CN112813120A

CN112813120A - 一种使用dna聚合酶突变株高效合成5’标记rna的方法

Info

Publication number: CN112813120A
Application number: CN202011640837.4A
Authority: CN
Inventors: 陈庭坚; 何传平; 邹金容; 张汝洁; 彭乐丽; 王光远; 吴静
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2020-12-31
Filing date: 2020-12-31
Publication date: 2021-05-18

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种使用DNA聚合酶突变株高效合成5’标记RNA的方法。该方法包括：将含目标序列的单链DNA、聚合酶缓冲溶液、5’末端带修饰的DNA寡核苷酸链的引物混合均匀，升温进行去空间结构处理再降温退火，得到混合体系1；往混合体系1中加入核糖核苷酸，SFM4‑3聚合酶，混合均匀，得到转录体系，孵育，纯化分离RNA，得到目标序列的5’标记RNA。本发明提供的方法，利用定向改造获取的热稳定DNA聚合酶在合成RNA的时候直接实现对所有RNA产物5’末端的荧光素或生物素等标记，并且在实现标记的同时仍然保持RNA分子的活性与功能。

Description

一种使用DNA聚合酶突变株高效合成5’标记RNA的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种使用DNA聚合酶突变株高效合成5’标记RNA的方法。

背景技术

在核酸分子的研究和应用中，单链RNA末端标记是一项很重要的技术。单链RNA末端标记是将标记物(如荧光素、生物素等)通过一定的方式连接到RNA的5’末端或者RNA的3’末端，通过检查标记物，进而实现对RNA鉴别、检测，或对功能核酸(如RNA适配体)进行亲和力测定和应用开发。

单链RNA末端标记主要分为化学标记和酶法标记。化学标记难度大，成本高，而酶法标记比化学标记简单方便。单链RNA的5’末端标记和3’末端标记的方法各不相同。单链RNA的3’末端标记技术主要通过TdT法和T4 RNA连接酶法在RNA 3’末端增加一个修饰的核苷酸或者带修饰的小核酸片段。单链RNA的5’末端标记技术比较复杂，一般是先利用T4多聚核苷酸激酶对RNA的5’末端进行磷酸化，然后在T4 RNA连接酶的作用下，与一条通过化学修饰的寡核苷酸链连接。由于T4 RNA连接酶将带修饰的DNA片段连接到磷酸化的RNA 5’或3’末端的反应效率都较低，难以保证所有目标RNA分子的完全标记，单链RNA5’末端标记又一直没有很好的技术，因此使用该方法进行RNA的5’末端标记仍然比较困难。

RNA适配体是指在没有互补链存在的情况下，自身经过卷曲和折叠，形成特定的三级结构，并对靶标分子具有高亲和力和高特异性的单链RNA分子。RNA适配体文库经指数富集的配体***进化技术(Systematic Evolution of Ligands by ExponentialEnrichment,SELEX)筛选后，需要通过亲和力表征确定是否成功筛选到RNA适配体，而RNA的末端标记是测定RNA适配体亲和力的重要技术工具。RNA适配体的末端标记要符合以下要求：1)不破坏适配体的结构；2)不影响适配体对靶标的亲和力；3)标记物灵敏度高。已报道的RNA适配体亲和力测定都是采用放射性标记，此方法具有一定的危险性，需要专门的实验条件和资源，无法普及。单链RNA的5’末端标记技术又难以满足需求，因此RNA适配体末端标记还没有简便、安全、高效的方法。

SFM4-3聚合酶是以Taq DNA聚合酶的催化结构域SF片段为进化起点，通过使用噬菌体展示***经定向进化后具有转录活性的DNA聚合酶。经过改造的SFM4-3聚合酶能识别2’-F/2’-OMe修饰的核糖核苷酸，并且可以直接转录合成天然的RNA以及带修饰的非天然RNA链。与T7 RNA聚合酶转录RNA不同，SFM4-3聚合酶转录RNA时不需要启动子，而是以单链DNA为模板，从DNA引物的3’末端开始延伸，直到模板的5’末端结束。由于使用SFM4-3聚合酶突变株进行的RNA以及修饰RNA的转录具有这一特点，所以可以方便地通过DNA引物在转录产物的5’端快速地引入各种标记。同时，如果选取适当的DNA引物，5’端的标记以及DNA小片段也不会对RNA转录产物的活性与功能产生太大的影响。

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种使用DNA聚合酶突变株高效合成5’标记RNA的方法。

本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。

本发明提供了一种简便、高效的RNA5’末端加标记的方法。该方法以含目标序列的单链DNA为模板，以5’末端带修饰的DNA寡核苷酸链为引物(由15个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸组成)，通过使用定向改造获取的SFM4-3聚合酶转录合成5’标记的目标RNA或糖环修饰/非天然RNA。

本发明提供的使用DNA聚合酶突变株高效合成5’标记RNA的方法，包括如下步骤：

(1)将含目标序列的单链DNA、聚合酶反应缓冲液、5’末端带修饰的DNA寡核苷酸链的引物混合均匀，得到混合液，然后升温进行去空间结构处理，再降温退火，得到混合体系1；

(2)往步骤(1)所述混合体系1中加入核糖核苷酸、SFM4-3聚合酶，混合均匀，得到转录体系；

(3)将步骤(2)所述转录体系进行孵育处理，得到转录产物，纯化分离RNA，得到目标序列的5’标记RNA。

进一步地，步骤(1)所述聚合酶反应缓冲液包含400-600mM的Tris、400-600mM的MgCl₂、60-70mM的KCl；步骤(1)所述混合液的pH值为8-9。

进一步地，步骤(1)所述5’末端带修饰的DNA寡核苷酸链的引物包括15个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸及修饰部分；所述修饰部分为生物素标记、荧光素标记、放射性标记中的一种以上。

进一步地，在步骤(1)所述混合液中，含目标序列的单链DNA的终浓度为400-600nM，Tris的浓度为40-60mM、MgCl₂的浓度为40-60mM、KCl的浓度为6-7mM，5’末端带修饰的DNA寡核苷酸链的引物的终浓度为400-1200nM。

进一步地，步骤(1)所述去空间结构处理的温度为90-98℃，去空间结构处理的时间为2-5min。

进一步地，步骤(2)所述的天然的核糖核苷酸包括ATP、UTP、GTP、CTP，非天然核糖核苷酸包括糖基2’位修饰的ATP、糖基2’位修饰的UTP、糖基2’位修饰的GTP、糖基2’位修饰的CTP，所述修饰为2’-F、2’-OMe、2’-N₃、2'-Cl、2'-NH₂中的一种以上；在所述转录体系中，使用的ATP、UTP、GTP、CTP无论是天然还是非天然的，ATP、UTP、GTP、CTP这四种核糖核苷酸的浓度相同。

进一步地，步骤(2)所述的SFM4-3聚合酶的序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，在步骤(2)所述转录体系中，核糖核苷酸的终浓度为0.2-0.6mM，SFM4-3聚合酶的终浓度为0.8-1.6μM。

进一步地，步骤(3)所述孵育处理的温度为45-70℃，孵育处理的时间为8-16h。

进一步地，步骤(3)所述纯化分离RNA，包括：

将转录产物经过变性胶分离后，切胶回收5’末端带标记的RNA或糖环修饰/非天然RNA，完成RNA的纯化分离。

所述变性胶的组分包含15％PAGE和8M尿素，所述15％PAGE主要成分包括：40％丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺，1×TBE缓冲液，30wt％的过硫酸铵(APS)和100wt％四甲基乙二胺(TEMED)，所述丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的质量比为29:1。

优选地，本发明提供的使用DNA聚合酶突变株高效合成5’标记RNA或糖环修饰/非天然RNA的方法中，转录体系如表1所示，单链DNA模板和带标记的引物混合后，95℃加热5min，然后冷却至室温，然后将NTPs或含修饰的NTPs混合物或修饰的NTPs混合液、10×聚合酶缓冲液(含500mM Tris，pH 8.5)，500mM MgCl₂，65mMKCl)以及SFM4-3聚合酶加入反应体系，混匀后于50℃，孵育12h。转录产物经变性胶(15％的8M尿素胶)分离后，切胶回收5’末端带标记的RNA、5’末端带标记的糖环修饰RNA或5’末端带标记的非天然RNA。

表1RNA 5’末端加标记的转录体系

本发明转录合成的5’末端带修饰的RNA适配体仍然具有优良的与靶标结合的亲和力。本发明以15个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸为连接臂，将生物素、荧光素等标记到RNA适配体的5’末端，RNA适配体经90℃加热4min后，缓慢冷却至室温。经过热处理后的5’末端带修饰的RNA适配体，连接臂不会影响链间的折叠，仍能折叠成具有生物活性的特定结构。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

本发明提供的方法，利用定向改造获取的热稳定DNA聚合酶在合成RNA或糖修饰/非天然RNA的时候直接实现对所有RNA产物5’末端的荧光素或生物素等标记，并且在实现标记的同时仍然保持RNA分子的活性与功能(以5’末端带修饰的RNA适配体为例)。

附图说明

图1为RNA5’末端标记标签的技术流程图。

图2为实施例1中合成5’末端标记Biotin的RNA的电泳图。

图3为实施例2中测定5’末端标记FAM的靶向人凝血酶的RNA适配体以及2’-F-C,U修饰的RNA适配体的凝血酶结合活性的实验结果图。

图4为用靶向人凝血酶5’末端标记Biotin的RNA适配体检测人凝血酶的夹心ELISA实验原理图。

图5为用靶向人凝血酶5’末端标记Biotin的2’-F-C,U修饰的RNA适配体的检测人凝血酶ELISA实验结果图。

具体实施方式

以下结合附图和实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。

以下实施例采用的SFM4-3聚合酶，序列如SEQ ID NO.1所示。

以下实施例采用的1×聚合酶缓冲溶液中，Tris的浓度为40-60mM、MgCl₂的浓度为40-60mM、KCl的浓度为6-7mM。

实施例1制备5’末端带Biotin标记的RNA

实施例1中采用的模板和引物序列如表2所示。

表2

参照图1所示，制备5’末端带Biotin标记的RNA的方法，包括：

1)1×聚合酶缓冲溶液中加入500nM的引物与500nM的模板，混合物于95℃加热5min后，冷却至室温，得到反应体系。

2)向反应体系加入0.5mM NTPs(NTPs包括ATP、UTP、GTP、CTP，所述ATP、UTP、GTP、CTP的浓度相同，均为0.5mM)和1μM SFM4-3聚合酶，混合均匀得到转录体系，转录体系于50℃孵育12h。

3)转录产物(DNA/RNA杂合体)经含8M尿素的15％PAGE胶分离后，切下5’末端标记上Biotin的RNA链。

4)含有5’末端标记Biotin的RNA适配体的PAGE胶块，经枪头挤压破碎后，加入洗脱缓冲液(0.5M乙酸铵，1mM EDTA(pH 8.0)，0.1％SDS)，经45℃水浴处理1h后，用0.22μm过滤器除去碎胶块，保留上清液。向上清液中加入2倍体积的无水乙醇以及总体积1/10的3M乙酸钠，混合液于-20℃静置1h。静置后的混合液于4℃，12000rpm离心10min，弃上清液。沉淀用预冷的70％的乙醇洗3次后，用DEPC处理水重悬5’末端标记Biotin的RNA链(如图2所示)。图2为实施例1中合成5’末端标记Biotin的RNA的电泳图，其中a是5’末端标记Biotin的RNA适配体；b是5’末端标记Biotin的引物。由图2可知，利用定向改造获取的热稳定DNA聚合酶在合成RNA的时候直接实现对所有RNA产物5’末端的生物素标记。

实施例2制备具有生物活性的5’末端带FAM标记的RNA适配体以及2’-F-C,U修饰的RNA适配体

实施例2中采用的模板和引物序列如表3所示。

表3

2)向反应体系加入0.5mM NTPs(NTPs包括ATP、UTP、GTP、CTP，所述ATP、UTP、GTP、CTP的浓度相同，均为0.5mM)或含修饰的NTPs混合物(含修饰的NTPs包括ATP、GTP、2’-F-CTP、2’-F-UTP，所述ATP、GTP、2’-F-CTP、2’-F-UTP的浓度相同，均为0.5mM)和1μMSFM4-3聚合酶，混合均匀得到转录体系，转录体系于50℃孵育12h。

3)转录产物(DNA/RNA杂合体)经含8M尿素的15％PAGE胶分离后，切下5’末端标记FAM的RNA适配体以及2’-F-C,U修饰的RNA适配体。

4)含有5’末端标记FAM的RNA适配体以及2’-F-C,U修饰的RNA适配体的PAGE胶块，经枪头挤压破碎后，加入洗脱缓冲液(0.5M乙酸铵，1mM EDTA(pH 8.0)，0.1％SDS)，经45℃水浴处理3h后，用0.22μm过滤器除去碎胶块，保留上清液。向上清液中加入2倍体积的无水乙醇以及总体积1/10的3M乙酸钠，混合液于-2℃静置1h。静置后的混合液于4℃，12000rpm离心10min，弃上清液。沉淀用预冷的70％的乙醇洗3次后，用DEPC处理水重悬5’末端标记FAM的RNA适配体。

5)5’末端标记FAM的RNA适配体以及2’-F-C,U修饰的RNA适配体加入折叠缓冲液(150mMNaCl,2mM CaCl₂,20mM HEPES(pH 7.3))后，于90℃处理4min后，迅速置于冰上，冰浴5min。经热变性后的5’末端标记FAM的RNA适配体以及2’-F-C,U修饰的RNA适配体在降温过程中折叠为具有活性的高级结构。

6)将上一步折叠好的5’末端标记FAM的RNA适配体以及2’-F-C,U修饰的RNA适配体与人的凝血酶于37℃，孵育15min，5’末端标记FAM的RNA适配体以及2’-F-C,U修饰的RNA适配体靶向人凝血酶(如图3所示)。图3为实施例2中测定5’末端标记FAM的靶向人凝血酶的RNA适配体以及2’-F-C,U修饰的RNA适配体的凝血酶结合活性的实验结果图，其中，a和d是5’末端标记FAM的引物；b是靶向人凝血酶的5’末端标记FAM的2’-F-C,U修饰的RNA适配体(2’-F-C,U-RNA)；c是该5’末端FAM标记的2’-F-C,U修饰的RNA适配体与人凝血酶结合的复合物；e是靶向人凝血酶的5’末端标记FAM的RNA适配体；f是该5’末端FAM标记的RNA适配体与人凝血酶结合的复合物。由图3可知，利用定向改造获取的热稳定DNA聚合酶在合成RNA适配体或者2’-F-C，U修饰的RNA适配体的时候直接实现对所有RNA适配体产物5’末端的荧光素标记，并且靶向人凝血酶5’末端标记FAM的RNA适配体和2’-F-C，U修饰的RNA适配体仍然保持活性与功能。

实施例3制备具有生物活性的5’末端带Biotin标记的2’-F-C,U修饰的RNA适配体的方法

实施例3中采用的模板和引物序列如表4所示。

表4

1)1×聚合酶缓冲溶液中加入500nM的引物与500nM的模板。混合物于95℃加热5min后，冷却至室温，得到反应体系。

2)向反应体系加入0.5mM的含修饰的NTPs混合物(含修饰的NTPs包括ATP、GTP、2’-F-CTP、2’-F-UTP，所述ATP、GTP、2’-F-CTP、2’-F-UTP的浓度相同，均为0.5mM)和1μM SFM4-3聚合酶，混合均匀得到转录体系，转录体系于50℃孵育12h。

3)转录产物(DNA/RNA杂合体)经含8M尿素的15％PAGE胶分离后，切下5’末端标记Biotin的RNA适配体。

4)含有5’末端标记Biotin的2’-F-C,U修饰的RNA适配体的PAGE胶块，经枪头挤压破碎后，加入洗脱缓冲液(0.5M乙酸铵，1mM EDTA(pH 8.0)，0.1％SDS)，经45℃水浴处理3h后，用0.22μm过滤器除去碎胶块，保留上清液。向上清液中加入2倍体积的无水乙醇以及总体积1/10的3M乙酸钠，混合液于-20℃静置1h。静置后的混合液于4℃，12000rpm离心10min，弃上清液。沉淀用预冷的70％的乙醇洗3次后，用DEPC处理水重悬5’末端标记Biotin的RNA适配体。

5)将5’末端标记Biotin的2’-F-C,U修饰的RNA适配体加入折叠缓冲液(150mMNaCl,2mM CaCl₂,20mM HEPES(pH 7.3))后，于90℃处理4min后，迅速置于冰上，冰浴5min。经热变性后的5’末端标记Biotin的2’-F-C,U修饰的RNA适配体在降温过程中折叠为具有活性的高级结构。

6)用靶向人凝血酶5’末端标记Biotin的RNA适配体检测人凝血酶的夹心ELISA实验原理如图4所示，具体操作是：将上一步折叠好的5’末端标记Biotin的2’-F-C,U修饰的RNA适配体加入用人凝血酶铺板并用牛血清蛋白(BSA)封闭、洗涤好的96孔板中，37℃，孵育15min。

7)用折叠缓冲液洗3次孔后，加入1:1000稀释后的辣根过氧化物标记链霉亲和素，室温静置1h。

8)用折叠缓冲液洗6次孔后，加入邻苯二胺盐酸盐(OPD)显色液后，室温静置15-20min显色。

9)读取490nm处的吸光值，对照(不加适配体)读数为：0.075，0.091，0.087；靶向人凝血酶的5’末端标记Biotin的RNA适配体读数为：1.72，1.407，1.651。计算每组的平均值以及标准差后，绘制误差柱状图(如图5所示)。图5为用靶向人凝血酶5’末端标记Biotin的2’-F-C,U修饰的RNA适配体的检测人凝血酶ELISA实验结果图。图5的纵坐标为吸光度490nm，图5的横坐标为对照(不加适配体)和添加适配体。如图5所示，利用定向改造获取的热稳定DNA聚合酶在合成2’-F-C，U修饰的RNA适配体的时候直接实现对所有RNA适配体产物5’末端的生物素标记，并且靶向人凝血酶5’末端标记Biotin的2’-F-C，U修饰的RNA适配体仍然保持活性与功能。

以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 一种使用DNA聚合酶突变株高效合成5’标记RNA的方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1652

<212> DNA

<213> 水生嗜热菌(Thermusaquaticus)

<400> 1

atggcccagc cggccagccc caaggccctg gaggaggccc cctggccccc gccggaaggg 60

gccttcgtgg gctttgtgct ttcccgcaag gagcccatgt gggccgatct tctggccctg 120

gccgccgcca gggggggtcg ggtccaccgg gcccccgagc cttataaagc cctcagggac 180

ctgaaggagg cgcgggggct tctcgccaaa gacctgagcg ttctggccct gagggaaggc 240

cttggcctcc cgcccggcga cgaccccatg ctcctcgcct acctcctgga cccttccaac 300

accacccccg agggggtagc ccggcgctat ggcggggagt ggacggagga ggcgggggag 360

cgggccgccc tttccgagag gctcttcgcc aacctgtggg ggaggcttga gggggaggag 420

aggctccttt ggctttaccg ggaggtggag aggccccttt ccgctgtcct ggcccacatg 480

gaggccacgg gggtgcgcct ggacgtggcc tatctcaggg ccttgtccct ggaggtggcc 540

gaggagatcg cccgcctcga ggccgaggtc ttccgcctgg ccggccaccc cttcaacctc 600

aactcccggg accagctgga aagggtcctc tttgacgagc tagggcttcc cgccatcggc 660

aagacggaga agaccggcaa gcgctccacc agcgccgccg ccctggaggc cctccgcgag 720

gcccacccca tcgtggagaa gatcctgcag taccgggagc tcaccaagct gaagagcacc 780

tatattgacc ccttgccgga cctcatccac cccaggacgg gccgcctcca cacccgcttc 840

aaccagacgg ccacggccac gggcaggcta agtagctccg atcccaacct ccagagcatc 900

cccgtccgca ccccgcttgg gcagaggatc cgccgggcct tcatcgccga ggaggggtgg 960

ctattggtgg ccctggacta tagccaggaa gggctcaggg tgctggccca cctctccggc 1020

gacgagaacc tgatccgggt cttccaggag gggcgggaca tccacacgga gaccgccagc 1080

tggatgttcg gcgtcccccg ggaggccgtg aaccccctga tgcgccgggc ggccaagacc 1140

atcaacttcg gggtcctcta cggcatgtcg gcccaccgcc tctcccagaa gctagccatc 1200

ccttacgagg aggcccaggc cttcattgag cgctactttc agagcttccc caaggtgcgg 1260

gcctggattg agaagaccct ggaggagggc aggaggcggg ggtacgtgga gaccctcttc 1320

ggccgccgcc gctacgtgcc agacctagag gcccgggtga agagcgtgcg gcaggcggcc 1380

gagcgcaggg ccttcaacat gcccgtccag ggcaccgccg ccgacctcat gaagctggct 1440

atggtgaagc tcttccccag gctggaggaa atgggggcca ggatgctcct tcaggtccac 1500

gacgagctgg tcctcgaggc cccaaaagag agggcggagg ccgtggcacg gctggccaag 1560

gaggtcatgg agggggtgta tcccctggcc gtgcccctgg aggtggaggt ggggataggg 1620

gaggactggc tctccgccaa ggaggcggcc gc 1652

<210> 2

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 2

caccaaacgg ggggccagac cctgcagcca aaaaaaaaaa aaaaagttgt gtccctatag 60

tgagc 65

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 3

tttttttttt ttttt 15

<210> 4

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 4

gggtaagtac ttcagctttg ttcccaaaaa aaaaaaaaaa gttgtgtccc tatagtgagc 60

<210> 5

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 5

tttttttttt ttttt 15

<210> 6

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 6

gggtaagtac ttcagctttg ttcccaaaaa aaaaaaaaaa gttgtgtccc tatagtgagc 60

<210> 7

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 7

tttttttttt ttttt 15

Claims

1.一种使用DNA聚合酶突变株高效合成5’标记RNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将含目标序列的单链DNA、聚合酶反应缓冲液、5’末端带修饰的DNA寡核苷酸链的引物混合均匀，得到混合液，然后升温进行去空间结构处理，冷却至室温，得到混合体系1；

(2)往步骤(1)所述混合体系1中加入核糖核苷酸，SFM4-3聚合酶，混合均匀，得到转录体系；

2.根据权利要求1所述的使用DNA聚合酶突变株高效合成5’标记RNA的方法，其特征在于，步骤(1)所述聚合酶反应缓冲液包含400-600mM的Tris、400-600mM的MgCl₂、60-70mM的KCl；所述混合液的pH值为8.0-9.0。

3.根据权利要求1所述的使用DNA聚合酶突变株高效合成5’标记RNA的方法，其特征在于，步骤(1)所述5’末端带修饰的DNA寡核苷酸链的引物包括15个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸及修饰部分；所述修饰部分为生物素标记、荧光素标记、放射性标记中的一种以上；在步骤(1)所述混合液中，含目标序列的单链DNA的终浓度为400-600nM，Tris的浓度为40-60mM、MgCl₂的浓度为40-60mM、KCl的浓度为6-7mM，5’末端带修饰的DNA寡核苷酸链的引物的终浓度为400-1200nM。

4.根据权利要求1所述的使用DNA聚合酶突变株高效合成5’标记RNA的方法，其特征在于，步骤(1)所述去空间结构处理的温度为90-98℃，去空间结构处理的时间为2-5min。

5.根据权利要求1所述的使用DNA聚合酶突变株高效合成5’标记RNA的方法，其特征在于，步骤(2)所述核糖核苷酸包括天然的核糖核苷酸和非天然核糖核苷酸中的一种以上；所述天然的核糖核苷酸包括ATP、UTP、GTP、CTP；非天然核糖核苷酸包括糖基2’位修饰的ATP、糖基2’位修饰的UTP、糖基2’位修饰的GTP、糖基2’位修饰的CTP；所述修饰为2’-F、2’-OMe、2’-N₃、2'-Cl、2'-NH₂中的一种以上。

6.根据权利要求5所述的使用DNA聚合酶突变株高效合成5’标记RNA的方法，其特征在于，当使用的核糖核苷酸为天然的核糖核苷酸时，在所述转录体系中，ATP、UTP、GTP、CTP的浓度相同；当使用的核糖核苷酸为非天然的核糖核苷酸时，糖基2’位修饰的ATP、糖基2’位修饰的UTP、糖基2’位修饰的GTP、糖基2’位修饰的CTP的浓度相同。

7.根据权利要求1所述的使用DNA聚合酶突变株高效合成5’标记RNA的方法，其特征在于，步骤(2)所述的SFM4-3聚合酶的序列如SEQ ID NO.1所示；在步骤(2)所述转录体系中，核糖核苷酸的终浓度为0.2-0.6mM，SFM4-3聚合酶的终浓度为0.8-1.6μM。

8.根据权利要求1所述的使用DNA聚合酶突变株高效合成5’标记RNA的方法，其特征在于，步骤(3)所述孵育处理的温度为45-70℃，孵育处理的时间为8-16h。

9.根据权利要求1所述的使用DNA聚合酶突变株高效合成5’标记RNA的方法，其特征在于，步骤(3)所述纯化分离RNA，包括：

将转录产物经过变性胶分离后，切胶回收5’末端带标记的RNA，完成RNA的纯化分离。

10.根据权利要求1所述的使用DNA聚合酶突变株高效合成5’标记RNA的方法，其特征在于，步骤(3)所述5’标记RNA为RNA适配体。