CN107406880A

CN107406880A - 用于检测癌症的生物标志物组

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Publication number: CN107406880A
Application number: CN201680010907.3A
Authority: CN
Inventors: 芭芭拉·伯温克尔; 杨荣西; 安德烈亚斯·施内魏斯
Original assignee: Universitaet Heidelberg
Current assignee: Universitaet Heidelberg
Priority date: 2015-02-24
Filing date: 2016-02-24
Publication date: 2017-11-28
Also published as: EA037995B1; EA201791578A1; MX2017010836A; JP2018509934A; EP3262190A1; CA2975952A1; WO2016135168A1; UA124612C2; EP3262190B1; IL253756A0; US10941451B2; AU2016223532B2; US20180245159A1; AU2016223532A1; IL253756B; HK1246828A1; ES2893297T3; JP6807873B2; PL3262190T3; BR112017018008A2

Abstract

本发明涉及甲基化和miRNA的标志物组及其在预后、诊断和/或治疗癌症中的用途，用于检测所述标志物的装置，包含所述装置的试剂盒，以及用于分析所述标志物组的设备。

Description

用于检测癌症的生物标志物组

背景技术

癌症是世界上最重要的医疗和健康问题之一。作为全世界死亡的主要原因，2008年有1240万例新发癌症病例和760万例癌症相关死亡。预测在全世界由癌症导致的死亡持续升高，并且在2030年将有1200万例死亡由癌症造成。乳腺癌(breast cancer)是女性中最常见的癌症。约有九分之一的女性在其生命期间会发生乳腺癌(Feuer，E.J.等，Thelifetime risk of developing breast cancer.J Natl Cancer lnst 85，892-897(1993))。每年全世界约有130万女性发生乳腺癌。由于在早期诊断和治疗中做出的所有努力和进展，近年来死亡率持续下降(Jemal A，Bray F，Center MM，Ferlay J，Ward E，FormanD.Global cancer statistics.CA Cancer J Clin2011；61：69-90)。然而，每年仍有数千名女性死于这种疾病。在美国女性中，当在早期阶段诊断出时，五年总体存活率为98％，相对而言，当疾病已经扩散到远端器官时为23％。因此，早期乳腺癌检测属于与这种疾病作斗争的主要挑战之一。目前，***摄影筛选(mammographic screening)被用作诊断标准。然而，由于其使用电离辐射并且假阳性率为8％至10％，还依赖于被筛选个体的年龄而具有限制(Taplin S，Abraham L，Barlow WE，Fenton JJ，Berns EA，Carney PA，Cutter GR，SicklesEA，Carl D，Elmore JG.Mammography facility characteristics associated withinterpretive accuracy of screening mammography.J Natl Cancer Inst2008；100：876-87)。

大多数乳腺癌散发性发生，而家族性乳腺癌占所有乳腺癌病例的约10％(Fackenthal，J.D.和Olopade，O.I.Breast cancer risk associated with BRCA1andBRCA2in diverse populations.Nat Rev Cancer 7，937-948(2007))。在所有家族性病例中，主要乳腺癌相关基因BRCA1和BRCA2中的突变占25％，其他中和低外显率基因中的突变占约5％(Yang，R.和Burwinkel，B.(编辑).Familial risk in breast cancer，251-256(Springer，2010))。最近的全基因组关联研究(genome-wide association study，GW AS)和单候选基因方法在检测乳腺癌的遗传性低风险变体方面已经相当成功(Thomas，G.等.Amultistage genome-wide association study in breast cancer identifies two newrisk alleles at 1p 11.2 and 14q24.1(RAD51L1).Nat Genet 41，579-584(2009)；Cox，A.等.A common coding variant in CASP8is associated with breast cancerrisk.Nat Genet 39，352-358(2007)；Stacey，S.N.等.Common variants on chromosome5p12 confer susceptibility to estrogen receptor-positive breast cancer.NatGenet 40，703-706(2008)；Ahmed，S.等.Newly discovered breast cancersusceptibility loci on 3p24 and 17q23.2.Nat Genet 41，585-590(2009)；Easton，D.F.等.Genome-wide association study identifies novel breast cancersusceptibility loci.Nature 447，1087-1093(2007)；Milne，R.L.等.Risk of estrogenreceptor-positive and-negative breast cancer and single-nucleotidepolymorphism 2q35-rs13387042.J Natl Cancer Inst 101，1012-1018(2009)；Frank，B.等.Association of a common AKAP9variant with breast cancer risk：acollaborative analysis.J Natl Cancer Inst100，437-442(2008))。然而，大量乳腺癌风险因子仍有待探索。

与BC相比，卵巢癌(ovarian cancer，OvCa)的发生相对罕见，但由于其高恶性程度而是妇科癌症死亡的主要原因。在2008年，全世界有225,000位女性被诊断患有卵巢癌，并且这些女性中有140,000人死于这种疾病。通常，患有OvCa的女性几乎没有早期症状，并且因此近四分之三的卵巢癌病例在晚期阶段显现，其中疾病已充分扩散到卵巢以外。胰腺癌(pancreatic cancer，PaCa)是所有上皮恶性肿瘤中最具侵袭性的。全世界有279,000例新诊断的PaCa，PaCa患者的5年总体存活率低于5％。虽然最近的全基因组关联研究(GWAS)已经成功地检测到与BC、OvCa和PaCa的风险相关的数种遗传变体，但是仍没有鉴定出用于早期检测BC的有价值标志物。

转移性乳腺癌(metastatic breast cancer，MBC)是全世界的主要健康问题。目前的治疗策略主要靶向姑息护理，但是只有很少病例被治愈。处理MBC的可替选方法是开发筛选方法和应用生物标志物以鉴定高风险组群和治疗响应。这可以有利于临床医生做出决策，并帮助他们针对患者采取合适的治疗方案。

已经提出将循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)作为用于转移，特别是用于无进展存活和总体存活的经FDA批准的独立预后标志物。已经将每7.5ml血液大于5个CTC的基本截留值限定为CTC阳性(Cristofanilli M，Budd GT，Ellis MJ，Stopeck A等；Circulating tumor cells，disease progression，and survival in metastatic breastcancer；N Engl J Med.2004年8月19日；351(8)：781-91)。然而，重要的是注意到，显著部分具有明显远端转移的患者是CTC阴性的。这可能部分地是由于CTC中的上皮-间充质转化现象，在这种情况下，其可被利用上皮标志物(例如EpCAM或细胞角蛋白-8、-18和-19)的表达的计数技术所忽略。

除CTC之外，基于蛋白质的循环肿瘤标志物(例如癌胚抗原(carcinoembryonicantigen，CEA)和糖类抗原15-3(carbohydrate antigen 15-3，CA 15-3))也被广泛用作预后标志物，以及用于监测乳腺癌治疗成功和随访(Uehara M，Kinoshita T，Hojo T，Akashi-Tanaka S，Iwamoto E，Fukutomi T.Long-term prognostic study of carcinoembryonicantigen(CEA)and carbohydrate antigen 15-3(CA 15-3)in breast cancer.Int J ClinOncol 2008；13：447-51；Harris L，Fritsche H，Mennel R，Norton L，Ravdin P，Taube S，Somerfield MR，Hayes DF，Bast RC，Jr.American Society of Clinical Oncology 2007update of recommendations for the use of tumor markers in breast cancer.JClin Oncol 2007；25：5287-312)。然而，这些标志物的灵敏度低。因此，需要新的灵敏性且特异性的并且侵入性最低的标志物。

表观遗传变化定义为不是由于基因组DNA序列中的任何变化的基因表达变化。异常表观遗传标记已被认为是人癌症的标志(Esteller，M.Cancer epigenomics：DNAmethylomes and histone-modification maps.Nat Rev Genet 8，286-298(2007))。最重要的表观遗传标记之一DNA甲基化在基因活性的控制和细胞核的结构中具有关键作用(Weber，M.等.Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites ofdifferential DNA methylation in normal and transformed human cells.Nat Genet37，853-862(2005))。此外，与遗传标记或变体不同，DNA甲基化主要是可逆的。因此，特定基因的甲基化谱被认为是治疗靶标(Mack，G.S.Epigenetic cancer therapy makesheadway.J Natl Cancer Inst 98，1443-1444(2006))。同时，由于可变特性，DNA甲基化可以用作环境因素与基因组之间的联系。由环境因素或衰老调节的DNA甲基化可以改变细胞关键基因的表达，并且从而诱导细胞的恶性转化或甚至癌症(Widschwendter，M.，等.Epigenotyping in peripheral blood cell DNA and breast cancer risk：a proof ofprinciple study.P LoS One 3，e2656(2008))。

作为癌症发生的早期事件，DNA甲基化的变化特别有希望作为癌症早期检测的标志。最近的研究表明，血细胞DNA的甲基化分析可以用作可靠且稳健的标志。深入研究已经在体细胞水平上揭示了癌症中DNA甲基化标记的改变，然而只有少数利用候选基因方法的研究已经对癌症中外周血DNA中的甲基化标记进行了分析。

之前的研究已经研究了与其正常的相邻组织相比乳腺癌中肿瘤抑制基因的启动子区中的超甲基化和癌基因的启动子区中的低甲基化(Ito，Y.等.Somatically acquiredhypomethylation of IGF2in breast and colorectal cancer.Hum Mol Genet 17，2633-2643(2008)；Potapova，A.，Hoffman，A.M.，Godwin，A.K.，Al-Saleem，T.和Cairns，P.Promoter hypermethylation of the PALB2 susceptibility gene in inherited andsporadic breast and ovarian cancer.Cancer Res 68，998-1002(2008)；Radpour，R.等.Methylation profiles of 22 candidate genes in breast cancer using high-throughput MALDI-TOF mass array.Oncogene 28，2969-2978(2009)；Widschwendter，M.和Jones，P.A.DNA methylation and breast carcinogenesis.Oncogene 21，5462-5482(2002))。非常少的研究集中在外周血DNA中的甲基化标记与乳腺癌风险。在这些研究中，仅研究了特定基因，例如BRCA1(Iwamoto，T.，Yamamoto，N.，Taguchi，T.，Tamaki，Y.和Noguchi，S.BRCA1 promoter methylation in peripheral blood cells is associatedwith increased risk of breast cancer with BRCA1promoter methylation.BreastCancer Res Treat 129，69-77(2011))、ATM(Flanagan，J.M.等.Gene-bodyhyperrnethylation of ATM in peripheral blood DNA of bilateral breast cancerpatients.Hum Mol Genet 18，1332-1342(2009))，以及特定途径中的基因(Widschwendter等.(2008)，同上)。

因此，在本领域中需要鉴定乳腺癌和其他癌症的另外表观遗传标志物，其优选地允许通过凭借低侵入性方式获得样品(例如，通过采集血液样品)来鉴定受影响的对象。

miRNA是通过降解mRNA分子或阻断其翻译来在转录后水平调节基因表达的小的非编码RNA(长度为约18至25个核苷酸)(Bartel DP.：MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function.Cell 2004；116：281-97)。因此，其在调节包括癌症在内的大量生物过程中具有必要作用(Calin GA，Dumitru CD，Shimizu M，Bichi R，Zupo S，Noch E，Aldler H，Rattan S，Keating M，Rai K，Rassenti L，Kipps T，等Frequent deletions anddown-regulation of micro-RNA genes miR15and miR16at13q14in chroniclymphocytic leukemia.Proc Natl Acad Sci U S A 2002；99：15524-9)。在标准命名***下，给实验确认的miRNA分配了名称。在前缀“mir”之后是破折号和数字。未大写的“mir-”是指前miRNA，而大写的“miR-”是指成熟的形式。除一个或两个核苷酸外具有几乎相同序列的miRNA用额外的小写字母注释。来源物种用三字母前缀指定，例如has用于智人(Homosapien)(人)。来源于相同前miRNA的相对臂的两种成熟miRNA用-3p或-5p后缀表示。

循环miRNA定义为存在于体液的无细胞组分(例如血浆、血清等)中的miRNA。Lawrie等(Lawrie CH，Gal S，Dunlop HM，Pushkaran B，Liggins AP，Pulford K，BanhamAH，Pezzella F，Boultwood J，Wainscoat JS，Hatton CS，Harris AL.Detection ofelevated levels of tumour-associated microRNAs in serum of patients withdiffuse large B-cell lymphoma.Br J Haematol 2008；141：672-5)首次证明体液中存在miRNA。从那时起，循环miRNA已经被报道为在不同类型癌症(例如***癌、结直肠癌或食管癌)中的血浆或血清中异常表达(Brase JC，Johannes M，Schlomm T，Falth M，Haese A，Steuber T，Beissbarth T，Kuner R，Sultmann H.Circulating miRNAs are correlatedwith tumor progression in prostate cancer.Int J Cancer 2011；128：608-16.；HuangZ，Huang D，Ni S，Peng Z，Sheng W，Du X.Plasma microRNAs are promising novelmarkers for early detection of colorectal cancer.Int J Cancer 2010；127：118-26.；Zhang C，Wang C，Chen X，Yang C，Li K，Wang J，Dai J，Hu Z，Zhou X，Chen L，ZhangY，Li Y，等.Expression profile of microRNAs in serum：a fingerprint foresophageal squamous cell carcinoma.Clin Chem 2010；56：1871-9.)。其最重要的优点包括以侵入性最低的方式重复测量的可能性以及其在血浆/血清中的显著稳定性，其中其大部分在外排体外循环并且由于其与Argonaute蛋白结合而是稳定的(Mitchell PS，Parkin RK，Kroh EM，Fritz BR，Wyman SK，Pogosova-Agadjanyan EL，Peterson A，Noteboom J，O′Briant KC，Allen A，Lin DW，Urban N，等.Circulating microRNAs asstable blood-based markers for cancer detection.Proc Natl Acad Sci U S A2008；105：10513-8；Turchinovich A，Weiz L，Langheinz A，BurwinkelB.Characterization of extracellular circulating microRNA.Nucleic Acids Res2011；39：7223-33；Arroyo JD，Chevillet JR，Kroh EM，Ruf IK，Pritchard CC，Gibson DF，Mitchell PS，Bennett CF，Pogosova-Agadjanyan EL，Stirewalt DL，Tait JF，TewariM.Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAsindependent of vesicles in human plasma.Proc Natl Acad Sci U S A 2011；108：5003-8)。

因此，本领域迫切需要用于对乳腺癌、特别是原发性乳腺癌和转移性乳腺癌进行诊断和预后的经改进方法。这些方法优选地还可用于预防性筛选表观健康的对象，低级侵入性是优选的。

发明概述

在第一方面，本发明涉及在对象中预后和/或诊断癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的方法，其包括在对象中：(a)确定选自HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P、DYRK4的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平，以及(b)确定选自miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127-3p、miR-409-3p、miR-148b的至少一种miRNA标志物的存在、特别是量，其中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平以及至少一种miRNA的存在指示所述对象的预后和/或诊断。

在第二方面，本发明涉及确定用于在对象中改变癌症或者预防或治疗癌症的药物剂量的方法，其包括以下步骤：(a)确定对象的样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量，以及任选地确定参考中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量，用于与目的样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量进行比较；以及(b)根据目的样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量，任选地根据目的样品与参考或参考样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量的比较来确定药物剂量。

在第三方面，本发明涉及调整用于改变癌症或者预防或治疗癌症的药物剂量的方法，其包括以下步骤：(a)确定样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量；(b)确定一个或更多个参考或参考样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量；(c)针对所述目的样品中存在的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量是否不同于一个或更多个参考或参考样品中的水平来检测受试样品；以及(d)根据目的样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量是否不同于一个或更多个参考或参考样品中的水平来调整药物剂量。

在第四方面，本发明涉及确定物质对癌症或癌症发生的有益和/或不利作用的方法，其包括以下步骤：(a)确定目的样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量，(b)确定一个或更多个参考或参考样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量，以及(c)针对所述目的样品中存在的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量是否不同于一个或更多个参考或参考样品中的水平来考察目的样品，其中目的样品与一个或更多个参考或参考样品不同地暴露于所述物质。

在第五方面，本发明涉及鉴定患者为癌症治疗的响应者的方法，其包括确定第一样品中和继第一样品之后取得的一个或更多个另外样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或至少一种甲基化标志物的表达水平以及至少一种miRNA的量，其中至少一种甲基化标志物的甲基化状态提高和/或至少一种甲基化标志物的表达水平较低以及至少一种miRNA标志物不存在或量降低指示针对治疗的响应。

在第六方面，本发明涉及鉴定患者为癌症治疗的非响应者的方法，其包括确定第一样品中和继第一样品之后取得的一个或更多个另外样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或至少一种甲基化标志物的表达水平以及至少一种miRNA的量，其中至少一种甲基化标志物的甲基化状态降低和/或至少一种甲基化标志物的表达水平提高以及至少一种miRNA标志物存在或量升高指示缺乏针对治疗的响应。

在第七方面，本发明涉及治疗癌症的方法，其包括以下步骤：(i)确定对象的第一样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或至少一种甲基化标志物的表达水平以及至少一种miRNA的量；(ii)开始用包含一种或更多种抗癌剂或治疗的第一治疗方案治疗所述患者；(iii)确定所述对象的一个或更多个随后取得的另外样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或至少一种甲基化标志物的表达水平以及至少一种miRNA的量；(iv)任选地重复步骤(ii)和(iii)一次或更多次；(v)如果至少一种甲基化标志物的甲基化状态显著提高和/或至少一种甲基化标志物的表达水平较低以及至少一种miRNA标志物的量降低或不存在，则继续用第一治疗方案治疗患者；或者(vi)如果至少一种甲基化标志物的甲基化状态降低和/或至少一种甲基化标志物的表达水平提高以及至少一种miRNA标志物的量升高或存在，则修改治疗或终止用第一治疗方案治疗患者并且作为替代用包含未包含在第一治疗方案中的一种或更多种抗癌剂或治疗的第二治疗方案治疗患者。

在第八方面，本发明涉及用于对以下进行预后和/或诊断的装置：i.发生癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的风险；ii.癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的存在；和/或iii.癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的进展，所述装置包含：a)检测至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平的一个或更多个装置，以及b)检测至少一种miRNA标志物的量的一个或更多个装置。

在第九方面，本发明涉及试剂盒，其包含第八方面的装置。

在第十方面，本发明涉及第八方面的装置或第九方面的试剂盒用于对以下进行预后和/或诊断的用途：i.发生癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的风险；ii.癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的存在；和/或iii.癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的进展。

在第十一方面，本发明涉及用于鉴定癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的设备，其包含：(a)分析单元，所述分析单元包含：(i)用于确定对象的样品中选自HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P、DYRK4的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平的检测剂，以及(ii)用于确定对象的样品中选自miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127-3p、miR-409-3p、miR-148b的至少一种miRNA的存在的检测剂；以及(b)包含数据处理器的评估单元，所述数据处理器有形地(tangibly)嵌入有用于进行通过分析单元确定的量与参考的比较的算法，并且能够生成包含基于所述比较建立的诊断结果的输出文件。

附图说明

图1：对用于早期检测乳腺癌的基于血液之生物标志物组的样品描述

图2：三轮验证中8种基因的甲基化差异

图3：DNA甲基化标志物组在其他中心的样品中区分BC病例与健康对照的辨别力

图4：DNA甲基化标志物组和miRNA标志物组在来自我们组的样品中区分BC病例与健康对照的辨别力

图5：具有不同临床特征的散发性BC患者(来自第二轮验证的病例)中8种基因的甲基化水平

图6：具有不同临床特征的散发性BC患者(来自我们组的病例)中8种基因的甲基化水平

图7：对用于早期检测胰腺癌的基于血液之生物标志物组的样品描述

图8：PaCa病例和对照的基因中的甲基化差异的比较

图9：按性别分层的PaCa病例和对照的基因中的甲基化差异的比较

图10：基因中的甲基化区分PaCa病例与健康对照的辨别力

图11：具有不同临床特征的PaCa患者中基因的甲基化

图12：对用于早期检测卵巢癌的基于血液之生物标志物组的样品描述

图13：OvCa病例和对照的基因中的甲基化差异的比较

图14：基因中的甲基化区分OvCa病例与健康对照的辨别力

图15：HYAL2中乳腺癌相关CpG岛岸(CpG island shore)的确定

图16：白细胞中S100P、SLC22A18和DYRK4的甲基化与表达之间的反相关

图17：通过Illumina 450K得到的HYAL2 CpG位点的甲基化水平

图18：通过Illumina 450K得到的S100P CpG位点的甲基化水平

图19：通过Illumina 450K得到的SLC22A18 CpG位点的甲基化水平

图20：通过Illumina 450K得到的DYRK4 CpG位点的甲基化水平

图21：通过Illumina 450K得到的FUT7 CpG位点的甲基化水平

图22：通过Illumina 450K得到的RAPSN CpG位点的甲基化水平

图23：通过Illumina 450K得到的RPTOR CpG位点的甲基化水平

图24：通过Illumina 450K得到的MGRN1 CpG位点的甲基化水平

图25：白细胞中HYAL2的甲基化与表达之间的反相关。(a)盒形图示出了来自36个散发性BC病例和40个健康对照的白细胞中HYAL2-A扩增子中cg27091787和相邻CpG位点的甲基化水平。cg27091787的盒形图框在方框中用于强调。(b)盒形图示出了来自散发性BC病例和健康对照的白细胞中HYAL2的表达水平。通过Mann-Whitney U检验计算所提出的p值。圆圈表示异常值。(c)白细胞中cg27091787的甲基化水平与HYAL2表达之间的反相关。

图26：经分选的白细胞级分中HYAL2-A扩增子中四个CpG位点的甲基化水平。在来自七个散发性BC病例和14个健康对照的样品(来自全血和来自经分选白细胞级分的DNA)中以一式三份测量甲基化水平。通过t检验计算病例与对照之间的甲基化差异。cg27091787的甲基化水平通过盒形图表示。圆圈表示异常值。

序列表

SEQ ID NO：1 hsa-miR-652-3p(MIMAT0003322)：aauggcgccacuaggguugug

SEQ ID NO：2 hsa-miR-652-5p(MIMAT0022709)：caacccuaggagagggugccauuca

SEQ ID NO：3 位于1号染色体：28847698-28847793上的miR-801：

gauugcucugcgugcggaaucgac

SEQ ID NO：4 hsa-miR-376c-3p(MIMAT0000720)：aacauagaggaaauuccacgu

SEQ ID NO：5 hsa-miR-376c-5p(MIMAT0022861)：gguggauauuccuucuauguu

SEQ ID NO：6 hsa-miR-376a-3p(MIMAT0000729)：aucauagaggaaaauccacgu

SEQ ID NO：7 hsa-miR-376a-5p(MIMAT0003386)：guagauucuccuucuaugagua

SEQ ID NO：8 hsa-miR-127-3p(MIMAT0000446)：ucggauccgucugagcuuggcu

SEQ ID NO：9 hsa-miR-127-5p(MIMAT0004604)：cugaagcucagagggcucugau

SEQ ID NO：10 hsa-miR-409-3p(MIMAT0001639)：gaauguugcucggugaaccccu

SEQ ID NO：11 hsa-miR-409-5p(MIMAT0001638)：agguuacccgagcaacuuugcau

SEQ ID NO：12 hsa-miR-148b-3p(MIMAT0000759)：ucagugcaucacagaacuuugu

SEQ ID NO：13 hsa-miR-148b-5p(MIMAT0004699)：aaguucuguuauacacucaggc

SEQ ID NO：14 HYAL2(NM_003773.4)

SEQ ID NO：15 HYAL2(NM_033158.4)

SEQ ID NO：16 HYAL2(NP_003764.3)

SEQ ID NO：17 HYAL2(NP_149348.2)

SEQ ID NO：18 MGRN1(NM_001142289.2)

SEQ ID NO：19 MGRN1(NM_001142290.2)

SEQ ID NO：20 MGRN1(NM_001142291.2)

SEQ ID NO：21 MGRN1(NM_015246.3)

SEQ ID NO：22 MGRN1(NP_001135761.2)

SEQ ID NO：23 MGRN1(NP_001135762.1)

SEQ ID NO：24 MGRN 1(NP_001135763.2)

SEQ ID NO：25 MGRN1(NP_056061.1)

SEQ ID NO：26 RPTOR(NM_001163034.1)

SEQ ID NO：27 RPTOR(NM_020761.2)

SEQ ID NO：28 RPTOR(NP_001156506.1)

SEQ ID NO：29 RPTOR(NP_065812.1)

SEQ ID NO：30 SLC22A18(NM_002555.5)

SEQ ID NO：31 SLC22A18(NM_183233.2)

SEQ ID NO：32 SLC22A18(NP_002546.3)

SEQ ID NO：33 SLC22A18(NP_899056.2)

SEQ ID NO：34 FUT7(NM_004479.3)

SEQ ID NO：35 FUT7(NP_004470.1)

SEQ ID NO：36 RAPSN(NM_005055.4)

SEQ ID NO：37 RAPSN(NM_032645.4)

SEQ ID NO：38 RAPSN(NP_005046.2)

SEQ ID NO：39 RAPSN(NP_116034.2)

SEQ ID NO：40 S100P(NM_005980.2)

SEQ ID NO：41 S100P(NP_005971.1)

SEQ ID NO：42 DYRK4(NM_001282285.1)

SEQ ID NO：43 DYRK4(NM_001282286.1)

SEQ ID NO：44 DYRK4(NM_003845.2)

SEQ ID NO：45 DYRK4(NP_001269214.1)

SEQ ID NO：46 DYRK4(NP_001269215.1)

SEQ ID NO：47 DYRK4(NP_003836.1)

SEQ ID NO：33 HYAL2引物的有义序列

SEQ ID NO：34 HYAL2引物的反义序列

SEQ ID NO：33 HYAL2-is-310引物的有义序列

SEQ ID NO：34 HYAL2-is-310引物的反义序列

SEQ ID NO：33 HYAL2-is-325引物的有义序列

SEQ ID NO：34 HYAL2-is-325引物的反义序列

SEQ ID NO：35 MGRN1引物的有义序列

SEQ ID NO：36 MGRN1引物的反义序列

SEQ ID NO：37 RPTOR引物的有义序列

SEQ ID NO：38 RPTOR引物的反义序列

SEQ ID NO：39 SLC22A18引物的有义序列

SEQ ID NO：40 SLC22A18引物的反义序列

SEQ ID NO：41 FUT7引物的有义序列

SEQ ID NO：42 FUT7引物的反义序列

SEQ ID NO：43 RAPSN引物的有义序列

SEQ ID NO：44 RAPSN引物的反义序列

SEQ ID NO：45 S100P引物的有义序列

SEQ ID NO：46 SL00P引物的反义序列

SEQ ID NO：47 DYRK4引物的有义序列

SEQ ID NO：48 DYRK4引物的反义序列

发明详述

定义

在下文对本发明进行详细描述之前，应理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以改变。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制将仅由所附权利要求书限制的本发明的范围。除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语的含义与本领域普通技术人员通常理解的含义相同。

在说明书的正文通篇引用了数篇文件。本文不管是在上文还是在下文引用的每篇文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指南等)都在此通过引用整体并入。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明无权由于在先发明而早于这样的公开内容。本文引用的_些文件的特征在于“通过引用并入”。如果这样的并入参考文献中的定义或教导与本说明书中详述的定义或教导相矛盾，则本说明书的正文优先。

在下文，将描述本发明的要素。这些要素随具体实施方案而列出，然而，应理解其可以以任何方式和以任意数量进行组合以产生另外的实施方案。多方面地描述的实例和优选实施方案不应被解释为将本发明仅限于明确描述的实施方案。这种描述应理解为支持和涵盖将明确描述的实施方案与任意数量的所公开和/或优选要素组合的实施方案。此外，除非上下文另外指出，否则本申请中描述的所有要素的任意排列和组合均应被认为通过本申请的说明书公开。

在本说明书和所附权利要求书通篇，除非上下文另外规定，否则词语“包括/包含”和变化形式将被理解为表示包括所述整数或步骤或者整数或步骤的组，但是不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤的组。

除非内容另外明确指出，否则本说明书和所附权利要求书中使用的没有数量词修饰的名词包括一个/种和/或更多个/种。

当与数值结合使用时，术语“约/大约”意指涵盖在具有比指示数值小5％的下限并且具有比指示数值大5％的上限的范围内的数值。

“核酸分子”理解为由核苷酸单体构成的聚合物或寡聚物大分子。核苷酸单体由核碱基、五碳糖(例如但不限于核糖或2’-脱氧核糖)和1至3个磷酸基团构成。通常，多核苷酸通过单个核苷酸单体之间的磷酸二酯键形成。在本发明的上下文中，提及的核酸分子包括但不限于核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、及其混合物(例如，如RNA-DNA杂交体)。术语“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在本文中可互换使用。核酸可以例如化学合成，例如根据磷酸三酯方法化学合成(参见，例如Uhlmann，E.和Peyman，A.(1990)Chemical Reviews，90，543-584)。适配体是以高亲和力与多肽结合的核酸，在此为mir146-a。适配体可以通过例如SELEmir146-a(参见，例如Jayasena(1999)Clin.Chem.，45，1628-50；Klug和Famulok(1994)M.Mol.Biol.Rep.，20，97-107；US5，582，981)的筛选方法从较大的不同单链RNA分子库分离。适配体还可以以其镜像形式，例如作为L-核糖核苷酸合成并筛选(Nolte等(1996)Nat.Biotechnol.，14，1116-9；Klussmann等(1996)Nat.Biotechnol.，14，1112-5)。以这种方式分离的形式具有其不被天然存在的核糖核酸酶降解并且因此具有更大稳定性的优点。核酸可被内切核酸酶或外切核酸酶，特别是可见于细胞中的DNA酶和RNA酶降解。因此，有利的是对核酸进行修饰以使其稳定防止降解，从而确保在细胞中在长时间内维持高浓度的核酸(Beigelman等(1995)Nucleic Acids Res.23：3989-94；WO95/11910；

WO98/37240；WO97/29116)。通常，这样的稳定可以通过引入一个或更多个核苷酸间磷基团或者通过引入一个或更多个非磷间核苷酸(internucleotide)来获得。合适的经修饰间核苷酸汇编在Uhlmann和Peyman(1990)(同上)(另参见Beigelman等(1995)NucleicAcids Res.23：3989-94；WO95/11910；WO98/37240；WO 97/29116)中。可以在根据本发明的用途之一中使用的核酸中的经修饰核苷酸间磷酸基团和/或非磷桥包含例如甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯和/或磷酸酯，而非磷间核苷酸类似物包含例如硅氧烷桥、碳酸酯桥、羧甲基酯、乙酰胺化物(acetamidate)桥和/或硫醚桥。还期望，这种修饰应提高可以在根据本发明的用途之一中使用的药物组合物的持久性。核酸可以选自：肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)；锁核酸(locked nucleic acid，LNA)；二醇核酸(glycolnucleic acid，GNA)和苏糖核酸(threose nucleic acid，TNA)；微RNA(microRNA，miRNA)；以及小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)；多核苷酸探针；引物(例如，引物对)，特别是用于聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)、逆转录(reversetranscription，RT)反应或DNA测序的引物。

在本发明不同方面的上下文中，术语核酸包含基因组DNA、cDNA、重组DNA、cRNA、mRNA、微RNA(miRNA)和小干扰RNA(siRNA)。核酸可以由全基因或其部分组成。核酸也可以是人工核酸。人工核酸包括聚酰胺或肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)、吗啉代和锁核酸(locked nucleic acid，LNA)、以及二醇核酸(glycol nucleic acid，GNA)和苏糖核酸(threose nucleic acid，TNA)。如本领域技术人员公知的，这些各自与天然存在DNA或RNA的区别之处在于分子骨架的变化。

技术人员理解本文中使用的术语“微RNA”以及例如“miRNA”和“miR”的变化形式，并且其涉及见于真核生物细胞和后生动物生物体的体液中的短核糖核酸(RNA)分子。miRNA包括人miRNA、成熟单链miRNA、前体miRNA(pre-miR)、及其变体，其可以是天然存在的。在一些情况下，术语“miRNA”还包括初级miRNA转录物(pri-miRNA)和双链体miRNA。除非另外指出，否则当在本文中使用时，特定miRNA的名称是指成熟miRNA。miRNA前体可以由25至数千个核苷酸，通常40至130、50至120、或60至110个核苷酸组成。通常，成熟miRNA由5至100个核苷酸，通常10至50、12至40、或18至26个核苷酸组成。术语miRNA还包括最终进入RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)的“引导”链以及与其互补的“过客”链。

本领域中已知的有数种miRNA的序列，并且技术人员可容易地通过例如miRBase(http：//www.mirbase.org/)的公知序列数据库对其进行评估(Griffiths-Jones S.，NAR200432(Database Issue)：D109-D111；Kozomara A，Griffiths-Jones S.，NAR 2011 39(Database Issue)：D152-D157)。应理解，以下所示的各个miRNA的数据库登录号是人来源的miRNA的那些。然而，这些数据库条目还提供了例如以下不同来源的各自miRNA的数据库登录号：例如任何哺乳动物、爬行动物、或鸟类来源的mirNA，例如如选自实验室动物(例如，小鼠或大鼠)、家养动物(包括例如豚鼠、兔、马、驴、牛、绵羊、山羊、猪、鸡、骆驼、猫、狗、海龟、陆龟、蛇或蜥蜴)或灵长类(包括黑猩猩、倭黑猩猩和大猩猩)的miRNA的那些。还应理解，通过其编号(例如，miR-652)来提及特定miRNA等同地指-3p和-5p序列(miR-652-3p和miR-652-5p)。

miR-652的序列保存于miRBase ID MI0003667，其包含分别对应于本发明的SEQID NO：1和2的hsa-miR-652-3p(MIMAT0003322)和hsa-miR-652-5p(MIMAT0022709)。

miR-801的序列保存于miRBase ID MI0005202：5′-GAUUGCUCUGCGUGCGGAAUCGAC-3′；然而，其现在被认为是U11剪接体RNA的片段并且因此从miRBase移除。前miRNA-801位于chr1：28847698-28847793。其序列对应于本发明的SEQ ID NO：3。

也称为miR-368的miR-376c保存于miRBase ID MI0000776，其包含分别对应于本发明的SEQ ID NO：4和5的miR-376c-3p(MIMAT0000720)和hsa-miR-376c-5p(MIMAT0022861)。

miR-376a的序列保存于miRBase ID MI0000784，其包含分别对应于本发明的SEQID NO：6和7的hsa-miR-376a-3p(MIMAT0000729)和hsa-miR-376a-5p(MIMAT0003386)。

miR-127的序列保存于miRBase ID MI0000472，其包含分别对应于本发明的SEQID NO：8和9的hsa-miR-127-3p(MIMAT0000446)和hsa-miR-127-5p(MIMAT0004604)。

miR-409的序列保存于miRBase ID MI0001735，其包含分别对应于本发明的SEQID NO：10和11的hsa-miR-409-3p(MIMAT0001639)和hsa-miR-409-5p(MIMAT0001638)。

miR-148b的序列保存于miRBase ID MI0000811，其包含分别对应于本发明的SEQID NO：12和13的hsa-miR-148b-3p(MIMAT0000759)和hsa-miR-148b-5p(MIMAT0004699)。

术语“miRNA组合”涉及本发明的miRNA的组合。miRNA的量可以通过本领域公知的技术在对象的样品中确定。根据样品的性质，所述量可以通过用于量化多核苷酸量的基于PCR的技术或者通过其他方法(如质谱或(下一代)测序或实例中所述的方法之一)(CissellKA，Deo SK.Trends in mieroRNA detection.Anal Bioanal Chem.2009；394(4)：1109-1116；或de Planell-Saguer M，Rodicio MC.Analytical aspects of microRNA indiagnostics：a review.Anal Chim Acta 2011年8月12日；699(2)：134-52)来确定。如本文所使用的术语“确定miRNA组合中至少所述miRNA的量”优选地涉及单独确定组合中每种miRNA的量以能够将组合中每种miRNA的量与所述miRNA特异性的参考进行比较。

如本文所使用的术语“探针”是指通常用于检测与探针的序列互补的靶RNA和/或RNA序列的单链寡核苷酸。探针与核苷酸序列由于探针与靶序列之间的互补性而允许核苷酸配对的单链核酸(DNA或RNA)杂交。探针的长度取决于预期用途以及所需的探针特异性。通常，探针的长度为20至500个(即50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500个)核苷酸，优选20至100个，更优选20至50个核苷酸。对于微RNA的检测，探针为12至30个核苷酸。探针用于多种实验设置，例如但不限于Southern和Northern印迹、实时PCR和原位杂交(In Situ Hybridization，ISH)以及微阵列实验。探针可以是未经标记的、经直接标记的或经间接标记的，例如用链霉抗生物素蛋白复合物随后可结合的生物素标记的。所述标记可以是可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其他物理手段检测的分子。例如，合适的标记包括32P、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如，通常用于ELISA)、生物素、地高辛配基(digoxigenin)、或半抗原以及其他可检测或可以变成可检测的实体。标记可以引入核酸中的任何位置，例如3，端、5，端或内部。术语“探针”还涵盖其骨架组成不同的核酸，例如但不限于肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。

如本文所使用的术语“引物”是指通常充当DNA复制酶的起点的单链寡核苷酸。引物与DNA模板结合或杂交，并且通常包含与其应该结合的DNA序列互补的序列。引物还可以包含另外的序列，例如充当核酸酶切割位点(例如，Bam H1、Hind III等)的序列。根据期望的用途来选择引物的长度。例如，用于聚合酶链反应(PCR)中DNA扩增的引物的长度通常为至少10个核苷酸，优选10至50个(即15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50个)核苷酸，更优选15至30个核苷酸。至少5个核苷酸的较短引物用于DNA模板的测序。还涵盖在术语“引物”中的是“简并引物”，其是类似但不相同的引物的混合物。引物可以用可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其他物理手段检测的标志物分子加标签或标记。

术语“表达水平”是指在特定的时间点体内或样品中存在的基因产物的量。表达水平可以例如通过由基因表达的蛋白质或mRNA来测量/量化/检测。可以例如如下量化表达水平：用相同样品或参考样品(例如，在相同时间从同一个体得到的样品或相同样品的相同尺寸(重量、体积)的部分)中相同类型基因产物的总量(总蛋白质或mRNA)归一化样品中存在的目的基因产物的量，或者确定目的基因产物的量/限定的样品尺寸(重量、体积等)。可以通过本领域已知的任何方法来测量或检测表达水平，所述方法例如用于目的基因产物的直接检测和量化的方法(例如质谱)，或者通常通过目的基因产物与对目的基因产物具有特异性的一种或更多种不同分子或检测装置(例如，引物、探针、抗体、蛋白质支架)结合而工作的用于间接检测和测量目的基因产物的方法。技术人员还已知的是确定基因拷贝的水平，其还包括确定一个或更多个片段的不存在或存在(例如，通过核酸探针或引物，例如定量PCR、多重连接依赖性探针扩增(Multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)PCR)。

术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用，并且是指任何肽相关的氨基酸链，不论长度或翻译后修饰。本发明中可使用的蛋白质(包括蛋白质衍生物、蛋白质变体、蛋白质片段、蛋白质区段、蛋白质表位、蛋白质结构域)可以通过化学修饰进一步修饰。这意味着这样的经化学修饰多肽包含除20种天然存在氨基酸之外的其他化学基团。这样的其他化学基团的实例包括但不限于糖基化氨基酸和磷酸化氨基酸。与亲本多肽相比，多肽的化学修饰可以提供有利的特性，例如增强的稳定性、延长的生物半衰期或升高的水溶解度中的一种或更多种。适用于本发明中可使用的变体的化学修饰包括但不限于聚乙二醇化、非糖基化亲本多肽的糖基化、或亲本多肽中存在的糖基化模式的修饰。

在本发明不同方面的上下文中，术语“肽”是指通过肽键连接的氨基酸的短聚合物。其具有与蛋白质相同的化学(肽)键，但通常长度较短。最短的肽是由通过单个肽键连接的两个氨基酸组成的二肽。还可以有三肽、四肽、五肽等。优选地，肽的长度为多至8、10、12、15、18或20个氨基酸。除非肽为环状肽，否则其具有氨基末端和羧基末端。

在本发明不同方面的上下文中，术语“多肽”是指通过肽键结合在一起的氨基酸的单线性链，并且优选地包含至少约21个氨基酸。多肽可以是由多于一条链构成的蛋白质的一条链，或者如果蛋白质由一条链构成，其可以是蛋白质本身。

在本发明不同方面的上下文中，术语“蛋白质”是指包含二级结构和三级结构的一个或更多个多肽的分子，并且另外地是指由形成四级结构的数个多肽(即数个亚基)构成的蛋白质。蛋白质有时附接有非肽基团，其可以被称为辅基或辅因子。蛋白质或多肽的一级结构是多肽链中氨基酸的序列。蛋白质中的二级结构是蛋白质的局部区段的一般三维形式。然而，其不描述三维空间中的特定原子位置，原子位置通常被认为是三级结构。在蛋白质中，二级结构通过主链酰氨基和羧基之间的氢键的模式来限定。蛋白质的三级结构是通过原子坐标确定的蛋白质的三维结构。四级结构是多亚基复合物中多个折叠或卷曲蛋白质或多肽分子的排布。术语“氨基酸链”和“多肽链”在本发明的上下文中同义使用。本文所使用的术语“翻译后”是指在将核苷酸三联体翻译成氨基酸并且顺序地与在前的氨基酸形成肽键之后发生的事件。这样的翻译后事件可以在整个多肽形成之后发生，或者已经在翻译过程期间对已被翻译的那些多肽部分发生。翻译后事件通常改变或修饰所得多肽的化学或结构特性。翻译后事件的实例包括但不限于例如以下事件：氨基酸的糖基化或磷酸化，或者肽链切割，例如通过内肽酶切割。本文使用的术语“共翻译”是指在核苷酸三联体翻译成氨基酸链的过程期间发生的事件。这些事件通常改变或修饰所得氨基酸链的化学或结构特性。共翻译事件的实例包括但不限于可能完全停止翻译过程或者中断肽键形成产生两个离散翻译产物的事件。

术语“区段”是指大分子(例如，多肽、蛋白质或多聚蛋白)的可被分割成的任何部分。大分子可以由一个或更多个区段组成。这样的分割可以由于大分子和/或单独区段的功能(例如，具有免疫反应性特征或膜附着功能)或结构(例如，核苷酸或氨基酸序列、或者二级或三级结构)特性而存在。在本发明的上下文中，优选地术语“区段”是指蛋白质或多聚蛋白的部分。特别优选地，这样的区段独立于蛋白质或多聚蛋白的剩余部分折叠和/或发挥功能。

“表位”(也被称为“抗原决定簇”)是被免疫***，特别是被抗体、B细胞或T细胞识别的大分子的区段。这样的表位是能够与抗体或其抗原结合片段结合的大分子的部分或区段。在上下文中，术语“结合”优选地涉及特异性结合。在本发明的上下文中，术语“表位”优选地是指被免疫***识别的蛋白质或多聚蛋白的区段。表位通常由例如氨基酸或糖侧链的分子的化学活性表面组群组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象与非构象表位的区别之处在于：在变性溶剂存在下，丧失与前者的结合而不丧失与后者的结合。

如本文所使用的术语“结构域”是指可以独立于蛋白质链的其余部分而演变、起作用和/或存在的蛋白质或多聚蛋白序列或结构(或对应的核苷酸序列)的区段。通常，蛋白质由一个或数个结构域组成，其中每个结构域为稳定且独立于蛋白质链的其余部分而折叠的三维结构。这样的结构域通常形成蛋白质中的独立功能单位(例如，跨膜结构域、免疫球蛋白样结构域或DNA结合结构域)。

数种肽和蛋白质的氨基酸序列以及编码各自肽和蛋白质的核苷酸序列在本领域中是公知的，并且技术人员可容易地通过众所周知的序列数据库例如Genbank(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)评估。应理解，以下所示的各个序列的数据库登录号是人来源的那些。然而，这些数据库条目还提供了例如以下不同来源的各自核苷酸序列的数据库登录号：例如如任何哺乳动物、爬行动物、或鸟类来源的氨基酸或核苷酸序列，例如如选自实验室动物(例如，小鼠或大鼠)、家养动物(包括例如豚鼠、兔、马、驴、牛、绵羊、山羊、猪、鸡、骆驼、猫、狗、海龟、陆龟、蛇或蜥蜴)或灵长类(包括黑猩猩、倭黑猩猩和大猩猩)的氨基酸或核苷酸序列的那些。

HYAL2：

Genbank登录号：NM_003773.4(GI：289802998)，转录物变体1，其对应于本发明的SEQ ID NO：14；

Genbank登录号：NM_033158.4(GI：289802999)，转录物变体2，其对应于本发明的SEQ ID NO：15；

Genbank登录号：NP_003764.3(GI：15022801)，由转录物变体1编码的HYAL2多肽，其对应于本发明的SEQ ID NO：16；以及

Genbank登录号：NP_149348.2(GI：34304377)，由转录物变体2编码的HYAL2多肽，其对应于本发明的SEQ ID NO：17；

MGRN1：

Genbank登录号：NM_001142289.2，转录物变体2，其对应于本发明的SEQ ID NO：18；以及

Genbank登录号：NM_001142290.2，转录物变体3，其对应于本发明的SEQ ID NO：19；以及

Genbank登录号：NM_001142291.2，转录物变体4，其对应于本发明的SEQ ID NO：20；以及

Genbank登录号：NM_015246.3，转录物变体1，其对应于本发明的SEQ ID NO：21；以及

Genbank登录号；NP_001135761.2，由转录物变体2编码的MGRN1多肽，其对应于本发明的SEQ ID NO：22；

Genbank登录号：NP_001135762.1，由转录物变体3编码的MGRN1多肽，其对应于本发明的SEQ ID NO：23；

Genbank登录号：NP_001135763.2，由转录物变体4编码的MGRN1多肽，其对应于本发明的SEQ ID NO：24；

Genbank登录号：NP_056061.1，由转录物变体1编码的MGRN1多肽，其对应于本发明的SEQ ID NO：25；

RPTOR

Genbank登录号：NM_001163034.1，转录物变体2，其对应于本发明的SEQ ID NO：26；

Genbank登录号：NM_020761.2，转录物变体1，其对应于本发明的SEQ ID NO：27；

Genbank登录号：NP_001156506.1，由转录物变体2编码的RPTOR多肽，其对应于本发明的SEQ ID NO：28；

Genbank登录号：NP_065812.1，由转录物变体1编码的RPTOR多肽，其对应于本发明的SEQ ID NO：29；

SLC22A18

Genbank登录号：NM_002555.5，转录物变体1，其对应于本发明的SEQ ID NO：30；

Genbank登录号：NM_183233.2，转录物变体2，其对应于本发明的SEQ ID NO：31；

Genbank登录号：NP_002546.3，由转录物变体1编码的SLC22A18多肽，其对应于本发明的SEQ ID NO：32；

Genbank登录号：NP_899056.2，由转录物变体2编码的SLC22A18多肽，其对应于本发明的SEQ_ID NO：33；

FUT7

Genbank登录号：NM_004479.3，转录物，其对应于本发明的SEQ ID NO：34；

Genbank登录号：NP_004470.1，由转录物编码的FUT7多肽，其对应于本发明的SEQID NO：35；

RAPSN

Genbank登录号：NM_005055.4，转录物变体1，其对应于本发明的SEQ ID NO：36；

Genbank登录号：NM_032645.4，转录物变体2，其对应于本发明的SEQ ID NO：37；

Genbank登录号：NP_005046.2，由转录物变体1编码的RAPSN多肽，其对应于本发明的SEQ ID NO：38；

Genbank登录号：NP_116034.2，由转录物变体1编码的RAPSN多肽，其对应于本发明的SEQ ID NO：39；

S100P

Genbank登录号：NM_005980.2，转录物，其对应于本发明的SEQ ID NO：40；

Genbank登录号：NP_005971.1，由转录物编码的S100P多肽，其对应于本发明的SEQID NO：41；

DYRK4

Genbank登录号：NM_001282285.1，转录物变体2，其对应于本发明的SEQ ID NO：42；

Genbank登录号：NM_001282286.1，转录物变体3，其对应于本发明的SEQ IDNO：43；

Genbank登录号：NM_003845.2，转录物变体1，其对应于本发明的SEQ ID NO：44；

Genbank登录号：NP_001269214.1，由转录物变体2编码的DYRK4多肽，其对应于本发明的SEQ ID NO：45；

Genbank登录号：NP_001269215.1，由转录物变体3编码的DYRK4多肽，其对应于本发明的SEQ ID NO：46；

Genbank登录号：NP_003836.1，由转录物变体1编码的DYRK4多肽，其对应于本发明的SEQ ID NO：47。

如本文所使用的术语“变体”应理解为与其衍生自的多核苷酸或蛋白质相比不同之处在于其长度或序列发生一种或更多种变化的多核苷酸或蛋白质。蛋白质或核酸变体衍生自的多肽或多核苷酸也被称为亲本多肽或多核苷酸。术语“变体”包含亲本分子的“片段”或“衍生物”。通常，“片段”的长度或尺寸比亲本分子小，而与亲本分子相比，“衍生物”表现出其序列中的一个或更多个差异。还涵盖经修饰的分子，例如但不限于经翻译后修饰的蛋白质(例如，糖基化、生物素化、磷酸化、泛素化、棕榈酰化或经蛋白水解切割的蛋白质)和经修饰的核酸(例如甲基化DNA)。术语“变体”还涵盖不同分子的混合物，例如但不限于RNA-DNA杂交体。通常，变体是人工构建的，优选通过基因技术手段人工构建的，而亲本多肽或多核苷酸是野生型蛋白质或多核苷酸。然而，应理解，天然存在的变体也涵盖在本文使用的术语“变体”中。此外，在本发明中可使用的变体还可以衍生自亲本分子的同源物、种间同源物(ortholog)或种内同源物(paralog)或者衍生自人工构建的变体，只要变体表现出亲本分子的至少一种生物活性，即是功能活性的即可。

在一些优选实施方案中，在本发明中可使用的变体显示出总数多至200个(多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200个)的氨基酸或核苷酸序列变化(即交换，***，缺失，5’-、3’-、N-末端和/或C-末端截短)。氨基酸交换可以是保守的和/或非保守的。在一些优选实施方案中，在本发明中可使用的变体与其衍生自的蛋白质或多核苷酸的不同之处在于多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸或核苷酸交换。作为替代或补充，如本文所使用的“变体”可以通过与其衍生自的亲本多肽或亲本多核苷酸的一定序列同一性程度来表征。更准确而言，在本发明上下文中的蛋白质变体显示与其亲本多肽具有至少80％序列同一性。在本发明上下文中的多核苷酸变体显示与其亲本多核苷酸具有至少80％序列同一性。优选地，蛋白质变体的序列同一性跨越20、30、40、45、50、60、70、80、90、100个或更多个氨基酸的连续延伸段。优选地，多核苷酸变体的序列同一性跨越60、90、120、135、150、180、210、240、270、300个或更多个核苷酸的连续延伸段。

在本说明书通篇关于多肽和多核苷酸序列的比较使用了术语“至少80％序列同一性”。该表述优选地是指相对于各自参考多肽或相对于各自参考多核苷酸的至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。优选地，所讨论多肽和参考多肽跨越20、30、40、45、50、60、70、80、90、100个或更多个氨基酸的连续延伸段或者跨越参考多肽的全长显示出所示序列同一性。优选地，所讨论多核苷酸和参考多核苷酸跨越60、90、120、135、150、180、210、240、270、300个或更多个核苷酸的连续延伸段或者跨越参考多肽的全长显示出所示序列同一性。

术语“缺失变体”和“片段”在本文中可互换使用。片段可以是天然存在的(例如，剪接变体)或者其可以是人工构建的，优选通过基因技术手段人工构建的。优选地，与亲本多肽相比，片段(或缺失变体)具有多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸或核酸的缺失。在其中两个序列进行比较并且未指定与其比较地计算序列同一性百分比的参考序列的情况下，如果未另外具体说明，则参考两个待比较序列中的较长者来计算序列同一性。如果指定了参考序列，如果未另外具体说明，则基于由SEQ ID表示的参考序列的全长来确定序列同一性。

可以通过序列比对来确定核苷酸和氨基酸序列的相似性，即序列同一性的百分比。这样的比对可以用本领域已知的数种算法来进行，优选地使用Karlin和Altschul的数学算法(Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877)、hmmalign(HMMER包，http：//hmmer.wustl.edu/)或CLUSTAL算法(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.和Gibson，G.J.(1994)Nucleic Acids Res.22，4673-80)来进行，CLUSTAL算法例如可在http：//www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/上或http：//www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html上或http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝/NPSA/npsa_clusta lw.html上获得。所使用的优选参数为默认参数，如其在http：//www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/或http：//www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html上设置的。序列同一性(序列匹配)的等级可以使用例如BLAST、BLAT或BlastZ(或BlastX)来计算。Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410的BLASTN和BLASTP程序中并入了类似的算法。用BLASTN程序进行BLAST多核苷酸检索(评分＝100，字长＝12)以获得同源的多核苷酸序列。

“杂交”也可以用作两个核酸序列之间的序列同一性或同源性的测量。编码F、N或M2-1或者这些中任一个的部分的核酸序列可以根据标准杂交技术用作杂交探针。F、N或M2-1探针与来自测试来源的DNA或RNA的杂交指示在测试来源中分别存在F DNA或RNA、N DNA或RNA、或者M2-1 DNA或RNA。杂交条件是本领域技术人员已知的，并且可见于例如CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.，6.3.1-6.3.6，1991中。“中等杂交条件”定义为等同于在30℃下在2X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在50℃下在1XSSC、0.1％SDS中洗涤。“高度严格条件”定义为等同于在45℃下在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在65℃下在0.2 X SSC、0.1％SDS中洗涤。

其中用化学相关氨基酸替换氨基酸的半保守的、并且尤其是保守的氨基酸替换是优选的。典型的替换在脂肪族氨基酸之间、在具有脂肪族羟基侧链的氨基酸之间、在具有酸性残基的氨基酸之间、在酰胺衍生物之间、在具有碱性残基的氨基酸之间或者是具有芳香族残基的氨基酸。典型的半保守和保守替换为以下：

如果新的半胱氨酸保留为游离的硫醇，则从A、F、H、I、L、M、P、V、W或Y到C的变化是半保守的。此外，技术人员将理解，在空间立体需求位置的甘氨酸不应被替换，并且P不应被引入蛋白质的具有α-螺旋或β-片结构的部分。

如本文所使用的术语“组织”是指协调地实现特定功能的相同来源的细胞的集合。组织的实例包括但不限于***、肌肉组织、神经组织和上皮组织。多种组织一起形成执行特定功能的“器官”。器官的实例包括但不限于腺、肌肉、血液、脑、心脏、肝、肾、胃、骨骼、关节和皮肤。

术语“疾病(disease）”和“病症(disorder）”在本文中可互换使用，是指其中组织、器官或个体不再能够高效地发挥其功能的异常状况，尤其是异常的医学状况，例如病患或损伤。通常但不必然地，疾病与指示存在这种疾病的特定症状或体征有关。因此，这样的症状或体征的存在可指示组织、器官或个体患有疾病。这些症状或体征的改变可以指示这样的疾病的进展。疾病的进展通常通过可指示疾病“恶化”或“好转”的这样的症状或体征增加或减少来表征。疾病的“恶化”通过组织、器官或生物体高效地实现其功能的能力降低来表征，而疾病的“好转”通常通过组织、器官或个体高效地实现其功能的能力提高来表征。“处于发生疾病风险之中”的组织、器官或个体处于健康状态但是表现出疾病发生的可能性。通常，发生疾病的风险与这样的疾病的早期或微弱体征或症状有关。在这种情况下，仍然可以通过治疗来预防疾病的发生。疾病的实例包括但不限于创伤性疾病、炎性疾病、感染性疾病、皮肤病、内分泌疾病、肠疾病、神经病症、关节病、遗传病症、自身免疫病和不种类型的癌症。

“癌症”是指可侵入或扩散至对象的其他组织或器官的涉及异常细胞生长的增殖性病症。癌症根据与肿瘤细胞类似并且因此被认为是肿瘤来源的细胞类型进行分类。这些类型包括但不限于癌(源自上皮细胞的癌症)、肉瘤(由例如骨、软骨、脂肪、神经的***发生的癌症)、淋巴瘤和白血病(由离开骨髓并且易于在***和血液中成熟的造血细胞发生的癌症)、生殖细胞肿瘤(源自多能细胞的癌症)、以及母细胞瘤(源自未成熟“前体”细胞或胚胎组织的癌症)。特别地，癌症包括但不限于急性淋巴细胞白血病(acutelymphoblastic leukemia，ALL)、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关性癌症、AIDS相关性淋巴瘤、***癌、阑尾癌、星形细胞瘤、儿童小脑或大脑癌症、基底细胞癌、胆管癌、肝外疾病(extrahepatic)、膀胱癌、骨肿瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、脑干胶质瘤、脑癌、脑肿瘤(小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚层瘤、视通路和下丘脑胶质瘤)、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、类癌肿瘤、中枢神经***淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、***、慢性支气管炎、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓源性白血病(chronic myelogenous leukemia)、慢性骨髓增殖性病症、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、促***增生性小圆细胞肿瘤(desmoplastic smallround cell tumor)、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤因肿瘤家族(Ewing family oftumor)中的尤因肉瘤(Ewing′s sarcoma)、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌(眼内黑素瘤、视网膜母细胞瘤)、胆囊癌、胃(胃部)癌、胃肠类癌肿瘤、胃肠间质肿瘤(gastrointestinal stromal tumor，GIST)、生殖细胞肿瘤(颅外、性腺外或卵巢)、妊娠性滋养层肿瘤、脑干胶质瘤、胃类癌、多毛细胞白血病、头和颈癌、心脏癌、肝细胞(肝)癌症、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、下咽癌、下丘脑和视通路胶质瘤、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)、肾癌(肾细胞癌)、喉癌、白血病(急性淋巴细胞性、急性骨性、慢性淋巴细胞性、慢性髓源性)、唇和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌(非小细胞、小细胞)、淋巴瘤(AIDS相关性、伯基特、皮肤T细胞、霍奇金、原发性中枢神经***)、巨球蛋白血症(瓦尔登斯特伦)、男性乳腺癌、骨恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、髓母细胞瘤、黑素瘤、梅克尔细胞癌(Merkel cell cancer)、间皮瘤、原发灶不明的转移性鳞状颈癌(metastatic squamous neck cancer with occult primary)、口癌、多发性内分泌瘤形成综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞赘生物、蕈样肉芽肿病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常性/骨髓增殖性疾病、髓源性白血病、慢性髓性白血病、骨髓瘤、骨髓增殖性病症、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、少突神经胶质瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜在肿瘤(ovarian low malignant potential tumor)、胰腺癌、鼻旁窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、***癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚层瘤、垂体腺瘤、浆细胞瘤形成/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经***淋巴瘤、***癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤(尤因肿瘤家族、卡波西、软组织、子宫)、塞泽里综合征(Sézarysyndrome)、皮肤癌(癌、黑素瘤、非黑素瘤、梅克尔细胞)、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、幕上原始神经外胚层瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺瘤、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、滋养层肿瘤、尿道癌、子宫癌(子宫内膜、肉瘤)、***癌、视通路和下丘脑胶质瘤、外阴癌、维尔姆斯肿瘤(Wilms tumor)(肾癌)。

如本文所使用的术语“乳腺肿瘤”涉及对象中乳腺组织细胞的异常过度增殖，其可以是良性(非癌性)肿瘤或恶性(癌性)肿瘤。良性乳腺肿瘤优选地包括纤维腺瘤、颗粒细胞肿瘤、管内***状瘤和叶状肿瘤。恶性肿瘤是如上文所述的乳腺癌(BC)。

如本文所使用的术语“转移性乳腺癌”(MBC)涉及其中癌细胞随着转移在至少一个继发位点，即对象机体的非相邻器官或部分生长的乳腺癌。

如本文所使用的术语“卵巢肿瘤”涉及对象中卵巢组织细胞的异常过度增殖，其可以是良性(非癌性)肿瘤或恶性(癌性)肿瘤。恶性肿瘤是如上文所述的卵巢癌(OvaCa)。

如本文所使用的术语“胰腺肿瘤”涉及对象中卵巢组织细胞的异常过度增殖，其可以是良性(非癌性)肿瘤或恶性(癌性)肿瘤。恶性肿瘤是如上文所述的胰腺癌(PaCa)。

技术人员理解术语“循环肿瘤细胞”或“CTC”，并且其涉及从原发性或转移性肿瘤脱离且在血流中循环的肿瘤细胞。应理解，CTC的数量是用于乳腺癌的疾病和治疗结果，例如用于总体存活的预后标志。术语“CTC状态”涉及在样品中存在或不存在多于参考量的CTC。优选地，CTC的参考量为2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7或7.5个CTC/7.5ml血液，更优选5个CTC/7.5ml血液。在其中血液样品包含多于所述参考量的CTC的对象中，CTC状态是不利的，指示成功治疗的可能性低以及无进展存活和总体存活的可能性低。相反地，在其中血液样品包含少于所述参考量的CTC的对象中，CTC状态是有利的，指示成功治疗的可能性高以及无进展存活和总体存活的可能性高。有利地，在本发明中已发现，如下文限定用于确定对象之CTC状态的miRNA的量指示对象的CTC状态。因此，如本文所使用确定对象中的CTC状态涉及确定一种或更多种所述miRNA的量，并且因此获得对象的CTC状态的指示。优选地，所述状态可以被诊断为“有利的”或“不利的”。

疾病的“症状”是可通过患有这样的疾病的组织、器官或生物体注意到的所述疾病的后果，并且包括但不限于组织、器官或个体的疼痛、乏力、压痛、劳损、僵硬和痉挛。疾病的“体征”或“信号”包括但不限于特定指标(例如生物标志或分子标志)的改变或变化，例如存在、不存在、增加或升高、降低或下降；或者症状的发生、存在或恶化。

术语“指标”和“标志”在本文中可互换使用，并且是指病症的体征或信号或者用于监测病症。这样的“病症”是指细胞、组织或器官的生物状态，或者是指个体的健康和/或疾病状态。指标可以是包括但不限于肽、蛋白质和核酸的分子的存在或不存在，或者可以是细胞、或组织、器官或个体中这样的分子的表达水平或模式变化。指标可以是个体中疾病的发生、发展或存在或者这样的疾病的进一步进展的体征。指标也可以是在个体中发生疾病的风险的体征。

如本文所使用的术语“基因产物”优选地涉及其在细胞中的存在取决于所述基因在所述细胞中的表达的大分子物理实体。本领域技术人员熟知基因表达的机理包括转录(即形成对应于所述基因或其部分的RNA)和翻译(即产生具有根据遗传密码由所述RNA编码的氨基酸序列的多肽分子)的基本机理；本领域技术人员熟知，其他细胞过程也可以涉及基因表达，例如RNA加工、RNA编辑、蛋白水解加工、蛋白质编辑等。因此，术语基因产物包括由所述基因表达的RNA(优选mRNA)以及多肽。从上文可以清楚地看出，术语基因产物还包括所述RNA的片段，其优选地长度为至少10、至少12、至少20、至少50或至少100个核苷酸；以及来自所述多肽的片段(肽)，其优选地长度为至少8、至少10、至少12、至少15、至少20个氨基酸。

“确定”基因产物的量涉及测量、优选地半定量或定量测量所述基因产物的量。测量可以直接或间接进行。优选地，对经加工的样品进行测量，所述加工包括从样品中提取多核苷酸或多肽。然而，本发明还设想了原位，例如通过免疫组织化学(immune-histochemistry，IHC)确定基因产物。

本发明的多核苷酸的量可以用本领域公知的若干种方法进行确定。量化优选地是绝对的，即涉及多核苷酸的具体数量，或者更优选地是相对的，即以任意经归一化单位进行测量。优选地，通过计算具体多核苷酸的数量与多核苷酸或参考扩增产物的总数量的比率来进行归一化。允许绝对或相对量化的方法是本领域中公知的。例如，定量PCR方法是用于相对量化的方法；如果将校准曲线并入这样的测定，则相对量化可用于获得绝对量化。其他已知的方法是例如基于核酸序列的扩增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)或分支DNA信号扩增测定方法(Branched DNA Signal Amplification Assay)，其与扩增的多核苷酸的斑点印迹或luminex检测组合。优选地，多核苷酸量是经归一化的多核苷酸量，即所获得的多核苷酸量被设置为相对于至少一种参考扩增产物，从而优选地将多核苷酸量设置为相对于样品中细胞的数量和/或多核苷酸扩增的效率。因此，优选地，参考扩增产物是由已知在每个细胞中具有恒定丰度的多核苷酸，即在样品的大多数(优选所有)细胞中以大约相同量包含的多核苷酸获得的产物。更优选地，参考扩增产物是由染色体或线粒体基因或者由持家基因的mRNA扩增。多核苷酸的量可以通过以下来确定：鸟枪法测序(Shotgun sequencing)，桥式PCR(Bridge PCR)，Sanger测序，焦磷酸测序，下一代测序，单分子实时测序，离子激流测序(Ion Torrent sequencing)，边合成边测序(Sequencing bysynthesis)，边连接边测序(Sequencing by ligation)，大规模并行标识测序(Massivelyparallel signature sequencing)，聚合酶克隆测序(Polony sequencing)、DNA纳米球测序(DNA nanobau sequencing)，Heliscope单分子测序，单分子实时(single moleculereal time，SMRT)测序，纳米孔DNA测序，隧道电流DNA测序(Tunnelling current DNAsequencing)，杂交测序(Sequencing by hybridization)，质谱测序，微流体Sanger测序，透射电子显微术DNA测序，RNA聚合酶测序，体外病毒高通量测序，通过RNA纯化的染色质分离(ChIRP-Seq)，全局运行测序(Global Run-on Sequencing，GRO-Seq)，核糖体图谱绘制测序(Ribosome Profiling Sequencing，Ribo-Seq)/ARTseq，RNA免疫沉淀测序(RNAImmunoprecipitation Sequencing，RIP-Seq)，CLIP cDNA文库高通量测序(High-Throughput Sequencing of CLIP cDNA library，HITS-CLIP)，交联和免疫沉淀测序，光激活核糖核苷增强交联和免疫沉淀(Photoactivatable Ribonucleoside-EnhancedCrosslinking and Immunoprecipitation，PAR-CLIP)，单核苷酸分辨率CLIP(IndividualNucleotide Resolution CLIP，iCLIP)，本地延长转录物测序(Native ElongatingTranscript Sequencing，NET-Seq)，多聚核糖体mRNA靶向纯化(Targeted Purificationof Polysomal mRNA，TRAP-Seq)，杂交体的交联、连接和测序(Crosslinking，Ligation，andSequencing of Hybrid，CLASH-Seq)，RNA末端测序平行分析(Parauel Analysis of RNAEnd Sequencing，PARE-Seq)，未加帽转录物全基因组图谱绘制(Genome-Wide Mapping ofUncapped Transcript，GMUCT)，转录物同种型测序(Transcript Isoform Sequencing，TIF-Seq)，TSS配对末端分析(Paired-End Analysis of TSS，PEAT)，通过引物延伸测序分析的选择性2’-羟基酰化(Selective 2’-Hydroxyl Acylation Analyzed by PrimerExtension Sequencing，SHAPE-Seq)，RNA结构平行分析(Parallel Analysis of RNAStructure，PARS-Seq)，片段化测序(Fragmentation Sequencing，FRAG-Seq)，CXXC亲和纯化测序(CXXC Affinity Purification Sequencing，CAP-Seq)，小牛肠碱性磷酸酶-烟草酸焦磷酸酶测序(Alkaline Phosphatase Calf Intestine-Tobacco Acid PyrophosphataseSeqnencing，CIP-TAP)，肌苷化学清除测序(Inosine Chemical Erasing Sequencing，ICE)，m6A特异性甲基化RNA免疫沉淀测序(m6A-Specific Methylated RNAImmunoprecipitation Sequencing，MeRIP-Seq)，数字RNA测序，单细胞全转录物扩增(Quartz-Seq)，基于设计引物的RNA测序(DP-Seq)，RNA模板5’端转换机理(SwitchMechanism at the 5’End of RNA Template，Smart-Seq)，RNA模板5’端转换机理第2版(Switch Mechanism at the 5’End of RNA Template Version 2，Smart-Seq2)，独特分子标识符(Unique Molecular Identifier，UMI)，线性扩增测序细胞表达(Cell Expressionby Linear Amplification Sequencing，CEL-Seq)，单细胞标记逆转录测序(Single-CellTagged Reverse Transcription Sequencing，STRT-Seq)，单分子分子倒置探针(Single-Molecule Molecular Inversion Probe，smMIP)，多重置换扩增(Multiple DisplacementAmplification，MDA)，基于多次退火和成环的扩增循环(Multiple Annealing andLooping-Based Amplification Cycle，MALBAC)，寡核苷酸选择性测序(Oligonucleotide-Selective Sequencing，OS-Seq)，双链体测序(Duplex Sequencing，双链体-Seq)，重亚硫酸盐测序(Bisulfite Sequencing，BS-Seq)，重亚硫酸盐后衔接子标记(Post-BisulfiteAdapter Tagging，PBAT)，基于细分的全基因组重亚硫酸盐测序(Tagmentation-BasedWhole Genome Bisulfite Sequencing，T-WGBS)，氧化重亚硫酸盐测序(OxidativeBisulfite Sequencing，oxBS-Seq)，Tet辅助的重亚硫酸盐测序(Tet-Assisted BisulfiteSequencing，TAB-Seq)，甲基化DNA免疫沉淀测序(Methylated DNA ImmunoprecipitationSequencing，MeDIP-Seq)，甲基化捕获(Methylation-Capture，MethylCap)测序，甲基结合结构域捕获(Methyl-Binding-Domain-Capture，MBDCap)测序，简化代表性重亚硫酸盐测序(Rednced-Representation Bisulfite Sequencing，RRBS-Seq)，DNA酶1高灵敏位点测序(DNase 1Hypersensitive Site Sequencing，DNase-Seq)，MNase辅助的核小体分离测序(MNase-Assisted Isolation of Nucleosome Sequencing，MAINE-Seq)，染色质免疫沉淀测序(Chromatin Immunoprecipitation Sequencing，ChIP-Seq)，调控元件的甲醛辅助分离(Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Element，FAIRE-Seq)，转座酶可接近染色质测定测序(Assay for Transposase-Accessible Chromatin Sequencing，ATAC-Seq)，通过配对末端标签测序的染色质相互作用分析(Chromatin InteractionAnalysis by Paired-End Tag Sequencing，ChIA-PET)，染色质构象捕获(Hi-C/3C-Seq)，环形染色质构象捕获(4-C或4C-Seq)，染色质构象捕获碳拷贝(5-C)，逆转录转座子捕获测序(Retrotransposon Capture Sequencing，RC-Seq)，转座子测序(TransposonSequencing，Tn-Seq)或***测序(Insertion Sequencing，INSeq)，易位-捕获测序(Translocation-Capture Sequencing，TC-Seq)，基于荧光的方法(例如：微阵列、实时PCR)，基于质量的方法(质谱)，基于限制性酶的方法，基于抗体免疫沉淀的方法，以及数字PCR。

本发明的肽或多肽的量可以以多种方式来确定。直接测量涉及基于信号来测量肽或多肽的量，所述信号其由肽或多肽自身获得，并且其强度与样品中存在的肽的分子数量直接相关。这样的信号(有时称为强度信号)可以例如通过测量肽或多肽的特定物理或化学特性的强度值来获得。间接测量包括测量由第二组分(即不是肽或多肽自身的组分)或生物读出***(例如可测量的细胞应答、配体、标记或酶促反应产物)获得的信号。

确定肽或多肽的量可以通过用于确定样品中肽的量的所有已知方式来实现。所述方式包括免疫测定和/或免疫组织化学设备以及多种夹心、竞争或其他测定形式的可以利用经标记分子的方法。所述测定将产生指示肽或多肽的存在或不存在的信号。此外，信号强度可以优选地与样品中存在的多肽的量直接或间接(例如，成反比)相关。其他合适的方法包括测量肽或多肽特异性的物理或化学特性，例如其精确的分子量或NMR谱。所述方法优选地包括生物传感器；与免疫测定偶联的光学设备；生物芯片；分析设备，例如质谱仪、NMR-分析仪或色谱设备。此外，方法包括基于微板ELISA的方法、全自动化或自动免疫测定、钴结合测定和胶乳凝集测定。

确定肽或多肽的量包括测量可从样品中肽或多肽获得的特定强度信号的步骤。如上所述，这样的信号可以是以在质谱中观察到的肽或多肽特异性m/z变量或者以肽或多肽特异性NMR谱观察到的信号强度。

确定肽或多肽的量可以优选地包括以下步骤：(a)使肽与特异性配体接触，(b)(任选地)移除未结合的配体，(c)测量结合的配体的量。结合的配体将产生强度信号。根据本发明的结合包括共价和非共价结合两种。根据本发明的配体可以是与本文所述肽或多肽结合的任何化合物，例如肽、多肽、核酸或小分子。优选的配体包括抗体；核酸；例如肽或多肽的受体或结合配偶体的肽或多肽及其包含肽结合结构域的片段；以及适配体，例如核酸或肽适配体。制备这样的配体的方法在本领域中是公知的。例如，商业供应商也提供合适抗体或适配体的鉴定和产生。本领域技术人员熟悉开发具有更高亲和力和特异性的这样的配体的衍生物的方法。例如，可向核酸、肽或多肽中引入随机突变。如本文所使用的术语“抗体”是指分泌型免疫球蛋白，其缺乏跨膜区域并且因此可以被释放至血流和体腔中。抗体通常由包含通过二硫键连接的两条相同重链和两条相同轻链的四条多肽链构成，并且类似于“Y”形大分子。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个各自具有单抗原结合位点的称为“Fab片段”(也称为“Fab部分”或“Fab区”)的相同抗原结合片段，以及其名称反映其容易结晶的能力的残余“Fc片段”(也称为“Fc部分”或“Fc区”)。已确定了人IgG Fc区的晶体结构(Deisenhofer(1981)Biochemistry 20：2361-2370)。在IgG、IgA和IgD同种型中，Fc区由衍生自抗体两条重链的CH2和CH3结构域的两个相同蛋白质片段构成；在IgM和IgE同种型中，Fc区在每条多肽链中包含三个重链恒定结构域(CH2-4)。此外，较小的免疫球蛋白分子天然存在或者已人工构建。术语“Fab’片段”是指另外地包含Ig分子的铰链区的Fab片段，而“F(a’)2片段”应被理解为包含化学连接或通过二硫键连接的两个Fab’片段。同时，“单结构域抗体(singledomain antibody，sdAb)”(Desmyter等(1996)Nat.Structure Biol.3：803-811)和“纳米抗体(nanobody)”仅包含单个VH结构域，“单链Fv(scFv)”片段包含通过短接头肽与轻链可变结构域连接的重链可变结构域(Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，5879-5883)。可以通过将两个scFv连接(scFvA-scFvB)来工程化二价单链可变片段(di-scFv)。这可以通过产生具有两个VH区和两个VL区的单肽链得到“串联scFv”(VHA-VLA-VHB-VLB)来实现。另一种可能性是产生具有对两个可变区折叠在一起而言太短从而迫使scFv二聚的接头的scFv。通常，使用长度为5个残基的接头来产生这些二聚体。这种类型被称为“双抗体(diabody)”。VH和VL结构域之间的较短接头(1或2个氨基酸)还导致形成单特异性三聚体，所谓的“三抗体(triabody)”或“三体(tribody)”。通过分别表达具有VHA-VLB和VHB-VLA或者VLA-VHB和VLB-VHA排布的链形成双特异性双抗体。单链双抗体(single-chain diabody，scDb)包含通过12至20个氨基酸(优选14个氨基酸)的接头肽(P)连接的VHA-VLB和VHB-VLA片段(VHA-VLB-P-VHB-VLA)。“双特异性T细胞衔接体(Bi-specific T-cell engager，BiTE)”是由不同抗体的2个scFv组成的融合蛋白，其中一个scFv通过CD3受体与T细胞结合，另一个通过肿瘤特异性分子与肿瘤细胞结合(Kufer等(2004)Trends Biotechnol.22：238-244)。双亲和重靶向分子(dual affinity retargeting molecule，“DART分子)是另外地通过C末端二硫桥稳定的双抗体。本发明还包括单链抗体和其中表现出所需抗原特异性的非人供体抗体的氨基酸序列与人受体抗体的序列组合的人源化杂合抗体。

供体序列通常至少包含供体的抗原结合氨基酸残基，但也可以包含供体抗体的其他结构和/或功能上相关的氨基酸残基。这样的杂合体可以通过本领域公知的若干种方法来制备。优选地，配体或试剂与肽或多肽特异性结合。根据本发明的特异性结合意指配体或试剂应当基本上不与待分析样品中存在的其他肽、多肽或物质结合(“交叉反应”)。优选地，与任何其他相关肽或多肽相比，特异性结合的肽或多肽应以至少高3倍、更优选至少高10倍并且甚至更优选至少高50倍的亲和力结合。如果非特异性结合仍可以清楚地进行区分和测量，例如在Western印迹上根据其尺寸或者根据其在样品中相对较高丰度来清楚地区分和测量，则非特异性结合是可接受的。可以通过本领域已知的任何方法来测量配体的结合。优选地，所述方法是半定量或定量的。以下描述了合适的方法。

首先，可以例如通过NMR或表面等离子体共振来直接测量配体的结合。第二，如果配体还充当目的肽或多肽的酶活性底物，则可以测量酶促反应产物(例如，可以通过例如在Western印迹上测量经切割底物的量来测量蛋白酶的量)。或者，配体可以自身表现出酶促特性，并且可以使“配体/肽或多肽”复合物或者被肽或多肽分别结合的配体与允许通过产生强度信号进行检测的合适底物接触。对于酶促反应产物的测量而言，优选地，底物的量是饱和的。在反应之前，还可以用可检测标记对底物进行标记。优选地，使样品与底物接触足够的时间。足够的时间是指产生可检测的，优选可测量的量的产物所需的时间。作为测量产物量的替代，还可以测量出现给定(例如，可检测)量产物所需的时间。第三，还可以使配体与允许配体的检测和测量的标记共价或非共价偶联。可通过直接或间接方法进行标记。直接标记涉及使标记与配体直接(共价或非共价)偶联。间接标记涉及第二配体与第一配体的结合(共价或非共价)。第二配体应与第一配体特异性结合。所述第二配体可以与合适的标记偶联和/或是与第二配体结合的第三配体的靶标(受体)。第二、第三或甚至更高次配体的使用通常是用于提高信号强度。合适的第二和更高次配体可以包括抗体、第二抗体和众所周知的链霉抗生物素蛋白-生物素体系(Vector Laboratories，Inc.)。还可用本领域已知的一种或更多种标签对配体或底物进行“标记”。然后，这样的标签可以是更高次配体的靶标。合适的标签包括生物素、地高辛配基(digoxygenin)、His-标签、谷胱甘肽-S-转移酶、FLAG、GFP、myc标签、甲型流感病毒血凝素(HA)、麦芽糖结合蛋白等。在肽或多肽的情况下，标签优选地在N-末端和/或C-末端。合适的标记是可通过合适的检测方法检测的任何标记。典型的标记包括金颗粒、胶乳珠、吖啶酯(acridan ester)、鲁米诺、钌、酶活性标记、放射性标记、磁性标记(“例如，磁珠”，包括顺磁和超顺磁标记)和荧光标记。酶活性标记包括例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、及其衍生物。用于检测的合适底物包括二-氨基-联苯胺(di-amino-benzidine，DAB)、3，3’-5，5’-四甲基联苯胺、NBT-BCIP(4-硝基蓝四唑氯化物和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸酯)、CDP-Star^TM(Amersham Bioscience)、ECF^TM(Amersham Biosciences)。合适的酶-底物组合可以产生可以根据本领域已知方法(例如，使用光敏膜或合适的照相***)测量的着色反应产物、荧光或化学发光。对于测量酶促反应而言，以上给出的标准类似地适用。典型的荧光标记包括荧光蛋白(例如GFP及其衍生物)、Cy3、Cy5、德克萨斯红(Texas Red)、荧光素和Alexa染料(例如Alexa 568)。另外的荧光标记可例如从Molecular Probes(Oregon)获得。还考虑使用量子点作为荧光标记。典型的放射性标记包括35S、125I、32P、33P等。放射性标记可以通过已知且合适的任何方法，例如光敏膜或磷光体成像仪进行检测。根据本发明的合适测量方法还包括沉淀(特别是免疫沉淀)、电化学发光(电产生的化学发光)、RIA(放射免疫测定)、ELISA(酶联免疫吸附测定)、夹心酶免疫测试、电化学发光夹心免疫测定(electrochemiluminescence sandwichimmunoassay，ECLIA)、解离增强镧系元素荧光免疫测定(dissociation-enhancedlanthanide fluoro immuno assay，DELFIA)、闪烁迫近测定(scintillation proximityassay，SPA)、比浊法、浊度法、胶乳增强比浊法或浊度法、或者固相免疫测试，如例如反相蛋白质阵列或抗体阵列。本领域已知的其他方法(例如凝胶电泳、2D凝胶电泳、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western印迹和质谱)可以单独使用或者与上述标记或其他检测方法组合使用。

肽或多肽的量还可以如下确定：(a)使包含上述肽或多肽的配体的固体支持物与包含肽或多肽的样品接触，以及(b)测量结合至支持物的肽或多肽的量。配体优选地以固定化形式存在于固体支持物上，所述配体优选地选自核酸、肽、多肽、抗体和适配体。用于制备固体支持物的材料在本领域中是公知的，并且尤其包括可商购获得的柱材料，聚苯乙烯珠，胶乳珠，磁珠，胶体金属颗粒，玻璃和/或硅芯片和表面，硝化纤维素条、膜、片、duracyte，反应盘的孔和壁，塑料管，等等。配体或试剂可以与许多不同的载体结合。众所周知的载体的实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、右旋糖酐、尼龙、直链淀粉、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿。为了本发明的目的，载体的性质可以是可溶性的或不溶性的。用于固定/固定化所述配体的合适方法是众所周知的，并且包括但不限于离子、疏水、共价相互作用等。还考虑使用“悬浮阵列”作为根据本发明的阵列(Nolan2002，Trends Bioteehnol.20(1)：9-12)。在这样的悬浮阵列中，例如微珠或微球的载体悬浮存在。阵列由携带不同配体的可能被标记的不同微珠或微球组成。制备，例如基于固相化学和光不稳定保护基团来制备这样的阵列的方法是公知的(US 5,744,305)。

如本文所使用的术语“CpG位点”涉及包含在多核苷酸中，优选包含在DNA中，更优选包含在对象的基因组DNA中的二核苷酸序列5’-CG-3’。根据本发明待分析的CpG位点是位于目的基因的内含子、外显子或启动子区中的CpG位点。在CpG位点位于启动子区的情况下，所述区域优选地为在相应目的基因的翻译起始位点上游的3000个核苷酸、2500个核苷酸、2100个核苷酸或1750个核苷酸。更优选地，根据本发明待分析的CpG位点是位于目的基因之基因翻译起始位点上游的1750至3000个核苷酸、2100至3000个核苷酸或2500至3000个核苷酸的区域中的CpG位点。

因此，分析与本发明的CpG位点对应的CpG位点也涵盖在本发明中。技术人员知道如何确定样品中对应于上文详述的CpG位点的CpG位点，例如通过确定目的基因的翻译起始位点和/或通过比对来自样品的所述序列与目的基因的序列来确定。此外，本发明还设想，除确定本发明CpG位点的甲基化状态之外，还确定其他CpG位点的甲基化状态。

术语“确定甲基化状态”涉及确定多核苷酸中胞嘧啶的嘧啶环的5位是否存在甲基。优选地，在3’方向上鸟苷残基紧随胞嘧啶残基，这两个残基形成CpG位点。所述甲基的存在可以通过技术人员熟知的多种方法来确定，包括例如甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR，MSP)、全基因组重亚硫酸盐测序或其他基于测序的方法(重亚硫酸盐测序(BS-Seq)、重亚硫酸盐后衔接子标记(PBAT)、基于细分的全基因组重亚硫酸盐测序(T-WGBS)、氧化重亚硫酸盐测序(oxBS-Seq)、Tet辅助的重亚硫酸盐测序(TAB-Seq)、甲基化DNA免疫沉淀测序(MeDIP-Seq)、甲基化捕获(MethylCap)测序、甲基结合结构域捕获(MBDCap)测序、简化代表性重亚硫酸盐测序(RRBS-Seq))，经重亚硫酸盐处理DNA的基于实时PCR的方法(例如Methylight)、甲基化敏感性限制性酶限制(restriction with a methylation-sensitive restriction enzyme)(例如在通过连接介导PCR的HpaII微小片段富集(HpaIItiny fragment enrichment by ligation-mediated PCR，HELP)-测定中)、经重亚硫酸盐处理DNA的焦磷酸测序，等等；AIMS，甲基化间位点扩增(amplification of intcr-methylated site)；BC-seq，亚硫酸氢盐(bisulphite)转化随后进行捕获和测序；BiMP；亚硫酸氢盐甲基化图谱绘制(bisulphite methylation profiling)；BS，亚硫酸氢盐测序(bisulphite sequencing)；BSPP，亚硫酸氢盐锁式探针(bisulphite padlock probe)；CHARM，相对甲基化综合高通量阵列(comprehensive high-throughput array forrelative methylation)；COBRA，联合亚硫酸氢盐限制性分析(combined bisulphiterestriction analysis)；DMH，差异甲基化杂交(differential methylationhybridization)；HELP，通过连接介导PCR的HpaII微小片段富集；MCA，甲基化CpG岛扩增(methylated CpG island amplification)；MCAM，MCA与微阵列杂交(MCA withmicroarray hybridization)；MeDIP、mDIP和mCIP，甲基化DNA免疫沉淀；MIRA，甲基化CpG岛回收测定(methylated CpG island recovery assay)；MMASS，基于微阵列的单样品甲基化评估(microarray-based methylation assessment of single sample)； MS-AP-PCR，甲基化敏感性任意引发PCR(methylation-sensitive arbitrarily primed PCR)；MSCC，甲基化敏感性切割计数(methylation-sensitive cut counting)；MSP，甲基化特异性PCR；MS-SNuPE，甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(methylation-sensitive single nucleotideprimer extension)；NGS，下一代测序；RLGS，限制性标记基因组扫描(restrictionlandmark genome scanning)；RRBS，简化代表性亚硫酸氢盐测序(reducedrepresentation bisulphite sequencing)；-seq，后测序(followed by sequencing)；WGSBS，全基因组鸟枪亚硫酸氢盐测序(whole-genome shotgun bisulphite sequencing)。(Manel Esteller，Cancer epigenomics：DNA methylomes and histone-modificationmaps，Nature，2007，8：286-298；Peter W.Laird，Principles and challenges of genome-wide DNA methylation analysis.Nature Review Genetics，2010，11：191-203)。优选地，通过下文实施例中所述的方法来确定甲基化状态，所方法例如基于测序的Infinium 27K甲基化测定或基于质谱的MALDI-TOF质谱法。因此，特定多核苷酸分子中特定胞嘧啶残基的甲基化状态只能是“未甲基化的”(意指0％甲基化)或“甲基化的”(意指100％甲基化)。在包含两个胞嘧啶残基的双链DNA分子中的CpG位点的情况下，甲基化状态可以是“未甲基化的”(意指0％甲基化，即两个胞嘧啶残基都没有甲基化)、“半甲基化的”(意指50％甲基化，即两个胞嘧啶残基中一个是甲基化的)、或者“甲基化的”或“完全甲基化”(意指100％甲基化，即两个胞嘧啶残基均甲基化)。然而，本领域技术人员应该理解，如果获得来自大量细胞的多核苷酸，并且确定了所述大量多核苷酸中特定胞嘧啶残基的甲基化状态，则确定平均甲基化状态，其可以例如优选地表示为百分比(甲基化％)，并且可以为介于0％和100％之间的任何值。技术人员还应理解，在确定不同细胞群的平均甲基化的情况下，甲基化状态可以以百分比表示。例如，根据本发明的血细胞是不同细胞类型的混合物。可能的是，某些细胞类型具有高甲基化水平，而另一些细胞类型具有较低的甲基化水平，并且最终达到例如50％的平均甲基化。

如本文所使用的术语“检测剂”涉及这样的试剂，其特异性地相互作用并且由此识别本发明目的基因的表达水平、目的基因的甲基化状态、或者miRNA的存在或量。优选地，所述检测剂是蛋白质、多肽、肽、多核苷酸或寡核苷酸。优选地，检测剂以允许所述检测剂通过合适测量检测的方式进行标记。标记可以通过本领域公知的多种技术并且根据所使用的标记来进行。优选的使用标记是荧光标记，其尤其包含例如荧光素、罗丹明或德克萨斯红的荧光染料。然而，标记也可以是酶或抗体。设想用作标记的酶将通过与底物反应产生可检测的信号。合适的酶、底物和技术在本领域中是公知的。用作标记的检测剂可特异性地识别可以被直接检测(例如，自身发荧光的靶分子)或间接检测(例如，产生可检测信号的靶分子，例如酶)的靶分子。使样品的经标记检测剂与样品接触以允许特异性相互作用。可能需要洗涤以去除非特异性结合的检测剂，否则会产生假值。在此相互作用步骤完成之后，研究人员将检测设备放入阅读设备或扫描仪中。用于检测荧光标记的设备优选地由一些激光器、优选地特殊显微镜和相机组成。荧光标记将被激光器激发，显微镜和相机一起工作以产生样品的数字图像。然后，可将这些数据存储在计算机中并使用特殊程序例如减去背景数据。所得到的数据优选地被归一化，并且可被转换为数字和常用单位格式。对数据进行分析以将样品与参考进行比较并鉴定显著变化。

如本文所使用的“比较”涵盖将待分析样品包含的本文所述指标的存在、不存在或量与合适参考样品中所述指标的存在、不存在或量进行比较。应理解，如本文所使用的比较是指对应参数或值的比较，例如将本文所述指标的绝对量与所述指标的绝对参考量进行比较；将指标的浓度与所述指标的参考浓度进行比较；将由样品中本文所述指标获得的强度信号与参考样品中所述指标的相同类型强度信号进行比较。所涉及的比较可以人工或计算机辅助地进行。对于计算机辅助的比较，确定量的值可以与对应于通过计算机程序存储在数据库中的合适参考的值进行比较。计算机程序可以通过专家***进一步对比较结果进行评价。因此，本文所述的鉴定结果可以以合适的输出格式自动化提供。

术语“样品”或“目的样品”在本文中可互换使用，是指旨在代表整个组织、器官或个体通常小于这样的组织、器官或个体的组织、器官或个体部分或碎片。在分析之后，样品提供关于组织状态或者器官或个体的健康或患病状态的信息。样品的实例包括但不限于流体样品，例如血液、血清、血浆、滑液、尿、唾液、淋巴液、泪液以及可从腺(例如乳腺或***)获得的流体；或者组织样品，例如从肿瘤组织或肿瘤邻近组织获得的组织提取物。样品的另一些实例是细胞培养物或组织培养物，例如但不限于不同癌细胞的培养物。

样品可以通过众所周知的技术来获得，并且优选地包括从消化道、肝、胰腺、肛管、口腔、上呼吸消化道和表皮获得的擦拭物、拭子或活组织。这样的样品可以通过使用刷子、(棉花)拭子、刮刀、冲洗/洗涤流体、穿孔活检设备、用针穿刺腔或外科手术用器械来获得。组织或器官样品可以通过例如活检或其他外科手术操作从任何组织或器官获得。更优选地，样品是体液样品，例如优选血液、血浆、血清、尿、唾液、泪液和可从乳腺获得的流体(例如，乳)。最优选地，体液样品包含对象的细胞。分离的细胞可以通过例如过滤、离心或细胞分选的分离技术从体液或组织或器官获得。优选地，样品从下文所述的那些体液获得。更优选地，细胞如下文所述从所述体液中分离。

样品的分析可以在视觉或化学基础上进行。视觉分析包括但不限于允许进行样品的形态学评价的组织、器官或个体的显微成像或放射照相扫描。化学分析包括但不限于检测特定指标的存在或不存在或者其量或水平的变化。

如本文所使用的术语“参考样品”是指以与目的样品基本上相同的方式进行分析并将其信息与目的样品的信息进行比较的样品。因此，参考样品提供允许对从目的样品获得的信息进行评价的标准。参考样品可以来源于健康或正常的组织、器官或个体，从而提供组织、器官或个体的健康状态的标准。正常参考样品的状态与目的样品的状态之间的差异可以指示疾病发生的风险或者这样的疾病或病症的存在或进一步进展。参考样品可以来源于异常或患病的组织、器官或个体，从而提供组织、器官或个体的患病状态的标准。异常参考样品的状态与目的样品的状态之间的差异可以指示疾病发生的风险降低或者这样的疾病或病症不存在或好转。参考样品也可以与目的样品来源于相同组织、器官或个体，但是在较早时间点被取得。较早所取参考样品的状态与目的样品的状态之间的差异可以指示疾病的进展，即疾病随着时间的推移好转或恶化。在较早或较晚的时间点取得参考样品，只要在取得参考样品和取得目的样品之间流逝一段时间即可。这样的时间段可表示数年(例如，1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100年)、数月(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月)、数周(例如，1、2、3、4、5、6、7、8周)、数天(例如，1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500天)、数小时(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12小时)、数分钟(例如，1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60分钟)或数秒(例如，1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60秒)。

参考样品可以与目的样品“不同地处理”或“不同地暴露”，只要除单因素之外两个样品都以基本上相同的方式进行处理即可。这样的单因素包括但不限于对某种物质的暴露时间、暴露浓度或暴露温度。因此，目的样品可以与参考样品暴露于不同剂量的某种物质，或者可以与参考样品暴露持续不同的时间间隔，或者可以与参考样品在不同的温度下暴露。目的样品可以暴露的不同剂量包括但不限于参考样品所暴露之剂量的升高或降低2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍和/或1000倍的剂量。目的样品可以暴露于的不同暴露时间包括但不限于参考之暴露的长或短2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍和/或1000倍的时间段。目的样品可以暴露于的不同暴露温度包括但不限于参考之暴露的升高或降低2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍和/或1000倍的温度。在一个非限制性实例中，与参考样品相比，目的样品可以暴露于浓度升高10倍的物质。然后，以基本上相同的方式对两个样品进行分析从而允许确定浓度升高的这种物质对目的样品的作用，即有益或不利作用。技术人员将理解，该实例经必要的修正适用于不同的浓度范围、不同的暴露时间和/或不同的暴露温度。

术语指标的水平“降低”或“下降”是指与参考或参考样品相比，样品中这样的指标的水平降低。术语指标的水平“升高”或“提高”是指与参考或参考样品相比，样品中这样的指标的水平更高。

在原理上，可以通过应用标准统计学方法基于给定miRNA的平均值或中值来对本文所指定的对象组或群组计算参考量。特别地，例如旨在或不旨在判断事件的方法的测试的精确度最好由其接受者操作特征(receiver-operating characteristic，ROC)来描述(尤其参见Zweig 1993，Clin.Chem.39：561-577)。ROC图是由在所观察到的整个数据范围上不断改变判定阈值获得的所有灵敏度相对于特异性对的图。诊断方法的临床表现取决于其精确度，即其将对象正确地分配到某种预后或诊断的能力。ROC图通过在适于区分的完整阈值范围将灵敏度相对于1-特异性绘图来表示两个分布之间的重叠。在y轴上是灵敏度或真阳性分数，其被定义为真阳性测试结果数与真阳性数和假阴性测试结果数之和的比率。这在疾病或病症的存在下也被称为阳性。其单独地由受影响的亚组计算。在x轴上是假阳性分数或1-特异性，其被定义为假阳性结果数与真阴性数和假阳性结果数之和的比率。其是特异性的指数，并且完全由未受影响的亚组计算。由于真和假阳性分数是完全单独地进行计算，因此通过使用来自两个不同亚组的测试结果，ROC图独立于群组中事件的普遍性。ROC图上的每个点表示对应于特定判定阈值的灵敏度/-特异性对。具有完美辨别(在两个结果分布中没有重叠)的测试具有经过左上角的ROC图，其中真阳性分数为1.0或100％(完美灵敏度)，假阳性分数为0(完美特异性)。没有辨别(两组结果的分布相同)的测试的理论图为从左下角到右上角的45°对角线。大多数图落在这两个极端之间。如果ROC图完全落在45°对角线之下，则这容易地通过将“阳性”标准从“大于”反转为“小于”来矫正，反之亦然。定性地，图越靠近左上角，测试的整体精确度就越高。根据期望的置信区间，可以从ROC曲线推导出阈值，允许分别用灵敏度和特异性的适当平衡诊断或预测给定事件。因此，可以优选地通过如上所述建立用于所述群组的ROC并从其推导出阈值量来生成用于本发明方法的参考。根据诊断方法的期望灵敏度和特异性，ROC图允许推导出合适的阈值。优选地，参考量位于这样的值范围内，其表示至少75％的灵敏度和至少45％的特异性、或者至少80％的灵敏度和至少40％的特异性、或者至少85％的灵敏度和至少33％的特异性、或者至少90％的灵敏度和至少25％的特异性。

如果不知道供体是否患有BC或MBC，优选地，如本文所使用的参考量由在治疗前获得的对象样品获得。该参考量水平可以是离散数字，或者可以是数字的范围。显然，参考水平或量可以在miRNA的个体物种之间变化。因此，优选地，用包含已知量的每种特定miRNA的样品或一系列样品校准测量***。技术人员理解，在这种情况下，miRNA的量可优选表示为任意单位(AU)。因此，优选地，通过将从样品获得的信号与包括在校准曲线中的信号进行比较来确定miRNA的量。适用于个体对象的参考量可以根据多种生理参数(例如年龄或亚群)而变化。因此，合适的参考量可以通过本发明的方法由待分析的参考样品与测试样品一起(即同时或先后)确定。此外，可以优选地使用阈值量作为参考量。参考量可以优选地由已知患有BC或MBC的患有BC或MBC的对象或对象组的样品获得。参考量还可以优选地由已知未患有BC或MBC的对象或对象组的样品获得。应理解，上述量可能由于统计学和测量误差而变化。偏差，即本文提及的miRNA量的降低或升高优选地是统计学上显著的偏差，即统计学上显著的降低或统计学上显著的升高。

如本文所使用的疾病或病症的“治疗”意指实现以下一项或更多项：(a)减轻病症的严重程度；(b)限制或预防所治疗病症特征性的症状的发生；(c)抑制所治疗病症特征性的症状的恶化；(d)限制或预防先前已患有病症的个体中所述病症的复发；以及(e)限制或预防先前对病症具有症状的个体中症状的复发。

如本文所使用的疾病或病症的“预防”意指预防在患者中发生这样的疾病或病症。

如本文所使用的术语“治疗”是指应用于对象以在显著程度上改善本文所涉及的疾病或病症或者其伴随的症状的所有措施。如本文所使用的所述治疗还包括针对本文提及的疾病或病症使得完全恢复健康的措施。应当理解，根据本发明所使用的治疗可能不是在所有的待治疗对象中都有效。然而，该术语应要求可以成功治疗患有本文所涉及疾病或病症的对象中的统计学显著部分。本领域技术人员可以使用上文讨论的多种众所周知统计学评价工具来确定某一部分是否具有统计学显著性而无需进一步的工作。

如本文所使用的术语“乳腺癌治疗”涉及向患有乳腺癌(包括转移性乳腺癌)的对象施用从对象中除去癌细胞、抑制癌细胞生长、杀伤癌细胞或促使患者机体抑制癌细胞生长或杀伤癌细胞的措施。优选地，乳腺癌治疗是化学治疗、抗激素治疗、靶向治疗、免疫治疗、或其任意组合。然而，还设想癌症治疗是单独或与其他治疗方案组合的放射治疗或外科手术。技术人员理解，乳腺癌治疗的选择取决于若干种因素，如对象的年龄、肿瘤分期和肿瘤细胞的受体状态。然而，本领域技术人员还理解，可以通过本发明的方法来辅助乳腺癌治疗的选择：如果例如通过用于诊断BC的方法诊断出BC，但是通过用于诊断MBC的方法未诊断出MBC，则肿瘤的外科手术去除可能是足够的。如果例如通过用于诊断BC的方法诊断出BC，并且通过用于诊断MBC的方法诊断出MBC，则除外科手术之外的治疗措施，例如化学治疗和/或靶向治疗可能是合适的。同样地，如果例如通过用于诊断BC的方法诊断出BC并且通过用于确定CTC状态的方法确定了不利的CTC状态，则例如可能需要向治疗方案进一步添加免疫治疗。

如本文所使用的术语“化学治疗”涉及用抗肿瘤药物治疗对象。优选地，化学治疗是包括以下的治疗：烷化剂(例如，环磷酰胺)、铂剂(例如，卡铂)、蒽环类(例如，多柔比星、表柔比星、伊达比星或柔红霉素)和拓扑异构酶II抑制剂(例如，依托泊苷、伊立替康、拓扑替康、喜树碱或VP16)、间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)-抑制剂(例如，克唑替尼(Crizotinib)或AP26130)、极光激酶抑制剂(aurora kinase inhibitor)(例如，N-[4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]嘧啶-2-基]硫烷基苯基]环丙烷甲酰胺(VX-680))、抗血管生成剂(例如，贝伐单抗)、或碘131-1-(3-碘苄基)胍(治疗性间碘苄胍)、组蛋白脱乙酰酶(histone deacetylase，HDAC)抑制剂，单独地或其任意合适组合。应理解，化学治疗优选地涉及完整的治疗周期，即向对象施用相隔数天或数周不进行这样的施用的一系列数个(例如4、6或8个)剂量的一种或更多种抗肿瘤药物。

术语“抗激素治疗”涉及通过阻断肿瘤细胞上表达的激素受体(例如，***受体或孕酮受体)或者通过阻断***的生物合成的乳腺癌治疗。阻断激素受体可以优选地通过施用特异性结合所述激素受体并且从而阻断所述激素受体的活性的化合物(例如他莫昔芬)来实现。阻断***生物合成优选地通过施用如例如阿那曲唑或来曲唑的芳香酶抑制剂来实现。技术人员知晓，抗激素治疗仅在肿瘤细胞表达激素受体的情况下是可取的。

如本文所使用的术语“靶向治疗”涉及向患者施用已知通过干扰已知为肿瘤发生或癌症或癌细胞生长所必需的特定分子来阻断癌细胞生长的化学物质。技术人员已知的实例是如例如PARP抑制剂(例如，Iniparib)的小分子或如例如曲妥珠单抗的单克隆抗体。

如本文所使用的术语“免疫治疗”涉及通过调节对象的免疫应答来治疗癌症。所述调节可以是诱导、增强或抑制所述免疫应答。术语“基于细胞的免疫治疗”涉及包括向对象施用免疫细胞(例如，T细胞，优选肿瘤特异性NK细胞)的乳腺癌治疗。

术语“放射治疗”或“放疗”是技术人员已知的。该术语涉及使用电离辐射来治疗或控制癌症。技术人员还已知术语“外科手术”，其涉及用于治疗乳腺癌的手术措施，例如，肿瘤组织切除。

如本文所使用的术语“治疗监测”涉及获得关于针对癌症的治疗对患有所述癌症之对象的癌症状态的效果的指示。优选地，治疗监测包括将本发明的方法应用于来自同一对象的两个样品，其中第一样品在第二样品之前的时间点获得。优选地，获得第一样品的时间点与获得第二样品的时间点相隔约一周、约两周、约三周、约四周、约五周、约六周、约七周、约两个月、约三个月、约五个月、约六个月或多于约六个月。然而，本发明还设想，治疗监测的方法用于对象的长期监测，例如监测无复发存活的时间等。在这种情况下，获得第一样品的时间点与获得第二样品的时间点优选地相隔至少六个月、至少一年、至少两年、至少三年、至少四年、至少五年或至少六年。本领域技术人员已知第一样品优选地在癌症治疗开始之前获得，而第二样品优选地在开始治疗之后获得。然而，本发明还设想，两个样品都在开始治疗之后获得。技术人员还理解，根据本发明的治疗监测方法可以获得多于两个连续样品，并且在这种情况下，在第一时间点获得的样品可以用作相对于第二样品以及第三样品的第一样品。经过必要的修改，仍然可以将在第二时间点获得的样品用作相对于第三样品的第一样品，等等。

如本文所使用的术语“治疗成功”优选地涉及在显著程度上改善本文所涉及的疾病或病症或者其伴随的症状。更优选地，该术语涉及所述对象的完全治愈，即涉及防止转移性乳腺癌的发展和/或复发至少5年。因此，“确定治疗成功”涉及评估据此对象被成功治疗的可能性。优选地，该术语涉及预测对象的无进展存活和/或总体存活，更优选地在特定时间段内。术语“预测无进展存活”涉及确定对象在特定时间段内没有转移性乳腺癌复发和/或进展而存活的可能性。因此，术语“预测总体存活”涉及确定据此对象在特定时间段内存活的可能性。优选地，所述时间段为至少12个月，更优选至少24个月。

术语“医药”、“药剂”和“药物”在本文中可互换使用，是指用于鉴定、预防或治疗组织状态或疾病的物质和/或物质组合。

如本文所使用的术语“试剂盒”是指优选地单独提供或提供在单个容器内的上述组分的集合。容器还优选地包含有用于实施本发明方法的说明。在本说明书中已经给出了试剂盒的这些组分的实例及其使用方法。优选地，试剂盒包含在即用型制剂中的上述组分。优选地，试剂盒可另外地包括说明书，例如用于调节组分(例如，检测剂的浓度)以及用于解释关于通过本发明方法所提供诊断的任何测定的结果的用户手册。特别地，这样的手册可以包括用于将确定基因产物的量分配至诊断类型的信息。细节见于本说明书的别处。此外，这样的用户手册可以提供关于正确地使用试剂盒组分用于确定相应生物标志物的量的说明。用户手册可以以纸质或电子形式提供(例如，存储在CD或CD ROM上)。本发明还涉及所述试剂盒在根据本发明的任何方法中的用途。

如本文所使用的术语“设备”涉及至少包含有效地互相联系以允许进行诊断的上述装置的装置***。在上文结合本发明的方法公开了优选的用于确定基因产物之甲基化状态或量的装置和用于进行比较的装置。如何以操作方式联系装置将取决于设备中包括的装置的类型。例如，在应用用于自动化确定基因产物的甲基化状态或量的装置的情况下，可以通过例如计算机程序来处理由所述自动化操作装置获得的数据以建立诊断。优选地，在这种情况下，装置包含在单设备中。因此，所述设备可以包括用于确定样品中基因产物的甲基化状态或量的分析单元以及用于处理所得数据用于诊断的评估单元。在上文结合涉及本发明方法的实施方案公开了优选的检测装置。在这种情况下，使装置有效地连接，使得***的使用者由于手册中给出的说明和解释将量的确定结果及其诊断值结合在一起。在这样的实施方案中装置可以呈现为单独的设备并且优选地作为试剂盒包装在一起。本领域技术人员将了解如何联系装置而无需进一步的创造性技能。优选的设备是可以在没有专业临床医师的特定知识的情况下应用的那些，例如仅需要加载样品的测试条或电子设备。结果可以作为参数诊断原始数据的输出，优选地作为绝对或相对量给出。应理解，这些数据将需要由临床医师解释。然而，还设想了专家***设备，其中输出包含经处理的诊断原始数据，其解释不需要专业的临床医师。另一些优选设备包含分析单元/设备(例如，生物传感器、阵列、与特异性识别多肽的配体偶联的固体支持物、等离子体表面共振设备、NMR光谱仪、质谱仪等)或上文根据本发明方法提及的评估单元/设备。

具体实施方式

在第一方面，本发明涉及在对象中预后和/或诊断疾病的方法，其包括在对象中：

a)确定选自HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P、DYRK4的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平，以及

b)确定选自miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409、miR-148b的至少一种miRNA标志物的存在。

在一些具体实施方案中，所述疾病是增殖性细胞疾病。在一些具体实施方案中，所述疾病是癌症。特别地，所述癌症选自乳腺癌、胰腺癌和卵巢癌。

在一些具体实施方案中，术语miR-652是指-3p或-5p链(特别是miR-652-3p)的序列，术语miR-801是指-3p或-5p链的序列，术语miR-376c是指-3p或-5p链(特别是miR-376c-3p)的序列，术语miR-376a是指-3p或-5p链(特别是miR-376a-3p)的序列，术语miR-127是指-3p或-5p链(特别是miR-127-3p)的序列，术语miR-409是指-3p或-5p链(特别是miR-409-3p)的序列，术语miR-148b是指-3p或-5p链(特别是miR-148-3p)的序列。

在另一些实施方案中，HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P和/或DYRK4的甲基化状态和/或表达水平改变指示组织状态或疾病的变化，例如组织状态或疾病(特别是癌症)的恶化或好转。特别地，HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P和/或DYRK4的甲基化状态降低指示组织状态或疾病恶化。HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P和/或DYRK4的甲基化状态提高指示组织状态或疾病好转。HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P和/或DYRK4的甲基化状态改变还指示发生经改变的组织状态或疾病(特别是癌症)的风险。更具体地，HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P和/或DYRK4的甲基化状态降低指示发生变性组织状态或疾病(特别是癌症)的风险。HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P和/或DYRK4的甲基化状态改变，特别是HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P和/或DYRK4的甲基化状态降低还指示个体遭受经改变的组织状态或疾病(特别是癌症)。此外，HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P和/或DYRK4的甲基化状态改变，例如HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P和/或DYRK4的甲基化状态水平升高或降低指示对象中组织状态或疾病(特别是癌症)的进展或阶段。特别地，HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P和/或DYRK4的甲基化状态降低指示组织状态或疾病(特别是癌症)的恶化。

特别地，HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P和/或DYRK4的表达水平提高指示组织状态或疾病恶化。HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P和/或DYRK4的表达水平降低指示组织状态或疾病好转。HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P和/或DYRK4的表达水平改变还指示发生经改变的组织状态或疾病(特别是癌症)的风险。更具体地，HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P和/或DYRK4的表达水平提高指示发生变性组织状态或疾病(特别是癌症)的风险。HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P和/或DYRK4的表达水平改变，特别是HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P和/或DYRK4的表达水平提高还指示个体遭受经改变的组织状态或疾病(特别是癌症)。此外，HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P和/或DYRK4的表达水平改变，例如HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P和/或DYRK4的表达水平升高或降低指示对象中组织状态或疾病(特别是癌症)的进展或阶段。特别地，HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P和/或DYRK4的表达水平提高指示组织状态或疾病(特别是癌症)恶化。

在另一些实施方案中，miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409和/或miR-148b水平的改变指示组织状态或疾病的变化，例如组织状态或疾病(特别是癌症)的恶化或好转。

特别地，miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409和/或miR-148b的水平升高指示组织状态或疾病恶化。miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409和/或miR-148b的水平降低指示组织状态或疾病好转。miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409和/或miR-148b水平的改变还指示发生经改变的组织状态或疾病(特别是癌症)的风险。更具体地，miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409和/或miR-148b的水平升高指示发生变性组织状态或疾病(特别是癌症)的风险。miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409和/或miR-148b水平改变，特别是miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409和/或miR-148b水平升高还指示个体遭受经改变的组织状态或疾病(特别是癌症)。此外，miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409和/或miR-148b水平改变，例如miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409和/或miR-148b的水平升高或降低指示对象中组织状态或疾病的进展或阶段。特别地，miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409和/或miR-148b水平升高指示组织状态或疾病(特别是癌症)恶化。

至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平以及至少一种miRNA的存在(特别是量)指示所述对象的预后和/或诊断。癌症的预后和/或诊断包括：

i.发生癌症的风险，

ii.癌症的存在，和/或

iii.癌症的进展、特别是恶化或好转。

在一些具体实施方案中，确定选自miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127p、miR-409和miR-148b的一种miRNA标志物的存在、特别是量。

在一些具体实施方案中，确定选自HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P和DYRK4的一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平。

在一些具体实施方案中，确定至少2、3、4、5、6、7或8种不同甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平，和/或确定至少2、3、4、5、6或7种不同miRNA标志物的存在、特别是量。特别地，确定所有7种miRNA标志物。在确定所有7种miRNA标志物的情况下，这种组合被称为miR-7，即miR-7涵盖所有7种miRNA标志物miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127p、miR-409和miR-148b。

应理解，甲基化标志物和miRNA的多种特定组合可以用于预后和/或诊断癌症。

在一些具体实施方案中，确定以下一种或更多种甲基化标志物组合的甲基化状态和/或表达水平：

HYAL2+RAPSN；S100P+RAPSN；RPTOR+HYAL2；MGRN1+HYAL2；SLC22A18+S100P；HYAL2+SLC22A18；RPTOR+S100P；miR-7+DYRK4；RPTOR+RAPSN；FUT7+RAPSN；MGRN1+SLC22A18；RPTOR+FUT7；FUT7+MGRN1；miR-7+MGRN1；MGRN1+S100P；DYRK4+RAPSN；FUT7+S100P；RPTOR+DYRK4；RPTOR+miR-7；DYRK4+MGRN1；FUT7+HYAL2；miR-7+RAPSN；MGRN1+RAPSN；HYAL2+S100P；miR-7+SLC22A18；RPTOR+MGRN1；DYRK4+SLC22A18；SLC22A18+RAPSN；DYRK4+HYAL2；DYRK4+S100P；FUT7+SLC22A18；miR-7+HYAL2；RPTOR+SLC22A18；miR-7+S100P；miR-7+FUT7；DYRK4+FUT7；

miR-7+DYRK4+FUT7；miR-7+MGRN1+HYAL2；RPTOR+MGRN1+RAPSN；MGRN1+SLC22A18+RAPSN；RPTOR+miR-7+S100P；miR-7+MGRN1+S100P；RPTOR+MGRN1+SLC22A18；RPTOR+FUT7+HYAL2；FUT7+HYAL2+SLC22A18；FUT7+HYAL2+RAPSN；miR-7+SLC22A18+S100P；miR-7+S100P+RAPSN；RPTOR+DYRK4+S100P；DYRK4+SLC22A18+S100P；DYRK4+MGRN1+HYAL2；DYRK4+MGRN1+SLC22A18；RPTOR+DYRK4+MGRN1；miR-7+DYRK4+S100P；DYRK4+S100P+RAPSN；DYRK4+MGRN1+RAPSN；RPTOR+miR-7+MGRN1；DYRK4+FUT7+MGRN1；miR-7+FUT7+RAPSN；miR-7+MGRN1+RAPSN；RPTOR+HYAL2+S100P；HYAL2+S100P+RAPSN；DYRK4+FUT7+RAPSN；MGRN1+HYAL2+SLC22A18；FUT7+MGRN1+S100P；RPTOR+DYRK4+RAPSN；FUT7+S100P+RAPSN；RPTOR+FUT7+S100P；DYRK4+HYAL2+RAPSN；FUT7+HYAL2+S100P；RPTOR+SLC22A18+RAPSN；RPTOR+miR-7+HYAL2；HYAL2+SLC22A18+RAPSN；DYRK4+MGRN1+S100P；miR-7+HYAL2+RAPSN；RPTOR+miR-7+RAPSN；miR-7+FUT7+MGRN1；RPTOR+DYRK4+HYAL2；FUT7+MGRN1+RAPSN；miR-7+DYRK4+MGRN1；FUT7+MGRN1+SLC22A18；RPTOR+miR-7+DYRK4；miR-7+DYRK4+SLC22A18；RPTOR+S100P+RAPSN；miR-7+DYRK4+RAPSN；RPTOR+HYAL2+SLC22A18；SLC22A18+S100P+RAPSN；RPTOR+HYAL2+RAPSN；RPTOR+FUT7+MGRN1；RPTOR+SLC22A18+S100P；MGRN1+SLC22A18+S100P；MGRN1+HYAL2+S100P；miR-7+HYAL2+S100P；RPTOR+MGRN1+S100P；RPTOR+FUT7+SLC22A18；MGRN1+S100P+RAPSN；RPTOR+DYRK4+FUT7；DYRK4+FUT7+HYAL2；RPTOR+FUT7+RAPSN；DYRK4+HYAL2+S100P；FUT7+SLC22A18+RAPSN；RPTOR+miR-7+FUT7；miR-7+FUT7+HYAL2；miR-7+MGRN1+SLC22A18；miR-7+FUT7+SLC22A18；miR-7+DYRK4+HYAL2；MGRN1+HYAL2+RAPSN；FUT7+MGRN1+HYAL2；DYRK4+PUT7+SLC22A18；HYAL2+SLC22A18+S100P；DYRK4+FUT7+S100P；RPTOR+DYRK4+SLC22A18；DYRK4+HYAL2+SLC22A18；RPTOR+MGRN1+HYAL2；DYRK4+SLC22A18+RAPSN；FUT7+SLC22A18+S100P；miR-7+SLC22A18+RAPSN；RPTOR+miR-7+SLC22A18；miR-7+FUT7+S100P；miR-7+HYAL2+SLC22A18；

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miR-7+DYRK4+FUT7+MGRN1+HYAL2+SLC22A18+S100P；RPTOR+miR-7+FUT7+MGRN1+SLC22A18+S100P+RAPSN；RPTOR+miR-7+DYRK4+FUT7+MGRN1+HYAL2+S100P；RPTOR+miR-7+FUT7+MGRN1+HYAL2+SLC22A18+RAPSN；miR-7+DYRK4+FUT7+HYAL2+SLC22A18+S100P+RAPSN；RPTOR+DYRK4+MGRN1+HYAL2+SLC22A18+S100P+RAPSN；RPTOR+miR-7+DYRK4+FUT7+HYAL2+SLC22A18+S100P；RPTOR+DYRK4+FUT7+MGRN1+HYAL2+SLC22A18+RAPSN；RPTOR+miR-7+DYRK4+FUT7+HYAL2+S100P+RAPSN；RPTOR+miR-7+DYRK4+FUT7+MGRN1+SLC22A18+S100P；RPTOR+miR-7+FUT7+MGRN1+HYAL2+S100P+RAPSN；miR-7+DYRK4+FUT7+MGRN1+SLC22A18+S100P+RAPSN；RPTOR+miR-7+DYRK4+FUT7+SLC22A18+S100P+RAPSN；RPTOR+miR-7+DYRK4+FUT7+HYAL2+SLC22A18+RAPSN；RPTOR+DYRK4+FUT7+MGRN1+HYAL2+S100P+RAPSN；RPTOR+miR-7+DYRK4+HYAL2+SLC22A18+S100P+RAPSN；RPTOR+miR-7+DYRK4+FUT7+MGRN1+SLC22A18+RAPSN；RPTOR+miR-7+DYRK4+MGRN1+HYAL2+S100P+RAPSN；RPTOR+FUT7+MGRN1+HYAL2+SLC22A18+S100P+RAPSN；RPTOR+miR-7+FUT7+HYAL2+SLC22A18+S100P+RAPSN；RPTOR+miR-7+DYRK4+MGRN1+HYAL2+SLC22A18+S100P；miR-7+DYRK4+MGRN1+HYAL2+SLC22A18+S100P+RAPSN；RPTOR+miR-7+DYRK4+MGRN1+SLC22A18+S100P+RAPSN；RPTOR+miR-7+DYRK4+FUT7+MGRN1+HYAL2+RAPSN；RPTOR+DYRK4+FUT7+HYAL2+SLC22A18+S100P+RAPSN；RPTOR+miR-7+DYRK4+FUT7+MGRN1+HYAL2+SLC22A18；miR-7+FUT7+MGRN1+HYAL2+SLC22A18+S100P+RAPSN；miR-7+DYRK4+FUT7+MGRN1+HYAL2+SLC22A18+RAPSN；RPTOR+miR-7+MGRN1+HYAL2+SLC22A18+S100P+RAPSN；RPTOR+miR-7+FUT7+MGRN1+HYAL2+SLC22A18+S100P；RPTOR+DYRK4+FUT7+MGRN1+HYAL2+SLC22A18+S100P；RPTOR+DYRK4+FUT7+MGRN1+SLC22A18+S100P+RAPSN；RPTOR+miR-7+DYRK4+MGRN1+HYAL2+SLC22A18+RAPSN；DYRK4+FUT7+MGRN1+HYAL2+SLC22A18+S100P+RAPSN；miR-7+DYRK4+FUT7+MGRN1+HYAL2+S100P+RAPSN；RPTOR+miR-7+DYRK4+FUT7+MGRN1+S100P+RAPSN；

RPTOR+miR-7+DYRK4+FUT7+MGRN1+HYAL2+SLC22A18+RAPSN；RPTOR+miR-7+DYRK4+FUT7+MGRN1+SLC22A18+S100P+RAPSN；RPTOR+miR-7+DYRK4+FUT7+HYAL2+SLC22A18+S100P+RAPSN；RPTOR+miR-7+DYRK4+FUT7+MGRN1+HYAL2+S100P+RAPSN；miR-7+DYRK4+FUT7+MGRN1+HYAL2+SLC22A18+S100P+RAPSN；RPTOR+miR-7+DYRK4+FUT7+MGRN1+HYAL2+SLC22A18+S100P；RPTOR+miR-7+FUT7+MGRN1+HYAL2+SLC22A18+S100P+RAPSN；RPTOR+DYRK4+FUT7+MGRN1+HYAL2+SLC22A18+S100P+RAPSN；RPTOR+miR-7+DYRK4+MGRN1+HYAL2+SLC22A18+S100P+RAPSN；以及

RPTOR+miR-7+DYRK4+FUT7+MGRN1+HYAL2+SLC22A18+S100P+RAPSN.

在一些具体实施方案中，确定甲基化标志物RPTOR、MGRN1和RAPSN的甲基化状态和/或表达水平，以及确定miRNA标志物miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127-3p、miR-409-3p和miR-148b的存在、特别是量。任选地，还确定HYAL2的甲基化状态和/或表达水平。

在一些具体实施方案中，确定甲基化标志物DYRK4、S100P、FUT7和SLC22A18的甲基化状态和/或表达水平，以及确定miRNA标志物miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127-3p、miR-409-3p和miR-148b的存在、特别是量。任选地，还确定HYAL2的甲基化状态和/或表达水平。

在另一些实施方案中，确定甲基化标志物MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P和DYRK4的甲基化状态和/或表达水平，以及确定miRNA标志物miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127-3p、miR-409-3p和miR-148b的存在。任选地，还确定HYAL2的甲基化状态和/或表达水平。

在一些具体实施方案中，甲基化状态的确定包括确定HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P和/或DYRK4基因中至少一个CpG位点的甲基化。特别地，确定所述基因的启动子、内含子和/或外显子区的甲基化状态。

特别地，HYAL2基因是位于人3号染色体的人HYAL2基因(Genbank登录号：NC_000003.11GI：224589815)。特别地，确定位于人3号染色体上位置50334760和位置50335700之间的至少一个CpG位点的甲基化状态。更具体地，特别地涉及人基因组的版本36.1/hg18，确定位于以下位置的至少一个CpG位点的甲基化状态：

50335694(cg27091787)，50335584(HYAL_CpG_1)，50335646(HYAL_CpG_2)，or50335671(HYAL_CpG_3)，50335166(HYAL-is-310 CpG_1)，50335180(HYAL-is-310 CpG_2)，50335192(HYAL-is-310 CpG_3)，50335195(HYAL-is-310 CpG_4)，50335227(HYAL-is-310CpG_5)，50335233(HYAL-is-310 CpG_6)，50335300(HYAL-is-310 CpG_7)，50335315(HYAL-is-310 CpG_8)，50335375(HYAL-is-310 CpG_9)，50335392(HYAL-is-310 CpG_10)，50335401(HYAL-is-310 CpG_11)，50334744(HYAL2-is-325_CpG_1)，50334761(HYAL2-is-325_CpG_2)，50334804(HYAL2-is-325_CpG_3)，50334844(HYAL2-is-325_CpG_4)，50334853(HYAL2-is-325_CpG_5)，50334862(HYAL2-is-325_CpG_6)，50334880(HYAL2-is-325_CpG_7)，50334906(HYAL2-is-325_CpG_8)，50334913(HYAL2-is-325_CpG_9)，50334917(HYAL2-is-325_CpG_10)，0334928(HYAL2-is-325_CpG_11)，50334944(HYAL2-is-325_CpG_12)，50334956(HYAL2-is-325_CpG_13)，50334980(HYAL2-is-325_CpG_14)，50334982(HYAL2-is-325_CpG_15)，50335010(HYAL2-is-325_CpG_16)50335014(HYAL2-is-325_CpG_17)，50331237(cg08776109)以及50330420(cg06721473)。

最具体地，至少一个CpG位点选自由以下组成的列表：位置50335694处的cg27091787、位置50335584处的HYAL_CpG_1、位置50335646处的HYAL_CpG_2和位置50335671处的HYAL_CpG_3。特别地，确定本发明的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个或至少15个CpG位点的甲基化状态。技术人员应理解，所述CpG位点的确切编号可以取决于待分析样品中包含的特定基因组序列和HYAL2启动子区的特定序列。例如，在版本37/hg19中HYAL2基因位于3号染色体：位置50，355，221-50，360，337上，而在版本36/hg18中，其位于3号染色体：位置50，330，244-50，335，146上。

特别地，MGRN1基因是位于人16号染色体的人MGRN1基因(Genbank登录号：NC_000016.10，范围：4624824-4690974，参考GRCh38初级装配；Genbank登录号：NC_018927.2，范围：4674882-4741756，可选择装配CHM1_1.1；Genbank登录号：AC_000148.1，范围：4641815-4707494，可选择装配HuRef)。特别地，确定位于人16号染色体上位置4654000和位置4681000之间的至少一个CpG位点的甲基化状态。特别地，CpG位点位于16号染色体的以下一个或更多个区域：4670069-4670542、4654000-4655000、4669000-4674000和4678000-4681000。更具体地，特别地涉及人基因组的版本36.1/hg18，位于以下位置的至少一个CpG位点的甲基化状态：

4670487(MGRN1_CpG_1)，4670481(MGRN1_CpG_2)，4670466(MGRN1_CpG_3)，4670459(MGRN1_CpG_4)，4670442(MGRN1_CpG_5)，4670440(MGRN1_CpG_6)，4670435(MGRN1_CpG_7)，4670433(MGRN1_CpG_8)，4670422(MGRN1_CpG_9)，4670414(MGRN1_CpG_10)，4670411(MGRN1_CpG_11)，4670402(MGRN1_CpG_12)，4670393(MGRN1_CpG_13)，4670357(MGRN1_CpG_14)，4670352(MGRN1_CpG_15)，4670343(MGRN1_CpG_16)，4670341(MGRN1_CpG_17)，4670336(MGRN1_CpG_18)，4670313(MGRN1_CpG_19)，4670310(MGRN1_CpG_20)，4670301(MGRN1_CpG_21)，4670292(MGRN1_CpG_22)，4670287(MGRN1_CpG_23)，4670281(MGRN1_CpG_24)，4670276(MGRN1_CpG_25)，4670264(MGRN1_CpG_26)，4670234(MGRN1_CpG_27)，4670211(MGRN1_CpG_28)，4670180(MGRN1_CpG_29)，4670174(MGRN1_CpG_30)，4670157(MGRN1_CpG_31)，4670137(MGRN1_CpG_32)，4670123(MGRN1_CpG_33)，4670117(MGRN1_CpG_34)。

特别地，确定本发明的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个或至少15个CpG位点的甲基化状态。技术人员应理解，所述CpG位点的确切编号可以取决于待分析样品中包含的特定基因组序列和MGRN1启动子区的特定序列。

特别地，RPTOR基因是位于人17号染色体的人RPTOR基因(Genbank登录号：NC_000017.11，范围：80544825-80966373，GRCh38初级装配；Genbank登录号：NG_013034.1，范围：5001-426549，RefSeqGene；Genbank登录号：NC_018928.2，范围：78604958-79026514，可选择装配CHM1_1.1；Genbank登录号：NG_013034.1；Genbank登录号：AC_000149.1，范围：73954508-74378467，可选择装配HuRef)。特别地，确定位于人17号染色体上位置76.297.000和位置76.416.000之间的至少一个CpG位点的甲基化状态。特别地，CpG位点位于17号染色体的以下一个或更多个区域：76.369.937-76.370.536、76.297.000-76.310.000、76.333.000-76.341.000、76.360.000-76.380.000和76.411.000-76.416.000。更具体地，特别地涉及人基因组的版本36.1/hg18，位于以下位置的至少一个CpG位点的甲基化状态：76370001(RPTOR_CpG_1)、76370037(RPTOR_CpG_2)、76370073(RPTOR_CpG_3)、76370092(RPTOR_CpG_4)、76370172(RPTOR_CpG_5)、76370199(RPTOR_CpG_6)、76370220(RPTOR_CpG_7)、76370253(RPTOR_CpG_8)。特别地，确定本发明的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个或至少15个CpG位点的甲基化状态。技术人员应理解，所述CpG位点的确切编号可以取决于待分析样品中包含的特定基因组序列和RPTOR启动子区的特定序列。

特别地，SLC22A18基因是位于人11号染色体的人SLC22A18基因(Genbank登录号：NC_000011.10，范围：2899721-2925246，参考GRCh38初级装配；Genbank登录号：NG_011512.1，范围：5001-30526，RefSeqGene；Genbank登录号：NT_187585.1，范围：131932-157362，参考GRCh38 ALT_REF_LOCI_1；Genbank登录号：AC_000143.1，范围：2709509-2734907，可选择装配HuRef；Genbank登录号：NC_018922.2，范围2919878-2945340，可选择装配CHM1_1.1)。特别地，确定位于人11号染色体上位置2876000和位置2883000之间的至少一个CpG位点的甲基化状态。特别地，CpG位点位于2.877.113-2.877.442。更具体地，chr11：2.876.000-chr11：2.883.000，7000bp的癌症相关，特别是BC、OvaCa和/或PaCA相关的差异甲基化区域，其覆盖SLC22A18(转录物变体)的启动子区、CpG岛和部分基因主体区域。更具体地，特别地涉及人基因组的版本36.1/hg18，位于以下位置的至少一个CpG位点的甲基化状态：2877395(SLC22A18_CpG_1)、2877375(SLC22A18_CpG_2)、2877365(SLC22A18_CpG_3)、2877341(SLC22A18_CpG_4)、2877323(SLC22A18_CpG_5)、2877311(SLC22A18_CpG_6)、2877193(SLC22A18_CpG_7)、2877140(SLC22A18_CpG_8)。特别地，确定本发明的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个或至少15个CpG位点的甲基化状态。技术人员应理解，所述CpG位点的确切编号可以取决于待分析样品中包含的特定基因组序列和SLC22A18启动子区的特定序列。

特别地，FUT7基因是位于人9号染色体的人FUT7基因(Genbank登录号：NC_000009.12，范围：137030174-137032840，参考GRCh38初级装配；Genbank登录号：NG_007527.1，范围：5001-7667，RefSeqGene；Genbank登录号：AC_000141.1，范围：109383478-109386144，可选择装配HuRef；Genbank登录号：NC_018920.2，范围：140073389-140076055，可选择装配CHM1_1.1)。特别地，确定位于人9号染色体上位置139046000和位置139048000之间的至少一个CpG位点的甲基化状态。更具体地，2000bp的BC、OvaCa和/或PaCA相关差异甲基化区域位于FUT7的启动子区。特别地，CpG位点位于139.047.218-139.047.610、139.046.000-139.048.000和139.045.065-139.045.817。更具体地，特别地涉及人基因组的版本36.1/hg18，位于以下位置的至少一个CpG位点的甲基化状态：139047253(FUT_CpG_1)、139047314(FUT_CpG_2)、139047346(FUT_CpG_3)、139047427(FUT_CpG_4)、139047445(FUT_CpG_5)、139047467(FUT_CpG_6)、139047483(FUT_CpG_7)、139047566(FUT_CpG_8)。特别地，确定本发明的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个或至少15个CpG位点的甲基化状态。技术人员应理解，所述CpG位点的确切编号可以取决于待分析样品中包含的特定基因组序列和FUT7启动子区的特定序列。

特别地，RAPSN基因是位于人11号染色体的人RAPSN基因(Genbank登录号：NC_000011.10，范围：47437757-.47449178，参考GRCh38初级装配；Genbank登录号：NG_008312.1，范围：5001-16423，RefSeqGene；Genbank登录号：NC_018922.2，范围：47458570-47469991，可选择装配CHM1_1.1；Genbank登录号：AC_000143.1，范围：47159075-47170494，可选择装配HuRef)。特别地，确定位于人11号染色体上位置47427500和位置47428500之间的至少一个CpG位点的甲基化状态。优选地，CpG位点位于47427500-47428300。更具体地，1000bp的癌症相关，优选BC、OvaCa和/或PaCA相关的差异甲基化区域位于RAPSN的启动子区。更具体地，特别地涉及人基因组的版本36.1/hg18，位于以下位置的至少一个CpG位点的甲基化状态：47427787(RAPSN_CpG_1)、47427825(RAPSN_CpG_2)、47427883(RAPSN_CpG_3)、47427915(RAPSN_CpG_4)、47427930(RAPSN_CpG_5)、47427976(RAPSN_CpG_6)、47428029(RAPSN_CpG_7)、47428110(RAPSN_CpG_8)。特别地，确定本发明的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个或至少15个CpG位点的甲基化状态。技术人员应理解，所述CpG位点的确切编号可以取决于待分析样品中包含的特定基因组序列和RAPSN启动子区的特定序列。

特别地，S100P基因是位于人4号染色体的人S100P基因(Genbank登录号：NC_000004.12，范围：6693839-6697170，参考GRCh38初级装配；Genbank登录号：AC_000136.1，范围：6627254-6630595，可选择装配HuRef；Genbank登录号：NC_018915.2，范围：6693944-6697285，可选择装配CHM1_1.1)。特别地，确定位于人4号染色体上位置6746000和位置6747000之间的至少一个CpG位点的甲基化状态。更具体地，1000bp的癌症相关(优选BC、OvaCa和/或PaCA相关)差异甲基化区域位于S100P的启动子区至第一外显子。特别地，CpG位点位于6.746.537-6.746.823。更具体地，特别地涉及人基因组的版本36.1/hg18，位于以下位置的至少一个CpG位点的甲基化状态：6746565(S100P_CpG_1)、6746599(S100P_CpG_2)、6746609(S100P_CpG_3)、6746616(S100P_CpG_4)、6746623(S100P_CpG_5)、6746634(S100P_CpG_6)、6746710(S100P_CpG_7)、6746728(S100P_CpG_8)、6746753(S100P_CpG_9)、6746779(S100P_CpG_10)、6746788(S100P_CpG_11)、6746791(S100P_CpG_12)。特别地，确定本发明的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个或至少15个CpG位点的甲基化状态。技术人员应理解，所述CpG位点的确切编号可以取决于待分析样品中包含的特定基因组序列和S100P启动子区的特定序列。

特别地，DYRK4基因是位于人12号染色体的人DYRK4基因(Genbank登录号：NC_000012.12，范围：4590072-4613888，参考GRCh38初级装配；Genbank登录号：AC_000144.1，范围：4555932-4579747，可选择装配HuRef；Genbank登录号：NC_018923.2，范围：4698860-4722666，可选择装配CHM1_1.1)。特别地，确定位于人12号染色体上位置4569000和位置4571000之间的至少一个CpG位点的甲基化状态。更具体地，2000bp的癌症相关，优选BC、OvaCa和/或PaCA相关的差异甲基化区域位于DYRK4的启动子区。特别地，CpG位点位于4569448-4569945。更具体地，特别地涉及人基因组的版本36.1/hg18，位于以下位置的至少一个CpG位点的甲基化状态：4569879(DYRK4_CpG_1)、4569809(DYRK4_CpG_2)、4569707(DYRK4_CpG_3)、4569493(DYRK4_CpG_4)。特别地，确定本发明的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个或至少15个CpG位点的甲基化状态。技术人员应理解，所述CpG位点的确切编号可以取决于待分析样品中包含的特定基因组序列和DYRK4启动子区的特定序列。

在另一些实施方案中，预后和/或诊断癌症的方法还包括以下步骤：将所述对象中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和至少一种miRNA标志物的存在(特别是量)与一个或更多个参考中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和至少一种miRNA标志物的存在(特别是量)进行比较。特别地，所述参考为阈值、参考值或参考样品。

在其中参考为阈值的实施方案中，选自HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P和DYRK4的至少一种甲基化标志物的甲基化状态低于阈值指示对象患有癌症、发生癌症的风险升高或疾病恶化；然而，等于或大于阈值的甲基化状态指示对象未患癌症、发生癌症的风险降低或疾病好转。应理解，上述水平可以由于统计学和测量误差而不同。

在其中参考为阈值的实施方案中，选自HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P和DYRK4的至少一种甲基化标志物的表达水平等于或大于阈值指示对象患有癌症、发生癌症的风险升高或疾病恶化；然而，低于阈值的表达水平指示对象未患癌症、发生癌症的风险降低或疾病好转。应理解，上述水平可以由于统计学和测量误差而不同。

在其中参考为阈值的实施方案中，选自miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409和miR-148b的至少一种miRNA标志物的量等于或大于阈值指示对象患有癌症、发生癌症的风险升高或疾病恶化；然而，低于阈值的量指示对象未患癌症、发生癌症的风险降低或疾病好转。应理解，上述水平可以由于统计学和测量误差而不同。

在一些具体实施方案中，对于HYAL2，对象患有癌症、发生癌症的风险升高或疾病恶化的阈值为甲基化状态小于对照的90％和表达水平比对照高1.2倍以上。在一些具体实施方案中，MGRN1的阈值为小于对照的90％的甲基化状态。在一些具体实施方案中，RPTOR的阈值为小于对照的95％的甲基化状态。在一些具体实施方案中，SLC22A18的阈值为甲基化状态小于对照的95％和表达水平比对照高1.1倍以上。在一些具体实施方案中，FUT7的阈值为小于对照的92％的甲基化状态。在一些具体实施方案中，RAPSN的阈值为小于对照的98％的甲基化状态。在一些具体实施方案中，S100P的阈值为甲基化状态小于对照的90％和表达水平比对照高2倍以上。在一些具体实施方案中，DYRK4的阈值为小于对照的85％的甲基化状态。

在一些具体实施方案中，miR-652的阈值水平为比对照小至少0.5Ct值(或比对照高1.4倍以上)的量。在一些具体实施方案中，miR-801的阈值水平为比对照小至少0.6Ct值(或比对照高1.5倍以上)的量。在一些具体实施方案中，miR-376c的阈值水平为比对照小至少0.5Ct值(或比对照高1.4倍以上)的量。在一些具体实施方案中，miR-376a的阈值水平为比对照小至少0.6Ct值(或比对照高1.5倍以上)的量。在一些具体实施方案中，miR-127的阈值水平为比对照小至少0.5Ct值(或比对照高1.4倍以上)的量。在一些具体实施方案中，miR-409的阈值水平为比对照小至少0.4Ct值(或比对照高1.3倍以上)的量。在一些具体实施方案中，miR-148b的阈值水平为比对照小至少0.3Ct值(或比对照高1.2倍以上)的量。

在其中参考为参考值的一些实施方案中，所述参考值为癌症不存在、癌症存在或者发生癌症的风险升高或降低的代表值。

在另一些实施方案中，参考样品选自从健康个体获得的参考样品、从患病个体获得的参考样品、在较早或较晚时间点取得的与目的样品从同一个体获得的参考样品、以及代表健康个体或者代表癌症存在或不存在或者代表发生癌症的风险升高或降低的参考样品。

在其中参考为健康对象或者发生癌症的风险降低的对象或者代表癌症不存在的甲基化标志物的甲基化状态或miRNA量的一些实施方案中，与参考相比至少一种甲基化标志物的甲基化水平降低和/或表达提高以及至少一种miRNA标志物存在或量升高指示在对象中：

i.发生癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的风险；

ii.癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的存在；和/或

iii.癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的进展。

在其中参考为患病对象或者发生癌症的风险升高的对象或者代表癌症存在的甲基化标志物的甲基化状态或miRNA量的一些实施方案中，至少一种甲基化标志物的甲基化状态或表达水平类似以及至少一种miRNA标志物的量类似指示在对象中：

i.发生癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的风险；

ii.癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的存在；和/或

iii.癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的进展。

在其中参考样品与目的样品从同一对象获得并且在较早时间点取得的一些实施方案中，在对象中：

(i)与参考相比至少一种甲基化标志物的甲基化降低和/或表达提高以及至少一种miRNA标志物存在或量升高指示：

i.发生癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的风险，

ii.癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的存在，和/或

iii.癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的进展；

(ii)与参考相比至少一种甲基化标志物的甲基化提高和/或表达较低以及至少一种miRNA标志物不存在或量降低指示：

i.发生癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的风险降低，

ii.癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的不存在，和/或

iii.癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的进展下降；和/或

(iii)与参考相比至少一种甲基化标志物的甲基化和/或表达水平类似以及至少一种miRNA标志物的量类似指示：

i.发生癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的风险类似，

ii.癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的进展停滞，和/或

iii.癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的持续。

在一些具体实施方案中，确定选自miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409、miR-148b的至少一种miRNA标志物的量。特别地，miR-652的比对照小至少0.5Ct值(或比对照高1.4倍以上)的量指示癌症。在一些具体实施方案中，miR-801的比对照小至少0.6Ct值(或比对照高1.5倍以上)的量指示癌症。在一些具体实施方案中，miR-376c的比对照小至少0.5Ct值(或比对照高1.4倍以上)的量指示癌症。在一些具体实施方案中，miR-376a的比对照小至少0.6Ct值(或比对照高1.5倍以上)的量指示癌症。在一些具体实施方案中，miR-127的比对照小至少0.5Ct值(或比对照高1.4倍以上)的量指示癌症。在一些具体实施方案中，miR-409的比对照小至少0.4Ct值(或比对照高1.3倍以上)的量指示癌症。在一些具体实施方案中，miR-148b的比对照小至少0.3Ct值(或比对照高1.2倍以上)的量指示癌症。

在一些具体实施方案中，目的样品和/或参考样品为体液样品或组织样品。在另一些实施方案中，体液样品选自血液、血清、血浆、滑液、尿、唾液、淋巴液、泪液和可从腺(例如，如乳腺或***)获得的流体。在一些具体实施方案中，体液为血液。

在另一些实施方案中，组织样品为从肿瘤组织或肿瘤邻近组织获得的组织提取物。在另一些实施方案中，目的样品和/或参考样品为细胞培养物或组织培养物，例如但不限于不同癌细胞的培养物。在另一些实施方案中，目的样品和/或参考样品为从所述细胞培养物或组织培养物获得的介质。

在一些具体实施方案中，对象为哺乳动物、爬行动物或鸟类。特别地，对象选自实验室动物(例如小鼠或大鼠)、家养动物(包括例如豚鼠、兔、马、驴、牛、绵羊、山羊、猪、鸡、骆驼、猫、狗、海龟、陆龟、蛇或蜥蜴)或灵长类(包括黑猩猩、倭黑猩猩、大猩猩和人)。人是特别优选的。

在第二方面，本发明涉及用于确定用于在对象中改变癌症或预防癌症或治疗癌症的药物剂量的方法，其包括以下步骤：

(a)确定对象的样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量，以及

(b)根据目的样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量来确定药物剂量。

在一些具体实施方案中，在参考中如上详述地确定选自HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P和DYRK4的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平，以及如上详述地确定选自miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409、miR-148b的至少一种miRNA标志物的量，用于与目的样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量进行比较。

在一些具体实施方案中，根据比较目的样品与参考或参考样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平以及至少一种miRNA标志物的量来确定药物剂量。

在一些具体实施方案中，目的样品和/或参考样品为体液样品或组织样品。在一些具体实施方案中，体液样品选自血液、血清、血浆、滑液、尿、唾液、淋巴液、泪液和可从腺(例如，如乳腺或***)获得的流体。在一些具体实施方案中，体液为血液。

在一些具体实施方案中，对象为哺乳动物、爬行动物或鸟类。优选地，对象选自实验室动物(例如小鼠或大鼠)、家养动物(包括例如豚鼠、兔、马、驴、牛、绵羊、山羊、猪、鸡、骆驼、猫、狗、海龟、陆龟、蛇或蜥蜴)或灵长类(包括黑猩猩、倭黑猩猩、大猩猩和人)。人是特别优选的。

在第三方面，本发明涉及用于调整用于改变癌症或者预防或治疗癌症的药物剂量的方法，其包括以下步骤：

(a)在样品中如上详述确定选自HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P和DYRK4的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平，以及如上详述确定选自miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409、miR-148b的至少一种miRNA标志物的量；

(b)确定一个或更多个参考或参考样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量；

(c)针对所述目的样品中存在的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量是否不同于一个或更多个参考或参考样品中的水平来考察受试样品；以及

(d)根据目的样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量是否不同于一个或更多个参考或参考样品中的水平来调整药物剂量。

在一些具体实施方案中，如果出现以下情况，则提高药物剂量：

a)与指示疾病不存在或发生疾病的风险降低的参考或者健康对象或代表疾病不存在的参考样品相比，至少一种甲基化标志物的甲基化状态降低；

b)与指示疾病存在或发生疾病的风险升高的参考或者患病对象或代表疾病存在的参考样品相比，至少一种甲基化标志物的甲基化状态相等或降低；

c)与在较早时间点从所述对象获得的参考样品相比，至少一种甲基化标志物的甲基化状态相等或降低；

d)与指示疾病不存在或发生疾病的风险降低的参考或者健康对象或代表疾病不存在的参考样品相比，至少一种甲基化标志物的表达水平提高；

e)与指示疾病存在或发生疾病的风险升高的参考或者患病对象或代表疾病存在的参考样品相比，至少一种甲基化标志物的表达水平相等或提高；

f)与在较早时间点从所述对象获得的参考样品相比，至少一种甲基化标志物的表达水平相等或提高；

g)与指示疾病不存在或发生疾病的风险降低的参考或者健康对象或代表疾病不存在的参考样品相比，至少一种miRNA的量升高；

h)与指示疾病存在或发生疾病的风险升高的参考或者患病对象或代表疾病存在的参考样品相比，至少一种miRNA标志物的量相等或升高；

i)与在较早时间点从所述对象获得的参考样品相比，至少一种miRNA标志物的量相等或升高。

在一些具体实施方案中，如果出现以下情况，则降低药物剂量：

a)与指示疾病不存在或发生疾病的风险降低的参考或者健康对象或代表疾病不存在的参考样品相比，至少一种甲基化标志物的甲基化状态相等或提高；

b)与指示疾病存在或发生疾病的风险升高的参考或者患病对象或代表疾病存在的参考样品相比，至少一种甲基化标志物的甲基化状态降低；

d)与指示疾病不存在或发生疾病的风险降低的参考或者健康对象或代表疾病不存在的参考样品相比，至少一种甲基化标志物的表达水平相等或降低；

e)与指示疾病存在或发生疾病的风险升高的参考或者患病对象或代表疾病存在的参考样品相比，至少一种甲基化标志物的表达水平降低；

f)与在较早时间点从所述对象获得的参考样品相比，至少一种甲基化标志物的表达水平降低；

g)与指示疾病不存在或发生疾病的风险降低的参考或者健康对象或代表疾病不存在的参考样品相比，至少一种miRNA的量相等或降低；

h)与指示疾病存在或发生疾病的风险升高的参考或者患病对象或代表疾病存在的参考样品相比，至少一种miRNA标志物的量降低；

i)与在较早时间点从所述对象获得的参考样品相比，至少一种miRNA标志物的量降低。

在一些具体实施方案中，目的样品和/或参考样品为体液样品或组织样品。在一些具体实施方案中，体液样品选自血液、血清、血浆、滑液、尿、唾液、淋巴液、泪液和可从腺(例如，如乳腺或***)获得的流体。在一些具体实施方案中，体液样品为血液样品。

在第四方面，本发明涉及确定物质对癌症或癌症发生的有益和/或不利作用的方法，其包括以下步骤：

(a)在样品中如上详述确定选自HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P和DYRK4的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平，以及如上详述确定选自miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409、miR-148b的至少一种miRNA标志物的量，

(b)确定一个或更多个参考或参考样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量，以及

(c)针对目的样品中存在的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量是否不同于一个或更多个参考或参考样品中的水平来考察所述目的样品；

其中目的样品与一个或更多个参考或参考样品不同地暴露于所述物质。

在一些具体实施方案中，目的样品在时间和/或浓度方面不同地暴露于所述物质。因此，目的样品可以在较长或较短的时间间隔内和/或以所述物质的较高或较低浓度暴露于所述物质。

在其中目的样品暴露于较高浓度和/或持续较长时间间隔的实施方案中，如果出现以下情况，则确定物质的不利作用：

在其中目的样品暴露于较高浓度和/或持续较长时间间隔的实施方案中，如果出现以下情况，则确定物质的有益作用：

在其中目的样品暴露于较低浓度和/或持续较短时间间隔的实施方案中，如果出现以下情况，则确定物质没有作用或具有不利作用：

在其中目的样品暴露于较低浓度和/或持续较短时间间隔的实施方案中，如果出现以下情况，则确定物质的有益作用：

在第五方面，本发明涉及用于鉴定患者为癌症治疗的响应者的方法，其包括在第一样品中和继第一样品之后从对象取得的一个或更多个另外样品中如上详述确定选自HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P和DYRK4的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平，以及如上详述确定选自miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409、miR-148b的至少一种miRNA标志物的量，其中至少一种甲基化标志物的甲基化状态提高和/或至少一种甲基化标志物的表达水平较低以及至少一种miRNA标志物不存在或量降低指示针对治疗的响应。

在一些具体实施方案中，目的样品和/或参考样品为体液样品或组织样品。在一些具体实施方案中，体液样品选自血液、血清、血浆、滑液、尿、唾液、淋巴液、泪液和可从腺(例如，乳腺或***)获得的流体。在一些具体实施方案中，体液样品为血液样品。

在第六方面，本发明涉及用于鉴定患者为癌症治疗的非响应者的方法，其包括在第一样品中和继第一样品之后取得的一个或更多个另外样品中如上详述确定选自HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P和DYRK4的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平，以及如上详述确定选自miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409、miR-148b的至少一种miRNA标志物的量，其中至少一种甲基化标志物的甲基化状态降低和/或至少一种甲基化标志物的表达水平提高以及至少一种miRNA标志物存在或量升高指示缺乏针对治疗的响应。

在一些具体实施方案中，目的样品和/或参考样品为体液样品或组织样品。在一些具体实施方案中，体液样品选自血液、血清、血浆、滑液、尿、唾液、淋巴液、泪液和可从腺(例如，如乳腺或***)获得的流体。在另一些实施方案中，组织样品为从肿瘤组织或肿瘤邻近组织获得的组织提取物。在另一些实施方案中，目的样品和/或参考样品为细胞培养物或组织培养物，例如但不限于不同癌细胞的培养物。在另一些实施方案中，目的样品和/或参考样品为从所述细胞培养物或组织培养物获得的介质。

在第七方面，本发明涉及用于治疗癌症的方法，其包括以下步骤：

(i)在对象的第一样品中如上详述确定选自HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P和DYRK4的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平，以及如上详述确定选自miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409、miR-148b的至少一种miRNA标志物的量；

(ii)开始用包含一种或更多种抗癌剂或治疗的第一治疗方案治疗所述对象；

(iii)确定所述对象的一个或更多个随后取得的第二样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或至少一种甲基化标志物的表达水平以及至少一种miRNA的量；

(iv)任选地重复步骤(ii)和(iii)一次或更多次；

(v)如果至少一种甲基化标志物的甲基化状态显著提高和/或至少一种甲基化标志物的表达水平较低以及至少一种miRNA标志物的量降低或不存在，则继续用第一治疗方案治疗对象；或者

(vi)如果至少一种甲基化标志物的甲基化状态降低和/或至少一种甲基化标志物的表达水平提高以及至少一种miRNA标志物的量升高或存在，则修改治疗或终止用第一治疗方案治疗对象并且作为替代用包含未包含在第一治疗方案中的一种或更多种抗癌剂或治疗的第二治疗方案治疗对象。

在一些具体实施方案中，治疗方案选自化学治疗、抗激素治疗、免疫治疗和放射治疗。

在第八方面，本发明涉及用于预后和/或诊断以下的装置：

i.发生癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的风险；

ii.癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的存在；和/或

iii.癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的进展，

所述装置包含：

c)检测至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平的一个或更多个装置，以及

d)检测至少一种miRNA标志物的量的一个或更多个装置。

在一些具体实施方案中，所述装置如上详述检测选自HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P、DYRK4的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平。

在另一些实施方案中，用于检测至少一种甲基化标志物的甲基化状态的一个或更多个装置包含至少一种甲基化特异性多核苷酸。在一些具体实施方案中，甲基化特异性多核苷酸为甲基化特异性引物和/或甲基化特异性探针。

在另一些实施方案中，用于检测至少一种甲基化标志物的表达水平的一个或更多个装置包含结合部分。所述结合部分特别地为多核苷酸、肽、蛋白质或适配体。在另一些实施方案中，结合部分选自单克隆抗体、多克隆抗体、Fab片段、Fc片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、单结构域抗体(sdAb)、纳米抗体、单链Fv(scFv)、二价单链可变片段(di-scFv)、串联scFv、双抗体、三抗体、双特异性双抗体、单链双抗体(scDb)、双特异性T细胞衔接体(BiTE)和DART″分子。

在一些具体实施方案中，结合部分与甲基化标志物的基因产物的一部分结合。因此，在其中结合部分为多核苷酸的实施方案中，所述多核苷酸与由相应甲基化标志物的基因(即，HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P或DYRK4的基因)转录的mRNA结合。

在其中结合部分为肽、蛋白质或适配体的一些实施方案中，所述肽、蛋白质或适配体与由相应甲基化标志物的基因(即，HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P或DYRK4的基因)翻译的蛋白质的一部分(特别是表位)结合。

在一些具体实施方案中，所述装置如上详述检测选自miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409、miR-148b的至少一种miRNA标志物。

在另一些实施方案中，用于检测至少一种miRNA标志物的量的一个或更多个装置包含至少一种miRNA特异性多核苷酸。

在一些具体实施方案中，所述至少一种miRNA特异性多核苷酸具有根据SEQ IDNO：1至13的序列。

在一些具体实施方案中，所述装置用于上文详述的方法。特别地，所述装置用于选自以下的方法：

(i)在对象中预后和/或诊断癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的方法，其包括在对象中(a)确定选自HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P、DYRK4的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平，以及(b)确定选自miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409、miR-148b的至少一种miRNA标志物的存在(特别是量)，其中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平以及至少一种miRNA的存在指示所述对象的预后和/或诊断；

(ii)用于确定用于在对象中改变癌症或者预防或治疗癌症的药物剂量的方法，其包括以下步骤：(a)在对象的样品中如上详述确定选自HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P、DYRK4的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平，以及如上详述确定选自miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409、miR-148b的至少一种miRNA标志物的量，以及任选地确定参考中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量，用于与目的样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量进行比较；以及(b)根据目的样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量，任选地根据目的样品与参考或参考样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量的比较来确定药物剂量；

(iii)用于调整用于改变癌症或者预防或治疗癌症的药物剂量的方法，其包括以下步骤：(a)在样品中如上详述确定选自HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P、DYRK4的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平，以及如上详述确定选自miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409、miR-148b的至少一种miRNA标志物的量，(b)确定一个或更多个参考或参考样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量，(c)针对所述目的样品中存在的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量是否不同于一个或更多个参考或参考样品中的水平来考察受试样品，以及(d)根据目的样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量是否不同于一个或更多个参考或参考样品中的水平来调整药物剂量；

(iv)确定物质对癌症或癌症发生的有益和/或不利作用的方法，其包括以下步骤：(a)在目的样品中如上详述确定选自HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P、DYRK4的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平，以及如上详述确定选自miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409、miR-148b的至少一种miRNA标志物的量，(b)确定一个或更多个参考或参考样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量，以及(c)针对所述目的样品中存在的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量是否不同于一个或更多个参考或参考样品中的水平来考察目的样品，其中目的样品与一个或更多个参考或参考样品不同地暴露于所述物质；

(v)用于鉴定患者为癌症治疗的响应者的方法，其包括在第一样品中和继第一样品之后取得的一个或更多个另外样品中如上详述确定选自HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P、DYRK4的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平，以及如上详述确定选自miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409、miR-148b的至少一种miRNA标志物的量，其中至少一种甲基化标志物的甲基化状态提高和/或至少一种甲基化标志物的表达水平较低以及至少一种miRNA标志物不存在或量降低指示针对治疗的响应；

(vi)用于鉴定患者为癌症治疗的非响应者的方法，其包括在第一样品中和继第一样品之后取得的一个或更多个另外样品中如上详述确定选自HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P、DYRK4的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平，以及如上详述确定选自miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409、miR-148b的至少一种miRNA标志物的量，其中至少一种甲基化标志物的甲基化状态降低和/或至少一种甲基化标志物的表达水平提高以及至少一种miRNA标志物存在或量升高指示缺乏针对治疗的响应；以及

(vii)用于治疗癌症的方法，其包括以下步骤：(i)在对象的第一样品中如上详述确定选自HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P、DYRK4的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平，以及如上详述确定选自miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409、miR-148b的至少一种miRNA标志物的量；(ii)开始用包含一种或更多种抗癌剂或治疗的第一治疗方案治疗所述患者；(iii)确定所述对象的一个或更多个随后取得的另外样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或至少一种甲基化标志物的表达水平以及至少一种miRNA的量；(iv)任选地重复步骤(ii)和(iii)一次或更多次；(v)如果至少一种甲基化标志物的甲基化状态显著提高和/或至少一种甲基化标志物的表达水平较低以及至少一种miRNA标志物的量降低或不存在，则继续用第一治疗方案治疗患者；或者(vi)如果至少一种甲基化标志物的甲基化状态降低和/或至少一种甲基化标志物的表达水平提高以及至少一种miRNA标志物的量升高或存在，则修改治疗或终止用第一治疗方案治疗患者并且作为替代用包含未包含在第一治疗方案中的一种或更多种抗癌剂或治疗的第二治疗方案治疗患者。

在第九方面，本发明涉及试剂盒，其包含上述用于如上详述检测选自HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P、DYRK4的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平，以及如上详述检测选自miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409、miR-148b的至少一种miRNA标志物的存在(特别是量)的装置。

在一些具体实施方案中，所述试剂盒还包含：

(a)容器；和/或

(b)数据载体，其中所述数据载体包含有例如以下信息：

(i)关于用于鉴定癌症发生风险和/或鉴定癌症存在和/或监测癌症进展的方法的说明，

(ii)对于使用装置检测特别是在样品中、更具体是来自个体的样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平以及至少一种miRNA标志物的量和/或使用试剂盒的说明，

(iii)质量信息，例如关于用于检测至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量的装置和/或试剂盒的批次/批号、制造或装配场所或者有效日期或最迟销售日期的信息、关于正确存储或操作试剂盒的信息，

(iv)关于用于检测至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量的缓冲剂、稀释剂、试剂和/或用于检测至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量的装置的组成的信息，

(v)关于解释在进行上述鉴定和/或监测癌症进展的方法时获得的信息的信息，

(vi)关于在应用不合适方法和/或不合适装置时的可能误解或错误结果的警告，和/或

(vii)关于在使用不合适试剂和/或缓冲剂时的可能误解或错误结果的警告。

在一些具体实施方案中，试剂盒用于上文详述的方法。特别地，试剂盒用于选自以下的方法：

(v)用于鉴定患者为癌症治疗的响应者的方法，其包括在第一样品中和继第一样品之后取得的一个或更多个另外样品中如上详述确定选自HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P、DYRK4的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平，以及如上述详述确定选自miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409、miR-148b的至少一种miRNA标志物的量，其中至少一种甲基化标志物的甲基化状态提高和/或至少一种甲基化标志物的表达水平较低以及至少一种miRNA标志物不存在或量降低指示针对治疗的响应；

在第十方面，本发明涉及用于如上详述检测选自HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P、DYRK4的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平，以及如上详述检测选自miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409、miR-148b的至少一种miRNA标志物的存在(特别是量)的装置或者如上详述包含所述装置的试剂盒用于预后和/或诊断以下的用途：

i.发生癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的风险；

ii.癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的存在；和/或

iii.癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的进展。

在一些具体实施方案中，所述装置和/或所述试剂盒的用途是在上文详述的方法之一中的用途。特别地，是在选自以下的方法中的用途：

(i)在对象中预后和/或诊断癌症，优选BC、OvaCa和/或PaCA的方法，其包括在对象中(a)确定选自HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P、DYRK4的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平，以及(b)确定选自miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409、miR-148b的至少一种miRNA标志物的存在(特别是量)，其中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平以及至少一种miRNA的存在指示所述对象的预后和/或诊断；

在第十一方面，本发明涉及用于鉴定癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的设备，其包括：

(a)分析单元，所述分析单元包含：

(i)用于确定对象的样品中选自HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P、DYRK4的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平的检测剂，以及

(ii)用于确定对象的样品中选自miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127-3p、miR-409-3p、miR-148b的至少一种miRNA的存在的检测剂；以及

(b)包含数据处理器的评估单元，所述数据处理器有形地嵌入有用于进行通过分析单元确定的量与参考的比较的算法，并且能够生成包含基于所述比较建立的诊断结果的输出文件。

在一些具体实施方案中，所述检测剂为如上详述的装置。

特别的设备是可以在没有专业临床医师的特定知识的情况下应用的那些，例如仅需要装载样品的测试条或电子设备。结果可以作为参数诊断原始数据的输出，特别地作为绝对或相对量给出。应理解，这些数据将需要由临床医师解释。然而，还设想了专家***设备，其中输出包含经处理的诊断原始数据，其解释不需要专业的临床医师。另一些优选设备包含分析单元/设备(例如，生物传感器、阵列、与特异性识别本发明miRNA的配体偶联的固体支持物、等离子体表面共振设备、NMR光谱仪、质谱仪等)或评估单元/设备。

本发明的另一些方面如下：

1.在对象中预后和/或诊断癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的方法，其包括在对象中：

其他癌症是否也包括在这方面？这需要确认。

b)确定选自miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409、miR-148b的至少一种miRNA标志物的存在，优选量，

其中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平以及至少一种miRNA的存在指示所述对象的预后和/或诊断。

2.根据方面1所述的方法，其中癌症的所述预后和/或诊断包括：

i.发生癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的风险；

ii.癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的存在；和/或

iii.癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的进展，优选恶化或好转。

3.根据方面1或2中任一项所述的方法，其中：

a)确定至少2、3、4、5、6或7种不同甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平，和/或

b)确定至少2、3、4、5、6或7种不同miRNA标志物的存在。

4.根据方面1至3中任一项所述的方法，其中：

a)确定所述甲基化标志物MGRN1、RPTOR和RAPSN以及任选地HYAL2的甲基化状态和/或表达水平，和/或

b)确定所述miRNA标志物miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409和miR-148b的存在。

5.根据方面1至3中任一项所述的方法，其中：

a)确定所述甲基化标志物SLC22A18、FUT7、S100P和DYRK4以及任选地HYAL2的甲基化状态和/或表达水平，和/或

6.根据方面1至4中任一项所述的方法，其中：

a)确定所述甲基化标志物MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P和DYRK4以及任选地HYAL2的甲基化状态和/或表达水平，和/或

7.根据方面1至7中任一项所述的方法，其中确定所述甲基化状态包括确定HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P、DYRK4基因，特别是所述基因的启动子、内含子或外显子区中至少一个CpG位点的甲基化。

8.根据方面7所述的方法，其中所述至少一个CpG位点选自S100P中的cg22266967、SLC22A18中的cg21019522、DYRK4中的cg09418321和FUT7中的cg0279745、RPTOR中的cg06418238、MGRN1中的cg00736299、MGRN1中的cg01662869、RAPSN中的cg27466532、HYAL2中的cg27091787。

9.根据方面1至8中任一项所述的方法，其还包括以下步骤：

c)将所述对象中所述至少一种甲基化标志物的甲基化状态和所述至少一种miRNA标志物的存在与一个或更多个参考中所述至少一种甲基化标志物的甲基化状态和所述至少一种miRNA标志物的量进行比较。

10.根据方面9所述的方法，其中所述参考为阈值、参考值或参考样品。

11.根据方面10所述的方法，其中所述参考样品选自健康个体、患病个体或者在较早或较晚时间点的与受试个体的同一个体，或者癌症不存在、癌症存在或发生癌症的风险升高或降低的代表值。

12.根据方面10或11所述的方法，其中所述参考样品选自从健康个体获得的参考样品、从患病个体获得的参考样品、在较早或较晚时间点取得的与目的样品从同一个体获得的参考样品、以及代表健康个体或者代表癌症存在或不存在或者代表发生癌症的风险升高或降低的参考样品。

13.根据方面10至12中任一项所述的方法，其中所述参考是健康对象或者发生癌症的风险降低的对象或者代表不存在癌症的甲基化状态或miRNA量，其中与所述参考相比所述至少一种甲基化标志物的甲基化降低和/或过表达以及所述至少一种miRNA标志物存在或量升高指示在所述对象中：

iv.发生癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的风险；

v.癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的存在；和/或

vi.癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的进展。

14.根据方面10至12中任一项所述的方法，其中所述参考是患病个体或发生癌症的风险升高的个体或代表存在癌症的值，其中所述至少一种甲基化标志物的甲基化状态或表达类似以及所述至少一种miRNA标志物的量类似指示在所述对象中：

iv.发生癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的风险；

v.癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的存在；和/或

vi.癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的进展。

15.根据方面10至12中任一项所述的方法，其中所述参考样品与目的样品从同一个体获得并且在较早时间点取得，其中在所述对象中：

(ii)与所述参考相比，所述至少一种甲基化标志物的甲基化降低和/或过表达以及所述至少一种miRNA标志物存在或量升高指示：

iv.发生癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的风险，

v.癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的存在，和/或

vi.癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的进展；

(ii)与所述参考相比，所述至少一种甲基化标志物的甲基化提高和/或表达较低以及所述至少一种miRNA标志物不存在或量降低指示：

iv.发生癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的风险降低，

v.不存在癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA，和/或

vi.癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的进展下降；

和/或

(iii)与所述参考相比，所述至少一种甲基化标志物的甲基化和/或表达水平类似以及所述至少一种miRNA标志物的量类似指示：

iv.发生癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的风险类似，

v.癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的进展停滞，和/或

vi.癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的持续。

16.用于确定用于在对象中改变癌症或者预防或治疗癌症的药物剂量的方法，其包括以下步骤：

(a)确定对象的样品中选自HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P、DYRK4的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和选自miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409、miR-148b的至少一种miRNA标志物的量，以及任选地确定参考中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量，用于与目的样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量进行比较；以及

(b)根据所述目的样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量，任选地根据所述目的样品与所述参考或参考样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量的比较来确定药物剂量。

17.用于调整用于改变癌症或者预防或治疗癌症的药物剂量的方法，其包括以下步骤：

(a)确定样品中选自HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P、DYRK4的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平，以及选自miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409、miR-148b的至少一种miRNA标志物的量；

(c)针对所述目的样品中存在的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量是否不同于所述一个或更多个参考或参考样品中的水平来考察受试样品；以及

(d)根据所述目的样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量是否不同于所述一个或更多个参考或参考样品中的水平来调整药物剂量。

18.确定物质对癌症或癌症发生的有益和/或不利作用的方法，其包括以下步骤：

(a)确定目的样品中选自HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P、DYRK4的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平，以及选自miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409、miR-148b的至少一种miRNA标志物的量，

(c)针对所述目的样品中存在的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量是否不同于所述一个或更多个参考或参考样品中的水平来考察所述目的样品；

其中所述目的样品与所述一个或更多个参考或参考样品不同地暴露于所述物质。

19.用于鉴定患者为癌症治疗的响应者的方法，其包括确定第一样品中和继所述第一样品之后取得的一个或更多个另外样品中选自HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P、DYRK4的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平，以及选自miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409、miR-148b的至少一种miRNA标志物的量，其中所述至少一种甲基化标志物的甲基化状态提高和/或所述至少一种甲基化标志物的表达水平较低以及所述至少一种miRNA标志物不存在或量降低指示针对所述治疗的响应。

20.用于鉴定患者为癌症治疗的非响应者的方法，其包括确定第一样品中和继所述第一样品之后取得的一个或更多个另外样品中选自HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P、DYRK4的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平，以及选自miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409、miR-148b的至少一种miRNA标志物的量，其中所述至少一种甲基化标志物的甲基化状态降低和/或所述至少一种甲基化标志物的表达水平提高以及所述至少一种miRNA标志物存在或量升高指示缺乏针对所述治疗的响应。

21.用于治疗癌症的方法，其包括以下步骤：

(i)确定对象的第一样品中选自HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P、DYRK4的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平，以及选自miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409、miR-148b的至少一种miRNA标志物的量；

(ii)开始用包含一种或更多种抗癌剂或治疗的第一治疗方案治疗所述患者；

(iii)确定所述对象的一个或更多个随后取得的另外样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或至少一种甲基化标志物的表达水平以及至少一种miRNA的量；

(iv)任选地重复步骤(ii)和(iii)一次或更多次；

(v)如果所述至少一种甲基化标志物的甲基化状态显著提高和/或所述至少一种甲基化标志物的表达水平较低以及所述至少一种miRNA标志物的量降低或不存在，则继续用所述第一治疗方案治疗所述患者；或者

(vi)如果所述至少一种甲基化标志物的甲基化状态降低和/或所述至少一种甲基化标志物的表达水平提高以及所述至少一种miRNA标志物的量升高或存在，则修改所述治疗或终止用所述第一治疗方案治疗所述患者并且作为替代用包含未包含在所述第一治疗方案中的一种或更多种抗癌剂或治疗的第二治疗方案治疗所述患者。

22.根据方面1至21中任一项所述的方法，其中所述目的样品是组织样品和/或体液样品。

23.根据方面22所述的方法，其中所述组织样品是肿瘤样品和/或所述体液样品选自血液、血浆、血清、尿、唾液、泪液和可从乳腺获得的流体。

24.用于预后和/或诊断以下的装置：

iv.发生癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的风险，

v.癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的存在，和/或

vi.癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的进展，

所述装置包含：

a)检测至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平的一个或更多个装置，以及

b)检测至少一种miRNA标志物的量的一个或更多个装置。

25.根据方面24所述的装置，其中：

a)用于检测至少一种甲基化标志物的甲基化状态的一个或更多个装置包含至少一种甲基化特异性多核苷酸，和/或

b)用于检测至少一种甲基化标志物的表达水平的一个或更多个装置包含mRNA特异性多核苷酸，特别地选自蛋白质或肽、更具体地单克隆或多克隆抗体的结合部分；以及

c)用于检测至少一种miRNA标志物的量的一个或更多个装置包含至少一种miRNA特异性多核苷酸。

26.试剂盒，其包含根据方面24或25所述的装置。

27.根据方面26所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含：

(a)容器；和/或

(b)数据载体，其中所述数据载体包含例如以下信息：

(ii)对于使用所述装置检测特别是在样品中、更具体是来自个体的样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平以及至少一种miRNA标志物的量和/或使用所述试剂盒的说明，

(iii)质量信息，例如关于用于检测至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量的所述装置和/或所述试剂盒的批次/批号、制造或装配场所或者有效日期或最迟销售日期的信息、关于正确存储或操作所述试剂盒的信息，

28.根据方面24或25所述的装置或者根据方面26或27所述的试剂盒用于预后和/或诊断以下的用途：

iv.发生癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的风险；

v.癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的存在；和/或

vi.癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的进展。

29.根据方面24或25所述的装置或者根据方面26或27所述的试剂盒在根据方面1至23中任一项所述的方法中的用途。

30.用于鉴定癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的设备，其包含：

(a)分析单元，所述分析单元包含：

(b)包含数据处理器的评估单元，所述数据处理器有形地嵌入有用于进行通过所述分析单元确定的量与参考的比较的算法，并且能够生成包含基于所述比较建立的诊断结果的输出文件。

以下实施例仅举例说明本发明。无论如何，其不应被解释为限制本发明的范围。

实施例

研究群体

本研究由海德堡大学伦理委员会(Ethics Committee of the University ofHeidelberg)(德国)批准。所有的癌症患者和健康对照均为高加索人。所有招募的病例和对照都给出了对于研究的书面知情同意书。基因组DNA使用来自Qiagen的DNA分离试剂盒从外周全血中分离。在分离之后将白细胞立即在液氮中冷冻并储存于-80℃直至使用。DNA和RNA使用来自Qiagen的AllPrep DNA/RNA/蛋白质微型试剂盒从白细胞中分离。样品的详细信息示于表1中。请参见表5和表6中散发性BC患者的临床数据。

BC病例和匹配的对照

由德国遗传性乳腺癌和卵巢癌联合会(German Consortium for HereditaryBreast and Ovarian Cancer)在海德堡和科隆的中心收集来自270位BRCA1/2突变负指数家族性BC患者的外周血样品(第一轮验证)。所有的家族性BC病例均根据家族史的标准招募。在海德堡大学医院(University Hospital of Heidelberg)在任何BC治疗和外科手术之前在首次BC诊断的时间点收集来自350位散发性BC患者(189位在第二轮验证中，161位在第三轮验证中)的外周血样品。根据美国癌症联合委员会(American Joint Committee onCancer，AJCC)癌症分期指南定义散发性BC患者的临床特征。由德国巴登-符腾堡州-黑森州红十字血液服务站(German Red Cross Blood Service of Baden-Württemberg-Hessen)从献血者收集来自459位健康女性对照(251位在第一轮验证中，189位在第二轮验证中)的外周血样品。在海德堡大学医院收集来自151位健康女性对照的外周血样品(第三轮验证)。第三轮验证中的所有病例和对照均以相同的方式并行处理。在海德堡大学医院在血液收集后4小时内使用红细胞裂解缓冲液从外周血中分离白细胞。来自病例和对照的所有白细胞均并行处理。

PaCa病例和匹配的对照

从德国的多个中心收集来自147位散发性PaCa患者(80位男性病例和67位女性病例)的外周血样品。特别地以具有较高百分比的早期病例来选择PaCa病例。由德国巴登-符腾堡州-黑森州红十字血液服务站从献血者收集来自191位健康对照(115位男性病例和76位女性病例)的外周血样品。

OvCa病例和匹配的对照

在海德堡大学医院收集来自84位散发性OvCa患者的外周血样品。特别地以具有较高百分比的早期病例来选择OvCa病例。在海德堡大学医院收集来自148位健康对照的外周血样品。

实施例1：甲基化标志物的分析

Infinium 27k甲基化测定和Infinium 450k甲基化测定

在发现轮中，通过EZ-96DNA甲基化试剂盒(Zymo Research)处理来自每个样品的500ng基因组DNA用于重亚硫酸盐转化，并通过人甲基化27珠芯片(Human Methylation27BeadChip，Illumina)和Infinium人甲基化450珠芯片试剂盒(InfiniumHumanMethylation450 BeadChip Kit，Illumina)根据制造商建议进行全基因组甲基化筛选(Steemers FJ，ChangW，Lee G，Barker DL，Shen R，Gunderson KL.Whole-genomegenotyping with the single-base extension assay.Nat Methods 2006；3：31-3；BorkS，Pfister S，Witt H，等.DNA methylation pattern changes upon long-term cultureand aging of human mesenchymal stromal cells.Aging Cell 2009；9：54-63)。所有的样品均通过了根据制造商说明的质量控制。

通过Maldi-TOF质谱进行甲基化分析

由Breitling等(Breitling LP，Yang R，Korn B，Burwinkel B，BrennerH.Tobacco-smoking-related differential DNA methylation：27K discovery andreplication.Am J Hum Genet 2011；88：450-7.)描述的MALDI-TOF质谱(Sequenom)用于不同验证轮。将DNA通过EZ-96 DNA甲基化金试剂盒(Zymo Research)进行重亚硫酸盐转化，并通过重亚硫酸盐特异性引物扩增(图1)。根据Sequenom EpiTyper测定的标准方案处理PCR产物，并通过纳米分配器(Nanodispenser)分配至384 SpectroCHIP。通过Sequenom质谱仪***读取芯片。通过SpectroACQUIRE v3.3.1.3软件收集数据，并用MassArray EpiTyperv1.0软件可视化。随机选择5％样品用于重复分析。

RNA表达的定量实时PCR

通过逆转录试剂(Applied Biosystems)将来自每个样品的100ng总RNA转录成cDNA。对于HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P和DYRK4基因以及作为内源对照的管家基因HPRT1，与TaqMan基因表达测定(Applied Biosystems)组合使用LightCycler480(Roche)进行定量实时PCR。通过LightCycler 480基本软件(Roche)使用二阶导数最大值方法计算交点值。通过相对于HPRT1归一化根据ΔΔCt方法计算每个样品的基因的相对表达。所有病例和对照均并行处理。

不同扩增子的重亚硫酸盐特异性引物

统计学分析

通过Illumina BeadStudio软件用默认设置处理Illumina 27K阵列数据。移除检测P值＞0.01的探针，并将样品分位数归一化。使用R包betareg v2.2-3 30通过具有逻辑联系的β回归模型和相关Wald检验评估探针与病例/对照状态的关联。使用似然比检验针对芯片差异将病例/对照模型与嵌套模型进行比较以鉴定由于芯片效应混杂而引起的可能假命中。用Benjamini-Hochberg方法进行多重测试调整控制假发现率的水平为0.05。用统计学软件R v2.11.1进行所有的分析。

通过SPSS Statistics 17.0软件进行基因表达数据的所有统计学分析。通过Spearman秩相关系数评估相关性。将逻辑回归模型和非参数检验用于两组和多组之间的比较。通过在逻辑回归模型中包括另外的共变量来针对年龄和不同测量批次的可能混杂影响调整逻辑回归的结果。进行接受者操作特征(Receiver operating characteristic，ROC)曲线分析以评估甲基化水平的鉴别力。

实施例2：miRNA标志物的分析

血液处理和从血浆中的miRNA分离

从病例和对照个体收集EDTA血液样品，并在收集的2小时内进行处理以获得血浆。为了避免来自初始皮肤穿刺的上皮细胞的污染，不将在静脉切开术期间收集的第一管血液处理用于获得血浆。将血液在10℃下以1300g离心20分钟。将上清液(血浆)转移到微量离心管中，然后在10℃下以15500g进行第二高速离心步骤10分钟以除去细胞碎片和片段。将血浆等分到冷冻小瓶中，在液氮中快速冷冻并储存在-80℃直到使用。从400μL血浆中提取总RNA(包括miRNA)。使用TRIzol LS(Invitrogen，德国)根据制造商的方案但稍作以下修改进行变性和相分离：掺加入10fmol的秀丽隐杆线虫(C.elegans)miR-39/miR-238混合物。将水相转移到另一管中，添加1.5体积的无水乙醇，并将混合物施加到miRNeasy微型试剂盒柱(Qiagen，德国)上。在洗涤之后，将miRNA在30μL不含RNA酶的水中洗脱。

所选标志物候选物的验证

使用TaqMan miRNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems，德国)以及miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409和miR-148b的miRNA特异性RT引物(AppliedBiosystems，德国)进行逆转录(RT)反应。分别以7.5μl或15μl的体积进行单重(原发性乳腺癌)或多重(转移性乳腺癌)反应。每种反应包含1×RT缓冲液、1mM dNTP、0.3×miRNA特异性RT引物、0.25U RNA酶抑制剂、3.3U Multiscribe逆转录酶和固定体积的miRNA模板(分别为2μl或1μl)。对于良性和恶性乳腺癌组织样品，以15μl进行反应并且反应包含以下：1×RT缓冲液、1mM dNTP、0.6×miRNA特异性引物和RNU6B RT引物、0.25U RNA酶抑制剂、3.3UMultiscribe逆转录酶和5ng RNA。样品的盲法和在反应板上对病例和对照进行随机化同时研究旨在使验证期间的偏差和批次效应最小化。在G-STORM GS2 PCR循环仪(Alphametrix，德国)中在以下条件下进行RT：16℃30分钟，42℃30分钟，85℃5分钟，然后保持在4℃。

在按比例缩小的反应中一式三份地进行TaqMan实时PCR反应，所述反应包含：2.5μL无AmpErase UNG的TaqMan 2x通用PCR主混合物(Applied Biosystems，德国)、0.25μL 20xmiRNA特异性引物/探针混合物(Applied Biosystems，德国)和2.25μL逆转录产物(1∶4稀释)。在LightCycler 480热循环仪(Roche，德国)中在以下条件下进行实时PCR：95℃10分钟；然后50个循环：95℃15秒、60℃30秒和72℃30秒；然后保持在4℃。

如Kroh等中所述，将在血浆中进行验证研究的原始数据相对于掺入的cel-miR-39归一化(Kroh EM，Parkin RK，Mitchell PS，Tewari M.Analysis of circulatingmicroRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reversetranscription-PCR(qRT-PCR).Methods 2010；50：298-301)。如用户公告#2：ABI PRISM7700序列检测***(Applied Biosystems)中所述，将来自乳腺组织样品的原始Ct值相对于RNU6B归一化。

癌症病例与对照的比较

为了评价乳腺癌和***癌检测潜力，构建了接受者操作特征(ROC)曲线，并计算曲线下面积(area under the curve，AUC)。基于具有95％置信区间的ROC曲线，计算miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409和miR-148b在预定灵敏度(75％至90％)下的最低特异性。基于ROC曲线，计算信息最多且冗余最小的miRNA模型在预定灵敏度(75％至90％)下的最低特异性作为95％置信区间的下限(Tom Fawcett(2006)“Anintroduction to ROC analysis”.Pattern Recognition Letters 27，861-874.DOI：10.1016/j.patrec.2005.10.010；使用R包pROC v1.3.2)。

血浆中miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409和miR-148b的诊断潜力

进行ROC曲线分析以评价miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409和miR-148b用于在血浆中进行乳腺癌和***癌检测的诊断潜力。肿瘤和对照样品之间的辨别力由曲线下面积(AUC)描绘。

通过研究miR-148b、miR-376c、miR-409-3p和miR-801的不同组合，我们发现利用全部七种miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409和miR-148b的组合ROC给出了信息最多且冗余最小的miRNA组，其中AUC为0.89。

实施例3：甲基化和miRNA标志物的组合

样品制备

在海德堡大学医院在任何BC治疗和外科手术之前在首次BC诊断的时间点收集来自161位散发性BC患者的外周血样品(第三轮验证)。根据美国癌症联合委员会(AJCC)癌症分期指南定义散发性BC患者的临床特征。在海德堡大学医院收集来自151位健康女性对照的外周血样品(第三轮验证)。第三轮验证中的所有病例和对照均以相同的方式并行处理。从每个样品中提取来自全血的DNA和来自血浆的miRNA。

DNA甲基化水平和miRNA水平的确定.如实施例1中所述，通过MALDI-TOF质谱(Sequenom)确定DNA甲基化水平。如实施例2中所述，通过实时PCR确定血浆的miRNA水平。

统计学分析

通过SPSS Statistics 17.0软件进行基因表达数据的所有统计学分析。使用逻辑回归算法产生标志物组(DNA甲基化标志物和miRNA标志物的组合)的结果。将逻辑回归模型和非参数检验用于两组和多组之间的比较。通过在逻辑回归模型中包括另外的共变量针对年龄和不同测量批次的可能混杂影响来调整逻辑回归的结果。进行接受者操作特征(ROC)曲线分析以评估甲基化水平的鉴别力。

Claims

1.在对象中对癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA进行预后和/或诊断的方法，其包括：在对象中

b)确定选自miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409、miR-148b的至少一种miRNA标志物的存在、特别是量，

2.权利要求1所述的方法，其中癌症的所述预后和/或诊断包括：

i.发生癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的风险；

ii.癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的存在；和/或

iii.癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的进展、特别是恶化或好转。

3.权利要求1至2中任一项所述的方法，其中：

a)确定所述甲基化标志物RPTOR、MGRN1和RAPSN以及任选地HYAL2的甲基化状态和/或表达水平，和/或

b)确定所述miRNA标志物miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409、miR-148b的存在。

4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中：

a)确定所述甲基化标志物DYRK4、S100P、FUT7和SLC22A18以及任选地HYAL2的甲基化状态和/或表达水平，和/或

5.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中：

a)确定所述甲基化标志物MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P、DYRK4和任选地HYAL2的甲基化状态和/或表达水平，和/或

6.确定用于在对象中改变癌症或者预防或治疗癌症的药物剂量的方法，其包括以下步骤：

(a)确定对象的样品中选自HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P、DYRK4的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平，以及选自miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409、miR-148b的至少一种miRNA标志物的量，以及任选地确定参考中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平以及至少一种miRNA标志物的量，以用于与目的样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平和至少一种miRNA标志物的量进行比较；以及

(b)根据目的样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平以及至少一种miRNA标志物的量，任选地根据所述目的样品与所述参考或参考样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平以及至少一种miRNA标志物的量的比较来确定药物剂量。

7.调整用于改变癌症或者预防或治疗癌症的药物剂量的方法，其包括以下步骤：

(b)确定一个或更多个参考或参考样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平以及至少一种miRNA标志物的量；

(c)针对所述目的样品中存在的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平以及至少一种miRNA标志物的量是否不同于所述一个或更多个参考或参考样品中的水平来考察受试样品；以及

(d)根据所述目的样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平以及至少一种miRNA标志物的量是否不同于所述一个或更多个参考或参考样品中的水平来调整药物剂量。

8.确定物质对癌症或癌症发生的有益和/或不利作用的方法，其包括以下步骤：

(b)确定一个或更多个参考或参考样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平以及至少一种miRNA标志物的量，以及

(c)针对所述目的样品中存在的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平以及至少一种miRNA标志物的量是否不同于所述一个或更多个参考或参考样品中的水平来考察所述目的样品；

9.鉴定患者为癌症治疗的响应者的方法，其包括确定第一样品中和继所述第一样品之后取得的一个或更多个另外样品中选自HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P、DYRK4的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平，以及选自miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409、miR-148b的至少一种miRNA标志物的量，其中所述至少一种甲基化标志物的甲基化状态提高和/或所述至少一种甲基化标志物的表达水平降低，以及所述至少一种miRNA标志物不存在或量降低指示针对所述治疗的响应。

10.鉴定患者为癌症治疗的非响应者的方法，其包括确定第一样品中和继所述第一样品之后取得的一个或更多个另外样品中选自HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100P、DYRK4的至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或表达水平，以及选自miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409、miR-148b的至少一种miRNA标志物的量，其中所述至少一种甲基化标志物的甲基化状态降低和/或所述至少一种甲基化标志物的表达水平提高，以及所述至少一种miRNA标志物存在或量升高指示缺乏针对所述治疗的响应。

11.治疗癌症的方法，其包括以下步骤：

(i)确定对象的第一样品中至少一种甲基化标志物的甲基化状态和/或至少一种甲基化标志物的表达水平以及至少一种miRNA的量；

(iv)任选地重复步骤(ii)和(iii)一次或更多次；

(v)如果所述至少一种甲基化标志物的甲基化状态显著提高和/或所述至少一种甲基化标志物的表达水平降低，以及所述至少一种miRNA标志物的量降低或不存在，则继续用所述第一治疗方案治疗所述患者；或者

(vi)如果所述至少一种甲基化标志物的甲基化状态降低和/或所述至少一种甲基化标志物的表达水平提高，以及所述至少一种miRNA标志物的量升高或存在，则修改所述治疗或终止用所述第一治疗方案治疗所述患者，并且作为替代用包含有未包含在所述第一治疗方案中的一种或更多种抗癌剂或治疗的第二治疗方案治疗所述患者。

12.用于对以下进行预后和/或诊断的装置：

vii.发生癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的风险，

viii.癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的存在，和/或

ix.癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的进展；

所述装置包含：

b)检测至少一种miRNA标志物的量的一个或更多个装置。

13.试剂盒，其包含权利要求12所述的装置。

14.权利要求12所述的装置或权利要求13所述的试剂盒用于对以下进行预后和/或诊断的用途：

vii.发生癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的风险；

viii.癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的存在；和/或

ix.癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的进展。

15.用于鉴定癌症，特别是BC、OvaCa和/或PaCA的设备，其包含：

(a)分析单元，所述分析单元包含：

(ii)用于确定对象的样品中选自miR-652、miR-801、miR-376c、miR-376a、miR-127、miR-409、miR-148b的至少一种miRNA的存在的检测剂；以及

(b)包含有数据处理器的评估单元，所述数据处理器有形地嵌入有用于将通过所述分析单元确定的量与参考进行比较的算法，并且能够生成包含基于所述比较建立的诊断结果的输出文件。