CN102058679B - 一种治疗动脉粥样硬化的药物或保健食品组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了藏边大黄或其提取物的新用途，具体地，是在制备预防或/和治疗动脉粥样硬化的药物或保健食品中的用途。本发明还提供了藏边大黄中的成分3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷的新用途。本发明还提供了一种治疗动脉粥样硬化的药物或保健食品组合物。本发明能通过改善内皮功能、抑制血小板聚集、抑制血管平滑肌细胞增生、抑制粘附分子的表达、阻断内皮细胞与单核细胞之间的粘附作用，具有降低血脂、防治动脉粥样硬化作用。

Description

一种治疗动脉粥样硬化的药物或保健食品组合物

技术领域

本发明涉及藏边大黄或其提取物的新用途，具体地，是在制备预防或/和治疗动脉粥样硬化的药物中的用途。

背景技术

藏边大黄Rheum emodi Wall.系蓼科大黄属波叶组植物的根与根茎，味酸、苦，性寒，主要分布在西藏、青海、四川及云南等地，均系野生。藏医称曲扎(Quza)，内用于治疗胃肠炎，外用于止血、治疮、消炎、愈伤口(刘兵，等，藏边大黄的化学成分研究，《华西药学杂志》，2007年22卷1期)。近年来又发现其有良好的降血脂和降血糖的功效(李军林，王志斌，李家实，藏边大黄降血糖作用的研究.中药材，1997，20(5)：249-250.)。

大黄品种很多，在我国就有40余种。我国1990年版药典收载的大黄有3种：掌叶大黄Rheum palmatum L.唐古特大黄R.tanguticumMaxim.Ex Balf.或药用大黄R.officinale Baill.称为正品大黄。其它大黄属的品种，包括藏边大黄均列为非正品大黄。一般认为非正品大黄不宜作为正品大黄药用。大黄和藏边大黄均来源于蓼科大黄属植物的根及根茎，以含有大量蒽醌类成分为特征，唯藏边大黄不含大黄酸及其苷(李军林，等，大黄与藏边大黄显微定量鉴别，《中药材》，1996年19卷5期)。李九丹研究认为藏边大黄和河套大黄与正品不同，不具有通里攻下作用；郭济贤的“大黄生药学研究”也认为非正品大黄不宜作正品药用，这是由于非正品大黄的成分在质和量上与正品大黄有所不同或有所偏重所致。

大黄(指药典收载的植物来源为掌叶大黄、药用大黄和唐古特大黄的干燥根茎和根，即所谓的正品大黄、生品大黄或掌叶组大黄)的主要有效成分为蒽醌类化合物，包括有强烈致泄作用的双蒽醌，如有番泻苷A、B、C、D、E、F等；二苯乙烯苷类成分含量极少，且不含3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷(见：大黄的现代研究：北京大学医学出版社，郑俊华，果德安2007年10月P361)。而藏边大黄(为波叶组大黄)所含蒽醌中没有强烈致泄作用的双蒽醌类，其主要成分应为二苯乙烯苷类成分，包括3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷。双蒽醌类与二苯乙烯苷类药理活性完全不同，进一步说明目前藏边大黄不能作为正品大黄使用的原因。

动脉粥样硬化(AS)的预防和治疗一直是医学难题，AS的发病率逐年增高，已成为全球范围内的重大公共卫生问题。现代研究表明，中药活性成分在预防和治疗AS方面有积极地作用效果，因此针对中药活性成分在防治AS疾病的研究越来越受到学术界的关注。尤其是我国有悠久应用历史的中药和民族药，值得积极认真的研究与开发。目前还未发现用藏边大黄治疗动脉粥样硬化的报道，也未发现用其有效成分3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷治疗动脉粥样硬化的报道。

发明内容

本发明的技术方案是提供了藏边大黄的新用途。本发明的另一技术方案是提供了一种化合物的新用途。

本发明提供了藏边大黄或其提取物在制备预防或/和治疗动脉粥样硬化的药物或保健食品中的用途。

所述的药物或保健食品是具有降血脂作用的药物或保健食品。

其中，所述的藏边大黄为蓼科大黄属波叶组植物Rheum emodi Wall.的根或根茎。

其中，所述的藏边大黄提取物为藏边大黄的水或有机溶剂提取物。

其中，所述的藏边大黄提取物为藏边大黄乙醇提取物。

其中，所述的藏边大黄提取物中含有化合物：3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷的重量百分含量为30％～100％。

本发明还提供了如式1所示的化合物在制备预防或/和治疗动脉粥样硬化的药物或保健食品中的用途，

式1

其中，R₁为

R₂-R₇为H或OH，R₂和R₃不同时为H或OH，R₄和R₅不同时为H或OH，R₆和R₇不同时为H或OH。

进一步地，所述的化合物为：

进一步优选地，所述的化合物为3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷，其结构式如下：

本发明还提供了一种治疗动脉粥样硬化的药物或保健食品组合物，其特征在于：它是由有效量的藏边大黄或其提取物、或式1所示的化合物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的制剂。

其中，所述的制剂是固体或液体剂型。

本发明通过大量的药理学实验发现，藏边大黄提取物，藏边大黄中提取的单体化合物(3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷)及有关人工合成的单体化合物(3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷)能够通过改善内皮功能、抑制血小板聚集、抑制血管平滑肌细胞增生、抑制粘附分子的表达、阻断内皮细胞与单核细胞之间的粘附作用，具有降低血脂、防治动脉粥样硬化作用，为临床提供了一种新的用药选择。

具体实施方式

以下试验及其数据仅是范例性的，并不对本专利的范围构成任何限制，本领域技术人员和科研人员所理解的应该是：在不偏离本发明的精神和范围条件下，可以对本发明技术方案的细节进行修改或替换，如改变化合物3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷的提取方法及其改变化合物的分子结构等。但这些修改和替换均落入本发明的保护范围以内。

实施例1本发明藏边大黄提取物的提取方法

藏边大黄提取物的制备工艺流程为：取一定量藏边大黄药材粉碎过20目筛，加适量70％乙醇浸泡24h，用5倍柱体积70％乙醇洗脱，流速为10ml·min^-1，收集洗脱液，减压浓缩至干，即得到藏边大黄提取物。

实施例2单体化合物3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷(PDG)的制备

藏边大黄中3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷(PDG)的分离纯化工艺流程为：藏边大黄药材粉碎后过20目筛，加70％乙醇浸泡24h，再以10ml·min^-1的流速渗漉提取，用4倍柱体积70％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至适量。取浓缩液用5倍体积的石油醚(沸程60～90℃)萃取3次，收集水层残留物，再用1.5倍体积的乙酸乙酯萃取5次，分别得乙酸乙酯萃取物和水层残留物。取乙酸乙酯萃取物部分溶于少量蒸馏水中，称取100-200目聚酰胺约样品重量的30倍，湿法装柱，采用水、10％乙醇、20％乙醇、30％乙醇、40％梯度洗脱，每个梯度用4倍柱体积的流动相洗脱，合并30％乙醇和40％乙醇洗脱液部分，减压浓缩至适量，用等量乙酸乙酯萃取5次，收集乙酸乙酯液，减压真空浓缩得固体物。固体物干法上200-300目硅胶柱，采用氯仿-甲醇***洗脱，采用氯仿、氯仿甲醇(12∶1)、氯仿甲醇(5∶1)、氯仿甲醇(3∶1)、纯甲醇5个梯度洗脱液洗脱，每个梯度用5倍柱体积洗脱液，收集氯仿甲醇(5∶1)部分，回收溶剂，减压浓缩至干得PDG纯品。

3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷(PDG)结构解析

式2 3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷

白色无定形粉末(乙醇)。点于硅胶薄层板上，置于紫外灯(365nm)下显蓝紫色荧光。¹³CNMR谱给出14个不饱和碳信号和六碳糖信号。¹HNMRδ4.77(1H，d，J＝7.2Hz，anomeric-H)和¹³CNMR δ104.1，78.2，77.6，74.8，71.3，62.4推断出为β-D-葡萄糖。¹HNMR谱给出trans烯质子(δ6.83，6.92，each 1H，J＝16Hz，olefinic H)以及各有3个芳质子的两个苯环，一个环呈ABX型信号(δ7.02，1H，d，J＝2Hz，H-2’；δ6.93，1H，dd，J＝8.4，2Hz，H-6’；δ7.15，1H，d，J＝8.4Hz，H-5’)，另一环呈AX₂型信号(δ6.44，2H，d，J＝2Hz，H-2，6；δ6.16，1H，t，J＝2Hz，H-4)。酸水解检出葡萄糖和piceatannol，¹HNMR和¹³CNMR数据与文献报道的piceatannol-4’-O-β-D-glucopyranoside一致，故鉴定为3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷。

实施例3本发明藏边大黄提取物中单体化合物3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷(PDG)的含量测定

对照品溶液的制备精密称取3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷纯品适量，加甲醇配制成每1ml约含0.4mg的溶液作为对照品溶液。

供试品溶液的制备取干燥的藏边大黄提取物适量，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理(150W，40kHz)40min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液即得供试品溶液。

色谱条件与***适应性条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，检测波长为320nm，流动相为乙腈-水(12∶88)，流速为1.0ml·min^-1，柱温为30℃，理论板数按3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷峰计算应不低于3000。3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷主峰与其他杂质峰的分离度应达到要求。

测定法分别精密吸取对照品溶液10μl与样品溶液5μl注入液相色谱仪，测定，即得。

具体结果如下：

表1藏边大黄提取物中3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷含量(％)

样品编号	取样(g)	主峰面积	含量(％)
				1	0.6023	619024	30.81
2	0.5131	727001	36.18
				3	0.3053	1221163	60.78
4	0.2821	1321784	65.80
				5	0.1939	1917180	95.70
6	0.1878	1985658	98.83

以下通过具体的药效学试验证明本发明的有益效果。

试验例1藏边大黄提取物及3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷对实验性动脉粥样硬化大鼠血脂和炎症因子的调节实验

一实验材料

试剂与药品：藏边大黄提取物(由实施例1制备，其中，含3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷30％)；3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷(PDG，四川大学华西药学院生药学研究室按实施例2的方法分离提取，纯度为≥98％)；辛伐他汀(鲁南贝特制药有限公司)；胆酸钠(成都三生元生物科技有限公司)；大鼠IL-6，TNF-α，ELISA试剂盒(上海江莱生物科技有限公司)；高脂饲料由四川大学动物实验中心配制，脂饲料配制方法：由胆固醇2％、胆酸钠0.5％、丙基硫氧嘧啶0.2％、猪油10％、白糖5％和基础饲料82.3％组成。

实验动物：SD大鼠，雄性，体重180～200g，SPF级，由四川大学动物实验中心提供。

二实验方法

SD大鼠在实验室用普通饲料喂养1周后，体随机分为9组，每组10只，均分笼喂养，供给充足的水和饲料。9组为：正常对照组(N)，给予普通饲料；模型组(M，高脂饲料)；PDG高剂量组(PDG-1，150mg·kg^-1d^-1)；PDG中剂量组(PDG-2，75mg·kg^-1d^-1)；PDG低剂量组(PDG-3，40mg·kg^-1d^-1)；舒降之对照组(C，2.5mg·kg^-1d^-1)，藏边大黄提取物组(按生药量计：E1：2400mg·kg^-1d^-1，E2：1200mg·kg^-1d^-1和E3：600mg·kg^-1d^-1)。开始给药的同时，除正常对照组外，高脂饲料喂养的大鼠一次性腹腔注射给予VitD₃80万U/kg剂量。PDG、藏边大黄提取物和舒降之均用生理盐水配成混合液。实验采用灌胃给药。每周称大鼠体重1次，调整给药剂量，给药量每只大鼠药物混合液为1ml/100g。正常对照组和模型组灌胃给予同体积生理盐水。大鼠喂养11周，PDG各组，藏边大黄提取物各组和舒降之组采用高脂喂养+药物干预模式进行实验。SD大鼠持续喂养11周后，经颈动脉取血2ml，待血液自凝后，用3000r/min×20min离心，取血清，测定血清TC、TG、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及C反应蛋白(CRP)水平，ELISA法测定血清IL-6、TNF-α水平。

三实验结果

1藏边大黄提取物及PDG对大鼠血脂水平的影响

给药11周后，与正常对照组相比，模型组大鼠血清TC、TG、LDL-C含量明显升高，血清HDL-C含量则明显降低，达到显著性差异水平(P＜0.01)；与模型组相比较，PDG中，高剂量组能明显降低血清TC、TG、LDL-C含量(P＜0.05)，显著提高血清HDL-C含量(P＜0.05)，而PDG低剂量组虽能降低血清TC、TG、LDL-C含量及提高血清HDL-C含量，但无统计学意义(P＞0.05)；藏边大黄提取物组中，高剂量均能明显降低血清TC、TG、LDL-C含量和显著提高血清HDL-C含量，与模型组相比较均有显著统计学差异。见表2。

表2 3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷及提取物对大鼠血脂水平的影响

^aP＜0.01，^bP＜0.05与正常组相比较；^cP＜0.01，^dP＜0.05与模型组相比较。

2 PDG和藏边大黄提取物抗炎作用结果分析

给药12周，与正常对照组相比，模型组大鼠血清IL-6、TNF-α、CRP水平有明显升高(P＜0.01)。与模型组比较，PDG中、高剂量组和藏边大黄提取物中高剂量组(E1和E2)均能明显降低血清IL-6、TNF-α、CRP含量并具有统计学意义(P＜0.05)，而PDG低剂量虽能降低血清IL-6、TNF-α、CRP含量，但无统计学意义(P＞0.05)，与模型组相比较，藏边大黄低剂量组在降低TNF-α方面有显著地统计学差异。见表3。

表3 PDG及藏边大黄提取物对实验性动脉硬化大鼠血清TNF-α、CRP、IL-6含量的影响(n＝10)。

^aP＜0.01，^bP＜0.05与正常组相比较；^cP＜0.01，^dP＜0.05与模型组相比较；

试验例2单体化合物(3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷，PDG)对大鼠血栓形成及血液流变学的影响实验

一实验材料

实验药物：藏边大黄提取物；3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷(PDG，四川大学华西药学院生药学研究室分离提取，纯度为≥98％)；阿司匹林(阳性对照药，四川广元蓉成制药有限公司)；盐酸肾上腺素液(四川迪康科技药业股份有限公司)；肝素钠注射液(成都通德药业有限公司)。实验动物：SD大鼠，体质量180～200g，雄性，由四川大学动物实验中心提供。

二实验方法

1PDG对大鼠血栓形成的影响实验

SD大鼠80只分为8组：空白组(N)，阿司匹林组(C，10mg/kg)，PDG低剂量组(PDG-3，8mg/kg)、PDG中剂量组(PDG-2，16mg/kg)、PDG高剂量组(PDG-1，32mg/kg)。所有大鼠用1％戊巴比妥钠麻醉固定后，上述各组份均以0.1ml/100g舌下静脉注射，给药后20min，分离右侧颈总动脉和左侧颈外静脉，以三段聚乙烯管合成一插管，中间管放入一根长8cm的手术丝线，先在管中注满浓度为60u/ml的肝素生理盐水溶液。待管一端***左颈外静脉后，再经聚乙烯管注入肝素60u/kg抗凝。然后再将管另一端***右颈总动脉，打开动脉夹，形成右总动脉和左外静脉循环。开放血流17min后，动脉夹夹断血流，迅速取出丝线称重，总重量减去丝线干重即为血栓湿重。用t检验同空白组(N)进行比较，同时计算出血栓抑制率。

血栓抑制率(％)＝[血栓湿重(生理盐水组)-血栓湿重(试验组)]×100％/血栓湿重(生理盐水组)

2 PDG对急性血淤模型大鼠血液流变学的影响实验

SD大鼠分为5组：空白组(N)，血瘀模型组(M)，PDG低剂量组(PDG-3，8mg/kg)、PDG中剂量组(PDG-2，16mg/kg)、PDG高剂量组(PDG-1，32mg/kg)。各实验组分别尾静脉给药1次/d，连续7d。血瘀模型组和空白对照组分别连续给予等容量0.9％氯化钠溶液。于第7天给药1h后，除空白对照组外，其余各组皮下注射盐酸肾上腺素10mg/kg共2次，间隔4h，第1次注射肾上腺素后将大鼠浸入冰水中5min，造成血瘀模型。腹主动脉取血8m，l其中4ml迅速注入含肝素钠的抗凝管内，摇匀静置，用于检测血流变学指标；4ml注入含3.5％的枸椽酸钠的硅化管内，用于检测血沉。检测血流变学采用流变仪测定，先测定全血粘度后，将其低速离心(1500r/min离心10min)分离出血浆，然后测血浆粘度、红细胞压积及血沉所有数据均用

表示，统计学分析两组间比较用t检验。

三实验结果

1 PDG对大鼠动静脉旁路血栓形成的影响

与空白组相比，PDG高、中、低剂量组均可以使血栓湿重下降，且具有统计学意义(P＜0.05)，从结果可以看出剂量与效应呈明显正相关。见表4。

表4PDG对大鼠动静脉旁路血栓形成的影响

^aP＜0.01，^bP＜0.05与空白对照组相比较。血栓抑制率(％)＝[血栓湿重(生理盐水组)-血栓湿重(试验组)]×100％/血栓湿重(生理盐水组)。

2PDG对急性血淤模型大鼠血液流变学的影响

与空白组(N)相比，模型组(M)大鼠的全血粘度(WBV)、血浆粘度(PV)、红细胞压积(HCT)均明显升高，达到了显著差异水平(P＜0.01)，而PDG高、中、低剂量组与模型组相比，全血粘度、血浆粘度、红细胞压积明显下降，具有显著统计学差异(P＜0.01)。说明PDG有改善血液流变学的作用。见表5。

表5PDG对急性血淤模型大鼠血液流变学的影响

^aP＜0.01，^bP＜0.05与空白相比较；^cP＜0.01，^dP＜0.05与模型组相比较。

试验例3藏边大黄提取物及单体化合物(3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷，PDG)对动脉粥样硬化大鼠主动脉胞间粘附分子1、血管细胞粘附分子1及血管内皮生长因子表达的影响

一实验材料

实验药品：藏边大黄提取物；3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷(PDG，由四川大学华西药学院生药学研究室提取提供，含量＞98％)；高脂饲料由四川大学动物实验中心配制，脂饲料配制方法：由胆固醇2％、胆酸钠0.5％、丙基硫氧嘧啶0.2％、猪油10％、白糖5％和基础饲料82.3％组成。辛伐他汀(鲁南贝特制药有限公司)；超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)活性测试盒，丙二醛(mal ondialdehyde，MDA)含量测试盒和BCA蛋白定量试剂盒均够自美国sigma公司。兔抗鼠血管壁细胞间粘附分子1(intercellular adhesi on molecule-1，ICAM-1)、血管细胞粘附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)多抗，均够自上海越研生物科技有限公司。辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，美国贝克曼库尔特有限公司。总RNA提取Trizol试剂盒，VCAM-1，ICAM-1和β-肌动蛋白(β-actin)引物，均由上海沪峰生物科技有限公司完成。

实验动物：SD大鼠，♂，体重180～200g，SPF级，由四川大学动物实验中心提供。

二实验方法

1 AS大鼠模型的制备及分组给药

120只SD大鼠用普通饲料喂养1周后随机抽取10只给予普通饲料喂养，作为正常对照组；其余给予高脂饲料喂养，并一次性ip维生素D₃10MU·kg^-1。12周后从高脂饲料喂养的大鼠和正常对照组大鼠各随机抽取5只，戊巴比妥钠腹腔麻醉，取血清检测总胆固醇(total cholesterol，TC)，甘油三酯(triglyceride，TG)，低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoproteincholesterol，LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoproteincholesterol，HDL-C)水平。从主动脉弓起始部至腹主动脉髂前分叉处取主动脉，用4％多聚甲醛固定，冰冻切片苏丹红Ⅳ和HE染色，光镜下观察。将AS模型大鼠随机分为8组(每组12只)：模型对照组、PDG(30，60及120mg·kg^-1)组，藏边大黄提取物组(E3：0.6g生药·kg^-1，E2：1.2g生药·kg^-1及E1：2.4g生药·kg^-1)阳性对照辛伐他汀(2mg·kg^-1)组。PDG组、藏边大黄提取物组和辛伐他汀组均用生理盐水配成混悬液，ig给药，给药容量为10ml·kg^-1，每天1次，连续给药7周。正常对照组和模型对照组给予等体积蒸馏水。每周称体重1次，调整给药剂量。

2血清SOD活性和MDA含量检测

大鼠给药7周后，经颈动脉穿刺取血2ml，待血液自凝后，3000xg离心15min，取血清，用黄嘌呤氧化酶法测定血清SOD活性，硫代巴比妥酸比色法测定MDA含量。

3 Western蛋白印迹法检测

Western蛋白印迹法检测主动脉血管壁细胞ICAM-1，VCAM-1及VEGF蛋白表达，大鼠给药7周后，在冰上剪取2～3cm主动脉，用预冷的PBS洗净，剪碎，加入蛋白裂解液制备匀浆，4℃，12000xg离心10min，取上清分装后-70℃冻存，BCA法测蛋白含量。以30μg总蛋白样品上样，100mV电泳2h，350mA转膜2h，转膜后PVDF膜放入T BS封闭液中封闭4h。将兔抗鼠ICAM-1，VCAM-1及VEGF一抗以TBS封闭液1∶200稀释，与PVDF膜4℃反应12h。弃去一抗，TBS洗3次后加入1∶5000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗，反应2h，按照化学发光试剂盒使用说明进行操作，在自显影胶片上曝光1min，可见蛋白条带，经计算机图像分析仪扫描，进行积分吸光度(A)测定及分析，重复实验5次。

4 RT-PCR检测主动脉ICAM-1及VCAM-1

mRNA的表达按Trizol法提取细胞总RNA，紫外分光光度计测量A260nm和A280nm，通过其比值计算RNA纯度及浓度。由Primer5软件设计引物序列，

VCAM-1扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性45s，56℃复性45s，72℃延伸1min，扩增35个循环，72℃延伸10min。ICAM-1反应条件：95℃预变性10min，95℃变性40s，54℃复性40s，72℃延伸40s，扩增31个循环，72℃延伸10min。β-肌动蛋白反应条件：循环次数为25次，其余条件同上。PCR产物用含0.5mg.L^-1溴化乙啶的1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，Labworks凝胶分析***收集图像，以每例标本VCAM-1和I CAM-1与β-肌动蛋白条带A值之比作为该例标本目的基因表达的相对数值，重复实验5次。

5免疫组织化学法检测主动脉VEGF蛋白表达

本实验采用SABC法。实验中加入特异性兔抗鼠VEGF抗体和生物素化山羊抗兔IgG二抗，DAB染色，苏木素轻度复染，胞膜或胞浆出现咖啡色颗粒为阳性细胞。每组随机抽取3只大鼠，每只大鼠切片20张，厚40μm，随机抽取其中3张切片，用图像分析仪测A值，量化为计量资料反映VEGF蛋白表达水平。

三实验结果

1 AS大鼠模型的鉴定

模型组大鼠血清TC，TG及LDL-C水平较正常对照组明显增高，HDL-C水平明显降低，且均达到了统计学差异水平。主动脉冰冻切片苏丹红Ⅳ染色光镜下观察，正常对照组大鼠主动脉内膜下未见明显的脂质浸润，模型组大鼠主动脉内膜下见明显的脂质浸润。HE染色光镜观察，正常对照组动脉血管壁结构清晰，内皮细胞连续完整无脱落；模型组主动脉内膜明显增厚，内膜下见大量脂质沉积及胆固醇结晶，中膜萎缩。结果表明AS模型制备成功。

2 PDG及藏边大黄提取物对AS大鼠血清SOD活性及MDA含量的影响

给药7周后，与正常对照组相比，AS模型对照组大鼠血清MDA水平明显升高(P＜0.01)，SOD活性明显降低(P＜0.01)；与模型对照组相比，PDG三个剂量组、藏边大黄提取物三个剂量组及辛伐他汀组血清MDA含量显著降低，SOD活性显著增加(表6)。

表6 PDG及藏边大黄提取物对AS大鼠血清SOD活性及MDA含量的影响

注：a与正常组比较P＜0.01，b与正常组比较P＜0.05；c与模型组比较P＜0.01，d与模型组比较P＜0.05；

3 PDG及藏边大黄提取物对AS大鼠主动脉ICAM-1，VCAM-1及VEGF蛋白表达的影响

Western蛋白印迹法分析结果显示，与正常对照组相比，AS模型对照组大鼠主动脉ICAM-1，VCAM-1和VEGF蛋白表达明显升高，有显著的统计学差异(P＜0.05)；与模型对照组相比，给药7周后，PDG组60和120mg·kg^-1、藏边大黄提取物组(1.2g生药.kg^-1及2.4g生药.kg^-1)及辛伐他汀组主动脉ICAM-1，VCAM-1及VEGF表达明显降低，有显著的统计学差异(P＜0.05)。见表7

表7 PDG及藏边大黄提取物对AS大鼠主动脉ICAM-1，VCAM-1及VEGF蛋白表达的影响

注：a与正常组比较P＜0.01，b与正常组比较P＜0.05；c与模型组比较P＜0.01，d与模型组比较P＜0.05；

4 PDG对AS大鼠主动脉ICAM-1和VCAM-1mRNA水平的影响

RT-PCR检测结果表明，模型对照组大鼠胸主动脉ICAM-1和VCAM-1mRNA水平较正常对照组明显升高，有显著的统计学差异(P＜0.01)；给药7周，PDG30、60和120mg·kg^-1和辛伐他汀均明显降低ICAM-1和VCAM-1mRNA水平。见表8

表8 PDG对AS大鼠主动脉ICAM-1和VCAM-1mRNA水平的影响

注：a与正常组比较P＜0.01，b与正常组比较P＜0.05；c与模型组比较P＜0.01，d与模型组比较P＜0.05；

5 PDG对AS大鼠主动脉VEGF蛋白表达的影响

免疫组织化学法检测结果表明，正常对照组主动脉VEGF染色阳性强度较弱，主要分布于血管内皮。模型对照组动脉组织VEGF染色阳性细胞数较正常对照组明显增加，棕色强度增加，内皮细胞和平滑肌细胞均呈强阳性染色；PDG各组、藏边大黄各组和辛伐他汀组动脉VEGF染色阳性细胞较模型对照组减少，具有显著地统计学差异。见表9。

表9 PDG对AS大鼠主动脉VEGF蛋白表达的影响

注：a与正常组比较P＜0.01，b与正常组比较P＜0.05；c与模型组比较P＜0.01，d与模型组比较P＜0.05；

通过上述将本发明药物对实验性动脉粥样硬化大鼠血脂和炎症因子的调节实验，对大鼠血栓形成及血液流变学的影响，动脉粥样硬化大鼠主动脉胞间粘附分子、血管细胞粘附分子及血管内皮生长因子表达的影响实验可知，本发明能通过改善内皮功能、抑制血小板聚集、抑制血管平滑肌细胞增生、抑制粘附分子的表达、阻断内皮细胞与单核细胞之间的粘附作用等而具有降低血脂、防治动脉粥样硬化作用。

Claims (2)

1.藏边大黄或其提取物在制备预防或/和治疗动脉粥样硬化的药物或保健食品中的用途；所述的藏边大黄提取物为藏边大黄乙醇提取物；所述的藏边大黄提取物中含有化合物：3,5,3′,4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷的重量百分含量为30％。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的药物或保健食品是具有降血脂作用的药物或保健食品。

3、根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述的藏边大黄为蓼科大黄属波叶组植物Rheum emodi Wall.的根或根茎。

4、根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述的药物或保健食品是固体或液体剂型。