CN102070725B - 一种硫酸半乳聚糖及其制备方法和应用 - Google Patents
一种硫酸半乳聚糖及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种硫酸半乳聚糖,其分子量为8.5×104;硫酸基团的质量百分含量为25~27%;化学结构是由重复单元A、重复单元B、重复单元C和重复单元D无规组成,其中:重复单元A的摩尔百分含量为10~13%,重复单元B的摩尔百分含量为6~7%,重复单元C的摩尔百分含量为63~65%,重复单元D的摩尔百分含量为17~19%,四种重复单元的摩尔百分含量的总和为98~100%。所述的硫酸半乳聚糖是首先通过水提取蜈蚣藻,然后将提取液进行醇沉、冻干和分离纯化操作制备而得。本发明的硫酸半乳聚糖可应用于制备抗血管生成和/或抗肿瘤药物,特别是可应用于制备抗S-180肉瘤和肝癌药物。
Description
技术领域
本发明涉及一种硫酸半乳聚糖及其制备方法和应用,具体说,是涉及一种从蜈蚣藻的多糖提取物中分离出的一种均一的硫酸半乳聚糖及其制备方法和应用,属于天然药物技术领域。
背景技术
海藻中的硫酸化多糖因具有抗氧化、抗病毒、抗凝血和抗肿瘤等多种生物活性,近几年来受到国内外的广泛关注。蜈蚣藻为一种红藻海膜科蜈蚣藻属藻类,蜈蚣藻自古以来就作为一种海洋中药,具有清热解毒和驱虫之功效,并且资源丰富,在我国的青岛、大连等地沿海有着广泛的分布,并被当地人所食用。多糖为蜈蚣藻的主要成分之一,近几年的研究结果表明:其具有较好的抗凝血、抗病毒等生物活性,显示出了其具有开发成药物的潜在价值。虽然中国专利文献ZL 200510023551.0公开了一种长叶蜈蚣藻多糖提取物、其制备方法及其在制备抗血管生成和/或抗肿瘤药物中的用途;及专利号为ZL200610026830.7的专利公开了一种蜈蚣藻多糖提取物在制备抗凝血、抗血栓、抗艾滋病和/或抗肿瘤药物中的用途。但上述专利文献中公开的蜈蚣藻多糖提取物,是一种由多种成分组成的粗多糖,要将蜈蚣藻来源的多糖提取物应用到临床,制造出一种有效、安全、作用机制明确的药物,还需要对其多糖提取物中的有效成分进行分离、结构确认及其药效的进一步深入临床研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种从蜈蚣藻的多糖提取物中分离出的一种均一的硫酸半乳聚糖及其制备方法和应用,为蜈蚣藻多糖提取物能得到广泛应用奠定基础。
为了实现上述发明目的,本发明采用的技术方案如下:
本发明提供的硫酸半乳聚糖,其特征在于:
分子量为8.5×104;硫酸基团的质量百分含量为25~27%;
化学结构是由重复单元A、重复单元B、重复单元C和重复单元D无规组成,其中:重复单元A的摩尔百分含量为10~13%,重复单元B的摩尔百分含量为6~7%,重复单元C的摩尔百分含量为63~65%,重复单元D的摩尔百分含量为17~19%;
重复单元A的化学结构式如下:
重复单元B的化学结构式如下:
重复单元C的化学结构式如下:
重复单元D的化学结构式如下:
上述四种重复单元的摩尔百分含量的总和为98~100%。
本发明所述的硫酸半乳聚糖中还含有摩尔百分含量为0~2%的含丙酮酸基的1,3连接的D-半乳糖。
本发明提供的硫酸半乳聚糖的制备方法,包括如下具体操作步骤:
a)水提取:将新鲜采集的蜈蚣藻用自来水冲洗掉表面盐分后切碎,加入蒸馏水,用冰醋酸调至pH=5~7,在85~95℃提取0.5~1.5小时;残渣按上述过程再提取1次;合并2次的提取液;
b)醇沉:在搅拌下加入上述提取液2~4倍体积的乙醇,静置,离心收集沉淀;
c)冻干:将所得沉淀溶于水,透析24~72小时,然后冷冻干燥;
d)分离纯化:将上述冻干的多糖用pH=7.2、浓度为20mmol/L的磷酸盐缓冲溶液溶解后,用DEAE-Sepharose Fast Flow凝胶色谱柱层析,先以浓度为0.5mol/L的氯化钠溶液及pH=7.2、浓度为20mmol/L的磷酸盐缓冲溶液洗脱2倍柱体积,再用浓度为0.8mol/L的氯化钠溶液及pH=7.2、浓度为20mmol/L的磷酸盐缓冲溶液洗脱,苯酚-硫酸法检测收集,流水透析24~72小时,冷冻干燥;再用蒸馏水溶解,用Sepharose CL-6B柱纯化,以蒸馏水洗脱,硫酸苯酚法检测收集,冷冻干燥,即得本发明所述的硫酸半乳聚糖。
步骤a)中的水提取条件优先推荐为:用冰醋酸调至pH=6,在90℃提取1小时。
步骤b)中的醇沉条件优先推荐为:在搅拌下加入上述提取液3倍体积的体积百分含量为95%的乙醇。
步骤c)中的透析时间优先推荐为48小时。
步骤d)中的流水透析时间优先推荐为48小时。
本发明还提供了所述的硫酸半乳聚糖在制备抗血管生成和/或抗肿瘤药物中的应用,特别是在制备抗S-180肉瘤和肝癌的药物中的应用。
与现有技术相比,本发明的有益效果如下:
本发明首次从蜈蚣藻的多糖提取物中分离纯化得到了一种均一的硫酸半乳聚糖,并对其进行了药效研究,为蜈蚣藻多糖提取物能制备出一种有效、安全、作用机制明确的药物提供了宝贵的途径,使蜈蚣藻多糖提取物能得到广泛应用成为可能。
附图说明
图1是实施例1制得的GFP08样品的高效凝胶排阻色谱图(HPGPC图)。
图2是实施例1制得的GFP08样品的红外图谱。
图3是实施例1制得的GFP08样品经碱修饰处理后的红外图谱。
图4是实施例1制得的GFP08样品的13C-NMR图谱。
图5是人脐静脉内皮细胞HUVEC管腔在不同浓度的GFP08作用下的倒置显微照片,其中:a为空白对照组,b为10mg/L GFP08组,c为50mg/L GFP08组,d为100mg/L GFP08组。
图6是不同浓度的GFP08对人脐静脉内皮细胞HUVEC管腔的抑制作用的数理统计图,图中:**表示与对照组比较p<0.01,***表示与对照组比较p<0.001。
图7是在无诱导组、20%FBS诱导组、阳性药物对照组和药物组下的人脐静脉内皮细胞HUVEC的倒置显微照片,其中:a为无诱导组,b为20%FBS诱导组,c为阳性药物对照组(20%FBS+10μM Suramin组),d为药物组(20%FBS+100mg.L-1GFP08组)。
图8是GFP08对人脐静脉内皮细胞HUVEC迁移抑制作用以OD值进行的数理统计图,图中:FBS1为阳性药物对照组(20%FBS+10μM Suramin组),FBS2为药物组(20%FBS+100mg.L-1GFP08组);*表示与对照组比较p<0.05,**表示与对照组比较p<0.01。
图9是GFP08对人脐静脉内皮细胞HUVEC迁移抑制作用以细胞迁移个数进行的数理统计图,图中:FBS1为阳性药物对照组(20%FBS+10μM Suramin组),FBS2为药物组(20%FBS+100mg.L-1GFP08组);**表示与对照组比较p<0.01,***表示与对照组比较p<0.001。
图10为100mg/L的GFP08对人脐静脉内皮细胞HUVEC的TF蛋白的表达图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整的说明:
实施例1
一、制备硫酸半乳聚糖
将新鲜采集的蜈蚣藻用自来水冲洗掉表面盐分后切碎,加入蒸馏水,用冰醋酸调至pH=6,在90℃提取1小时;残渣按上述过程再提取1次;合并2次的提取液;
在搅拌下加入上述提取液3倍体积的体积百分含量为95%的乙醇,静置,离心收集沉淀;
将所得沉淀溶于水,透析48小时,然后冷冻干燥;
取3g上述冻干的多糖用100mL pH=7.2、浓度为20mmol/L的磷酸盐缓冲溶液溶解,然后用DEAE-Sepharose Fast Flow凝胶色谱柱(2.6cm×60cm)层析,先以浓度为0.5mol/L的氯化钠溶液及pH=7.2、浓度为20mmol/L的磷酸盐缓冲溶液洗脱2倍柱体积,再用浓度为0.8mol/L的氯化钠溶液及pH=7.2、浓度为20mmol/L的磷酸盐缓冲溶液洗脱,苯酚-硫酸法检测收集,流水透析48小时,冷冻干燥得样品500mg;将此500mg样品再用5mL蒸馏水溶解,用Sepharose CL-6B柱(2.6cm×100cm)纯化,以蒸馏水洗脱,硫酸苯酚法检测,收集43~55管(每管5ml),冷冻干燥,即得本发明所述的硫酸半乳聚糖(标记为GFP08)样品250mg。
二、纯度及分子量测定
以HPGPC检测,检测器为示差检测器,色谱柱为Shodex KS-805和KS-804串联,0.2mol/L的氯化钠水溶液洗脱,不同分子量的葡聚糖为标准品,以AgilentGPC软件根据洗脱时间计算出其分子量。
所制得的GFP08样品经HPGPC检测为单一对称峰(见图1所示),表明本发明所述的硫酸半乳聚糖为均一多糖,分子量为8.5×104。
三、结构鉴定
1、糖组成分析
采用还原水解法测定GFP08样品的单糖组成,硫酸钡比浊法测定硫酸基含量,2,4-二硝基苯肼法测定其丙酮酸基含量,D-和L-半乳糖含量使用手性试剂(S)-(+)-异丙醇胺,根据Navarro,D.A.等报道的两步水解还原氨化法测定。测定结果见表1所示。
表1GFP08的糖组成与分子量
注:3,6-脱水半乳糖和6-甲基半乳糖的绝对构型采用13C NMR确定。
由表1可以看出:GFP08为一硫酸半乳聚糖,且D-半乳糖(D-半乳糖+6-甲基-D-半乳糖)与L-半乳糖(L-半乳糖+L-3,6脱水半乳糖)的比例接近1∶1,表明该多糖为琼胶类型结构。
2、甲基化分析
从GFP08DS的甲基化结果(见表2所示)可以看出:GFP08主要由1,3连接的D-半乳糖、2位硫酸化的D-半乳糖和1,4连接的2,3位硫酸化的L半乳糖、3,6脱水L半乳糖、6位硫酸化的L半乳糖组成。
表2GFP08的甲基化分析结果
3、IR分析
GFP08的红外图谱中(见图2所示):有硫酸酯基(1260cm-1)和3,6-脱水半乳糖(935cm-1)的特征吸收峰,842cm-1左右的吸收峰表明该多糖硫酸基取代位置在2位、3位或4位,在820cm-1处有一肩峰说明有6位硫酸基取代;经过碱修饰处理后(见图3所示),820cm-1处的肩峰减弱许多,这表明有6位硫酸基取代在1,4连接的半乳糖上,经碱处理后,6位硫酸基脱去并与3位羟基缩合形成3,6脱水半乳糖。
4、13C NMR分析
GFP08的13C NMR(见图4所示)中异头碳信号峰位置主要为四个:104.4、103.0、102.1、99.2,比99.2更高场处无吸收峰,表明该多糖不含1,4连接的α-L-半乳糖,而3,6脱水α-L-半乳糖(99.2)的存在进一步证实了其结构为琼胶类型;详细归属见表3所示。
表3GFP0813C NMR信号的归属
注:D代表1,3连接的D-半乳糖,D2S代表2位硫酸化的1,3连接的D-半乳糖,DP代表含丙酮酸基的1,3连接的D-半乳糖,D6M代表6位甲基1,3连接的D-半乳糖,L2S3S代表2,3位双硫酸化的1,4连接的L-半乳糖,L6S代表6位硫酸化1,4连接的L-半乳糖,LA代表3,6脱水1,4连接的L-半乳糖。a由于含量低,信号不清楚仅作部分归属。
综上分析可推知:本发明所述的硫酸半乳聚糖是由重复单元A、重复单元B、重复单元C和重复单元D无规组成,其中:重复单元A的摩尔百分含量为10~13%,重复单元B的摩尔百分含量为6~7%,重复单元C的摩尔百分含量为63~65%,重复单元D的摩尔百分含量为17~19%,四种重复单元的摩尔百分含量的总和为98~100%,可能还含有摩尔百分含量为0~2%的含丙酮酸基的1,3连接的D-半乳糖。
实施例2
取生长良好的7~11天的S-180肉瘤瘤种,将瘤液制成1×107/ml细胞悬液,小鼠右腋部皮下接种0.1ml/只。接种24小时后随机分笼,24小时后静脉注射给以不同浓度的GFP08,连续给药12天。阳性药5-FU于肿瘤接种后每两天给药一次。停药后24小时处死动物,称体重、瘤重,计算各组平均瘤重,按下列公式求出肿瘤抑制率并进行t检验。
肿瘤抑制率(%)=(空白对照组平均瘤重-治疗组平均肿瘤)/空白对照组平均肿瘤×100%。
疗效评价标准:肿瘤抑制率<40%为无效;肿瘤抑制率≥40%,并经统计学处理p<0.05为有效。具体数据参见表4所示。
表4GFP08对小鼠S-180肉瘤生长的影响
由表4可见:小鼠于肿瘤接种后连续静脉给予25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg的本发明的硫酸半乳聚糖(GFP08)12天,50mg/kg、100mg/kg组均能显著抑制S-180肉瘤生长,抑瘤率分别为54.7%和68.9%,效果优于中国专利申请200610026830.7中公开的抗肿瘤效果,表明蜈蚣藻多糖经纯化后提高了其抗肿瘤效果。阳性对照药5-FU 25mg/kg于肿瘤接种后每两天静脉给药一次,显著抑制S-180肉瘤生长,抑瘤率为90.5%。
实施例3
96孔板每孔植入Bel7402肝癌细胞液90μl,约6000个细胞,培养24小时。将GFP08样品配制成1.0mg/ml,0.1mg/ml和0.01mg/ml三种不同的浓度,然后每孔加入100μl。每个浓度种三个孔。周围一圈加入200μl培养液,防止边缘效应。加药后培养3天。吸出孔内全部液体,并用PBS洗一遍。(防止样品与MTT反应)然后每孔加入新鲜的MTT溶液20μl(5mg/ml),摇床上振荡5分钟。加样后37℃继续培养4h。每孔加入100μl DMSO,振荡5分钟。用酶标免疫测定仪570nm处测定各孔吸光度。根据下面的公式计算出抑制率,结果见表5所示。
抑制率=(1-OD实验组/OD对照组)×100%
表5GFP08对Bel-7402肝癌细胞生长的影响
浓度(mg/ml) | 1.0 | 0.1 | 0.01 |
抑制率(%) | 98.4 | 70.0 | 20.5 |
由表5可见:1.0mg/ml的GFP08对BEL-7402肝癌细胞生长具有显著抑制作用,抑制率达到98.4%。
实施例4
96孔板每孔涂30μl的液体ECMatix胶,在37℃下固化45分钟。每孔加100μl的HUVEC细胞悬液(3×104/孔),加不同浓度的药物或溶媒,37℃,5%CO2培养8小时。用倒置差像显微镜250倍镜下记录图像,随即计算完整的管腔形成数N。管腔形成率=(N实验组-N对照组)/N对照组×100%。所有实验数据均以均数±标准差表示,多组比较采用单因素方差分析,用SPSS16.0软件进行统计分析。
图5是人脐静脉内皮细胞HUVEC管腔在不同浓度的GFP08作用下的倒置显微照片,其中:a为空白对照组,b为10mg/L GFP08组,c为50mg/L GFP08组,d为100mg/L GFP08组。
图6是不同浓度的GFP08对人脐静脉内皮细胞HUVEC管腔的抑制作用的数理统计图,图中:**表示与对照组比较p<0.01,***表示与对照组比较p<0.001。
结合图5和图6可见:GFP08在10、50、100mg/L时均能显著性地抑制HUVEC细胞的管腔形成并呈剂量依赖性。
实施例5
将Millicell底部膜浸入0.1%明胶溶液中,37℃恒温2h,取出,小室倒置,晾干。取一张24孔板,分别设无诱导组、20%FBS诱导组、阳性药物对照组和药物组,其中无诱导组孔中加入500μl含0.1%BSA的M199培液,其余各组孔中加入500μl含20%FBS的M199培液。将晾好的Millicell放入24孔板中,往小室中加入100μl细胞悬液(3×105/孔),依次加入溶媒或药物,37℃,5%CO2培养24h,取出,将Millicell底部浸入4%多聚甲醛中固定2h,用棉签轻轻擦去上室细胞,下室细胞用0.1%结晶紫染色30min,晾干后到100X显微镜下计数(随机5个视野取平均值)。然后染色细胞上的结晶紫溶于300μl含30%乙酸的溶液中,600nm处测定光吸收值,细胞迁移率=(OD实验组/OD对照组))×100%。所有实验数据均以均数±标准差表示,多组比较采用单因素方差分析,用SPSS16.0软件进行统计分析。
图7是在无诱导组、20%FBS诱导组、阳性药物对照组和药物组下的人脐静脉内皮细胞HUVEC的倒置显微照片,其中:a为无诱导组,b为20%FBS诱导组,c为阳性药物对照组(20%FBS+10μM Suramin组),d为药物组(20%FBS+100mg.L-1GFP08组)。
图8是GFP08对人脐静脉内皮细胞HUVEC迁移抑制作用以OD值进行的数理统计图,图中:FBS1为阳性药物对照组(20%FBS+10μM Suramin组),FBS2为药物组(20%FBS+100mg.L-1GFP08组);*表示与对照组比较p<0.05,**表示与对照组比较p<0.01。
图9是GFP08对人脐静脉内皮细胞HUVEC迁移抑制作用以细胞个数进行的数理统计图,图中:FBS1为阳性药物对照组(20%FBS+10μM Suramin组),FBS2为药物组(20%FBS+100mg.L-1GFP08组);**表示与对照组比较p<0.01,***表示与对照组比较p<0.001。
结合图7至图9可见:100mg/L GFP08能显著性地抑制体外20%FBS诱导的HUVEC细胞的迁移。
实施例6
按照以下的处理方法,细胞用裂解液(50mM Tris(pH7.5),1mM EDTA,150mM NaCl,20mM NaF,0.5%NP-40,10%甘油(glycerol),1mM苯甲磺酰氟,10μg/ml抑肽酶(aprotinin),10μg/ml亮抑酶肽(leupeptin),10μg/ml胃酶抑素(pepstatin)A来进行裂解,蛋白浓度测定后调整成等浓度等体积的样本。将制备好的样本用SDS-PAGE胶进行电泳。转膜后上待检测的一抗,4℃摇床过夜后,上相应的二抗。ECL显色后,用X光片曝光成像。为了重复利用蛋白印记,我们用Strip buffer(62.5mM Tris(pH6.7),20%SDS和0.1M 2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol)于50℃水浴30分钟,将上过的一抗去除掉,再重新上新的一抗。
图10为100mg/L的GFP08对HUVEC的TF蛋白的表达图,由图10可见:GFP08的抗肿瘤、抗血管生成作用可能与TF信号通路有关。
另外要说明的是:本发明的硫酸半乳聚糖可与可药用载体制备成各种药用制剂。所述“可药用载体”应不会破坏硫酸半乳聚糖的药学活性,其有效用量,即能够起到药物载体作用时的用量应对人体无毒,其包括但不限于:离子交换材料、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、自乳化药物传递***。
其他可药用辅料如填充剂(如无水乳糖、淀粉、乳糖珠粒和葡萄糖)、粘合剂(如微晶纤维素)、崩解剂(如交联羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素和交联PVP)、润滑剂(如硬酯酸镁)、吸收促进剂、香味剂、甜味剂、稀释剂、赋形剂、润湿剂、溶剂、增溶剂和着色剂等也可加入由本发明的硫酸半乳聚糖制备的药物制剂中。
尤其是,由本发明的硫酸半乳聚糖可制备成静脉给药制剂,当然,也可制备成通过肠道或非肠道途径给药、气雾吸入或植入蓄积或针刺等方式给药的药物制剂。
最后应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
Claims (10)
2.根据权利要求1所述的硫酸半乳聚糖,其特征在于:所述的硫酸半乳聚糖中还含有摩尔百分含量为0~2%的含丙酮酸基的1,3连接的D-半乳糖。
3.一种权利要求1所述的硫酸半乳聚糖的制备方法,其特征在于,包括如下具体操作步骤:
a)水提取:将新鲜采集的蜈蚣藻用自来水冲洗掉表面盐分后切碎,加入蒸馏水,用冰醋酸调至pH=5~7,在85~95℃提取0.5~1.5小时;残渣按上述过程再提取1次;合并2次的提取液;
b)醇沉:在搅拌下加入上述提取液2~4倍体积的乙醇,静置,离心收集沉淀;
c)冻干:将所得沉淀溶于水,透析24~72小时,然后冷冻干燥;
d)分离纯化:将上述冻干的多糖用pH=7.2、浓度为20mmol/L的磷酸盐缓冲溶液溶解后,用DEAE-Sepharose Fast Flow凝胶色谱柱层析,先以浓度为0.5mol/L的氯化钠溶液及pH=7.2、浓度为20mmol/L的磷酸盐缓冲溶液洗脱2倍柱体积,再用浓度为0.8mol/L的氯化钠溶液及pH=7.2、浓度为20mmol/L的磷酸盐缓冲溶液洗脱,苯酚-硫酸法检测收集,流水透析24~72小时,冷冻干燥;再用蒸馏水溶解,用Sepharose CL-6B柱纯化,以蒸馏水洗脱,硫酸苯酚法检测收集,冷冻干燥,即得所述的硫酸半乳聚糖。
4.根据权利要求3所述的硫酸半乳聚糖的制备方法,其特征在于,步骤a)中的水提取条件为:用冰醋酸调至pH=6,在90℃提取1小时。
5.根据权利要求3所述的硫酸半乳聚糖的制备方法,其特征在于,步骤b)中的醇沉条件为:在搅拌下加入上述提取液3倍体积的体积百分含量为95%的乙醇。
6.根据权利要求3所述的硫酸半乳聚糖的制备方法,其特征在于,步骤c)中的透析时间为48小时。
7.根据权利要求3所述的硫酸半乳聚糖的制备方法,其特征在于,步骤d)中的流水透析时间为48小时。
8.权利要求1所述的硫酸半乳聚糖在制备抗血管生成中的应用。
9.权利要求1所述的硫酸半乳聚糖在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.权利要求1所述的硫酸半乳聚糖在制备抗S-180肉瘤或肝癌药物中的应用。
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2010
- 2010-12-24 CN CN2010106046918A patent/CN102070725B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1341126A (zh) * | 1999-02-23 | 2002-03-20 | 宝酒造株式会社 | 硫酸化岩藻半乳聚糖 |
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Publication number | Publication date |
---|---|
CN102070725A (zh) | 2011-05-25 |
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