CN103435580B - 灵芝酚a及其在制药和食品中的应用 - Google Patents
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Abstract
中药灵芝自古被称为仙草，可治“百病”，从赤芝中纯化一对灵芝酚A光学对映体，它们具有显著的抑制高糖诱导的大鼠肾系膜细胞株产生活性氧自由基，IL-6,纤粘连蛋白（Fibronectin）和IV型胶原蛋白的作用，也可显著抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞Smad3磷酸化，显示该类化合物在制备抗糖尿病性肾病和慢性肾病药物中的应用前景。
Description
技术领域：
本发明属于药物技术领域，具体地，涉及灵芝酚A及含其的药物组合物及其在制备治疗糖尿病性肾病或慢性肾病的药物或保健食品中的应用。
背景技术：
糖尿病肾病或慢性肾病的危害、病理机制及药物研究的方法和原理，本申请人在已公开的专利申请（中国专利公开号：CN102153630A）中均有明确的描述。众所周知，现代饮食起居生活方式变化，加之环境污染，药物滥用等因素，导致全球范围内糖尿病并发症及慢性肾病如肾纤维化多发、高发，但目前这些疾病的临床有效治疗药物还比较缺乏。
现代研究表明糖尿病肾病的发生发展是与细胞因子如IL-6,MCP-1等以及细胞外基质如I型、Ⅳ型胶原、纤粘蛋白等的过度分泌密切相关,近些年临床和动物实验表明肾纤维化的主要病理机制是TGF-β/Smad3信号通路的活化。因此观察药物对高糖诱导的肾系膜细胞的细胞因子和胶原蛋白的影响，或观察药物对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞Smad3磷酸化的抑制作用，已经成为目前研究糖尿病肾病或肾纤维化药物的常用方法。但目前关于Smad3磷酸化的小分子药物还比较缺乏。
灵芝被称为仙草，中药之王，我国有近百种。灵芝自古为名贵中药，在我国已有2000多年应用历史，据称灵芝可治疗百病，其不仅在我国，且在东亚和美国都有应用，目前其已被收录于美国草药药典中。我国关于灵芝的保健品众多，表明其功能备受关注，本申请人从灵芝（Ganoderma lucidum）具有扶正固本功能推测其可能含有抗糖尿病肾病或慢性肾病活性物质，用于糖尿病肾病或慢性肾病的干预。现有技术中未见有本发明的化合物及其具有糖尿病肾病或慢性肾病价值治疗前景的活性的相关报道。
发明内容：
本发明的目的在于提供具有抗糖尿病肾病或慢性肾病价值的化合物(+)-1,(-)-1；含其的药物组合物；该发明的化合物在制备抗糖尿病性肾病或/和慢性肾病的药物或保健食品中的应用。
本发明的上述目的是由下述的技术方案得以实现的：
具有下述结构式的灵芝杂萜类化合物，其晶体结构（晶体数据存于CambridgeCrystallographic Data Centre(no.CCDC959365).www.ccdc.cam.an.uk/conts/retrieving.html.）如下：
治疗糖尿病肾病或慢性肾病的药物组合物，含有治疗有效量的上述化合物和药学上可接受的载体。
上述化合物在制备治疗糖尿病肾病或慢性肾病的药物中的应用。
上述化合物的制备方法，取赤芝（Ganoderma lucidum），粉碎，用95%乙醇回流提取，合并提取液并减压回收溶剂得粗提取物，将粗提取物混悬于适量水中，然后用等体积乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，减压浓缩得乙酸乙酯萃取物，经硅胶200-300目柱层析，99:1，98:2，97:3，96:4，95:5，94:6，93:7，92:8，90:10，85:15，80:20，50:50氯仿－甲醇***梯度洗脱，每种溶剂梯度为1.5倍柱体积，按照每份500mL收集得7个合并组份；组份4经硅胶柱层析，10:1:0.2氯仿/丙酮/醋酸洗脱得4个亚组份，其中组份4.3经MCI gel CHP20P柱层析（MeOH/H2O,40-100%)得4个亚组份，其中组份4.3.2经Sephadex LH-20（MeOH/H2O,80:20）柱层析，根据薄层显色跟踪合并相同流份，合并组份经反相RP-18柱层析，甲醇-水（40-60%）洗脱，薄层指导合并斑点，然后经半制备反相RP-18高效液相色谱纯化(MeOH/H2O,40%)，得化合物1，该化合物为消旋体，经手性拆分(正己烷/乙醇，80:20)得化合物(-)-1和(+)-1。
本发明化合物可以单独直接应用或组合应用，也可以与其它药物包括植物提取物组成复方的形式使用，可以使用不同的药用辅料，制成多种固体制剂和液体制剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明的药物可经口服和注射两种形式给药。使用量可根据给药途径、患者的年龄、体重、所治疗疾病的类型和严重程度等变化进行一次或多次使用。
附图说明：
图1表示化合物抑制高糖诱导的肾系膜细胞促炎症因子及细胞外基质测定实验：采用USCK公司的ELISA试剂盒检测大鼠系膜细胞培养上清IL-6，CollagenIV和Fibronectin的表达；图1A为化合物对白细胞介素-6(IL-6)的抑制作用，*P<0.05vs正常糖;#P<0.05vs高糖；图1B为化合物对纤粘连蛋白（fibronectin）的抑制作用.*P<0.05vs正常糖;#P<0.05vs高糖；图1C为化合物对IV型胶原的抑制作用.*P<0.05vs正常糖;#P<0.05vs高糖;图1D为化合物对活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的抑制作用，*P<0.05vs高糖(high glucose，HG)。
图2表示化合物抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞Smad3磷酸化水平：图2A和2B分别为化合物(-)-1和(+)-1的作用,药物分组从左至右分别为：对照组（不加TGF-β1和受试药物），对照组（受试药物30μM,但不加TGF-β1）TGF-β1+DMSO组，TGF-β1+(+)-1or(-)-1(1μM),组TGF-β1+(+)-1or(-)-1(3μM)组,TGF-β1+(+)-1or(-)-1(10μM)组,TGF-β1+(+)-1or(-)-1(30μM)组。
图3为本发明化合物的结构示意图和晶体结构图。
具体实施方式：
下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明的范围。
实施例1：
化合物1的分离纯化：
赤芝（Ganoderma lucidum）80kg，粉碎，用95%乙醇回流提取(2×360L×2h)，合并提取液并减压回收溶剂得粗提取物，将粗提取物混悬于适量水中，然后用等体积乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，减压浓缩得乙酸乙酯萃取物1.1kg。该酚性物质经硅胶柱层析（硅胶200-300目,7kg），氯仿－甲醇***梯度洗脱（99:1，98:2，97:3，96:4，95:5，94:6，93:7，92:8，90:10，85:15，80:20，50:50），每种溶剂梯度为1.5倍柱体积，按照每份500mL收集)得7个合并组份。组份4(420g)经硅胶柱层析，氯仿/丙酮/醋酸(10:1:0.2)洗脱得4个亚组份，其中组份4.3(180g)经MCI gel CHP20P柱层析（MeOH/H2O,40-100%)得4个亚组份，其中组份4.3.2（13.4g）经Sephadex LH-20（MeOH/H2O,80:20）柱层析，根据薄层显色跟踪合并相同流份，合并组份经反相RP-18柱层析，甲醇-水（40-60%）洗脱，薄层指导合并斑点，然后经半制备反相RP-18高效液相色谱纯化(MeOH/H2O,40%)，得化合物1，该化合物为消旋体，经手性拆分(正己烷/乙醇，80:20)得化合物(-)-1(25mg)和(+)-1(25mg)。
化合物1的结构确证：
化合物1的结构式如下所示：
化合物1的结构鉴定数据：
Table1.1H(400MHz)and13C NMR(100MHz)data of1in acetone-d6(δin ppm,J in Hz)
Lingzhiol A(1).yellowish crystals;UV(MeOH)λmax:374,266(sh),235(sh)nm;IR(KBr)νmax3536,3441,3426,3237,1757,1653,1591,1475,1458,1328,1313,1291,1208,1130,1100,1011cm-1;1H and13C NMR spectroscopic data,see Table1;ESIMS:(negative)m/z289[M-H]-;HREIMS:m/z290.0794[M]+(calcd for C15H14O6,290.0790).{[α]D19+90.5(c0.36,MeOH);CD(MeOH)Δε214–24.56,Δε2415.14,Δε2659.91,Δε3143.66,Δε373–2.04;(+)-lingzhiolA};{[α]D 19–94.2(c0.36,MeOH);CD(MeOH)Δε21426.85,Δε241–6.46,Δε265–11.20,Δε314–3.89,Δε3731.88;(–)-lingzhiol A}.
实施例2：
实施例1中化合物中的任一种，按常规法加注射用水，精滤，灌封灭菌后可制成注射液。
实施例3：
实施例1中化合物中的任一种，将其溶于无菌注射用水中，用无菌漏斗过滤，分装，低温冷冻干燥后无菌熔封即得粉针剂。
实施例4：
实施例1中化合物中的任一种，按常规法配以各种药用辅料可制成片剂。
使用实施例1中化合物中的任一种作为药物活性成分，使用几种赋形剂作为制备组合药物片剂的辅料成分，按照一定比例配比制成每片含有药物成分1-100mg的片剂样品，表1给出普通片剂的配方比例。
实施例5：
实施例1中化合物中的任一种按常规法配以各种药用辅料可制成胶囊剂：
含有实施例1中化合物中的任一种作为有效成分的药物组合胶囊制剂的制备，使用实施例1中化合物中的任一种作为药物活性成分、使用几种赋形剂作为制备组合药物胶囊剂的辅料成分，按照一定比例配比制成每粒胶囊中含有化合物成分1-100mg的胶囊制剂。
实施例6：
本发明化合物及其与药用辅料组成的药物组合物的抗糖尿病肾病或慢性肾病的药理作用。
化合物1抑制肾系膜细胞株炎症因子、细胞外基质和活性氧自由基的测定实验（见图1所示）：
采用Uscn公司的ELISA试剂盒检测大鼠系膜细胞培养上清IL-6，CollagenIV和Fibronectin表达。图1A为IL-6的化合物剂量依赖性表达；图1B为Fibronectin的化合物剂量依赖性表达；图1C为Collagen IV的化合物剂量依赖性表达；图1D为化合物对活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的抑制作用。
炎症因子和细胞外外基质实验原理：
采用双抗体夹心法测定标本中大鼠系膜细胞培养上清IL-6、Fibronectin及Collagen IV表达水平。用纯化的抗IL-6、Fibronectin及Collagen IV抗体包被微孔板，制成固相抗体，向包被单抗的微孔中依次加入含表达IL-6、Fibronectin及Collagen IV的待测样品，再与HRP标记的抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的IL-6、Fibronectin及Collagen IV的表达呈正相关。用酶标仪450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠IL-6、Fibronectin及Collagen IV浓度。
样本处理：
1）细胞培养上清：无菌管收集，2,000rpm/min，离心20min。仔细收集上清。分装冻存于-80℃。
2）刮取底壁细胞，总蛋白裂解液裂解，12,000rpm/min，4℃离心10min，收集上清，Bradford法测量总蛋白含量。
ELISA检测：
操作按试剂盒说明进行：
1）标准品的稀释与加样：酶标包被板设标准品孔，倍比稀释（稀释后各孔加样量都为50μl）加入IL-6、Fibronectin及Collagen IV的标准品。
2）加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品和酶标试剂，其余各骤操作相同）、待测样品孔（样品稀释度为5倍）。轻轻晃动混匀。
3）温育：37℃，30min。
4）洗涤：弃去板中液体，甩干，洗液洗5次，30秒/次。吸水纸拍干。
5）加酶：每孔加入50μl酶标记液，空白孔除外。
6）温育：37℃，30min。
7）洗涤：弃去板中液体，甩干，洗液洗5次，30秒/次。吸水纸拍干。
8）显色：每孔加入底物A、B液各50μl/孔。37℃，15min。避光。
9）终止：每孔加入终止液各50μl/孔。
10）测定：以空白孔调零，酶标仪450nm读吸光度（OD值）。
11）实验重复3次。
结果计算：利用标准品定量曲线分析计算样品浓度并以细胞总蛋白含量校正（IL-6：pg/mg cell protein；Fibronectin&Collagen IV：ng/mg cell protein）。
以上结果说明化合物(+)-1和(-)-1在1，3，10和30μM时对高糖诱导的肾系膜细胞株炎症因子IL-6、Fibronectin及Collagen IV均有剂量依赖性的抑制作用。
化合物1抑制高糖诱导的系膜细胞ROS产生：
参照文献方法(Wei XF,Zhou QG,Hou FF et al.Advanced oxidation proteinproducts induce mesangial cell perturbation through PKC-dependent activation ofNADPH oxidase.Am J Physiol Renal Physiol2009;296:F427－F437)，大鼠系膜细胞株(HBZY-1,Life-Science Academy of Wuhan University,Wuhan,China)在37℃条件下，培养在pH值为7.4的DMEM(Invitrogen,Carlsbad,CA)培养液中，培养液中加入10%胎牛血清(Invitrogen,Carlsbad,CA),2mM谷氨酰胺,100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。细胞融合达到80%时，采用含有0.5%胎牛血清的培养液饥饿24小时，使细胞同步化于G0期，用于后续实验。
为了检测化合物1的作用,系膜细胞首先与不同浓度的化合物1预孵育1小时,然后以5.6mM(normal glucose,NG)或25mM(high glucose,HG)的D-葡萄糖（Xia L,Wang H,Munk S et al.Reactive oxygen species,PKC-β1,and PKC-ζmediate high-glucose-induced vascular endothelial growth factor expression inmesangial cells.Am J Physiol Endocrinol Metab2007;293:E1280－E1288）刺激。
细胞内ROS含量采用荧光探针carboxymethyl-H2-dichlorofluoresceindiacetate(CM-H2-DCF-DA,Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)染色，流式细胞仪检测（Xia L,Wang H,Goldberg HJ et al.Mesangial cell NADPH oxidaseupregulation in high glucose is protein kinase C dependent and required for collagenIV expression.Am J Physiol Renal Physiol2006;290:F345－F356）。消化搜集细胞，与CM-H2-DCF-DA（1μM）孵育30分钟。以流式细胞仪(BD FACSCalibursystem,Franklin Lakes,NJ)测定荧光强度（激发波长λ=488nm,发射波长λ=515nm）。每组ROS含量用各组细胞荧光强度与正常糖浓度培养的细胞荧光强度的比值表示，结果以细胞总蛋白含量进行校正（Rygiel TP,Mertens AE,Strumane Ket al.The Rac activator Tiam1prevents keratinocyte apoptosis by controllingROS-mediated ERK phosphorylation.J Cell Sci2008;121:1183－1192）。
统计学分析：
所有实验重复三次。连续变量表示为均数±标准差,采用单因素方差分析进行比较，SPSS13.0进行统计学分析。方差齐时采用Student-Newman-Keuls法进行比较，方差不齐时采用Dunnett's T3法进行比较。双尾检验P值小于0.05认为具有统计学差异。
为了排除化合物1对于细胞的毒性影响，每次实验结束均采用MTT实验检测细胞活力。结果显示各组间没有统计学差异（数据未显示）。
化合物1抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞Smad3磷酸化：
大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）用含10%胎牛血清(Gibco,life technologies)的DMEM培养基培养，化合物用DMSO溶解.人重组TGF-β1(catalog number240-B/CF,R&D systems)按照指定方法用含0.1%的胎牛血清的去离子水溶解。细胞用不同浓度的药物提前孵育1小时，然后用TGF-β1(10ng/mL)刺激1小时，收集细胞按照常规指定方法进行Western blot分析。抗体为anti-phospho-Smad2(catalog number3108S),anti-phospho-Smad3(catalog number9520S),anti-Smad2(catalog number5339S)and anti-Smad3(catalog number9523S,Cell SignalingTechnology,Inc.,Beverly,MA).
由于这些细胞因子和细胞外基质在糖尿病肾病和慢性肾病中被检测到且呈现高表达，且慢性肾病发病过程中TGF-β1/Smad3磷酸化功能被活化，进一步加重肾脏病，因此抑制它们的分泌和磷酸化无疑对糖尿病肾病或慢性肾病的防治具有积极的价值。
Claims (8)
1.具有下述结构式的灵芝酚A(lingzhiol A)，
2.治疗糖尿病肾病的药物组合物，含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物和药学上可接受的载体。
3.治疗慢性肾病的药物组合物，含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物和药学上可接受的载体。
4.权利要求1所述的化合物在制备治疗糖尿病肾病的药物中的应用。
5.权利要求1所述的化合物在制备治疗慢性肾病的药物中的应用。
6.权利要求1所述的化合物在制备治疗糖尿病肾病的保健食品中的应用。
7.权利要求1所述的化合物在制备治疗慢性肾病的保健食品中的应用。
8.权利要求1所述的化合物的制备方法，取赤芝Ganoderma lucidum，粉碎，用95％乙醇回流提取，合并提取液并减压回收溶剂得粗提取物，将粗提取物混悬于适量水中，然后用等体积乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，减压浓缩得乙酸乙酯萃取物，经硅胶200-300目柱层析，99:1，98:2，97:3，96:4，95:5，94:6，93:7，92:8，90:10，85:15，80:20，50:50氯仿－甲醇***梯度洗脱，每种溶剂梯度为1.5倍柱体积，按照每份500mL收集得7个合并组份；组份4经硅胶柱层析，10:1:0.2氯仿/丙酮/醋酸洗脱得4个亚组份，其中组份4.3经MCI gel CHP20P柱层析MeOH/H2O,40-100％洗脱得4个亚组份，其中组份4.3.2经SephadexLH-20MeOH/H2O,80:20柱层析，根据薄层显色跟踪合并相同流份，合并组份经反相RP-18柱层析，甲醇-水40-60％洗脱，薄层指导合并斑点，然后经半制备反相RP-18高效液相色谱纯化，MeOH/H2O,40％洗脱，得化合物1，该化合物为消旋体，经手性拆分正己烷/乙醇，80:20洗脱得化合物(-)-1和(+)-1。
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| CN1434047A (zh) * | 2002-01-25 | 2003-08-06 | 中国医学科学院药用植物研究所 | 齿梗孢素b1及提取方法和在抗肿瘤药物中的应用 |
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- 2013-09-24 CN CN201310438223.1A patent/CN103435580B/zh active Active
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