使得其中受体寡核苷酸的3′末端被连接到具有5′单磷酸基团的RNA的5′末端上，生成5′-连接标记的RNA。
在方法1的有些实施方案中，在步骤(A)中提供的样品另外含有不需要的具有5′单磷酸基团的RNA(例如，miRNA)，和，在步骤(B)中将具有5′多磷酸基团的RNA转化成具有5′单磷酸基团的RNA或在步骤(C)中将受体寡核苷酸连接到所述RNA上之前，所述方法另外包含：提供RNA 5′单磷酸酶(例如，RNA 5′单磷酸酶1或RMP1，EPICENTRE Technologies，Madison，WI)；和使含有不需要的RNA的样品接触RNA 5′单磷酸酶，以便使不需要的具有5′单磷酸基团的RNA脱磷酸，生成具有5′羟基的RNA，使它不会被连接到受体寡核苷酸上(即，它不会被5′连接标记)。
因而，本发明的方法2与方法1相同，例外在于：在步骤(A)中，所述样品另外含有具有5′单磷酸基团的RNA，且步骤(A)另外包含，提供RNA 5′单磷酸酶(例如，RMP1)；且步骤(B)另外包含下述子步骤：在使所述样品接触RNA 5′多磷酸酶之前，使所述样品接触RNA 5′单磷酸酶，接触的条件和时间足以使得其中样品中具有5′单磷酸基团的RNA被转化成具有5′羟基的RNA，并灭活或去除RNA 5′单磷酸酶。
在方法1或方法2的有些实施方案中，在步骤(A)中提供的样品另外含有由加帽的RNA或具有5′羟基的RNA组成的不需要的RNA(所述不需要的RNA在步骤(B)中不被转化成具有5′单磷酸基团的RNA，且在步骤(C)中不被连接到寡核苷酸受体上以得到5′-连接标记的RNA)。
在方法1或方法2的有些实施方案中，称作方法3，所述方法另外包含5′连接标记样品中加帽的RNA，其中所述方法另外包含下述子步骤：提供核酸焦磷酸酶或脱帽酶；和，在步骤(C)之前，使来自步骤(B)的样品接触核酸焦磷酸酶或脱帽酶，接触的条件和时间足以使得其中样品中加帽的RNA被转化成具有5′单磷酸基团的RNA，由此在步骤(A)中提供的样品中包含的加帽的RNA也在步骤(C)中被5′-连接标记。
在本发明的方法4中，所述样品含有需要的加帽的RNA，并任选地，包含具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA的不需要的RNA(例如，具有5′三磷酸或5′二磷酸基团的真核的和/或原核RNA，或未加帽的pri-miRNA或未加帽的前-miRNA)和/或具有5′单磷酸基团的RNA(例如，miRNA)，且所述方法使用RNA 5′多磷酸酶将具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA转化成具有5′单磷酸基团的RNA，然后，使用RNA 5′单磷酸酶将通过使具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA接触RNA 5′多磷酸酶得到的具有5′单磷酸基团的RNA和样品中的在用RNA 5′多磷酸酶处理之前具有5′单磷酸基团的RNA脱磷酸。因而，样品中的未加帽的初级RNA和5′-单磷酸化的RNA都被转化成具有5′羟基的RNA，它们因此不是5′连接标记的底物。然后，在灭活或去除RNA 5′单磷酸酶之后，使样品接触核酸焦磷酸酶(例如，烟酸焦磷酸酶)或脱帽酶(例如，酵母脱帽酶、哺乳动物脱帽酶、拟南芥脱帽酶或D9和D10痘苗病毒脱帽酶)，以将加帽的RNA转化成具有5′单磷酸基团的RNA，用于5′连接标记。在不同的实施方案中，样品中加帽的RNA是天然存在的(例如，真核mRNA)，或使用加帽酶通过体外加帽而产生(例如，原核mRNA)。因而，在有些实施方案中，5′-连接标记方法可用于将转录起始位点作图(例如，在真细菌***中)。本领域已知的现有的CAGE方法不能将原核的(例如，真细菌的)转录物的转录起始位点作图。本发明的方法4与本领域的寡核苷酸加帽方法相比的一个益处是，如果需要，在产生具有5′单磷酸基团的RNA的每个步骤之后，通过取样品的等分试样用于5′连接标记，可以5′连接标记样品中的每个类型的RNA(基于它的5′末端的性质)。该方法能5′连接标记加帽的RNA、而不5′连接标记具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA或样品中具有5′单磷酸基团的RNA。
因而，方法4是5′连接标记样品中加帽的RNA的方法，其包含下述步骤：(A)提供(i)样品，其含有加帽的RNA(例如，m7G-加帽的RNA)，和，任选地，具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA(例如，具有5′三磷酸的RNA和/或具有5′二磷酸基团的RNA)，和具有5′单磷酸基团的RNA(例如，miRNA)；(ii)RNA 5′多磷酸酶(例如，大肠杆菌RPP I或志贺氏菌属RPP I)；(iii)RNA 5′单磷酸酶(例如，RMP1)；(iv)核酸焦磷酸酶(例如，TAP)或脱帽酶(例如，酵母脱帽酶、哺乳动物脱帽酶、拟南芥脱帽酶或D9和D10痘苗病毒脱帽酶)；(v)受体寡核苷酸(例如，RNA受体寡核苷酸)；和(vi)RNA连接酶(例如，T4 RNA连接酶，EPICENTRE或噬菌体TS2126 RNA连接酶)；(B)使所述样品接触RNA 5′多磷酸酶，接触的条件和时间足以使得其中具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA被转化成具有5′单磷酸基团的RNA；(C)使所述样品接触RNA 5′单磷酸酶，接触的条件和时间足以使得其中具有5′单磷酸基团的RNA被转化成具有5′羟基的RNA；(D)灭活或去除RNA 5′单磷酸酶；(E)使所述样品接触核酸焦磷酸酶或脱帽酶，接触的条件和时间足以使得其中样品中加帽的RNA被转化成具有5′单磷酸基团的RNA；(F)使来自步骤(E)的样品接触受体寡核苷酸和RNA连接酶，接触的条件和时间足以使得其中受体寡核苷酸的3′末端被连接到步骤(E)中生成的具有5′单磷酸基团的RNA的5′末端上，但是未连接到在步骤(B)中从具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA转化得到的具有5′单磷酸基团的RNA上或在步骤(A)中提供的样品中已经存在的具有5′单磷酸基团的RNA上，并且从加帽的RNA生成5′-连接标记的RNA。
在方法4的有些实施方案中，所述样品另外含有具有5′羟基的RNA，其在步骤(F)中不被5′连接标记。
本发明的方法5是5′连接标记加帽的RNA和具有5′多磷酸基团的未加帽的初级RNA的方法，其包含下述步骤：(A)提供(i)样品，其含有加帽的RNA(例如，m7G-加帽的RNA)和/或具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA(例如，具有5′三磷酸或5′二磷酸基团的RNA)；(ii)核酸焦磷酸酶(例如，TAP)；(iii)受体寡核苷酸(例如，RNA受体寡核苷酸)；和(iv)RNA连接酶(例如，T4 RNA连接酶，EPICENTRE或噬菌体TS2126RNA连接酶)；(B)使样品(其中所述样品尚未接触过碱性磷酸酶)接触核酸焦磷酸酶，接触的条件和时间足以使得其中具有5′多磷酸基团的加帽的RNA和未加帽的RNA被转化成具有5′单磷酸基团的RNA；(C)使来自步骤(B)的样品接触受体寡核苷酸和RNA连接酶，接触的条件和时间足以使得其中受体寡核苷酸的3′末端被连接到具有5′单磷酸基团的RNA的5′末端上，生成5′-连接标记的RNA。
在方法5的有些实施方案中，所述样品另外含有具有5′单磷酸基团的RNA，其在步骤(C)中也被5′连接标记，或具有5′羟基的RNA，其在步骤(C)中不被5′连接标记。
方法5不同于现有技术中的寡核苷酸加帽方法，因为那些方法使用AP，其将具有5′三磷酸的RNA转化成具有5′羟基的RNA，后者不能被RNA连接酶用作5′连接标记(或寡核苷酸加帽)的底物。本方法5的益处是，它从具有5′三磷酸的RNA和具有5′单磷酸的RNA生成5′-连接标记的RNA，这允许分析同一性(例如，序列)、5′-三磷酸化的和5′-单磷酸化的RNA分子的量或相对丰度(例如，相对于样品中和/或一种或多种其它样品中的其它RNA分子)、注释和生物学功能。具有5′三磷酸或5′单磷酸的未加帽的RNA可能具有重要的生物学功能。另一方面，本方法与现有方法相比的一个潜在缺点是，由于没有用AP处理样品中的RNA的步骤，样品中的具有5′单磷酸基团的RNA分子也被5′连接标记，该5′-连接标记的RNA分子可能是特定目的所不感兴趣的。
本发明的方法6是5′连接标记样品中具有5′多磷酸基团的加帽的RNA和未加帽的RNA、而不5′连接标记样品中具有5′单磷酸基团的RNA的方法，所述方法包含下述步骤：(A)提供(i)样品，其含有加帽的RNA(例如，m7G-加帽的RNA)、具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA(例如，具有5′三磷酸或5′二磷酸基团的真核和/或原核RNA)和具有5′单磷酸基团的RNA(例如，miRNA)；(ii)RNA 5′单磷酸酶(例如，RMP1)；(iii)核酸焦磷酸酶(例如，TAP)；(iv)受体寡核苷酸(例如，RNA受体寡核苷酸)；和(v)RNA连接酶(例如，T4 RNA连接酶，EPICENTRE或噬菌体TS2126 RNA连接酶)；(B)使所述样品接触RNA 5′单磷酸酶，接触的条件和时间足以使得其中样品中具有5′单磷酸基团的RNA被转化成具有5′羟基的RNA；(C)灭活或去除RNA 5′单磷酸酶；(D)使来自步骤(C)的样品接触核酸焦磷酸酶，接触的条件和时间足以使得其中具有5′多磷酸基团的加帽的RNA和未加帽的RNA被转化成具有5′单磷酸基团的RNA；(E)使来自步骤(D)的样品接触受体寡核苷酸和RNA连接酶，接触的条件和时间足以使得其中受体寡核苷酸的3′末端被连接到在步骤D)中生成的具有5′单磷酸基团的RNA的5′末端上，生成5′-连接标记的RNA。
在方法6的有些实施方案中，所述样品另外含有具有5′羟基的RNA，其在步骤(E)中不被5′连接标记。
方法6不同于现有技术中的寡核苷酸加帽方法，因为那些方法使用AP，其将具有5′三磷酸的RNA转化成具有5′羟基的RNA，后者不能被RNA连接酶用作寡核苷酸加帽的底物。本方法的一个益处是，它从具有5′三磷酸的RNA生成5′-连接标记的RNA，其可能具有重要的生物学功能。因而，具有5′三磷酸基团的未加帽的RNA的5′连接标记，允许分析它的同一性(例如，序列)、相对于其它RNA分子的量或相对丰度(例如，在样品中相对于其它样品中的丰度)、注释和生物学功能。本方法的另一个益处是，使用RNA 5′单磷酸酶，其将样品中具有5′单磷酸基团的RNA转化成具有5′羟基的RNA，因此，将不被5′连接标记。因而，该方法可以用于去除特定目的所不感兴趣的5′-单磷酸化的RNA。
本发明的方法7是5′连接标记样品中具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA、而不5′连接标记样品中具有5′单磷酸基团的RNA的方法，所述方法包含下述步骤：(A)提供(i)样品，其含有具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA(例如，具有5′三磷酸基团的RNA(例如，原核mRNA)或具有5′二磷酸基团的RNA)和具有5′单磷酸基团的RNA(例如，miRNA)；(ii)加帽酶(例如，SCRIPTCAPTM加帽酶***，EPICENTRE)；(iii)RNA 5′单磷酸酶(例如，RMP1，EPICENTRE)或碱性磷酸酶(例如，APEXTM碱性磷酸酶，EPICENTRE；虾碱性磷酸酶，USB，Cleveland，OH；或北极碱性磷酸酶，New England Biolabs，MA)；(iv)核酸焦磷酸酶(例如，TAP，EPICENTRE)或脱帽酶(例如，酵母脱帽酶、哺乳动物脱帽酶、拟南芥脱帽酶或D9和D10痘苗病毒脱帽酶)；(v)受体寡核苷酸(例如，RNA受体寡核苷酸)；和(vi)RNA连接酶(例如，T4 RNA连接酶，EPICENTRE或噬菌体TS2126 RNA连接酶)；(B)使所述样品接触加帽酶，接触的条件和时间足以使得其中具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA被转化成加帽的RNA；(C)使来自步骤(B)的样品接触RNA 5′单磷酸酶或碱性磷酸酶，接触的条件和时间足以使得其中具有5′单磷酸基团的RNA被转化成具有5′羟基的RNA；(D)灭活或去除在步骤(C)中使用的RNA 5′单磷酸酶或碱性磷酸酶；(E)使步骤(D)之后的样品接触核酸焦磷酸酶或脱帽酶，接触的条件和时间足以使得其中加帽的RNA被转化成具有5′单磷酸基团的RNA；和(F)使来自步骤(E)的样品接触受体寡核苷酸和RNA连接酶，接触的条件和时间足以使得其中受体寡核苷酸的3′末端被连接到具有5′单磷酸基团的RNA的5′末端上，生成5′-连接标记的RNA。
在方法7的有些实施方案中，所述样品另外含有具有5′羟基的RNA，其在步骤(F)中不被5′连接标记。
包含用加帽酶处理样品的方法7步骤(B)，从具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA(例如，具有5′三磷酸基团的RNA，诸如原核初级RNA，或具有5′二磷酸基团的RNA)生成加帽的RNA。然后，在步骤(C)中，样品中具有5′单磷酸基团的RNA(例如，miRNA)被转化成具有5′羟基的RNA，其不被RNA连接酶5′连接标记。最后，使用核酸焦磷酸酶(例如，TAP)或脱帽酶，将加帽的RNA转化成具有5′单磷酸基团的RNA，然后使用RNA连接酶5′连接标记具有5′单磷酸基团的RNA。
本发明的方法8包含方法7的实施方案，例外在于：在步骤(A)中提供的样品另外含有加帽的RNA(例如，m7G-加帽的RNA，例如，真核mRNA)，和，在步骤(F)中，该方法从在步骤(A)的样品中提供的加帽的RNA和在步骤(B)中加帽的、样品中的具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA，生成5′-连接标记的RNA。在方法8的有些实施方案中，所述样品另外含有具有5′羟基的RNA，其在步骤(F)中不被5′连接标记。
在其中在步骤(A)中提供核酸焦磷酸酶(例如，TAP)的任意方法的有些实施方案(例如，方法4至8的有些实施方案)中，所述方法另外包含下述步骤：在以下步骤，即使含有具有5′多磷酸基团的加帽的RNA或未加帽的RNA的样品接触核酸焦磷酸酶，接触的条件和时间足以使得其中样品中具有5′多磷酸基团的加帽的RNA和未加帽的RNA被转化成具有5′单磷酸基团的RNA之后，灭活或去除核酸焦磷酸酶。关于特定实施方案，如果可能，优选地，通过在反应后改变反应混合物的条件至新条件(其中核酸焦磷酸酶是无活性的，但是在该方法的下一步骤中使用的酶是有活性的)，灭活核酸焦磷酸酶。例如，烟酸焦磷酸酶(TAP)在由50mM醋酸钠(pH 6.0)、1mM EDTA、0.1％β-巯基乙醇和0.01％Triton X100组成的反应混合物中是有活性的。在反应后，通过向TAP反应混合物中加入磷酸钠(pH 7.8)至20mM的终浓度，调节pH至约7.5，可以灭活TAP。当然，重要的是，证实在该方法的下一步骤中使用的酶在这些条件下是有活性的。
本发明的方法9是5′连接标记样品中加帽的RNA和具有5′单磷酸基团的RNA、而不5′连接标记样品中具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA的方法，所述方法包含下述步骤：(A)提供(i)样品，其至少含有加帽的RNA、具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA(例如，具有5′三磷酸基团的RNA(例如，原核mRNA)或具有5′二磷酸基团的RNA)，和具有5′单磷酸基团的RNA(例如，miRNA)；(ii)脱帽酶(例如，酵母脱帽酶、哺乳动物脱帽酶、拟南芥脱帽酶或D9和D10痘苗病毒脱帽酶)；(iii)受体寡核苷酸(例如，RNA受体寡核苷酸)；和(iv)RNA连接酶(例如，T4 RNA连接酶，EPICENTRE或噬菌体TS2126 RNA连接酶)；(B)使所述样品接触脱帽酶，接触的条件和时间足以使得其中加帽的RNA被转化成具有5′单磷酸基团的RNA；和(C)使来自步骤(B)的样品接触受体寡核苷酸和RNA连接酶，接触的条件和时间足以使得其中受体寡核苷酸的3′末端被连接到具有5′单磷酸基团的RNA的5′末端上，生成5′-连接标记的RNA。
在方法9的有些实施方案中，所述样品另外含有具有5′羟基的RNA，其在步骤(C)中不被5′连接标记。
本发明的方法10是5′连接标记样品中加帽的RNA、而不5′连接标记样品中具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA或具有5′单磷酸基团的RNA的方法，所述方法包含下述步骤：(A)提供(i)样品，其至少含有加帽的RNA、具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA(例如，具有5′三磷酸基团的RNA(例如，原核mRNA)或具有5′二磷酸基团的RNA)、具有5′单磷酸基团的RNA(例如，miRNA)和/或具有5′羟基的RNA；(ii)RNA 5′单磷酸酶(例如，RMP1，EPICENTRE)或碱性磷酸酶(例如，APEXTM碱性磷酸酶，EPICENTRE；虾碱性磷酸酶，USB，Cleveland，OH；或北极碱性磷酸酶，New England Biolabs，MA)；(iii)脱帽酶(例如，酵母脱帽酶、哺乳动物脱帽酶、拟南芥脱帽酶或D9和D10痘苗病毒脱帽酶)；(iv)受体寡核苷酸(例如，RNA受体寡核苷酸)；和(v)RNA连接酶(例如，T4RNA连接酶，EPICENTRE或噬菌体TS2126 RNA连接酶)；(B)使所述样品接触RNA 5′单磷酸酶或碱性磷酸酶，接触的条件和时间足以使得其中各个酶是有活性的，且它催化的反应可以完成；(C)灭活或去除在步骤(B)中使用的RNA 5′单磷酸酶或碱性磷酸酶；(D)使所述样品接触脱帽酶，接触的条件和时间足以使得其中加帽的RNA被转化成具有5′单磷酸基团的RNA；和(E)使来自步骤(D)的样品接触受体寡核苷酸和RNA连接酶，接触的条件和时间足以使得其中受体寡核苷酸的3′末端被连接到在步骤(D)中从加帽的RNA生成的具有5′单磷酸基团的RNA的5′末端上，生成5′-连接标记的RNA。
在方法10的有些实施方案中，所述样品另外含有具有5′羟基的RNA，其在步骤(E)中不被5′连接标记。
在其中在步骤(A)中提供脱帽酶(例如，酵母脱帽酶、哺乳动物脱帽酶、拟南芥脱帽酶或D9和D10痘苗病毒脱帽酶)的任意方法的有些实施方案(例如，在方法4和7至10的有些实施方案中)中，所述方法另外包含下述步骤：在以下步骤，即使含有加帽的RNA的样品接触脱帽酶，接触的条件和时间足以使得其中样品中加帽的RNA被转化成具有5′单磷酸基团的RNA之后，灭活或去除脱帽酶。关于特定实施方案，如果可能，优选地，通过在反应后改变反应混合物的条件至新条件(其中脱帽酶是无活性的，但是在该方法的下一步骤中使用的酶是有活性的)，灭活脱帽酶。当然，重要的是，证实在该方法的下一步骤中使用的酶在这些条件下是有活性的。
本发明也包含方法1-10中任一种方法的实施方案，其中，在步骤(A)中，另外提供5′核糖核酸外切酶(XRN)(例如，啤酒糖酵母Xrn I核糖核酸外切酶(Xrn I)；TERMINATORTM 5′-磷酸-依赖性的外切核酸酶，EPICENTRE)，和，在步骤(B)之前，使样品接触XRN，接触的条件和时间足以使得其中样品中具有5′单磷酸基团的RNA被消化。
本发明也包含方法1-10中任一种方法的实施方案，其中，在步骤(A)中另外提供5′核糖核酸外切酶(XRN)(例如，啤酒糖酵母Xrn I核糖核酸外切酶(Xrn I)；TERMINATORTM 5′-磷酸-依赖性的外切核酸酶，EPICENTRE)，和，在样品中存在的RNA被转化成具有5′单磷酸基团的RNA的步骤之后，使样品接触XRN，接触的条件和时间足以使得其中具有5′单磷酸的RNA被消化。在某些这样的实施方案中，使所述样品接触XRN的步骤代替反应中的另一个步骤，诸如使样品接触RNA 5′单磷酸酶(RMP)或碱性磷酸酶(AP)的步骤。
在方法1-10中任一种方法的某些优选实施方案中，在步骤(A)中提供的样品用于该方法之前，对其进行处理，以去除核糖体RNA(例如，18S和26S或28S真核rRNA，或16S和23S原核rRNA)(例如，使用来自INVITROGEN的RIBOMINUSTM rRNA去除试剂盒，或其它合适的方法)。使用诸如用于RIBOMINUS试剂盒的方法去除核糖体RNA，会促进使用本发明方法分析样品中感兴趣的RNA分子，包括具有5′-单磷酸基团的感兴趣的RNA分子。
本发明的方法11包含方法1-10中任一种方法的实施方案，包括其任意实施方案，其中样品中的至少一些感兴趣的RNA分子不具有聚(A)尾序，其中所述方法另外包含，将聚(A)尾序添加到感兴趣的RNA分子的3′-末端。
在有些实施方案中，添加聚(A)尾序的方法包含下述步骤：提供聚(A)聚合酶(例如，大肠杆菌聚(A)聚合酶或糖酵母属聚(A)聚合酶)和ATP；并且使样品接触聚(A)聚合酶和ATP，接触的条件和时间足以使得其中聚(A)尾序被添加到样品中RNA分子的3′末端，生成具有聚(A)尾序的RNA。
但是，申请人发现，使用大肠杆菌或糖酵母属聚(A)聚合酶，在体外难以或不能使在3′-端核苷酸上具有2’-O-甲基基团(2’OMe)的RNA分子(例如，植物miRNA、种系-特异性的piwiRNA、内源的siRNA)腺苷酸化。这是不幸的，因为研究这样的2’-O-甲基化的RNA(也称作“2’OMe-RNA”)，以描绘它们的丰度、鉴别它们的功能和将它们用于研究、医学和农业用途，目前具有重大意义。这种2’OMe-RNA的聚腺苷酸化，能够添加引发位点，其用于合成第一链cDNA和其它下游操纵，包括扩增(例如，RNA扩增)，和/或用于添加测序标记结构域到第一链cDNA或双链cDNA上(例如，用于制备下一代或更老的测序方法(例如，Sanger测序方法)的模板)。申请人观察到，与2’OMe-RNA(例如，化学合成的2’OMe-寡核糖核苷酸(IDT，Coralville，IA)；例如，与miR173[2’OMe]，即2’OMe-拟南芥miRNA相同的2’OMe-寡核糖核苷酸)和RNA连接酶(例如，T4 RNA连接酶1或T4 RNA连接酶2(EPICENTRE，Madison，WI))一起温育摩尔过量的纯化的二-腺苷焦磷酸(A5′pp5′A，腺苷-5′-单磷酸的腺苷酸化形式)，导致大致定量合成2’OMe-寡核糖核苷酸，其具有一个或两个连接到它的3′-末端的3′-位上的腺苷核苷酸，然后，根据生产商的说明书(EPICENTRE，Madison，WI，USA)，使用聚(A)聚合酶，在体外反应中将聚(A)尾序(例如，适合用作第一链cDNA合成的引发位点的聚(A)尾序)添加到大约100％的这些腺苷核苷酸-延伸的2’OMe-寡核糖核苷酸分子上。因而，在方法11的一个特定的实施方案中(其中希望被5′连接标记的样品中的至少一些RNA具有在它的3′-端核苷酸上的2’Ome基团，且其中添加聚(A)尾序的步骤包含使用聚(A)聚合酶)，所述方法另外包含以下步骤：在使样品接触聚(A)聚合酶和ATP的步骤之前，在没有ATP或NAD的情况下，与二腺苷焦磷酸(A5′pp5′A)和T4RNA连接酶(例如，T4 RNA连接酶1或T4 RNA连接酶2)一起温育含有在3′-端核苷酸上具有2’Ome基团的RNA的样品，温育的条件和时间足以使得其中至少一个腺苷残基被添加到至少在3′-端核苷酸上具有2’OMe基团的RNA分子的3′末端上。
意外地，申请人进一步观察到，与二腺苷焦磷酸(A5′pp5′A)和T4RNA连接酶(例如，T4 RNA连接酶1或T4 RNA连接酶2)一起温育含有在3′-端核苷酸上具有2’OMe基团的感兴趣的RNA的样品(或含有在3′-端核苷酸上不具有2’OMe基团的感兴趣的RNA的样品)更长的反应时间，导致多个腺苷添加到在3′-端核苷酸上具有2’Ome基团的RNA的3′-末端上。例如，在一个实验中，在与摩尔过量的二腺苷焦磷酸(A5′pp5′A)和T4 RNA连接酶(例如，T4 RNA连接酶1或T4 RNA连接酶2)的4-小时反应期间，约15-20个腺苷被添加到几乎所有的51-聚体5′-三磷酸化的RNA分子上。因而，在有些实施方案中，将聚(A)尾序添加到样品中的感兴趣的RNA分子的3′-末端的方法11只包含下述步骤：与摩尔过量的二腺苷焦磷酸(A5′pp5′A)和T4 RNA连接酶(例如，T4 RNA连接酶1或T4 RNA连接酶2)一起温育含有感兴趣的RNA分子的样品，温育的条件和时间足以使得其中聚(A)尾序包含被添加到感兴趣的RNA分子的3′-末端上的多个腺苷或由它们组成。
申请人认为，包含以下步骤的方法是以前在本领域没有描述过的新颖的方法，且甚至当它们没有与本发明的将受体寡核苷酸连接到用于5′连接标记的感兴趣的RNA分子的5′-末端上的方法相关联时，也是创造性的：与摩尔过量的二腺苷焦磷酸(A5′pp5′A)和T4 RNA连接酶(例如，T4 RNA连接酶1或T4 RNA连接酶2，包括截短的T4 RNA连接酶2)一起温育含有感兴趣的RNA分子(例如，其中感兴趣的RNA分子包含在3′-端核苷酸具有2’Ome基团的RNA分子，或其中感兴趣的RNA分子包含任意一个或多个RNA分子，无论是否具有2’OMe基团)的样品，所述温育的条件和时间足以使包含多个腺苷或由多个腺苷组成的聚(A)尾序添加到它们的3′-末端。
因而，本发明的一个实施方案是将聚(A)尾序添加到样品中的2’OMe-RNA分子的3′-末端上的一般方法，其中所述2’-OMe基团是在它们的3′-端核苷酸上，其中所述方法包含下述步骤：(a)与腺苷酸化的单核苷酸(A5′pp5′X)(例如，腺苷酸化的腺苷5′-单磷酸或二腺苷焦磷酸(A5′pp5′A))和T4 RNA连接酶(例如，T4 RNA连接酶1或T4 RNA连接酶2或截短的T4 RNA连接酶2)一起温育样品，温育的条件和时间足以使得其中至少一个单核苷酸-5′-磷酸残基(5′-XMP)(例如，5′-AMP)被连接到2’OMe-RNA分子的3′-末端上；然后，(b)使来自步骤(a)的样品接触聚(A)聚合酶和ATP，接触的条件和时间足以使得其中聚(A)尾序被添加到具有至少一个连接在3′-末端的单核苷酸-5′-磷酸残基(5′-XMP)(例如，5′-AMP)的2’OMe-RNA分子的3′末端上。
因而，本发明的另一个实施方案是将同聚多核苷酸尾序(即，聚(X)尾序)(例如聚(A)尾序)添加到样品中的感兴趣的RNA分子(包括在3′-端核苷酸上具有2’OMe基团的感兴趣的RNA分子，或在3′-端核苷酸上缺少2’OMe基团的感兴趣的RNA分子)的3′-末端上的一般方法，其中所述方法包含：与摩尔过量的腺苷酸化的5′-单核苷酸(A5′pp5′X)(例如，腺苷酸化的腺苷-5′-单磷酸或二腺苷焦磷酸(A5′pp5′A))和T4 RNA连接酶(例如，T4 RNA连接酶1或T4 RNA连接酶2或截短的T4 RNA连接酶2)一起温育样品，温育的条件和时间足以使得其中作为从腺苷酸化的5′-单核苷酸连接供体(A5′pp5′X)(例如，A5′pp5′A))多次连续连接转移5′-单核苷酸(5′-XMP)残基的结果，同聚核苷酸尾序(聚(X)尾序)(例如，聚(A)尾序)被添加到感兴趣的RNA分子的3′-末端上。
在方法11的有些实施方案中，聚(A)尾序被添加到在方法1-10中的任一个方法中生成的5′-连接标记的RNA上。在方法11的某些其它的实施方案中，在生成5′-连接标记的RNA之前，进行向样品中的RNA添加聚(A)尾序的步骤。
在方法11的有些实施方案中，用于5′连接标记的受体寡核苷酸是具有5′帽核苷酸的RNA受体寡核苷酸，且所述方法另外包含下述步骤：用具有聚(A)尾序的5′-连接标记的RNA转化真核细胞，其中在真核细胞中表达具有聚(A)尾序的5′-连接标记的RNA；在某些这样的实施方案中，从样品中编码蛋白的RNA(例如，从包括原核mRNA的RNA)生成具有聚(A)尾序的5′-连接标记的RNA，并在真核细胞中表达所述蛋白。
在方法11的其它实施方案中，将不同的同聚核苷酸尾序添加到样品中RNA的3′末端上的酶用于方法1-10中的任一个方法中。例如，可以使用将聚(U)或聚(C)或聚(I)尾序添加到样品中RNA的3′末端上的酶和反应条件，在该情况下，可以在本文讨论的实施方案中使用与同聚核苷酸尾序退火的合适引物，其中，提供引物，并用在所述方法中。本领域已经描述了具有聚(U)聚合酶活性的酶(例如，Kwak，Jae Eun和Wickens，M，RNA 13：860-867，2007)。能将同聚核苷酸尾序添加到样品中RNA的3′末端上的任意酶，可以用于本发明的方法1-10中的任一个方法中。
方法11可以是有益的，因为即使样品中的RNA包含多种显示不同序列的不同RNA分子，聚(A)或另一种同聚核苷酸尾序向样品中RNA的3′末端的添加，会提供从样品中的所有RNA分子合成第一链cDNA的引发位点。另外，由于聚(A)尾序(或另一种同聚核苷酸尾序)被添加到样品中的RNA或在方法1-10中的任一个方法中生成的5′-连接标记的RNA的3′末端，使用该尾序作为第一链cDNA合成引物的引发位点，至少会提供生成全长第一链cDNA的潜力，这在使用含有所述RNA或5′-连接标记的RNA的内部序列作为引发位点的情况下是不可能的。
在本文所述的本发明方法的其中聚(A)或其它同聚核苷酸尾序被添加到样品中的RNA或5′-连接标记的RNA上的那些实施方案中，在本文中应当理解，术语“5′-连接标记的RNA”是指在3′末端具有聚(A)或其它同聚核苷酸尾序的5′-连接标记的RNA。
本发明的其它实施方案提供了方法和试剂盒，它们通过扣除与另一种类型或条件或环境中的细胞中的RNA相同的一种类型或条件或环境的细胞中的5′-连接标记的RNA部分，仅得到类型特异性的或条件特异性的或环境特异性的5′-连接标记的RNA。
因而，在有些实施方案中，所述方法另外包含下述步骤：使过量的从含有来自第二种状态或条件或环境的细胞的RNA的第二种样品制备的cDNA与从含有来自第一种状态或条件或环境的细胞的RNA的第一种样品产生的5′-连接标记的RNA退火；和使与cDNA退火的5′-连接标记的RNA接触RNA酶H，接触的条件和时间足以使得其中与cDNA退火的5′-连接标记的RNA被消化，且没有与cDNA退火的5′-连接标记的RNA未被消化，由此扣除与cDNA同源的5′-连接标记的RNA。在有些实施方案中(其中使用附着或连接了亲和分子的受体寡核苷酸生成来自第一种样品的5′-连接标记的RNA)，在扣除步骤之后，如下回收在扣除步骤后剩下的来自第一种样品的5′-连接标记的RNA：通过使含有来自第一种样品的5′-连接标记的RNA的样品接触附着了能结合亲和分子的亲和结合物质的固体表面，接触的条件和时间足以使得其中所述亲和分子会结合附着在所述表面上的亲和结合物质。在有些实施方案中，亲和分子是生物素，且附着在固体表面上的亲和结合物质是亲和素或链霉亲和素。
因而，本发明的有些实施方案提供了从一种样品中的RNA生成5′-连接标记的RNA的方法，在所述样品中，已经扣除了与第二种样品中的RNA相同的RNA。例如，本发明的方法12包含方法1-11中任一个方法的实施方案，其中所述样品包含第一种样品，其含有源自第一种类型或第一种条件或第一种环境的细胞的RNA，且其中所述方法导致从由第一种样品生成的5′-连接标记的RNA中扣除了在源自第二种类型或第二种条件或第二种环境的细胞的第二种样品中也已经存在的那些RNA分子，从而产生源自仅在第一种样品中存在、但是在第二种样品中缺乏的RNA的5′-连接标记的RNA分子群体，所述方法包含下述步骤：(i)提供从第一种样品产生的5′-连接标记的RNA，和第二种样品，其含有源自第二种类型或第二种条件或第二种环境的细胞的RNA；(ii)通过第二种样品中的RNA的逆转录，制备第一链cDNA；(iii)使从第一种样品产生的5′-连接标记的RNA与从来自第二种样品的RNA制备的第一链cDNA退火，退火的条件和时间足以使得其中在从第一种样品产生的5′-连接标记的RNA和从来自第二种样品的RNA制备的第一链cDNA之间形成杂交复合体；(iv)用RNA酶H处理杂交复合体，处理的条件和时间足以使得其中与cDNA退火的RNA被消化，并生成经扣除的5′-连接标记的RNA，其由源自仅在第一种样品中存在、但是在第二种样品中缺乏的RNA的5′-连接标记的RNA组成；和(v)得到经扣除的5′-连接标记的RNA。
在方法12的有些实施方案中，所述方法另外包含下述步骤：在步骤(iv)后，灭活或去除RNA酶H。在优选的实施方案中，通过加热，灭活RNA酶H。
方法13是方法12的一个实施方案，其中在步骤(A)中提供的用于从第一种样品中的RNA生成5′-连接标记的RNA的受体寡核苷酸含有亲和分子，且所述方法另外包含下述步骤：提供固体表面，能结合亲和分子的亲和结合物质附着在所述固体表面上；和，在步骤(iv)之前或之后，使从第一种样品产生的5′-连接标记的RNA接触固体表面，接触的条件和时间足以使得其中来自第一种样品的5′-连接标记的RNA结合到亲和结合物质所附着的固体表面上，源自第一种样品中的RNA的5′-连接标记的RNA被捕获到固体表面上。
因而，生成和捕获经扣除的5′-连接标记的RNA的方法12和13各自提供了得到含有对样品中的细胞类型特异性的(即，“类型特异性的”)或对样品中的细胞所处的条件特异性的(即，“条件特异性的”)或对获得样品中的细胞的环境特异性的(即，“环境特异性的”)RNA分子群体的样品的方法。该RNA分子群体(有时称作“经扣除的RNA”或“经扣除的5′-连接标记的RNA”)可用于另外的分析或应用。作为实例，可以鉴别经扣除的RNA(例如通过在Affymetrix、Agilent、Illumina或NimbleGen Systems微阵列芯片上进行分析)，或它可以用于制备第一链cDNA，用作测序模板(例如，使用Sanger双脱氧法或本领域的“NexGen”测序方法中的任一种(例如，使用来自Roche的454测序仪，来自Illumina的Solexa测序仪，来自Applied Biosystems的Solid测序仪，或本领域的任何其它测序仪和***))。在有些实施方案中，5′-连接标记的RNA在它的5′末端具有标记，其显示序列标记结构域(例如，用于Roche 454A序列接头或它的互补序列)，并使用显示第二种序列标记结构域(例如，用于Roche 454B序列接头或它的互补序列)的第一链cDNA合成引物，合成第一链cDNA，由此提供合适的5′-和3′-标记的第一链cDNA分子(例如，用作Roche 454平台上的测序模板)。
更进一步，如果扣除的RNA是来自具有状况的细胞，诸如癌细胞，或来自另一种器质性疾病的细胞，或被细菌、支原体、真菌或病毒病原体感染的细胞，则它包含潜在的药物靶群体，其经过进一步验证后，可以用于开发药物，以缓解症状或潜在地治愈疾病。当然，验证过的状况特异性的靶也可以用于开发人或动物诊断实验、测定和试剂盒。扣除的RNA也可以用于研究目的。例如，在一个实施方案中，将扣除的来自癌症干细胞的RNA与来自相同类型的正常细胞和/或来自癌病变的非干细胞的其它癌细胞的扣除的RNA进行对比，以便理解癌症的进展和开发疗法和治疗。在另一个实施方案中，将扣除的RNA用于合成加帽的和聚腺苷酸化的RNA，所述RNA进一步用于制备RNA-加载的抗原呈递细胞(APC)，用作预防或治疗疾病的疫苗。例如，在有些实施方案中，将扣除的来自患者肿瘤的癌症干细胞的RNA用于制备加帽的和聚腺苷酸化的RNA，所述RNA用于转化从相同患者制备的树突细胞，其中加载了肿瘤特异性的RNA的树突细胞呈递肿瘤特异性的抗原。呈递肿瘤抗原的树突细胞被活化，并用于制备疫苗，以尝试在患者中诱导细胞-介导的免疫应答。在另一个实施方案中，呈递肿瘤抗原的树突细胞被用于在培养物中制备细胞毒性的T-淋巴细胞(CTL)，且将所述CTL作为免疫治疗疫苗施用给患者(例如，静脉内、皮下、肌肉内、腹膜内地或通过另一种递送途径)，以治疗患者。在其它实施方案中，通过体外翻译，将扣除的RNA用于制备类型特异性的或状况特异性的蛋白或多肽，其可以用作抗原，以制备免疫治疗疫苗，用于预防或治疗疾病。
更进一步，如果扣除的RNA是来自这样的样品：含有来自特定环境的细胞，诸如来自环境样品的原核或真核微生物，则所述方法可以用于鉴别(例如，序列)、定量或测定核酸分子的相对丰度(例如，通过测量相对于另一个样品中核酸分子的丰度，来自或衍生自一个样品的一种或多种核酸分子的丰度，所述测量例如，使用微阵列、数字下一代测序或其它方法)、注释和发现在环境样品中表达的核酸分子的生物学功能，并将一个环境样品的那些方面与其它环境样品的那些方面进行对比，无论它们是在不同时间来自相同的位置和环境，还是来自不同的位置和环境。因而，所述方法可以用于各种后转录组学研究中，包括用于鉴别有用的基因，所述基因用于研究或用于工业或其它商业用途。
本发明的方法14包含方法1-13中任一个方法的实施方案，其中所述方法另外包含从5′-连接标记的RNA合成第一链cDNA，其中所述方法另外包含下述步骤：提供RNA-依赖性的DNA聚合酶；和使5′-连接标记的RNA接触RNA-依赖性的DNA聚合酶，接触的条件和时间足以使得其中合成与5′-连接标记的RNA互补的第一链cDNA。
在方法14的有些实施方案中，不为使用RNA-依赖性的DNA聚合酶合成第一链cDNA而提供与样品中的RNA互补的第一链cDNA合成引物。不受理论的约束，推测通过分子间或分子内引发，在这些实施方案中合成cDNA。在有些实施方案中，合成的cDNA是双链的。不受理论的约束，推测通过分子间引发(例如，使用与cDNA退火的RNA，所述cDNA用于引发cDNA的第二条链的合成)或分子内引发(例如，使用在cDNA的第一条链的3′末端处的发夹，所述cDNA用于引发cDNA的第二条链的合成)，合成双链cDNA。
在方法14的其它实施方案中，提供了第一链cDNA合成引物，用于引发第一链cDNA的合成，所述合成使用5′-连接标记的RNA作为模板(该5′-连接标记的RNA包括在它的3′末端上的任意的聚(A)或其它同聚核苷酸尾序或寡核苷酸标记序列)。因而，方法15包含方法14，其中方法15另外包含下述步骤：提供与5′-连接标记的RNA互补的第一链cDNA合成引物；和使5′-连接标记的RNA接触第一链cDNA合成引物和RNA-依赖性的DNA聚合酶，接触的条件和时间足以使得其中合成与5′-连接标记的RNA互补的cDNA。
方法16包含方法15的实施方案，其中所述第一链cDNA合成引物包含这样的序列，即其中至少它的3′末端显示选自下述的序列：与同聚序列互补的序列，所述同聚序列在转录后(在体内细胞中或在体外)添加到样品中RNA的3′末端上或5′-连接标记的RNA的3′末端上；与一个或多个RNA分子的3′末端处的已知序列互补的序列；与一个或多个RNA分子的一个或多个内部区域互补的序列(例如，与一个或多个特定的内部序列互补的序列)；所有可能的序列的集合，其中每个序列是随机的(例如，随机的六聚体序列或随机的九聚体序列，其中存在至少一个与RNA中的每个序列互补的引物)；与聚(A)尾序互补的序列(例如，选自任意长度的寡(dT)n序列、寡(dU)n序列、寡(U)n序列、寡(dT)nX锚定的序列、寡(dU)nX锚定的序列、和寡(U)nX锚定的序列的序列，但是优选其中″n″是约6至约24个核苷酸，且″X″是dG、dC和dA核苷酸的混合物)；和与寡核苷酸标记互补的序列，所述寡核苷酸标记添加到样品中RNA的3′末端或5′-连接标记的RNA的3′末端。
在方法16的某些优选的实施方案中，第一链cDNA合成引物与聚(A)尾序或其它同聚核苷酸尾序互补，或与感兴趣的RNA的3′末端上的寡核苷酸标记序列互补。这些实施方案对于某些用途而言是优选的，因为在RNA分子的3′末端处退火的第一链cDNA合成引物能使得可能合成全长第一链cDNA。然后，如果第一链cDNA用于制备双链cDNA，且第二链cDNA合成引物与第一链cDNA的一部分互补，后者又与连接到感兴趣的RNA的5′末端上的受体寡核苷酸互补，则双链cDNA将也是全长的，且将包括与感兴趣的RNA分子的真实5′和3′末端相对应的序列。在有些实施方案中，引发聚(A)尾序的方法是优选的，因为聚(A)尾序可以添加到群体中的所有RNA分子上，即使RNA包含不同的序列。在有些实施方案中，聚(A)尾序天然存在于样品中(例如，真核mRNA，包括寡(dT)-选择的含聚(A)-尾序的真核mRNA)。这些实施方案可用于，例如，从样品中的一个或多个(包括所有)全长RNA分子(例如，mRNA分子)制备cDNA(例如，用于克隆；或用于使用阵列或微阵列的基因表达分析；或用于测序；或用于其它分析)。
在方法16的某些其它的实施方案中，其中所述第一链cDNA合成引物与样品中的RNA的已知序列互补(例如，与RNA的编码区的3′末端处的已知序列互补)，所述方法可以用于从特定的mRNA制备cDNA，用于特定基因的克隆或表达分析。
在方法16的其它实施方案中，其中所述第一链cDNA合成引物显示随机序列(例如，随机的六聚体或随机的九聚体引物)，所述方法用于从降解的RNA(诸如来自***固定的石蜡包埋的组织切片的降解的mRNA)制备cDNA，例如，用于组织切片中基因的克隆或表达分析。显示随机序列的第一链cDNA合成引物也可以用于制备cDNA的实施方案中，其中RNA的序列是未知的，或RNA包含多个显示不同序列的不同的RNA分子。
本发明的方法17包含方法16的任一个实施方案，其中所述第一链cDNA合成引物另外显示特异性5′序列，其位于出现在该引物的3′末端的序列的5′，其中所述特异性5′序列能用作合成第二链cDNA的模板，该第二链cDNA显示特异性3′序列，该特异性3序列′与所述特异性5′序列互补，并提供第二链cDNA的特异性引发位点。在有些实施方案中，特异性5′序列包含显示一个或多个标记结构域(诸如显示Roche 454测序接头的测序标记结构域)的标记或由其组成，例如，用于大规模平行的DNA测序，其中使用Roche 454测序平台。
本发明的方法18包含方法14至17中任一个方法的实施方案，其中所述方法另外包含下述步骤：提供RNA酶H(例如，大肠杆菌RNA酶H或HYBRIDASETM热稳定的RNA酶H，EPICENTRE，Madison，WI)和RNA酶I(例如，大肠杆菌RNA酶I，EPICENTRE)；和使含有第一链cDNA的样品接触RNA酶H和RNA酶I，接触的条件和时间足以使得其中所述RNA被消化。
方法18用于在合成第一链cDNA之后，去除RNA模板和未杂交的RNA。在方法18的某些优选的实施方案中，所述方法另外包含灭活或去除RNA酶H和RNA酶I的步骤。在有些实施方案中，通过在进行下一步之前加热反应物(例如，对于大肠杆菌RNA酶H和RNA酶I，在70℃约15-30分钟)，灭活RNA酶H和RNA酶I。在所述方法的有些实施方案中(其中在用RNA酶H和RNA酶I处理之后，是一个或多个其它的步骤，其中RNA酶H和RNA酶I的存在不是有害的)，省略了灭活或去除RNA酶H和RNA酶I的步骤。
本发明的方法19包含方法14至18中任一个方法的实施方案，其中所述方法另外包含下述步骤：提供DNA-依赖性的DNA聚合酶；和使第一链cDNA接触DNA-依赖性的DNA聚合酶，接触的条件和时间足以使得其中合成双链cDNA。
方法20包含方法14至19中任一个方法的实施方案，其中所述方法另外包含合成双链cDNA，其中所述方法另外包含下述步骤：提供第二链cDNA合成引物(其与第一链cDNA的一部分互补，所述部分与在步骤(A)中提供的受体寡核苷酸互补)和DNA-依赖性的DNA聚合酶；和使第二链cDNA合成引物和DNA-依赖性的DNA聚合酶接触第一链cDNA，接触的条件和时间足以使得其中合成双链cDNA。
方法21包含方法19或20的实施方案，其中所述DNA-依赖性的DNA聚合酶与为第一链cDNA的合成所提供的RNA-依赖性的DNA聚合酶相同。
方法22包含方法19或20的实施方案，其中所述DNA-依赖性的DNA聚合酶不同于为第一链cDNA的合成所提供的RNA-依赖性的DNA聚合酶。
方法23包含方法19至22中任一个方法的实施方案，其中受体寡核苷酸(例如，RNA受体寡核苷酸)的5′部分、第一链cDNA合成引物的5′-部分或第二链cDNA合成引物的5′-部分显示双链RNA聚合酶启动子(例如，T7-型RNA聚合酶，诸如T7、T3或SP6 RNA聚合酶的启动子)的一条链的序列，且所述方法另外包含下述步骤：提供可以使用双链RNA聚合酶启动子(其一条链的序列显示在受体寡核苷酸中)合成RNA的RNA聚合酶、第一链cDNA合成引物，或第二链cDNA合成引物；和使双链cDNA接触RNA聚合酶，接触的条件和时间足以使得其中合成RNA。
因而，在方法23的有些实施方案中，受体寡核苷酸显示RNA聚合酶启动子的一条链的序列，而在其它实施方案中，受体寡核苷酸没有显示RNA聚合酶启动子的一条链的序列。
在方法23的有些实施方案中(其中所述受体寡核苷酸没有显示RNA聚合酶启动子的一条链的序列)，第二链cDNA合成引物的5′部分显示RNA聚合酶启动子的一条链的序列，其中它的3′部分显示与在第一链cDNA的3′末端处的标记互补且退火的序列。在第一链cDNA的3′末端处的标记又与在所述方法的5′连接标记步骤中被RNA连接酶连接到具有5′单磷酸基团的RNA上的受体寡核苷酸互补。因而，在使5′-连接标记的RNA接触RNA-依赖性的DNA聚合酶的步骤期间，添加上在第一链cDNA的3′末端处的标记。然后，在合成双链DNA的步骤期间，通过DNA-依赖性的DNA聚合酶延伸第二链cDNA引物(使用第一链cDNA作为模板)和延伸第一链cDNA(使用第二链cDNA合成引物的5′部分作为模板)，生成RNA聚合酶启动子。在某些这样的实施方案中，相对于在所述方法的步骤(A)中提供的样品中含有的RNA，使用双链cDNA合成的RNA是有义RNA。
在方法23的其它实施方案中，其中所述受体寡核苷酸没有显示RNA聚合酶启动子的一条链的序列，第一链cDNA合成引物的5′部分显示RNA聚合酶启动子的一条链的序列，其中它的3′部分显示与使用所述方法生成的5′-连接标记的RNA互补的序列。在某些这样的实施方案中，相对于在所述方法的步骤(A)中提供的样品中含有的RNA，使用双链cDNA合成的RNA是反义RNA。
方法24包含方法1-23中任一个方法的实施方案，其中所述受体寡核苷酸、第一链cDNA引物或第二链cDNA引物各自含有或连接到亲和分子(例如，生物素或洋地黄毒苷)，且所述方法另外包含下述步骤：提供固体表面，其共价地或非共价地包被有能特异性地结合亲和分子并与之形成特异性结合对的亲和结合物质(例如，结合生物素的链霉亲和素或亲和素，或结合洋地黄毒苷的抗体)；和，在使用亲和分子的步骤之前或之后，接触化学连接到亲和分子上的各个受体寡核苷酸、第一链cDNA引物或第二链cDNA引物，接触的条件和时间足以使得其中亲和分子结合于连接到固体表面上的亲和结合物质。
关于方法24，本发明不限于特定固体表面，其可以是多孔的或无孔的，且具有适合特定方法和用途的任意组成、大小或形状。例如，固体表面可以选自：磁珠，包被的珠子，载玻片，微量滴定板的孔，由玻璃、塑料(例如，胶乳或聚苯乙烯)、二氧化硅、特氟隆或其它合适的材料制成的试管和测杆。用亲和结合物质包被固体表面的目的是，允许操纵(例如，捕获并洗涤，以去除反应混合物中的其它分子)、分离和捕获化学连接到亲和分子上的受体寡核苷酸、第一链cDNA引物或第二链cDNA引物，或允许操纵、分离和捕获从其得到的各个5′-连接标记的RNA、第一链cDNA、第二链cDNA或双链cDNA。为了阻止非特异性的结合，在有些实施方案中，用选自下述的大量物质处理固体支持物：无DNA的tRNA；蛋白(例如BSA)、多糖(例如，糖原、硫酸葡聚糖或肝素)。本发明也不限于特定的亲和分子或亲和结合物质，只要它们能特异性地结合和形成特异性结合对。
本发明的方法25包含方法24的优选的实施方案，其中合成的各个5′-连接标记的RNA、第一链cDNA或第二链cDNA含有亲和分子，且所述含有亲和分子的5′-连接标记的RNA、第一链cDNA或第二链cDNA通过它与固体表面的结合被捕获、分离或纯化，所述方法包含下述步骤：在有促进含有亲和分子的5′-连接标记的RNA、第一链cDNA或第二链cDNA与附着在固体表面上的亲和结合物质结合的试剂和条件下，使含有亲和分子的5′-连接标记的RNA、第一链cDNA或第二链cDNA接触固体表面，其中所述含有亲和分子的5′-连接标记的RNA、第一链cDNA或第二链cDNA被结合到表面上，由此捕获、分离或纯化含有亲和分子的5′-连接标记的RNA、第一链cDNA或第二链cDNA。
方法26包含方法24或25的实施方案，其中所述亲和分子是生物素，且所述亲和结合物质是生物素或链霉抗生物素，或其中所述亲和分子是洋地黄毒苷，且所述亲和结合物质是特异性地结合洋地黄毒苷的抗体。
在方法1-26中任一个方法的有些实施方案中，具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA包含选自下述的具有5′三磷酸基团的RNA或由其组成：初级真核RNA；初级原核RNA(例如，细菌mRNA)；ncRNA；和使用RNA聚合酶在体外转录反应中合成的RNA。
在方法1-26中任一个方法的有些实施方案中，具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA包含具有5′二磷酸基团的RNA或由其组成，所述具有5′二磷酸基团的RNA是用加帽酶***(例如，痘病毒加帽酶、痘苗病毒加帽酶、啤酒糖酵母加帽酶、或SCRIPTCAPTM加帽酶试剂盒，EPICENTRE)的RNA三磷酸酶消化初级RNA转录物的产物。
一般而言，在方法1-26中任一个方法的步骤(A)中提供的样品可以来自真核生物、原核生物，或来自一种或多种真核生物和/或一种或多种原核生物这两者。在有些实施方案中，使用体外转录或RNA扩增，来扩增样品中的RNA；但是，在这样的实施方案中，优选地，在体外转录或RNA扩增之前5′连接标记RNA，使得样品中的RNA的5′末端上的被5′连接标记的基团是在生物来源中存在的基团。
关于本发明的任一种方法：如果在样品中存在，具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA可以由具有5′三磷酸的RNA或具有5′二磷酸基团的RNA组成。在任一种方法的有些实施方案中，如果在样品中存在，具有5′三磷酸基团的未加帽的RNA选自：原核初级RNA、真核初级RNA和使用RNA聚合酶体外转录DNA模板而合成的RNA。在有些实施方案中，使用RNA聚合酶体外转录DNA模板而合成的RNA是来自RNA扩增反应，包括使用本发明的一种或多种方法合成有义或反义RNA的RNA扩增反应。在任意方法的有些实施方案中，如果在样品中存在，具有5′三磷酸基团的未加帽的RNA包含真核mRNA、真核非编码RNA、原核mRNA和/或原核非编码RNA。在任意方法的有些实施方案中，如果在样品中存在，具有5′二磷酸基团的RNA可以是用RNA三磷酸酶(例如，具有RNA三磷酸酶活性的多肽，其包含加帽酶***(例如，痘病毒加帽酶、痘苗病毒加帽酶或啤酒糖酵母RNA三磷酸酶))消化未加帽的初级RNA的产物，或它可以是用包含Dcp2亚基的脱帽酶(例如，真核mRNA脱帽酶：Coller，J和Parker，R，Ann.Rev.Biochem.73：861-890，2004；酵母脱帽酶：Steiger，M等人，RNA 9：231-238，2003；哺乳动物脱帽酶：Piccirillo，C等人，RNA 9：1138-1147，2003；拟南芥脱帽酶：Gunawardana，D等人，Nucleic Acids Res.36：203-216，2008，和Iwasaki S，等人，FEBS Lett.581：2455-2459，2007)；和痘苗病毒脱帽酶(例如，痘苗病毒D9或D10脱帽酶；Parrish，S和Moss，B，J Virol.81：12973-12978，2007；Parrish，S等人，Proc Natl Acad Sci USA 104：2139-2144，2007)消化5′加帽的RNA的产物。
一般而言，如果希望5′连接标记的感兴趣的RNA分子包含样品中具有5′-羟基的RNA分子，方法1-26中任一个方法另外包含下述步骤：在包含与受体寡核苷酸和RNA连接酶一起温育RNA的步骤之前，用多核苷酸激酶(PNK)(例如，T4 PNK)和ATP处理样品，处理的条件和时间足以使得其中样品中具有5′-羟基的RNA被转化成具有5′-单磷酸基团的RNA。
一般而言，RNA受体寡核苷酸是优选受体寡核苷酸，其提供和使用在本发明的提供和使用受体寡核苷酸的所有方法中。因而，在方法1-26中任一个方法的某些优选实施方案中，受体寡核苷酸是RNA受体寡核苷酸(也称作″RNA受体寡物(oligo)″或″RNA受体″或″受体RNA″或″RNA受体分子″或″RNA寡物受体″等)。但是，在有些实施方案中，使用DNA受体寡核苷酸。受体寡核苷酸没有长度限制，但是一般而言，RNA受体寡核苷酸的最小大小由三核苷二磷酸组成。在某些优选的实施方案中，RNA受体寡核苷酸由3个核糖核苷酸至约25个核糖核苷酸组成。在该小的大小范围内的RNA受体寡核苷酸胜过更大的受体寡核苷酸，因为在RNA连接酶步骤中可能使用更高摩尔浓度的RNA受体寡核苷酸(例如，以增加RNA供体分子的5′连接标记的效率)，也因为更短的RNA受体寡核苷酸与它自身退火或与RNA供体分子显示的一个或多个RNA序列退火的可能性更低，所述任一种退火都会降低连接效率或产生假象。因而，在某些优选的实施方案中，优选地，RNA受体寡核苷酸显示这样的序列，其不太可能与它自身退火(例如，由于分子内序列的互补性)，也不太可能与RNA供体分子或样品中的其它核酸退火(例如，由于分子间序列的互补性)。
在某些优选的实施方案中，RNA受体寡核苷酸的5′末端具有5′羟基，使它不能用作用于连接的RNA供体。在某些优选的实施方案中，RNA受体寡核苷酸的5′末端具有5′帽核苷酸，该5′-加帽的RNA受体寡核苷酸不能用作用于连接的RNA供体。
关于核苷组合物，在其中T4 RNA连接酶用作连接酶的某些优选的实施方案中，RNA受体寡核苷酸的3′末端核苷酸由腺苷组成。在某些优选的实施方案中，RNA受体寡核苷酸的3′末端核苷酸不是由尿苷组成。在某些优选的实施方案中，在RNA受体寡核苷酸的3′末端处的最后2个核苷酸由腺苷组成。在某些优选的实施方案中，在RNA受体寡核苷酸的3′末端处的最后3个核苷酸由腺苷组成。在某些优选的实施方案中，RNA受体寡核苷酸的3′末端核苷酸不是由尿苷组成。在本领域中已经公开了关于设计和使用RNA受体寡核苷酸的其它信息，以及与要使用本发明的方法5′连接标记的供体RNA的性质和用途有关的信息(例如，Gumport RI和Uhlenbeck OC，Gene Amplif Anal.2：313-345，1981；Gumport RI和Uhlenbeck OC，Gene Amplif Anal.2：313-345，1981；Romaniuk E，McLaughlin LW，Neilson T，和Romaniuk PJ.Eur J Biochem.125：639-43，1982；Romaniuk PJ和Uhlenbeck OC.Methods Enzymol.；100；52-59，1983；和Uhlenbeck OC和Gumport RI(1982)见：The Enzymes Vol.XV，第31-58页，(Boyer，P.D.，编)Academic Press，New York)。一般而言，供体分子的5′-磷酸化的末端的具体核苷酸组成对5′连接标记的效率的影响不象RNA受体寡核苷酸的3′-羟基化的末端的核苷酸组成那样大。
在某些其它的优选的实施方案中，将另一种RNA连接酶(不是T4RNA连接酶)用作连接酶(例如，噬菌体TS2126 RNA连接酶)，且RNA受体寡核苷酸的3′末端的一个或多个核苷酸可以由腺苷以外的一个或多个核苷组成。如果可能，实验地确定对于由特定RNA连接酶连接到5′-单磷酸化的供体RNA分子上而言最佳的RNA受体寡核苷酸的3′核苷酸。
多种不同的酶可用于本发明的方法中。在其中使用RNA 5′多磷酸酶(RPP)的本发明任意方法的有些实施方案中，所述RPP选自铝-可诱导的RNA 5′多磷酸酶、大肠杆菌RPP、大肠杆菌RPP I、志贺氏菌属RPP和志贺氏菌属RPP I。在其中使用RNA 5′单磷酸酶(RMP)的本发明任意方法的有些实施方案中，所述RMP是RNA 5′单磷酸酶1(RMP1，EPICENTRE)。在其中使用碱性磷酸酶的本发明任意方法的有些实施方案中，所述碱性磷酸酶选自APEXTM碱性磷酸酶(EPICENTRE)、虾碱性磷酸酶(USB，Cleveland，OH)和北极碱性磷酸酶(New England Biolabs，MA)。在其中使用核酸焦磷酸酶的本发明任意方法的有些实施方案中，所述焦磷酸酶是烟酸焦磷酸酶(TAP)(EPICENTRE)。在其中使用脱帽酶的本发明任意方法的有些实施方案中，所述脱帽酶选自酵母脱帽酶、哺乳动物脱帽酶、拟南芥脱帽酶和痘苗病毒脱帽酶D9或D10。在其中使用加帽酶的本发明任意方法的有些实施方案中，所述加帽酶选自痘病毒加帽酶、啤酒糖酵母加帽酶、痘苗病毒加帽酶和SCRIPTCAPTM加帽酶(EPICENTRE)。在其中使用RNA连接酶的本发明任意方法的有些实施方案中，所述RNA连接酶选自T4 RNA连接酶(EPICENTRE)和噬菌体TS2126 RNA连接酶。在其中使用聚(A)聚合酶的本发明任意方法的有些实施方案中，所述聚(A)聚合酶选自大肠杆菌聚(A)聚合酶(EPICENTRE)和啤酒糖酵母聚(A)聚合酶。在其中使用RNA-依赖性的DNA聚合酶的本发明任意方法的有些实施方案中，所述RNA-依赖性的DNA聚合酶选自SUPERSCRIPT RT(Invitrogen，Carlsbad，CA)、AMV RT和MMLV RT(EPICENTRE)。在其中使用RNA酶H的本发明任意方法的有些实施方案中，所述RNA酶H选自大肠杆菌RNA酶H(EPICENTRE)、Tth RNA酶H、Tfl RNA酶H和HYBRIDASETM RNA酶H(EPICENTRE)。在其中使用RNA聚合酶(RNAP)的本发明任意方法的有些实施方案中，所述RNA聚合酶选自T7-型RNAP、T7 RNAP、T3 RNAP和SP6 RNAP(EPICENTRE)。在其中使用核糖核酸外切酶(XRN)的本发明任意方法的有些实施方案中，所述核糖核酸外切酶选自啤酒糖酵母Xrn I核糖核酸外切酶(Xrn I)和TERMINATORTM5′-磷酸-依赖性的外切核酸酶(EPICENTRE)。在其中使用多核苷酸激酶(PNK)的本发明任意方法的有些实施方案中，所述多核苷酸激酶是T4 PNK(EPICENTRE)。
本领域技术人员会理解，执行本发明的各种方法的某些步骤的次序是重要的，但是所述步骤的次序可以变化，条件是，小心地考虑每种酶对可能在样品中存在的各种RNA分子类别的5′-末端处的基团的影响，从而不会不利地影响预期目标。
在其中提供和使用特定酶的本发明任意方法的有些实施方案中，所述方法还另外包含下述步骤：在将特定酶用于方法中之后，灭活或去除特定酶。关于特定实施方案，如果可能，优选地，通过加热，或通过在反应后改变反应混合物的条件至新条件(其中所述特定酶变得无活性，但是在该方法的下一步骤中使用的酶是有活性的)，灭活特定酶。例如：通过将反应混合物在65℃加热约15分钟，可以灭活RNA 5′单磷酸酶1(RMP1)；通过加入镁至约1-10mM的终浓度和/或加入无机磷酸盐离子至约0.1mM的终浓度，可以灭活RPP I反应混合物中的大肠杆菌RNA 5′多磷酸酶I(RPP I)；且通过向TAP反应混合物中加入磷酸钠(pH 7.8)至约10mM的终浓度，将pH从pH 6.0调至约pH 7.5，可以灭活烟酸焦磷酸酶(TAP)。当然，重要的是，证实在该方法的下一步骤中使用的酶在从特定酶的灭活步骤导致的反应条件下是有活性的。
本发明的一个实施方案是试剂盒，其包含RNA连接酶(例如，T4RNA连接酶或噬菌体TS2126 RNA连接酶(都来自EPICENTRE)；RNA受体寡核苷酸；和RNA 5′多磷酸酶(例如，铝-可诱导的RNA 5′多磷酸酶，例如，大肠杆菌RNA 5′多磷酸酶I(大肠杆菌RPP I或RPP I，EPICENTRE)或志贺氏菌属RNA 5′多磷酸酶I)。在有些实施方案中，所述试剂盒另外包含RNA 5′单磷酸酶(例如，RNA 5′单磷酸酶1(RMP1，EPICENTRE)。在试剂盒另外包含RNA 5′单磷酸酶的有些实施方案中，所述试剂盒另外包含核酸焦磷酸酶(例如，烟酸焦磷酸酶(TAP)，EPICENTRE)；或脱帽酶(例如，酵母脱帽酶、哺乳动物脱帽酶、拟南芥脱帽酶或痘苗病毒脱帽酶D9或D10)。
本发明的另一个实施方案是试剂盒，其包含RNA连接酶(例如，T4RNA连接酶，EPICENTRE或噬菌体TS2126 RNA连接酶)；RNA受体寡核苷酸；RNA 5′单磷酸酶(例如，RNA 5′单磷酸酶1(RMP1，EPICENTRE)；和核酸焦磷酸酶(例如，烟酸焦磷酸酶(TAP)，EPICENTRE)。
本发明的另一个实施方案是试剂盒，其包含核酸焦磷酸酶(例如，烟酸焦磷酸酶)、RNA受体寡核苷酸和噬菌体TS2126 RNA连接酶。
本发明的另一个实施方案是试剂盒，其包含RNA连接酶(例如，T4RNA连接酶，EPICENTRE或噬菌体TS2126 RNA连接酶)；RNA受体寡核苷酸；RNA 5′多磷酸酶(例如，铝-可诱导的RNA 5′多磷酸酶，例如，大肠杆菌RNA 5′多磷酸酶I(大肠杆菌RPP I或RPP I，EPICENTRE)或志贺氏菌属RNA 5′多磷酸酶I)，和至少一种选自下述的其它组分：RNA 5′单磷酸酶(例如，RNA 5′单磷酸酶1(RMP1，EPICENTRE)；和核酸焦磷酸酶(例如，烟酸焦磷酸酶(TAP)，EPICENTRE)；和脱帽酶(例如，酵母脱帽酶、哺乳动物脱帽酶、拟南芥脱帽酶或痘苗病毒脱帽酶D9或D10)。
本发明的另一个实施方案是试剂盒，其包含RNA连接酶(例如，T4RNA连接酶，EPICENTRE或噬菌体TS2126 RNA连接酶)；RNA受体寡核苷酸；加帽酶(例如，痘病毒加帽酶、啤酒糖酵母加帽酶或SCRIPTCAPTM加帽酶试剂盒，(EPICENTRE))；和至少一种选自下述的其它组分：RNA 5′单磷酸酶(例如，RNA 5′单磷酸酶1(RMP1)，EPICENTRE)或碱性磷酸酶(例如，APEXTM碱性磷酸酶(EPICENTRE)、虾碱性磷酸酶(USB，Cleveland，OH)或北极碱性磷酸酶(New England Biolabs，MA)；和核酸焦磷酸酶(例如，烟酸焦磷酸酶(TAP)，EPICENTRE)或脱帽酶(例如，酵母脱帽酶、哺乳动物脱帽酶、拟南芥脱帽酶或痘苗病毒脱帽酶D9或D10)。
本发明的另一个实施方案是试剂盒，其包含RNA连接酶(例如，T4RNA连接酶，EPICENTRE或噬菌体TS2126 RNA连接酶)；RNA受体寡核苷酸；脱帽酶(例如，酵母脱帽酶、哺乳动物脱帽酶、拟南芥脱帽酶或痘苗病毒脱帽酶D9或D10)；和至少一种选自下述的其它组分：RNA 5′单磷酸酶(例如，RNA 5′单磷酸酶1(RMP1)，EPICENTRE)；和碱性磷酸酶(例如，APEXTM碱性磷酸酶(EPICENTRE)、虾碱性磷酸酶(USB，Cleveland，OH)或北极碱性磷酸酶(New England Biolabs，MA)。
本发明的另一个实施方案是试剂盒，其包含RNA连接酶(例如，T4RNA连接酶，EPICENTRE或噬菌体TS2126 RNA连接酶)；RNA受体寡核苷酸；和脱帽酶(例如，酵母脱帽酶、哺乳动物脱帽酶、拟南芥脱帽酶或痘苗病毒脱帽酶D9或D10)。
在任一种上述试剂盒的有些实施方案中，所述试剂盒另外包含至少一种选自下述的其它组分：多核苷酸激酶(PNK)(例如，T4 PNK，EPICENTRE)；第一链cDNA合成引物；第二链cDNA合成引物；和RNA-依赖性的DNA聚合酶；和RNA聚合酶(RNAP)(例如，T7-型RNAP，例如，T7 RNAP、T3 RNAP或SP6 RNAP，EPICENTRE)。
本发明的另一个实施方案是试剂盒，其包含RNA 5′多磷酸酶(例如，铝-可诱导的RNA 5′多磷酸酶，例如，大肠杆菌RNA 5′多磷酸酶I(大肠杆菌RPP I或RPP I，EPICENTRE)或志贺氏菌属RNA 5′多磷酸酶I)，所述多磷酶与至少一种选自下述的其它组分组合：RNA 5′单磷酸酶(例如，RNA 5′单磷酸酶1(RMP1，EPICENTRE)；碱性磷酸酶(例如，APEXTM碱性磷酸酶(EPICENTRE)、虾碱性磷酸酶(USB，Cleveland，OH)或北极碱性磷酸酶(New England Biolabs，MA)；核酸焦磷酸酶(例如，烟酸焦磷酸酶(TAP)，EPICENTRE)；脱帽酶(例如，酵母脱帽酶、哺乳动物脱帽酶、拟南芥脱帽酶或痘苗病毒脱帽酶D9或D10)；加帽酶(例如，痘病毒加帽酶、啤酒糖酵母加帽酶或SCRIPTCAPTM加帽酶试剂盒，(EPICENTRE))；RNA连接酶(例如，T4 RNA连接酶，EPICENTRE或噬菌体TS2126 RNA连接酶)；RNA受体寡核苷酸；聚(A)聚合酶(例如，大肠杆菌聚(A)聚合酶，EPICENTRE)或聚(U)聚合酶；RNA-依赖性的DNA聚合酶(RT)(例如，SUPERSCRIPT RT(Invitrogen，Carlsbad，CA)、AMV RT、MMLV RT(EPICENTRE))；第一链cDNA合成引物；RNA酶H(例如，大肠杆菌RNA酶H或HYBRIDASETM RNA酶H，EPICENTRE)；第二链cDNA合成引物；RNA聚合酶(RNAP)(例如，T7-型RNAP，例如，T7 RNAP、T3 RNAP或SP6 RNAP，EPICENTRE)；5′核糖核酸外切酶(XRN)(例如，啤酒糖酵母Xrn I核糖核酸外切酶(Xrn I)，或TERMINATORTM5′-磷酸-依赖性的外切核酸酶，EPICENTRE)；多核苷酸激酶(PNK)(例如，T4 PNK，EPICENTRE)；和具有5′三磷酸或二磷酸基团的RNA分子，其中所述基团的β或γ磷酸被标记。
本发明的另一个实施方案是试剂盒，其包含RNA 5′单磷酸酶(RMP)(例如，RNA 5′单磷酸酶1(RMP1，EPICENTRE)，其与至少一种选自下述的其它组分组合：RNA 5′多磷酸酶(例如，铝-可诱导的RNA 5′多磷酸酶，例如，大肠杆菌RNA 5′多磷酸酶I(大肠杆菌RPP I或RPP I，EPICENTRE)或志贺氏菌属RNA 5′多磷酸酶I)；碱性磷酸酶(例如，APEXTM碱性磷酸酶(EPICENTRE)、虾碱性磷酸酶(USB，Cleveland，OH)或北极碱性磷酸酶(New England Biolabs，MA)；核酸焦磷酸酶(例如，烟酸焦磷酸酶(TAP)，EPICENTRE)；脱帽酶(例如，酵母脱帽酶、哺乳动物脱帽酶、拟南芥脱帽酶或痘苗病毒脱帽酶D9或D10)；加帽酶(例如，痘病毒加帽酶、啤酒糖酵母加帽酶或SCRIPTCAPTM加帽酶试剂盒，(EPICENTRE))；RNA连接酶(例如，T4 RNA连接酶，EPICENTRE或噬菌体TS2126 RNA连接酶)；RNA受体寡核苷酸；聚(A)聚合酶(例如，大肠杆菌聚(A)聚合酶，EPICENTRE)；RNA-依赖性的DNA聚合酶(RT)(例如，SUPERSCRIPT RT(Invitrogen，Carlsbad，CA以及(EPICENTRE))；第一链cDNA合成引物；RNA酶H(例如，大肠杆菌RNA酶H或HYBRIDASETM RNA酶H，EPICENTRE)；第二链cDNA合成引物；RNA聚合酶(RNAP)(例如，T7-型RNAP，例如，T7 RNAP、T3 RNAP或SP6RNAP，EPICENTRE)；5′核糖核酸外切酶(XRN)(例如，TERMINATORTM5′-磷酸-依赖性的外切核酸酶，EPICENTRE，或啤酒糖酵母Xrn I核糖核酸外切酶(Xrn I))；多核苷酸激酶(PNK)(例如，T4 PNK，EPICENTRE)；和具有5′三磷酸或二磷酸基团的RNA分子，其中所述基团的β或γ磷酸被标记。
本发明的方法、试剂盒和组合物具有广泛用途。例如，使用它们产生的核酸分子可以用于从任意需要的全长RNA(例如，全长加帽的真核mRNA、miRNA、全长未加帽的真核初级RNA，包括非编码RNA或全长原核初级mRNA)合成cDNA，和用于克隆所述cDNA，用于所述需要的RNA的RNA扩增，和用于捕获和鉴别所述需要的RNA的精确5′末端(例如，通过测序，或通过使用诸如cDNA末端的随机扩增(RACE)、外显子阵列或其它微阵列等方法)。
一般而言，本文公开的方法1-26中的任一种或任意试剂盒和组合物会提供胜过世界专利申请WO 2007/117039A1的改进，并可以用于与世界专利申请WO 2007/117039A1所述相同的目的和用途。
在本发明的有些实施方案中，单独地或组合地使用本文公开的方法1-26中任一个方法或任意试剂盒和组合物，从而生成由标记的或未标记的5′-连接标记的RNA、第一链cDNA、第二链cDNA、双链cDNA或通过体外转录来自两种不同样品中的每一种的双链cDNA合成的RNA组成的核酸分子，且所述分子用于分析、鉴别(例如，序列)、定量或测定核酸分子的相对丰度(例如，通过测量相对于另一个样品中核酸分子的丰度，来自或源自一个样品的一种或多种核酸分子的丰度，所述测量例如，使用微阵列或实时PCR)、注释和发现产生所述核酸分子的样品中的RNA分子的生物学功能。在有些实施方案中，为了研究目的，分析、鉴别、定量、测序、注释核酸分子，或发现生物学功能，而在其它实施方案中，该工作是为了商业目的而进行(例如，为了发现和表达用于工业、农业或其它商业用途的基因，或为了使用用于人或动物的医学、治疗或诊断用途的信息)。
定义
基于下面限定的术语的定义，将会理解和解释本发明。
当在本文中使用术语“例如”、“诸如”、“如”、“包括”、“包含”或其变化形式时，这些术语不应当视作限制术语，应当解释为是指“但不限于”或“不限于”。
本文使用的“受体寡核苷酸”是指，通过RNA连接酶的作用能连接到具有5′磷酸基团的RNA的5′末端上的具有3′羟基的寡核苷酸，其中所述具有5′磷酸基团的RNA称作“供体”。由核糖核苷酸组成的受体寡核苷酸在本文中称作“RNA受体寡核苷酸”或“RNA受体”。
“亲和结合分子”或“特异性的结合对”在本文中是指，在某些条件(称作“结合条件”)下彼此具有亲和力并彼此“结合”的分子。生物素和链霉亲和素或亲和素是“特异性的结合对”或“亲和结合分子”的实例，但是本发明不限于使用该具体的特异性的结合对。
本文中定义的“亲和分子”是指，能特异性地结合另一种物质(在本文中称作“亲和结合物质”)的分子。亲和分子和亲和结合物质组成或包含“亲和结合分子”或“特异性的结合对”。亲和分子(例如，生物素或洋地黄毒苷)可以缀合到其它分子(例如，RNA或DNA)上，且使用本领域已知的方法(例如，使用在下述文献中所述的试剂和方法：Avidin-Biotin Chemistry：A Handbook，D.Savage等人，Pierce Chemical Company，1992，和Handbook of Fluorescent Probes and Research Products，第9版，R.P.Hoagland，Molecular Probes，Inc.，和BIOCONJUGATE Techniques，Greg T.Hermanson，Academic Press，Inc.，San Diego，CA，1996)，可以将亲和结合物质(例如，结合生物素的链霉亲和素或亲和素，或结合洋地黄毒苷的特异性抗体)共价缀合到或非共价结合到固体表面上。使用本领域已知的试剂和方法，使用寡核苷酸合成仪，也可以合成缀合到DNA或RNA上的亲和分子。
根据本发明的术语“结合”是指，作为非共价键(例如，氢键、疏水相互作用、范德华键和离子键)的结果，亲和分子和亲和结合物质之间的相互作用。不受理论的约束，本领域认为，这些类型的非共价键导致结合，部分是由于参与特异性结合对的分子的互补形状或结构。基于“结合”的定义和亲和结合分子或特异性的结合对的广泛种类，显而易见，结合条件随不同的特异性的结合对而异。本领域技术人员可以容易地发现或确定在样品中发生亲和结合分子之间的结合所需的条件。具体地，本领域技术人员可以容易地确定可以使亲和结合分子之间发生结合的条件，所述结合在本领域中被视作“特异性的结合”。如本领域所理解的，这样的特异性通常是由于与样品中的其它物质和组分(例如，容器壁、固体支持物)相比亲和结合分子之间更高的亲和力。在某些情况下，特异性也可能涉及或可能是由于与样品中的其它物质和组分相比亲和结合分子的明显更快速的缔合。
“帽”或“帽核苷酸”是连接到初级RNA转录物的5′末端上的修饰的鸟嘌呤核苷酸。具有连接到5′末端上的帽核苷酸的RNA称作“加帽的RNA”或“加帽的RNA转录物”或“加帽的转录物”。常见的帽核苷是7-甲基鸟苷或N7-甲基鸟苷(有时称作“标准帽”)，其具有指定为“m7G”的结构，在该情况下，加帽的RNA或“m7G-加帽的RNA”具有指定为m7G(5′)ppp(5′)N1(pN)x-OH(3′)的结构，或更简单地，指定为m7GpppN1(pN)x或m7G(5′)ppp(5′)N，其中m7G代表7-甲基鸟苷帽核苷，ppp代表帽核苷的5′碳和初级RNA转录物的第一个核苷酸之间的三磷酸键，N1(pN)x-OH(3′)代表初级RNA转录物，其中N1是最5′的核苷酸，“p”代表磷酸基团，“G”代表鸟苷核苷，“m7”代表在鸟嘌呤的7-位上的甲基，且“(5′)”表示“p”与帽核苷酸的核糖和mRNA转录物的第一个核苷(“N”)相连的位置。除了该“标准帽”以外，本领域已知许多其它天然存在的和合成的帽类似物。具有任意帽核苷酸的RNA被称作“加帽的RNA”。加帽的RNA可以是天然存在于生物样品中，或它可以通过用加帽酶***(例如，痘苗病毒加帽酶***或啤酒糖酵母加帽酶***)对具有5′三磷酸基团的RNA或具有5′二磷酸基团的RNA进行体外加帽而得到。或者，使用本领域已知的方法(例如，使用AMPLICAPTM T7加帽试剂盒(EPICENTRE))，通过含有RNA聚合酶启动子的DNA模板的体外转录(IVT)，可以得到加帽的RNA，其中，除了GTP以外，IVT反应还含有二核苷酸帽类似物(例如，m7GpppG帽类似物或N7-甲基，2′-O-甲基-GpppG ARCA帽类似物或N7-甲基，3′-O-甲基-GpppG ARCA帽类似物)。
在体内，通过几个酶促步骤，发生5′-三磷酸化的初级mRNA转录物的加帽(例如，参见Martin，S A等人，J.Biol.Chem.250：9322，1975；Myette，J R和Niles，E G，J.Biol.Chem.271：11936，1996；M A Higman，等人，J.Biol.Chem.267：16430，1992)。
在真核mRNA的加帽中涉及下述的酶促反应：
(1)RNA三磷酸酶将mRNA的5′-三磷酸切割成二磷酸，
pppN1(p)Nx-OH(3′)→ppN1(pN)x-OH(3′)+Pi；然后
(2)RNA鸟苷酰转移酶催化GTP向mRNA的最5′的核苷酸(N1)的5′-二磷酸上的连接，
ppN1(pN)x-OH(3′)+GTP→G(5′)ppp(5′)N1(pN)x-OH(3′)+PPi；最后，
(3)鸟嘌呤-7-甲基转移酶使用S-腺苷-甲硫氨酸(AdoMet)作为辅因子，催化帽核苷酸中鸟嘌呤的7-氮的甲基化，
G(5′)ppp(5′)N1(pN)x-OH(3′)+AdoMet→m7G(5′)ppp(5′)N1(pN)x-OH(3′)+AdoHyc。
源自RNA三磷酸酶和RNA鸟苷酰转移酶活性的作用的RNA，以及被鸟嘌呤-7-甲基转移酶活性额外甲基化的RNA，在本文中称作“5′加帽的RNA”或“加帽的RNA”，且“加帽酶***”或简称“加帽酶”在本文中是指具有产生“加帽的RNA”的酶活性的一种或多种多肽的任意组合。加帽酶***，包括这些酶的克隆形式，已经从许多来源鉴别和纯化出来，且是本领域熟知的(例如，参见Shuman，S，Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol.66：1-40，2001；Shuman，S，Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol.50：101-129，1995；Shuman，S等人，J.Biol.Chem.255：11588，1980；Banerjee，A K，Microbiol.Rev.44：175-205，1980；Wang，S P等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：9573，1997；Higman M.A.等人，J.Biol.Chem.267：16430，1992；Higman，MA等人，J.Biol.Chem.269：14974-14981，1994；Myette，JR和Niles，EG，J.Biol.Chem.271：11936-11944，1996)。可以将具有5′多磷酸的未加帽的RNA转化成加帽的RNA的任何加帽酶***，可以用于本发明的提供或使用加帽酶***的任意实施方案中。在有些实施方案中，所述加帽酶***是痘病毒加帽酶***。在某些优选的实施方案中，所述加帽酶***是痘苗病毒加帽酶。在有些实施方案中，所述加帽酶***是啤酒糖酵母加帽酶。另外，考虑到下述事实，即来自一种来源的编码RNA三磷酸酶、RNA鸟苷酰转移酶和鸟嘌呤-7-甲基转移酶的基因可以在来自另一种来源的一个或所有这样的基因中完全缺失，所述加帽酶***可以源自一种来源，或RNA三磷酸酶、RNA鸟苷酰转移酶和/或鸟嘌呤-7-甲基转移酶活性中的一种或多种可以包含来自不同来源的多肽。
本文定义的“脱帽酶”是指，在不会将具有5′多磷酸基团的RNA转化成具有5′单磷酸基团的RNA的条件下，将加帽的RNA转化成具有5′单磷酸基团的RNA的酶。在真核细胞中，加帽的长RNA通常被由Dcp1/Dcp2复合物组成的脱帽酶转化成具有5′单磷酸基团的RNA，其中，Dcp2是催化亚基，且所述脱帽酶在本文中称作“Dcp2-型脱帽酶”。因而，在本发明的其中使用脱帽酶的优选实施方案中，所述脱帽酶是Dcp2-型脱帽酶。Dcp2-型脱帽酶是Nudix酶超家族的成员，所述酶共有保守的氨基酸序列，称作Nudix(或MutT)基序或Nudix盒，其显示序列GX5EX7REUXEEXGU(Dunckley，T和Parker，R.EMBO J 18：5411-5422，1999；van Dijk，E等人，EMBO J.21：6915-6924，2002；Steiger，M等人，RNA 9：231-238，2003；Xu，W等人J.Biol.Chem.279：24861-24865，2004；Gunawardana，D等人，Nucleic Acids Res.36：203-216，2008)。将加帽的短RNA(包括二核苷酸)消化成具有5′二磷酸基团的RNA的DcpS-型酶，不是本文定义的脱帽酶。
本文使用的术语“酶”是指负责催化化学和生物学反应的蛋白分子或蛋白分子聚集体。一般而言，本发明的方法、组合物或试剂盒不限于使用来自特定来源的特定酶。相反，本发明的方法、组合物或试剂盒包含来源任意来自的任意酶，其具有与在本文中关于特定方法、组合物或试剂盒公开的特定酶的等效酶活性。作为实例，RNA 5′多磷酸酶可以是大肠杆菌或志贺氏菌属RNA 5′多磷酸酶I，或它可以是在合适的反应条件下将具有5′多磷酸基团的RNA转化成具有5′单磷酸基团的RNA的另一种RNA 5′多磷酸酶；RNA-依赖性的DNA聚合酶可以是AMV逆转录酶；MMLV逆转录酶；SUPERSCRIPT I、SUPERSCRIPT II、SUPERSCRIPT III或AMV THERMOSCRIPT逆转录酶(INVITROGEN)；或MONSTERSCRIPT逆转录酶(EPICENTRE)，或它可以是另一种酶，其可以使用RNA作为模板和与模板中的互补序列退火的寡核苷酸引物，在合适的反应条件下合成DNA；多核苷酸激酶可以是T4多核苷酸激酶，或它可以是另一种酶，其可以在合适的反应条件下，将来自ATP或另一种核苷-5′-三磷酸的单磷酸基团转移到具有5′羟基的RNA的5′末端；聚(A)聚合酶可以是由pcnB基因编码的大肠杆菌聚(A)聚合酶，或它可以是另一种酶，其在有ATP存在下，在没有核酸模板的情况下，在合适的反应条件下，可以在具有3′羟基的RNA的3′末端上合成聚(A)尾序；核糖核酸酶H可以是大肠杆菌RNA酶H或HYBRIDASETM热稳定的RNA酶H(EPICENTRE，Madison，WI)，或它可以是另一种酶，其在合适的反应条件下，消化与DNA退火的RNA，但是不消化单链RNA或与RNA退火的RNA；核酸焦磷酸酶可以是烟酸焦磷酸酶，或它可以是另一种酶，其在合适的反应条件下，通过切割m7G-加帽的RNA的三磷酸桥，生成具有5′单磷酸基团的RNA；且碱性磷酸酶可以是APEXTM碱性磷酸酶(EPICENTRE，Madison，WI)或虾碱性磷酸酶或北极碱性磷酸酶(New England Biolabs，MA)，或它可以是另一种酶，其在合适的反应条件下，将具有5′多磷酸基团的RNA或具有5′单磷酸基团的RNA转化成具有5′羟基的RNA。更进一步，本发明的方法也包括这样的实施方案：其中，在所述方法的步骤中提供和使用的任意一种特定酶被替换为两种或更多种酶的组合，它们当组合使用时(无论以分步方式分开使用，还是同时在反应混合物中一起使用)，导致与使用一种特定酶合成的RNA相同的RNA的合成。本文(包括在实施例中)提供的方法、缓冲液和反应条件，目前对于本发明的方法、组合物和试剂盒的实施方案而言是优选的。但是，用于本发明的某些酶的其它酶储存缓冲液、反应缓冲液和反应条件，是本领域已知的，它们也适用于本发明中，且包括在本文中。
在本发明的方法、组合物或试剂盒中使用的任意酶可以是天然蛋白或重组蛋白。术语“天然蛋白”在本文中用于表示从天然存在的(即，非重组的)来源分离的蛋白。本文使用的术语“重组蛋白”或“重组多肽”是指从重组DNA分子表达的蛋白分子。分子生物学技术可以用于生产重组形式的蛋白，其具有与天然形式的蛋白相比等同或类似的性质。也可以生产天然序列的变体，例如，以提高多肽的表达、纯化或其它需要的性质。重组蛋白可以是融合蛋白。本文使用的术语“融合蛋白”是指，含有与外源蛋白片段(例如，含有非-RPP I蛋白的融合配偶体)相连的感兴趣的蛋白(例如，大肠杆菌RNA 5′多磷酸酶I(RPP I)或其片段)的嵌合蛋白。融合配偶体可以提高在宿主细胞中表达的具有需要的酶活性的蛋白的溶解度，可以提供亲和标记，以允许从宿主细胞或培养上清液或二者纯化重组融合蛋白。如果需要，通过本领域已知的多种酶或化学方法，可以从感兴趣的蛋白去除融合蛋白。
在本发明的优选的实施方案中，在方法、组合物或试剂盒中使用的酶组合物包含纯化的蛋白。本文使用的术语“纯化的”或“纯化”是指，从感兴趣的组分(诸如蛋白)去除一些污染物的任意过程的结果。例如，通过去除其它污染性的不需要的蛋白、核酸、碳水化合物、脂质和/或小生化分子，纯化特定的需要的蛋白(例如，RPP I或RMP 1)。污染物的去除，导致需要的蛋白在组合物中的百分比增加。例如，在优选的实施方案中，纯化RPP I或RMP1组合物，使其不含有污染核酸和对核酸有活性的其它酶。
在某些优选的实施方案中，如下得到需要的蛋白(例如，RPP I或RMP1)：通过在质粒或在大肠杆菌细胞中复制和表达的其它载体中表达基因(和/或其功能变体和同源物)，或通过使用TRANSPOSOMETM***(例如，EZ-Tn5TM TRANSPOSOMETM***(EPICENTRE，Madison，WI)表达***大肠杆菌细胞的染色体中的基因(和/或其功能变体和同源物)，因为从这样的重组来源得到的酶具有更高的纯度，不含有污染酶活性，且通常处于比从非重组来源得到的酶浓度更高的酶浓度。
本文使用的术语“基因”是指DNA序列，其包含编码的多肽或蛋白前体的生产所需的控制和编码序列。多肽可以由全长编码序列或编码序列的任意部分编码，只要保留需要的蛋白活性即可。
在本发明的优选的实施方案中，将酶“稳定化”是指，酶是足够纯的蛋白酶，且不含有导致降解和酶活性丧失的其它污染物，并提供在酶储存缓冲液制剂中，其中在-20℃储存6个月期间没有显著的活性丧失。为许多酶(例如，大肠杆菌5′RPP I、T4 PNK、T4 RNA连接酶)提供稳定化的组合物的一种合适的酶储存缓冲液包含：含有50mM Tris-HCL(pH7.5)、100mM NaCl、100mM EDTA、1mM DTT和0.1％非离子型去污剂Triton X-100的50％甘油溶液。
此外，本发明的蛋白(例如，RNA 5′多磷酸酶或RNA 5′单磷酸酶)的变体形式也视作与本文更详细地阐述的那些肽和DNA分子等同。例如，考虑到，用异亮氨酸或缬氨酸分离地替换亮氨酸，用谷氨酸替换天冬氨酸，用丝氨酸替换苏氨酸，或用结构相关的氨基酸类似地替换氨基酸(即，保守突变)，不会对得到的分子的生物活性产生重大影响。因此，本发明的有些实施方案提供了本文公开的酶的变体，其含有保守替换。保守替换是发生于侧链相关的氨基酸家族内的那些。遗传编码的氨基酸可以分成4个家族：(1)酸性的(天冬氨酸、谷氨酸)；(2)碱性的(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；(3)非极性的(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)；和(4)不带电荷的极性的(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时一起归类为芳族氨基酸。以类似的方式，可以将全部氨基酸分组为：(1)酸性的(天冬氨酸、谷氨酸)；(2)碱性的(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，(3)脂族(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸)，其中丝氨酸和苏氨酸任选地单独分组为脂族-羟基；(4)芳族的(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)；(5)酰胺(天冬酰胺、谷氨酰胺)；和(6)含硫的(半胱氨酸和甲硫氨酸)(例如，Stryer编，Biochemistry，第17-21页，第2版，WH Freeman和Co.，1981)。通过评估变体肽的以与野生型蛋白类似的方式起作用的能力，可以容易地确定肽的氨基酸序列的变化是否产生功能性多肽。以相同的方式，可以容易地测试具有超过一种替换的肽。
更罕见地，在本发明的方法、组合物或试剂盒中使用的酶的变体包括“非保守的”变化(例如，用色氨酸替换甘氨酸)。类似的微小变异也可以包括氨基酸缺失或***或二者。使用计算机程序(例如，LASERGENE软件，DNASTAR Inc.，Madison，WI)，可以找到确定取代、***或去除哪些氨基酸残基而不影响生物活性的指南。
通过下面更详细地描述的诸如定向进化等方法或生产变体的组合文库的其它技术，可以生产变体。在本发明的其它实施方案中，可以工程改造本发明的核苷酸序列，以便改变本发明的方法、组合物或试剂盒中的酶的编码序列(例如，通过工程改造RNA 5′多磷酸酶或RNA 5′单磷酸酶的序列)，包括修饰基因产物的克隆、加工、定位、分泌和/或表达的改变。例如，使用本领域熟知的技术(例如，定点诱变以***新的限制位点，改变糖基化模式，或改变密码子优先性等)，可以引入突变。
本发明的其它实施方案提供了本发明的酶的突变体或变体形式。可能为了诸如增强活性或稳定性(例如，离体保质期和/或对体内蛋白水解降解的抗性)等目的，修饰具有活性的肽(例如，RNA 5′多磷酸酶)的结构。这样的修饰的肽被视作具有本文定义的主题蛋白的活性的肽的功能等同物。可以生产修饰的肽，其中氨基酸序列已经被改变，诸如通过氨基酸取代、缺失或添加。
此外，如上所述，主题蛋白的变体形式(例如，突变体)也被视作与更详细阐述的那些肽和DNA分子等同。例如，如上所述，本发明包括含有保守的或非保守的氨基酸取代的突变体和变体蛋白。
本发明另外包括生产本发明的蛋白(例如，RNA 5′多磷酸酶或RNA5′单磷酸酶)的组合突变体集合以及截短突变体(例如，使用EZ-Tn5TM蛋白截短试剂盒，EPICENTRE)的方法，并特别适用于鉴别功能性的(例如，RNA 5′多磷酸酶或RNA 5′单磷酸酶活性)潜在变体序列(即，突变体)。筛选这样的组合文库的目的是，例如，生成具有提高的或改变的酶活性的新颖的酶变体。
因此，在本发明的有些实施方案中，通过本发明的方法，工程改造蛋白变体(例如，RNA 5′多磷酸酶或RNA 5′单磷酸酶的变体)，以提供改变的(例如，增加的或减少的)酶活性。在其它实施方案中，工程改造蛋白变体，为特定用途提供热稳定的(即，“耐热的”)或不耐热的活性。在本发明的其它实施方案中，生产组合衍生的变体，它们具有不同于天然存在的蛋白的底物变异性。当从重组DNA构建体表达时，这样的蛋白可以用于本文所述的方法中。
本发明的其它实施方案提供了蛋白变体(例如，RNA 5′多磷酸酶或RNA 5′单磷酸酶的变体)，其具有明显不同于对应的野生型蛋白的细胞内半衰期。例如，可以使改变的蛋白对蛋白水解降解或导致蛋白破坏或以其它方式灭活蛋白的其它细胞过程的稳定性更高或更低。这样的变体和编码它们的基因可以用于通过调节蛋白的半衰期，改变表达位置。例如，短的半衰期可以产生更短暂的生物学效应，且当作为可诱导的表达***的一部分时，可以允许更紧密地控制细胞内的蛋白水平。
在本发明的其它实施方案中，通过组合方法生产蛋白变体(例如，RNA 5′多磷酸酶或RNA 5′单磷酸酶的变体)用作拮抗剂，因为它们能够干扰对应的野生型蛋白调节细胞功能的能力。在本发明的组合诱变方法的有些实施方案中，比对蛋白同源物、变体或其它有关蛋白群体的氨基酸序列，优选地，以促进可能的最高同源性。这样的变体群体可以包括来自一个或多个物种或亚种的蛋白同源物(例如，RNA 5′多磷酸酶或RNA 5′单磷酸酶的同源物)，或来自相同物种或亚种、但是由于突变或多态性而不同的蛋白变体。选择出现在比对的序列的每个位置的氨基酸，以建立组合序列的简并集合。
在本发明的一个优选的实施方案中，通过编码多肽文库(其各自包括至少一部分潜在的蛋白序列)的基因的简并文库，生成组合蛋白文库。例如，可以将合成的寡核苷酸的混合物酶促连接到基因序列中，使得潜在序列的简并集合(例如，RNA 5′多磷酸酶或RNA 5′单磷酸酶的潜在序列)可表达为单个多肽，或者，表达为其中含有该序列集合的更大的融合蛋白集合(例如，用于噬菌体展示)。
存在多种从简并寡核苷酸序列产生潜在的蛋白同源物和变体的文库的方法。在有些实施方案中，在自动DNA合成仪中进行简并基因序列的化学合成，并将合成的基因连接进适当的基因中进行表达。基因的简并集合的目的是，在一种混合物中提供编码需要的潜在蛋白序列集合的所有序列。简并寡核苷酸的合成是本领域熟知的(参见例如，Narang，Tetrahedron Lett.，39：39，1983；Itakura等人，Recombinant DNA，见Walton(编)，Proceedings of the 3rd Cleveland Symposium on Macromolecules，Elsevier，Amsterdam，第273-289页，1981；Itakura等人，Annu.Rev.Biochem.，53：323，1984；Itakura等人，Science 198：1056，1984；Ike等人，Nucl.Acid Res.，11：477，1983)。这样的技术已经用于其它蛋白的定向进化(参见例如，Scott等人，Science 249：386，1980；Roberts等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：2429，1992；Devlin等人，Science 249：404，1990；Cwirla等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：6378，1990；以及美国专利号5223409；5198346；和5096815)。
考虑到编码蛋白的核酸可以用作定向进化的起始核酸。这些技术可以用于开发具有需要的性质(诸如增加的、降低的或改变的酶活性)的酶变体。
在有些实施方案中，通过随机诱变进行人工进化(例如，通过使用易错的PCR来将随机突变引入给定的编码序列)。该方法要求精细调节突变的频率。作为一般规律，有益突变是稀少的，而有害突变是常见的。这是因为，有害突变和有益突变的组合经常产生无活性的酶。靶向的基因的碱基取代的理想数目通常是1.5至5(Moore和Arnold，Nat.Biotech.，14，458，1996；Eckert和Kunkel，PCR Methods Appl.，1：17-24，1991；Caldwell和Joyce，PCR Methods Appl.，2：28，1992；和Zhao和Arnold，Nuc.Acids Res.25：1307，1997)。诱变后，选择得到的克隆，获得需要的活性。开发具有需要的性质的酶，经常需要连续数轮诱变和选择。应当指出，仅有用的突变进入下一轮诱变。
在本发明的其它实施方案中，本发明的多核苷酸用于基因改组或性PCR操作(例如，Smith，Nature，370：324，1994；美国专利号5837458；5830721；5811238；5733731)。基因改组包含几个突变DNA的随机断裂，然后通过PCR将它们重新组装成全长分子。各种基因重排操作的实例包括，在DNA酶处理后组装，交错的延伸过程，和随机引发体外重组。在DNA酶介导的方法中，从阳性突变体集合分离出的DNA区段被DNA酶I切割成随机片段，并在没有加入引物的情况下，进行多轮PCR。随着PCR循环进行，随机片段的长度接近未切割的区段的长度，导致在不同克隆中存在的突变变得混合，且积累在某些得到的序列中。多轮选择和改组，已经导致几种酶的功能增强(Stemmer，Nature，370：398，1994；Stemmer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：10747，1994；Crameri等人，Nat.Biotech.，14：315，1996；Zhang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：4504，1997；和Crameri等人，Nat.Biotech.，15：436，1997)。
本领域已知多种技术，用于筛选通过点突变产生的组合文库的基因产物，和用于筛选具有某种性质的基因产物的cDNA文库。这样的技术通常适用于快速筛选通过组合诱变或蛋白同源物或变体的重组产生的基因文库。最广泛使用的筛选大基因文库的技术通常包含，将基因文库克隆进可复制的表达载体中，用得到的载体文库转化适当的细胞，并在以下条件下表达组合基因：其中需要的活性的检测会促进载体的相对容易的分离，所述载体编码基因，所述基因的产物被检测。
也可以使用本发明的核酸和蛋白的片段，只要所述片段编码或具有需要的酶活性。
本文使用的“5′核糖核酸外切酶”(“XRN”)是指这样的5′外切核酸酶：其对具有5′-单磷酸化的末端的单链RNA底物的5′-至-3′外切核酸酶活性比具有5′-三磷酸化的或5′-加帽的末端的相同RNA底物高20倍以上。使用许多不同的方法，可以测量本发明的5′核糖核酸外切酶的酶活性。Stevens和Poole(J.Biol.Chem.，270：16063，1995)描述了使用具有5′-三磷酸、5′-帽或5′-单磷酸的RNA底物测定活性和测定相对活性的适当方法。5′核糖核酸外切酶的优选组合物是啤酒糖酵母Xrn1p/5′核糖核酸外切酶1(或“Xrn I核糖核酸外切酶”或“Xrn I 5′核糖核酸外切酶”或“5′Xrn1p核糖核酸外切酶”)，它们可以使用本领域已知的方法来制备。在有些实施方案中，通过已经克隆进质粒中然后在大肠杆菌细胞中复制和表达的啤酒糖酵母XRN1基因的表达，得到5′核糖核酸外切酶。
“寡物帽”(oligo cap)”或“寡核苷酸帽(oligonucleotide cap)”是这样的受体寡核苷酸：其通过RNA连接酶的作用，被连接到5′-单磷酸化的RNA分子的5′末端上，作为“寡物加帽”方法的一部分。在本领域的寡物加帽方法的大多数实施方案中，寡物帽是RNA受体寡核苷酸。“寡物帽”不同于在真核mRNA分子上常见的“m7G帽”。真核mRNA上的帽(例如，m7G帽)和某些其它的真核RNA分子在本文中有时称作“m7G-帽”或“帽核苷酸”或“核苷酸帽”，以将它与“寡核苷酸帽”或“寡物帽”区分开。我们在本文中有时将具有帽核苷酸的RNA(例如，真核mRNA)称作“m7G-加帽的RNA”，即使所述帽核苷酸可能具有除了鸟嘌呤碱基的N7-甲基基团以外的其它修饰。
本文使用的“核酸焦磷酸酶”或“焦磷酸酶”(“PPase”)是指这样的酶，其切割m7G-加帽的RNA的三磷酸桥的焦磷酸键或具有5′三磷酸的初级RNA中的5′三磷酸的焦磷酸键，生成具有5′单磷酸的RNA。核酸焦磷酸酶可以是烟酸焦磷酸酶(“TAP”)，或它可以是在所述方法中具有类似活性的任意其它酶。例如，已经报道，杆状病毒磷酸酶(BVP)(Takagi，T.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：9808-9812，1998；Gross，C.H.和Shuman，S.，J.Virology 72：7057-7063，1998)、人PIR1蛋白(Deshpande，T.等人，J.Biol.Chem.274：16590-16594，1999)和大肠杆菌RppH蛋白(Deana，A等人，Nature 451：355-358，2008)会将5′-三磷酸化的RNA转化成5′-单磷酸化的RNA，但是尚未报道它们对加帽的RNA的活性。考虑到，可以测试该活性，且从BVP、PIR1和RppH蛋白中选出的具有将加帽的RNA转化成具有5′单磷酸基团的RNA的活性的任意蛋白，可以用作本发明的任意方法中的核酸焦磷酸酶。烟酸焦磷酸酶是本发明方法的优选核酸焦磷酸酶。
“聚腺苷酸聚合酶”(“PAP”)是指在大多数真核生物、原核生物和真核病毒中发现的独立于模板的RNA聚合酶，其选择性地使用ATP，将AMP残基掺入RNA的3′-羟基化的末端。由于从植物、动物、细菌和病毒研究的PAP酶都催化相同的总反应(例如，参见Edmonds，M，Methods Enzymol.，181；161-180，1990)，在结构上是高度保守的(例如，参见Gershon，P，Nature Structural Biol.7：819-821，2000)，并且缺少对RNA分子的特定序列或大小的固有特异性，如果PAP分离自识别AAUAAA多腺苷酸化信号的蛋白(Wilusz，J和Shenk，T，Cell 52：221，1988)，从众多来源中的任一种来源纯化的野生型和重组的PAP酶可以用于本发明的试剂盒和方法中。
“初级RNA”或“初级RNA转录物”是指由RNA聚合酶在体内或在体外合成的RNA分子，且所述RNA分子在它的最5′的核苷酸的5′-碳上具有三磷酸。
“复制”是指，使用RNA分子作为模板，由RNA-依赖性的RNA聚合酶(或“复制酶”)形成或合成RNA分子。
根据本发明的“RNA扩增”是导致RNA产物的合成的方法，其中与样品中存在的序列的拷贝数相比，RNA序列或它的互补序列的拷贝数增加。作为实例，使用寡(dT)启动子引物作为第一链cDNA合成引物的方法，可以用于合成反义RNA(aRNA)，如Van Gelder，R.N.，等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1663，1990)所述。用于该目的的试剂盒可商业上得到，且可以使用，包括1-轮和2-轮扩增试剂盒，诸如不同的1-轮和2-轮TARGETAMPTM Aminoallyl-aRNA扩增试剂盒或TARGETAMPTMaRNA扩增试剂盒，它们可从EPICENTRE(Madison，WI)得到。或者，在5′部分显示RNA聚合酶启动子的一条链的序列、且在3′部分显示与第一链cDNA的3′末端上的标记所显示的序列互补的序列的第二链cDNA合成引物(或PCR引物)，可以用于合成有义RNA的RNA扩增方法中(例如，使用本文所述的方法)。因而，在这些实施方案中，RNA受体寡核苷酸被连接到感兴趣的RNA(包括具有5′单磷酸基团的RNA)的5′末端，由此得到5′-连接标记的RNA，其再用作模板，用于使用RNA-依赖性的DNA聚合酶合成第一链cDNA。然后，使用DNA聚合酶和第二链cDNA合成引物(或PCR引物)，合成含有RNA聚合酶启动子的双链cDNA。最后，使用结合RNA聚合酶启动子并从RNA聚合酶启动子启动转录的RNA聚合酶，通过体外转录双链cDNA，合成扩增的有义RNA。如果样品中的感兴趣的RNA尚不具有5′单磷酸基团，将它转化成具有5′单磷酸基团的RNA(例如，使用烟酸焦磷酸酶来转化感兴趣的RNA，包括加帽的RNA和具有5′多磷酸基团的RNA两者，或使用RNA多磷酸酶只转化具有5′多磷酸基团的RNA)。
本发明也不限于需要合成双链cDNA的RNA扩增方法。作为实例，本发明也包含在美国专利申请号2004/0171041中所述的RNA扩增方法和组合物(其使用这样的RNA聚合酶：其可以使用在功能上连接到单链启动子上的单链模板合成RNA)，诸如使用MINI-V RNA聚合酶(可从EPICENTRE在MINI-VTM体外转录试剂盒中得到)的方法；在这些实施方案中，单链启动子连接在cDNA的5′末端或cDNA的3′-末端，所述cDNA通过mRNA的逆转录来制备(其中使用RNA-依赖性的DNA聚合酶来延伸引物)，随后通过体外转录单链DNA模板(例如，使用MINIVRNA聚合酶)，分别导致扩增的反义RNA或扩增的有义RNA的合成。
本文定义的“RNA连接酶”是指这样的酶或酶组合物：其能催化在它的3′末端具有羟基的RNA受体寡核苷酸结合或连接到在5′末端具有5′磷酸基团的RNA供体上。关于RNA连接酶，本发明不受限制，来自任意来源的任何RNA连接酶可以用于本发明的方法和试剂盒的实施方案中。例如，在有些实施方案中，RNA连接酶是由噬菌体T4基因63编码的多肽(gp63)；该酶通常简称为“T4 RNA连接酶”，现在更正确地称为“T4 RNA连接酶1”，因为Ho，CK和Shuman，S(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：12709-12714，2002)描述了由噬菌体T4基因24.1编码的第二种RNA连接酶(gp24.1)，其现在称为“T4 RNA连接酶2”。除非另有说明，当在本说明书中使用“T4 RNA连接酶”时，我们是指“T4 RNA连接酶1”。例如，在某些其它的实施方案中，RNA连接酶是由来自美国专利号7303901中所公开的噬菌体TS2126(其感染水管致黑栖热菌)的RNA连接酶基因衍生或编码的多肽(即，噬菌体TS2126 RNA连接酶)。
本文定义的“RNA 5′单磷酸酶”或“RNA 5′单磷酸酶”或“RNA 5′单磷酸酶组合物”或“RMP”是指这样的酶或酶组合物：其能在所述RNA 5′单磷酸酶基本上不将未加帽的初级RNA(是指具有5′三磷酸基团的RNA)消化成具有5′羟基的RNA的条件下，将具有5′单磷酸基团的RNA转化成具有5′羟基的RNA。在不同的实施方案中，适用于本发明的采用RNA5′单磷酸酶的方法中的RNA 5′单磷酸酶是这样的酶：其在使用的条件下，在反应中将＞50％、＞60％、＞70％、＞80％、＞90％或＞90％的5′-单磷酸化的RNA转化成具有5′羟基的RNA，而基本上不消化在反应混合物中的5′-三磷酸化的RNA(例如，原核mRNA)。例如，在有些实施方案中，这可以使用本领域已知的用于实时qRT-PCR方法进行测量，其中使用适合扩增5′-单磷酸化的RNA和5′-三磷酸化的RNA的引物对。尽管在本文中针对将RNA的5′单磷酸基团消化成5′羟基的能力定义了RNA 5′单磷酸酶，RNA 5′单磷酸酶也可以具有其它酶活性。例如，在本文中应当理解，RNA 5′单磷酸酶可以(但是不一定)也具有从含有3′单磷酸基团的RNA去除3′单磷酸基团的酶活性。另外，RNA 5′单磷酸酶可以(但是不一定)也能从DNA、核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸的末端或甚至从非-核酸底物切割单磷酸基团。可以用于采用RNA 5′单磷酸酶的任意方法中的一种合适的RNA 5′单磷酸酶是RNA 5′单磷酸酶1(RMP 1，EPICENTRE，Madison，WI，USA)。本发明不限于包含RMP1的实施方案，可以使用任意的RNA 5′单磷酸酶，只要酶起它的预期目的的功能，即特异性地将具有5′单磷酸基团的RNA转化成具有5′羟基的RNA，而不将在相同反应混合物中存在的具有5′三磷酸基团的RNA转化成具有5′羟基的RNA。
使用不同的底物(例如，磷酸对硝基苯酯或具有5′单磷酸基团的核酸(RNA或DNA))、条件和测定，可以以多种方式定义RNA 5′单磷酸酶的酶活性。例如，可以使用的1单位定义是：“1单位的RNA 5′单磷酸酶是，在25℃，在1M二乙醇胺缓冲液(pH 9.6，其含有15mM磷酸对硝基苯酯和5mM氯化钙)中，在1分钟内使1微摩尔磷酸对硝基苯酯脱磷酸的酶的量”。例如，可以使用的1其它单位定义是：“1分子生物学单位(MBU)的RNA 5′单磷酸酶(例如，RNA 5′单磷酸酶1(RMP1)，EPICENTRE)是，在30℃，在合适的反应缓冲液(例如，对于RMP1，一种合适的反应缓冲液包含：33mM Tris-醋酸盐、pH 7.5、66mM醋酸钾、10mM醋酸镁、5mM氯化钙和0.5mM DTT)中，在60分钟内从1微克的具有5′-单磷酸基团的核酸底物的确定制剂(例如，对于RMP1、RNA或DNA底物，例如，16S和/或23S细菌核糖体RNA的确定制剂，或具有5′单磷酸基团的确定的DNA)去除5′单磷酸基团的酶的量”。
本文定义的“RNA 5′多磷酸酶”或“RNA多磷酸酶”是指这样的酶或酶组合物，其将具有5′三磷酸基团的RNA(例如，未加帽的初级真核的或原核的RNA)或具有5′二磷酸基团的RNA转化成具有5′单磷酸基团的RNA，但是不将加帽的RNA(例如，m7G-加帽的RNA)转化成具有5′单磷酸基团的RNA。但是，除了具有本文定义的酶活性以外，RNA 5′多磷酸酶也可以具有其它酶活性。例如，在本文中应当理解，RNA 5′多磷酸酶也可以从包含两个或更多个磷酸(其连接到RNA分子的5′末端)的任意线性多磷酸去除磷酸。另外，RNA 5′多磷酸酶也可以能够消化包含两个或更多个磷酸的线性多磷酸，所述磷酸连接在DNA、RNA、核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸的5′末端上或甚至非-核酸多磷酸底物上。本发明的有些实施方案包含这样的组合物、试剂盒和方法：其使用由铝-可诱导的细菌基因编码的RNA 5′多磷酸酶(例如，大肠杆菌RNA 5′多磷酸酶I或“大肠杆菌5′RPP I”或“大肠杆菌RPP I”，或有时简称“RPPI”)。发现纯化的大肠杆菌RNA 5′多磷酸酶I酶是接近19-kDa蛋白。测定了RNA 5′多磷酸酶I的核酸序列(SEQ ID NO：1)和氨基酸序列(SEQ ID NO：2)(图4)。本文使用的术语“RNA 5′多磷酸酶”可以是指蛋白或基因，除非另有说明。
一种适用于提供大肠杆菌RNA 5′多磷酸酶I(大肠杆菌5′RPP I)的稳定化酶组合物的酶储存缓冲液包含：含有50mM Tris-HCL(pH 7.5)、100mM NaCl、100mM EDTA、1mM DTT和0.1％非离子型去污剂TritonX-100的50％甘油溶液。
使用不同的底物(例如，NTP、初级RNA、6，8-二氟-4-甲基伞形酮磷酸酯(methylumbelliferyl phosphate))、条件和测定，可以以多种方式定义RNA 5′多磷酸酶的酶活性。例如，可以使用的1单位定义是：“1单位的RNA 5′多磷酸酶是，在37℃，在标准的反应测定条件下(例如，对于大肠杆菌RNA 5′多磷酸酶I，使用在由50mM HEPES/KOH、pH 7.5、0.1M NaCl、1mM EDTA、0.1％BME和0.01％TRITON X100组成的反应缓冲液中的1mM ATP)，在60分钟内从ATP释放1纳摩尔无机磷酸盐的酶的量”。
本发明的方法不限于使用大肠杆菌5′RPP I。可以使用在所述方法的预定反应条件下具有与大肠杆菌5′RPP I等同的酶活性的任意RNA 5′多磷酸酶。本文定义的“RNA 5′多磷酸酶”或“RNA多磷酸酶”是指这样的酶组合物：其在所述RNA多磷酸酶不会将加帽的RNA的5′末端消化成单磷酸的条件下，能将初级RNA的5′三磷酸基团消化成5′单磷酸。例如，RNA 5′多磷酸酶可以选自大肠杆菌RNA 5′多磷酸酶I(大肠杆菌RPPI)和志贺氏菌属RNA 5′多磷酸酶I(志贺氏菌属RPP I)。但是，关于本发明的方法，所述酶可以是在该特定方法中具有RNA 5′多磷酸酶活性的来自任意来源的任意酶。例如，已经报道，杆状病毒磷酸酶(BVP)(Takagi，T.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：9808-9812，1998；Gross，C.H.和Shuman，S.，J.Virology 72：7057-7063，1998)、人PIR1蛋白(Deshpande，T.等人，J.Biol.Chem.274：16590-16594，1999)和大肠杆菌RppH蛋白(Deana，A等人，Nature 451：355-358，2008)会将5′-三磷酸化的RNA转化成5′-单磷酸化的RNA，但是尚未报道它们对加帽的RNA的活性。考虑将测试该活性，且从BVP、PIR1和RppH蛋白中选出的不具有将加帽的RNA转化成具有5′单磷酸基团的RNA的活性的任意蛋白，可以用作本发明的采用RNA多磷酸酶的任意方法中的RNA多磷酸酶。
本文定义的“RNA酶H”是指这样的酶或酶组合物，其特异性地消化在RNA:DNA杂合体中的RNA，而不消化在相同反应混合物中存在的DNA或未杂交的RNA。示例性的RNA酶H酶包括大肠杆菌RNA酶H、HYBRIDASETM热稳定的RNA酶H和栖热菌属RNA酶H(例如，Tth或Tfl RNA酶H)。但是，关于RNA酶H，本发明不受限制，只要它起它的预期目的的功能，即特异性地消化在RNA:DNA杂合体中的与DNA退火的RNA。
本文定义的“RNA酶I”是指这样的酶或酶组合物：其能特异性地将所有二核苷酸对之间的单链RNA切割成核苷-3′-单磷酸，而不消化在相同反应混合物中存在的双链RNA或单链或双链DNA。一种示例性的RNA酶I酶包括大肠杆菌RNA酶I。但是，本发明不限于RNA酶I，只要该酶起它的预期目的的功能，即特异性地消化单链RNA，而不消化在相同反应混合物中存在的双链RNA或单链或双链DNA。
本文使用的“核苷”是指，由共价连接到戊糖上的嘌呤(鸟嘌呤(G)或腺嘌呤(A))或嘧啶(胸腺嘧啶(T)、尿苷(U)或胞苷(C))碱基组成的化合物，而“核苷酸”是指在戊糖的一个羟基处被磷酸化的核苷。
本文使用的“核酸”或“多核苷酸”是共价连接的核苷酸序列，其中一个核苷酸的糖部分的3′位通过磷酸二酯基团连接到下一个核苷酸的糖部分的5′位，且其中核苷酸残基(碱基)以特定次序相连；即，核苷酸的线性次序。本文使用的“寡核苷酸”是短多核苷酸或多核苷酸的一部分。寡核苷酸通常含有约2至约100个碱基的序列。词语“寡物(oligo)”有时用于替换词语“寡核苷酸”。在有些实施方案中，寡核苷酸是受体寡核苷酸(也称作“受体寡物”或”寡核苷酸受体”或”寡物受体”或”受体”或”受体分子”等)。受体寡核苷酸在它的3′末端上具有羟基，该羟基使它能连接到具有5′单磷酸的RNA分子(“供体”)上。在有些实施方案中，寡核苷酸由2′-脱氧核糖核苷酸(DNA)组成，或包含2′-脱氧核糖核苷酸(DNA)。在有些实施方案中，寡核苷酸由核糖核苷酸(RNA)组成，或包含核糖核苷酸(RNA)。在某些其中寡核苷酸由核糖核苷酸(RNA)组成的优选实施方案中，所述寡核苷酸是“RNA受体寡核苷酸”或“RNA受体寡物”或“RNA受体”或“RNA寡核苷酸受体”(等)，这意味着它在3′末端上具有羟基，且能被RNA连接酶(例如，T4 RNA连接酶，EPICENTRE或噬菌体TS2126 RNA连接酶)连接到在5′末端具有单磷酸基团的RNA分子(即，“RNA供体”或“RNA供体分子”等)上。
将线性核酸分子描述成具有“5′-末端”(5′末端)和“3′-末端”(3′末端)，因为核酸磷酸二酯键发生在取代基单核苷酸的糖部分的5′碳和3′碳处。与5′碳建立新键的多核苷酸末端是它的5′末端核苷酸。与3′碳建立新键的多核苷酸末端是它的3′末端核苷酸。本文使用的末端核苷酸是在3′-或5′-末端的末端位置处的核苷酸。
将核酸分子描述成具有“5′末端”和“3′末端”，因为除了关于帽以外(如本文别处所述)，单核苷酸通过磷酸二酯键在一个方向相连，形成寡核苷酸，连接方式使得在一个单核苷酸糖部分的5′-碳上的磷酸连接到它的相邻单核苷酸的糖部分的3′-碳上的氧。因此，如果寡核苷酸的5′磷酸没有连接到单核苷酸糖部分的3′-碳的氧上，寡核苷酸的末端称作“5′末端”；如果它的3′氧没有连接到随后的单核苷酸的糖部分的5′磷酸上，则称作“3′末端”。
本文使用的术语“在...的5′”和“在...的3′”是指，在核酸的单条链内，特定化学基团、核苷酸或核苷酸序列相对于另一个化学基团、核苷酸或核苷酸序列的位置或朝向。例如，在RNA受体寡核苷酸的3′末端处的3′核苷酸的3′位上的羟基(RNA供体分子的5′末端可以使用RNA连接酶与之相连)，在RNA受体寡核苷酸内的任意其它基团或核苷酸的3′。所有其它化学基团、核苷酸或核苷酸序列在RNA受体寡核苷酸的3′末端的5′。例如，在有些实施方案中，RNA聚合酶启动子序列可以在RNA受体寡核苷酸的3′末端处的核苷酸的5′。在核酸化学和结构的上下文中，尤其关于规范的核酸核苷酸的糖部分的3′-和5′-位，本领域技术人员会理解这些术语。如果第一个核酸序列在一条链上的第二个序列的3′，则第一个序列的互补序列将在互补链上的第二个序列的互补序列的5′-。
将多肽分子描述成具有“氨基端”(N-端)和“羧基端”(C-端)，因为肽键产生在第一个氨基酸残基的主链氨基和第二个氨基酸残基的主链羧基之间。
“RNA三磷酸酶”是指加帽酶***的酶或酶亚基，其将帽核苷酸(例如，m7G)添加到真核mRNA的5′末端。RNA三磷酸酶催化初级mRNA转录物的5′三磷酸切割成5′二磷酸。在某些加帽酶***中，RNA三磷酸酶是也具有鸟苷酰转移酶活性的蛋白的一种活性(例如，关于痘苗病毒加帽酶)，而在其它加帽酶***中，RNA三磷酸酶和鸟苷酰转移酶活性是在分开的蛋白中(例如，啤酒糖酵母)。具有将初级mRNA转录物的5′三磷酸切割成5′二磷酸的活性的任意RNA三磷酸酶，可以用于本发明的方法中。
术语“样品”和“生物样品”以它们的最广泛的含义使用，包括从任意来源(包括生物和环境来源)得到的样品或标本。本文使用的术语“样品”当用于指从生物体得到的生物样品时，包括液体、固体、组织和气体。在本发明的优选的实施方案中，生物样品包括体液、分离的细胞、固定的细胞、细胞裂解物等。例如，在有些实施方案中，样品是***固定的石蜡包埋的(FFPE)组织切片，且在样品中含有的RNA包含降解的RNA分子，包括降解的加帽的RNA、降解的具有5′多磷酸基团的RNA、降解的具有5′单磷酸基团的RNA和/或降解的具有5′羟基的RNA。因而，在5′连接标记样品中的一个或多个RNA分子的任意方法的有些实施方案中，所述样品含有降解的RNA，且所述方法用于5′连接标记样品中的各个降解的RNA分子中的一个或多个(例如，降解的加帽的RNA或降解的5′-三磷酸化的RNA)。在某些这样的实施方案中，得到、分离、纯化或分析的一个或多个RNA分子仅包含或主要包含RNA分子的5′末端部分，所述RNA分子源自天然存在的未降解的RNA分子(例如，仅加帽的RNA分子或5′-三磷酸化的RNA分子的5′末端部分)。但是，这些实施例不应理解为限制可以使用本发明的样品的类型。
“标记”是指显示序列(称作“标记序列”)的DNA，其允许所述标记所连接或附着的DNA的鉴别、识别和/或分子或生化操纵(例如，通过为DNA聚合酶进行的延伸提供引物退火的位点(即，“引发位点”)，例如，用于DNA测序或核酸扩增反应；或例如，通过为连接反应提供寡核苷酸退火的位点(即，用于使用模板-依赖性的DNA连接酶的连接的“连接模板”，例如，用于通过连接反应测序)；或例如，通过为寡脱氧核糖核苷酸的退火提供位点，例如，用于通过杂交测序，诸如Drmanac等人在美国专利申请号20090011943；20090005252；20080318796；20080234136；20080213771；20070099208；和20070072208中所述)。将标记连接到DNA分子上的过程，在本文中有时称作“标记”，且经历标记的DNA称作“标记的”(例如，“标记的DNA”)。标记可以具有一个或多个“标记部分”或“标记结构域”，其在本文中是指显示用于需要的预期目的或用途的序列的标记部分或结构域。不同的标记结构域的名称和描述是为了方便，诸如使得更容易理解和讨论标记的不同部分或结构域在不同实施方案中的预期目的和用途。但是，这些名称和描述无意以任何方式限制标记或它的任何标记结构域的应用或用途。因而，除了预期的或主要的目的或用途以外，或作为替代，任何特定的标记或标记结构域可以用于任何目的。例如，“捕获标记结构域”或“捕获标记”是指这样的标记结构域：其显示以促进标记结构域所连接的ssDNA片段的捕获为目的的序列(例如，为了将标记的RNA或DNA捕获到珠子或其它表面上，提供退火位点或亲和标记，例如，其中标记结构域序列的退火位点允许通过与在表面上的特异性序列退火而进行捕获，所述特异性序列诸如在珠子上或在微芯片或微阵列上或在测序珠上的探针)。在所述方法的有些实施方案中，通过与表面上的互补探针退火而捕获标记的RNA或DNA以后，捕获标记结构域会提供引发DNA合成的位点，在所述合成中使用所述标记的RNA或DNA(或所述标记的RNA或DNA的互补序列)作为模板。在某些其它的实施方案中，将捕获标记结构域连接到包含亲和结合分子或由亲和结合分子组成的化学基团或部分上(例如，其中标记的RNA或DNA的5′-部分连接到第一种亲和结合分子(诸如生物素、链霉亲和素、抗原或结合抗原的抗体)上，其允许将标记的RNA或DNA捕获到的表面上，第二种亲和结合分子附着在所述表面上，与第一种亲和结合分子形成特异性的结合对)。“测序标记结构域”或“测序标记”是指这样的标记结构域：其显示促进对标记所连接的RNA或DNA测序的目的的序列(例如，为了通过合成测序，提供引发位点，或为了通过连接测序，提供退火位点，或为了通过杂交测序，提供退火位点)。例如，在有些实施方案中，测序标记结构域会提供用于引发标记的DNA或所述标记的DNA的互补序列的DNA合成的位点。“检测标记结构域”或“检测标记”是指这样的标记结构域：其显示以促进使用本发明的方法产生的标记的RNA或DNA的检测为目的的序列或可检测的化学或生化部分(例如，其中所述序列或化学部分包含可检测的分子或连接到可检测的分子上；诸如选自下述的可检测的分子：可见的、荧光的、化学发光的或其它可检测的染料；在有底物存在下可检测的酶，例如，碱性磷酸酶与NBT+BCIP，或过氧化物酶与合适的底物)；可检测的蛋白，例如，绿色荧光蛋白；和亲和结合分子，其结合到可检测的部分上，或可以与另一种可检测的亲和结合分子形成亲和结合对或特异性的结合对；或本领域已知的许多其它可检测的分子或***中的任一种)。“地址标记结构域”或“地址标记”是指这样的标记结构域：其显示允许鉴别特定样品的序列(例如，其中所述标记的RNA或DNA具有不同的地址标记结构域，后者对于每种样品显示不同的序列)。“限制位点结构域”是指这样的标记结构域：其显示以促进使用限制性内切核酸酶的切割为目的的序列。例如，在有些实施方案中，使用限制位点结构域，生成二-标记的RNA或DNA。在有些实施方案中，使用限制位点结构域，在标记结构域中生成相容的双链5′-末端，使得该末端可以使用模板-依赖性的DNA连接酶连接到另一种DNA分子上。在某些优选的实施方案中，标记中的限制位点结构域显示仅罕见地(如果存在)存在于靶DNA中的限制位点序列(例如，罕见切割限制性内切核酸酶(诸如NotI或AscI)的限制位点)。在某些优选的实施方案中，限制位点结构域中的限制位点是II型限制性内切核酸酶(诸如FokI限制性内切核酸酶)的限制位点。一种标记结构域可以包含或提供2种或更多种其它标记结构域的功能或目的或用途(例如，测序标记结构域可以包含捕获标记结构域和地址标记结构域或检测标记结构域)。更进一步，为了用于任意具体的目的或用途或功能，不需要在一种或多种不同结构域方面来描述标记。
“转录”是指，使用DNA分子作为模板，由RNA聚合酶形成或合成RNA分子。关于用于转录的RNA聚合酶，本发明不受限制。例如，可以使用T7-型RNA聚合酶。
本文定义的“T7-型RNA聚合酶”是源自T7-型噬菌体的RNA聚合酶的野生型或突变体形式，包括噬菌体编码的酶和通过把RNA聚合酶基因克隆进DNA载体并在细菌或其它细胞中表达它而得到的酶。这是基于下述事实，即已经发现，已经检查过的所有T7-型噬菌体的遗传组构基本上与T7相同。根据本发明的T7-型噬菌体的实例包括大肠杆菌噬菌体T3、phi I、phi II、W31、H、Y、A1、122、cro、C21、C22和C23；恶臭假单胞菌噬菌体gh-1；鼠伤寒沙门氏菌噬菌体SP6；粘质沙雷氏菌噬菌体IV；柠檬酸杆菌属噬菌体ViIII；和克雷伯氏菌属噬菌体第11号(Hausmann，Current Topics in Microbiology and Immunology 75：77-109，1976；Korsten等人，J.Gen.Virol.43：57-73，1975；Dunn，等人，Nature New Biology 230：94-96，1971；Towle，等人，J.Biol.Chem.250：1723-1733，1975；Butler和Chamberlin，J.Biol.Chem.257：5772-5778，1982)。突变体RNAP(Sousa等人，美国专利号5,849,546；Padilla，R和Sousa，R，Nucleic Acids Res.，15：e138，2002；Sousa，R和Mukherjee，S，Prog Nucleic Acids Res Mol Biol.，73：1-41，2003)，诸如T7 RNAP Y639F突变体酶、T3 RNAP Y640F突变体酶、SP6 RNAP Y631F突变体酶、在639和784位具有改变的氨基酸的T7 RNAP、在640和785位具有改变的氨基酸的T3 RNAP、或在631和779位具有改变的氨基酸的SP6RNAP，也可以用在本发明的方法或测定的有些实施方案中。具体地，这样的突变体酶可以掺入dNTP和2’-F-dNTP，以及ddNTP和某些其它底物，它们对于具有特定性质和用途的RNA分子的合成是有益的。在有些实施方案中，噬菌体N4微-vRNAP是T7-型RNAP，所述噬菌体N4微-vRNAP是N4 vRNAP的有转录活性的1,106个氨基酸的结构域，其与N4 vRNAP的氨基酸998-2103相对应，且具有某些与T7 RNAP共有的结构域(Kazmierczak，K.M.，等人，EMBO J 21：5815-5823，2002；美国专利号7,452,705)。或者，在有些实施方案中，N4微-vRNAP Y678F突变体酶(美国专利号7,452,705)(其可以掺入非规范的核苷酸诸如2’-F-dNTP)是T7-型RNAP。为了进行转录，RNA聚合酶会识别和结合长度为约25个核苷酸的DNA序列(其称作“RNA聚合酶启动子”、“转录启动子”或简称“启动子”)，并从这里开始转录。在大多数情况下，启动子序列是双链的。本文使用的双链启动子的链(其共价连接到用于合成RNA的模板链上)被定义为“有义链”或“有义启动子序列”，且它的互补序列被定义为“反义链”或“反义启动子序列”。
本文使用的术语“缓冲液”或“缓冲剂”是指这样的物质：当加入溶液中时，其造成溶液抵抗pH的变化。本文使用的术语“反应缓冲液”是指在其中进行酶促反应的缓冲溶液。本文使用的术语“储存缓冲液”是指在其中储存酶的缓冲溶液。
本文使用的术语“螯合剂”或“螯合试剂”是指具有超过一个原子的任意物质，所述原子具有可用于键合金属阳离子的孤电子对。本文使用的术语“二价盐”或“二价金属阳离子”是指其中金属(例如，Mg、Mn、Ca或Sr)在溶液中具有净2+电荷的任意盐。
本文使用的术语“互补的”或“互补性”是针对通过碱基配对规则相关联的核苷酸序列而使用的。例如，序列5′-A-G-T-3′与序列3′-T-C-A-5′互补。互补性可以是“部分的”，其中仅一些核酸碱基根据碱基配对规则相匹配。或者，核酸之间可以存在“完全的”或“总的”互补性。核酸链之间的互补性程度对核酸链之间的杂交的效率和强度具有显著影响。这在扩增反应以及依赖于核酸杂交的检测方法中特别重要。
术语“同源性”是指一个核酸序列与另一个核酸序列的互补性程度。可以存在部分的同源性或完全的同源性(即，互补性)。部分互补的序列是这样的序列：其至少部分地抑制完全互补的序列与靶核酸的杂交，且使用功能术语“基本上同源的”来表示。使用在低严格性条件下的杂交测定(DNA或RNA印迹、溶液杂交等)，可以检查完全互补的序列与靶序列的杂交的抑制。在低严格性条件下，基本上同源的序列或探针会竞争并抑制完全同源的序列与靶的结合(即，杂交)。这并不是说，低严格性条件是允许非特异性结合的条件；低严格性条件要求，两个序列彼此的结合是特异性的(即，选择性的)相互作用。使用缺少互补性或仅具有低程度的互补性(例如，小于约30％互补性)的第二种靶，可以测试非特异性结合的缺失。在其中特异性结合较低或不存在的情况下，探针不会与核酸靶杂交。
当针对双链核酸序列(诸如cDNA或基因组克隆)而使用时，术语“基本上同源的”是指，在本文所述的低严格性条件下，可以与双链核酸序列的任一条链或两条链杂交的任意探针。
本文使用的术语“杂交”或“退火”用于指互补核酸链的配对。杂交和杂交的强度(即，核酸链之间缔合的强度)受到本领域熟知的多种因素的影响，包括核酸之间的互补性程度、受到诸如盐浓度等条件影响的涉及的条件的严格性、形成的杂合体的Tm(解链温度)、其它组分的存在(例如，聚乙二醇或甜菜碱的存在或缺失)、杂交链的摩尔浓度和核酸链的G:C含量。
术语“分离的”或“纯化的”当与核酸关联使用时，如在“分离的多核苷酸”或“分离的寡核苷酸”或“纯化的RNA”或“纯化的加帽的RNA”中，是指这样的核酸：其从在它的来源中通常伴随它的至少一种污染物中鉴别和分离出来。因而，分离的或纯化的核酸(例如，DNA和RNA)是以这样的形式存在或存在于这样的环境：其不同于在自然界中发现它的形式或环境，或不同于在对它执行处理或纯化方法之前存在的形式或环境。例如，在宿主细胞染色体上发现给定的DNA序列(例如，基因)与其它基因在一起，且在细胞中发现特定的RNA(例如，编码特定蛋白的特定mRNA)是与许多其它mRNA(它们编码多种蛋白)的混合物。分离的或纯化的多核苷酸或核酸或寡核苷酸或DNA或RNA可以以单链或双链形式存在。当分离的或纯化的多核苷酸或核酸用于表达蛋白时，多核苷酸至少含有有义链或编码链(即，多核苷酸可以是单链的)，但是可以含有有义链和反义链(即，多核苷酸可以是双链的)。
实施例
下面的实施例用于解释本发明的某些优选的实施方案和方面，不应理解为限制其范围。
RNA多磷酸酶的发现和纯化
当我们在SDS-PAGE凝胶中原位复性大肠杆菌蛋白时，发现了RNA多磷酸酶(RPP)。通过在有γ32P-末端-标记的RNA(使用T7 RNA聚合酶、T7反应缓冲液、γ-32P-标记的GTP和未标记的ATP、CTP和UTP，通过线性DNA模板的体外转录来合成)存在下聚丙烯酰胺的聚合，制备SDS-PAGE(15％)电泳凝胶。电泳后，通过在不含有SDS的缓冲液中温育凝胶，交换SDS-PAGE电泳缓冲液，以去除SDS，并允许蛋白原位复性。在缓冲液中温育凝胶过夜，并用SYBR金(Invitrogen，Carlsbad，CA)对凝胶染色。显示出未染色的带，其以接近30,000的分子量迁移。但是，当在7.5％醋酸中固定凝胶、然后干燥并进行放射自显影时，观察到2条缺乏放射性的带，它们以接近30,000(30kDa)和接近19,000(19kDa)的分子量迁移。SYBR金染色指示19-kDa带中RNA的存在，与19-kDa蛋白的32P-末端-标记的RNA的脱磷酸相一致，但是不与其降解相一致。30-kDa带中SYBR金染色的缺失，与该带中的RNA酶蛋白相一致，其可能是RNA酶I。
为了简化酶活性的测定和便利酶的纯化，我们搜索了替代性酶底物。我们发现，产生荧光的磷酸酶底物6，8-二氟-4-甲基伞形酮磷酸酯(DiFMUP)是19-kDa蛋白的底物。在水解后，该底物被转化成荧光产物6，8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素(DiFMU)，其具有在358nm的吸收峰和在455nm的发射峰。令人惊奇地，与使用4-甲基伞形酮磷酸酯(4MUP)作为底物相比，当使用DiFMUP作为底物时，RPP酶显示高50-倍以上的活性。因而，使用标准的紫外***，使用DiFMUP来检测在聚丙烯酰胺凝胶上原位蛋白复性后大肠杆菌总提取物中的单个19-kDa荧光带。该带也被考马斯蓝蛋白染料染色。使用更简单的DiFMUP测定，我们能够按比例放大RNA多磷酸酶蛋白的纯化，并进一步表征它的物理和酶性质。例如，在有些实施方案中，使用一种或多种下述的方法，纯化RNA多磷酸酶活性：聚乙烯亚胺分级分离；硫酸铵分级分离；Bio-Rex 70阳离子交换柱色谱法(例如，Bio-Rex 70色谱法)；凝胶过滤柱色谱法(例如，Sephacryl S100)；和阴离子交换柱色谱法(例如，SP-Sepharose)。在离子交换和凝胶过滤柱中，RNA多磷酸酶活性被色谱分离为单个峰，表明19-kDa蛋白是显示出该活性的唯一酶。
编码RNA多磷酸酶的基因的鉴别
为了鉴别蛋白和测定编码RNA多磷酸酶的基因座，用胰蛋白酶在凝胶中消化RNA多磷酸酶，并使用基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF MS)，分析得到的胰蛋白酶消化物。当使用MASCOT搜索机与NCBI数据库中的蛋白序列相对比时，胰蛋白酶消化的源自RNA多磷酸酶的肽序列与来自大肠杆菌53638的蛋白相匹配。实际上，顶部的12个匹配(蛋白评分为439至229，p＜0.05)是针对来自不同大肠杆菌菌株的数据库中的相同蛋白。来自不同大肠杆菌菌株的12种蛋白的比对表明，它们基本上是相同的。在大肠杆菌K12(MG1655)中，该蛋白(基因座标记b2252)已经被注释为未知功能的铝-可诱导的蛋白。对应的铝-可诱导的(ais)基因作图到50.04min，并编码约200个氨基酸的蛋白。将它归类为非必需基因，在向缺乏无机磷酸盐的确定成分培养基中生长的培养物加入0.2mM ZnSO4后，其mRNA水平被诱导了16倍。关于该基因的蛋白产物的信息不可得到，因为以前没有检测出它。不受理论的约束，对ORF中的保守结构域的搜索，证实该蛋白可以是磷酸甘油酸变位酶-样超家族的成员。该家族的酶的催化活性通常参与组氨酸的磷酸化。
ais基因的克隆和超量表达
我们通过聚合酶链式反应扩增了ais基因(b2252基因座)，其中使用从大肠杆菌K12(MG1655)分离出的基因组DNA，所述分离使用特异性的寡核苷酸引物，其含有NdeI和BamHI限制酶的识别位点。工程改造含有NdeI识别序列的正向引物，以将第一个密码子GTG改成ATG。将扩增的产物克隆进可诱导的基于T7的pET质粒表达载体的对应位点，并在转化感受态大肠杆菌EC100细胞和选择重组体以后，证实***DNA的序列是ais基因的序列。使用前述的原位凝胶测定，通过荧光检测来自重组克隆的蛋白的RNA多磷酸酶活性，并通过考马斯蓝染色，监测诱导后蛋白的超量表达。在这些实验中，使用纯化的天然RNA多磷酸酶作为对照。在凝胶测定中使用更少的来自重组克隆的总蛋白，以便使在未诱导的细胞中存在的内源RNA多磷酸酶的检测最小化。
在从诱导的重组细胞制备的蛋白提取物中，观察到两个荧光和考马斯蓝-染色带。来自诱导的重组细胞的这些带之一是具有RNA多磷酸酶活性的可溶性蛋白，其大小和性质与19-kDa天然RNA多磷酸酶相同。另外，第二种具有RNA多磷酸酶活性的24-kDa蛋白(其主要存在于包含体中)也在诱导的重组细胞中超量表达。通过埃德曼降解，测定纯化的天然酶和重组的24-kDa和19-kDa RNA多磷酸酶的氨基端。天然的和超量表达的重组19-kDa蛋白的氨基端的序列S-N-G-L-P是相同的。24-kDa重组蛋白的氨基端M-L-A-F，与克隆的ais基因的氨基端相对应。天然酶的氨基端序列S-N-G-L-P表明，该蛋白可能被信号肽酶加工，且成熟的酶存在于周质间隙中。为了测定天然酶的亚细胞分布，将大肠杆菌B细胞转化成原生质球，并通过荧光原位凝胶测定，测量释放进上清液中(周质级分)和被原生质球保留(胞质级分)的RNA多磷酸酶活性。检测周质级分中的RNA多磷酸酶，该活性与19-kDa大小的纯化的天然酶一起迁移。胞质级分也含有作为19-kDa蛋白迁移的RNA多磷酸酶活性，但是没有检测到24-kDa RNA多磷酸酶。不受理论的约束，数据表明，重组的19-kDa RNA多磷酸酶是通过加工氨基末端从24-kDa蛋白衍生出的周质蛋白。在非重组细胞的胞质级分中观察到的19-kDa RNA多磷酸酶活性的存在，是由于细胞向原生质球的不完全转化，重组细胞中24-kDa活性蛋白的存在可能是由于在重组细胞的包含体中存在未加工的蛋白。有趣地发现，Zalucki，YM，等人(Nucleic Acids Res.35：5748-5754，2007)将ais基因归类为分泌蛋白，但是预测的切割位点不同于鉴别的氨基端。
纯化的RNA多磷酸酶的催化性质
纯化的RNA多磷酸酶在广范围的pH是有活性的(例如，它在pH 5.0至pH 8.0的范围内具有最佳活性)。令人惊奇地，不同于某些其它的磷酸去除酶，它不需要二价阳离子如Mg2+，且在有EDTA存在下是有活性的。实际上，在有1mM Mg2+阳离子存在下，该酶被抑制。
除了从核酸(诸如初级RNA)或从5′-二磷酸化的RNA(例如，从加帽酶RNA三磷酸酶反应)去除β和γ磷酸以外，纯化的约19-kDa单亚基RNA多磷酸酶可以从多种其它底物去除磷酸基团，所述底物包括核苷-5′-二磷酸和三磷酸(例如，NTP、NDP、dNTP、dNDP)。水解产物是核苷5′单磷酸和无机正磷酸盐。核苷-5′-单磷酸不是底物。与ATP相比，ADP的水解效率是50％。该酶以逐步的方式水解核苷三磷酸，释放无机正磷酸盐，而不是焦磷酸盐。通过薄层色谱法对ATP水解产物的时程分析表明，在出现AMP后首先积累ADP。有趣地，尽管多磷酸是象ATP一样好的RNA多磷酸酶底物，无机焦磷酸盐不能作为底物。对称的二核苷三磷酸G[5′]ppp[5′]G和它的甲基化衍生物m7G[5′]ppp[5′]G非常难以水解(如果可以)，表明该酶是外切多磷酸酶。另外，尽管DiFMUP(在该酶的初期筛选和鉴别中使用的底物是良好底物)、4-甲基-伞形酮磷酸酯和磷酸对硝基苯酯(PNPP)是该酶的差底物，二(对硝基苯基)磷酸酯非常难以水解。不受理论的约束，推测在6和8位的氟可能在使DiFMUP成为该酶的底物中起作用，尽管它具有单个磷酸。5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯和磷酸氨基酸磷酸丝氨酸基本上不被识别为底物。
我们认为，在本领域以前没有描述过可以将在5′末端上具有三磷酸或二磷酸基团的RNA切割成单磷酸、但是不能将加帽的RNA切割成单磷酸的RNA多磷酸酶。该活性可用于本文所述的多种方法中。但是，不受理论的约束，我们不认为RNA多磷酸酶的来源细菌在自然界中使用该酶来达到类似功能。相反，我们认为，RNA多磷酸酶是原核生物的周质酶的发现，表明它的天然功能可能是用于清除它的环境中的必需营养素(例如，磷酸)。因而，即使对于我们的目的而言是便利的，本文所述的方法可能是人工的。尽管如此，由于这些和某些其它的磷酸酶是多功能的，且对广范围的磷酸化的化合物(例如，核苷酸、糖磷酸、磷脂和多磷酸)是有活性的，RNA多磷酸酶在自然界中所起的作用仍然未知。
从样品分离用于5′连接标记的总RNA
在有些实施方案中，从样品分离总RNA(例如，使用MASTERPURETM RNA纯化试剂盒，EPICENTRE，Madison，WI，根据生产商的方案或本领域的另一种合适的方法)。在有些实施方案中，总RNA来自细菌培养物。在有些实施方案中，使用MASTERPURETM RNA纯化试剂盒，从培养的HeLa人细胞分离总RNA。在有些实施方案中，总RNA来自环境来源(例如，如Frias-Lopez，J等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105：3805-3810，2008所述)。在有些实施方案中，总RNA来自含有根瘤菌属或其它固氮共生细菌的豆科植物根瘤。在有些实施方案中，总RNA来自动物或人的被细菌或支原体病原体感染的组织的临床样品。在有些实施方案中，总RNA来自人或动物样品(例如，来自癌症标本或来自相同类型的正常细胞)。
用RNA 5′多磷酸酶处理RNA，以将具有5′多磷酸基团的RNA转化成具有5′单磷酸基团的RNA
在有些实施方案中，在20-微升反应混合物中(所述反应混合物含有在由50mM HEPES/KOH(pH 7.5)、0.1M NaCl、1mM EDTA、0.1％BME和0.01％TRITON X100组成的1X RNA 5′多磷酸酶反应缓冲液中的大肠杆菌RNA 5′多磷酸酶I(RPP I，EPICENTRE))，在37℃温育1微克样品RNA(未处理的，或在用另一种酶预处理之后)30min；将20单位的RPP I用于标准的20-微升反应中，但是在某些实验中使用不同量的酶。在有些实施方案中，使用Zymo Research RNA净化柱(Orange，CA)，纯化RPP I-处理过的和/或TERMINATOR-处理过的样品RNA，并通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。RPP I酶将来自AMPLISCRIBETM T7试剂盒(EPICENTRE)的1.4-Kb 5′-三磷酸化的对照转录物转化成TERMINATOR-敏感的5′-单磷酸化的形式，这是通过琼脂糖凝胶分析所证实的。在相同条件下的对照实验中，TERMINATOR酶没有消化RPP I-处理过的5′-加帽的915个碱基的转录物，这证实了RPP I酶的将5′-多磷酸化的RNA转化成5′-单磷酸化形式、但是不转化5′-加帽的RNA的特异性。
在有些实施方案中，通过苯酚∶氯仿和氯仿萃取和乙醇沉淀，提纯RPP I-处理过的RNA。在某些其它的实施方案中(其中在RPP I处理之前用RMP1处理样品(参见下面的实施例))，通过加入EDTA来抑制RMP1酶活性，并将来自RMP1-处理过的RNA的整个反应混合物加入10微升2倍浓缩的RPP I反应混合物中。
在有些实施方案中，用苯酚∶氯仿(1∶1混合物)萃取用酶处理RNA得到的反应混合物一次，用氯仿萃取一次，并通过乙醇沉淀，从水相回收RNA，并溶于10.0微升10mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM EDTA中。
在有些希望对RNA进行聚腺苷酸化的实施方案中，将来自RPP I反应的整个体积的反应混合物用于聚(A)加尾序反应。
用RNA 5′单磷酸酶处理RNA，将具有5′单磷酸基团的RNA转化成具有5′羟基的RNA
在有些实施方案中(其中样品RNA用于本发明的5′-连接标记的方法中)，将反应缓冲液中的约1至约100分子生物学单位(MBU)(或另一个根据经验确定的最佳量)的RNA 5′单磷酸酶1(RMP1，EPICENTRE)与最多约1微克的样品RNA一起在30℃温育60分钟，所述反应缓冲液由以下成分组成：(i)33mM Tris-醋酸盐pH 7.5、66mM醋酸钾、10mM醋酸镁、5mM氯化钙和0.5mM DTT或(ii)50mM Tris-HCl、pH 8.0、2mM氯化镁、100mM氯化钠和5mM氯化钙。在优选的实施方案中，在用于本发明的方法之前，从样品去除rRNA(例如，18S和26S或28S真核rRNA或16S和23S原核rRNA)。这是因为，申请人已经发现，其它方法(例如，RIBOMINUSTM试剂盒)可以比RMP1更有效地去除在大多数样品中存在的高水平的rRNA(例如，最多约98％的总RNA)。已经发现，如果从样品去除rRNA，可以更容易地使用本发明的5′-连接标记方法和其它更低丰度的5′-单磷酸化的RNA分子(例如，miRNA)的下游分析。
尽管如此，申请人使用包含不同的RNA分子类别的样品，进行了许多实验来研究RMP1的活性和特异性。例如，在某些实验中，与在上述反应缓冲液中的约10-60MBU的RMP1(EPICENTRE)一起温育样品RNA，后者由以下组成：(i)来自HeLa细胞的总RNA，或(ii)人总参照RNA(STRATAGENE)，或(iii)来自AMPLISCRIBETM T7高产量转录试剂盒(EPICENTRE)的1.4-Kb 5′-三磷酸化的对照转录物。在有些实施方案中，然后根据生产商的指导，用TERMINATORTM 5′-磷酸-依赖性的外切核酸酶(EPICENTRE，Madison，WI)处理RMP1-处理过的样品RNA。在分别不含RMP1酶或不含TERMINATORTM酶的相同条件下，温育对照反应物。在某些其它的实施方案中，然后使用Zymo Research RNA净化柱(Orange，CA)，纯化RMP1-和TERMINATOR-处理过的样品RNA，并通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。观察到，每20-微升反应物约10MBU或更多的RMP1会降低TERMINATORTM酶对18S或28S HeLa rRNA的消化，每20-微升反应物20MBU或更多的RMP1显著(但不是完全)降低TERMINATORTM酶对18S或28S HeLa rRNA的消化。在使用STRATAGENE的人参照RNA的类似反应中，每20-微升反应物约10MBU或更多可检测地降低TERMINATORTM酶对人18S或28S rRNA的消化；每20-微升反应物约20MBU的RMP1显著降低TERMINATORTM酶对人18S或28S rRNA的消化；每20-微升反应物约40MBU的RMP1保护人18S或28S rRNA免于TERMINATORTM酶的降解，这比每20-微升反应物20MBU的RMP1的好约2-倍。看起来，RMP1会使5′-单磷酸化的18或28S rRNA脱磷酸，保护它免受TERMINATOR 5′-磷酸-依赖性的外切核酸酶的降解。尽管用RMP1处理后再用RPPI处理RMP1-处理过的1.4-Kb转录物(参见上面)确实导致TERMINATOR酶对1.4-Kb转录物的消化，但用约10MBU的RMP1预处理来自AMPLISCRIBETM T7试剂盒的1.4-Kb 5′-三磷酸化的对照转录物，没有使1.4-Kb转录物对TERMINATOR酶消化敏感；因而，在测试的条件下，RMP1没有将1.4-Kb5′-三磷酸化的转录物转化成TERMINATOR-敏感的5′-单磷酸化形式或TERMINATOR-抗性的5′-羟基化形式，表明各个RMP1和RPP I酶的特异性。在其它反应中，5′-加帽的915个碱基的RNA转录物没有被TERMINATOR酶消化，无论5′-加帽的RNA转录物未经处理，还是首先用RMP1酶处理；如下制备5′-加帽的RNA转录物：使用AMPLISCRIBETM T7-快速转录试剂盒(EPICENTRE)进行体外转录，然后使用SCRIPTGUARDTM加帽酶(EPICENTRE)进行加帽，二者都根据生产商的指导。(在有些实施方案中，用苯酚∶氯仿(1∶1混合物)萃取反应混合物一次，用氯仿萃取一次，并通过乙醇沉淀，从水相回收RNA，并在RMP1和/或TERMINATOR处理后，溶于10微升10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA中。在有些实施方案中，不萃取反应混合物，但是在进行下一步之前(例如，在TERMINATOR或RNA 5′多磷酸酶反应之前)，加入10-20mM EDTA。)
进行其它实验，以分析RMP1、RPP I和其它酶对5′-单磷酸化的RNA(与5′-三磷酸化的RNA相比)的特异性。对于这些实验，通过使用AMPLISCRIBETM T7转录试剂盒(EPICENTRE)和γ-32P-GTP的体外转录，制备γ-32P-标记的51-聚体5′-三磷酸化的RNA；如下制备相同序列的α-32P-标记的51-聚体5′-单磷酸化的RNA：首先用APexTM不耐热的碱性磷酸酶(EPICENTRE)处理用AMPLISCRIBETM T7转录试剂盒制备的未标记的51-聚体RNA，以制备5′-羟基化的51-聚体RNA，然后，使用γ-32P-标记的ATP和T4多核苷酸激酶(EPICENTRE)，标记它的5′-末端。分别与RMP1(EPICENTRE)、RPP I(EPICENTRE)、ApexTM不耐热的碱性磷酸酶、SCRIPT CAPTM加帽酶(EPICENTRE)、烟酸焦磷酸酶(TAP，EPICENTRE)和TERMINATORTM5′-磷酸酶依赖性的外切核酸酶(EPICENTRE)一起，温育各个γ-和α-32P-标记的51-聚体RNA。RMP1(2MBU，约1MBU/pmol)将约0.13pmol的α-32P-单磷酸-标记的51-聚体RNA脱磷酸成5′-羟基化形式，其程度与APexTM碱性磷酸酶相同；另外，在与TERMINATOR外切核酸酶一起温育后，α-32P-单磷酸-标记的51-聚体RNA被消化，没有检测出32P标记的RNA，但是RPP I、TAP或SCRIPT CAPTM加帽酶没有从α-32P-单磷酸-标记的51-聚体RNA去除32P标记。RMP1(2MBU，约1MBU/pmol)和TERMINATOR外切核酸酶都没有从γ-32P-标记的5′-三磷酸化的51-聚体RNA去除32P标记，但是APex碱性磷酸酶、RPP I、TAP和SCRIPT CAPTM加帽酶各自从γ32P-标记的5′-三磷酸化的51-聚体RNA去除了32P标记。
总RNA的聚腺苷酸化
在室温将下述组分依次加入来自前一步的20微升每种反应混合物从而给RNA添加聚腺苷酸尾序：
Figure BPA00001283896700761
10X聚腺苷酸聚合酶Rxn缓冲液：0.5M Tris-HCl(pH 8.0)、2.5MNaCl、10mM DTT和100mM MgCl2。
将反应混合物在37℃温育30min。
在有些实施方案中，用苯酚∶氯仿(1∶1混合物)萃取反应混合物一次，用氯仿萃取一次，并通过乙醇沉淀，从水相回收RNA，并溶于10.0微升由Tris-HCl(pH 8.0)和1mM EDTA组成的1O mM TE溶液中。
具有2’-O-甲基化的3′-末端核苷酸的RNA的聚腺苷酸化
在3′-端核苷酸上具有2’-O-甲基基团的RNA分子(2’OMe-RNA)(例如，植物miRNA、种系-特异性的piwiRNA、内源的siRNA)，难以或根本不会被大肠杆菌或糖酵母属聚腺苷酸聚合酶聚腺苷酸化。
但是，申请人发现，在没有加入ATP的情况下，通过T4 RNA连接酶1或T4 RNA连接酶2将在2’OMe-RNA的3′-末端的1个或两个AMP残基(用作连接受体)连接到腺苷酸化的-5′-AMP(A5′pp5′A)(用作连接供体)上后，具有1个或两个AMP残基的2’OMe-RNA会被聚腺苷酸聚合酶(EPICENTRE)聚腺苷酸化。另外，在2’OMe-RNA或相同序列的缺少2’OMe基团的RNA(用作连接受体)上长时间温育(例如，≥4小时)2000-倍摩尔过量的A5′pp5′A，导致接近15-20个核苷酸的聚腺苷酸尾序的添加，这是由于多个AMP核苷酸被先后连接到每个单个RNA分子的3′-末端上。从这两种方法得到的聚腺苷酸化的2’OMe-RNA分子是通过逆转录合成cDNA的模板，其中使用互补的寡(dT)或寡(dU)引物或包含寡(dT)或寡(dU)的锚定引物，包括这样的引物：其也显示具有标记的5′-部分(例如，包含测序标记结构域，例如，Roche 454A或454B测序标记结构域，或由其组成，例如，用于产生测序模板，后者用于使用Roche454测序平台或其它下一代或更老的测序平台的测序)。
如前所述，用聚腺苷酸聚合酶给A-延伸的2’OMe-RNA定量地添加尾序，但是不给在3′-末端没有额外的A核苷酸的22-核苷酸RNA添加。然后可以根据生产商(EPICENTRE)的方案，在ATP-依赖性的T4 RNA连接酶1-介导的标准连接反应中，在5′-末端5′-连接标记该添加聚腺苷酸尾序的分子。
因而，在某些实验中，与在10-微升反应物中的0.5微摩尔2’OMe-RNA受体(从IDT得到)一起在22℃温育纯化的A5′pp5′A(1mM)(作为连接供体)各种时间，所述2’OMe-RNA受体已经被鉴别为拟南芥miRNA(miR173[2’OMe])，其显示下述序列：rUrUrCrGrCrUrUrGrCrArGrArGrArGrArArArUrCrAmC(SEQ ID NO：3)，所述反应物含有25mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM MgCl2、50mM NaCl、10mM DTT、20％DMSO、20单位的ScriptGuardTM RNA酶抑制剂、0.5微升APexTM不耐热的碱性磷酸酶(包括它是为了使从A5′pp5′A供体和2’OMe-RNA受体之间的连接反应释放出的5′-AMP脱磷酸)和不同量的T4RNA连接酶1或T4 RNA连接酶2的不同制品(所有酶都来自EPICENTRE)。在16％尿素-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并用SYBR金染色后，分析来自每个反应的2.5-微升等分试样。
T4 RNA连接酶1和T4 RNA连接酶2都把AMP残基连接到2’OMe-RNA上，但是在这些实验中，T4 RNA连接酶2更有效地把供体连接到2’OMe-RNA上，特别是如果腺苷酸化的连接酶分子的百分比较低时。在温育1至约4小时后，T4 RNA连接酶2(5微摩尔)将一个或多个AMP残基添加到约50％至约80％的2′OMe-RNA分子上。温育12小时后，超过约90％的2′OMe-RNA分子具有一个或多个连接到它们的3′末端上的AMP残基。将温育时间延长至大于12小时和/或使用更高浓度的任一种RNA连接酶(例如，＞5至约50微摩尔)，会提高连接效率。
在某些实验中，通过使用MMLV逆转录酶的逆转录，将得到的5′-连接标记的且加聚腺苷酸尾序的RNA转化成cDNA，并通过PCR进行扩增(例如，通过向40微升反应物中加入10-微升连接反应混合物，以提供第一链cDNA合成的模板，所述反应物含有各500微摩尔的dATP、dCTP、dGTP、dTTP、0.5微摩尔锚定寡(dT)接头引物：(CTATAGGCGCGCCACCGGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN)(SEQ ID NO：4)，和40单位的MMLV逆转录酶(EPICENTRE)，所述扩增在37℃进行10min，然后，通过在85℃温育10min来灭活酶，并通过用1微升的RNA酶混合物(EPICENTRE)在55℃消化5分钟，去除RNA)。
通过在100-微升反应混合物中的PCR，扩增第一链cDNA合成混合物的1微升50-倍稀释液，所述反应混合物含有1X MasterAmpTM PCRPreMix E(EPICENTRE)、20pmol的正向PCR引物(AATGCGGCCGCGCCTCCCTCGCGCCATCAG(SEQ ID NO：5))、20pmol的反向PCR引物(TATAGGTGCCGGCGCGCCACCGGTG(SEQ ID NO：6))、和1微升的FailSafeTMPCR酶混合物(EPICENTRE)，循环是，在94℃30秒、在60℃10秒和在72℃10秒。在15和18个周期后，在8％聚丙烯酰胺凝胶上分析5微升PCR反应物，并通过SYBR金染色显影。
然后用Not I和Asc I限制酶消化PCR产物，并连接进pCDC1-KTM克隆预备载体(EPICENTRE)，后者用于转化TransforMaxTM EC 100TM细胞(EPICENTRE)。对来自21个随机挑选的转化体菌落的质粒测序，并证实与预期的miR173序列相对应。
烟酸焦磷酸酶反应
在有些实施方案中，省略了RPP I反应步骤或RMP1和RPP I反应步骤两者，并替换为烟酸焦磷酸酶(TAP)反应步骤。例如，在有些实施方案中，在37℃，以10微升的体积与在50mM醋酸钠(pH 6.0)、1mMEDTA、0.1％β-巯基乙醇和0.01％Triton X100中的10单位的烟酸焦磷酸酶(EPICENTRE)一起温育1微克没有用碱性磷酸酶处理过的总RNA30min。在没有TAP酶的相同缓冲液中，温育对照反应物。
5′连接标记具有5′单磷酸基团的RNA的反应
用RPP I或TAP处理每个样品(在添加聚(A)尾序反应步骤之前或之后，或有或没有添加聚(A)尾序反应步骤)，所述样品含有希望通过5′-连接标记进行标记的5′-单磷酸化的RNA，然后进行5′连接标记反应。在室温将下述组分依次加入来自前一步骤的反应混合物：
  组分   体积(微升)
  水   4
  10X RLRT缓冲液   2
  200毫摩尔磷酸钠   1
  50微摩尔RNA受体   1
  2mM rATP   1
  T4 RNA连接酶(5U/微升)   1
10X RLRT缓冲液：500mM Tris-HCl、pH 8.3、750mM KCl和30mMMgCl2。
RNA受体寡核苷酸的实例序列：
rGrArGrCrGrGrCrCrGrCrCrUrGrCrArGrGrArArA(SEQ ID NO：7)
将反应混合物在37℃温育30min，导致5′-单磷酸化的RNA的5′连接标记。
第一链cDNA合成反应
在5′连接标记反应后，将每个5′-连接标记的RNA样品用作合成第一链cDNA的模板。如果需要，第一链cDNA合成引物在它的5′-部分具有标记，该部分不与用作第一链cDNA合成的模板的5′-连接标记的RNA的3′-末端互补；在有些实施方案中，在第一链cDNA合成引物的5′-部分中的标记包含测序标记结构域或由其组成。通过将下述组分加入来自以前的5′连接标记反应的反应混合物，完成第一链cDNA合成：
  组分   体积(微升)
  水   14
  10X RLRT缓冲液   2
  各10mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP   2
  第一链cDNA合成引物(2微摩尔)   1
  MMLV逆转录酶(40U/微升)   1
第一链cDNA合成引物的实例序列：
TAGACTTAGAAATTAATACGACTCACTATAGGCGCGCCACCGGTGd(T)18(SEQ ID NO：8)
将反应混合物在37℃温育30min，导致5′和3′-标记的第一链cDNA的合成。
合成第一链cDNA后RNA的去除
在第一链cDNA合成反应后，用RNA酶I和RNA酶H消化在RNA:cDNA杂交体中的RNA和未使用的RNA受体寡核苷酸，仅得到第一链cDNA。这通过将1微升RNA酶混合物(含有0.5单位的RNA酶I和0.5单位的HYBRIDASETM热稳定的RNA酶H，EPICENTRE)加入第一链cDNA合成反应混合物然后在55℃温育5min来实现。
第二链cDNA合成
将如上所述合成的第一链cDNA用作合成第二链cDNA的模板：
Figure BPA00001283896700801
第二链cDNA合成引物的实例序列：
TCATACACATACGATTTAGGTGACACTATAGAGCGGCCGCCTG CAGGAAA(SEQ ID NO：9)
将反应混合物在72℃温育10min，导致双链cDNA的合成，所述双链cDNA在每条cDNA链的两个末端上具有标记。
然后，用苯酚∶氯仿(1∶1混合物)萃取反应混合物一次，用氯仿萃取一次，并加入100微升DNA片段2X沉淀溶液(EPICENTRE)，在冰上冷却10min。通过离心回收DNA，并用70％乙醇洗涤沉淀物一次，再溶于25微升10mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM EDTA中。
PCR扩增
在某些其它的实施方案中，通过加入与上面关于第二链cDNA合成所述相同的组分，通过PCR扩增第一链cDNA(例如，用于克隆)，例外是，除了第二链cDNA合成引物(用作PCR引物1)以外，还加入1微升下述引物(PCR引物2)到PCR反应物中，代替1微升水，以扩增标记的第一链cDNA：
PCR引物2的实例序列：
5′TAGACTTAGAAATTAATACGACTCACTATAGGCGCGCCACCG(SEQ ID NO：10)
在下述温度循环PCR反应混合物：
步骤I：95℃/30秒
步骤II：(94℃/30秒，60℃/30秒，72℃/4min)，15个循环
然后，用苯酚∶氯仿(1∶1混合物)萃取反应混合物一次，用氯仿萃取一次，并加入100微升DNA片段2X沉淀溶液(EPICENTRE)，在冰上冷却10min。通过离心回收DNA，并用70％乙醇洗涤沉淀物一次，再溶于25微升10mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM EDTA中。
RNA合成反应
在有些实施方案中，将双链cDNA或PCR-扩增的cDNA用作RNA体外转录的模板。例如，上述实施例中的第二链cDNA合成引物显示SP6RNA聚合酶启动子的序列。含有该启动子的双链cDNA是合成有义RNA的模板。根据与试剂盒一起提供的方案，可以进行RNA合成反应(例如，使用AMPLISCRIBETM SP6转录试剂盒，EPICENTRE)。在其它实施方案中，在5′部分中显示RNA聚合酶启动子序列的第一链cDNA合成引物，可以用于第一链cDNA合成反应。例如，在上述实施例中的第一链cDNA合成引物(其显示T7 RNA聚合酶启动子序列)或在TARGETAMPTMRNA扩增试剂盒中提供的寡(dT)T7启动子引物，可以用于合成具有聚(A)尾序的RNA的第一链cDNA。然后，根据与每个试剂盒一起提供的方案，在合成双链cDNA或PCR-扩增的cDNA后，在得到的双链cDNA中的启动子可以用作合成反义RNA的模板(例如，使用AMPLISCRIBETMT7转录试剂盒，EPICENTRE)或TARGETAMPTM RNA扩增试剂盒中的体外转录试剂。在有些实施方案中，在体外转录过程中或之后，标记RNA，并用作微阵列分析的靶。
5′-连接-标记的RNA的5′末端的分析
在某些其它的实施方案中，通过PCR，扩增标记的第一链cDNA的3′末端(与对应的5′-连接标记的RNA的5′末端相对应)。聚合酶链式反应(PCR)使用PCR引物1和不同靶-特异性的引物。为此目的，将寡核苷酸引物(其与添加到第一链cDNA的3′末端上的标记的序列互补)(PCR引物1)和靶特异性的引物(作为第二种PCR引物，其与第一链cDNA的已知序列互补，与希望分析的每种不同的RNA的编码区的5′末端相对应)用于下图所示的PCR：
Figure BPA00001283896700821
使用5′-和3′-标记的第一链cDNA作为测序模板
在某些其它的实施方案中，在第一链cDNA合成反应期间，将包含测序标记结构域或由其组成的5′和/或3′标记导入5′-和/或3′-标记的第一链cDNA(如上所述)：(i)通过使用第一链合成引物，其在它的5′-部分显示第一种测序标记结构域，将该第一种测序标记结构域掺入第一链cDNA的3′-末端；和/或(ii)通过使用RNA受体寡核苷酸，其包含第二种测序标记结构域或由其组成，将该第二种测序标记结构域拷贝进第一链cDNA的3′-末端(例如，其中所述测序标记结构域显示用于各个测序平台的测序接头序列，例如，用于Roche 454、Illumina Solexa、Intelligent Biosystems或其它测序平台)。在这些实施方案中，5′-和/或3′-标记的第一链cDNA分子用作测序模板。在有些实施方案中，5′-和/或3′-标记的第一链cDNA分子被转化成双链双标记的cDNA(一般如上所述)，且双标记的双链cDNA分子用作测序模板。
总结：
使用上述的方法，可以从未加帽的初级RNA分子制备标记的RNA和第一链或双链cDNA，所述方法用于从初级RNA分子(使用RNA多磷酸酶)或从初级RNA和加帽的RNA(使用TAP或脱帽酶)合成5′-单磷酸化的RNA、使RNA聚腺苷酸化、5′连接标记5′-单磷酸化的RNA(通过使用RNA连接酶连接到RNA受体寡核苷酸上)、合成第一链cDNA(使用RNA-依赖性的DNA聚合酶(逆转录酶)和与添加的聚(A)尾序退火的第一链cDNA合成引物)、去除RNA(使用RNA酶I和RNA酶H)和合成第二链cDNA(并由此合成双链cDNA)(使用DNA聚合酶和与第一链cDNA的部分序列退火的第二链cDNA合成引物，所述部分序列与添加到RNA分子的5′末端上的5′连接标记互补)。如果需要，可以将如上合成的双链cDNA分子克隆进质粒或其它载体，用于制备与样品中的全长初级RNA分子相对应的cDNA文库。因而，所述5′连接标记方法能够从转录物捕获生物学上相关的cDNA，所述转录物不具有5′-帽，因此不会通过本领域以前已知的寡核苷酸-加帽cDNA合成方法捕获。
在本申请中提及的所有出版物和专利都通过引用并入本文。本领域技术人员会明白所述的本发明的方法和组合物的不同修改和变动，而不脱离本发明的范围和精神。尽管已经结合特定的优选实施方案描述了本发明，应当理解，要求保护的发明不应当不适当地限于这些特定的实施方案。实际上，相关领域的技术人员显而易见的用于实现本发明的描述的方式的不同修改，应当在下述权利要求书的范围内。

Claims (22)

1.5′连接标记样品中具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA的方法，所述方法包含下述步骤：
(A)提供：
(i)样品，其含有具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA，包括其中所述样品另外含有具有5′单磷酸基团的RNA和/或加帽的RNA和/或具有5′羟基的RNA；
(ii)RNA 5′多磷酸酶；
(iii)显示标记的受体寡核苷酸；和
(iv)RNA连接酶；
(B)使所述样品接触RNA 5′多磷酸酶，接触的条件和时间足以使得其中具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA被转化成具有5′单磷酸基团的RNA；和
(C)使来自步骤(B)的样品接触受体寡核苷酸和RNA连接酶，接触的条件和时间足以使得其中受体寡核苷酸的3′末端被连接到具有5′单磷酸基团的RNA上，但是不连接到加帽的RNA上，并且生成5′-连接标记的RNA。
2.权利要求1的方法，其中，在步骤(A)中提供的样品另外含有具有5′单磷酸基团的RNA，但是所述受体寡核苷酸仅连接到在步骤(B)中从具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA转化得到的具有5′单磷酸基团的RNA上，且不连接到在步骤(A)中提供的样品中已经存在的具有5′单磷酸基团的RNA上，其中所述方法另外包含下述子步骤：提供RNA 5′单磷酸酶；且在步骤(B)之前，使所述样品接触RNA 5′单磷酸酶，接触的条件和时间足以使得其中样品中具有5′单磷酸基团的RNA被转化成具有5′羟基的RNA；和灭活或去除RNA 5′单磷酸酶。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述方法另外包含5′连接标记样品中加帽的RNA，其中所述方法另外包含下述子步骤：提供核酸焦磷酸酶或脱帽酶；和，在步骤(C)之前，使来自步骤(B)的样品接触核酸焦磷酸酶或脱帽酶，接触的条件和时间足以使得其中样品中加帽的RNA被转化成具有5′单磷酸基团的RNA，由此在步骤(A)中提供的样品中包含的加帽的RNA也在步骤(C)中被5′-连接标记。
4.5′连接标记样品中加帽的RNA的方法，所述方法包含下述步骤：
(A)提供：
(i)样品，其含有加帽的RNA，并任选地含有具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA，和/或具有5′单磷酸基团的RNA；和/或具有5′羟基的RNA，
(ii)RNA 5′多磷酸酶；
(iii)RNA 5′单磷酸酶；
(iv)核酸焦磷酸酶或脱帽酶；
(v)受体寡核苷酸；和
(vi)RNA连接酶；
(B)使所述样品接触RNA 5′多磷酸酶，接触的条件和时间足以使得其中具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA被转化成具有5′单磷酸基团的RNA；
(C)使来自步骤(B)的样品接触RNA 5′单磷酸酶，接触的条件和时间足以使得其中具有5′单磷酸基团的RNA被转化成具有5′羟基的RNA；
(D)灭活或去除RNA 5′单磷酸酶；
(E)使步骤(D)之后的样品接触核酸焦磷酸酶或脱帽酶，接触的条件和时间足以使得其中样品中加帽的RNA被转化成具有5′单磷酸基团的RNA；
(F)使来自步骤(E)的样品接触受体寡核苷酸和RNA连接酶，接触的条件和时间足以使得其中受体寡核苷酸的3′末端被连接到步骤(E)中生成的具有5′单磷酸基团的RNA的5′末端上，但是未连接到在步骤(B)中从具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA转化得到的具有5′单磷酸基团的RNA上或在步骤(A)中提供的样品中已经存在的具有5′单磷酸基团的RNA上，并且从加帽的RNA生成5′-连接标记的RNA。
5.5′连接标记具有5′多磷酸基团的加帽的RNA和/或未加帽的RNA的方法，所述方法包含下述步骤：
(A)提供：
(i)样品，其含有具有5′多磷酸基团的加帽的RNA和/或未加帽的RNA；
(ii)核酸焦磷酸酶；
(iii)受体寡核苷酸；和
(iv)RNA连接酶；
(B)使尚未接触过碱性磷酸酶的样品接触核酸焦磷酸酶，接触的条件和时间足以使得其中具有5′多磷酸基团的加帽的RNA和未加帽的RNA被转化成具有5′单磷酸基团的RNA；
(C)使来自步骤(B)的样品接触受体寡核苷酸和RNA连接酶，接触的条件和时间足以使得其中受体寡核苷酸的3′末端被连接到具有5′单磷酸基团的RNA的5′末端上，生成5′-连接标记的RNA。
6.权利要求5的方法，其中在步骤(A)中提供的样品另外含有具有5′单磷酸基团的RNA，但是所述受体寡核苷酸仅连接到在步骤(B)中从具有5′多磷酸基团的加帽的RNA和/或未加帽的RNA转化得到的具有5′单磷酸基团的RNA上，且未连接到在步骤(A)中提供的样品中已经存在的具有5′单磷酸基团的RNA上，其中所述方法另外包含下述子步骤：提供RNA 5′单磷酸酶；且在步骤(B)之前，使所述样品接触RNA 5′单磷酸酶，接触的条件和时间足以使得其中样品中具有5′单磷酸基团的RNA被转化成具有5′羟基的RNA；和灭活或去除RNA 5′单磷酸酶。
7.5′连接标记样品中具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA、而不5′连接标记样品中具有5′单磷酸基团的RNA的方法，所述方法包含下述步骤：
(A)提供：
(i)样品，其含有具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA和具有5′单磷酸基团的RNA；
(ii)加帽酶；
(iii)RNA 5′单磷酸酶或碱性磷酸酶；
(iv)核酸焦磷酸酶或脱帽酶；
(v)受体寡核苷酸；和
(vi)RNA连接酶；
(B)使所述样品接触加帽酶，接触的条件和时间足以使得其中具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA被转化成加帽的RNA；
(C)使来自步骤(B)的样品接触RNA 5′单磷酸酶或碱性磷酸酶，接触的条件和时间足以使得其中具有5′单磷酸基团的RNA被转化成具有5′羟基的RNA；
(D)灭活或去除在步骤(C)中使用的RNA 5′单磷酸酶或碱性磷酸酶；
(E)使步骤(D)之后的样品接触核酸焦磷酸酶或脱帽酶，接触的条件和时间足以使得其中加帽的RNA被转化成具有5′单磷酸基团的RNA；
(F)使来自步骤(E)的样品接触受体寡核苷酸和RNA连接酶，接触的条件和时间足以使得其中受体寡核苷酸的3′末端被连接到具有5′单磷酸基团的RNA的5′末端上，生成5′-连接标记的RNA。
8.权利要求7的方法，其中在步骤(A)中提供的样品另外含有加帽的RNA，且其中从在步骤(A)的样品中提供的加帽的RNA和从在步骤(B)中加帽的、样品中的具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA，生成5′-连接标记的RNA。
9.5′连接标记样品中加帽的RNA和具有5′单磷酸基团的RNA、而不5′连接标记样品中具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA的方法，所述方法包含下述步骤：
(A)提供：
(i)样品，其至少含有加帽的RNA、具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA和具有5′单磷酸基团的RNA；
(ii)脱帽酶；
(iii)受体寡核苷酸；和
(iv)RNA连接酶；
(B)使所述样品接触脱帽酶，接触的条件和时间足以使得其中加帽的RNA被转化成具有5′单磷酸基团的RNA；和
(C)使来自步骤(B)的样品接触受体寡核苷酸和RNA连接酶，接触的条件和时间足以使得其中受体寡核苷酸的3′末端被连接到具有5′单磷酸基团的RNA的5′末端上，生成5′-连接标记的RNA。
10.5′连接标记样品中加帽的RNA、而不5′连接标记具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA或具有5′单磷酸基团的RNA的方法，所述方法包含下述步骤：
(A)提供：
(i)样品，其含有加帽的RNA、具有5′多磷酸基团的未加帽的RNA、具有5′单磷酸基团的RNA和/或具有5′羟基的RNA；
(ii)RNA 5′单磷酸酶或碱性磷酸酶；
(iii)脱帽酶；
(iv)受体寡核苷酸；和
(v)RNA连接酶；
(B)使所述样品接触RNA 5′单磷酸酶或碱性磷酸酶，接触的条件和时间足以使得其中各个酶是有活性的，且它催化的反应可以完成；
(C)灭活或去除在步骤(B)中使用的RNA 5′单磷酸酶或碱性磷酸酶；
(D)使来自步骤(C)的样品接触脱帽酶，接触的条件和时间足以使得其中加帽的RNA被转化成具有5′单磷酸基团的RNA；和
(E)使来自步骤(D)的样品接触受体寡核苷酸和RNA连接酶，接触的条件和时间足以使得其中受体寡核苷酸的3′末端被连接到在步骤(D)中从加帽的RNA生成的具有5′单磷酸基团的RNA的5′末端上，生成5′-连接标记的RNA。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述方法另外包含下述步骤：提供聚(A)聚合酶和ATP；并且使样品接触聚(A)聚合酶和ATP，接触的条件和时间足以使得其中聚(A)尾序被添加到样品中的RNA分子的3′-末端上，生成具有聚(A)尾序的RNA。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述样品包含第一种样品，其含有源自第一种类型或第一种条件或第一种环境的细胞的RNA，且其中所述方法另外包含：从由第一种样品生成的5′-连接标记的RNA中扣除在源自第二种类型或第二种条件或第二种环境的细胞的第二种样品中也存在的那些RNA分子，从而产生源自仅在第一种样品中存在、但是在第二种样品中缺乏的RNA的5′-连接标记的RNA分子群体，所述方法包含下述步骤：
(i)提供从第一种样品产生的5′-连接标记的RNA，和第二种样品，其含有源自第二种类型或第二种条件或第二种环境的细胞的RNA；
(ii)通过第二种样品中的RNA的逆转录，制备第一链cDNA；
(iii)使从第一种样品产生的5′-连接标记的RNA与从来自第二种样品的RNA制备的第一链cDNA退火，退火的条件和时间足以使得其中在从第一种样品产生的5′-连接标记的RNA和从来自第二种样品的RNA制备的第一链cDNA之间形成杂交复合体；和
(iv)用RNA酶H处理杂交复合体，处理的条件和时间足以使得其中与cDNA退火的RNA被消化，并生产经扣除的5′-连接标记的RNA，其由源自仅在第一种样品中存在、但是在第二种样品中缺乏的RNA的5′-连接标记的RNA组成。
13.权利要求12的方法，其中在步骤(A)中提供的用于从第一种样品中的RNA生成5′-连接标记的RNA的受体寡核苷酸含有亲和分子，且所述方法另外包含下述步骤：提供固体表面，能结合亲和分子的亲和结合物质附着在所述固体表面上；和，在步骤(iv)之前或之后，使从第一种样品产生的5′-连接标记的RNA接触固体表面，接触的条件和时间足以使得其中来自第一种样品的5′-连接标记的RNA结合到亲和结合物质所附着的固体表面上，且源自第一种样品中的RNA的5′-连接标记的RNA被捕获到固体表面上。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述方法另外包含从5′-连接标记的RNA合成第一链cDNA，其中所述方法另外包含下述步骤：提供RNA-依赖性的DNA聚合酶；和使5′-连接标记的RNA接触RNA-依赖性的DNA聚合酶，接触的条件和时间足以使得其中合成与5′-连接标记的RNA互补的第一链cDNA；包括其中所述方法另外包含：提供与5′-连接标记的RNA互补的第一链cDNA合成引物，和使5′-连接标记的RNA接触第一链cDNA合成引物和RNA-依赖性的DNA聚合酶，接触的条件和时间足以使得其中合成与5′-连接标记的RNA互补的cDNA；诸如其中所述第一链cDNA合成引物包含这样的序列，即其中至少它的3′末端显示选自下述的序列：与同聚序列互补的序列，所述同聚序列在转录后在体内中细胞或在体外添加到样品中RNA的3′末端上或5′-连接标记的RNA的3′末端上；与一个或多个RNA分子的3′末端处的已知序列互补的序列；与一个或多个RNA分子的一个或多个内部区域互补的序列；所有可能的序列的集合，其中每个序列是随机的；与聚(A)尾序互补的序列，其选自寡(dT)n序列、寡(dU)n序列、寡(U)n序列、寡(dT)nX锚定的序列、寡(dU)nX锚定的序列、和寡(U)nX锚定的序列；和与寡核苷酸标记互补的序列，所述寡核苷酸标记添加到样品中RNA的3′末端或5′-连接标记的RNA的3′末端；和/或其中所述第一链cDNA合成引物另外显示特异性5′序列，它位于所述引物的3′末端显示的序列的5′，其中所述特异性5′序列能用作合成第二链cDNA的模板，该第二链cDNA显示特异性3′序列，该特异性3′序列与所述特异性5′序列互补并提供用于第二链cDNA的特异性引发的位点。
15.权利要求14的方法，其中所述方法另外包含下述步骤：提供RNA酶H和RNA酶I；和使含有第一链cDNA的样品接触RNA酶H和RNA酶I，接触的条件和时间足以使得其中所述RNA被消化。
16.权利要求14至15中任一项的方法，其中所述方法另外包含下述步骤：提供DNA-依赖性的DNA聚合酶；和使第一链cDNA接触DNA-依赖性的DNA聚合酶，接触的条件和时间足以使得其中合成双链cDNA；包括其中所述方法另外包含下述步骤：提供第二链cDNA合成引物和DNA-依赖性的DNA聚合酶，所述引物与第一链cDNA的一部分互补，所述部分与在步骤(A)中提供的受体寡核苷酸互补；和使第二链cDNA合成引物和DNA-依赖性的DNA聚合酶接触第一链cDNA，接触的条件和时间足以使得其中合成双链cDNA；其中所述DNA-依赖性的DNA聚合酶与为第一链cDNA的合成所提供的RNA-依赖性的DNA聚合酶相同；或其中所述DNA-依赖性的DNA聚合酶不同于为第一链cDNA的合成所提供的RNA-依赖性的DNA聚合酶。
17.权利要求19的方法，其中受体寡核苷酸的5′部分、第一链cDNA合成引物的5′-部分或第二链cDNA合成引物的5′-部分显示双链RNA聚合酶启动子的一条链的序列，且所述方法另外包含下述步骤：提供：可以使用双链RNA聚合酶启动子合成RNA的RNA聚合酶、第一链cDNA合成引物，或第二链cDNA合成引物，所述启动子一条链的序列显示在受体寡核苷酸中；和使双链cDNA接触RNA聚合酶，接触的条件和时间足以使得其中合成RNA。
18.权利要求1-17中任一项的方法，其中受体寡核苷酸、第一链cDNA引物或第二链cDNA引物含有亲和分子或连接到亲和分子上，且所述方法另外包含下述步骤：提供固体表面，其共价地或非共价地包被有能特异性地结合亲和分子的亲和结合物质；和，在涉及亲和分子的步骤之前或之后，接触化学连接到亲和分子上的受体寡核苷酸、第一链cDNA引物或第二链cDNA引物，接触的条件和时间足以使得其中亲和分子结合于连接到固体表面上的亲和结合物质。
19.权利要求18的方法，其中合成的各个5′-连接标记的RNA、第一链cDNA或第二链cDNA含有亲和分子，且所述含有亲和分子的5′-连接标记的RNA、第一链cDNA或第二链cDNA通过它与固体表面的结合被捕获、分离或纯化，所述方法包含下述步骤：在存在促进含有亲和分子的5′-连接标记的RNA、第一链cDNA或第二链cDNA与附着在固体表面上的亲和结合物质的结合的试剂和条件下，使含有亲和分子的5′-连接标记的RNA、第一链cDNA或第二链cDNA接触固体表面，其中所述含有亲和分子的5′-连接标记的RNA、第一链cDNA或第二链cDNA被结合到表面上，由此捕获、分离或纯化含有亲和分子的5′-连接标记的RNA、第一链cDNA或第二链cDNA；包括其中所述亲和分子是生物素，且所述亲和结合物质是亲和素或链霉亲和素，或其中所述亲和分子是洋地黄毒苷，且所述亲和结合物质是特异性地结合洋地黄毒苷的抗体。
20.用于执行权利要求1-26中任一项的方法的试剂盒，其中所述试剂盒包含RNA 5′多磷酸酶(RPP)和至少一种选自下述的其它组分：RNA5′单磷酸酶(RMP)；碱性磷酸酶(AP)；核酸焦磷酸酶；脱帽酶；加帽酶；连接酶；RNA受体寡核苷酸；聚(A)聚合酶；聚(U)聚合酶；RNA-依赖性的DNA聚合酶(RT)；第一链cDNA合成引物；RNA酶H；第二链cDNA合成引物；RNA聚合酶(RNAP)；5′核糖核酸外切酶(Xrn)；多核苷酸激酶(PNK)；和具有5′三磷酸或二磷酸基团的RNA分子，其中所述基团的β或γ磷酸被标记；或其中所述试剂盒包含RNA 5′单磷酸酶(RMP)和至少一种选自下述的其它组分：RNA 5′多磷酸酶；碱性磷酸酶、虾碱性磷酸酶或北极碱性磷酸酶；核酸焦磷酸酶；脱帽酶；加帽酶；RNA连接酶；RNA受体寡核苷酸；聚(A)聚合酶；RNA-依赖性的DNA聚合酶(RT)；第一链cDNA合成引物；RNA酶H；第二链cDNA合成引物；RNA聚合酶(RNAP)；5′核糖核酸外切酶；多核苷酸激酶(PNK)；具有5′三磷酸或二磷酸基团的RNA分子，其中所述基团的β或γ磷酸被标记；包括其中所述RPP选自铝-可诱导的RPP、大肠杆菌RPP I和志贺氏菌属RPP I；和，如果包含在试剂盒中，所述至少一种其它组分选自：所述RMP是RNA 5′单磷酸酶1(RMP1)；所述AP选自APEXTM碱性磷酸酶、虾碱性磷酸酶和北极碱性磷酸酶；所述核酸焦磷酸酶是烟酸焦磷酸酶(TAP)；所述脱帽酶选自酵母脱帽酶、哺乳动物脱帽酶、拟南芥脱帽酶、痘病毒脱帽酶和痘苗病毒脱帽酶；所述加帽酶选自痘病毒加帽酶、啤酒糖酵母加帽酶和SCRIPTCAPTM加帽酶；所述RNA连接酶选自T4 RNA连接酶和噬菌体TS2126 RNA连接酶；所述聚(A)聚合酶选自大肠杆菌聚(A)聚合酶和啤酒糖酵母聚(A)聚合酶；所述RT选自SUPERSCRIPTTM RT、AMV RT和MMLV RT；所述RNA酶H选自大肠杆菌RNA酶H和HYBRIDASETMRNA酶H；所述RNAP选自T7-型RNAP、T7 RNAP、T3 RNAP和SP6RNAP；所述5′核糖核酸外切酶选自TERMINATORTM 5′-磷酸-依赖性的外切核酸酶和啤酒糖酵母Xrn I核糖核酸外切酶(Xrn I)；或所述PNK是T4 PNK。
21.向样品中的2’OMe-RNA分子的3′-末端添加聚(A)尾序的方法，其中所述2’-OMe基团是在它们的3′-端核苷酸上，其中所述方法包含：(a)使样品与腺苷酸化的单核苷酸(A5′pp5′X)和T4 RNA连接酶一起温育，温育的条件和时间足以使得其中至少一个单核苷酸-5′-磷酸残基(5′-XMP)被连接到2’OMe-RNA分子的3′-末端；然后，(b)使来自步骤(a)的样品接触聚(A)聚合酶和ATP，接触的条件和时间足以使得其中聚(A)尾序被添加到2’OMe RNA分子的3′末端上，所述分子具有至少一个连接到它们的3′-末端的单核苷酸-5′-磷酸残基(5′-XMP)。
22.向样品中感兴趣的RNA分子的3′-末端添加同聚多核苷酸尾序的方法，其中所述方法包含：将样品与摩尔过量的腺苷酸化的5′-单核苷酸(A5′pp5′X)和T4 RNA连接酶一起温育，温育的条件和时间足以使得其中作为从腺苷酸化的5′-单核苷酸连接供体(A5′pp5′X)多次连续连接转移5′-单核苷酸(5′-XMP)残基的结果，同聚核苷酸尾序(聚(X)尾序)被添加到感兴趣的RNA分子的3′-末端。
CN2009801253796A 2008-05-02 2009-05-04 Rna的选择性的5′连接标记 Pending CN102076851A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US5004608P 2008-05-02 2008-05-02
US61/050046 2008-05-02
PCT/US2009/042723 WO2009135212A2 (en) 2008-05-02 2009-05-04 Selective 5' ligation tagging of rna

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102076851A true CN102076851A (zh) 2011-05-25

Family

ID=41255899

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2009801253796A Pending CN102076851A (zh) 2008-05-02 2009-05-04 Rna的选择性的5′连接标记

Country Status (7)

Country Link
US (3) US8163491B2 (zh)
EP (1) EP2283132B1 (zh)
JP (1) JP5774474B2 (zh)
CN (1) CN102076851A (zh)
AU (1) AU2009242484B2 (zh)
CA (1) CA2723265C (zh)
WO (1) WO2009135212A2 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014048185A1 (zh) * 2012-09-29 2014-04-03 深圳华大基因科技服务有限公司 从rna样本富集转录本的方法及其用途
CN111944864A (zh) * 2020-08-20 2020-11-17 深圳市瑞吉生物科技有限公司 一种新型Cap2结构5′帽子类似物及其制备方法
CN112626177A (zh) * 2019-10-09 2021-04-09 华中科技大学 一种快速定量检测rna加帽效率的方法

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5774474B2 (ja) 2008-05-02 2015-09-09 エピセンター テクノロジーズ コーポレーションＥｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｒｎａへの選択的な５’ライゲーションによるタグの付加
WO2009135214A2 (en) * 2008-05-02 2009-11-05 Epicentre Technologies Corporation Rna polyphosphatase compositions, kits, and uses thereof
KR102091207B1 (ko) 2009-02-13 2020-03-20 엑스-켐, 인크. Ｄｎａ―코딩된 라이브러리의 생성 및 스크리닝 방법
US8486666B2 (en) * 2010-09-29 2013-07-16 New England Biolabs, Inc. Removal of the guanine cap on the 5′ terminus of RNA
DK2665833T3 (en) 2011-01-17 2017-07-24 Life Technologies Corp WORKING PROCEDURE FOR DETECTING LIGANDS USING NUCLEIC ACIDS
CN103748236B (zh) 2011-04-15 2018-12-25 约翰·霍普金斯大学 安全测序***
EA032438B1 (ru) * 2011-09-07 2019-05-31 Икс-Чем, Инк. Способы мечения днк-кодированных библиотек
WO2013063308A1 (en) * 2011-10-25 2013-05-02 University Of Massachusetts An enzymatic method to enrich for capped rna, kits for performing same, and compositions derived therefrom
CN108300765B (zh) * 2012-03-13 2022-01-11 斯威夫特生物科学公司 用于通过核酸聚合酶对衬底多核苷酸进行大小受控的同聚物加尾的方法和组合物
EP2684954A1 (en) 2012-07-10 2014-01-15 Lexogen GmbH 5´ protection dependent amplification
NZ739931A (en) 2012-07-13 2019-08-30 X Chem Inc Dna-encoded libraries having encoding oligonucleotide linkages not readable by polymerases
PL2912468T3 (pl) 2012-10-29 2019-04-30 Univ Johns Hopkins Test papanicolaou pod kątem raka jajnika i endometrium
EP3626866B1 (en) * 2013-08-19 2021-03-24 Abbott Molecular Inc. Next-generation sequencing libraries
WO2015126823A1 (en) * 2014-02-18 2015-08-27 Board Of Regents, The University Of Texas System A method for single cell sequencing of mirnas and other cellular rnas
US11286531B2 (en) 2015-08-11 2022-03-29 The Johns Hopkins University Assaying ovarian cyst fluid
KR20200115450A (ko) 2017-08-07 2020-10-07 더 존스 홉킨스 유니버시티 암을 평가하고 치료하기 위한 방법 및 재료
CN112322700B (zh) * 2019-08-05 2022-11-22 武汉华大医学检验所有限公司 短rna片段文库的构建方法、试剂盒及应用
AU2021281234A1 (en) * 2020-05-26 2023-01-05 Simplseq, Inc. Isolation and immobilization of nucleic acids and uses thereof
CA3199080A1 (en) * 2020-10-26 2022-05-05 Eclipse Bioinnovations, Inc. Methods and kits for enriching for polynucleotides
CN112813120A (zh) * 2020-12-31 2021-05-18 华南理工大学 一种使用dna聚合酶突变株高效合成5’标记rna的方法
KR20240026181A (ko) * 2021-06-30 2024-02-27 쿄와 기린 가부시키가이샤 폴리뉴클레오티드 및 의약 조성물
WO2023023584A2 (en) 2021-08-19 2023-02-23 Eclipse Bioinnovations, Inc. Methods for detecting rna binding protein complexes
WO2023129973A2 (en) * 2021-12-30 2023-07-06 Eclipse Bioinnovations, Inc. Methods for detecting rna modification targets on a gene

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3337748B2 (ja) * 1992-09-25 2002-10-21 財団法人神奈川科学技術アカデミー 完全長ｃＤＮＡの合成方法、その中間体の製造方法及び完全長ｃＤＮＡを含む組換えベクターの製造方法
US5514224A (en) 1993-11-05 1996-05-07 Magnequench International, Inc. High remanence hot pressed magnets
DE4406524A1 (de) * 1994-02-28 1995-08-31 Boehringer Mannheim Gmbh 3'-RNA-Markierung mit Terminaler Transferase
US5849546A (en) 1996-09-13 1998-12-15 Epicentre Technologies Corporation Methods for using mutant RNA polymerases with reduced discrimination between non-canonical and canonical nucleoside triphosphates
WO2001004286A1 (fr) 1999-07-08 2001-01-18 Helix Research Institute PROCEDE DE CREATION D'UNE BANQUE D'ADNc PLEINE LONGUEUR
US6429300B1 (en) * 1999-07-27 2002-08-06 Phylos, Inc. Peptide acceptor ligation methods
US7452705B2 (en) 2001-05-22 2008-11-18 The University Of Chicago N4 virion single-stranded DNA dependent RNA polymerase
US8137911B2 (en) 2001-05-22 2012-03-20 Cellscript, Inc. Preparation and use of single-stranded transcription substrates for synthesis of transcription products corresponding to target sequences
US20040029129A1 (en) * 2001-10-25 2004-02-12 Liangsu Wang Identification of essential genes in microorganisms
US20040058330A1 (en) * 2002-09-20 2004-03-25 Prokaria, Ltd. Methods of use for thermostable RNA ligases
EP1546313B1 (en) 2002-09-20 2008-04-02 Prokaria ehf. Thermostable rna ligase from thermus phage
US20050130201A1 (en) * 2003-10-14 2005-06-16 Dharmacon, Inc. Splint-assisted enzymatic synthesis of polyribounucleotides
WO2006084201A2 (en) * 2005-02-04 2006-08-10 Genosensor Corporation Method of isolating, labeling and profiling small rna and whole-genome transcripts
DK2620510T4 (da) 2005-06-15 2020-03-30 Complete Genomics Inc Enkeltmolekyle-arrays til genetisk og kemisk analyse
JP5180845B2 (ja) 2006-02-24 2013-04-10 カリダ・ジェノミックス・インコーポレイテッド Ｄｎａアレイ上でのハイスループットゲノム配列決定
SG10201405158QA (en) 2006-02-24 2014-10-30 Callida Genomics Inc High throughput genome sequencing on dna arrays
JP2009072062A (ja) * 2006-04-07 2009-04-09 Institute Of Physical & Chemical Research 核酸の５’末端を単離するための方法およびその適用
US7910302B2 (en) 2006-10-27 2011-03-22 Complete Genomics, Inc. Efficient arrays of amplified polynucleotides
US20080108804A1 (en) * 2006-11-02 2008-05-08 Kabushiki Kaisha Dnaform Method for modifying RNAS and preparing DNAS from RNAS
WO2008070375A2 (en) 2006-11-09 2008-06-12 Complete Genomics, Inc. Selection of dna adaptor orientation
WO2009006438A2 (en) * 2007-06-29 2009-01-08 Epicentre Technologies Corporation Copy dna and sense rna
WO2009026148A1 (en) 2007-08-17 2009-02-26 Epicentre Technologies Corporation Selective 5' ligation tagging of rna
JP5774474B2 (ja) 2008-05-02 2015-09-09 エピセンター テクノロジーズ コーポレーションＥｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｒｎａへの選択的な５’ライゲーションによるタグの付加
WO2009135214A2 (en) 2008-05-02 2009-11-05 Epicentre Technologies Corporation Rna polyphosphatase compositions, kits, and uses thereof

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014048185A1 (zh) * 2012-09-29 2014-04-03 深圳华大基因科技服务有限公司 从rna样本富集转录本的方法及其用途
CN112626177A (zh) * 2019-10-09 2021-04-09 华中科技大学 一种快速定量检测rna加帽效率的方法
CN111944864A (zh) * 2020-08-20 2020-11-17 深圳市瑞吉生物科技有限公司 一种新型Cap2结构5′帽子类似物及其制备方法
CN111944864B (zh) * 2020-08-20 2021-06-22 深圳市瑞吉生物科技有限公司 一种Cap2结构5＇帽子类似物及其制备方法
WO2022036858A1 (zh) * 2020-08-20 2022-02-24 深圳市瑞吉生物科技有限公司 一种新型Cap2结构5'帽子类似物及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
US8309335B2 (en) 2012-11-13
AU2009242484A1 (en) 2009-11-05
WO2009135212A3 (en) 2009-12-23
US20130029326A1 (en) 2013-01-31
EP2283132A2 (en) 2011-02-16
JP5774474B2 (ja) 2015-09-09
JP2011521625A (ja) 2011-07-28
US8163491B2 (en) 2012-04-24
EP2283132B1 (en) 2016-10-26
CA2723265A1 (en) 2009-11-05
EP2283132A4 (en) 2013-02-20
US9963735B2 (en) 2018-05-08
US20120156753A1 (en) 2012-06-21
AU2009242484B2 (en) 2012-08-16
WO2009135212A2 (en) 2009-11-05
US20100159526A1 (en) 2010-06-24
CA2723265C (en) 2015-11-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102076851A (zh) Rna的选择性的5′连接标记
US9957549B2 (en) Compositions and methods for negative selection of non-desired nucleic acid sequences
JP5794572B2 (ja) 核酸を修飾するためのトランスポゾン末端組成物及び方法
US8039214B2 (en) Synthesis of tagged nucleic acids
JP7282692B2 (ja) ガイド核酸の作製および使用
CN102268428A (zh) 使用编码双链启动子一条链的引物的方法
JP2016511007A (ja) 鎖になったｒｎａまたはｄｎａのライブラリを生成するための方法、組成物およびキット
AU2009242486B2 (en) RNA polyphosphatase compositions, kits, and uses thereof
EP3015554A1 (en) Gene expression analysis
WO2023137292A1 (en) Methods and compositions for transcriptome analysis

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20110525