CN102051408B - 用于***癌转移早期诊断的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于***癌转移早期诊断的两对引物对：第一引物对具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示的序列，第二引物对具有SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4所示的序列。本发明还提供一种用于***癌转移早期诊断的试剂盒，包含上述的两对引物对。该试剂盒还可包含具有SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示的序列的引物对，用于巢式PCR扩增。本发明通过甲基化特异性聚合酶链式反应来检测***癌组织中脑衰蛋白反应调节蛋白-4基因启动子区的甲基化状况来判定有无***癌的转移。该方法利用分子生物学原理，具有很高的特异性和准确率，可以在早期明确诊断出***癌的微小转移。

Description

用于***癌转移早期诊断的试剂盒

技术领域

本发明涉及用于***癌转移的诊断试剂盒，特别是用于***癌转移早期诊断的试剂盒。

背景技术

***癌在西方许多国家是男性最常见的恶性肿瘤。在美国，***癌更是占男性癌症死亡原因的第二位。近年来，我国的***癌发病率有明显增加，***癌已成为泌尿外科领域一个越来越重要的课题。***癌的治疗方案的选择主要根据患者年龄、一般状况、肿瘤分期及分级具体而定，也就是说在确定治疗方案之前必须首先明确患者及肿瘤的具体情况。肿瘤具体情况的明确依靠于正确的诊断。目前***癌的诊断主要有以下几种方法：

(1)直肠指诊：在体格检查中，直肠指诊是发现、诊断***癌的最有帮助的第一线检查，但是直肠指诊是一种非特异性的检查，发现***癌时常常病理分级已达恶性程度较高的级别，也即到了***癌的晚期。

(2)***特异性抗原测定：***特异性抗原是一种蛋白酶，通常只在***液和***测得，如果在血液中测得***特异性抗原存在，往往可作为患者发生良性或恶性***病变的标志。***特异性抗原作为单一检查，目前具有较好的***癌阳性诊断预测率，同样，它也帮助提高了许多小病灶、低分级***癌的发现率与诊断率。但是，有近30％***癌患者的血清***特异性抗原可能不升高，只在正常范围内(即***特异性抗原＜4.0ng/ml)波动。即使直肠指诊呈阴性、血清***特异性抗原＜4.0ng/ml的患者，仍有30％的***穿刺发现***癌的可能性。

(3)经直肠超声检查与***穿刺活检：经直肠超声检查是诊断***癌的一种非常有价值的手段，它可帮助医师检查患者的***以及周围组织结构寻找可疑病灶，并能初步判断肿瘤的体积大小。此外。它还能帮助引导医师进行***可触及或不可触及的病变的穿刺活检。而即便在超声引导下，***的***六点穿刺的假阳性率仍可高达23％～42％。经直肠超声检查在***癌诊断特异性方面也较低，发现一个***低回声病灶要与多种疾病相鉴别。

(4)其它影像学检查：(a)计算机断层扫描(CT)检查：由于CT检查不能显示正常***的三个带(外周带、中央带和移行带)，加之多数肿瘤组织的密度与正常腺体近似或相同，因此CT不能用来诊断早期***癌及***癌的早期转移；(b)磁共振扫描(MRI)：磁共振有很好的软组织分辨率，能直接多方向平面(三维)成像，因此，MRI对***的检查优于其它影像学方法。但经腹部MRI仅可发现60％的***癌，只可对57％的***癌患者进行准确的临床分期，同时对***癌的早期转移的诊断阳性率仍然较低。

综上所述，目前对***癌的诊断，尤其是***癌早期转移的诊断，仍然没有比较有效的方法。目前所使用的帮助进行***癌临床分期的方法，都存在着不能鉴别该肿瘤究竟是早期的器官局限肿瘤还是已经发生微转移的局部晚期癌的不足。而这种鉴别诊断对于患者的预后非常重要，因为如已发展为局部晚期癌，手术治愈的可能性就微乎其微了。据《吴阶平泌尿外科学》上卷第五十章《***肿瘤》指出：在术前诊断为器官局限性肿瘤的患者中有将近50％术后病理证实为局部晚期癌。如能术前明确***癌患者所患为器官局限肿瘤或是局部晚期癌，从而选择合适的治疗方案，将极大裨益于治疗效果的提高及患者生活质量的改善。

因此有必要提供一种新的***癌的诊断方法，尤其是***癌早期转移的诊断方法来克服现有技术中存在的缺陷。

发明内容

为了克服现有检查手段不能早期诊断***癌转移的不足，本发明的目的之一在于提供一种***癌转移早期诊断的方法，该方法利用分子生物学原理，能够明确诊断出***癌的转移，更重要的是对***癌的微小转移也能早期明确诊断。

本发明的另一目的在于提供一种用于***癌转移早期诊断的试剂盒，该试剂盒可以明确诊断出***癌的微小转移，准确率非常高。

为实现上述目的，本发明一方面提供一种***癌转移早期诊断的方法，该方法包括：(a)提取***癌组织的基因组DNA；(b)分别利用SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2所示的M引物对和SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示的U引物对，使用甲基化特异性聚合酶链式反应(Methylation specific PCR，MSP)进行PCR扩增；(c)对上述PCR扩增的产物进行电泳；(d)根据特异性条带的有无来判断是否发生转移。

在本发明的另一个实施方式中，在步骤(b)之前还使用SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的外引物对来扩增所述基因组DNA，随后再进行步骤(b)，即采用巢式PCR对基因组DNA进行扩增，以增加本发明方法的灵敏度，使结果更加稳定可靠。

另一方面，本发明提供一种用于***癌转移早期诊断的试剂盒，其包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示的M引物对；和SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示的U引物对。在优选的实施方式中，所述试剂盒还包括SEQ ID NO：5和SEQID NO：6所示的外引物对。在实际应用中，本发明的试剂盒还包含PCR反应液、基因组DNA提取试剂中的一种或多种，以方便操作。所述PCR反应液具有广泛的涵义，通常包含PCR反应体系中除引物对以外的其他组分，例如dNTP、PCR缓冲液、聚合酶等；所述基因组DNA提取试剂具有广泛的含义，通常包含提取基因组DNA所需的各种试剂，例如苯酚、氯仿、异丙醇等。

本发明通过甲基化特异性聚合酶链式反应来检测***癌组织中脑衰蛋白反应调节蛋白-4(Collapsin response mediator protein-4，CRMP4)基因启动子区的甲基化状况来判定有无***癌的转移。该方法利用分子生物学原理，具有很高的特异性和准确率，可以在早期明确诊断出***癌的微小转移。

附图说明

图1是显示经本发明的方法对各样本处理后的PCR产物的电泳结果图。

具体实施方式

以下将结合实验和附图对本发明作详细描述。

发明原理

脱氧核糖核酸(DNA)甲基化是指DNA分子上CpG双核苷酸中的胞嘧啶(C)处于甲基化状态，即一个甲基团以共价键的形式结合到CpG双核苷酸上胞嘧啶的5-碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶。在基因组转录区，CpG相互聚集，称之为CpG岛(CpG islands)。CpG岛一般长0.5～2.0kb，常位于5’端基因启动子区。在正常细胞中，大多数管家基因的5’CpG岛处于非甲基化状态；而在肿瘤细胞中，许多基因的CpG岛则表现为异常的高甲基化。DNA甲基化并不改变核苷酸的序列，而是通过改变染色体结构和组蛋白乙酰化作用的水平等，从而间接导致基因转录抑制，也就是使其表达下调。

CRMP4基因作为CRMP家族的一个成员，是参与神经元分化和突触重组调控的重要分子。但研究发现，CRMP4在***癌中是抑制***癌转移的抑癌基因，其在转移性***癌中的表达较良性***增生及局限性***癌明显下调，表达下调的原因之一是因为CRMP4启动子区存在着明显的高甲基化状态。因而，检测CRMP4启动子区的甲基化状态的高低就可以明确***癌有无转移，即CRMP4启动子区高甲基化提示***癌有转移，CRMP4启动子区低或无甲基化提示***癌没有转移。影响CRMP4基因表达的CpG位点，关键的有以下10个：-848、-841、-690、-680、-678、-674、-671、-665、-660、-658。因此，检测这10个位点甲基化的程度即可判断***癌是否发生转移，检测方法即为MSP法。

MSP的原理：双链DNA变性解链后，在亚硫酸氢盐(HSO₃ ^-)作用下发生胞嘧啶(C)→尿嘧啶(U)转化，C若已有甲基化则无此改变。但是，甲基化修饰只发生于5′→3′方向C-G(胞嘧啶-鸟嘌呤)相联结构的C上。因此，在HSO₃ ^-作用后，DNA CpG位点若无甲基化，则序列中的改变为C→U，CG→UG；若有甲基化则为C→C，CG→CG。因而用不同的引物做PCR，即可检测出这种差异，从而确定基因有无CpG岛甲基化。根据目的基因修饰前后的改变，相应设计M(甲基化)和U(非甲基化)引物，如果M引物可以扩增，则判定存在甲基化；如果U引物可以扩增，则判定为非甲基化；如果M和U引物同时得到扩增，则判定这些CpG位点同时存在甲基化和非甲基化两种状态。

将扩增的产物进行电泳，即可判断相应引物(M引物和U引物)是否扩增得到特异性片段，根据片段的有无来判断对应基因是否存在甲基化。存在甲基化者，可以判定***癌已发生转移。

实施例

一、引物

在本发明的实施例中，根据上述原理设计出的引物如下：

M引物对(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)：

正义引物：TTTTTGTAGTTTTTGAGAGCGAGTTAC；

反义引物：CTCTACCATAACGCGAATCGAATACGACG；

扩增得到的片断为222bp。

U引物对(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)：

正义引物：GTTTTTTGTAGTTTTTGAGAGTGAGTTAT；

反义引物：CTCTCCTCTACCATAACACAAATCAAATACAACA；

扩增得到的片断为226bp。

外引物对(SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6)

正义引物：TGATTTTGAGATTTAGTTAGGTAGTG；

反义引物：TTTCCTCTTTACATCTACCTCAC；

扩增得到的片断为612bp。

二、方法步骤

1.基因组DNA的提取

在本发明中，基因组DNA的提取使用酚氯仿法，当然本领域的技术人员可以预期到，也可以使用本领域已知的其他方法来提取基因组DNA。另外，该实施例中所使用的试剂和试剂的量仅是示例性的，本领域技术人员可根据实际情况作相应调整。如不特别指出，所用双蒸水(DDW)、EP管均经高压蒸汽灭菌。

1)取新鲜或冰冻***癌组织块0.1g，尽量剪碎后置于玻璃匀浆器中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml离心管中，加入蛋白酶K(500μg/ml)20μl，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000rpm离心5min，取上清液入另一离心管中；

2)加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100μl吸头挑出，晾干，用200μl TE重新溶解；

3)加等量的酚、氯仿、异戊醇振荡混匀，离心12000rpm，5min；

4)取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿∶异戊醇，振荡混匀，离心12000rpm，5min；

5)取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/L乙酸氨，再加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2min，离心12000rpm，10min；

6)小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残液除掉；

7)用1ml 70％乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000rpm，5min；

8)小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥；

9)加200μl TE重新溶解沉淀物，然后置于-20℃保存备用。

2.亚硫酸氢钠修饰基因组DNA

1)将约2μg DNA于1.5ml EP管中使用DDW稀释至50ul；

2)加5.5μl新鲜配制的3M NaOH；

3)42℃水浴30min；

4)加30μl 10mM对苯二酚(氢醌)至上述水浴后混合液中(溶液变成淡黄色)；

5)加520μl 3.6M亚硫酸氢钠(配制方法例如：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至pH5.0(要准确)，最终体积为5ml；大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解)至上述水浴后溶液中；

6)EP管外裹以铝箔纸(避光)，轻柔颠倒混匀溶液；

7)加200μl石蜡油(防止水分蒸发，限制氧化)，并在50℃避光水浴16h。

3.修饰后DNA的纯化回收

根据本发明，可使用本领域已知的任何合适的方法来纯化回收修饰后的DNA，例如可使用市售的合适的回收试剂盒来完成该步骤。以下是使用市售的Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收***(Promega，A7280)进行修饰后DNA纯化回收的一个例子，具体步骤如下。

1)将移液器枪头伸入石蜡油层下，先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出，然后吸取混合液至一洁净1.5mlEP管中；

2)以下使用Promega A7280 DNA纯化回收***

a)70℃水浴预热DDW；配制80％异丙醇；

b)加1ml Promega Wizard DNA Clean-up树脂，轻柔颠倒混匀，使DNA充分与树脂结合；

c)将注射器针筒与试剂盒提供的回收小柱紧密连接后，将上述混合物用移液器移至针筒内，用2ml以上的EP管放置小柱下接收废液。加针栓，轻轻加压，将液体挤出，此时可见小柱内有白色的树脂沉积；

d)将注射器与小柱分离后拔出针栓，再将针筒与小柱连接，向针筒内加入2ml 80％的异丙醇，***针栓，轻轻加压，将异丙醇挤出；

e)将注射器与小柱分离，将小柱置于洁净1.5ml洁净EP管上，离心12000rpm，2min，以甩去残余异丙醇成分，使树脂干燥(此时，修饰后DNA处于与树脂结合的状态)；

f)将小柱取下置于另一洁净1.5mlEP管上，移液器加50ul预热好的DDW，室温放置5min；离心12000rpm，20s(此为洗脱步骤)，此时EP管内液体即为洗脱的修饰后DNA溶液，终体积为50ul；

3)加5.5μl新鲜配制的3M NaOH，室温放置15min；

4)加33μl 10M乙酸铵，以中和NaOH，使溶液pH于7.0左右。

5)加4μl 10mg/ml糖原(作为沉淀指示剂)；

6)加270μl冰无水乙醇，置于-20度，过夜沉淀；

7)4℃，12000rpm离心，30min，倒去上清液，收集沉淀(不必吸净)；

8)加500μl 70％乙醇(不要将沉淀吹打起来，只要把乙醇加上即可)，轻柔倾斜EP管，旋转一圈，再次离心，4℃ 12000rpm，5min；离心后倒掉上清，再加同量乙醇，同样再做一遍(此为洗涤步骤，共2次)；

9)倒掉上清，并常温简短离心后，将附壁乙醇离至EP管底，移液器小心将残余液体吸净，室温干燥5min，或沉淀由不透明变为半透明或透明时，加入20-30μl DDW，溶解沉淀；-20℃保存DNA溶液。

4.对修饰后DNA进行MSP

本领域技术人员可意识到，可使用合适的手段(例如试剂盒)进行MSP，以下以TaKaRa Taq^TM(编号DR001A)试剂盒为例进行说明。在本发明的方法中，可采用两种PCR方法进行MSP，分别为(1)直接PCR法或(2)巢式PCR法。

(1)直接PCR法

按下表1所示建立反应体系，并按下表2所示的条件进行PCR扩增：

表1反应体系

表2反应条件

94℃    1min         1个循环

98℃    10sec

64℃    30sec        30个循环

72℃    30sec

(2)另外，在本步骤中，可使用巢式PCR对基因组DNA进行扩增，具体方法及条件如下：

按下表3所示建立反应体系，并按下表4所示的条件进行外引物PCR扩增：

表3反应体系

表4反应条件

95℃    1min         1个循环

98℃    10sec

55℃    30sec        30个循环

72℃    30sec

在使用外引物对扩增后，再取适量外引物扩增产物，以上述M引物对和U引物对作为内引物进行PCR扩增，按下表5所示建立反应体系，并按下表6所示的条件进行PCR扩增：

表5反应体系

表6反应条件

94℃    1min         1个循环

94℃    30sec

64℃    30sec        30个循环

72℃    30sec

5.MSP产物的凝胶电泳

1)取12μl PCR产物(直接PCR产物)进行3％琼脂糖凝胶电泳；

2)在紫外灯下观察电泳条带，以确定是否得到特异性条带。

利用上述方法步骤，以具有转移性性质的组织和不具有转移性质的组织进行实验，得到的各样本的电泳结果见图1。在图1中显示的有：局限性***癌(L1、L2、L3、L4、L5)，转移性***癌(M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7)，***癌细胞系(PC3、PC3M、DU145)，***增生(BPH1、BPH2)，正常***(N1、N2)，局限性***癌***(L3-LN、L4-LN、L5-LN)和转移性***癌***(M5-LN、M6-LN、M7-LN)。结果可见所有具有转移特性的***癌细胞系、多数转移性***癌和转移性***癌***可见甲基化条带(即M条带)。利用巢式PCR产物进行MSP产物的凝胶电泳，可得到比图1的结果效果更好的图片，且结果更加可靠和稳定。

本发明具有很高的特异性，因CRMP4只在转移性***癌中表达下调(原因之一即为甲基化)，在其它肿瘤(比如肝癌、肺癌、胃癌等)未观察到此现象，因而只有在转移性***癌中才存在CRMP4甲基化现象。另外本发明也具有很高的准确性，每个标本重复3次，结果相同。在5/7的转移性***癌标本及所有转移特性的***癌细胞系中，都能扩增甲基化条带。本发明仅需2.5-25ngDNA(100mg组织或者更少)即可检测。

本领域技术人员可以预期到，也可使用巢式PCR进行本发明的MSP方法，以增加本发明方法的准确性和特异性。

以上所述仅为本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明的范围。根据本发明的公开内容所作出的改进、等同变化均应包含在本发明的保护范围内。

序列表

<110>申请人：高新

<120>用于***癌转移早期诊断的试剂盒

<160>6

<210>1

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

tttttgtagt ttttgagagc gagttac   27

<210>2

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ctctaccata acgcgaatcg aatacgacg 29

<210>3

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gttttttgta gtttttgaga gtgagttat 29

<210>4

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ctctcctcta ccataacaca aatcaaatac aaca 34

<210>5

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

tgattttgag atttagttag gtagtg          26

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

tttcctcttt acatctacct cac             23

Claims (5)

1. 用于***癌转移早期诊断的两对引物对，其特征在于，第一引物对具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示的序列，第二引物对具有SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示的序列，并通过其甲基化特异性聚合酶链式反应，来检测***癌组织中脑衰蛋白反应调节蛋白-4基因启动子区的甲基化状况，以判定有无***癌的转移。

2. 一种用于***癌转移早期诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2的第一引物对和SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4的第二引物对，并通过其甲基化特异性聚合酶链式反应，来检测***癌组织中脑衰蛋白反应调节蛋白-4基因启动子区的甲基化状况，以判定有无***癌的转移。

3. 如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的外引物对。

4. 如权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含PCR反应液。

5. 如权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含基因组DNA提取试剂。

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